DE69833675T2

DE69833675T2 - Faktor g reduzierte amebozyten-lysate zur nachweisung der bakteriellen endotoxinen

Info

Publication number: DE69833675T2
Application number: DE69833675T
Authority: DE
Inventors: T. Foster JORDAN; Hui-Ti Charleston CHIANG; F. James Charleston COOPER; R. Norman Falmouth WAINWRIGHT
Original assignee: CHARLES RIVER LAB; Charles River Breeding Laboratories Inc; Charles River Laboratories Inc
Current assignee: CHARLES RIVER LAB; Charles River Breeding Laboratories Inc; Charles River Laboratories Inc
Priority date: 1997-10-09
Filing date: 1998-10-02
Publication date: 2006-11-16
Anticipated expiration: 2018-10-03
Also published as: WO1999019355A1; EP1021463A1; AU9784098A; ATE318843T1; US6270982B1; US20030104501A1; DE69833675D1; US6391570B1; EP1021463B1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein eine Amöbocytenlysat-Zubereitung zur Verwendung im Nachweis und/oder der Quantifizierung eines bakteriellen Endotoxins in einer Probe und betrifft insbesondere eine Endotoxin-spezifische Amöbocytenlysat-Zubereitung, die eine reduzierte Faktor-G-Aktivität aufweist, zur Verwendung im Nachweis und/oder der Quantifizierung eines bakteriellen Endotoxins in einer Probe.
Hintergrund der Erfindung
Bakterielle Endotoxine, die auch als Pyrogene bekannt sind, sind Fieber erzeugende Nebenprodukte von Gram-negativen Bakterien und können Menschen gefährden oder sogar töten. Symptome einer Infektion können sich von Fieber, in milden Fällen, bis hin zum Tode erstrecken. Um eine geeignete medizinische Behandlung sofort zu beginnen ist es wichtig, so früh wie möglich das Vorhandensein eines Endotoxins und, falls möglich, die Konzentration des Endotoxins im Subjekt von Interesse zu identifizieren. In ähnlicher Weise fordert die US Food and Drug Administration (USFDA), dass bestimmte Hersteller feststellen, dass ihre Produkte, beispielsweise parenterale Arzneistoffe und medizinische Vorrichtungen, frei von nachweisbaren Mengen Gram-negativer bakterieller Endotoxine sind.
Bis jetzt wurde eine Vielzahl von Verfahren zur Verwendung im Nachweis bakterieller Endotoxine entwickelt. Ein gegenwärtig bevorzugtes Verfahren schließt die Verwendung von Amöbocytenlysat (AL) ein, das aus der Hämolymphe eines Hufeisenkrebses, beispielsweise eines Hufeisenkrebses ausgewählt aus der Gruppe, die aus Limulus polyphemus, Tachpleus gigas, Tachypleus tridentatus und Carcinoscorpius rotundicauda besteht. Amöbocytenlysate, die aus Limulus, Tachpleus und Carcinoscorpius erzeugt wurden, werden hierin als LAL, TAL und CAL bezeichnet.
Gegenwärtig wird LAL wegen seiner Empfindlichkeit bzw. Sensitivität, Spezifität und relativen Einfachheit bei der Vermeidung von Störungen durch andere Bestandteile, die in einer Probe von Interesse vorliegen können, in bakteriellen Endotoxin-Assays der Wahl verwendet. LAL reagiert, wenn es mit einer Probe kombiniert wird, die bakterielles Endotoxin enthält, mit dem Endotoxin und erzeugt ein Produkt, beispielsweise ein Gel oder ein chromogenes Produkt, das beispielsweise entweder visuell oder durch Verwendung eines optischen Detektors nachgewiesen werden kann.
Die Endotoxin-vermittelte Aktivierung von LAL wird gut verstanden und wurde sorgfältig in der Technik dokumentiert. Siehe beispielsweise Levin et al. (1968) Thromb. Diath. Haemorrh. 19: 186, Nakamura et al. (1986) Eur. J. Biochem. 154: 511, Muta et al. (1987) J. Biochem. 101: 1321, und Ho et al. (1993) Biochem. & Mol. Biol. Int. 29: 687. Wenn bakterielles Endotoxin mit LAL in Berührung gebracht wird, beginnt das Endotoxin eine Reihe enzymatischer Reaktionen, die in der Technik als Faktor-C-Weg bezeichnet werden, der zumindest drei Serinproteasezymogene einschließt, genannt Faktor C, Faktor B und Pro-Clotting-Enzym (siehe 1). Kurz gesagt, wird nach Exposition gegenüber dem Endotoxin der Endotoxin-empfindliche Faktor, nämlich Faktor C, aktiviert. Der aktivierte Faktor C hydrolysiert und aktiviert danach Faktor B, wonach der aktivierte Faktor B das Pro-Clotting-Enzym aktiviert, um das Clotting-Enzym bzw. Gerinnungsenzym zu erzeugen. Das Gerinnungsenzym hydrolysiert danach spezielle Stellen, beispielsweise Arg¹⁸-Thr¹⁹ und Arg⁴⁶-Gly⁴⁷ von Coagulogen, einem Fibrinogen-artigen gerinnbaren Protein von Wirbellosen, so dass ein Coagulin-Gel erzeugt wird. Siehe beispielsweise US-Patent Nr. 5 605 806.
Obwohl die Gerinnungskaskade von LAL ursprünglich als für das Endotoxin spezifisch betrachtet wurde, wurde später entdeckt, dass (1→3)-B-D-Glucane ebenfalls die Gerinnungskaskade von LAL durch einen einzigartigen enzymatischen Weg aktivieren, der in der Technik als der Faktor-G-Weg bezeichnet wird (siehe 1). Nach Exposition gegenüber (1→3)-B-D-Glucan wird Faktor G aktiviert, um aktiviertes Faktor G zu erzeugen. Aktivierter Faktor G wandelt danach das Pro-Gerinnungs- bzw. Pro-Clotting-Enzym in ein Gerinnungsenzym um, wohingegen das Gerinnungsenzym Coagulogen zu Coagulin umwandelt, ähnlich wie im Falle des Endotoxins. Demgemäß besteht das Coagulationssystem von LAL wie das Säugetier-Blutcoagulationssystem aus zumindest zwei Coagulationskaskaden, die einen Endotoxin-vermittelten Weg (den Faktor-C-Weg) und einen (1→3)-B-D-Glucan-vermittelten Weg (den Faktor-G-Weg) einschließen. Siehe beispielsweise Morita et al. (1981) FEBS Lett. 129: 318-321 und Iwanaga et al. (1986) J. Protein Chem. 5: 255-268.
In Hinsicht der Faktor-C- und Faktor-G-Wege von LAL kann der Nachweis eines bakteriellen Endotoxins in einer Probe unter bestimmten Umständen zweideutig sein. Als Folge wurden Versuche unternommen, die Spezifität von LAL für ein Endotoxin zu erhöhen, d.h. eine Endotoxin-spezifische Amöbocytenlysat-Zubereitung zu erzeugen.
Bei einem Ansatz werden Polysaccharid-basierte Faktor-G-Inhibitoren mit Amöbocytenlysat kombiniert, um die Gerinnung, die durch (1→3)-B-D-Glucan, das in der biologischen Probe vorliegt, indu ziert wird, zu reduzieren oder zu eliminieren, d.h. die Faktor-G-Kaskade zu hemmen. Siehe beispielsweise US-Patent Nr. 5 155 032; 5 179 006; 5 318 893; 5 474 984 und 5 641 643.
Bei einem alternativen Ansatz haben mehrere Gruppen versucht, Faktor G aus LAL zu entfernen, um dadurch eine Faktor-G-abgereicherte Amöbocytenlysat zu erzeugen, das gegenüber (1→3)-B-D-Glucan unempfindlich ist. Beispielsweise offenbaren Obayashi et al. (1985) Clin. Chim. Acta 149: 55-65 ein Verfahren zur Fraktionierung von Coagulationsenzymen in LAL und danach ein Rekombinieren nur solcher Faktoren, die in die Endotoxin-induzierte Coagulationskaskade (d.h. Faktor-C-Kaskade) involviert sind, um ein Faktor-G-depletiertes Amöbocytenlysat zu erzeugen. Dem sich ergebenden Lysat jedoch mag nicht nur Faktor G fehlen, sondern auch andere Bestandteile, die für eine vollständige Faktor-C-Kaskade erforderlich sind. Das rekonstituierte Lysat, das durch dieses Verfahren erzeugt wird, erzeugt offensichtlich keine natürliche Coagulintyp-Gerinnung und kann nur bei synthetischen chromogenen Substraten verwendet werden.
US-Patent Nr. 5 401 647 offenbart ein Verfahren zur Entfernung von Faktor G aus LAL durch Kombinieren von LAL mit (1→3)-β-D-Glucan, immobilisiert an einem unlöslichen Träger. Wenn er einmal an den Träger über die (1→3)-β-D-Glucan-Komponente gebunden ist, kann der Faktor G danach aus dem LAL entfernt werden, um ein Faktor-G-depletiertes Lysat zu erzeugen. In ähnlicher Weise offenbart US-Patent Nr. 5 605 806 ein Immunaffinitäts-basiertes Verfahren unter Verwendung eines Faktor-G-spezifischen Antikörpers zur Entfernung von Faktor G aus LAL, um dadurch ein Faktor-G-depletiertes Amöbocytenlysat zu erzeugen.
Es besteht nach wie vor jedoch ein Bedarf nach einem Endotoxin-spezifischen Amöbocytenlysat, das ökonomisch in kommerziellen Mengen produziert werden kann. Ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Amöbocytenlysates sollte schnell, reproduzierbar, preiswert, einfach durchzuführen sein und sollte vorzugsweise ein Amöbocytenlysat zur Folge haben, das in einer zuverlässigen und quantitativen Bestimmung eines Endotoxins in einer Probe von Interesse verwendet werden kann.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung umfasst bevorzugte Amöbocytenlysat-Zubereitungen, die eine reduzierte Faktor-G-Aktivität aufweisen, Verfahren zur Herstellung solcher Lysat-Zubereitungen und Verfahren zur Verwendung solcher Lysat-Zubereitungen im Nachweis und/oder der Quantifizierung eines oder mehrerer bakterieller Endotoxine in einer Probe von Interesse.
In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Endotoxinspezifischen Amöbocytenlysat-Zubereitung zur Verwendung im Nachweis von bakteriellen Endotoxi nen in einer Probe bereit. Die Amöbocytenlysat-Zubereitung wird durch Reduktion und/oder Elimination der Faktor-G-Aktivität in der Zubereitung Endotoxin-spezifisch gemacht. Die Amöbocytenlysat-Zubereitung der Erfindung wird (a) durch Mischen von rohem Amöbocytenlysat, d.h. Amöbocytenlysat, das sowohl mit Endotoxin als auch (1→3)-B-D-Glucan reaktiv ist, mit einem Tensid bzw. oberflächenaktiven Stoff in einer Menge, die ausreichend ist, um eine Lösung, die ein Präzipitat enthält, zu erzeugen; und (b) durch Abtrennen des Präzipitats aus der Lösung, wodurch eine Amöbocytenlysat-Zubereitung erzeugt wird, die weniger reaktiv mit einem (1→3)-β-D-Glucan, als es das rohe Amöbocytenlysat ist, hergestellt. Das durch Zusatz eines Tensids zum Rohlysat erzeugte Präzipitat kann irgendeinen Bestandteil enthalten, der für eine vollständige Faktor-G-Kaskade notwendig ist, jedoch wird die Produktion eines Präzipitats, das tatsächlich Faktor G enthält, bevorzugt.
