DE3024270C2 - Zusammensetzung zur Bestimmung des menschlichen Erythropoietins und Verfahren zu dessen Bestimmung - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft eine Zusammensetzung zur Bestimmung des menschlichen Erythropoietins, bestehend aus Tragertellchen und auf die Oberfläche dieser Trägerteilchen aufgebrachtem menschlichen Erythropoletln, und ein Verfahren zu dessen Bestimmung. Die Lebensdauer menschlicher Erythrocyten beträgt etwa 120 Tage und V₁₂₀ der gesamten Erythrocyten

jo werden täglich In dem Reticulo-Endothelial-System terstört. Gleichzeitig wird die gleiche Anzahl an Erythrccyten gebildet, um die Anzahl der Erythrocyten stets konstant zu halten.

Die Erythrocyten werden durch die Reifung und Differenzierung der Erythroblasten In dem Knochenmark gebildet und Erythropoietln Ist ein Faktor, welcher durch Einwirkung auf die undlfferenzlerten Stammzellen deren Differenzierung zu Erythrocyten einleitet. Die Ausscheidung von Erythropoietin wird beschleunigt, wenn ein Abfall Im Sauerstoffpartlaldruck der Körpergewebe auftritt. Somit Ist Erythropoletln ein Humoralhormon, welches die Anzahl der Erythrocyten steuert, die Im Knochenmark gebildet werden.

Im Fall von Säugetieren wird die Gesamtheit oder ein größerer Teil dieses Erythropoietins durch die Niere durch ein Slallnsäure enthaltendes Glycoproteln gebildet, dessen Molekulargewicht auf etwa 27 000 bis 66 000 geschätzt wird.

Die Störungen, bei denen die menschlichen Erythrocyten abnehmen, d. h. Anämien, können grob ätiologisch in drei Arten unterteilt werden. Die erste Art Ist diejenige, bei welcher die Stammzellen, der Ursprung der Erythrocyten, anomal sind, so daß die Erythrocyten nicht gebildet werden können, selbst wenn die Produktionsfähigkeit des Erythropoietins normal Ist, d. h. die splastische Anämie. Diese Anomalie der Stammzellen kann weiterhin in solche Fälle unterteilt werden, wie die Hypoplastle des Knochenmarks, die Anomalie des Knochen marks selbst, die Unzulänglichkeit der Stellen, wo die Erythrocyien gebildet werden, und der Abfall der Reakti vität für Erythropoietin.

Im Fall der anämischen Störungen dieser Art tritt der Mechanismus des Körpers, der zu einer Erhöhung der Anzahl der Erythrocyten tendiert. In Wirkung, so daß die Menge des Erythropoietins einen extrem oder abnormal hohen Wert zeigt. Die zweite Art der Anämie Ist diejenige einer chronischen Renai.tisufflzient, d. h.

Anämie der Renalkrankhellen. Da In diesem Fall dies eine organische Störung der Nieren, der Erzeuger des Erythropoietins, darstellt, kann Erythropoietin nicht geblluet werden, selbst wenn die Stammzellen normal sind. Deshalb kann keine Erhöhung der Anzahl der Erythrocyten stattfinden, so daß sich eine Anämie ergibt. In diesem Fall Ist In der Flüssigkeit lediglich eine niedrige Konzentration an Erythropoletln vorhanden. Die dritte Art der Anämien Ist der Fall, bei weichen sowohl die Stammzellen als auch die Erythropoletln-Produktlvltäts fählgkelt normal sind, wobei der anämische Zustand auf Elsenmangel, Hämorrhage, Vitamin Bu-Mangel, auf AutoImmunität zurückführende Hämolyse und dgl. zurückzuführen 1st. In diesem Fall zeigt die Menge des Erythropoietins einen hohen Wert und eine negative Beziehung zur Menge des Hämoglobins.

