DE3750344T2 - Beschleuniger der Aktivität von Hydrolase. - Google Patents

Beschleuniger der Aktivität von Hydrolase.

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Description

  • 1. Gebiet der Erfindung:
  • Die vorliegende Erfindung betrifft einen Beschleuniger der Aktivität von Hydrolase, insbesondere einen Beschleuniger, der die Aktivierung der Vorläufer der Serinprotease beschleunigt, einschließlich des Blutgerinnungsfaktors XII, und der die Enzymaktivität der durch die Aktivierung der genannten Vorläufer gebildeten Serinprotease beschleunigt. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung einen Beschleuniger der Blutgerinnung unter Verwendung diese Beschleunigers.
  • 2. Beschreibung des Standes der Technik:
  • Der bemerkenswerte Fortschritt bei der Untersuchung von Techniken im Zusammenhang mit der Ausführung von Blutuntersuchungen einschließlich biochemischer Serumtests, immunologischer Serumtests und Blutzellenuntersuchungen trägt bedeutend zur Verhinderung von Krankheiten und zur frühzeitigen Diagnose bei. Die meisten Blutuntersuchungen sind Untersuchungen des Serums, und das für derartige Untersuchungen benötigte Serum wird in der Regel aus Blut erhalten, das man in einem Behälter für Blutuntersuchungen sammelt und gerinnen läßt, wonach sich eine Zentrifugation anschließt, durch die man das Blutgerinnsel (die gel-ähnliche Masse einer Mischung aus Fibrin und Blutzellen), welches eine vom Serum abweichende Dichtezahl aufweist, abtrennt, und man das Serum unter Verwendung einer Pipette oder durch Dekantieren sammelt.
  • Es verstreicht eine relativ lange Zeitdauer, bis das von zu untersuchenden Patienten gesammelte Blut gerinnt. Beispielsweise dauert es selbst bei Verwendung von gläsernen Teströhrchen, die die Blutgerinnung in relativ kurzer Zeit erlauben, 40-60 Minuten bis zur Gerinnung, und wenn Teströhrchen verwendet werden, die aus einem synthetischen Harz hergestellt sind, sind 4 Stunden oder länger erforderlich. Aus diesem Grunde besteht das Problem, daß es nicht möglich ist, das für Untersuchungen erforderliche Serum schnell zu erhalten. Dies ist ein besonderes Problem, wenn die Untersuchung im Rahmen eines Notfalls erfolgen soll.
  • Es wird ein Beschleuniger der Blutgerinnung eingesetzt, damit das Blut schnell gerinnt. Der Faktor XII ist eine Form eines Vorläufers einer im Zusammenhang mit der Blutgerinnung stehenden Proteinhydrolase (Serinprotease), und durch dessen Aktivierung werden wiederum andere Faktoren der Blutgerinnung im Blut aktiviert, um die Blutgerinnung auszulösen. Als Beschleuniger der Aktivität des Faktors XII sind Glas, Kaolin, Bentonit, Siliciumdioxid und andere anorganische fein verteilte oder kolloidale Partikel, sowie Ellagsäure bekannt. Diese werden ebenfalls als ein Inhaltsstoff der Reagenzien zur Messung der aktivierten partiellen Thromboplastin-Zeit (APTT) verwendet, was eine Art der Untersuchung des Gerinnungsverlaufs darstellt. Selbst wenn diese als Beschleuniger der Blutgerinnung eingesetzt werden, führen die Unterschiede in ihrer Reinheit und Zusammensetzung jedoch zu einer Streuung der Untersuchungsergebnisse wie der Zeit zur Blutgerinnung. Hinzu kommt, daß die Trennung von Blutserum und Blutgerinnsel selbst bei Verwendung dieser Beschleuniger der Blutgerinnung zur Förderung der Blutgerinnung unvollständig ist, so daß es bei der Zentrifugation zum Erhalt des Serums der Nachteil einstellt, daß einige Komponenten des Blutgerinnsels in das Serum eingemischt werden.
  • Ein weiteres Problem entsteht, wenn das Serum aus dem Blut von Patienten gewonnen wird, die eine Hämodialyse erhalten oder Unregelmäßigkeiten bei der Blutgerinnung aufweisen. Derartigen Patienten wird Heparin zur Verhinderung der Bildung von Blutgerinnseln verabreicht, so daß bei ihnen 1-20 Einheiten Heparin auf 10 ml Blut gefunden werden. Dieses Heparin bindet in ihrem Blut mit Antithrombin III und führt zu einer stark ausgeprägten Hemmung der Effekte von Thrombin. Es wird davon ausgegangen, daß das Heparin ferner die Wirkungen von Blutgerinnungsfaktoren einschließlich des Faktors XII inhibiert. Aus diesem Grunde wird Fibrinogen nicht in Fibrin umgewandelt, weshalb das Blut nicht gerinnt. Selbst wenn man die oben genannten Beschleuniger der Blutgerinnung hinzugibt, kommt es nicht zu einer tatsächlichen Gerinnung des Blutes, so daß es schwierig ist, das Serum zu erhalten.
  • Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben in der offengelegten japanischen Patentveröffentlichung Nr. 60-115 519 vorgeschlagen, daß eine organische cyclische Verbindung der folgenden allgemeinen Formel benachbarte Carbonylgruppen in der Struktur aufweist, die im wesentlichen in derselben Ebene liegen und sich als Beschleuniger der Aktivität von Hydrolase eignet, die als Beschleuniger der Blutgerinnung eingesetzt werden kann.
  • (in der A den Rest der cyclischen Verbindung bezeichnet).
  • Für die oben genannten Verbindungen werden beispielsweise oxidiertes Alkylgallat, oxidierte Ellagsäure etc. genannt. Diese Verbindungen aktivieren den Blutgerinnungsfaktor XII auf nichtenzymatische Weise und ermöglichen eine Blutgerinnung in relativ kurzer Zeit. Die Wirkung ist stärker als diejenige, die unter Verwendung herkömmlicher Beschleuniger der Blutgerinnung erzielt wird. Die Erfinder haben ferner einen Beschleuniger der Blutgerinnung vorgeschlagen, in dem diese Verbindungen der Hauptbestandteil sind, oder in dem diesen Verbindungen verschiedene Additive' zugesetzt sind. Beispielsweise sind bereits Anmeldungen eingereicht worden, für einen Beschleuniger der Blutgerinnung, der Proteinhydrolase als Co-Beschleuniger zur weiteren Förderung der Blutgerinnung enthält (offengelegte japanische Patentveröffentlichung Nr. 60-174 952), und für einen Beschleuniger der Blutgerinnung, der eine Heparin neutralisierende Substanz einschließt, damit das Heparin im Blut von Heparin erhaltenden Patienten neutralisiert wird (offengelegte japanische Patentveröffentlichung Nr. 60-27 858).
  • Es ist möglich, als Proteinhydrolasen für die Beschleunigung der Blutgerinnung sämtliche Arten von Proteasen einschließlich Trypsin, Thrombin und Cathepsin B einzusetzen. Diese Proteinhydrolasen dienen der Beschleunigung der Aktivierung der im Blut befindlichen Blutgerinnungsfaktoren, so daß das Blut schnell gerinnt. Als die oben genannten Substanzen zur Neutralisierung von Heparin können Verbindungen mit Aminsalzen und/oder einem quartären Stickstoff einschließlich Alkylamin-Hydrochlorid verwendet werden. Mit einem Beschleuniger der Blutgerinnung, der derartige Verbindungen einschließt, werden die oben genannten Aminsalze etc. vom Heparin adsorbiert und führen im Wege der Neutralisierung zur Inaktivierung des Heparins. Darüber hinaus aktivieren die Verbindungen mit der Struktur der Formel I den Blutgerinnungsfaktor XII im Blut, so daß die Blutgerinnung in kurzer Zeit erfolgen kann.
  • Wie oben ausgeführt, ist es durch Verwendung eines Beschleunigers der Blutgerinnung, der Verbindungen der in der Formel I dargestellten Struktur als Hauptbestandteil enthält, nunmehr möglich, Serum aus Blut zu erhalten, das entweder gesunden Personen oder Heparin erhaltenden Patienten entnommen worden ist und innerhalb kurzer Zeit geronnen ist. Hinsichtlich der ermittelten Zeit für die Blutgerinnung bestehen keine größeren Abweichungen. Die Verbindungen der Struktur gemäß Formel I interagieren jedoch wechselseitig mit einigen Blutbestandteilen und beeinflussen die aus klinischen Untersuchungen erhaltenen Daten, so daß die Verwendung der Verbindungen als Hauptbestandteil eines Beschleunigers der Blutgerinnung eingeschränkt werden muß.
  • JP 6 027 858 offenbart die Verwendung von cyclischen Diketonen zur Vereinfachung der Bluttrennung, und in JP 60 186 760 wird die Inkorporation eines spezifischen Oxalatsalzes in das Serum zur Beschleunigung der Blutgerinnung vorgeschlagen.
  • Ferner sind Komplexe zwischen Metallionen und organischen Molekülen bekannt.