Die Amöbocytenlysat-Zubereitung, die durch die hierin beschriebene Methodik erzeugt wird, umfasst alle Bestandteile, die für eine vollständige Faktor-C-Kaskade notwendig sind, d.h. ist noch dazu in der Lage, ein Coagulin-Gel über den Endotoxin-vermittelten Weg zu erzeugen. Demgemäß ist die sich ergebende Amöbocytenlysat-Zubereitung dazu in der Lage, mit einem bakteriellen Endotoxin zu reagieren, beispielsweise ein bakterielles Endotoxin, das durch Gram-negative Bakterien erzeugt wird, um ein Coagulin-Gerinsel zu erzeugen.
Es wird in Erwägung gezogen, dass jedes Tensid (andererweise als oberflächenaktives Mittel oder Detergens bekannt), das ein Präzipitat erzeugt, wenn es einem rohen Amöbocytenlysat hinzugefügt wird, wobei, wenn das Präzipitat einmal aus dem Lysat entfernt ist, dies eine Reduktion der Faktor-G-Aktivität zur Folge hat, in der Ausübung der Erfindung verwendet werden kann. Das Tensid jedoch ist vorzugsweise ein zwitterionisches Tensid, d.h. eine Tensid, das eine Kopfgruppe aufweist, die sowohl eine negativ geladene chemische Komponente als auch eine positiv geladene chemische Komponente aufweist. Beispiele für zwittenonische Tenside schließen Betaine und Sulfobetaine ein, jedoch werden Sulfobetaintyp-Tenside bevorzugt. Bevorzugte Sulfobetaintyp-Tenside schließen ohne Einschränkung n-Octyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propansulfonat; n-Decyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propansulfonat; n-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propansulfonat; n-Tetradecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propansulfonat; und n-Hexadecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propansulfonat ein. Das Sulfobetaintyp-Tensid n-Tetradecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propansulfonat wird jedoch am meisten bevorzugt.
In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren den zusätzlichen Schritt der Entfernung des zugesetzten Tensides in der Lösung oder der Reduktion seiner Konzentration. Das Tensid kann beispielsweise durch chromatographische Auftrennung beispielsweise unter Verwendung eines geeigneten Ionenaustauscherharzes oder alternativ durch irgendeine der Technik bekanntes Mittel zur Entfernung eines speziellen Tensids aus einer wässrigen Lösung entfernt werden. In einem bevorzugten Verfahren wird das Tensid durch konventionelle organische Lösungsmittelextraktion entfernt. Jedes organische Lösungsmittel, das das Tensid von Interesse löst und mit Amöbocytenlysat kompatibel ist, kann im Lösungsmittelextraktionsschritt verwendet werden, jedoch wird aus den unten diskutierten Gründen Chloroform bevorzugt.
In einer weiteren Ausführungsform kann die Empfindlichkeit einer Amöbocytenlysat-Zubereitung gegenüber einem bakteriellen Endotoxin, die eine reduzierte Faktor-G-Aktivität aufweist, durch Zusatz von exogenem (1→3)-β-D-Glucan zur Amöbocytenlysat-Zubereitung erhöht werden. Insbesondere wird (1→3)-β-D-Glucan der Lysat-Zubereitung in einer Menge zugesetzt, die ausreichend ist, um die Empfindlichkeit der Lysat-Zubereitung gegenüber Endotoxin bezüglich einer ähnlichen Amöbocytenlysat-Zubereitung ohne exogen zugesetztem (1→3)-β-D-Glucan zu erhöhen. Ohne an eine Theorie gebunden sein zu wollen, scheint es, dass exogen zugesetztes (1→3)-β-D-Glucan synergistisch mit dem Endotoxin-vermittelten Weg wirkt. Es sollte jedoch klar sein, das dieselbe Menge an (1→3)-β-D-Glucan, wenn sie rohem Amöbocytenlysat zugesetzt wird, d.h. Amöbocytenlysat, das sowohl mit Endotoxin als auch (1→)-β-D-Glucan reaktiv ist, wahrscheinlich die Erzeugung eines Coagulin-Gels über die Faktor-G-Kaskade induzieren würde. Tatsächlich wird während der Ausübung dieser speziellen Ausführungsform der Erfindung ein Substrat oder Initiator der Faktor-G-Kaskade der Amöbocytenlysat-Zubereitung der Erfindung zugesetzt.
Obwohl ins Auge gefasst wird, dass jede Menge an (1→3)-β-D-Glucan, die die Empfindlichkeit des Amöbocytenlysates gegenüber dem Endotoxin bezüglich einem ähnlichen Amöbocytenlysat ohne dem exogen zugesetzten (1→3)-β-D-Glucan erhöht, in der Ausübung der Erfindung verwendet werden kann, kann die optimale Menge an exogenem (1→3)-β-D-Glucan zur Erhöhung der Endotoxinspezifischen Kaskade in einem speziellen Lysat durch Routineexperimente bestimmt werden. Beispielsweise kann die optimale Konzentration durch Zusetzen unterschiedlicher Mengen eines speziellen (1→3)-β-D-Glucans zum rohen Amöbocytenlysat bestimmt werden, d.h. ein Amöbocytenlysat, das sowohl mit Endotoxin als auch (1→3)-β-D-Glucan reaktiv ist. Die optimale Menge des zur Amöbocytenlysat-Zubereitung der Erfindung zuzusetzenden (1→3)-β-D-Glucans kann unter Verwendung beispielsweise eines kinetischen turbidimetrischen Assays bestimmt werden, wobei die optimale Menge die Menge an (1→3)-β-D-Glucan ist, die die rascheste Coagulin-Gerinselbildung in rohem Amöbocytenlysat induziert. Diese Assayvorschrift ist beispielhaft und es sollte klar sein, dass der Fachmann auf dem Gebiet eine Vielzahl anderer Assays verwenden kann, beispielsweise ein Gel-Gerinsel- bzw. Gel-Clot-assay, einen turbidimetrischen Endpunktassay, oder einen chromogenen Assay, um die optimale Menge an (1→3)-β-D-Glucan zu bestimmen, die dem Lysat von Interesse zugesetzt werden muss.
Es wird ins Auge gefasst, dass jedes (1→3)-β-D-Glucan, das die Faktor-G-Kaskade in rohem Amöbocytenlysat induziert, zur Steigerung der Empfindlichkeit des Endotoxin-vermittelten Weges in der Amöbocytenlysat-Zubereitung der Erfindung verwendet werden kann. Bevorzugte (1→3)-β-D-Glucane schließen ohne Einschränkung Baumwollextrakt; Spülungen aus Celluloseacetatmembranen; Curdlan; Pachyman; Scleratan; Leutinan; Schizophyllan; Coriolan; Laminaran; und Laminarin ein. Gegenwärtig wird jedoch haminarin am meisten bevorzugt.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Amöbocytenlysat-Zubereitung bereit, die eine reduzierte Faktor-G-Aktivität aufweist, d.h. ein Amöbocytenlysat mit einer reduzierten Reaktivität gegenüber (1→3)-β-D-Glucanen bezüglich Rohlysat, das durch die vorher erwähnten Methoden erzeugt wurde. In einer Ausführungsform kann eine solche Zusammensetzung (i) eine Amöbocytenlysat-Zubereitung mit einer reduzierten Faktor-G-Aktivität oder am meisten bevorzugt, eine Amöbocytenlysat-Zubereitung umfassen, der eine Faktor-G-Aktivität fehlt, und (ii) exogen zugesetztes (1→3)-β-D-Glucan, wobei das (1→3)-β-D-Glucan in einer Menge zugesetzt wird, die ausreichend ist, um die Empfindlichkeit der Amöbocytenlysat-Zubereitung gegenüber Endotoxin bezüglich einer ähnlichen Amöbocytenlysat-Zubereitung ohne dem exogen zugesetzten (1→3)-β-D-Glucan zu erhöhen. Die Bestimmung der optimalen Menge eines speziellen (1→3)-β-D-Glucans zur Erhöhung des Empfindlichkeit des Lysats gegenüber Endotoxin wurde vorher diskutiert.
Gemäß eines weiteren Aspektes stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zum Nachweisen und/oder Quantifizieren der Menge eines bakteriellen Endotoxins in einer Probe bereit. Die Verbesserung in solchen Verfahren liegt in der Verwendung der Amöbocytenlysat-Zubereitung der Erfindung.
Die vorhergehenden und weitere Aufgaben, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der nachfolgenden ausführlichen Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen der Erfindung klarer ersichtlich werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die Aufgaben und Merkmale der Erfindung können unter Bezugnahme auf die unten beschriebenen Zeichnungen besser verstanden werden, bei denen,
1 eine schematische Darstellung des Blutgerinnungssystems von Hufeisenkrabben-Amöbocyten sind.
2 ein Flussdiagramm ist, das eine beispielhafte Vorschrift zur Erzeugung einer Amöbocytenlysat-Zubereitung mit einer reduzierten Faktor-G-Aktivität darstellt.
3 eine densitometrische Darstellung eines Coomassie-Blau-gefärbten Natriumdodecylsulfat-(SDS)-polyacrylamid-Gels ist, bei dem Bahn 1 Molekulargewichtsmarker, Bahn 2 rohes Limulus-Amöbocytenlysat, Bahn 3 Präzipitat, das aus Limulus-Amöbocytenlysat im Anschluss an den Zusatz einer ausfällenden Menge Tensids entfernt wurde, und Bahn 4 einen Amöbocytenlysat-Überstand enthält, der nach Entfernung des durch Tensid induzierten Präzipitats erzeugt wurde.
4 eine graphische Darstellung ist, die die Reaktivität mit Laminarin von rohem Limulus-Amöbocytenlysat und Limulus-Amöbocytenlysat der Erfindung zeigt. Die Rauten repräsentieren die Charge bzw. den Ansatz K2222L, die Quadrate repräsentieren die Charge L4941LB, die Dreiecke repräsentieren die Charge L1081LB und die Kreise repräsentieren die Charge L1711LB.
5 eine graphische Darstellung ist, die die Reaktivität mit einer Celluloseacetat-Spülung von rohem Limulus-Amöbocytenlysat und Limulus-Amöbocytenlysat der Erfindung darstellt. Die Rauten repräsentieren die Charge K2222L, die Quadrate repräsentieren die Charge L4941LB, die Dreiecke repräsentieren die Charge L1081LB und die Kreise repräsentieren die Charge L1711LB.
6 eine graphische Darstellung ist, die die Reaktivität von rohem Limulus-Amöbocytenlysat und Limulus-Amöbocytenlysat der Erfindung mit Baumwollextrakt zeigt. Die Rauten repräsentieren die Charge K2222L, die Quadrate repräsentieren die Charge L4941LB, die Dreiecke repräsentieren die Charge L1081LB und die Kreise repräsentieren die Charge L1711LB.
7 eine graphische Darstellung ist, die die Empfindlichkeit von Limulus-Amöbocytenlysat der Erfindung in Gegenwart und Abwesenheit von exogen zugesetztem (1→3)-β-D-Glucan gegenüber Endotoxin zeigt. Die Kreise repräsentieren Lysat ohne exogen zugesetztem Laminarin und die Kästchen repräsentieren Lysat mit exogen zugesetztem Laminarin.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Wie unten ausführlicher beschrieben werden wird, basiert diese Erfindung teilweise auf der Erkenntnis eines preiswerten und zuverlässigen Verfahrens zur Herstellung einer Endotoxin-spezifischen Amöbo cytenlysat-Zubereitung. Die sich ergebenden Amöbocytenlysat-Zubereitungen sind beim Nachweis und/oder der Quantifizierung eines bakteriellen Endotoxins in einer Probe von Interesse von Nutzen.