Während die Anämien selbst leicht durch eine Zählung der tatsächlichen Anzahl der Erythrocyten, die Bestimmung des Hämetokrlt-Wertes oder die Bestimmung des Hämoglobins leicht diagnostiziert werden können. Ist die Diagnose der Ursache des anämischen Zustandes, ob nämlich die Ursache der Störung auf eine Anomalie der Stammzellen zurückzuführen Ist, ob sie auf eine unzureichende Produktion von Erythropoletln auf Grund von Renalstörungen zurückzuführen Ist oder ob die Ursache auf andere Gründe außer den vorstehenden Ursachen zurückzuführen Ist, äußerst wichtig bei der Aufstellung der Behandlungsvorschrift und bei der Erstellung einer Prognose der Krankhell. In jedem Fall Ist eine Bestimmung des Erythropoletlns in der Körper flüssigkeit für diesen Zweck unerläßlich.

Bekannt Ist ein biologisches Bestlmrnungs-Verfahren, das sowohl kompliziert als auch zeltraubend und kostspielig Ist. Bei diesem Verfahren wird die Menge des Erythropoietins In folgender Welse berechnet. Polythythemlsche Mause oder hungernde Ratten werden mit Erythropoletln Injiziert, worauf dann eine Injektion mil "Fe

erfolgt. Die Menge des Erythropoletlns wird aus der Geschwindigkeit berechnet, mit der das ⁵⁹Fe in die Erythrocyten aufgenommen wird. Obwohl dieses Verfahren eine ganz ausgezeichnete Spezifität hat, bestehen solche Nachteile, daß eine große Anzahl von Tieren während eines langen Zeitraumes gezüchtet werden muß und daß ein Isotop verwendet wird. Darüberhinaus erfordert das Verfahren erhebliche Arbeit und Kosten. Es ist deshalb schwierig, es bei den klinischen Untersuchungen anzuwenden.

Zur Verminderung dieser Nachteile und Störungen wurde ein Verfahren entwickelt, welches darin besteht, daß Erythrocyten mit menschlichem Erythropotetin überzogen werden. Anllerythropoleiin-Antlkörper wird bei diesem Verfahren zunächst mit dem in der Probe enthaltenen Erythropoietin neutralisiert, anschließend werden die sensiblltsienen Erythrocyten zugegeben und die Hemmung der Anttgen-AnUkörper-Agglutlnierungsreaktlon festgestellt. Da jedoch bei diesem Verfahren die Notwendigkeit zur Entfernung des nicht-spezifischen Hämagglutlns, welches im menschlichen Serum enthalten Ist, besteht, muß eine Behandlung zur Absorption des Hämagglutins vorgenommen werden und ein Test, der die Entfernung bestätigt, ausgeführt werden.

In der Literaturstelle: G. Müller, Kiln. Biochemie und Laboratoriumsdiagnostik, 1977, S. 53/54 ist ein Verfahren zum Nachwels von Antikörper oder Antigenen In einer Körperflüssigkeit durch einen Agglutinations-Hemmtfcst angegeben, bei dem anstelle von Erythrocyten serologisch Inerte Latexträger mit einer Teilchengröße von 0,05 bis 0,9 μπι mit Antikörpern bzw. Antigenen überzogen werden. Auch aus der DE-OS 22 04 684 ist ein solches Verfahren bekannt, wobei Polymerlatexteilchen vom Styroltyp mit einem spezifischen Gewicht von 1,03 verwendet werden. Jedoch ergibt sich daraus keinerlei Hinweis auf ein Verfahren zur Bestimmung von menschlichem Erythropoiet'n.

Die Aufgabe der Erfindung besteht in der Schaffung einer Zusammensetzung zur Bestimmung des mensch»- chen Erythropoietlns, bei deren Anwendung es Im Gegensatz zu den komplizierten und zeltraubenden bisher angewandten Verfahren möglich Ist, sowohl quantitativ als auch qualitativ mit Genauigkeit und Exaktheit das In einer Flüssigkeitsprobe enthaltene menschliche Erythropoietin mittels einfacher Maßnahmen unter Anwendung eines einfachen Geräts zu bestimmen.