  • US-A-3 177 237 offenbart Silicium- und Germaniumchelate von Tropolonen. US-A-3 093 659 offenbart Halokojinsäure-Metallkomplexe zur Verwendung als antifungale und insektizide Agenzien. EP-A-159 917 offenbart pharmazeutische Zusammensetzungen, die einen Hydroxypyron-Eisenkomplex enthalten. US-A-3 647 842 offenbart ein Verfahren zur Stabilisierung von Cobaltcarbonylverbindungen durch Sauerstoff-zähnige Liganden. J. Am. Chem. Soc. 1982, 104, 1555-1566 beschreibt O-Benzosemichinon und dessen Metallchelate. Chem. Abs. Vol. 91, 1979, Seite 620, Abstract Nr. 123856V, beschreibt seitlich gebundene Ketonkomplexe von Platinum. Chem. Abs. Vol. 98, 1983, Seite 644, Abstract Nr. 53598f, offenbart Basiskomplexe von 2-Indolinonen, und Chem. Abs. Vol. 76, 1972, Seite 508, Abstract Nr. 127110k, beschreibt Reaktionen von Hexacarbonylen der Metalle der Gruppe VI.
  • Keine dieser Veröffentlichungen betrifft jedoch die Verwendung eines Metallkomplexes einer organischen cyclischen Verbindung mit benachbarten Carbonylgruppen zur Verwendung als ein Beschleuniger einer Hydrolase.
  • Erfindungsgemäß wird die Verwendung eines Metallkomplexes bereitgestellt, welcher als einen Liganden eine organische cyclische Verbindung der Formel (I)
  • in der A ein Rest der 5 oder 6 Kohlenstoffatome enthaltenden organischen cyclischen Verbindung ist,
  • und die organische cyclische Verbindung benachbarte Carbonylgruppen aufweist, die im wesentlichen in derselben Ebene liegen, und ein Metall umfaßt, das kein Alkalimetall ist, wobei das Metall in der Lage ist, mit den Carbonylgruppen der organischen cyclischen Verbindung eine koordinative Bindung auszubilden, als ein Beschleuniger der Aktivität einer Hydrolase.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Hydrolase Serinprotease.
  • Nach einer bevorzugten Ausführungsform ist die Hydrolase der Blutgerinnungsfaktor XII.
  • Der erfindungsgemäße Beschleuniger der Blutgerinnung enthält den oben genannten Beschleuniger der Hydrolaseaktivität.
  • Nach einer bevorzugten Ausführungsform enthält der Beschleuniger der Blutgerinnung ferner Hydrolase als ein Co-Beschleuniger, wobei die Hydrolase ein Enzym ist, welches die Bindung zwischen Arg und jedwedem Aminosäurerest und/oder die Bindung zwischen Lys und jedwedem Aminosäurerest einer Peptidkette hydrolysieren kann.
  • Nach einer bevorzugten Ausführungsform ist die in dem Beschleuniger der Blutgerinnung enthaltene Hydrolase mindestens eine ausgewählt aus Serinprotease, Thiolprotease und Metallprotease.
  • Nach einer bevorzugten Ausführungsform schließt der Beschleuniger der Blutgerinnung ferner eine organische Verbindung ein, die ein Aminsalz und/oder einen quartären Stickstoff aufweist.
  • Nach einer bevorzugten Ausführungsform schließt der Beschleuniger der Blutgerinnung ferner ein antifibrinolytisches Agens und/oder ein Antiplasminagens ein.
  • Aus diesen Gründen ermöglicht es die hier offenbarte Erfindung, (1) einen Beschleuniger der Aktivität von Hydrolase bereitzustellen, der ein ausgezeichneter Beschleuniger der Blutgerinnung sein kann, (2) einen oben genannten Beschleuniger der Aktivität von Hydrolase bereitzustellen, der leicht hergestellt und aufbereitet werden kann, (3) einen Beschleuniger der Aktivität von Hydrolase bereitzustellen, der aufgrund seiner relativen Stabilität gegenüber Hitze lange Zeit aufbewahrt werden kann, (4) einen Beschleuniger der Blutgerinnung bereitzustellen, der den Beschleuniger der Hydrolaseaktivität einschließt und die Blutgerinnung innerhalb kurzer Zeit fördert, (5) einen Beschleuniger der Blutgerinnung bereitzustellen, der zu einer guten Trennung von Serum und Blutgerinnsel führt und die Trennung von Serum und Blutgerinnsel in hoher Ausbeute erbringt, (6) einen Beschleuniger der Blutgerinnung bereitzustellen, der das Serum nicht verändert, so daß das Serum eingesetzt werden kann für jede Art einer biochemischen und klinischen Untersuchung zum jederzeitigen Erhalt von genauen und verläßlichen Ergebnissen, (7) einen Beschleuniger der Blutgerinnung bereitzustellen, der die schnelle Blutgerinnung fördert, selbst wenn das Blut Heparin enthält, und mit dem selbst nach der Gerinnung eine Stabilität und auch eine gute Trennung des Serums geschaffen wird.
    • Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
  • Die in der nachfolgenden Formel I dargestellten Verbindungen, die ein Ligand der koordinativen Bindung oder des Metallkomplexes sind (d. h. der erfindungsgemäße Beschleuniger der Aktivität von Hydrolase), können homocyclische Verbindungen oder heterocyclische Verbindungen sein. Ferner können sie monocyclische oder polycyclische Verbindungen sein.
  • (in der A den Rest der cyclischen Verbindung bezeichnet).
  • Von diesen cyclischen Verbindungen wird ein sechsgliedriger Ring oder ein fünfgliedriger Ring bevorzugt, der die beiden in Formel I dargestellten Carbonylgruppen enthält.
  • Unter den homocyclischen Verbindungen ist der bevorzugte sechszählige Ring eine Verbindung mit einem o-Chinon, nachfolgend dargestellt in der allgemeinen Formel II:
  • (in der R&sub1;, R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; unabhängig voneinander Wasserstoff, ein Kohlenwasserstoff, eine polare Gruppe oder ein Rest einer polycyclischen Verbindung sind).
  • Die Formel II ist nicht auf Kohlenwasserstoffe beschränkt, und Alkylgruppen und insbesondere Alkylgruppen mit 1 bis 18 Kohlenstoffatomen sind bevorzugt. Beispiele für die polare Substitutionsgruppe sind Carboxylgruppen, Carbonsäureester, Hydroxylgruppen, Aminosäuren, Mercaptogruppen etc., wobei sie aber nicht darauf beschränkt sind. Als Verbindung, die einen o-Chinonring aufweist, können o-Chinon und andere Verbindungen nach den folgenden Formeln III - VII genannt werden:
  • Oxidiertes Alkylgallat
  • (in der R&sub5; Alkyl ist).
  • Partiell oxidierte Ellagsäure
  • Vollständig oxidierte Ellagsäure
  • Partiell oxidiertes 1,4-Di-(3,4-dihydroxyphenyl)-2,3-dimethylbutan
  • Vollständig oxidiertes 1,4-Di-(3,4-dihydroxyphenyl)-2,3-dimethylbutan
  • Als bevorzugtes Beispiel für die zu den homocyclischen Verbindungen zählenden Verbindungen mit fünfzähligem Ring wird das in der folgenden Formel VIII dargestellte 1,2,3-Triketohydroinden genannt.
  • Als heterocyclische Verbindungen werden z. B. die nachfolgend dargestellten Verbindungen (IX) genannt.
  • (in der R&sub6; Wasserstoff oder Kohlenwasserstoff oder ein Rest einer polycyclischen Verbindung ist, und R&sub7; und R&sub8; unabhängig voneinander Wasserstoff, eine polare Gruppe oder einen Rest einer polycyclischen Verbindung bezeichnen. Der Kohlenwasserstoff und die polare Gruppe sind wie in der Formel II definiert).
  • Als ein bevorzugtes Beispiel der in der Formel (IX) dargestellten Verbindungen wird z. B. das nachfolgend dargestellte Isatin genannt.
  • Die den Komplex bildenden Metalle sind keine Alkalimetalle, die o,o-Liganden aufweisen. Da der Umgang mit Fe, Co, Ni, Al etc. enthaltenden Komplexen besonders einfach ist, sind sie bevorzugt. Der Metallkomplex, der der erfindungsgemäße Beschleuniger der Aktivität von Hydrolase ist, kann erhalten werden durch Zugabe einer Salzlösung, die die oben genannten Metallionen enthält, zu einer Verbindung I, die zum oben genannten Liganden wird. Beispielsweise ist es durch Zugabe einer wäßrigen Lösung von Hydrochlorid, Sulfat etc., allein oder durch Zugabe einer Mischung dieser wäßrigen Lösungen möglich, den Metallkomplex als Reaktionsprodukt zu erhalten. Dieses Reaktionsprodukt wird als ein Präzipitat gewonnen, wenn der pH-Wert der Lösung in geeigneter Weise eingestellt wird, und es ist ebenfalls möglich, das Reaktionsprodukt in Form einer Lösung zu verwenden. Beispielsweise kann ein oxidiertes Propylgallat-Eisenkomplex erhalten werden aus einer Mischung einer oxidiertes Propylgallat enthaltenden Lösung mit einer Lösung von Eisenchlorid. In einem derartigen Metallkomplex kann ein Ligand vorliegen, der eine oder mehrere Arten von Halogenradikalen, Schwefelsäurerest, Salpetersäurerest und Ammoniumrest enthält. Wasser kann ebenfalls als ein Ligand eingeschlossen sein.