Insbesondere basiert das Verfahren auf einer Vorschrift zum Reduzieren oder vorzugsweise Abreichern von Amöbocytenlysat bezüglich einer Faktor-G-Aktivität, wobei das sich ergebende Lysat weniger reaktiv gegenüber (1→3)-β-D-Glucan ist als unbehandeltes Amöbocytenlysat. Zusätzlich basiert die Erfindung teilweise auf der Entdeckung, dass (1→3)-β-D-Glucan, wenn es einer Amöbocytenlysaten-Zubereitung, die bezüglich Faktor-G-Aktivität abgereichert ist (beispielsweise durch Entfernung von Faktor G oder durch Zusatz von Faktor-G-Inhibitoren, beispielsweise Faktor-G-Inhibitoren des Typs, der in US-Patenten Nr. 5 155 032; 5 179 006; 5 318 893; 5 474 984 und 5 641 643 beschrieben sind, deren Offenbarung durch diese Bezugnahme mit aufgenommen sind) die Empfindlichkeit der sich ergebenden Amöbocytenlysat-Zubereitung gegenüber Endotoxin erhöhen kann. Die Erfindung stellt deswegen eine Endotoxin-spezifische Amöbocytenlysat-Zubereitung zur Verwendung im zuverlässigen Nachweisen und/oder Quantifizieren eines bakteriellen Endotoxins in einer Probe von Interesse bereit.
Die Amöbocytenlysat-Zubereitung der Erfindung wird durch Folgendes hergestellt: (a) Mischen einer Probe eines rohen Amöbocytenlysats, d.h. Amöbocytenlysat, das sowohl mit Endotoxin als auch mit (1→3)-β-D-Glucan reaktiv ist, mit einem Tensid in einer Menge, die ausreichend ist, um eine Lösung zu erzeugen, die ein Präzipitat enthält; und (b) Abtrennen des Präzipitats aus der Lösung, wodurch eine Amöbocytenlysat-Zubereitung erzeugt wird, die weniger reaktiv mit einem (1→3)-β-D-Glucan ist als das rohe Amöbocytenlysat. Die sich ergebende Amöbocytenlysat-Zubereitung umfasst vorzugsweise nach wie vor alle Bestandteile, die für die Faktor-C-Kaskade notwendig sind, und ist deswegen dazu in der Lage, ein Coagulin-Gel im Anschluss an den Zusatz eines Endotoxins zu erzeugen.
Wie hierin verwendet, soll der Begriff „Amöbocytenlysat" jegliches Lysat bedeuten, das durch die Lyse von Blutzellen (Amöbocyten) erzeugt wird, die aus der Hämolymphe von Hufeisenkrabben extrahiert wird. Bevorzugte Hufeisenkrabben schließen Krabben ein, die zur Art Limulus gehören, beispielsweise Limulus polyphemus, die Art Tachpleus, beispielsweise Tachpleus gigas, und Tachypleus tridentatus und die Art Carcinoscorpius, beispielsweise Carcinoscorpius rotundicauda. Wie hierin verwendet, soll der Begriff „rohes Amöbocytenlysat" jegliches Amöbocytenlysat bedeuten, das dazu in der Lage ist, ein Coagulin-Gerinsel in Gegenwart eines Endotoxins, beispielsweise ein Endotoxin, das durch Gram-negative Bakterien erzeugt wird, und (1→3)-β-D-Glucan, beispielsweise Laminarin, zu erzeugen.
Wie hierin verwendet, sollt der Begriff „Faktor G" jegliches Protein oder Polypeptid bedeuten, das als ein Serinproteaserymogen wirkt und das dazu in der Lage ist, die Produktion eines Coagulin-Gel- Gerinsels in einem rohen Amöbocytenlysat im Anschluss an die Exposition gegenüber (1→3)-β-D-Glucan zu initiieren. Die Isolierung und Charakterisierung von Hufeisenkrabben-Faktor-G wurde intensiv in der Technik diskutiert (siehe beispielsweise Seki et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 1370-1374, deren Offenbarung durch diese Bezugnahme mit aufgenommen ist) und wird deswegen hierin nicht im Detail diskutiert werden.
Wie hierin verwendet, soll der Begriff „(1→3)-β-D-Glucan" jegliches wasserlösliches Polysaccharid, Disaccharid oder Derivat hiervon bedeuten, das (i) dazu in der Lage ist, die Bildung eines Coagulin-Gerinsels in rohem Limulus-Amöbocytenlysat zu induzieren und (ii) zumindest zwei β-D-Glucoside enthält, wie in Formel 1 unten definiert ist, verbunden durch eine (1→3)-β-D-glycosidische Bindung. Es wird in Erwägung gezogen, dass ein solches Polysaccharid oder Derivat hiervon zusätzlich dazu, dass es eine (1→3)-β-D-glycosidische Bindung enthält, ebenfalls Glucosid-Komponenten enthalten kann, die durch eine Vielzahl anderer glycosidischer Bindungen verbunden sind, beispielsweise über eine (1→3)-β-D-glycosidische Bindung und/oder (1→6)-β-D-glycosidische Bindung. Es wird in Erwägung gezogen, dass solche (1→3)-β-D-Glucane aus einer Vielzahl von Quellen isoliert werden können, einschließlich, ohne Einschränkung, Pflanzen, Bakterien, Hefen, Algen und Pilzen, oder alternativ können diese unter Verwendung einer konventionellen Zuckerchemie synthetisiert werden.
Formel I
Wie hierin verwendet, betrifft der Begriff „reaktiv mit (1→3)-β-D-Glucan" ein Amöbocytenlysat, das in Gegenwart eines (1→3)-β-D-Glucans dazu in der Lage ist, ein Produkt zu erzeugen, das in einem herkömmlichen Gel-Gerinselassay, einem turbidimetrischen Endpunktassay, einem kinetischen turbidimetrischen Assay oder einem chromogenen Assay nachgewiesen werden kann. In ähnlicher Weise betrifft der Begriff „reaktiv mit einem bakteriellen Endotoxin", wie hierin verwendet, ein Amöbocytenlysat, das in Gegenwart eines durch Gram-negative Bakterien erzeugten Endotoxins dazu in der Lage ist, ein Produkt zu erzeugen, das in einem herkömmlichen Gel-Gerinselassay, einem turbidimetrischen Endpunktassay, einem kinetischen turbidimetrischen Assay oder einem chromogenen Assay nachgewiesen werden kann.
Wie hierin verwendet, soll der Begriff „Tensid" jedes oberflächenaktiven Mittel oder Detergens bedeuten, das dazu in der Lage ist, ein Präzipitat zu erzeugen, wenn es mit rohem Amöbocytenlysat vermischt wird, wobei das Präzipitat, wenn es einmal aus dem Lysat entfernt wird, eine Reduktion der Faktor-G-Aktivität zur Folge hat. Wie hierin verwendet, soll der Begriff „zwitterionisches Tensid" jegliches Tensid bedeuten, das eine Kopfgruppe aufweist, die sowohl eine negativ geladene chemische Komponente als auch eine positiv geladene chemische Komponente aufweist. Beispiele nützlicher zwitterionischer Tenside, die in der Ausübung der vorliegenden Erfindung von Nutzen sind, schließen ohne Einschränkung, Betaine (siehe beispielsweise Formel II unten) und Sulfobetaine (siehe beispielsweise Formel III unten) ein, jedoch werden Sulfobetaine gegenwärtig am meisten bevorzugt. Formel II
Formel III
wobei n 7, 9, 11, 13 oder 15 sein kann.
Wie hierin verwendet, soll der Begriff „Präzipitat" jegliches unlösliches Material bedeuten, das im Anschluss an die Mischung eines rohen Amöbocytenlysats mit einem Tensid erzeugt wird. Es wird in Erwägung gezogen, dass das Präzipitat Faktor G und/oder andere, bis jetzt nicht entdeckte, Bestandteile enthalten kann, die für eine funktionelle Faktor-G-Kaskade notwendig sind.
Herstellung eines Amöbocytenlysats, das eine reduzierte Faktor-G-Aktivität aufweist
Ein Flussdiagramm, das eine beispielhafte Vorschrift zur Erzeugung einer Amöbocytenlysat-Zubereitung mit einer reduzierten Faktor-G-Aktivität aufweist, besonders bevorzugt eine Amöbocytenlysat-Zubereitung, die bezüglich Faktor-G-Aktivität abgereichert ist, ist in 1 dargestellt. Es wird in Erwägung gezogen, dass jegliches rohe Amöbocytenlysat als Ausgangsmaterial in der in 1 dargestellten Vorschrift verwendet werden kann.
Rohe Lysate bzw. Rohlysate können unter Verwendung des wie ursprünglich in Levin et al. (1968) Thromb. Diath. Haemorrh. 19: 186 beschriebenen Verfahrens unter Modifikationen hergestellt werden. Kurz gesagt, wird Blut (Hämolymphe) aus Hufeisenkrabben in einer Salzlösung gewonnen, die mit Seewasser isotonisch ist (ungefähr 3% NaCl (G/V)), die ein Anti-Coagulans enthält, beispielsweise N-Ethylmaleimid, Koffein oder Tween^® 20. Die Amöbocyten werden mit derselben Lösung zur Entfernung von Hämolymph-Faktoren gewaschen und durch osmotischen Schock über eine Exposition gegenüber Pyrogen-freiem Wasser gewaschen. Nach 24 Stunden wird das Amöbocytenlysat von Zellbruchstücken durch Zentrifugation abgetrennt. Die Zubereitung von Rohlysat wird ebenfalls beispielsweise in Richard B. Prior, Hsg., „Clinical Applicatons of the Limulus Amebocyte Lysate Test" CRC Press, Seiten 28-36 und Seiten 159-166 und in US-Patent Nr. 4 322 217, deren Offenbarungen durch diese Bezugnahme hierin mit aufgenommen sind, diskutiert.
Um Amöbocytenlysat mit einer reduzierten Faktor-G-Aktivität zu erzeugen, wird ein Tensid einem Amöbocyten-Rohlysat in einer Menge zugesetzt, die ausreichend ist, um ein Präzipitat bzw. eine Ausfällung zu erzeugen. Wie vorher erwähnt, wird in Erwägung gezogen, dass jegliches Tensid oder Detergens, das ein Präzipitat nach Zusatz zum rohen Amöbocytenlysat erzeugt, wobei das Präzipitat, wenn es einmal aus dem Lysat entfernt ist, eine Reduktion der Faktor-G-Aktivität aufweist, in der Ausübung der Erfindung verwendet werden kann. Bevorzugte Tenside schließen zwitterionische Tenside ein, d.h. Tenside mit einer Kopfgruppe, die sowohl eine negativ geladene chemische Komponente als auch eine positiv geladene chemische Komponente aufweisen. Beispiele für zwitterionische Tenside, die in der Ausübung der Erfindung von Nutzen sind, schließen Betaine und Sulfobetaine ein, jedoch werden die Sulfobetaintyp-Tenside am meisten bevorzugt.
Eine Familie von Sulfobetaintyp-Tensiden sind kommerziell von Calbiochem^®, San Diego, Kalifornien, unter dem Handelsnamen Zwittergent^® erhältlich. Sulfobetaintyp-Detergentien behalten offensichtlich ihren zwitterionischen Charakter über einen breiten pH-Bereich bei. Gegenwärtig bevorzugte Betaintyp-Tenside schließen ohne Einschränkung n-Octyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propansulfonat (ebenfalls bekannt als Zwittergent^® 3-08); n-Decyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propansulfonat (ebenfalls als Zwittergent^® 3-10 bekannt); n-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propansulfonat (ebenfalls als Zwittergent^® 3-12 bekannt); n-Tetradecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propansulfonat (ebenfalls als Zwittergent^® 3-14 bekannt; und n-Hexadecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propansulfonat (ebenfalls als Zwittergent^® 3-16 bekannt) ein. Jedoch wird das Sulfobetaintyp-Tensid n-Tetradecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propansulfonat (Zwittergent^® 3-14) am meisten bevorzugt.