Die Lösung dieser Aufgabe erfolgt gemäß der Erfindung durch die Schaffung einer Zusammensetzung zur Bestimmung des menschlichen Erytkiopoietins bestehend aus Trägertellchen und auf die Oberfläche dieser Trägerteilchen aufgebrachtem menschlichen Erythropoietin, die dadurch gekennzeichnet Ist, daß die Trägerteilchen aus synthetischen Polymerlatexteilchen vom Styroltyp mit einem spezifischen Gewicht von 1,1 bis 1,4 bestehen und aus der Gruppe von Teilchen eines Styrolpolymeren, Styrolcopolymeren und carboxyllerten oder Aminogruppen enthaltenden carboxyllerten Produkten hiervon ausgewählt sind. Jö

Ferner wird gemäß der Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung des menschlichen Erythropoietins In menschlichem Urin oder Serum nati, dem Mikroliterverfahren unter Verwendung einer Zusammensetzung, bestehend aus Trägerteilchen und auf die Oberfläche dieser Trägerteilchen aufgebrachtem menschlichen Erythropoietin geschaffen, das dadurch .,^kennzeichnet Ist, daß die Trägerteilchen aus synthetischen Polymerlatexteilchen vom Styroltyp mit einem spezifischen Gewicht von 1,1 bis 1,4 bestehen und aus der Gruppe von Teilchen eines Styrolpolymeren. Styrolcopolymeren und carboxyllerten oder Aminogruppen enthaltenden carboxyllerten Produkten hiervon ausgewählt sind.

Synthetische polymere Latexteilchen oder Teilchen aus einem synthetischen polymeren Latex vom Styroltyp, die mit gereinigtem menschlichen Erythropoleiln (Antigen) überzogen sind, können leicht hergestellt werden. Bei Anwendung dieser Latexteilchen kann das In der Körperflüssigkeit enthaltene Erythropoietin leicht und «1 mühelos mit guter Genauigkeit durch die passive Latex-Agglutlnlerungshemmreaktlon bestimmt werden, ohne daß aufwendige Vorbehandlungen der Testflüsslgkeil notwendig sind.

Da der mit Erythropoietin überzogene Latex eine Agglutlnlerung durch Reaktion mit dem Antierythropoietln-Antlkörper erleidet, findet eine Agglutination des mit Antigen überzogenen Latex nicht statt, wenn dieser Antikörper vorhergehend mit dem In der Probe enthaltenen Antigen neutralisiert wurde. Wenn die Probe kein Antigen enthält, kann der Antikörper nicht neutralisiert werden. Infolgedessen findet die Agglutlnlerung des mit Antigen überzogenen Latex Infolge dieses Antikörpers statt. Dadurch wird es möglich, die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Antigens mittels der passiven Latcx-Agglullnlerungs-Hemmreaktion zu bestimmen.

Bei quantitativer Bestimmung des Erythropoietins werden aaf einer MlkroplaUe bestimmte Mengen des Antikörpers zu fortschreitend verdünnten Proben zwecks Neutralisation des in der Probe enthaltenen Lrythropoletlns zugegeben, anschließend der mit Antigen überzogene Latex zugesetzt und das Agglutlnatlons-Reaktlonsmuster beobachtet, welches durch den Latex und den unneutrallsiert verbliebenen Antikörper gebildet wurde.

Diese Zusammensetzung reagiert nur mil einem Antlerythropoletln-Antlkörper, welcher zu der Versuchsprobe zugegeben wurde, und nicht mit anderen Antikörpern, die In der P-obe oder dem Plasmaprotein vorliegen können.

Verschiedene synthetische Latexteilchen können zur Herstellung der Zusammensetzung zur Bestimmung des menschlichen Erythropoietins gemäß der Erfindung verwendet werden. Beispiele für Polymere oder Copolymere, welche derartige Laiexe bilden, umfassen beispielsweise Polystyrol, carboxyliertes Polystyrol, amlnhaltlges carboxylates Polystyrol, Styrol-Butadlen-Copolymere, carboxyliert Styrol-Butadlen-Copolymere, Styrol-Dlvlnylbenzol-Copolymere und Acryinllrll-Buladicn-Styrol-Copolymcre.

Als Copolymere von Styrol werden bcvor/.ugl Monomere aus der Gruppe von Chlorstyrol, Methylmethacrylat und Vinylidenchlorid. Die synthetischen Polymurlaiexteilchen können nach einer Vorbehandlung Ihrer Oberflächen mit einem nlcht-ionischcn oberflächenaktiver. Mittel verwendet werden. Beispielsweise wird es bevorzugt, die Teilchen zu verwenden, nachdem ein nicht-Ionisches oberflächenaktives Mittel vom Athylenoxldtyp hieran absorbiert wurde. Beispiele für geeignete nlcht-lonlschc oberflächenaktive MIttel vom Athylenoxldtyp sind Blockcopolymerc von Äthylunoxld und Polyoxypropylenglykol. Polyoxyäthylenalkylälhcrn und l'olyoxyäthylenalkylaryläthern.