  • Der erfindungsgemäße Beschleuniger der Blutgerinnung kann eine andere Hydrolase als ein Co-Beschleuniger enthalten, die von dem oben genannten Beschleuniger der Aktivität der Hydrolase verschieden ist. Diese Hydrolase ist eine Protease, die die Bindung zwischen Arg und jedwedem Aminosäurerest oder die Bindung zwischen Lys und jedwedem Aminosäurerest einer Peptidkette hydrolysieren kann. Als eine derartige Protease bieten sich beispielsweise Serinproteasen wie Trypsin, Thrombin, Thrombin-artige Enzyme aus Schlangengift, etc., sowie Thiolproteasen wie Cathepsin B und Ficin, etc., und Metallproteasen an, wie Kinase I, etc. Insbesondere sind Serinproteasen zur Verwendung geeignet. Diese allein verwendeten Proteasen dienen der Beschleunigung der Blutgerinnung, und wenn sie zusammen als ein Co-Beschleuniger mit dem oben genannten Beschleuniger (Metallkomplex) der Aktivität von Hydrolase verwendet werden, verläuft die Aktivierung der Blutgerinnung sogar noch viel schneller.
  • Wenn die oben genannte Hydrolase eingeschlossen ist, wird sie im Verhältnis von 10&supmin;²-10&supmin;&sup7; Gewichtsteilen des Enzyms (10¹- 10¹&sup0; Einheiten) zu 100 Gewichtsteilen des Metallkomplexes eingeschlossen. Selbst wenn eine zu geringe Enzymmenge eingeschlossen ist, wird die Blutgerinnung beschleunigt, wenn ein Metallkomplex anwesend ist, jedoch sind die Effekte sehr viel kleiner im Vergleich zur Bereitstellung des Enzyms in den oben genannten Proportionen; wenn ein Überschuß vorhanden ist, werden die Effekte im Vergleich mit denjenigen, die mit den oben genannten Proportionen erhalten werden, nicht erzielt.
  • Ferner kann in dem erfindungsgemäßen Beschleuniger der Blutgerinnung eine organische Verbindung vorliegen, die Aminsalze und/ oder einen quartären Stickstoff einschließt. Diese Verbindungen führen durch deren Adsorption von Heparin zu dessen Neutralisierung und werden als Mittel zur Neutralisierung von Heparin verwendet. Als die Aminsalze bildende Amine sind primäre, sekundäre und tertiäre Amine akzeptabel, und die Säure in der Struktur des Aminsalzes kann entweder eine anorganische Säure oder eine organische Säure sein. Als anorganische Säure können Halogenwasserstoffsäuren, Schwefelsäure, schweflige Säure, etc. verwendet werden, und als organische Säure kommen Ameisensäure, Essigsäure, etc. in Betracht. Gewöhnlich ist der organische Rest eines Aminsalzes eine Alkylgruppe, aber er kann auch eine Kohlenwasserstoffgruppe einschließlich eines unterschiedlichen Elements wie einer Iminogruppe, Ethergruppe oder dergleichen sein. Das Aminsalz kann auch ein intramolekulares Salz sein.
  • Als bevorzugtes Beispiel für die Aminsalze sind diese beispielsweise Hexadecyldimethylamin-Hydrochlorid und Tetradecyldi-(aminoethyl)-glycin.
  • Ein Beispiel für eine organische Verbindung mit einem quartären Stickstoff ist das Tetraalkylammoniumion. Es ist auch akzeptabel, daß die Verbindung eine Kohlenwasserstoffgruppe aufweist, die ein anderes Element wie eine Iminogruppe, Ethergruppe, etc. enthält, oder daß sie anstelle einer Alkylgruppe eine Allylgruppe aufweist. Als bevorzugtes Beispiel wird das in der folgenden Formel XIII dargestellte Dodecyltrimethylammoniumchlorid genannt.
  • Zusätzlich zu diesen chemischen Verbindungen mit relativ geringem Molekulargewicht ist es ebenfalls möglich, organische Polymere zu verwenden, die einen quartären Stickstoff aufweisen. Als ein derartiges Polymer kann das nachfolgend in der allgemeinen Formel XIV dargestellte Polykation mit einer sich wiederholenden Einheit genannt werden.
  • (in der R&sub9; - R&sub1;&sub2; Wasserstoff oder eine Alkylgruppe, X eine Halogengruppe oder ein Säurerest, und Y eine Alkylengruppe oder eine Alkylengruppe-SO&sub2;- sind, und die oben genannte Einheit 5-2000 mal wiederholt ist).
  • Von den Verbindungen der Formel XIV sind Polykationen mit sich wiederholenden Einheiten wie solche gemäß Formel XV und XVI besonders geeignet.
  • Wenn das oben genannte Heparin-neutralisierende Agens eingeschlossen wird, betragen die Proportionen 5-10.000 Gewichtsteile des neutralisierenden Agens zu 100 Gewichtsteilen des Metallkomplexes. Wenn keine genügende Menge des neutralisierenden Agens vorhanden ist, wird das Heparin im Falle des Vorliegens von Heparin im Blut nicht neutralisiert, so daß das Blut nicht gerinnen wird. Wenn eine zu große Menge des neutralisierenden Agens vorhanden ist, werden die Effekte im Vergleich mit denjenigen, die mit den oben genannten Verhältnissen erhalten werden, nicht erzielt.
  • Bei dem erfindungsgemäßen Beschleuniger der Blutgerinnung kann ein antifibrinolytisches Agens und/oder ein Antiplasminagens eingeschlossen sein. Die üblicherweise klinisch verwendeten Substanzen Aprotinin, Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor, ε-Aminocapronsäure, p-Aminomethylbenzoesäure, 4-(Aminomethyl)-cyclohexancarbonsäure, etc. können als antifibrinolytisches Agens und/oder als Antiplasminagens verwendet werden. Diese können unabhängig voneinander oder in Kombination eingesetzt werden. Beispielsweise werden Aprotinin im Verhältnis von etwa 100-600 KIU pro ml Blut, Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor im Verhältnis von etwa 500- 4.000 FU pro ml Blut, und ε-Aminocapronsäure, p-Aminomethylbenzoesäure und 4-(Aminomethyl)-cyclohexancarbonsäure im Verhältnis von etwa 10&supmin;²-10&supmin;&sup8; g pro ml Blut im Beschleuniger der Blutgerinnung verwendet.
  • Der erfindungsgemäße Beschleuniger der Blutgerinnung wird in Verhältnissen im Bereich von 1·10&supmin;¹&sup0; bis 1·10&supmin;¹ g pro ml Blut eingesetzt. Wenn das Verhältnis zu klein ist, werden die Effekte der Beschleunigung der Blutgerinnung nicht erzielt. Im Falle eines Überschusses entsprechen die Ergebnisse nicht dem Verhältnis der eingesetzten Menge.
  • Wenn der erfindungsgemäße Beschleuniger der Blutgerinnung verwendet wird, können die das zu untersuchende Blut enthaltenden Röhrchen entweder aus Glas oder aus Harz beschaffen sein. Der Beschleuniger der Blutgerinnung kann dem Blut zugesetzt werden, nachdem es in das Röhrchen überführt wurde, oder er kann bereits in dem zu verwendenden Röhrchen vor der Zugabe von Blut vorhanden sein. Der Beschleuniger der Blutgerinnung kann in Form eines Pulvers vorliegen, und er kann ferner vorher in einem geeigneten Lösungsmittel gelöst werden. Wenn der Beschleuniger der Blutgerinnung in Form eines Pulvers oder einer Lösung von hoher Konzentration eingesetzt wird, und wenn ein Teil des Blutes in Kontakt mit dem Blutgerinnungs-Beschleuniger in einer hohen Konzentration gerät, so daß die Gefahr besteht, daß die Proteine des Blutes denaturiert werden können, sollte der Beschleuniger der Blutgerinnung auf einer Trägersubstanz vorliegen, die einen großen spezifischen Oberflächenbereich aufweist.
