DE3125181A1

DE3125181A1 - Verfahren zur herstellung von limulus-lysat

Info

Publication number: DE3125181A1
Application number: DE19813125181
Authority: DE
Inventors: Roxane N. 63141 Creve Coeur Mo. Dikeman
Original assignee: Mallinckrodt Inc
Current assignee: Lonza Walkersville Inc
Priority date: 1980-06-27
Filing date: 1981-06-26
Publication date: 1982-03-04
Also published as: NL192139C; DE3125181C2; GB2080524A; NL192139B; SE8104016L; AU7232181A; NL8103113A; FR2485740B1; FR2485740A1; IT1211070B; US4322217A; IT8122595A0; AU545395B2; GB2080524B; SE447029B; CH647871A5

Description

Die Erfindung betrifft^ ein Verfahren zur Verbesserung der Empfindlichkeit von Limulusamoebocyten-Lysat (nachfolgend manchmal als LAL oder Lysat bezeichnet) gegenüber -Endotoxin, ein verbessertes LAL-Reagenz und die Verwendung dieses LAL-Reagenz.

Bekanntlich ist der LAL-Test zur Feststellung von Endotoxinen vielleicht der praktischste und empfindlichste Test zur Endotoxin-Bestimmung. Tests mit handelsüblicher Prüfsubstanz verwenden Amoebocyten-Lysat aus Limulus-Hämolymphe, die man aus Hufeisenkrabben erhält. Dieses Lysat bildet zusammen mit geeigneten zweiwertigen Kationen, geeigneten Puffern und anderen Bestandteilen ein LAL-Reagenz. Dieses Reagenz reagiert dann während der Untersuchung mit dem Endotoxin unter Bildung eines Gels. Hersteller von LAL-Reagentien haben bei der Herstellung von Lysat der gewünschten Empfindlichkeit für die Endotoxin-Bestimmung oft Schwierigkeiten. Die Empfindlichkeit ist auch von einer Herstellung zur nächsten veränderlich. Diese Probleme werden wenigstens zum Teil der Anwesenheit einer endogenen Undefinierten Endotoxin-Inhibitor-Substanz in dem Lysat (nachfolgend manchmal als Inhibitor bezeichnet) zugeschrieben.

über die Natur des Inhibitors oder seine in-vivo-Funktion in der Hufeisenkrabbe ist wenig bekannt. Elektrophoretische Studien zeigen, daß der Inhibitor ein hochmolekulares Lipoprotein ist. Er kann in der Amoebocyte die Funktion haben, die Abwehrreaktion gegen Koagulation zu steuern. Es ist auch plausibel, daß der Inhibitor ein Membranbestandteil ist, der bei der ZeI!zerstörung freigesetzt wird. Die Ungewissheit über die Rolle und die Herkunft des Inhibitors ist verbunden mit der Tatsache, daß der Inhibitionsmechanismus unklar ist. Vermutlich

blockiert der Inhibitor die enzymatische Reaktion in irgendeiner Weise, entweder durch Assoziation mit dem Enzym selbst oder mit dem Endotoxin oder mit beiden Stoffen. Es ist anzunehmen, daß das Progerinnungsenzym wie einige andere Serin-Proteasen mit Calcium und Glycerophospholipid komplex gebunden wird. Endotoxin ist selbst lipoid; daher wäre ein Inhibitor mit Lipoprotein-Charakter mit beiden Komponenten in hohem Maße verträglich.

Dafür, daß der Inhibitor ein Lipoprotein ist, spricht seine Empfindlichkeit gegenüber Chloroform. Wie in der US-PS 4 107 077 beschrieben ist, wird die Empfindlichkeit von LAL wesentlich verbessert., wenn man das Lysat mit einem organischen Lösungsmittel, wie etwa Chloroform, behandelt, um den Inhibitor aus dem Lysat auszufällen. Die wässrige Phase wird dann gewonnen und zur Herstellung des LAL-Reagenz aufgearbeitet.

Bisher ist das oben erwähnte Lösungsmittelextraktionsverfahren die schnellste Methode_s um die LAL-Empfindlichkeit zu.verbessern. Unglücklicherweise hat die Methode mehrere Nachteile. Wegen der unabdingbaren Notwendigkeit, bei der Lysat-Herstellung endotoxinfreie Bedingungen einzuhalten, erhöht sich durch ein umfangreiches Extraktionsverfahren und die anschließende Zentrifugierung die Wahrscheinlichkeit von Produktmängeln. Wie in der Patentschrift bemerkt ist," verringert die Lösungsmittelbehandlung die Beständigkeit des Lysats, so daß die Herstellung in der Kälte schnell zuende geführt werden muß. Der durch die Lösungsmittelbehandlung aus dem Lysat entfernte Niederschlag enthält ferner viel Koagulogen, das erforderliche Gerinnungsprotein. Die Einhaltung eines geeigneten Proteingehaltes ist eine Voraus-

Setzung für die Bildung eines festen Gels während der Prüfung auf Endotoxin. Offensichtlich ist unter diesen Umständen die Überwachung der Empfindlichkeit des Reagenz schwierig. Chloroform, das mit dem meisten Erfolg benutzte Lösungsmittel, ist durch seine unerwünschten Wirkungen auf den Menschen bekannt. Die Gesundheit und Sicherheit des mit der Herstellung befassten Personals ist daher von beachtlicher Bedeutung. Es ist offensichtlich, daß ein Verfahren, das diese latenten Gefahren vermeidet und dabei doch die Empfindlichkeit im gewünschten Maße erhöht, eine Verbesserung auf diesem technischen Gebiet bringen würde.

Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur einfachen und schnellen Erhöhung der Empfindlichkeit des LAL zu schaffen.

Erfindungsgemäß wird ein Verfahren geschaffen, bei dem man unter Lysat-Behandlungsbedingungen LAL mit auf Grund der Anwesenheit eines endogenen Inhibitors herabgesetzter Endotoxin-Empfindlichkeit mit einer verstärkenden Menge eines die Lysat-Empfindlichkeit verstärkenden Mittels behandelt, um den Lysat-Inhibitor teilweise oder vollständig zu neutralisieren und dadurch die LAL-Empfindlichkeit gegenüber Endotoxin zu steigern.

Es gibt gewisse Mindestkriterien, die der Eigenschaft der Verstärkung der LAL-Empfindlichkeit zugrunde liegen. Dies bedeutet, daß die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren brauchbaren Mittel für die Erhöhung der LAL-Empfindlichkeit besitzen sollten (a) die Fähigkeit., die Lysat-Empfindlichkeit auf eine geeignete Empfindlichkeit zu steigern, z.B. auf das Zweifache oder mehr, (b) die Eigenschaft, der Depyro-

genierung, d.h. der Entfernung oder Zerstörung von Endotoxin, durch Ultrafiltration oder Säurebehandlung bei pH-Werten unter 5 oder alkalischer Behandlung bei pH-Werten oberhalb 8 standzuhalten, (c) die Sterilisierfähigkeit, z.B. durch Autoklavenbehandlung beispielsweise bei oder oberhalb 121 ⁹C bei 1,05 bar für einen Zeitraum von 15 Minuten, (d) die Fähigkeit zur Bildung wässriger Lösungen von etwa 2 % (Gewicht/ Volumen) bei 25 °C, (e) die Fähigkeit zur Funktion in dem pH-Bereich etwa von 6,0 bis etwa 9, (f) die Verträglichkeit mit Puffersubstanzen und anderen in dem LAL-Reagenz benutzten Bestandteilen, und (g) die Verträglichkeit mit bezug auf LAL und dessen Reaktion mit Endotoxinen,