Die synthetischen PolymcrlatcxtcHchcn haben vorzugsweise einen durchschnittlichen Tellchcndurehmesser

von 0,01 bis 10 μπι, insbesondere von 0,1 bis 1 μηι. Zur Erhöhung der Reproduzierbarkeit der Ergebnisse der Bestimmungen wird es bevorzugt. Teilchen Innerhalb eines relativ engen Bereiches hinsichtlich der Größenverteilung, beispielsweise eines Bereiches von 0,2 ± 0,005, anzuwenden. Das spezifische Gewicht der Latexteilchen beträgt 1,1 bis 1,4 und vorzugsweise Ul bis 1,3.

5 Obwohl es möglich 1st, sowohl Blut aus auch Urin als Ausgangsmaterial Tür die Gewinnung des Erythropoletlns einzusetzen, Ist Urin besonders geeignet, da er eine Ausscheidung darstellt und somit leicht zur Verfügung steht. Wie in Journal oi Biological Chemistry, Band 252, Seiten 5558 bis 5564 (1977) angegeben, können sämtliche bekannten Maßnahmen, wie Äthanol-Ausfällung, Aceton-Ausfällung, Gerbsäure-Ausfällung, Llthiumoxid-Au^fällung, Aussalzung mit Ammoniumsulfat, Gelfiltration, DEAE-Cellulose-Chromatographle, Polyacrylamldgel-Chromatographie und Kaolln-Adsorptlon undDissozlation zur Herstellung von Erythropoletin aus den vorstehenden Ausgangsmaterialien angewandt werden.

Da Erythropoieiin eine Erhitzung auf beispielsweise 100⁰C während 15 Minuten aushalten kann. Ist es auch wirksam, das Material einer Wärmebehandlung bei beispielsweise etwa 80 bis 100⁰C während etwa 10 bis 15 Minuten vor seiner Reinigung zu unterziehen, so daß ein Großteil der anderen gegebenenfalls vorhandenen Proteine wärmemodifiziert werden. Das im Rahmen der Erfindung eingesetzte Erythropoletin kann eines sein, welches nach einem der vorstehend ausgeführten Verfahren oder Kombinationen hiervon erhalten wurde. Jedoch wird es bevorzugt, daß es ein einziges Protein von hoher Reinheit Ist, da die Möglichkeit für Nebenreaktionen besteht, falls die Reinheit niedrig ist.

Der Antikörper kann durch Anwendung des In dieser Welse erhaltenen gereinigten Erythropoletlns als Antl-

gen und Immunisierung von Tieren mit der Fähigkeit zur Bildung von Antikörpern, wie Ziegen, Kaninchen

und Meerschweinchen, durch inokunerung dieser Tiere mit dem Erythropoietin mit anspießender Abnahme

des Blutes derselben erhalten werden. Sämtliche Tiere können In diesem Fall verwendet werden, sofern sie solche sind, worauf der Antikörper lelchi erhalten werden kann.

Die Zusammensetzung zur Bestimmung des menschlichen Erylhropoletins gemäß der Erfindung ku.nn nach einem einfachen Verfahren hergestellt werden. Beispielswelse kann sie erhalten werden. Indem Latexteilchen und das Erythropoietin In Wasser, einer physiologischen Salzlösung oder verschiedenen Pufferlösungen von pH 5,5 bis 10, vorzugsweise pH 6,4 bis 7,6, bei etwa 4° bis etwa 40" C während etwa 30 Minuten bis etwa 24 Stunden unter gelindem Rühren vorzugsweise mit Konzentrationen der Latexteilchen von 0,05 bis 3% und Konzentrationen des Antigens von 50 bis 1000 mlu/ml kontaktlert werden.