  • Für die auf diese Weise eingesetzte Trägersubstanz gibt es keine speziellen Beschränkungen unter der Voraussetzung, daß es zu keinen schädigenden Effekten auf die Ergebnisse der Blutuntersuchung kommt, und daß die Trägersubstanz einen großen spezifischen Oberflächenbereich aufweist. Beispielsweise sind ungewebte Tücher, Textilien, Harzkügelchen, etc. zur Verwendung geeignet. Um den Beschleuniger der Blutgerinnung auf einer derartigen Trägersubstanz zu halten, kann beispielsweise die Lösung oder Dispersion des Beschleunigers auf die Trägersubstanz aufgebracht werden, 'oder die Trägersubstanz kann in eine Lösung oder Dispersion des Beschleunigers eingetaucht werden, wonach sich die Trocknung anschließt. Zur Herstellung und Verwendung einer Dispersion des Beschleunigers der Blutgerinnung wird Wasser eingesetzt, das geeignete Hilfsagenzien wie Gummi Arabicum, etc. enthält, und diese kann lyophilisiert werden, wodurch ein Beschleuniger der Blutgerinnung erhalten wird, der von einer Trägersubstanz in partikelförmiger Form gehalten wird.
  • Der erfindungsgemäße Beschleuniger der Aktivität von Hydrolase ist ein Beschleuniger der Aktivität von Enzymen, die Proteine zersetzen, und ist insbesondere ein Beschleuniger von Serinprotease. Die Serinprotease weist die Fähigkeit auf, auf dem Wege der Hydrolyse die Bindung von Peptidketten zwischen Arg und jedwedem Aminosäurerest und auch die Bindung zwischen Lys und jedwedem Aminosäurerest zu spalten. Der erfindungsgemäße Beschleuniger der Aktivität von Hydrolase führt bei seiner Verwendung als ein Beschleuniger der Blutgerinnung zunächst zur Aktivierung des Faktors XII, welcher ein Typ eines Vorläufers der Serinprotease ist. Anschließend wird die Enzymreaktion des aktivierten Faktors XII weiter beschleunigt, und die anderen im Blut befindlichen Blutgerinnungsfaktoren werden ihrerseits aktiviert, so daß das Blut innerhalb kurzer Zeit gerinnt. Wenn in dem Beschleuniger der Blutgerinnung eine Serinprotease und/oder andere derartige Enzyme, die Proteine hydrolysieren, als Co- Beschleuniger vorhanden sind, wird die Aktivierung der Gerinnungsfaktoren in dem Blut weiter beschleunigt. Es wird davon ausgegangen, daß der in dem Beschleuniger der Blutgerinnung enthaltene Beschleuniger der Aktivität von Hydrolase die Reaktion dieser Proteine hydrolysierenden Enzyme beschleunigt. Im Ergebnis führt dies innerhalb kurzer Zeit zur Blutgerinnung.
  • Wenn in dem Beschleuniger der Blutgerinnung eine organische Verbindung enthalten ist, die ein Aminsalz oder einen quartären Stickstoff aufweist, kann dieser Beschleuniger der Blutgerinnung zur Gerinnung von Heparin enthaltendem Blut eingesetzt werden. Wenn ein derartiger Beschleuniger von Blut einem Blut zugegeben wird, welches Heparin enthält, wird das Heparin von der neutralisierenden Substanz des Aminsalzes, etc. adsorbiert, neutralisiert und präzipitiert, so daß die Hemmung von Thrombin und Faktor XII durch das Heparin eliminiert werden kann. Aus diesem Grund wird die normale Fähigkeit des Blutes zur Gerinnung wiederhergestellt. Zusätzlich besitzt ein in dem Beschleuniger der Blutgerinnung enthaltener Hydrolase Aktivitäts-Beschleuniger (Metallkomplex) die Fähigkeit, auf den im Blut befindlichen Faktor XII aktivierend zu wirken. Folglich gerinnt das Blut genau so schnell wie im Falle der Behandlung von normalem Blut.
  • Wenn zusätzlich zu den oben genannten Aminsalzen, etc. auch ein antifibrinolytisches Agens und/oder ein Antiplasminagens eingeschlossen ist, wird die Zersetzung des Fibrins durch Plasmin, welches sich gegenüber der Gerinnungsreaktion des Blutes kompetitiv verhält, inhibiert. Aus diesem Grund wird die Gerinnung des Blutes beschleunigt, und zusätzlich ist die Gerinnung nach ihrem Eintreten stabil.
  • In Abhängigkeit des in dem Beschleuniger der Blutgerinnung enthaltenen Metallkomplexes und der Verschiedenartigkeit der neutralisierenden Substanzen variieren die Menge an Beschleuniger der Blutgerinnung, das Material des verwendeten Röhrchens, die Menge an Heparin im Blut, und dergleichen, sowie die zur Blutgerinnung erforderliche Zeit. Wenn der Metallkomplex der einzige Hauptinhaltsstoff ist, und wenn ein aus einem synthetischen Harz hergestelltes Röhrchen verwendet wird, beträgt die erforderliche Zeit im allgemeinen etwa 20-30 Minuten; wenn eine Hydrolase als Co-Beschleuniger eingeschlossen wird, sind unter denselben Bedingungen etwa 3-7 Minuten erforderlich. Wenn Heparin enthaltendes Blut behandelt wird, nimmt eine Gerinnung unter denselben Bedingungen etwa 20-40 Minuten in Anspruch.
  • Wie oben ausgeführt, ist es durch Verwendung des erfindungsgemäßen Beschleunigers der Blutgerinnung möglich, innerhalb kurzer Zeit sowohl normales Blut als auch Heparin enthaltendes Blut zu gerinnen. Das Blutgerinnsel aggregiert in ausreichender Weise und der Effekt auf die Trennung von Serum und Blutgerinnsel ist ausgezeichnet. Folglich vermischt sich das Blutgerinnsel bei Erhalt des Serums nicht mit dem Serum, und es ist möglich, Serum in hoher Ausbeute zu erhalten.
  • Die den Hauptbestandteil des erfindungsgemäßen Beschleunigers der Blutgerinnung bildende Verbindung ist ein Metallkomplex, weshalb die Stabilität gegenüber Hitze im Vergleich mit der organischen cyclischen Verbindung I, die in den von den Erfindern bereits offenbarten Beschleuniger der Blutgerinnung eingeschlossen ist, sogar noch größer ist. Demgemäß wird die Funktion des erfindungsgemäßen Beschleunigers der Blutgerinnung nicht vermindert, selbst wenn er einer Behandlung wie Sterilisation in einem Autoklaven, etc. unterzogen wird. Es ist ebenfalls möglich, diesen Beschleuniger in zufriedenstellender Weide für eine lange Zeitdauer zu lagern. Wenn die oben genannte organische cyclische Verbindung als Beschleuniger der Blutgerinnung eingesetzt wird, besteht die Gefahr der Veränderung einiger Serumkomponenten, aber die in dem erfindungsgemäßen Beschleuniger der Blutgerinnung eingeschlossene Verbindung reagiert nicht mit den Bestandteilen des Blutes, so daß genaue Untersuchungsergebnisse erhalten werden können.
    • Beispiel 1-1
  • Zunächst wurden 50 ul einer physiologischen Kochsalzdispersionsflüssigkeit enthaltend einen oxidiertes n-Propylgallat-Eisenkomplex (Beschleuniger der Blutgerinnung) in einer Konzentration von 0,1 Gew.-% in ein handelsübliches Röhrchen aus Polymethylmethacrylat gegeben, und anschließend wurden 5 ml frisch entnommenes menschliches Blut zugegeben, und das Röhrchen wurde bei 23ºC stehengelassen. Der Zeitpunkt, zu dem das Blutgerinnsel sich zu bilden begann und zu dem Serum in Erscheinung trat, wurde als Zeit der Blutgerinnung definiert. Sobald Serum in Erscheinung trat, wurde die Probe in eine Zentrifuge überführt und 5 Minuten lang mit 1000·g zentrifugiert. Der Effekt der Trennung des Serums wurde mit dem Auge beobachtet. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. Die Ergebnisse aus den Beispielen 1-2 bis 1-8 und aus den Vergleichsbeispielen 1-1 und 1-2 sind ebenfalls in Tabelle 1 dargestellt.
    • Beispiel 1-2
  • Ein Eisenkomplex von oxidierter Ellagsäure (eine Verbindung mit der Struktur gemäß Formel V) wurde als Beschleuniger der Blutgerinnung eingesetzt. Die anderen Bedingungen entsprachen den in Beispiel 1-1 angegebenen.
    • Beispiel 1-3
  • Ein Eisenkomplex von 1,2,3-Triketohydroinden wurde als Beschleuniger der Blutgerinnung eingesetzt. Die anderen Bedingungen entsprachen den in Beispiel 1-1 beschriebenen.
    • Beispiel 1-4
  • Ein Eisenkomplex von Isatin wurde als Beschleuniger der Blutgerinnung verwendet. Die anderen Bedingungen entsprachen den in Beispiel 1-1 beschriebenen.
    • Beispiel 1-5
  • Ein Eisenkomplex von oxidiertem 1,4-Di-(3,4-dihydroxyphenyl)- 2,3-methylbutan wurde als Beschleuniger der Blutgerinnung eingesetzt. Die anderen Bedingungen entsprachen den in Beispiel 1-1 angegebenen.
    • Beispiel 1-6
  • Ein Cobaltkomplex wurde anstelle eines Eisenkomplexes verwendet. Die anderen Bedingungen entsprachen den in Beispiel 1-2 angegebenen.