Diese Verstärkungsmittel umfassen amphotere oberflächenaktive Mittel, die in ihrer Struktur eine anionische und eine kationische· Gruppe haben. Veranschaulicht werden diese Mittel durch die Sulfobetaine der folgenden Formel (nachfolgend Formal A):

0 R₉

R₃ Y worin R₁ ein Alkylenrest mit 1 bis etwa 4 Kohlenstoffatomen,

Y irgendein unschädlicher, chemisch geeigneter Substituent, wie (1) Wasserstoff und (2) substituiertes oder unsubstituiertes niederes Alkyl mit beispielsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, wie Methyl, Äthyl, Propyl oder Hydroxy, usw., bedeuten,

R2 und R₃ ausgewählt sind unter substituiertem oder unsubstituiertem niederen Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, wie z.B. Methyl Äthyl, Propyl, Hydroxymethyl, Hydroxyäthyl, Hydroxypropyl, usw.,

η = 0 oder 1,

R» substituiertes oder unsubstituiertes Alkyl mit beispielsweise

etwa 8 bis etwa 18 Kohlenstoffatomen, wenn η = 0, und einen Alkylenrest mit etwa 1 bis etwa 6 Kohlenstoffatomen, wenn η = 1, und

Rc ein substituiertes oder unsubstituiertes Alkyl mit beispielsweise etwa 8 bis etwa 18 Kohlenstoffatomen bedeuten.

Der Ausdruck "Alkylen", wie er hier benutzt wird, umfasst Polymethylenreste und andere zweiwertige gesättigte aliphatische Reste. Demzufolge kann in der durch den Alkylenrest gebildeten, verbindenden Gruppe eine Verzweigung vorliegen. Der Ausdruck "niederes" bedeutet einen Rest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen.

Die in den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung benutzten Sulfobetaine sind in der Technik bekannt und als zwitterionische, oberflächenaktive Mittel beschrieben worden. Die Herstellung dieser Verbindungen ist beispielsweise beschrieben von G. W. Fernley in JOURNAL OF AMERICAN OIL CHEMISTS SOCIETY, Januar 1978, Bd. 55, Seiten 98-103 und von R. Ernst In der US-PS 3 280 179, auf die hier bezug genommen wird.

Bei den bevorzugten oberflächenaktiven Sulfobetainen sind Rp und Ro in der obigen Struktur Methyl. Vorzugsweise bedeutet R₁ auch Propylen.

Ein Typ des oberflächenaktiven Sulfobetains, der verwendet werden kann, hat die obige Struktur, wobei η gleich O und R. ein Alkylrest mit etwa 8 bis 18 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise ein geradkettiger Alkylrest, sind. Bei diesen oberflächenaktiven Sulfobetainen ist

Talgfettalkohol ein geeigneter Ausgangsstoff für die R.-Komponente. Dieser Alkohol weist ein Gemisch verschiedener Kettenlängen auf, wobei eine typische Zusammensetzung etwa 66 % C₁₃, 30 % C^, 4 % G₅₄ und andere enthält. Eine andere geeignete Quelle ist der Mittelschnitt von destilliertem Kokosfettalkohol, der ebenfalls ein Gemisch verschiedener Kettenlängen aufweist, wobei eine typische Zusammensetzung bei etwa.6.6 % C."«,· , 9 % C₁₆ und 2 % C₁₀ liegt.

Spezifische oberflächenaktive Sulfobetaine der obigen Struktur, in der η gleich 0 ist, sind in der US-PS 3 539 521 angegeben, auf die hier bezug genommen wird. Ein besonders bevorzugtes oberflächenaktives Mittel dieses Typs ist N-Tetradecyl-NsN-dimethyl-3-ammonio-1-propansulfonat, das im Handel von der Calbiochem-Behring Corp. unter dem Warenzeichen ZWITTERGENT 3-14 erhältlich ist.

Ein anderer Typ der oberflächenaktiven Sulfobetaine, der benutzt werden kann, hat die oben genannte Struktur, in der η gleich und R₄ ein Alkylenrest mit etwa 1 bis etwa 6 Kohlenstoffatomen sind. In diesen Sulfobetainen mit η gleich 1 ist R₅ ein Alkylrest mit etwa 8 bis etwa 18 Kohlenstoffatomen. Vorzugsweise ist R₅ geradkettig. Wie oben erläutert, sind Talgfettalkohol und Kokosfettalkohol geeignete Ausgangsmaterialien für Alkylreste mit etwa 10 bis etwa 18 Kohlenstoffatomen. Spezifische oberflächenaktive Sulfobetaine der obigen Struktur mit η gleich 1 sind in der erwähnten US-PS 3 280 179 angegeben.

Besonders bevorzugte oberflächenaktive Sulfobetaine, die in den erfindungsgemäßen Zubereitungen verwendet werden können, sind

3-(N,N-Dimethyl-N-acyl amidopropylammonio)-2-hydroxypropan-1-sulfonate, τη denen sich die Acyl gruppe von Talgfettalkohol oder Kokosfettalkohol ableitet, wobei Kokosfettalkohol bevorzugt wird. Wie der Fachmann erkennt, ergibt sich bei der normalen Herstellung dieser Talgfett- oder Kokosfettalkoholderivate ein Gemisch von Sulfobetainen mit verschiedenen Kohlenstoffkettenlängen der Acyl gruppen. Wie oben erläutert, enthalten diese Fettalkohole größtenteils Kohlenstoffkettenlängen, die zu Acyl gruppen mit der gewünschten Zahl von Kohlenstoffatomen, d.h. von etwa 8 bis etwa 18 Kohlenstoffatomen, führen. Demzufolge sind diese aus Talg- oder Kokosfettalkoholen erhaltenen Gemische zur Herstellung des oberflächenaktiven Sulfobetains in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen brauchbar. Ein für den Einsatz in dem Gemisch der Erfindung besonders bevorzugtes Material dieser Art ist N-Kokosamido-propyl-NjN-dimethyl-N-Z-hydroxypropylsulfobetain, wofür ein Beispiel LONZAINE CS ist, das im Handel von Lonza, Inc., Fair Lawn, Mew Jersey, erhältlich ist. Ein anderes Beispiel hierfür ist VARION CAS, das im Handel von Sherex Chemical Company, Inc., erhältlich ist.

Andere amphotere oberflächenaktive Mittel sind u.a. N-Alkylaminocarbonsäuren mit langkettiger Alkylgruppe der Formel (nachfolgend als Formel B bezeichnet):

Rr-N-R₁-COOM, ' 5 , ,1

γ γ,

die N-Alkyliminodicarbonsäuren mit langkettiger Alkylgruppe der Formel (nachfolgend als Formel C bezeichnet):

R₅-N(R₁-COOM)₂

und die N-AIkyl- oder amidobetaine mit langkettiger Alkylgruppe der Formel (nachfolgend als Formel D bezeichnet):

0 R₂

(Rc-C-HN)-R₄-N^-R₁-COO⁹ ^ I I R₃ Y

worin R,, R₉, R₃₅ R«, Y- und η die gleiche Bedeutung wie in der Formel; A haben, M Wasserstoff oder salzbildendes Metall bedeutet und Y' die gleiche Bedegtung wie Y in Formel A hat. Y und Y¹ können gleich oder verschieden sein. Beispiele spezifischer amphoterer Detergentien sind N-Al kyl -ß-aminopropionsä'ure, N-Al kyl-ß-iminodipropionsäure und N-Al kyl -Ν,Ν-dimethylglycin. Die Alkylgruppe kann sich beispielsweise ableiten von Kokosfettalkohol, Laurylalkohol, Myristylalkohol (oder einem Gemisch aus Lauryl- und Myristylalkohol), hydriertem Talgalkohol, Cetyl al kohol _5> Stearylalkohol oder Mischungen dieser Alkohole. Die substituierten Aminopropion- und Iminodipropionsäuren werden oft in Form der Natrium- oder anderer Salze geliefert, die auch bei der praktischen Ausführung der Erfindung eingesetzt werden können. Besondere Beispiele sind u.a. Kokosbetain, das unter dem Namen EMCOL CC 37-18 von der Witco Chemical Corp. verkauft wird, Kokosamidopropylbetain, das unter dem Namen LONZAINE CO und VARION CADG von Lonza, Inc., bzw. Sherex Chemical Company verkauft wird, N-Kokos-ß-aminopropionsaures Natrium, das unter dem Namen DERIPHAT 151 von der Henkel Corp. verkauft wird, Dinatrium-Laurylß-iminodipropionat, das unter dem Namen DERIPHAT 160 von der Henkel Corp. verkauft wird, sowie Dinatrium-N-Talg-ß-iminodipropionat, das unter dem Namen DERIPHAT 154 von der Henkel Corp. verkauft wird.