Der verwendete Puffer kann beispielsweise eine phosphatgepufferte Salzlösung, wie z. B. M/60 Phosphatpuffer (pH 7,2) mit einem Gehalt von 0,15 M NaCl (abgekürzt PBS) oder glyclngepufferte Salzlösung sein. Gewünschtenralls können etwa 0,01 bis etwa 0,1¹V. eines Proteins,' wie Ochsenserum-Albumln (abgekürzt BSA) vorzugsweise zu der Antlgenlösung zugesetzt werden, um eine nicht-spezifische Agglutlnlerung zu verhindern. Nach der Überzugsreaktion wird das Reakiionsgemisch mit einem wäßrigen Lösungsmittel gewaschen. Das nicht an den Latexteilchen adsorbierte Antigen kann vollständig durch Waschen der Teilchen beispielsweise mit derartigen Puffern entfernt werden. Wiederum wird es empfohlen, daß der Latex In einem Verdünnungsmittel suspendiert wird, um den nicht vom Antigen überzogenen Teil der Latexteilchen mit Protein gesättigt zu halten.

Als Verdünnungsmittel wird eine Lösung, welche durch Zusatz von etwa 0,1% BSA zum beispielsweise einer glydngepufferten Natriumchlorldlösung oder einer phosphatgepufferten Natriumchloridlösung erhalten wuide. wozu weiterhin 0,01 bis 0,5% Natrlumazld (NaN₃) zugegeben wurde, verwendet.

Der in dieser Welse erhaltene mit Antigen überzogne Latex kann In einem Kühlschrank suspendiert In • einem Verdünnungsmittel mit einer Konzentration von beispielsweise etwa 0,25 Gew.-» gehalten werden oder er kann lyophllislert werden. Bei der Ausführung der Lyophlllslerung können verschiedene Amirosauren, insbesondere solche Aminosäuren wie Glycin und Natrlumglutamai, und/oder Dextran In solchen Mengen wie 0,2 bis 2 Gew.% Im Fall der Aminosäuren und 0,3 bis 3 Gew.-% Im Fall des Dextrans zu dem Verdünnungsmittel als Stabilisatoren zugegeben werden, worauf der antlgenübcrzogenc Latex In flüssigem Stickstoff oder flüssiger Luft rasch gefroren werden kann und dann iyophllislerl wird. Der Aufbewahrungszeltraum wird weiterhin durch die Lyophlltsierung verlängert und der lyophlllsierte anllgenüber/.ogenc Latex kann üblicherweise stabil während etwa 2 Jahren (vier mehr gelagert werden.

Zur Ausführung der Bestimmung können an sich bekannte Maßnahmen angewandt werden. Beispielsweise ki>nn das Niveau <les menschlichen Erythropoletins Im Serum oder Urin leicht nach einem Mikrotlter-Verfahren ermittelt werden. Dabei wird eine gegebene Menge eines Verdünnungsmittels der vorstehend ausgeführten Art portionsweise auf eine Mikroplatte gegossen und denn *!rd eine gegebene Menge einer Versuchsprobe, wie Serum oder Urin. In die erste Aussparung der Platte eingeführt und aufeinanderfolgend mit einem Verdünner verdünnt. In der gleichen Welse wird eine Verdünnungsreihe unter Anwendung eines Standard-Erythropoieilns mit einer bekannten Konzentration hergestellt. Eine gegebene Menge des Antikörpers wird dann zu sämtlichen Proben und der Verdünnungsreihe zugesetzt, woraui die Proben bei Raumtemperatur während 15 bis 70 Minuten zur Neutralisation des Antikörpers gehalten werden. Daran schließt sich der Zusatz und das Vermischen einer gegebenen Menge des mit Antigen überzogenen Latex an. Nach Stehen während eines gegebenen ZeIlraums bei Raumtemperaiur wird der Endpunkt tier Agglullnlerung beobachtet. Die absolute Menge des Erythropoletins kann durch Vergleich mit der Suindard-Erythropolctlnrcihe bestimmt werden. Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen naher erläutert.