    • Beispiel 1-7
  • Anstelle eines Eisenkomplexes wurde ein Nickelkomplex verwendet. Die anderen Bedingungen entsprachen den in Beispiel 1-2 angegebenen.
    • Beispiel 1-8
  • Anstelle eines Eisenkomplexes wurde ein Aluminiumkomplex eingesetzt. Die anderen Bedingungen entsprachen den in Beispiel 1-2 angegebenen.
    • Vergleichsbeispiel 1-1
  • Der Beschleuniger der Blutgerinnung wurde nicht verwendet. Die anderen Bedingungen entsprachen den in Beispiel 1-1 angegebenen.
    • Vergleichsbeispiel 1-2
  • Ein gläsernes Röhrchen wurde verwendet, und der Beschleuniger der Blutgerinnung wurde nicht eingesetzt. Die anderen Bedingungen entsprachen den in Beispiel 1-1 beschriebenen. Tabelle 1 Beschleuniger der Aktivität von Hydrolase Zeit der Blutgerinnung (Minuten) Effekt der Trennung des Serums "Spitz" Beispiel oxidiertes n-Propylgallat-Eisenkomplex ausgezeichnet Polymethylmethacrylat oxidierte Ellagsäure-Eisenkomplex 1,2,3-Triketohydroinden-Eisenkomplex Isatin-Eisenkomplex oxidiertes 1,4-Di-(3,4-dihydroxyphenyl)-2,3-dimethylbutan-Eisenkomplex oxidierte Ellagsäure-Cobaltkomplex oxidierte Ellagsäure-Nickelkomplex oxidierte Ellagsäure-Aluminiumkomplex Vergleichsbeispiel
    • Beispiel 2 (1-1)
  • Es wurde eine physiologische Kochsalzlösungdispersionsflüssigkeit hergestellt, die einen Eisenkomplex von oxidierter Ellagsäure (einer Verbindung mit der Struktur gemäß Formel V) als ein Agens zur Aktivierung von Blutgerinnungsfaktoren (der Metallkomplex) und Trypsin als ein Co-Beschleuniger der Blutgerinnung in Konzentrationen von 0,5 Gew.-% bzw. 0,05 Gew.-% enthielt. Frisch entnommenes menschliches Blut (3 ml) wurde in ein handelsübliches glattes Röhrchen aus Polyethylen überführt, und 30 ul der oben beschriebenen Lösung des Beschleunigers der Blutgerinnung wurden hinzugegeben. Das glatte Röhrchen wurde bei Raumtemperatur stehengelassen, und die Zeitdauer wurde gemessen, innerhalb der das Blut seine Fließfähigkeit verlor, und als Zeit der Blutgerinnung definiert. Anschließend wurde die Probe nach Gerinnung 5 Minuten lang mit 3.000 UpM zentrifugiert, und der Effekt der Trennung des Serums wurde mit dem bloßen Auge bewertet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Die Ergebnisse der Beispiele 2 (1-2) bis 2 (4-3) sind ebenfalls in Tabelle 2 dargestellt.
    • Beispiel 2 (1-2)
  • Thrombin wurde als Hydrolase eines Co-Beschleunigers eingesetzt, und eine physiologische Kochsalzlösungdispersionsflüssigkeit des Beschleunigers der Blutgerinnung wurde so hergestellt, daß die Konzentration des Enzyms 500 Einheiten/ml betrug. Die anderen Bedingungen entsprachen denen von Beispiel 2 (1-1).
    • Beispiel 2 (1-3)
  • Als Hydrolase eines Co-Beschleunigers wurde Thrombin-artiges Enzym aus Schlangengift eingesetzt, und eine physiologische Kochsalzlösungdispersionsflüssigkeit des Beschleunigers der Blutgerinnung wurde so hergestellt, daß die Konzentration des Enzyms 0,005 Gew.-% betrug. Die anderen Bedingungen entsprachen denen von Beispiel 2 (1-1).
    • Beispiel 2 (2-1)
  • Als metallischer Komplex wurde ein Eisenkomplex von 1,2,3-Triketohydroinden verwendet. Die anderen Bedingungen entsprachen den in Beispiel 2 (1-1) angegebenen.
    • Beispiel 2 (2-2)
  • Als metallischer Komplex wurde ein Eisenkomplex von 1,2,3-Triketohydroinden verwendet. Die anderen Bedingungen entsprachen den in Beispiel 2 (1-2) dargelegten.
    • Beispiel 2 (2-3)
  • Als metallischer Komplex wurde ein Eisenkomplex von 1,2,3-Triketohydroinden verwendet. Die anderen Bedingungen entsprachen den in Beispiel 2 (1-3) dargelegten.
    • Beispiel 2 (3-1)
  • Als metallischer Komplex wurde ein Eisenkomplex von oxidiertem n-Propylgallat verwendet. Die anderen Bedingungen entsprachen den in Beispiel 2 (1-1) dargelegten.
    • Beispiel 2 (3-2)
  • Als metallischer Komplex wurde ein Eisenkomplex von oxidiertem n-Propylgallat verwendet. Die anderen Bedingungen entsprachen den in Beispiel 2 (1-2) dargelegten.
    • Beispiel 2 (3-3)
  • Als metallischer Komplex wurde ein Eisenkomplex von oxidiertem n-Propylgallat eingesetzt. Die anderen Bedingungen entsprachen den in Beispiel 2 (1-3) beschriebenen.
    • Beispiel 2 (4-1)
  • Als metallischer Komplex wurde ein Eisenkomplex von Isatin verwendet. Die anderen Bedingungen entsprachen den in Beispiel 2 (1-1) dargelegten.
    • Beispiel 2 (4-2)
  • Als metallischer Komplex wurde ein Eisenkomplex von Isatin eingesetzt. Die anderen Bedingungen entsprachen den in Beispiel 2 (1-2) dargelegten.
    • Beispiel 2 (4-3)
  • Als metallischer Komplex wurde ein Eisenkomplex von Isatin verwendet. Die anderen Bedingungen entsprachen den in Beispiel 2 (1-3) dargelegten.
    • Beispiel 2 (5-1)
  • Als metallischer Komplex wurde ein Cobaltkomplex von oxidierter Ellagsäure (eine Verbindung mit der Struktur gemäß Formel V) verwendet. Die anderen Bedingungen entsprachen den in Beispiel 2 (1-1) beschriebenen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt. Die Ergebnisse aus den Beispielen 2 (5-2) bis 2 (7-3) sind ebenfalls in Tabelle 3 dargestellt.
    • Beispiel 2 (5-2)
  • Als metallischer Komplex wurde ein Cobaltkomplex von oxidierter Ellagsäure (eine Verbindung mit der Struktur gemäß Formel V) verwendet. Die anderen Bedingungen entsprachen den in Beispiel 2 (1-2) dargelegten.
    • Beispiel 2 (5-3)
  • Als metallischer Komplex wurde ein Cobaltkomplex von oxidierter Ellagsäure (eine Verbindung mit der Struktur gemäß Formel V) verwendet. Die anderen Bedingungen entsprachen den in Beispiel 2 (1-3) dargelegten.
    • Beispiel 2 (6-1)
  • Als metallischer Komplex wurde ein Nickelkomplex von oxidierter Ellagsäure (eine Verbindung mit der Struktur gemäß Formel V) verwendet. Die anderen Bedingungen entsprachen den in Beispiel 2 (1-1) dargelegten.
    • Beispiel 2 (6-2)
  • Als metallischer Komplex wurde ein Nickelkomplex von oxidierter Ellagsäure (eine Verbindung mit der Struktur gemäß Formel V) verwendet. Die anderen Bedingungen entsprachen den in Beispiel 2 (1-2) dargelegten.
    • Beispiel 2 (6-3)
  • Als metallischer Komplex wurde ein Nickelkomplex von oxidierter Ellagsäure (eine Verbindung mit der Struktur gemäß Formel V) verwendet. Die anderen Bedingungen entsprachen den in Beispiel 2 (1-3) dargelegten.
    • Beispiel 2 (7-1)
  • Als metallischer Komplex wurde ein Aluminiumkomplex von oxidierter Ellagsäure (eine Verbindung mit der Struktur gemäß Formel V) verwendet. Die anderen Bedingungen entsprachen den in Beispiel 2 (1-1) dargelegten.
    • Beispiel 2 (7-2)
  • Als metallischer Komplex wurde ein Aluminiumkomplex von oxidierter Ellagsäure (eine Verbindung mit der Struktur gemäß Formel V) verwendet. Die anderen Bedingungen entsprachen den in Beispiel 2 (1-2) dargelegten.
    • Beispiel 2 (7-3)
  • Als metallischer Komplex wurde ein Aluminiumkomplex von oxidierter Ellagsäure (eine Verbindung mit der Struktur gemäß Formel V) verwendet. Die anderen Bedingungen entsprachen den in Beispiel 2 (1-3) dargelegten.
    • Vergleichsbeispiel 2-1
  • Als Beschleuniger der Blutgerinnung wurde Trypsin alleine verwendet. Die anderen Bedingungen entsprachen den in Beispiel 2 (1-1) dargelegten.