Die optimale Konzentration eines Tensids, die zur Erzeugung eines Präzipitats notwendig ist, wenn es mit einem rohen Amöbocytenlysat kombiniert wird, kann durch Routineexperimente bestimmt werden. Beispielsweise kann der Fachmann auf dem Gebiet einfach zunehmende Konzentrationen eines speziellen Tensids zu rohem Amöbocytenlysat zusetzen, bis ein Präzipitat erzeugt wird. Die Amöbocytenlysat-Zubereitung kann im Anschluss an die Entfernung des Präzipitats bezüglich einer reduzierten Faktor-G-Aktivität unter Verwendung irgendeines der konventionellen Assays getestet werden, beispielsweise eines Gel-Gerinsel, turbidimetrischen Endpunkt, kinetischen turbidimetrischen oder chromogenen Assays, die in der Technik bekannt und sorgfältig dokumentiert sind. Bezüglich der Sulfobetaintyp-Detergentien bewegen sich bevorzugte Detergens-Konzentrationen von ungefähr 0,01 bis ungefähr 0,6% (G/V) und am meisten bevorzugt von ungefähr 0,05% bis ungefähr 0,25% (G/V). Insbesondere bezüglich dem Sulfobetaintyp-Tensid n-Tetradecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propansulfonat (Zwittergent^® 3-14) wird dieses Detergens vorzugsweise dem rohen Lysat in einer Endkonzentration von ungefähr 0,05% (G/V) bis ungefähr 0,20% (G/V), am meisten bevorzugt ungefähr 0,12% (G/V) zugesetzt, um ein Präzipitat zu erzeugen.
Die optimalen Ausfällungsbedingungen können durch Variieren eines oder mehreren der Detergenskonzentration, der Temperatur und der Inkubationszeit bestimmt werden. Beispielsweise schließen bevorzugte Inkubationsbedingungen eine Inkubation bei Temperaturen unterhalb ungefähr 20° C, am meisten bevorzugt ungefähr 2 bis 15° C für ungefähr 2 bis 24 Stunden ein. Diese Bedingungen scheinen die Aktivität der Lysat-Zubereitung während des Präzipitationsschrittes zu konservieren. Beispielsweise wird im Falle von Zwittergent^® 3-14 das sich ergebende Gemisch vorzugsweise bei 2 bis 8° C für 8 bis 24 Stunden inkubiert. Im Anschluss an die Inkubation kann das sich ergebende Präzipitat durch irgendeine konventionelle Technik entfernt werden, die auf dem Fachgebiet bekannt ist, beispielsweise durch eine Zentrifugation, gefolgt vom Entfernen des Überstandes von dem Präzipitatpellet.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Konzentration des Tensids, das den Überstand enthält, falls notwendig, auf ein Niveau reduziert, das ein Funktionieren der Faktor-C-Kaskade ermöglicht. Das Ausmaß der Tensid-Entfernung zur Erzeugung eines Lysats, das eine operative Faktor-C-Kaskade enthält, kann durch Routineexperimente bestimmt werden. Beispielsweise kann die Menge an Tensid, die im Überstand verbleibt, beispielsweise durch Standard-Dünnschichtchromatographie (TLC) bestimmt werden. Unter bestimmten Umständen kann es bevorzugt sein, zumindest ungefähr 35% des Tensids aus dem Überstand zu entfernen, besonders bevorzugt zumindest ungefähr 70% und am meisten bevorzugt zumindest ungefähr 90%. Beispielsweise ermöglicht die konsistente Entfernung von zumindest ungefähr 90% des Tensids aus dem Lysat die Erzeugung von Zubereitungen aus Amöbocytenlysat-Zubereitungen mit relativ definierte Bestandteilen. Als Folge hiervon kann es leichter sein, Chargen von Amöbocytenlysat-Zubereitungen mit den gleichen oder ähnlichen Aktivitäten zu erzeugen. Es sollte jedoch klar sein, dass es möglich ist, die Sensitivität bzw. Empfindlichkeit der sich ergebenden Lysat-Zubereitung gegenüber einem Endotoxin durch Verändern der Konzentration des restlichen Detergens in der Lysat-Zubereitung zu kontrollieren. Beispielsweise wird, je mehr Detergens entfernt wird, desto mehr das Lysat gegenüber Endotoxin empfindlich. Demgemäß kann, um ein Lysat mit einer erwünschten Empfindlichkeit gegenüber dem Endotoxin herzustellen, die Menge des aus der Lysat-Zubereitung entfernten Detergens durch Variieren der Detergens-Extraktionsbedingungen, die unten diskutiert werden, verändert werden.
Es wird in Erwägung gezogen, dass der Fachmann auf dem Gebiet irgendein konventionelles Verfahren zur Entfernung eines speziellen Tensids oder insbesondere von Zwittergent^® aus dem Gemisch anwenden kann. Es wird beispielsweise erwogen, dass das Tensid beispielsweise durch konventionelle Ionenaustauschchromatographie oder besonders bevorzugt durch organische Lösungsmittelextraktion entfernt werden kann. Weiterhin wird erwogen, dass das Tensid vor, anschließend oder während des Entfernens des Präzipitats aus dem Gemisch, entfernt werden kann.
In einer bevorzugten Ausführungsfonn wird das Zwittergent^® Tensid aus dem Gemisch gleichzeitig mit dem Präzipitat durch die organische Lösungsmittelextraktion entfernt. Beispielsweise kann im Anschluss an die Produktion des Präzipitats das sich ergebende Gemisch mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert werden, das das Tensid löst, und mit einem Amöbocytenlysat kompatibel ist. In einer beispielhaften Vorschrift wird das organische Lösungsmittel dem Gemisch des Amöbocytenlysats und Tensids zugesetzt und die Kombination sorgfältig vermischt. Nach der Extraktion kann die Kombination aufgetrennt werden, um ein Drei-Phasen-System zu erzeugen, das eine organische Phase, eine Präzipitatinterphase und eine wässrige Phase enthält. Wenn ein organisches Lösungsmittel, beispielsweise Chloroform, verwendet wird, befindet sich die sich ergebende wässrige Phase über der organischen Phase, wobei das Präzipitat an der Grenzfläche der organischen und wässrigen Phasen vorliegt.
Es wird erwogen, dass jegliches organisches Lösungsmittel, das das Tensid löst und das mit dem Amöbocytenlysat kompatibel ist (d.h. die Faktor-C-Kaskade nicht beeinträchtigt) zur Entfernung des Tensids verwendet werden kann. Es wurde ebenfalls erwähnt, dass bestimmte organische Lösungsmittel zur Entfernung oder Inaktivierung von Lysat-Inhibitoren verwendet werden könne, die, wenn sie entfernt oder inaktiviert werden, die Empfindlichkeit des sich ergebenden Lysats gegenüber En dotoxin erhöhen. Siehe beispielsweise US-Patente Nr. 4 107 077 und 4 279 774, deren Offenbarungen durch diese Bezugnahme hierin mit aufgenommen sind. Demgemäß kann es bevorzugt sein, ist jedoch nicht essentiell, dass das organische Lösungsmittel, das zur Entfernung des Tensids verwendet wird, ebenfalls die Lysat-Inhibitoren entfernen oder inaktivieren kann. Bevorzugte Lösungsmittel schließen ohne Einschränkung Chloroform, Indoform, Bromoform, Niederalkylhalogenide wie beispielsweise Methylbromid, Methylchlorid, Methyliodid, Ethylchlorid, Ethyliodid, Propylchlorid, Propylbromid und Propyliodid, Ethylendichlorid, Methylendichlorid, Benzol, Monohalobenzole wie beispielsweise Chlorbenzol, Brombenzol und Iodbenzol, Niederalkylether wie beispielsweise Dimethylether und Diethylether, Kohlenstofftetrachlorid, Trichlorethan, Trichlorethylen, Toluol und Hexan ein. Die Auswahl des optimalen organischen Lösungsmittels für ein spezielles Tensid kann durch Routineexperimente bestimmt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist, wenn Sulfobetaindetergens Zwittergent^® 3-14 verwendet wird, Chloroform das bevorzugte organische Lösungsmittel zur Verwendung in der organischen Extraktion. Chloroform ist nicht nur mit dem Lysat kompatibel und dazu in der Lage, Zwittergent^® 3-14 zu lösen, sondern ist auch dazu in der Lage, bekannte LAL-Inhibitoren in einem Amöbocytenlysat zu entfernen und/oder zu inaktivieren. Es sollte klar sein, dass die Menge des entfernten Detergens, wodurch die Endotoxin-Empfindlichkeit des Lysats verändert werden kann, durch das Variieren des Verhältnisses von Chloroform zu Lysat während der organischen Lösungsmittelextraktion, verändert werden kann.
Im Anschluss an die Extraktion lässt man die sich ergebenden organischen und wässrigen Phasen sich auftrennen. Eine Auftrennung kann durch Zentrifugation beschleunigt werden. Beispielsweise kann die Phasentrennung durch Zentrifugation bei ungefähr 500 G bis ungefähr 2.000 G, am meisten bevorzugt ungefähr 1.200 G beschleunigt werden. Im Anschluss an eine Zentrifugation wird die wässrige Phase gewonnen. Beispielsweise kann, wenn Chloroform verwendet wird, die obere wässrige Phase durch Dekantieren der wässrigen Phase gewonnen werden, wodurch die Grenzflächenmaterialien und die untere Chloroform-organische Phase zurückgelassen wird. Die dekantierte obere wässrige Phase wird vorzugsweise einer zweiten Zentrifugationsrunde unterworfen, beispielsweise bei 5.000 G bis ungefähr 9.000 G, am meisten bevorzugt ungefähr 7.000 G. Die sich ergebende wässrige Phase wird dann abgetrennt und aus restlichem Grenzflächenmaterial und/oder organischer Phase gewonnen und entweder gelagert oder wie erwünscht zubereitet. Es wird jedoch zu schätzen gewusst, dass die optimale Zahl und der Umfang der Zentrifugationsschritte für ein spezielles System durch Routineexperimente bestimmt werden kann.
Die sich ergebende obere wässrige Phase kann bei reduzierten Temperaturen gelagert oder sofort zubereitet werden. Wenn beispielsweise das Lysat gefroren ist, kann es seine Aktivität bzw. Wirksamkeit unbegrenzt beibehalten, wohingegen, wenn das Lysat bei 2 bis 8° C gelagert wird, es seine Aktivität für mehrere Wochen aufrechterhalten kann. Die Reduktion der Faktor-G-Aktivität der sich ergebenden Amöbocytenlysat-Zubereitungen können unter Verwendung irgendeiner der hierin nachstehend beschriebenen Techniken bestimmt werden.