Beispiel 1

a) Herstellung von Erythropoletin 0.1% Phenol wurden /u dein lirin eines aniimlsehcn l'allcnlcn /ugcseUl und nach Zugabe des 4lachcn VoIu-

mens an Ahtanol wurde das Gemisch über Nacht In einein Kühlschrank stehengelassen. Dann wurde das (jcmisch hei 3000 U/mln während 30 Minuten zentrifugiert, worauf das Sediment gesammelt und In einer phys.ologischen Salzlösung gelöst wurde und erneut über Nacht gegen eine physiologische Salzlösung dialyslert wurde. Diese wurde dann anteilswelse In kleine Reagenzgläser gegeben, wobei diese Reagenzgläser In siedendes Wasser während 15 Minuten eingetaucht wurden und dann mit hoher Geschwindigkeit zentrifugiert wurden.Zu der überstehenden Flüssigkeit wurde 5mal in einer physiologischen Salzlösung gewaschenes Kaolin in einer Menge von 10% zugesetzt und nach der liinslcllung des pH-Wertes auf 4,8 wurde das Gemisch schwach bei 4^; C 24 Stunden lang gerührt. Das Kaolin wurde auf der Zentrifuge bei 3000 U/mln abgetrennt, gesammelt und mit einem Acetatpuffer von pH 4,8 gewaschen. Ils wurde dann In 1 M NlI₄CH suspendiert, schwach während 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt und bei 3000 U/mln während 30 Minuten zentrifugiert und anschließend wurde die erhaltene überstehende Flüssigkeit abgetrennt. Nachdem dieser Arbeitsgang dreimal wiederholt worden war, wurden die überstehenden Flüssigkeiten vereinigt. Diese Probe wurde erneut gegen eine Lösung mit einem Gehalt von 0,029 M NaII₂PO₄ und 0,029 M NaCl dlalysleri. Dann wurde diese Probe zu einer DEAE-Cellulose zugegeben, die mit einer Lösung von 0,029 M NaH₁PO₄ und 0.029 M NaCl Im Gleichgewicht stand und schwach bei Raumtemperatur während I Stunde zu Ihrer Adsorption gerührt. Dann wurde die DEAE-Cellulose durch Zentrifugalion bei 2000 U/mln gesammelt. In der vorstehenden Lösung zweimal gewaschen und anschließend dreimal In einer Lösung mit dem Gehalt von 0,05 M Na₁HPO₄ und 0,15 M NaCI eluieri. Das Elual wurde dann mit l.yphogcl (Polyacrylamldgel der üelman Instrument Co., USA) konzentriert und anschließend mit Sephadex G-100 (vernetzies Dextran der Pharmacia Fine Chemicals, AB. Schweden} einer Gelfiltration unterzogen und anschließend der aktive Teil gesammelt. Dieser wurde erneut mit Ähtanol ausgelallt, worauf der Niederschlag in Äthanol gewaschen wurde und nach der Auflösung in einer physiologischen Salzlösung erneut gegen eine physiologische Salzlösung zur Bildung der Eryihropolctlnprobe gelöst wurde.

b) Herstellung eines Erythropoletln-Antlkörpers

Eine In der gleichen Weise wie vorstehend hergestellte Probe, wobei jedoch die Wärmebehandlung nicht ausgeführt worden war, wurde als Antigen für die Immunisierung verwendet. Nach der Vermischung dieses Antigens mit Freund-L'nvollständlgkeltshillsmlitel wurde das Gemisch subkutan dreimal in Kaninchen mit einem Gewicht von 2 bis 3 kg Im Abstand von 7 Tagen injiziert und anschließend wurde eine Intramuskuläre Injektion verabfolgt. Drei Wochen später wurde die Probe In Lösung In einer physiologischen Salzlösung Intravenös injiziert. Eine Woche nach der abschließenden Injektion wurde das Gesamtblut aus der Carotldarterie abgenommen und das Serum wurde in üblicher Welse abgetrennt und anschließend auf 56° C während 30 Minuten erhitzt. Das Material wurde bei 4° C nach der Zugabe von 0,1% Natrlumazld aufbewahrt. Das erhaltene Antlserum bildete eine Bande mit einem Antigen nach dem Ouchterlony-Verfahren sowie nach der Immunoelektrophorese. Somit war bestätigt, daß es nur einen einzigen Antikörper enthielt.