    • Vergleichsbeispiel 2-2
  • Als Beschleuniger der Blutgerinnung wurde Thrombin alleine verwendet. Die anderen Bedingungen entsprachen den in Beispiel 2 (1-2) dargelegten.
    • Vergleichsbeispiel 2-3
  • Als Beschleuniger der Blutgerinnung wurden Thrombin-artige Enzyme aus Schlangengift alleine verwendet. Die anderen Bedingungen entsprachen den in Beispiel 2 (1-3) dargelegten.
    • Vergleichsbeispiel 2-4
  • Der Beschleuniger der Blutgerinnung wurde nicht eingesetzt. Die anderen Bedingungen entsprachen den in Beispiel 2 (1-1) dargelegten.
    • Vergleichsbeispiel 2-5
  • Der Beschleuniger der Blutgerinnung wurde nicht verwendet, und es wurde ein "Glas-Spitz" verwendet. Die anderen Bedingungen entsprachen den in Beispiel 2 (1-1) dargelegten. Tabelle 2 Metallkomplex Hydrolase Zeit der Blutgerinnung (Minuten) Effekt der Trennung des Serums "Spitz" Beispiel oxidierte Ellagsäure (V)-Eisenkomplex Trypsin ausgezeichnet Polyethylen Thrombin Thrombin-artiges Enzym aus Schlangengift 1,2,3-Triketohydroinden-Eisenkomplex oxidiertes n-Propylgallat-Eisenkomplex Isatin-Eisenkomplex Tabelle 3 Metallkomplex Hydrolase Zeit der Blutgerinnung (Minuten) Effekt der Trennung des Serums "Spitz" Beispiel oxidierte Ellagsäure (V)-Cobaltkomplex Trypsin ausgezeichnet Polyethylen Thrombin Thrombin-artiges Enzym aus Schlangengift oxidierte Ellagsäure (V)-Nickelkomplex oxidierte Ellagsäure (V)-Aluminiumkomplex Tabelle 4 Metallkomplex Hydrolase Zeit der Blutgerinnung (Minuten) Effekt der Trennung des Serums "Spitz" Vergleichsbeispiel Trypsin ausgezeichnet Polyethylen Thrombin Thrombin-artiges Enzym aus Schlangengift freie Blutzellen beobachtet Überstand enthielt Fibrin Glas
    • Beispiel 3-1
  • Zuerst wurde eine wäßrige Dispersionsflüssigkeit enthaltend einen Eisenkomplex von oxidierter Ellagsäure (eine Verbindung mit der Struktur gemäß Formel V) und ein Polykation (eine Verbindung mit der Struktur gemäß Formel XVI) hergestellt. Ein nicht-gewebtes Tuch aus Polyacetat wurde anschließend mit der Dispersion imprägniert und gründlich getrocknet. Auf jedem Quadratzentimeter des nicht-gewebten Tuches befanden sich 10&supmin;&sup4; g von jeder der beiden obigen Komponenten.
  • Anschließend wurden 8 ml frisch entnommenen menschlichen Blutes, welches Heparin in einer Konzentration von 2 Einheiten/ml enthielt, in ein handelsübliches 10 ml Röhrchen aus Polyethylen injiziert, und es wurde ein Quadratzentimeter des ungewebten Tuches, welches die oben genannten Inhaltsstoffe trug, zugegeben, und es wurde vorsichtig geschüttelt, bevor man das Röhrchen bei 20ºC stehenließ. Die Zeitdauer, in der das Blut seine Fließfähigkeit verlor, wurde als Zeit der Blutgerinnung definiert.
  • Sobald das Blut geronnen war, wurde es 5 Minuten lang mit 3000 UpM zentrifugiert. Anschließend wurde der Effekt der Trennung des Serums mit dem Auge bewertet. Das Serum wurde erhalten durch Verwendung einer Pipette, und sein Volumen wurde als Serumausbeute festgesetzt. Diese Ergebnisse sind in Tabelle 5 dargestellt. Die Ergebnisse der Beispiele 3-2 bis 3-10 und des Vergleichsbeispiels 3 sind ebenfalls in Tabelle 5 dargestellt.
    • Beispiel 3-2
  • Es wurde eine physiologische Kochsalzlösungdispersionsflüssigkeit enthaltend oxidiertes n-Propylgallat-Eisenkomplex und Tetradecyldi-(aminoethyl)-glycin in Konzentrationen von 0,5 bzw. 0,2 Gew.-% hergestellt.
  • In ein handelsübliches 10 ml Röhrchen aus Polyethylen wurden 8 ml frisch entnommenen menschlichen Blutes injiziert, das 2 Einheiten Heparin pro ml enthielt, und anschließend wurden 80 ul der oben genannten Dispersionsflüssigkeit zugegeben. Die weitere Behandlung entsprach der in Beispiel 3-1 angegebenen, und die Ergebnisse wurden bewertet.
    • Beispiel 3-3
  • Zuerst wurden 1 g des Eisenkomplexes von Isatin, 0,4 g Hexadecyldimethylamin-Hydrochlorid und 1 kg Polystyrol-Kügelchen mit einem mittleren Durchmesser von 1,5 mm als Trägersubstanz gut vermischt mit einem kleinen Volumen Ethanol als Dispersionshilfsmittel. Die Mischung wurde anschließend getrocknet. In 1 g der den Beschleuniger der Blutgerinnung tragenden partikelförmigen Substanz befanden sich 10&supmin;³ g Eisenkomplex von Isatin und 0,4 · 10&supmin;³ g Hexadecyldimethylamin-Hydrochlorid.
  • In ein handelsübliches 10 ml Röhrchen aus Polyethylen wurden 8 ml frisch entnommenen menschlichen Blutes injiziert, welches 2 Einheiten Heparin pro ml enthielt, und anschließend wurde 1 g der den Beschleuniger der Blutgerinnung tragenden oben genannten partikelförmigen Substanz hinzugegeben. Die Probe wurde wie in Beispiel 3-1 beschrieben behandelt und anschließend bewertet.
    • Beispiel 3-4
  • Ein Eisenkomplex von o-Chinon und ein Polykation (eine Verbindung mit der Struktur gemäß Formel XV) wurden anstelle des Eisenkomplexes von oxidiertem n-Propylgallat und Tetradecyldi- (aminoethyl)-glycin eingesetzt. Der Eisenkomplex von o-Chinon und das Polykation wurden verwendet in einer Konzentration von 0,5 bzw. 0,4 Gew.-%. Die weiteren Bedingungen entsprachen denen des Beispiels 3-2.
    • Beispiel 3-5
  • Ein Eisenkomplex von 1,2,3-Triketohydroinden und ein Polykation (eine Verbindung mit der Struktur gemäß Formel XVI) wurden anstelle des Eisenkomplexes von oxidiertem n-Propylgallat bzw. Tetradecyldi-(aminoethyl)-glycin verwendet. Die anderen Bedingungen entsprachen denen des Beispiels 3-2.
    • Beispiel 3-6
  • Anstelle des Tetradecyldi-(aminoethyl)-glycins wurde Dodecyltrimethylammoniumchlorid verwendet. Die anderen Bedingungen entsprachen denen des Beispiels 3-2.
    • Beispiel 3-7
  • Ein Eisenkomplex von oxidiertem 1,4-Di-(3,4-dihydroxyphenyl)- 2,3-dimethylbutan und ein Polykation (eine Verbindung mit der Struktur gemäß Formel XV) wurden anstelle des Eisenkomplexes von oxidiertem n-Propylgallat und Tetradecyldi-(aminoethyl)-glycin verwendet. Die anderen Bedingungen entsprachen denen des Beispiels 3-2.
    • Beispiel 3-8
  • Ein Cobaltkomplex von oxidierter Ellagsäure (V) und ein Polykation (eine Verbindung mit der Struktur gemäß Formel XV) wurden anstelle des Eisenkomplexes von oxidiertem n-Propylgallat und Tetradecyldi-(aminoethyl)-glycin verwendet. Die anderen Bedingungen entsprachen denen des Beispiels 3-2.
    • Beispiel 3-9
  • Ein Nickelkomplex von Ellagsäure (V) und ein Polykation (eine Verbindung mit der Struktur gemäß Formel XV) wurden anstelle des Eisenkomplexes von oxidiertem n-Propylgallat und Tetradecyldi- (aminoethyl)-glycin verwendet. Die anderen Bedingungen entsprachen denen des Beispiels 3-2.
    • Beispiel 3-10
  • Ein Aluminiumkomplex von Ellagsäure (V) und ein Polykation (eine Verbindung mit der Struktur gemäß Formel XV) wurden anstelle des Eisenkomplexes von oxidiertem n-Propylgallat und Tetradecyldi- (aminoethyl)-glycin verwendet. Die weiteren Bedingungen entsprachen denen des Beispiels 3-2.