Erhöhung der Empfindlichkeit von Amöbocytenlysat-Zubereitungen gegenüber Endotoxin
Wie hierin oben diskutiert wurde, hat sich herausgestellt, dass die Empfindlichkeit einer Amöbocytenlysat-Zubereitung mit einer reduzierten Faktor-G-Aktivität gegenüber Endotoxin durch Zusatz eines exogenen (1→3)-β-D-Glucans erhöht werden kann. Eine Zunahme der Empfindlichkeit soll bedeuten, dass das Lysat mit dem Additiv rascher zur Erzeugung eines Produktes bei niedrigeren Endotoxin-Konzentrationen als das Lysat ohne Additiv reagiert. Insbesondere kann (1→3)-β-D-Glucan der Lysat-Zubereitung in einer Menge zugesetzt werden, die ausreichend ist, um die Endotoxin-Empfindlichkeit der Lysat-Zubereitung bezüglich einer ähnlichen Amöbocytenlysat-Zubereitung ohne dem exogen zugesetzten (1→3)-β-D-Glucan zu erhöhen. Es sollte jedoch klar sein, dass die selbe Menge (1→3)-β-D-Glucan, wenn sie dem rohen Amöbocytenlysat zugesetzt wird, wahrscheinlich die Produktion eines Coagulin-Gels über die Faktor-G-Kaskade induzieren würde. Tatsächlich wird während der Ausübung dieser speziellen Ausführungsform der Erfindung überraschenderweise ein Substrat oder Initiator der nunmehr reduzierten oder depletierten Faktor-G-Kaskade der Amöbacytenlysat-Zubereitung der Erfindung zugesetzt. Es wird angenommen, dass diese Art der Steigerung mit jedem Lysat auftreten kann, das bezüglich einer Faktor-G-Aktivität depletiert ist (beispielsweise bei der Faktor G aus dem Lysat entfernt ist oder bei der das Lysat Faktor-G-Inhibitoren enthält).
Die Identifizierung geeigneter (1→3)-β-D-Glucane ebenso wie die Identifizierung optimaler Konzentrationen von (1→3)-β-D-Glucanen zur Erhöhung der Endotoxin-Empfindlichkeit kann durch Routineexperimente unter Verwendung der hierin nachstehend beschriebenen Methoden bestimmt werden. Bezüglich des Typs nützlicher (1→3)-β-D-Glucane wird in Erwägung gezogen, dass jedes (1→3)-β-D-Glucan, das ein Faktor-G-vermittelte Kaskade in Amöbocyten-Rohlysat vermittelt, in der Ausübung dieses Aspekts der Erfindung verwendet werden kann. Gegenwärtig bevorzugte (1→3)-β-D-Glucane schließen ohne Einschränkung natürliche Polysaccharide ein, die aus Zellwänden beispielsweise verschiedener Bakterien (beispielsweise der Art Alcaligenes und Agrobacterium), Hefen (beispielsweise Shiitake) gewonnen wurden, wobei spezielle Beispiele natürlicher Polysaccharide beispielsweise Curdlan, Pachyman, Scleratan, Leutinan, Schizophylan und Coriolan einschließen. Weitere natürliche Polysaccharide schließen Speicherpolysaccharide von Algen, beispielsweise Braunalgen, Euglena, Diatoma ein, wobei spezielle Beispiele von Speicherpolysacchariden, beispielsweise Laminaran, Laminarin und Paramilon einschließen. Bevorzugte (1→3)-β-D-Glucane schließen ebenfalls beispielsweise Polysaccharidderivate ein, bei denen zumindest eine Gruppe, die aus einer Carboxymethylgrup pe, einer Carboxyethylgruppe, einer Methylgruppe, einer Hydroxyethylgruppe, einer Hydroxypropylgruppe und einer Sulfopropylgruppe ausgewählt ist, in ein natürliches Polysaccharid oder Speicherpolysaccharid unter Verwendung konventioneller Methodiken eingebracht wird, die in der Technik bekannt sind. Siehe beispielsweise Munio Kotake „Daiyukikagaku" Bd. 19, 7. Ausg., Asakura Shoten, 10. Mai 1967, Seiten 70-110; A. E. Clarke et al. (1967) Phytochemistry 1: 175-188; und T. Sasaki et al. (1967) Europ. J. Cancer, 15: 211-215. Weitere natürlich vorkommende Polysaccharide können aus Baumwolle, beispielsweise Baumwollextrakten und bestimmten Cellulose-basierten Filtern, die in der Verarbeitung von Medikamenten verwendet werden, abgeleitet werden. Siehe beispielsweise Roslansky et al. (1991) J. Clin. Micro. 29: 2477; Henne et al. (1984) Artif. Organs 8: 299; und Ikemura et al. (1989) J. Clin. Micro. 27: 1965. Es wird weiterhin in Erwägung gezogen, dass die vorher erwähnten Polysaccharide und Derivate hiervon entweder alleine oder in Kombination miteinander verwendet werden können, um die Empfindlichkeit gegenüber Endotoxin zu erhöhen.
Obwohl es erwogen wird, dass jede Menge an (1→3)-β-D-Glucan, die die Empfindlichkeit des Amöbocytenlysats gegenüber Endotoxin erhöht, bezüglich eines ähnlichen Amöbocytenlysats ohne dem exogen zugesetzten (1→3)-β-D-Glucan in der Ausübung dieses Aspekts der Erfindung verwendet werden kann, kann die optimale Menge an exogenem (1→3)-β-D-Glucan zur Erhöhung der Endotoxin-spezifischen Kaskade in einem speziellen Lysat durch Routineexperimente bestimmt werden. Beispielsweise kann die optimale Konzentration durch Zusetzen unterschiedlicher Mengen an speziellem (1→3)-β-D-Glucan zu rohem Amöbocytenlysat bestimmt werden, wobei die optimale Menge die Menge an (1→3)-β-D-Glucan ist, die die rascheste Coagulin-Gerinnung oder Farbbildung im rohen Amöbocytenlysat induziert. Siehe beispielsweise die hierin nachstehend offenbarten Beispiele 4, 5 und 6. Diese Assayvorschriften werden als beispielhaft angesehen und es sollte für den Fachmann auf dem Gebiet klar sein, dass dieser eine Vielzahl von Assays verwenden kann, beispielsweise Gel-Gerinnung, kinetrisch-turbidimetrisch, turbidimetrisch Endpunkt und chromogene Assays, um die optimale Menge an (1→3)-β-D-Glucan, die dem Lysat von Interesse zugesetzt werden soll, zu bestimmen.
Wenn einmal die optimale Konzentration eines speziellen (1→3)-β-D-Glucans zur Erhöhung der Endotoxin-Empfindlichkeit bestimmt wurde, dann kann dieselbe Menge des (1→3)-β-D-Glucans einer Amöbocytenlysat-Zubereitung mit einer reduzierten oder eliminierten Faktor-G-Aktivität zugesetzt werden, um dadurch die Endotoxin-Empfindlichkeit des sich ergebenden Gemisches zu erhöhen. Es wird in Erwägung gezogen, dass die Endotoxin-Empfindlichkeit irgendeines Amöbocytenlysats, das eine reduzierte Faktor-G-Aktivität aufweist, durch Zusatz von (1→3)-β-D-Glucan gesteigert werden kann. Es wird beispielsweise in Erwägung gezogen, dass die Endotoxin-Empfindlichkeit irgendeines Amöbocytenlysats mit einer reduzierten Faktor-G-Aktivität durch Zusatz von exogenem (1→3)-β-D-Glucan erhöht werden kann.
Zubereitung des Amöbocytenlysats
Das sich ergebende Lysat kann unter Verwendung konventioneller Methodik, die in der Technik wohlbekannt und sorgfältig diskutiert wurde, formuliert werden. Siehe beispielsweise R.B. Prior, Hsg., (1990) „Clinical Applications of the Limulus Amebocyte Lysate Test", CRC Press, und US-Patent Nr. 4 322 217, deren Offenbarungen durch diese Bezugnahme hierin mit aufgenommen sind. Verfahren zur Erhöhung der Empfindlichkeit von Amöbocytenlysat können ohne Einschränkung die Alterung von rohem Amöbocytenlysat, die Einstellung des pH, die Einstellung der zweiwertigen Kationenkonzentration, der Einstellung der Coagulogen-Konzentration, der Chloroform-Extraktion und des Zusatzes von Serumalbumin, biokompatiblen Puffern und/oder biologischen Detergentien einschließen.
Beispielsweise können typische Formulierungsadditive ohne Einschränkung ungefähr 100-300 mM NaCl, ungefähr 10-100 mM zweiwertige Kationen (beispielsweise Mg²⁺ oder Ca²⁺), biokompatible Puffer, beispielsweise Tris, um einen endgültigen pH von ungefähr 6,8 bis 8,0 zu ergeben, und, falls das Lysat gefriergetrocknet werden soll, können Zucker, beispielsweise Mannitol oder Dextran, zugesetzt werden. Es wird erwogen, dass die Auswahl geeigneter Formulierungsadditive durch Routineexperimente bestimmt werden kann.
Lysat wird, wenn es einmal formuliert ist, typischerweise zur Langzeitlagerung lyophilisiert bzw. gefriergetrocknet. Die lyophilisierten Amöbocytenlysat-Zubereitungen können vor Anwendung durch Zusatz von beispielsweise Pyrogen-freiem Wasser oder irgendeinem anderen Pyrogen-freien biokompatiblen Puffer rekonstituiert werden.
Verfahren zur Messung bakterieller Endotoxine
Es wird in Erwägung gezogen, dass die Amöbocytenlysat-Zubereitungen der Erfindung zum Nachweisen und/oder Quantifizieren der Menge eines Endotoxins in irgendeiner Probe von Interesse verwendet werden können. Es wird beispielsweise in Erwägung gezogen, dass das Lysat dazu verwendet werden kann, die Konzentration eines Endotoxins in einer pharmazeutischen Zubereitung nachzuweisen und/oder zu messen, beispielsweise eines organisch produzierten Arzneistoffes oder eines rekombinant produzierten Proteins und/oder einer medizinischen Vorrichtung von Interesse. Zusätzlich kann das Lysat dazu verwendet werden, um die Konzentration eines Endotoxins in biologischen Proben nachzuweisen und/oder zu messen, beispielsweise von Blut, Serum, Plasma, Urin, Samen, Ascitesflüssigkeit, Peritonealflüssigkeit, Sputum, Brustexsudat und Spinalflüssigkeit.
Es wird erwogen, dass das Amöbocytenlysat der Erfindung zum Nachweisen und/oder Quantifizieren eines bakteriellen Endotoxins in einer Probe unter Verwendung irgendeines Lysat-basierten Assays verwendet werden kann, der jetzt bekannt ist oder später entwickelt wird, und der eine oder mehrere Produkte der Faktor-C-Kaskade nachweist. Es wird jedoch erwogen, dass die Amöbocytenlysat-Zubereitung der Erfindung vorteilhafterweise in jedem konventionellen Gel-Gerinnungs-, turbidimetrischen Endpunkts-, kinetisch-turbidimetrischen oder chromogenen Assay verwendet werden kann, der in der Technik bekannt ist und/oder verwendet wird. Die Einzelheiten jedes dieser vier Typen von Assays sind unten beschrieben.
(i) Gel-Clot-Assay
Diese Technik wird in Prior, R.B., Hsg., siehe oben, Seiten 28-34 beschrieben, deren Offenbarung durch diese Bezugnahme hierin mit aufgenommen und deswegen nicht im Detail beschrieben ist. Kurz gesagt, umfasst der Gel-Clot-Assay die Schritte des (i) Vermischens einer Amöbocytenlysat-Zubereitung mit der zu untersuchenden Probe, (ii) ein Inkubieren des sich ergebenden Gemisches bei einer Temperatur von 0 bis 40° C, vorzugsweise 25 bis 40° C für eine vorherbestimmte Zeitspanne, beispielsweise eine Stunde, und (iii) die visuelle Überprüfung, ob oder ob nicht ein Gel-Clot bzw. Gel-Gerinsel erzeugt wurde.
(ii) Turbidimetrischer Endpunktassay
Diese Technik ist in Prior, R.B., Hsg. siehe oben, Seiten 28-34 beschrieben und ist deswegen hierin nicht im Detail beschrieben. Kurz gesagt, umfasst der turbidimetrische Endpunktassay die Schritte des (i) Vermischen einer Amöbocytenlysat-Zubereitung mit einer zu untersuchenden Probe, (ii) das Inkubieren des sich ergebenden Gemisches bei einer Temperatur von 0 bis 40° C, vorzugsweise 25 bis 40° C für eine vorher bestimmte Zeit, und (iii) das Messen der Zunahme der Trübung als Folge einer Coagulation, falls vorhanden, unter Verwendung eines herkömmlichen Coagulometers, Nepherometers, Spektrophotometers oder dergleichen.