Beispiele anderer amphoterer Detergentien sind die Fett-

imidazoline, wie jene, die durch Umsetzung einer langkettigen Fettsäure (z.B. mit 10 bis 20 Kohlenstoffatomen) mit Diäthylentriarnin und Monohalogencarbonsäuren mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen hergestellt werden, z.B. i-Kokos-B-hydroxyäthyl-S-carboxy-methylimidazo!in.

Spezifische Beispiele sind u.a. Kokosimidazolin, das im Handel unter dem Namen AMPHOTERGE K-2 von Lonza, Inc., erhältlich ist, Caprindicarboxyimidazolin, das im Handel unter dem Namen AMPHOTERGE KJ von Lonza, Inc., erhältlich ist, und Kokosdicarboxyimidazolin, das vermischt mit sulfatierten oberflächenaktiven Stoffen im Handel unter dem Namen AMPHOTERGE 2 WAS MOD von Lonza, Inc. erhältlich ist.

Andere Beispiele von Verstärkungsmitteln sind u.a. anionische synthetische oberflächenaktive Stoffe, die generell als Verbindungen beschrieben werden, die in ihrer Molekül struktur hydrophile und lipophile Gruppen enthalten und in einem wässrigen Medium unter Bildung von Anionen ionisieren, welche die lipophile Gruppe und die hydrophile Gruppe enthalten. Die Alkyl aryl sulfonate, die Alkansulfate und die sulfatierten oxyäthylierten Alkylphenole sind Beispiele des anionischen Typs oberflächenaktiver Verbindungen.

Die Alkyl aryl sulfonate sind eine Klasse synthetischer anionischer oberflächenaktiver Mittel, die durch die allgemeine Formel (nachfolgend als Formel E bezeichnet) repräsentiert wird:

(R_fi) -(Y)Ar-(SO-M)_n

U lh O Il ο

worin Rg ein gerad- oder verzweigtkettiger Kohlenwasserstoffrest mit

etwa 1 bis etwa 24 Kohlenstoffatomen, wobei wenigstens ein R_g wenigstens 8 Kohlenstoffatome aufweist, n, eine Zahl von 1 bis 3, n^ eine Zahl von 1 bis 2, Ar ein Phenyl- oder Naphthylrest sind und Y und M die gleiche Bedeutung wie in Formel B haben. R_g kann beispielsweise Methyl, Äthyl, Hexyl, Octyl, Tetraoctyl, iso-Octyl, Nonyl, Decyl ,Dodecyl, Octacecyl und dergl. sein·

Beispielhafte Verbindungen für Alkyl aryl sulfonate sind u.a. Natriumdodecylbenzolsulfonat, Natriumdecylbenzolsulfonat_s Ammoniummethyldodecylbenzolsulfonat, Ammoniumdodecylbenzolsulfonat, Natriumoctadecylbenzolsulfonat, Natriumnonylbenzolsulfonat, Natriumdodecylnaphtha!insu! fonat, Natriumhexadecylbenzolsulfonat, Kaiiumeikososylnaphtha!insu! fonat, Äthylaminundecylnaphthalinsulfonat und Natriumdocosy!naphtha!insu! fonat.

Die AlkyTsulfate sind eine Klasse synthetischer anionischer oberflächenaktiver Mittel, die durch die folgende allgemeine Formel (nachfolgend als Formel F bezeichnet) repräsentiert wird:

R₅OSO₃M,
worin R₅. und M die gleiche Bedegtung wie in Formel B haben.

Beispielhafte Verbindungen der ATkylsulfat-Klasse anionischer oberflächenaktiver Mittel sind ua. Natriumoctadecylsulfat, NatriumhexadecylsuTfat, Natriumdodecylsulfat, Natriumnonylsulfat, Ammoniumdecyl-SuIfat, Kaiiumtetradecy!sulfat, Diäthanolaminooctylsulfat, Triäthano.laminooctadecylsulfat und Ammoniumnonylsulfat.

Die sulfatierten oxyäthylierten Alkylphenole sind eine Klasse synthetischer anionischer oberflächenaktiver Mittel, die durch die folgende allgemeine Formel (nachfolgend als Formel G bezeichnet) repräsentiert wird:

^R5T V^A-(^CH2^CH2⁰⁾z~^CH2^CH2~^0SO2^M

worin A Sauerstoff, Schwefel, eine Carbonamid-Gruppe, eine Thiocarbonamid-Gruppe, eine Carboxylgruppe oder eine Thiocarbonsäureestergruppe und ζ eine ganze Zahl von 3 bis 8 bedeuten und Rr und M die gleiche Bedeutung wie in Formel B haben.

Beispielhafte Verbindungen aus der Klasse der sulfatierten oxyäthylierten Alkylphenole unter den anionischen oberflächenaktiven Mitteln sind u.a. Ammoniumnonylphenoxy-tetraäthylenoxysulfat, Natriumdodecylphenoxytri äthylenoxysulfat, Äthanol ami ndecylphenoxytetraäthylenoxysulfat und Kaliumoctylphenoxytriäthylenoxysulfat.

Andere Beispiele für LAL-Verstärkungsmittel sind u.a. nichtionische oberflächenaktive Verbindungen, die allgemein als Verbindungen beschrieben werden, die nicht ionisieren, aber durch eine Sauerstoff enthaltende Seitenkette, wie etwa Polyoxyäthylen, hydrophile Eigenschaften annehmen, und wobei der lipophile Teil des Moleküls von Fettsäuren, Phenol, Alkoholen, Amiden oder Aminen herrührt. Die Verbindungen werden gewöhnlich dadurch hergestellt, daß man ein Alkylenoxid, wie Äthylenoxid, Butylenoxid, Propylenoxid und dergl., mit Fettsäuren, gerad- oder verzweigtkettigen Alkoholen mit einer oder mehreren Hydroxylgruppen, Phenolen, Thiophenolen, Amiden und Aminen unter Bildung von Polyoxyalkylenglycoäthern und -estern, Polyoxyalkylenalkylphenolen, Polyoxyalkylenthio-

- 19 - " "■"'.■

phenolen, Polyoxyalkylenamiden und dergl. umsetzt. Im allgemeinen setzt man vorzugsweise etwa 3 bis etwa 30, insbesondere 10 bis 30_s Mole Alkylenoxid je Mol Fettsäure, Alkohol, Phenol, Thiophenol, Amid oder Ami η um.