Ein Polystyrollatex (SDL 59, spezifisches Gewicht 1,18. Tellchcndurchmcsser 0.9 Mikron, Produkt der Takeda Chemical Industry Company) wurde in einem Gemisch aus 1 Volumen eines V₁, M-Phosphatpuffers (pH 7,2) und 3 Volumen einer physiologischen Salzlösung (abgekürzt mit PBS) so dlsperglert, daß die Tellchenkonzentralion 0.25".. betrug. Zu der erhaltenen Suspension wurde ein mit PBS auf eine Konzentration von 250 mlu/ml (mill! Immuno chemical unli/ml) verdünntes Erythropoletln zugesetzt. Das erhaltene Gemisch wurde bei Raumtemperatur während 3 Stunden gehalten und dann zur Sammlung der Latexteilchen zentrifugiert, welche mit PBS und dann mit einem Verdünnungsmittel gewaschen wurden, worauf die überzogenen Teilchen in dem Verdünnungsmittel zu einer Konzentration von 0,25 ^ suspendiert wurden. Obwohl dieser mit Antigen überzogene Latex mit einem Antierythropoietin-Aniikörper auf einer Mlkroplalte agglutlnlert, ergab er keine Agglutinlerung, wenn verschiedene Antikörper von menschlichem Albumin, menschlichem IgG, menschlichem Transferrin, menschlichem Haptoglobin und menschlichen /^-Mlkroglobulin zugesetzt wurden. Ferner fand keine Agglutlnierung statt, wenn der mit Antigen überzogene Latex zugesetzt wurde, nachdem der Antierythropo- so iesin-Antikörper durch Zusatz von Erylhropoietln neutralisiert worden war. Weiterhin land, nachdem der Antieryihropoietin-Antikörper unter Identischen Bedingungen zu einem Latex, welcher nicht mit Erythropoietin überzogen worden war. zugegeben wurde, keine Agglutlnlerung statt. Dadurch wurde bestätigt, daß dieser antigenüberzogene Latex spezifisch mit dem Antierythropoletln-Aniikörper und Agglutinaten reagiert.

Das ermähnte Verdünnungsmittel wurde erhalten, indem BSA zu einer mit '/„, M-Phosphai gepufferten physiologischen Salzlösung (pH 7.2) zu einer Konzentration von 0.1% zugesetzt worden war.

d) Lyophillsierung des mit Antigen überzogenen Latex

Der mit Antigen überzogene Latex wurde in einem Verdünnungsmittel mit einem Gehalt von 0,5 Gew.-¹^ M Glycin und 0,7 Gew.-s Dextran (Dextran, Molekulargewicht 200 000 bis 300 000, Produkt der Wako Jyunyaku Co.) zu einer Konzentration von 2.5h, suspendiert. Nach der Rasch-Gefrlerung dieses Materials im flüssigen Stickstoff wurde es lyophilisiert.

Beispiel 2
Bestimmung des Mrythropolcslns

0,025 ml des Verdünnungsmittels wurde in jede Aussparung der ersten Reihe einer Mikroplatte vom V-Typ gegossen. Zu der ersten Aussparung wurden 0,025 ml Serum zugesetzt. Weiterhin wurden 75 mlu/ml an Standard-F.rythropoletin zu der ersten Ausbohrung der zweiten Reihe zugesetzt und fortschreitend mit einem Verdünnungsmittel nach dem Zwcllach-Scrlcnverdünnungsverlahrcn verdünnt. Sämtliche Aussparungen wurden dann mit 0,025 ml eines vorhergehend mit Siandard-Erythropoletln In der Welse verdünnten Antlerylhropoletin-Antlkörpers vermischt, dall die sechste Aussparung den Endpunkt darstellte. Danr. wurden die Mischungen bei Raumtemperatur wutirend 30 Minuten gehalten, worauf 0,05 ml des In Beispiel 1 c) erhaltenen mit Antigen überzogenen Latex zu jeder Aussparung zugegeben wurden. Die Gemische wurden gründlich mit j,s einem Mlkromlxer vermischt und bei Raumtemperatur wahrend mindestens 10 Stunden stehengelassen. Der Entpunkt der Hemmung der Agglutlnlerung wurde dann gemessen und die F.rythropoietln-Konzentration wurde durch Vergleich mit dem Standard-Erythropolctln berechnet.

Die erhaltenen Ergebnisse, wenn die Konzentration des Erythropoictlns Im menschlichen Serum nach diesem Verfahren bestimmt wurde, sind In der folgenden Tabelle aufgeführt.