    • Vergleichsbeispiel 3
  • In ein handelsübliches 10 ml Röhrchen aus Polyethylen wurden 8 ml frisch entnommenen menschlichen Blutes injiziert, welches 2 Einheiten Heparin pro ml enthielt, und anschließend wurde dieselbe Behandlung wie in Beispiel 3-1 jedoch ohne Zugabe des Beschleunigers der Blutgerinnung durchgeführt, und die Ergebnisse wurden bewertet. Tabelle 5 Beschleuniger der Aktivität von Hydrolase Metallkomplex Neutralisierungsmittel Zeit der Blutgerinnung (Minuten) Effekt der Trennung des Serums Serumausbeute (ml) Beispiel oxidierte Ellagsäure (V)-Eisenkomplex Polykation (XVI) ausgezeichnet oxidiertes n-Propylgallat-Eisenkomplex Tetradecyldi-(aminoethyl)-glycin Isatin-Eisenkomplex Hexadecyldimethylamin-Hydrochlorid o-Chinon-Eisenkomplex 1,2,3-Triketohydroinden-Eisenkomplex oxidiertes n-Propylgallat-Eisenkomplex oxidiertes 1,4-Di-(3,4-hydroxyphenyl)-2,3-dimethylbutan-Eisenkomplex oxidierte Ellagsäure (V)-Cobaltkomplex oxidierte Ellagsäure (V)-Nickelkomplex oxidierte Ellagsäure (V)-Aluminiumkomplex nicht geronnen Trennung des Plasmas
    • Beispiel 4-1
  • Ein ungewebtes Tuch aus Polyester wurde mit einer wäßrigen Dispersionsflüssigkeit enthaltend einen Eisenkomplex von oxidierter Ellagsäure (eine Verbindung mit der Struktur gemäß Formel V), ein Polykation (eine Verbindung mit der Struktur gemäß Formel XVI), und Aprotinin imprägniert und anschließend vollständig getrocknet. Pro Quadratzentimeter des ungewebten Tuches waren 4·10&supmin;&sup4; g des Eisenkomplexes, 4·10&supmin;&sup4; g des Polykations und 500 KIU Aprotinin vorhanden.
  • In ein handelsübliches 5 ml Röhrchen aus Polyethylen wurden 2 ml frisch entnommenen menschlichen Blutes injiziert, welches 1,0 IU Heparin pro ml enthielt, und anschließend wurde 1 cm² des ungewebten Tuches mit den darauf befindlichen oben genannten Inhaltsstoffen zugegeben, und es wurde vorsichtig gerührt und bei 20ºC stehengelassen. Eine Stunde später oder 30 Stunden später wurde das Serum gesammelt, und das Fibrin und Fibrinogenabbauprodukt (FDP) wurden analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 dargestellt. Es bestand kein Unterschied in den Ergebnissen der Analyse von FDP nach einer Stunde oder 30 Stunden, was darauf hinweist, daß die Zersetzungsreaktion des Blutgerinnsels inhibiert war. Die Ergebnisse der Beispiele 4-2 bis 4-10 und des Vergleichsbeispiels 4 sind ebenfalls in Tabelle 6 dargestellt.
    • Beispiel 4-2
  • Eine Dispersion physiologischer Kochsalzlösung wurde so hergestellt, daß die Konzentration von oxidiertem n-Propylgallat 0,5 Gew.-% und die von Tetradecyldi-(aminoethyl)-glycin 0,5 Gew.-% und die von Aprotinin 10.000 KIU/ml betrugen.
  • In ein handelsübliches 5 ml Röhrchen aus Polyethylen wurden 2 ml frisch entnommenen menschlichen Blutes injiziert, das 1,0 IU Heparin enthielt, und anschließend wurden 50 ul der oben genannten Dispersionsflüssigkeit zugegeben. Nachfolgend wurde die Probe wie in Beispiel 4-1 behandelt, und die Ergebnisse wurden bewertet.
    • Beispiel 4-3
  • Zuerst wurden 1 g Isatin, 0,4 g Hexadecyldimethylamin-Hydrochlorid, 50 mg 4-(Aminomethyl)-cyclohexancarbonsäure und 1 kg Polystyrol-Kügelchen mit einem mittleren Durchmesser von 1,5 mm als Trägersubstanz mit einer kleinen Menge von Ethanol als Dispersionshilfsmittel gründlich miteinander vermischt und getrocknet.
  • In ein handelsübliches 5 ml Röhrchen aus Polyethylen wurden 2 ml frisch entnommenen menschlichen Blutes injiziert, das 1,0 IU Heparin pro ml enthielt. Anschließend wurden 0,3 g des oben beschriebenen Beschleunigers der Blutgerinnung hinzugegeben. Dann wurde die Probe wie in Beispiel 4-1 behandelt, und die Ergebnisse wurden bewertet.
    • Beispiel 4-4
  • Ein Eisenkomplex von o-Chinon, ein Polykation (eine Verbindung mit der Struktur gemäß Formel XV) und e-Aminocapronsäure wurden anstelle des Eisenkomplexes von oxidiertem n-Propylgallat, Tetradecyl-(aminoethyl)-glycin und Aprotinin verwendet. Der Eisenkomplex von o-Chinon, das Polykation und die ε-Aminocapronsäure wurden in Konzentrationen von 0,5 Gew.-%, 0,5 Gew.-% bzw. 0,1 Gew.-% verwendet. Die weiteren Bedingungen entsprachen denen des Beispiels 4-2.
    • Beispiel 4-5
  • Ein Eisenkomplex von 1,2,3-Triketohydroinden, ein Polykation (eine Verbindung mit der Struktur gemäß Formel XVI) und ε-Aminocapronsäure wurden anstelle des Eisenkomplexes von oxidiertem n- Propylgallat, Tetradecyl-(aminoethyl)-glycin und Aprotinin verwendet. Die weiteren Bedingungen entsprachen denen des Beispiels 4-2.
    • Beispiel 4-6
  • Dodecyltrimethylammoniumchlorid wurde anstelle des Tetradecyldi- (aminoethyl)-glycins verwendet. Die weiteren Bedingungen entsprachen denen des Beispiels 4-2.
    • Beispiel 4-7
  • Ein oxidierter Eisenkomplex von 1,4-Di-(3,4-dihydroxyphenyl)- 2,3-dimethylbutan und ein Polykation (eine Verbindung mit der Struktur gemäß Formel XV) wurden verwendet anstelle des Eisenkomplexes von oxidiertem n-Propylgallat und Tetradecyl(di-(aminoethyl)-glycin. Die weiteren Bedingungen entsprachen denen des Beispiels 4-2.
    • Beispiel 4-8
  • Ein Cobaltkomplex von oxidierter Ellagsäure (V) und ein Polykation (eine Verbindung mit der Struktur gemäß Formel XV) wurden anstelle des Eisenkomplexes von oxidiertem n-Propylgallat und Tetradecyldi-(aminoethyl)-glycin verwendet. Die weiteren Bedingungen entsprachen denen des Beispiels 4-2.
    • Beispiel 4-9
  • Ein Nickelkomplex von oxidierter Ellagsäure (V) und ein Polykation (eine Verbindung mit der Struktur gemäß Formel XV) wurden verwendet anstelle des Eisenkomplexes von oxidiertem n-Propylgallat und Tetradecyldi-(aminoethyl)-glycin. Die weiteren Bedingungen entsprachen denen des Beispiels 4-2.
    • Beispiel 4-10
  • Ein Aluminiumkomplex von oxidierter Ellagsäure (V) und ein Polykation (eine Verbindung mit der Struktur gemäß Formel XV) wurden verwendet anstelle des Eisenkomplexes von oxidiertem n-Propylgallat und Tetradecyldi-(aminoethyl)-glycin. Die weiteren Bedingungen entsprachen denen des Beispiels 4-2. Tabelle 6 Beschleuniger der Aktivität von Hydrolase Metallkomplex Neutralisierungsmittel Antifibrinolytisches Agens Ergebnisse der Analyse von FDP nach 1 Stunde Beispiel oxidierte Ellagsäure (V)-Eisenkomplex Polykation (XVI) Aprotinin 2,5 ug/ml oder weniger oxidiertes n-Propylgallat-Eisenkomplex Tetradecyldi-(aminoethyl)-glycin Isatin-Eisenkomplex Hexadecyldimethylamin-Hydrochlorid Aminomethylcyclohexancarbonsäure o-Chinon-eisenkomplex Polykation (XV) ε-Aminocapronsäure 1,2,3-Triketohydroinden-Eisenkomplex oxidiertes n-Propylgallat-Eisenkomplex Dodecyltrimethylammoniumchlorid oxidiertes 1,4-Di-(3,4-hydroxyphenyl)-2,3-dimethylbutan-Eisenkomplex oxidierte Ellagsäure (V)-Cobaltkomplex oxidierte Ellagsäure (V)-Nickelkomplex oxidierte ellagsäure (V)-Aluminiumkomplex
    • Beispiel 4-11
  • Sämtliche der in den Beispielen 4-1 bis 4-10 beschriebenen Beschleuniger der Blutgerinnung wurden hergestellt. Jeder Beschleuniger wurde in ein Röhrchen zur Blutsammlung überführt, und anschließend wurde frisch entnommenes menschliches Blut, das Heparin enthielt, in das Röhrchen injiziert. Die Röhrchen wurden vorsichtig geschüttelt und bei 20ºC stehengelassen. Anschließend wurde bei den Proben die Zeit gemessen, die verstrichen war, bis das Vollblut seine Fließfähigkeit verloren hatte. Das bedeutet, daß die Zeit der Blutgerinnung gemessen wurde. In sämtlichen Beispielen war das Blut innerhalb von 35 bis 40 Minuten geronnen. Nachdem das Blut geronnen war, wurden die Proben sofort 5 Minuten lang mit 3000 UpM zentrifugiert, und der Effekt der Trennung des Serums wurde mit dem Auge bewertet. Die Sammlung des Serums mittels einer Pipette wurde ebenfalls untersucht. In sämtlichen Beispielen waren der Effekt auf die Trennung von Serum und die Ausbeute an Serum exzellent.