Beispielhaft für diese nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittel sind die Produkte, die man erhält durch Umsetzung von Alkylenoxid mit einem aliphatischen Alkohol mit 8 bis 18 Kohlenstoffatomen, wie etwa Octyl-, Nonyl-, Decyl-, Octadecyl-, Dodecyl-, Tetradecylalkohol und dergl., mit Monoestern sechswertiger Alkohole, deren Estergruppe 10 bis 20 Kohlenstoffatome enthält, wie Sorbitanmonolaurat, Sorbitanmonooleat und Sorbitanmonopalmitat, mit einem Alkylphenol, in dem die Alkyl gruppe zwischen 4 und 20 Kohlenstoffatome enthält, wie Butyl-,
DibutyT·-, Amyl-, Octyl-, Dodecyl-, Tetradecyl- und dergl., sowie mit einem Alkylamin, in dem die ATkylgruppe 1 bis 8 Kohlenstoffatome enthält.

Beispielhafte Verbindungen synthetischer, nicht-ionischer Mittel sind u.a. die Produkte, die man durch Kondensation von Äthylenoxid oder Propylenoxid mit den folgenden Verbindungen erhält: Propylenglycol, Äthylendiamin, Diäthylenglycol, Dodecylphenol, Nonylphenol,
Tetradecylalkohol, N-Octadecyldiäthanolamid, N-Dodecylmonoäthanolamid, Polyoxyäthylen(20)-sorbitanmonool-eat, das unter dem Namen TWEEN 80
verkauft wird, sowie Polyoxyäthylen(20)-sorbitanmonolaurat₅ das unter dem Namen TWEEN 20 verkauft wird.

Andere nicht-ionische oberflächenaktive Mittel sind u>a, langkettige tertiäre Aminoxide entsprechend der folgenden allgemeinen Formel (nachfolgend als Formel H bezeichnet):

R_CR₇R_QN-»O
b / ο

worin Rr die gleiche Bedeutung wie in Formel A hat und R^ und Rg Methyloder Äthylreste bedeuten. Der Pfeil in der Formel ist die übliche Darstellung einer semipolaren Bindung. Beispiele von Aminoxiden, die für den Einsatz nach der Erfindung geeignet sind, sind u.a. Dimethyldodecylaminoxid, Dimethyloctylaminoxid, Dimethyldecylaminoxid, Dimethyltridecylaminoxid, Dimethylhexadecylaminoxid.

Kationische oberflächenaktive Mittel können ebenfalls als LAL-Verstärkungsmittel verwendet werden. Diese Mittel sind jene oberflächenaktiven Verbindungen, die eine organische hydrophobe Gruppe und eine kationische löslichmachende Gruppe enthalten. Typische kationische löslichmachende Gruppen sind Amin und quaternäre Gruppen. Diese kationischen oberflächenaktiven Mittel werden durch die folgende allgemeine Formel (nachfolgend als Formel I bezeichnet) dargestellt

R₅-C

CH.

CH

Y Y¹

worin Rg₃ Y und Y' die gleiche Bedeutung wie in Formel C haben. Ein Beispiel ist QUATERNARY 0, das von Ciba-Geigy Corp. erhältlich ist.

Andere Beispiele geeigneter synthetischer kationischer oberflächenaktiver Mittel sind die Diamine, wie etwa jene der Formel (nachfolgend als Formel J bezeichnet):

R₉NHC₂H₄NH₂

- 21 - -^:-- 'τ' ■--■■■-

worin R_g eine Alkyl gruppe mit etwa 12 bis 22 Kohlenstoffatomen bedeutet, wie z.B. N-2-Aminoäthylstearylamin und N-2-Aminoäthylmyristylamin, sowie amid-gebundene "Amine, wie jene der Formel (nachfolgend als Formel '< bezeichnet):

R₅CONHC₂H₄NH₃

wie z.B. N-2-Aminoäthylstearylamid und N-Aminoäthylmyristylamid, sowie ferner quaternäre Ammoniumverbindungen, bei denen im typischen Fall eine der an das Stickstoffatom gebundenen Gruppen eine Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen einschließlich solcher Alkylgruppen mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen und inerten Substituenten, wie Phenylgruppen, ist, und ein Anion, wie Halogenid, Acetat, Methylsulfat usw., anwesend ist. Typische quaternäre Ammoniumverbindungen sind Äthyl dimethylstearylammoniumchlorid, Benzyldimethylstearylammoniumchlorid, Benzy!dimethylstearylammoniumchlorid, TrimethyTstearylammmoniumchlorid, Trimethylcetylammoniumbromid, Dimethyläthyldilaurylammoniumchlorid, DimethylpropylmyristyTammoniumchlorid und die entsprechenden Methosulfate und Acetate.

Andere geeignete kationische oberflächenaktive Mittel werden durch die Formel (nachfolgend als Formle L bezeichnet) repräsentiert:

(CH₉CH₉O) H

c. C α

worin R₅ die gleiche Bedeutung wie in Formel A hat und jedes a eine ganze Zahl von 1 bis 15 ist. Ein Beispiel ist das Polyäthylenglycolamin des hydrierten Talgs, in dem Rj- den Talgrest darstellt und a+a einen mittleren Wert von 5 hat. Es ist erhältlich von der Ciba-Geigy Corp.

unter dem Handelsnamen BINA COBA 3001.

Wie oben erwähnt, wird das Lysat-Verstärkungsmittel in verstärkenden Mengen benutzt, d.h. ausreichenden Mengen, um den endogenen Endotoxin-Inhibitor in dem Lysat zu neutralisieren oder teilweise zu neutralisieren. Im allgemeinen ist dies eine Menge von etwa 0,001 bis 1,0 % (w/v), vorzugsweise von etwa 0,01 bis etwa 0,05 % (w/v), bezogen auf das Gesamtvolumen des Lysats. Häufig stören Mengen, die über eine verstärkende Menge hinausgehen, die Fähigkeit des LAL, während der Prüfung mit dem Endotoxin zu reagieren.

LAL kann durch die in der Technik bekannten Verfahren hergestellt werden, z.B. nach dem Verfahren der GB-PS 1 522 127, auf die hier bezug genommen wird.

Beispielsweise wird die Hämolymphe von gesunden Exemplaren des Limulus Polyphemus in einer gerinnungshemmenden Salzlösung gesammelt, wie allgemein von Levin und Bang in dem Aufsatz "Gerinnbares Protein im Limulus: Seine Lokalisierung und die Kinetik seiner Koagulation durch Endotoxin", Thromb. Diath. Haemorrh. JJ3 (1968) 186-197, beschrieben wurde. Die Amoebocyten werden gesammelt und mit der gerinnungshemmenden Salzlösung gewaschen, und die Amoebocyten werden durch Zentrifugieren von dem Antikoagulierungsmittel getrennt.

Die abgetrennten Amoebocyten werden in Wasser suspendiert, und die osmotische Zerstörung der Zellen wird durch mechanische Bewegung vervollständigt. Die Zellreste werden durch Zentrifugieren von dem Lysat abgetrennt, und die Lysat-Fraktionen werden vereinigt und

bei O bis 4 ⁰C aufbewahrt.

Zur Herstellung des LAL-Reagenz werden die vorerwähnten LAL-Fraktionen im allgemeinen auf einen geeigneten pH-Bereich, z.B. 5,5 bis 8,5, vorzugsweise 6,5 bis 7,5, mit einer geeigneten Puffersubstanz gepuffert. Geeignete Puffersubstanzen sind beispielsweise Tris(hydroxymethyl)aminomethan, Tris(hydroxymethyl)aminomethanmaleat, 1,4-Piperazindiäthansulfonsäure, Morpholinpropansulfonsäure, N-2-Hydroxyäthylpiperazin-N'-2-äthansulfonsäure, Triethanolamin, Imidazo! und Tris(hydroxymethyl)imidazol. Dann kann das LAL-Reagenz auf Serumampullen, die z.B. 1,2 oder 5,2 ml Lösung enthalten, verteilt und lyophilisiert werden. Normalerweise werden die Ampullen nach der Lyophilisierung abgedichtet und gekühlt (1 bis 5 ⁰C).