(iii) Kinetischer turbidimetrischer Assay
Diese Technik ist in Prior, R.B., Hsg., siehe oben, Seiten 28-34 beschrieben und ist deswegen hier nicht im Detail dargelegt. Kurz gesagt, umfasst der kinetische turbidimetrische Assay die Schritte des (i) Mischens einer Amöbocytenlysat-Zubereitung mit einer Probe, die untersucht werden soll, (ii) das Inkubieren des sich ergebenden Gemisches bei einer Temperatur von 0 bis 40° C, vorzugsweise 25 bis 40° C über eine vorherbestimmte Zeitspanne und (iii) das Messen der Zeit, die dazu erforderlich ist, damit entweder eine Veränderung der Trübheit, die durch Coagulation verursacht wird, bis zum Errei chen eines vorher ausgewählten Wertes oder das Verhältnis der Veränderung der Trübheit unter Verwendung eines konventionellen Coagulometers, Nepherometers, Spektrophotometers oder dergleichen zu messen.
(iv) Chromogener Assay
sDiese Technik ist in Prior, R.B., Hsg., siehe oben, Seiten 28-34 und US-Patent Nr. 4 301 245; 4 717 658; und 5 310 657 beschrieben, deren Offenbarungen durch diese Bezugnahme hierin mit aufgenommen und deswegen nicht im Detail beschrieben sind. Kurz gesagt, umfasst der chromogene Assay die Schritte des (i) Mischens einer Amöbocytenlysat-Zubereitung mit einer Probe, die untersucht werden soll, (ii) das Inkubieren des sich ergebenden Gemisches bei einer Temperatur von 0 bis 40° C, vorzugsweise 25 bis 40° C für eine vorherbestimmte Zeitspanne, dann, falls notwendig, das Zusetzen eines Reaktionsinhibitors und (iii) das Messen einer Substanz, die durch eine Protease-Aktivität aus dem synthetischen Substrat freigesetzt wird, colorimetrisch oder dergleichen.
Beispiele
Die Ausübung der Erfindung wird durch die folgenden Beispiele klarer verständlich werden, die hierin lediglich zu illustrativen Zwecken dargelegt sind und den Umfang der Erfindung keinesfalls beschränken sollen.
Beispiel 1: Zubereitung und Charakterisierung von Amöbocytenlysat das bezüglich einer Faktor-G- Aktivität depletiert ist
Dieses Beispiel beschreibt ein bevorzugtes Verfahren zur Erzeugung eines Amöbocytenlysates, das eine reduzierte Faktor-G-Aktivität aufweist. Während des gesamten Verfahrens werden alle Reagenzien und Vorrichtungen, wo dies angebracht ist, so erzeugt oder behandelt, dass sie Pyrogen-frei sind. Eine solche Methodik ist in der Technik wohlbekannt und wird deswegen hierin nicht im Detail diskutiert werden. Beispielsweise kann die Vorrichtung bzw. der Apparat durch Erwärmen in einem Ofen auf ≥ 200° C für 4 Stunden Pyrogen-frei gemacht werden, und Reagenzien können durch Behandlung durch Ultrafiltration (≤ 20 kD Cut-off) Oxidation mit Peroxid oder Behandlung mit NaOH Pyrogenfrei gemacht werden.
Ein rohes Amöbocytenlysat wurde durch Gewinnen von Hämolymphe aus Hufeisenkrabben hergestellt. Die sich ergebende Hämolymphe wurde zur Erzeugung eines Amöbocyten-Pellets zentrifugiert. Die Amöbocyten wurden dann erneut gewonnen, erneut gespült und erneut zentrifugiert. Nach dem zweiten Spülen und Gewinnungsschritten wurden die sich ergebenden Amöbocyten durch osmoti schen Schock lysiert und das sich ergebende rohe Amöbocytenlysat bis zur weiteren Anwendung bei 2 bis 8° C aufbewahrt.
Danach wurde Zwittergent^® 3-14 schrittweise dem Rohlysat bis zu einer Endkonzentration von 0,12% (G/V) zugesetzt. Die sich ergebende Lösung wurde für 8 bis 24 Stunden bei 2 bis 8° C aufbewahrt. Danach wurde die Lösung mit Chloroform (4 bis 5 Teile Lysat zu 1 Teil Chloroform) durch sanftes Rühren für 10 bis 30 Minuten bei 2 bis 8° C vermischt. Das sich ergebende Gemisch wurde dann bei 1.200 G für 15 Minuten zentrifugiert, wonach die sich ergebende obere wässrige und untere organische Phase durch Grenzflächenpräzipitat-Material abgetrennt waren. Die wässrige Phase wurde dann durch Dekantieren gewonnen und bei 7.000 G für zumindest 30 Minuten zur Erreichung einer Klarheit rezentrifugiert. Nach Zentrifugation wurde die sich ergebende wässrige Phase von der restlichen organischen Phase und dem Grenzflächenmaterial dekantiert. Der Umfang der Detergens-Extraktion wurde durch Dünnschichtchromatographie (TLC) geschätzt. Kurz gesagt, wurden Proben eines Chloroformextraktes und -lysates auf einer TLC-Platte (Whatman PE SIL GLUV) aufgebracht, die mit Methanol:Wasser (10:1 (V/V)) entwickelt wurden, und das Detergens wurde mit UV-Licht visualisiert. Durch dieses Verfahren war kein restliches Detergens im Lysat nachweisbar.
Die Fraktionierung des rohen Amöbocytenlysats, des durch das Tensid erzeugten Präzipitats und des Überstandes, das das Amöbocytenlysat enthält, durch Natriumdodecylsulfatpolyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-Page) legt nahe, dass Faktor G tatsächlich im Präzipitat enthalten ist und deswegen aus dem Lysat entfernt wurde. Densitometrische Profile jeder Bahn des sich ergebenen Coomassie-Blau-gefärbten SDS-PAGE-Gels sind in 3 dargestellt.
In 3 repräsentiert Bahn 1 das densitometrische Profil von Molekulargewichtsmarkern, wobei Peak 2 ein Protein mit einem Molekulargewicht von 66 kD repräsentiert, Peak 3 ein Protein mit einem Molekulargewicht von 45 kD repräsentiert und Peak 4 ein Protein mit einem Molekulargewicht von 36 kD repräsentiert, Peak 5 ein Protein mit einem Molekulargewicht von 29 kD repräsentiert, Peak 6 ein Protein mit einem Molekulargewicht von 24 kD repräsentiert, Peak 7 ein Protein mit einem Molekulargewicht von 20 kD repräsentiert, Peak 8 ein Protein mit einem Molekulargewicht von 14,2 kD repräsentiert und Peak 9 ein Protein mit einem Molekulargewicht von 6,5 kD repräsentiert.
In 3 repräsentiert Bahn 2 eine fraktionierte Probe von rohem Amöbocytenlysat, wobei die Peaks 12 und 15 offensichtlich die beiden Untereinheiten von Faktor G (eines mit einem Molekulargewicht von ungefähr 76 kD und das andere mit einem Molekulargewicht von ungefähr 36 kD) repräsentieren. Bahn 3 repräsentiert eine fraktionierte Probe von Amöbocytenlysat-Überstand im Anschluss an eine Detergens-Präzipitation. Gemäß Bahn 3 scheint, dass der Überstand der 76-kD-und 36-kD-Faktor-G-Untereinheiten depletiert ist. Bahn 4 repräsentiert eine fraktionierte Probe des Lysat-Präzipitats. Ge mäß Bahn 4 scheint, dass das Präzipitat die 76-kD- und 36-kD-Untereinheiten von Faktor G enthält (Peaks 29 bzw. 33/34). Es scheint gemäß dieser Profile, dass Faktor G tatsächlich aus dem Lysat durch das Tensid präzipitiert wurde.
Beispiel 2: Formulierung eines Amöbocytenlysats das bezüglich einer Faktor-G-Aktivität depletiert ist
Im Anschluss an die Zubereitung der Amöbocytenlysat-Zubereitung der Erfindung wurde das sich ergebende Lysat wie folgt formuliert:
Die sich ergebende Formulierung wurde bis zur Anwendung bei 2 bis 8° C aufbewahrt.
Beispiel 3: Reaktivität von rohem Amöbocytenlysat und Lysat das bezüglich einer Faktor-G-Aktivität depletiert ist, mit bakteriellem Endotoxin
Dieses Beispiel demonstriert, dass Amöbocytenlysat der Erfindung nach wie vor mit bakteriellem Endotoxin reagiert, wie es durch den Gel-Clot-Assay bestimmt wurde. Drei Chargen bzw. Ansätze Amöbocytenlysat mit reduzierter Faktor-G-Aktivität (bezeichnet als L4941LB, L1081LB, L1711LB) wie durch das Verfahren von Beispiel 1 erzeugt und wie in Beispiel 2 beschrieben formuliert, wurden bezüglich einer Endotoxin-Reaktivität unter Verwendung eines Gel-Clot-Assays getestet. Die Chargen L4941LB und L1081LB wurden ebenfalls mit 0,4% Bulkingprotein und 0,01% Zwittergent^® 3-14 formuliert.
Die Endotoxin-Reaktivität jedes Lysatansatzes wurde simultan mit einem Kontrollansatz des Lysats bestimmt, bezeichnet als Referenzlysat Serie 13, bezogen von der USFDA. Der Endotoxin-Standard, der bei jeder Bestimmung verwendet wurde, wurde von der USFDA bezogen und wird hierin als EC-6 bezeichnet. Kurz gesagt, wurde eine Standardlösung des EC-6-Endotoxins hergestellt. Danach wurde das Endoxin den Referenzlysaten zugesetzt, um eine endgültige Endotoxin-Konzentration von 0,5, 0,25, 0,125, 0,06 oder 0,03 EU/ml zu ergeben. In ähnlicher Weise wurde Endotoxin den Testlysaten zugesetzt, um eine endgültige Toxinkonzentration von 0,06, 0,03, 0,015 oder 0,007 EU/ml zu ergeben. Nach dem Mischen wurden die sich ergebenden Gemische bei 37° C für 1 Stunde inkubiert, wonach das Vorhandensein oder die Abwesenheit eines Gerinsels bzw. Clots bemerkt wurde. Alle Proben wurden gleich behandelt.
Um die Integrität des Assays sicherzustellen, wurden die Assays in einer speziellen Reihenfolge durchgeführt. Beispielsweise wurde ein erster Ansatz von vier Referenzlysatproben (bezeichnet durch Test Nr. 1 in den Tabellen 1, 3 und 5) zunächst analysiert, danach der Ansatz aus 10 Lysattestproben formuliert wie beschrieben in Beispiel 2 (durch die Vial-Nummern 1 bis 10 in den Tabellen 2, 4 und 6 bezeichnet) und letztendlich wurde eine zweite Charge bzw. Ansatz von vier Referenzlysatproben (bezeichnet durch Test Nr. 2 in den Tabellen 1, 3 und 5) analysiert.