Tabelle
Bestimmung des Scrum-Erythropoictins (Agglutinierungshcmmwcrl)

Nr. 1 2 3 4 5 (> 7 R <) I!) Il 12 miu/.nl

Standardlösung 75 miu/ml -- — — -- + + + + + +

Gesunder Erwachsener - — — -- + + + + + + + 37,5

(27 Jahre alt, männlich)

Gesunder Erwachsener — — — — - — + + + + + + 75

(46 Jahre alt, männlich)

Aplastische Anämie _________ — - + 2400

(18 Jahre alt. weiblich)

Aplastische Anämie _________- + + 1200

(24 Jahre alt, männlich)

Hypufcffiiische Anämie -______- + + + + 300

(51 Jahre alt, weiblich)

Chronische Renalinsuffizient - + + + + + + + + + + + 2,3

(47 Jahre alt, männlich)

Chronische RenalinsufTizient --- + + + + + + + + + 9,3

(39 Jahre alt, männlich)

—: unugglulinien + : agfluiinicri

Beispiel 3

Ein Verdünnungsmittel wurde zu dem mit Antigen überzogenen Latex, der nach Beispiel 1 d) erhalten wurde, in der Weise zugegeben, daß die Konzentration der Lrtextellchcn 0,25% betrug, worauf der Arbeitsgang wie in Beispiel 2 ausgeführt wurde, um das Im Serum enthaltene Erythropoletln zu bestimmen. Die erhaltenen Ergebnisse waren die gleichen wie in Beispiel 2.
Wie sich aus den vorstehenden Ergebnissen zeigt, zeigte das Erythropoietln im Blut einen hohen Wert im Fall der hypoferritlschen Anämie und einen abnormal hohen Wert im Fall der aplastischen Anämie, jedoch einen abnormal niedrigen Wert im Fall der renischen Anämie. Dadurch läßt sich feststellen, daß die Bestimmung des Erythropoleiins von anämischen Patienten äußerst wertvoll für die Diagnose der Ursache der Anämie bei diesen Patienten sowie für die Bestimmung des Ausmaßes der Krankheit Ist. Die Anwendung des mit Antigen überzogenen Latex gemäß der Erfindung ermöglicht es, sehr einfach das Niveau des Erythropoietlns innerhalb einer äußerst geringen Menge der Probe und ferner ohne die Notwendigkeit Irgendeiner Vorbehandlung der Probe festzustellen. Das Vorfahren gemäß der Erfindung ist somit besonders geeignet zur Anwendung In der klinischen Diagnose.

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Claims (5)

Patentansprüche:

1. Zusammensetzung zur Bestimmung des menschlichen Erythropoietins, bestehend aus Tragerteilchen und auf die Oberfläche dieser Trägertellchen aufgebrachtem menschlichen Erythropoletln, dadurch ge-

S kennzeichnet, daß die Trägerteilchen aus synthetischen Polymerlatexteilchen vom Styroltyp mit einem spezifischen Gewicht von 1,1 bis 1,4 bestehen und aus der Gruppe von Teilchen eines Styrolpclymeren, Styrolcopolyraeren und carboxyllerten oder Aminogruppen enthaltenden carboxyllerten Produkten hiervon ausgewählt sind.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Latexteilchen einen durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,01 bis 10 μΐη besitzen.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen Stabilisator aus Aminosäuren und/oder Dextran enthält.

4. Zusammensetzung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Stabilisator aus Glycin In einer Konzentration von 0,2 bis 2 Gew.-* und Dextran In einer Konzentration von 0,3 bis 3 Gew.-% besteht.

5. Verfahren zur Bestimmung des menschlichen Erythropoietins in menschlichem Urin oder Serum nach dem Mlkroilterverfahren unter Verwendung einer Zusammensetzung, bestehend aus Trägerteilchen und auf die Oberfläche dieser Trägerteilchen aufgebrachten menschlichen Erythropoletln, dadurch gekennzeichnet, daß die Trägerteilchen aus synthetischen Polymerlatexteilchen vom Styroltyp mit einem spezifischen Gewicht von 1,1 bis 1,4 bestehen und aus dieser Gruppe von Teilchen eines Styrolpolymeren, Styrolcopoly-

jo meren und carboxyllerten oder Aminogruppen enthaltenden carboxyllerten Produkten hiervon ausgewählt sind.