Die Empfindlichkeit des LAL-Reagenz gegenüber Endotoxin wird durch Zugabe niedriger Konzentrationen zweiwertiger und einwertiger Kationen weiter gesteigert. Calcium- und Manganionen sind die bevorzugten zweiwertigen Ionen, wenngleich andere Erdal kau ionen, wie Magnesium- und StrantiumTQnen oder andere zweiwertige Ionen eingesetzt werden können. Magnesium- und Strontiumionen sind ebenfalls bevorzugten zweiwertige Ionen. Natriumionen sind die bevorzugten einwertigen Ionen, jedoch können auch andere einwerige Ionen, insbesondere Alkalimetall ionen, wie Lithiumionen, eingesetzt werden. Die Chloride (CaCl₂₅ NaCl, usw.) sind geeignete Quellen für diese Ionenzusätze, wenngleich auch andere Salze verwendet werden können. Vorzugsweise werden diese Elektrolyte in Mengen zugesetzt, die die Endotoxin-Empfindlichkeit steigern, z-.ß. liegt bei dem zweiwertigen Kation (z.B. Ca ⁺) die Konzentration in dem Bereich

von 0,0001 bis 0,4 molar, und für das einwertige Kation (z.B. Na ) liegt die Konzentration in dem Bereich von 0,01 bis 0,4 molar.

Das LAL-Reagenz kann auch herkömmliche Hilfsstoffe, wie Stabilisatoren, einschließlich Lactose, enthalten. Diese Hilfsstoffe werden bei der Verwendung in geringeren Mengen zugesetzt, die ausreichen, um die beabsichtigten Qualitäten zu erreichen, jedoch nicht die gewünschten Eigenschaften der LAL-Reagentien beeinträchtigen.

Alle obigen Arbeitsgänge werden ausgeführt unter Lysatbehandlungsbedingungen, die gewährleisten, daß das Endprodukt steril und frei von Endotoxin ist. Maßnahmen, die die Freiheit von Endotoxin gewährleisten, sind in der Technik bekannt. Beispielsweise können anorganische Zusätze (CaCIp, NaCl, usw.) durch Erhitzen der trockenen Salze auf 250 °C für einen Zeitraum von wenigstens 120 Minuten frei von Endotoxin gemacht werden. Organische Zusätze müssen gewöhnlich wegen ihrer Schmelzpunkte usw. gelöst und sauer (pH<5) oder alkalisch (pH> 9) gemacht werden, und die Lösung muß zur Zerstörung irgendwelcher anwesender Endotoxine 30 bis 60 Minuten oder langer bei 121 ⁰C im Autoklaven behandelt werden.

Wie erwähnt, ist die Erfindung ferner gerichtet auf ein LAL-Reagenz, das als den wesentlichen Bestandteil eine wässrige Dispersion von LAL, ein die LAL-Empfindlichkeit verstärkendes Mittel entsprechend obiger Beschreibung in einer das Lysat verstärkenden Menge, sowie eine puffernde Menge eines geeigneten, oben beschriebenen Puffers enthält. Wahlweise können die oben beschriebenen einwertigen und zweiwertigen Kationen in die Lysatempfindlichkeit steigernden Mengen enthalten

sein, um die Empfindlichkeit des Lysats gegenüber Endotoxin weiter zu erhöhen.

Normalerweise liegt das Lysat in dem erfindungsgemäßen Reagenz in einer Endotoxin bestimmenden Menge vor, z.B. in einer Menge, die ausreicht, um Endotoxine in einer anschließenden LAL-Untersuchung auf Endotoxin zu bestimmen. Im allgemeinen ist dies eine Menge₅ die etwa 0,007 bis etwa 0,5 ng/ml, vorzugsweise etwa 0,007 bis etwa 0,050 ηg/ml FDA-Bezugsendotoxin EC-2 feststellt. Das vorerwähnte LAL-Reagenz wird vorzugsweise lyophilisiert.

Gemäß der Erfindung kann das LAL-Reagenz zur Endotoxin-Bestimmung unter Endotoxin bestimmenden Bedingungen nach der Methode benutzt werden, wie sie beispielsweise in der GB-PS 1 522 127 und in den nachfolgenden Beispielen beschrieben ist.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung; alle Teile bedeuten Gewicht/Volumen, wenn nichts anderes angegeben ist.

HERSTELLUNG VON LIMULUS-LYSAT

Limulus-Lysat wurde hergestellt nach einem Verfahren, das gegenüber dem ursprünglich von Levin und Bang (Thromb. Diath. Haemorrh. J_9, (1969) 186) beschriebenen Verfahren modifiziert wurde. Hufeisenkrabben, Limulus polyphemus, wurden aus dem Atlantik in der Nähe von 8eaufort_s N.C, entnommen. Etwa 500 ml Haemolymphe wurden durch Herzpunktion mit einer Nadel von 1,27 mm Durchmesser entnommen und in einer endotoxinfreien Zentrifugenglasflasche von 1 Liter Inhalt gesammelt, die 500 ml

einer 0,125 % N-Äthylmaleimid enthaltenden, endotoxinfreien, auf 42 ²C erwärmten 3 Sigen Salzlösung enthielt. Die Zentrifugenflasche, welche die Haemolymphe/Antikoagulierungsmittel-Lösung enthielt, wurde 8 Minuten auf 42 "C erwärmt und dann 10 Minuten bei 150 g zentrifugiert. Das überstehende Plasma wurde dekantiert, und die Amoebocytentablette wurde erneut in Antikoagulierungsmittellösung suspendiert. Die Zellen wurden abermals wi'e zuvor durch Zentrifugieren tablettiert. Die zusammengepressten Zellen wurden erneut in pyrogenfreier 0,9 %iger Salzlösung suspendiert und in ein depyrogeniertes 50 ml-Zentrifugenrohr aus Kunststoff überführt. Die gewaschenen Zellen wurden wiederum bei 150 g zentrifugiert. Nach Dekantieren der Salzlösung wurden die zusammengepressten Amoebocyten durch Zugabe von pyrogenfreiem Wasser zur Injektion in einem Verhältnis von 7 ml Wasser zu 3 ml zusammengepresste Zellen zerstört. Nach Mischen in einem Wirbelmischer für einen Zeitraum von 10 bis 15 Sekunden wurden die lysierten Zellen 24 Stunden bei 1 bis 5 °C aufbewahrt. Die Zellreste wurden durch Zentrifugieren bei 1500 g für einen Zeitraum von etwa 15 Minuten sedimentiert. Das Lysat wurde dekantiert und bei 0 bis 4 ⁰C aufbewahrt. Der Zeil rückstand wurde verworfen.

HERSTELLUNG VON STANDADARD-ENDOTOXIN-LÜSUNGEN

Es wurden Standard-Lösungen des FDA-Bezugsstandard-Endotoxin Lot EC-2 in pyrogenfreiem Wasser zur Injektion hergestellt. Die Wiederherstellung von 1 Mg Endotoxin mit 10 ml Wasser in einer Ampulle lieferte eine Ausgangskonzentration von 0,1 ug/ml. Die Ampulle wurde auf einem hin und her gehenden Schüttler 1 Stunde geschüttelt. Es wurden fortlaufende Verdünnungen vorgenommen, um die folgenden Endotoxin-Konzentrationen zu erhalten: 10 ng/ml, 1 ng/ml, 500 pg/ml, 250 pg/ml, 125 pg/ml, 62,5 pg/ml,

. 27 - ■'-- '■-' '■■■ "■ "·-■ -

31,25 pg/mT, 15,6 pg/ml und 7,8 pg/ml. Nach der Herstellung wurden die Endotoxin-Lösungen bis zu 48 Stunden aufbewahrt und dann verworfen. Andere benutzte Endotoxin-Standard-Lösungen waren Lösungen des FDA-Bezugsendotoxin Lot Nr. 1 von Klebsiella pneumoniae, Escherichia eoli Endotoxin Lot 071857 (Difco) sowie eine in unserem Laboratorium hergestellte Umformulierung von Bezugsendotoxin Lot EC-2. Die aus dem Endotoxin von E. coli Lot 071857 hergestellten Endotoxin-Standardlösungen hatten die folgenden Konzentrationen: 6,25, 12,5, 50, 75,.100, 150 und 200 pg/ml.