Jede Testprobe wurde Seite an Seite mit einem Referenzlysat analysiert. Demgemäß wurden die Daten bezüglich der Reaktivität von Referenzlysat 13 (Tabelle 1) gleichzeitig mit den Daten abgeleitet, bezüglich der Reaktivität des Testlysats der Chargen-Nr. L1711LB (Tabelle 2). Gemäß Tabelle 1 wies die Reaktivität von Referenzlysat 13 einen Endpunktwert (E.Pt.) von 0,06 EU/ml für das Assay auf (d. h. innerhalb eines anerkannt akzeptablen Niveaus). Gemäß Tabelle 2 wies die Reaktivität des Testlysats L1711LB (10 Proben) einen Endpunkt auf, der auf 0,06 EU/ml getestet wurde. Demgemäß war das Testlysat L1711LB innerhalb eines akzeptablen Sensitivitätsniveaus. Tabelle 1- Referenzlysat Serie 13, Endotoxin Serie EC-6

Durchschnitt (Log₂): -4
S.D. (Standardabweichung)(Log₂ Daten): –
Geometrisches Mittel: 0,06
Festgestellter Endpunkt: 0,06 EU/ml

Durchschnitt (Log₂): -4
S.D. (Log₂ Daten): –
Geometrisches Mittel: 0,06
Festgestellter Endpunkt: 0,06 EU/ml

In ähnlicher Weise wurden Daten bezüglich der Reaktivität von Referenzlysat 13 (Tabelle 3) mit Daten gleichzeitig abgeleitet, die auf die Reaktivität des Testlysatansatzes Nr. L1081LB (Tabelle 4) bezogen waren. Gemäß Tabelle 3 wies die Reaktivität von Referenzlysat 13 einen Endpunktwert (E.Pt.) von 0,06 EU/ml für den Assay auf (d.h. innerhalb eines anerkannt akzeptablen Niveaus). Gemäß Tabelle 4 wies die Reaktivität von Testlysat L1081LB (10 Proben) einen Endpunktwert auf, der auf 0,015 EU/ml getestet wurde. Demgemäß war das Testlysat L1081LB gegenüber Endotoxin empfindlicher als das Referenzlysat. Tabelle 3 – Referenzlysat Serie 13, Endotoxin Serie EC-6

Durchschnitt (Log₂): -4
S.D. (Log₂ Daten): –
Geometrisches Mittel: 0,015
Festgestellter Endpunkt: 0,015 EU/ml

Zusätzlich wurden Daten bezüglich der Reaktivität von Referenzlysat 13 (Tabelle 5) gleichzeitig mit Daten abgeleitet, die auf die Reaktivität des Testlysats Chargen-Nr. L4941LB bezogen waren (Tabelle 6). Gemäß Tabelle 5 wies die Reaktivität von Referenzlysat 13 einen Endpunktwert (E.Pt.) von 0,06 EU/ml für das Assay auf (d.h. innerhalb eines anerkannt akzeptablen Niveaus). Gemäß Tabelle 6 wies die Reaktivität des Testlysats L4941LB (10 Proben) einen Endpunktwert auf, der auf 0,03 EU/ml getestet wurde. Demgemäß war das Testlysat L4941LB gegenüber dem Endotoxin empfindlicher als das Referenzlysat. Tabelle 5 – Referenzlysat Serie 13, Endotoxin Serie EC-6

Durchschnitt (Log₂): -5,46
S.D. (Log₂ Daten): 0,52
Geometrisches Mittel: 0,02
Festgestellter Endpunkt: 0,03 EU/ml

Alle drei Chargen des Lysats, nämlich L4941LB, L1081LB und L1711LB entsprachen den 24-stündigen Negativkontrollerfordernissen, wie es von der USFDA gefordert wird.
Beispiel 4: Reaktivität von rohem Amöbocytenlysat und Lysat, das bezüglich Faktor-G-Aktivität depletiert wurde, mit Laminarin
Dieses Beispiel demonstriert, dass Limulus-Amöbocytenlysate, die durch das Verfahren der Erfindung erzeugt wurden, anders als Roh-Lysate gegenüber dem Vorhandensein von Laminarin in einer Probe unempfindlich sind. Zusätzlich definiert dieses Beispiel die optimale Menge an Laminarin (wie aus der Roh-Lysatprobe bestimmt), die exogen der Lysat-Zubereitung der Erfindung zugesetzt werden kann, wodurch die Empfindlichkeit der Lysat-Zubereitung gegenüber Endotoxin erhöht wird.
Eine Standardlösung von Laminarin wurde durch Lösen von 1,0 g Laminarin in 100 ml 5 mM NaOH zur Erzeugung einer 10-mg/ml-Lösung hergestellt. Die sich ergebende Lösung wurde für 1 Stunde bei 121 ° C autoklaviert. Nach dem Autoklavieren wurde der pH mit 0,1 M Tris-Puffer auf 7,0 eingestellt. Die Lösung wurde dann in Pyrogen-freiem Wasser verdünnt, um eine endgültige Laminarin-Stammlösung von 0,2 mg/ml zu ergeben. Eine Reihenverdünnung von Laminarin wurde hergestellt und die Reaktivität von Roh-Lysat und der Lysat-Zubereitung der Erfindung gegenüber Laminarin wurde sowohl durch Gel-Clot- als auch kinetisch-turbidimetrische Assays bestimmt.
I. Gel-Clot-Assay
Gel-Clot-Assays wurden durch Kombinieren entweder von Roh-Lysat oder Lysat-Zubereitungen der Erfindungen mit unterschiedlichen Mengen an Laminarin durchgeführt. Roh-Lysat (Charge K2222L) wurde im Wesentlichen wie in Beispiel 2 beschrieben formuliert, außer dass „extrahiertes Limulus-Amöbocytenlysat" durch Roh-Lysat ersetzt wurde, und die Konzentration von Laminarin zwischen den Proben variierte. Die Lysat-Zubereitungen der Erfindung (Charge L4941LB, Charge L1081LB und Charge L1711LB) wurden im Wesentlichen wie in Beispiel 3 beschrieben formuliert, außer dass die Konzentration von Laminarin zwischen den Beispielen variiert wurde. Die Proben wurden bei 37° C inkubiert und das Vorhandensein oder die Abwesenheit von Gerinseln nach 1 Stunde bestimmt. Jedes Experiment wurde zweifach durchgeführt und die Ergebnisse sind in Tabelle 7 zusammengefasst.
Tabelle 7
Die schattierten Areale repräsentieren den aktiven Bereich der Probe.
Die Ergebnisse in Tabelle 7 zeigen, dass keine der Chargen, die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung erzeugt wurde (d.h. L4941LB, L1081LB und L1711LB) mit exogen zugesetztem Laminarin reaktiv waren. Im Gegensatz hierzu war die Charge von Roh-Lysat (K2222L) mit Laminarin über den Verdünnungsbereich von 400 bis 6.400 in einem Gel-Clot-Assay reaktiv.
II. Kinetisch-turbidimetrischer Assay
Die Reaktionen wurden durch Kombinieren entweder von formuliertem Roh-Lysat (Charge K2222L) oder formulierten Lysat-Zubereitungen der Erfindung (Charge L4941LB, Charge L1081LB und Charge L1711LB) mit unterschiedlichen Mengen an Laminarin begonnen.
Der Assay wurde unter Verwendung eines Biotek elx-808 Inkubiermikroplatten-Lesegerätes gemäß der Instruktionen des Herstellers durchgeführt. Jeder Assay wurde zumindest zweifach durchgeführt. Während des Assays wurden die Proben bei 37 ± 0,2° C inkubiert und die Daten wurden über eine Zeitspanne von 1 Stunde gesammelt.
Der Assay wurde gleichzeitig unter Verwendung von zusätzlichen Lysatproben durchgeführt, die in Gegenwart bekannter Mengen an Endotoxin-Standards inkubiert wurden. Endotoxin-Standards wurden dazu verwendet, eine Standardkurve zu erzeugen, die einen 4-Log-Bereich abdeckte, beispielsweise von 50 bis 0,005 EU/ml. Nach der Datensammlung wurden die Daten unter Verwendung einer kinetischen Biotek Kc3-cre-Software (erhältlich von Charles River Endosafe, Charleston, SC) analysiert. Die Probenkonzentrationen wurden als „Endotoxinwerte" durch das Gerät interpretiert und wurden durch die Einheiten EU/ml repräsentiert, weil sie aus der Endotoxin-Standardkurve geschätzt wurden. Die sich ergebenden Konzentrationswerte widerspiegeln die Reaktivität des Lysats gegenüber Laminarin und werden als „Endotoxin-äquivalente Werte" bezeichnet.
Durch Plotten der Laminarin-Endotoxin-äquivalenten Werte gegen den Verdünnungsfaktor ist es möglich, eine glockenförmige Kurve mit Roh-Lysat zu erzeugen. Der Peak der Kurve stellt die optimale Menge an Laminarin bereit, die dem Amöbocytenlysat zugesetzt werden kann, dem eine Faktor-G-Aktivität fehlt, wodurch die Empfindlichkeit des Lysats gesteigert wird.
Die Ergebnisse des Experiments sind in 4 dargestellt. Gemäß 4 war keiner der durch das erfindungsgemäße Verfahren erzeugten Ansätze (d.h. L4941LB, L1081LB und L1711LB) mit exogen zugesetztem Laminarin reaktiv. Im Gegensatz hierzu war der Ansatz von Roh-Lysat (K2222L) mit Laminarin über den Verdünnungsbereich von 100 bis 51.200 reaktiv, wobei der Verdünnungswert von 3.200 den maximalen Endotoxin-äquivalenten Wert erzeugte. Demgemäß repräsentiert dieser Wert die optimale Menge an Laminarin, die dem an Faktor-G-Aktivität depletierten Amöbocytenlysat zugesetzt werden sollte, um eine maximale Empfindlichkeit gegenüber Endotoxin in einem turbidimetrischen kinetischen Assay bereitzustellen.
Beispiel 5: Reaktivität von rohem Amöbocytenlysat und Lysat, das bezüglich einer Faktor-G-Aktivität depletiert ist, mit LAL-reaktivem Material
Dieses Beispiel demonstriert, dass Limulus-Amöbocytenlysate, die durch das erfindungsgemäße Verfahren erzeugt wurden, anders als Roh-Lysate gegenüber dem Vorhandensein von LAL-reaktivem Material (LAL-RM) in der Probe unempfindlich sind, das durch Spülen eines Celluloseacetat-Filters mit Wasser erzeugt wurde. Zusätzlich definiert dieses Beispiel die optimale Menge dieses LAL-RM (wie aus der Roh-Lysat-Probe bestimmt), die exogen der Lysat-Zubereitung der Erfindung zugesetzt werden kann, wodurch die Empfindlichkeit der Lysat-Zubereitung gegenüber Endotoxin gesteigert werden kann.
LAL-RM wurde durch Passieren eines Liters Pyrogen-freien Wassers durch eine konventionelle sterile, nicht-pyrogene Celluloseacetat-Hohlfasermembran hergestellt, die zur Verwendung in der Nierendialyse angepasst war. Die sich ergebende Spülung wurde dann dazu verwendet, eine Verdünnungsreihe einer Celluloseacetat-Spülung zu erzeugen. Die Reaktivität von Roh-Lysat und der Lysat-Zubereitung der Erfindung gegenüber der Celluloseacetat-Spülung wurde sowohl durch Gel-Clot- als auch kinetisch-turbidimetrische Assays bestimmt.
I. Gel-Clot-Assay
Die Gel-Clot-Assays wurden wie in Beispiel 4, oben beschrieben, durchgeführt, außer dass in den Formulierungen Laminarin durch die Celluloseacetat-Spülung ersetzt wurde. Die Assays wurden durch Vereinigen entweder von formuliertem Roh-Lysat (Ansatz K2222L) oder von formulierten Lysat-Zubereitungen der Erfindung (Ansatz L4941LB, Ansatz L1081LB und Ansatz L1711LB) mit unterschiedlichen Mengen einer Celluloseacetat-Spülung durchgeführt. Die Proben wurden bei 37° C inkubiert und das Vorliegen oder die Abwesenheit von Clots wurde nach einer Stunde bestimmt. Jedes Experiment wurde zweifach durchgeführt und die Ergebnisse sind in Tabelle 8 zusammengefasst.