    • Beispiel 5-1
  • Zuerst wurden 50 ul einer physiologischen Kochsalzlösungdispersionsflüssigkeit enthaltend einen Eisenkomplex von oxidierter Ellagsäure (eine Verbindung mit der Struktur gemäß Formel V) in einer Konzentration von 0,1 Gew.-% in ein handelsübliches Röhrchen aus Polymethylmethacrylat überführt, und anschließend wurden 5 ml frisch entnommenen menschlichen Blutes hinzugegeben, und das Röhrchen wurde bei 23ºC stehengelassen. Nach Abschluß der Blutgerinnung wurde die Probe 5 Minuten lang mit 1000·g zentrifugiert, um das Serum vom Blutgerinnsel zu trennen. Anschließend wurden die in dem abgetrennten Serum vorhandene Harnsäure (UA), die Phospholipide (PL) und die Triglyceride (TG) gemessen, wobei die Ergebnisse in Tabelle 7 dargestellt sind. Die Ergebnisse der nachfolgend dargelegten Vergleichsbeispiele 5-1 und 5-2 sind ebenfalls in Tabelle 7 dargestellt.
    • Vergleichsbeispiel 5-1
  • Dieses Beispiel entspricht dem Beispiel 5-1 mit der Abweichung, daß als Beschleuniger der Blutgerinnung oxidierte Ellagsäure gemäß Formel V eingesetzt wurde.
    • Vergleichsbeispiel 5-2
  • Dieses Beispiel entspricht dem Beispiel 5-1 mit der Abweichung, daß die Dispersionsflüssigkeit des Beschleunigers der Blutgerinnung nicht eingesetzt wurde.
  • Ein Vergleich mit dem Vergleichsbeispiel 5-2, Tabelle 7, weist darauf hin, daß UA, PL und TG in dem aus Beispiel 5-1 erhaltenen Serum, bei dem ein Metallkomplex als Beschleuniger der Blutgerinnung verwendet wurde, genau gemessen werden können, wohingegen die Gehalte an UA, PL und TG in dem Serum, das aus dem Vergleichsbeispiel 5-1 erhalten wurde, bei dem oxidierte Ellagsäure verwendet wurde, die nicht einen Metallkomplex ausbildet, nicht genau gemessen werden können (die Gehalte an UA, PL und TG im Serum dieses Vergleichsbeispiels sind nämlich niedriger als diejenigen an UA, PL und TG im Serum aus dem Vergleichsbeispiel 5-2). Diese Tatsachen bedeuten, daß der Beschleuniger der Blutgerinnung des Vergleichsbeispiels 5-1 die Analyse der Gehalte der oben genannten Komponenten im Serum in dramatischer Weise beeinflußt. Tabelle 7 Beispiel Vergleichsbeispiel
    • Beispiel 6
  • Zuerst wurden 5 ml einer wäßrigen Dispersionsflüssigkeit enthaltend einen Eisenkomplex (ein Beschleuniger der Blutgerinnung) von oxidierter Ellagsäure (eine Verbindung gemäß Formel V) in einer Konzentration von 0,1 Gew.-% in ein Röhrchen aus Hartglas überführt, welches anschließend eine Stunde lang unter einem Druck von 2 Atmosphären bei 121ºC hitzebehandelt wurde. Der Beschleuniger der Blutgerinnung wurde weder vor noch nach einer derartigen Behandlung in einem Autoklaven denaturiert.
    • Vergleichsbeispiel 6
  • Zuerst wurden 5 ml einer wäßrigen Dispersionsflüssigkeit enthaltend oxidierte Ellagsäure (eine Verbindung gemäß Formel V) in einer Konzentration von 0,1 Gew.-% in ein Röhrchen aus Hartglas überführt, welches anschließend in derselben Weise wie in Beispiel 6 autoklaviert wurde. Die oxidierte Ellagsäure, welche vor der Behandlung in dem Autoklaven schwärzlich-braun war, wurde nach der Behandlung in dem Autoklaven gelblich-weiß. Darüber hinaus wurde das Oxid wasserlöslich, was darauf hindeutet, daß das Oxid denaturiert war.

Claims (14)

1. Verwendung eines Metallkomplexes, welcher als einen Liganden eine organische cyclische Verbindung der Formel
in der A ein Rest der 5 oder 6 Kohlenstoffatome enthaltenden organischen cyclischen Verbindung ist,
und die organische cyclische Verbindung benachbarte Carbonylgruppen aufweist, die im wesentlichen in derselben Ebene liegen,
und ein Metall umfaßt, das kein Alkalimetall ist, wobei das Metall in der Lage ist, mit den Carbonylgruppen der organischen cyclischen Verbindung eine koordinative Bindung aus zubilden,
als ein Beschleuniger der Aktivität einer Hydrolase.
2. Verwendung eines Metallkomplexes nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die organische cyclische Verbindung a)
in der R&sub1;, R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; unabhängig voneinander Wasserstoff, ein Kohlenwasserstoff, eine polare Gruppe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Carboxylgruppe, einer Carbonsäureestergruppe, einer Hydroxylgruppe, einem Aminosäurerest, und einer Mercaptogruppe, oder ein Rest einer polycyclischen Verbindung sind,
b)
oder
c)
ist, in der R&sub6; Wasserstoff, ein Kohlenwasserstoff, oder ein Rest einer polycyclischen Verbindung ist, und R&sub7; und R&sub8; unabhängig voneinander Wasserstoff, eine polare Gruppe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Carboxylgruppe, einem Aminosäurerest, und einer Mercaptogruppe oder ein Rest einer polycyclischen Verbindung sind.
3. Verwendung eines Metallkomplexes nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Metall in diesem Metallkomplex aus der Gruppe bestehend aus Fe, Ni, Co und Al ausgewählt wird.
4. Verwendung eines Metallkomplexes nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Hydrolase Serinprotease ist.
5. Verwendung eines Metallkomplexes nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Serinprotease der Blutgerinnungsfaktor XII ist.
6. Verwendung eines Metallkomplexes nach den Ansprüchen 1, 2 oder 3 als Beschleuniger der Blutgerinnung.
7. Beschleuniger der Blutgerinnung, dadurch gekennzeichnet, daß er einen Metallkomplex gemäß Anspruch 1, 2 oder 3 zusammen mit Hydrolase als ein Co-Beschleuniger enthält, wobei die Hydrolase ein Enzym ist, welches die Bindung zwischen Arg und jedwedem Aminosäurerest hydrolysieren und/oder die Bindung zwischen Lys und jedwedem Aminosäurerest einer Peptidkette hydrolysieren kann.
8. Beschleuniger der Blutgerinnung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Hydrolase mindestens eine ausgewählt aus Serinprotease, Thiolprotease und Metallprotease ist.
9. Beschleuniger der Blutgerinnung nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß er ferner eine organische Verbindung einschließt, die ein Aminsalz und/oder einen quartären Stickstoff aufweist, welche die Fähigkeit zur Neutralisierung von Heparin besitzt.
10. Beschleuniger der Blutgerinnung nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß er ferner ein antifibrinolytisches Agens und/oder ein Antiplasminagens einschließt.
11. Beschleuniger der Blutgerinnung umfassend einen Metallkomplex gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er ferner ein anitfibrinolytisches Agens und/oder ein Antiplasminagens und/oder eine organische Verbindung einschließt, die ein Aminsalz und/oder einen quartären Stickstoff aufweist, welche die Eigenschaft besitzt, Heparin zu neutralisieren.
12. Verfahren zur Gerinnung einer Blutprobe, dadurch gekennzeichnet, daß die Blutprobe der Wirkung eines Beschleunigers der Blutgerinnung gemäß einem der Ansprüche 7 bis 11 unterworfen wird.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Blutprobe mit dem Beschleuniger der Blutgerinnung kontaktiert wird, und daß der Beschleuniger in Form eines Pulvers oder in Form einer Lösung desselben in einem geeigneten Lösungsmittel vorliegt.
14. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Blutprobe mit einem inerten Träger mit einem großen Oberflächenbereich kontaktiert wird, von dem der Beschleuniger der Blutgerinnung getragen wird.
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