LYSAT-UNTERSUCHUNGSMETHODE

Lysat-Verdünnungen von 25 bis 70 % wurden in einem 0,t m. Puffer von pH = 7,0 hergestellt, der gewöhnlich Tris, d.h. Tris(hydroxymethyl)aminomethan, war. Andere benutzte Puffer waren u.a. Imidazo!, Trisimidazol, Triäthanolamin, Trismaleat, N-2-Hydroxyä'thyl pi perazi n-N-2-äthansulfonsäure (HEPES), 1,4-Piperazindiäthansulfonsäure (PIPES) und Morpholinpropansulfonsäure (MOPS).

Um die Empfindlichkeit des Lysats zu bestimmen, wurde 0,1 ml von jeder dieser Endotoxin-Verdünnungen mit 0,1 ml Lysat in depyrogenierten Glasröhrchen mit Schraubkappe der Größe 10 χ 75 mm vereinigt und eine Stunde bei 37 ⁰C inkubiert. Die Ergebnisse wurden in der Weise bestimmt, daß man jedes Rohr allmählich um 180 ° umdrehte. Ein Pfropfen, der nach dem Umdrehen unversehrt blieb, zeigte einen positiven Endotoxin-Test an.

HERSTELLUNG UND DEPYROGENIERUNG VON OBERFLÄCHENAKTIVEN LÖSUNGEN

Stammlösungen des Mittels zur Verstärkung der LAL-Empfindlichkeit wurden in Konzentrationen bis zu 10 % (w/v) aktive Bestandteile in

wässriger Lösung hergestellt. Am häufigsten betrug die Konzentration 1 % (w/v). Obgleich das Verfahren von einem Mittel zu dem nächsten in den Mengen variierte, war in 50 ml wässriger Lösung genug Material gelöst, um bei Verdünnung auf 100 ml die gewünschte Konzentration zu liefern. Die Lösung enthielt auch 7,5 ml 0,05 m Tris(hydroxymethyl)aminomethan nämlich TRIZMA BASE, Sigma Chemical Company) und 1 ml 2 η NaOH, so daß sich ein End-pH-Werf von > 11 ergab. Das Mittel in alkalischer Lösung wurde 12 Stunden oder länger bei 0 bis 4 ^ö gelagert, um eine vollständige Depyrogenierung zu gewährleisten. Nach Einstellung der Lösung auf einen pH-Wert von etwa 8 wurde sie 15 Minuten oder länger bei 1,05 bar und > 121 ⁰C im Autoklaven behandelt. Der pH-Wert wurde schließlich eingestellt auf pH = 7,0 +■ 0,5. Die Konzentration des Mittels wurde berechnet, und die Verdünnung so vorgenommen, daß sich die gewünschte Endkonzentration ergab. Alkaliempfindliche Mittel wurden durch Säurebehandlung depyrogeniert, bei der HCl und Tris-Puffer anstelle' von NaOH bzw. TRIZMA BASE benutzt wurden.

ZUGABE DER MITTEL ZUM LYSAT

Die wie oben beschrieben hergestellten Lösungen des Mittels wurden dem Lysat während der Verdünnung mit der Puffersubstanz zugesetzt. Die zugesetzte Menge variierte mit dem jeweiligen Mittel; der Konzentrationsbereich für alle getesteten Mittel war 0,001 bis 1,0 % (w/v) Endkonzentration in der Lysat-Lösung. Die Reihenfolge der Zugabe der Komponenten führte nicht zu einer Änderung der sich ergebenden Lysat-Empfindlichkeit.

BEISPIEL 1

Oas die LAL-Empfindlichkeit verstärkende Mittel ZWITTERGENT 3-14, N,M~Dimethyl-3-ammonio-1-propansulfonat, ein von der Caibiochem-Behring Corp. verkauftes Sulfobetain, wurde wie oben beschrieben depyrogeniert und auf eine Endkonzentration von 1 % (w/v) verdünnt. Der Lysatansatz 9CZC wurde als 50 %ige Verdünnung mit 0,1 m Trismaleat-Puffer, pH = 7₅0, hergestellt. Das Verstärkungsmittel wurde zugesetzt, um Endkonzentrationen an Lysat von 0,005, 0,01, 0,02, 0,05, 0,075 und 0,10 % (w/v) zu erhalten. Eine Vergleichsprobe enthielt pyrogenfreies Wasser anstatt des oberflächenaktiven Mittels. Die Lysat-Verdünnungen wurden über Nacht bei 0 bis 4 °C aufbewahrt und am folgenden Tag mit einer Reihe von Verdünnungen von speziell zubereitetem EC-Endotoxin (bezeichnet EC) geprüft. Die Ergebnisse (Tabelle I) zeigen den wirksamen Konzentrationsbereich für das Verstärkungsmittel und die Gesamtzunahme der Lysat-Empfindlichkeit gegenüber Endotoxin im Vergleich zu dem Vergleichs lysat.

TABELLE

Probe

Verstärkungsmittel (%} Lysat-Empfindlichkeit

Vergleichsprobe LAL und Verstärkungsmittel

0,005

0,01

0,02

0,05

0,075 0,10

500

1000,0

500,0

31_S2

10000,0 10000,0 10000,0

Ausgedrückt als die geringste Endotoxin-Konzentration (pg/ml), die einen positiven Koagulattest liefert.

BEISPIEL II

Es wurden Standard-Endotoxin-Lösungen hergestellt für E. coli Endotoxin 072857, FDA-Bezugsendotoxin EC-2 und K. pneumoniae FDA-Bezugsansatz Nr. 1. Das Lysät wurde mit 0,1 m" Tris-Puffer, pH = 7,0, und der Lösung des Verstärkungsmittels, ZWITTERGENT™ 3-14, verdünnt, so daß sich eine 30 SSige Lysat-Verdünming ergab, die 0,02 % (w/v) ZWITTERGENT 3-14 enthielt. In der Vergleichsprobe wurde das Mittel durch Wasser ersetzt. Die Lysatprobe wurde durchgeführt mit jeder Endotoxin-Verdünnungsreihe.

	TABELLE II	Lysat- Empfindlichkeit*
Endotoxin	Probe	75,0 25,0
E. coli 071857	Vergleichsprobe LAL Verstärkungsmittel	500,0 62,5
FDA Bezugs-EC-2	Vergleichsprobe LAL Verstärkungsmittel	1000,0 125,0
FDA K. pneumonia	Vergleichsprobe LAL Verstärkungsmittel

BEISPIEL III

Zweiundzwanzig im Handel erhältliche LAL-Verstärkungsmittel wurden durchgemessen, um ihre Wirkungen auf die Lysat-Empfindlichkeit gegenüber Endotoxin zu bestimmen. Es wurden Lösungen von jedem Mittel

hergestellt und dem Lysatansatz 9FI bis auf Endkonzentrationen in dem Bereich von 0,001 bis 0,20 % (w/v) zugesetzt. Die Lysatproben wurden dann mit reformuliertem FDA-EC-Endotoxin (EC) getestet. In Tabelle III sind die Mittel in der Reihenfolge abnehmender Wirksamkeit aufgelistet. Die wirksamste geprüfte Konzentration in dem Lysat und ihre entsprechende Lysat-Empfindlichkeit sind angegeben. Die Empfindlichkeit von Vergleichslysat (50 !Verdünnung), das kein Mittel enthält, ist ebenfalls aufgeführt.

BEISPIEL IV

Zur Feststellung, daß die erhöhte Empfindlichkeit, die in dem mit dem Verstärkungsmittel behandelten Lysat beobachtet wurde> während der Lyophilisierung erhalten bleibt, wurde eine 30 %ige Lysat-

TM

Verdünnung in 0,05 m Tris-Puffer mit und ohne 0,02 % ZWITTERGENT¹" 3-14 (Endkonzentration im Lysat) hergestellt. 1,2 ml Lysat-Lösung wurden in jede Serumampulle von 10 ml Inhalt gegeben. Die Proben wurden bei - 35 ⁰C eingefroren und während einer Trocknungszeit von etwa 32 Stunden unter 50 μ Vakuum lyophilisiert. Die Ampullen wurden mit Spalt-Gummistopfen und Metall kappen abgedichtet. Das gefriergetrocknete Lysat wurde mit 1,2 ml pyrogenfreiem Wasser zur Injektion wieder hergestellt und dann mit FDA-Bezugsendotoxin EC-2 geprüft. Das Vergleichslysat ohne das Verstärkungsmittel hatte eine Empfindlichkeit von 62,5 pg/ml. In Gegenwart des Verstärkungsmittels war die Empfindlichkeit des Lysats um das Zweifache auf 31,2 pg/ml verbessert.

BEISPIEL V
Limulus-Lysat-Tagessammelansatz ODH, der etwa eine Woche

Handelsname

Herkunft

TABELLE III
Oberflächenaktives Mittel

Effektive Konzentration {%)

Lysat-Empf i ndlichkeit

Zwittergent 3-14	Calbiochem-Behring	amphoter	0,02	15,6
Varion CADG	Sherex Chemical Comp,,Inc.	amphoter	0,02	15,6
Lonzaine CO	Lonza Inc.	amphoter	0,02	15,6
Lonzaine CS	Lonza Inc.	amphoter	0,02	15,6
Varion CAS	Sherex Chemical Comp.,Inc.	amphoter	0,02	31,2
Emcoi CC38-17	Witco Chemical Corporation	amphoter	0,02	31,2
Deriphat 151	Henkel Inc. USA	amphoter"	0,01	31,2
Bina Coba 3001	Ciba-Geigy Corporation	kationisch	0,01	31,2
Barlox 12	Lonza Inc.	nicht-ionisch	0,01	31,2
Quaternary O	Ciba-Geigy Corporation	kationisch	0,002	31,2
Polystep B-5	Stepan Chemical Company	anionisch	0,001	31,2
Tween 80	ICI Americas Inc.	nicht-ionisch	0,20	62,5
Amphoterge K-2	Lonza Inc.	amphoter	0,02	62,5
Lodyne S-100	Ciba-Geigy Corporation	amphoter	0,02	62,5
Deriphat 154	Henkel Inc. USA	amphoter^	0,002	62,5
Polystep A-15	Stepan Chemical Company	anionisch	0,002	62,5
Amphoterge KJ-2	Lonza Inc.	amphoter	0,001	62,5
Deriphat 160	Henkel Inc. USA	amphoter"	0,02	62,5
Polystep A-17	Stepan Chemical Company	anionisch	0,001	62,5
Amphoterge WAS	Lonza Inc.	amphoter	0,001	125,0
Dianol RSX	Quaker Chemical Corp.	anionisch	0,02	250,0
Tween 20	ICI Americas Inc.	nicht-ionisch	0,002	250,0
Vergieichslysat				_ i?c η

^Ausgedrückt als die geringste Endotoxin-Konzentration (pg/ml), die einen positiven Koagulattest liefert
³Bei pH 7 überwiegt die anionische Form

alt war, wurde als 40 "iige Verdünnung in 0,05 m Tris(hydrOxymethyl)aminomethanmaleat-Pu'ffer, pH = 7,0, mit Endkonzentrationen von 0,06 m CaCl₂

TM

und 0,01 m "'neu und 0,03 ''-. ZWITTERGENT 3-14 zubereitet. Diese Lösung wurde in aliquoten Mengen von 1,2 ml auf 8 ml Ampullen verteilt, bei - 45 °'C eingefroren und mit einer Trocknungszeit von etwa 28 Stunden unter 50 μ Vakuum lyophilisiert. Die Ampullen wurden mit Spalt-Gummi stopfen abgedichtet und mit Schraubkappen aus Kunststoff überkappt. Das gefriergetrocknete Lysat wurde mit 1,2 ml pyrogenfreiem Wasser zur Injektion wieder hergestellt und mit FDA-Bezugsendotoxin EC-2 geprüft. Die Empfindlichkeit des mit Verstärkungsmittel behandelten, lyophilisierten Lysats betrug 62 pg/ml. Eine zum Vergleich hergestellte 40 %ige Verdünnung von LAL ohne Verstärkungsmittel wurde vor der Lyophilisierung geprüft und hatte eine Empfindlichkeit von 1 ng/ml.

BEISPIEL VI

Limulus-Lysat-Tagessammelmengen mit einer Empfindlichkeit, die gleich oder größer als 500 pg/ml E. coli Endotoxin 1CF war, wurden vereinigt und als eine 40 %ige Verdünnung in 0,025 m Tris(hydroxymethyl)-aminomethanmaleat-Puffer, pH = 7,0, mit Endkonzentrationen von 0,02 m MgCl₂: 0,01 m SrCl₂, 0,01 m CaCl₂ und 0,025 % ZWITTERGENT™ 3-14 zubereitet. Diese Lösung wurde in aliquoten Mengen von 1,2 ml und 5,2 ml auf 10 ml-Ampullen verteilt und bei - 50 ⁰C eingefroren. Die Proben wurden während einer Trocknungszeit von etwa 72 Stunden unter 100 μ Vakuum lyophilisiert. Das lyophilisierte Produkt wurde je nach dem Ausgangsvolumen des Lysats mit 1,2 ml oder mit 5,2 ml pyrogenfreiem Wasser zur Injektion wieder hergestellt. Bei Prüfung mit E. coli-Endotoxin 1CF im Anschluß an die Lyophilisierung war die Empfindlichkeit des mit Verstärkungsmittel be-

handelten, lyophilisierten Lysats bei den beiden Probegrößen 25 pg/ml, verglichen mit einer Empfindlichkeit der Vergleichsprobe von 500 pg/ml.

Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Behandlung von Limulusamoebocyten-Lysat von durch die Anwesenheit eines endogenen Lysat-Inhibitors herabgesetzter Empfindlichkeit gegenüber Endotoxin mit einer verstärkenden Menge eines die Lysat-Empfindlichkeit verstärkenden Mittels unter Lysat-Behandlungsbedingungen, um den Lysat-Inhibitor ganz oder teilweise zu neutralisieren und dadurch die Lysat-Empfindlichkeit gegenüber Endotoxin zu erhöhen,, dadurch gekennzeichnet, daß man das Lysat-Verstärkungsmittel auswählt unter

(I) amphoteren oberflächenaktiven Mitteln der folgenden Formeln (A) 0 R₂

R₃Y

(B) R^-N-R₁-COOM ⁵ I I¹ Y Y¹

(C) R₁-N(R₁-COOML

ö , ι

(D) 0 R

^R3^Y

worin R- ein Alkylenrest mit 1 bis 4 C-Atomen,

Y und Y' Wasserstoff, niederes Alkyl oder niederes Hydroxyalkyl,

R₂ und R₃ niederes Alkyl oder niederes Hydroxyalkyl, η die Zahl 0 oder 1,

R₄ ein Alkyl mit etwa 8 bis etwa 18 C-Atomen, wenn η = 0, oder ein

Alkylenrest mit 1 bis etwa 6 C-Atomen, wenn η = 1, R₅ ein Alkyl mit etwa 8 bis etwa 18 C-Atomen, und M Wasserstoff, Natrium, Kalium oder Ammonium bedeuten;

(II) anionischen oberflächenaktiven Mitteln der folgenden Formeln

(Y)Ar-(SO₃M)^

(F) R₅OSO₃M,

worin R₅, Y und M die gleiche Bedeutung wie oben haben, Rg ein Alkyl mit 8 bis 24 C-Atomen, η- eine ganze Zahl von 1 bis 3, n„ die Zahl 1 oder 2, und Ar Phenyl oder Naphthyl bedeuten;

(III) kationischen oberflächenaktiven Mitteln der Formel

V^Cs

^CH₂ CH₂

worin R₅, Y und Y¹ die gleiche Bedeutung wie oben haben; und

(IV) nicht-ionischen oberflächenaktiven Mitteln der folgenden Formel

(H) R₅R₇R₈N^O

worin Rj- die gleiche Bedeutung wie oben hat,

R-, und R₀ jeweils Methyl oder Äthyl sind, sowie

/ ο

den nicht-ionischen oberflächenaktiven Mitteln aus der Gruppe, die aus den Kondensationsprodukten von etwa 10 bis 30 Molen Äthylenoxid mit dem Monoester eines 6 C-Atome enthaltenden, sechswertigen Alkohols besteht, wobei die Estergruppe 10 bis 20 C-Atome enthält.

. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Verstärkungsmittel aus der Gruppe amphoterer oberflächenaktiver Mittel nach Formel (A) auswählt.

3. Verfahren nach Anspruch 2₃ dadurch gekennzeichnet, daß das Verstärkungsmittel in einer Menge von etwa 0,01 bis etwa 0,05 % (w/v) anwesend ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß

η die Zahl 0, R₄ Tetradecyl, R₂ und R₃ jeweils Methyl und R, Trimethylen

bedeuten.

5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß η die Zahl 1, R₄ Trimethylen, R₂ und R₃ jeweils Methyl und R₁ die

Gruppe -CH₂-CH-CH₂- bedeuten. ^Y

OH

6. Verfahren nach Anspruch 1„ dadurch gekennzeichnet, daß man das Verstärkungsmittel aus der Gruppe der amphoteren oberflächenaktiven Mittel nach Formel (D) auswählt.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß

das Verstärkungsmittel in einer Menge von etwa 0,01 bis etwa 0,05 % (w/v) anwesend ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß

η die Zahl 1, R₄ Propylen, R₂ und R₃ jeweils Methyl und R. Methylen

Y bedeuten.

tr

9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß

η die Zahl 0, Rg und R₃ jeweils Methyl und R. Methylen bedeuten.

10. Limulusamoebocyten-Lysat-Reagenz zur Endotoxin-Bestimmung, bestehend aus einer gepufferten wässrigen Dispersion von Limulusamoebocyten-Lysat mit verbesserter Empfindlichkeit gegenüber Endotoxin und einer verstärkenden Menge eines die Lysat-Empfindlichkeit verstärkenden Mittels, dadurch gekennzeichnet, daß das Lysat-Verstärkungsmittel aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist:

(I) amphotere oberflächenaktive Mittel der folgenden Formeln (A) 0 R₂

R₃Y

(B) Rn-N-R₁-COOM ⁵II¹ Y Y¹

(C) R₁-N(R₁-COOM)
b jl
ν 2 I² -R₁-CO
I¹ (D) Y
0
Il ir
j I
Y (R₅-C-HN)_n-R 4" ^R3

worin R₁ ein Alkylenrest mit 1 bis 4 C-Atomen,

Y und Y' Wasserstoff, niederes Alkyl oder niederes Hydroxyalkyl,

R₉ und R- niederes Alkyl oder niederes Hydroxyalkyl, η die Zahl 0 oder 1,

R» ein Alkyl mit etwa 8 bis etwa 18 C-Atomen, wenn η = 0, oder ein

Alkylenrest mit 1 bis etwa 6 C-Atomen, wenn η = 1, R₅ ein Alkyl mit etwa 8 bis etwa 18 C-Atomen, und M Wasserstoff, Natrium, Kalium oder Ammonium bedeuten;

(H) anionische oberflächenaktive Mittel der folgenden Formeln

(E) (Rg)_n -(Y)Ar-(SO₃M)_n

(F) R₅OSO₃M,

worin R₅, Y und M die gleiche Bedeutung wie oben haben, Rg ein Alkyl mit 8 bis 24 C-Atomen, n, eine ganze Zahl von 1 bis 3, n₂ die Zahl 1 oder 2, und Ar Phenyl oder Naphthyl bedeuten;

(III) kationische oberflächenaktive Mittel der Formel

N ^X CH₂

CH₂

worin R,-, Y und Y¹ die gleiche Bedeutung wie oben haben; und

(IV)· nicht-ionische oberflächenaktive Mittel der folgenden Formel

(H) R₅R₇R₈N-^O

worin R₅ die gleiche Bedeutung wie oben hat, R₇ und R_n jeweils Methyl oder Äthyl sind, sowie

die nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittel aus der Gruppe, die aus den Kondensationsprodukten von etwa 10 bis 30 Molen Äthylenoxid mit dem Monoester eines 6 C-Atome enthaltenden, sechswertigen Alkohols besteht, wobei die Estergruppe 10 bis 20 C-Atome enthalt.

11. Reagenz nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich die Kationen Na⁺, Mn⁺⁺ und Ca⁺⁺ in die Lysat-Empfindlichkeit steigernden Mengen enthält.

12. Reagenz nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß

es zusätzlich die Kationen Na⁺, Sr⁺⁺, Ca⁺⁺ und Mg⁺⁺ in die Lysat-Empfindlichkeit steigernden Mengen enthält.

13. Reagenz nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Lysat in einer Menge zum Nachweis von etwa 0,007 bis etwa 0,050 ng/ml FDA-Bezugsendotoxin EC-2 anwesend ist.

14. Reagenz nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Verstärkungsmittel aus der Gruppe der amphoteren oberflächenaktiven Mittel nach Formel (A) ausgewählt ist.

15. Reagenz nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß

η die Zahl 0, R, TetradecyT, R₂ und R- jeweils Methyl und R. Trimethy-

Y len sind.

16. Reagenz nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß η die Zahl 1, R^ Trimethylen, R₂ und R₃ jeweils Methyl und R.

-CH₀-CH-CH₀- sind. ^Y

ε- ι ^
OH

17. Reagenz nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Verstärkungsmittel aus der Gruppe der amphoteren oberflächenaktiven Mittel der Formel (D) ausgewählt ist.

18. Reagenz nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß η die Zahl 1, R₄ Propylen, R₂ und R₃ jeweils Methyl und R. Methylen

sind.

19. Reagenz nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß

η die Zahl 0, R₂ und R₃ jeweils Me%^l und R. Methylen sind.

20. Reagenz nach einem der Ansprüche 10 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß es lyophilisiert ist.

21. Verfahren zur Endotoxin-Bestimmung unter Endotoxin bestimmenden Bedingungen, dadurch gekennzeichnet, daß man das Endotoxin mit einem Limulusamoebocyten-Lysat-Reagenz nach einem der Ansprüche 10 bis 20 umsetzt.