Tabelle 8
Die schattierten Areale repräsentierten den aktiven Probenbereich.
Die Ergebnisse von Tabelle 8 zeigen, dass keine der durch das Verfahren der Erfindung erzeugten Ansätze (d.h. L4941LB, L1081LB und L1711LB) mit exogen zugesetzter Celluloseacetat-Spülung reaktiv waren, wie es durch den Gel-Clot-Assay bestimmt wurde. Im Gegensatz hierzu war der Ansatz von Roh-Lysat (K2222L) mit Celluloseacetat über den Verdünnungsbereich von 50 bis 6.400 in einem Gel-Clot-Assay reaktiv.
II. Kinetisch-turbidimetrischer Assay
Dieser Assay wurde wie in Beispiel 4 II, oben beschrieben, durchgeführt, außer dass in den Formulierungen Laminarin durch eine Celluloseacetat-Spülung ersetzt wurde. Die Reaktionen wurden durch Kombinieren entweder von Roh-Lysat (Ansatz K22222L) oder Lysat-Zubereitungen der Erfindung (Ansatz L4941LB, Ansatz L1081LB und Ansatz L1711LB) mit unterschiedlichen Mengen an Celluloseacetat-Spülung gestartet. Die Ergebnisse des Assays sind in 5 dargestellt. Gemäß 5 war keiner der durch das Verfahren der Erfindung produzierten Ansätze (d.h. L4941LB, L1081LB und L1711LB) mit exogen zugesetztem Celluloseacetat reaktiv. Im Gegensatz hierzu war der Ansatz des Roh-Lysats (K2222L) mit Celluloseacetat über den Verdünnungsbereich von 50 bis 102.400 reaktiv, wobei der Verdünnungswert von 400 den maximalen Endotoxin-Äquivalenzwert erzeugte. Demgemäß repräsentiert dieser Wert die optimale Menge an Celluloseacetat, die dem im Hinblick auf die Faktor-G-Aktivität depletierten Amöbocytenlysat zugesetzt werden soll, um die maximale Empfindlichkeit gegenüber Endotoxin in einem kinetisch-turbidimetrischen Assay bereitzustellen.
Beispiel 6: Reaktivität von rohem Amöbocytenlysat und Lysat, das bezüglich einer Faktor-G-Aktivität depletiert ist, mit Baumwollextrakt
Dieses Beispiel demonstriert, dass Limulus-Amöbocytenlysate, die durch das Verfahren der Erfindung produziert wurden, anders als Roh-Lysate, gegenüber der Anwesenheit von Baumwollextrakt in der Probe unempfindlich sind. Zusätzlich definiert dieses Beispiel die optimale Menge an Baumwollextrakt (wie aus der Roh-Lysat-Probe bestimmt), die exogen der Lysat-Zubereitung der Erfindung zugesetzt werden kann, wodurch die Empfindlichkeit der Lysat-Zubereitung gegenüber Endotoxin gesteigert werden kann.
Baumwollextrakt wurde wie folgt hergestellt. Ungefähr 1 g Baumwolle (ungefähr 4 1 Zoll (Inch) Baumwoilbällchen) wurden 40 ml 1 N NaOH in einem konischen 50-ml-Polystyrolröhrchen zugesetzt. Danach wurde das Gemisch bei Raumtemperatur (ungefähr 20° C) für 10 Tage inkubiert. Vor der An wendung wurde die Lösung aus der Baumwolle in ein frisches, Pyrogen-freies Röhrchen (erwärmt 6 Stunden auf 200° C) dekantiert und mit HCl neutralisiert, um eine Stammlösung des Baumwollextraktes herzustellen. Weitere Verdünnungen wurden in Pyrogen-freiem Wasser (erhältlich von Charles River Endosafe, Charleston, SC) vorgenommen. Die Reaktivität des Roh-Lysats und der Lysat-Zubereitung der Erfindung gegenüber Baumwollextrakt wurde sowohl durch Gel-Clots- als auch kinetisch-turbidimetrische Assays bestimmt.
I. Gel-Clot-Assay
Die Gel-Clot-Assays wurden wie in Beispiel 41, oben beschrieben, durchgeführt, außer dass bei den Formulierungen Laminarin durch Baumwollextrakt ersetzt wurde. Die Assays wurden durch Kombinieren entweder von formuliertem Roh-Lysat (Ansatz K2222L) oder formulierten Lysat-Zubereitungen der Erfindung (Ansatz L4941LB, Ansatz L1081LB und Ansatz L1711LB) mit unterschiedlichen Mengen Baumwollextrakt formuliert. Die Proben wurden bei 37° C inkubiert und das Vorhandensein oder die Abwesenheit von Clots wurde nach einer Stunde bestimmt. Jedes Experiment wurde zweifach durchgeführt und die Ergebnisse sind in Tabelle 9 zusammengefasst.
Tabelle 9
Schattierte Areale repräsentieren den aktiven Probenbereich.
Die Ergebnisse in Tabelle 9 zeigen, dass keine der durch das erfindungsgemäße Verfahren erzeugten Ansätze (d.h. L4941LB, L1081LB und L1711LB) mit exogen zugesetztem Baumwollextrakt reaktiv waren. Im Gegensatz hierzu war das Roh-Lysat (K2222L) mit Baumwollextrakt über den Verdünnungsbereich von 100 bis 800 in einem Gel-Clot-Assay reaktiv.
II. Kinetisch-turbidimetrischer Assay
Dieser Assay wurde wie in Beispiel 4 II, oben, durchgeführt, außer dass in den Zubereitungen Laminarin durch Baumwollextrakt ersetzt wurde. Die Reaktionen wurden durch Kombinieren entweder des Roh-Lysats (Ansatz K2222L) oder von Lysat-Zubereitungen der Erfindung (Ansatz L4941LB, Ansatz L1081LB und Ansatz L1711LB) mit unterschiedlichen Mengen an Baumwollextrakt begonnen. Die Ergebnisse des Assays sind in 6 präsentiert. Gemäß 6 war keiner der durch das Verfahren der Erfindung produzierten Ansätze (d.h. L4941LB, L1081LB und L1711LB) mit exogen zugesetztem Baumwollextrakt reaktiv. Im Gegensatz hierzu war der Ansatz des Roh-Lysats (K2222L) mit Baumwollextrakt über den Verdünnungsbereich von zumindest 100 bis 3.200 reaktiv. Es scheint gemäß der Ergebnisse, dass Baumwollextrakt ebenfalls verwendet werden kann, um die Empfindlichkeit von Faktor-G-depletiertem Lysat gegenüber Endotoxin zu erhöhen.
Beispiel 7: Endotoxin-Empfindlichkeit von Amöbocytenlysat, das bezüglich einer Faktor-G-Aktivität abgereichert ist, mit und ohne (1→3)-β-D-Glucan
Dieses Beispiel demonstriert, dass die Empfindlichkeit eines Amöbocytenlysats gegenüber Endotoxin, das gegenüber einer Faktor-G-Aktivität abgereichert ist, durch Zusatz von exogenem (1→3)-β-D-Glucan erhöht werden kann.
Kurz gesagt, wurde ein Ansatz von Amöbocytentysat, hergestellt gemäß Beispiel 1, im Wesentlichen wie in Beispiel 2 beschrieben formuliert. Ein Kontrollansatz wurde ohne exogen zugesetztes Laminarin formuliert. Die Reaktivitäten von jedem Lysat gegenüber unterschiedlichen Mengen Endotoxin wurde durch kinetisch-turbidimetrischen Assay gemessen, im Wesentlichen wie in Beispiel 4 II beschrieben. Kurz gesagt, wurden unterschiedliche Mengen an Endotoxin (USFDA, Serie EC-6) jeder Lysat-Probe zugesetzt und die Endpunkte der Reaktion durch Bio-tek KC3-cre kinetische Software bestimmt. Die Ergebnisse sind in 7 dargestellt. Die Kreise repräsentieren Proben von Lysat, das nicht mit Laminarin ergänzt wurde (Kontrollproben), und die Kästchen repräsentieren Proben von Lysat, das mit Laminarin ergänzt wurde (Testproben).
Gemäß 7 scheint bei hohen Endotoxin-Konzentrationen (d.h. ungefähr 50 EU/ml) eine geringe Differenz in der Reaktionszeit zwischen Lysat, das mit Laminarin ergänzt wurde, und Lysat, das nicht mit Laminarin ergänzt wurde, zu bestehen. Jedoch reagierte bei niedrigen Endotoxin-Konzentrationen (d.h. ungefähr ≤ 0,05 EU/ml) das mit Laminarin ergänzte Lysat signifikant rascher mit Endotoxin als Lysat, das nicht mit Laminarin ergänzt war. Demgemäß demonstrieren diese Ergebnisse, dass es möglich ist, die Empfindlichkeit eines Amöbocytenlysats, das bezüglich einer Faktor-G-Aktivität abgereichert ist, durch Zusatz von exogenem (1→3)-β-D-Glucan zu erhöhen.

Claims

Verfahren zur Herstellung einer verbesserten Amöbocytenlysat-Zubereitung, die eine reduzierte Faktor-G-Aktivität aufweist, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Vermischen von rohem Amöbocyten-Lysat mit einem Tensid in einer Menge, die ausreichend ist, eine Lösung zu erzeugen, die ein Präzipitat enthält; und (b) Abtrennen des Präzipitats von der Lösung, um dadurch eine Amöbocytenlysat-Zubereitung zu erzeugen, die mit (1→3)-β-D-Glucan weniger reaktiv ist als das rohe Amöbocytenlysat.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Amöbocytenlysat-Zubereitung mit einem bakteriellen Endotoxin reaktiv ist.
Verfahren nach Anspruch 2, das den zusätzlichen Schritt umfasst, exogenes (1→3)-β-D-Glucan der Amöbocytenlysat-Zubereitung in einer Menge zuzusetzen, die ausreichend ist, die Empfindlichkeit der Amöbocytenlysat-Zubereitung gegenüber dem Endotoxin bezüglich der Amöbocytenlysat-Zubereitung ohne exogenem (1→3)-β-D-Glucan zu vergrößern.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei das exogene (1→3)-β-D-Glucan aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus LAL-RM, Curdlan, Pachyman, Scleratan, Leutinan, Schizophyllan, Coriolan, Laminaran und Laminarin besteht.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei das (1→3)-β-D-Glucan Laminarin ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Präzipitat Faktor G enthält.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, der den zusätzlichen Schritt umfasst, das Tensid aus der Lösung zu entfernten (beispielsweise durch organische Lösungsmittelextraktion, wie beispielsweise Chloroform-Extraktion).
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Tensid ein zwitterionisches Tensid ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das zwitterionische Tensid ein Sulfobetain-Typ-Tensid ist.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Sulfobetain-Typ-Tensid aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus n-Octyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propansulfonat, n-Decyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propansulfonat, n-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propan-sulfonat, n-Tetradecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propansulfonat und n-Hexadecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propansulfonat besteht.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Sulfobetain-Typ-Tensid ein n-Tetradecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propansulfonat ist.
Amöbocytenlysat-Zubereitung, die durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5 hergestellt ist.
Zusammensetzung, die eine Amöbocytenlysat-Zubereitung mit reduzierter Faktor-G-Aktivität und exogen in einer Menge zugesetztem (1→3)-β-D-Glucan umfasst, die ausreichend ist, um die Empfindlichkeit der Amöbocytenlysat-Zubereitung gegenüber dem Endotoxin bezüglich der Amöbocytenlysat-Zubereitung ohne dem exogen zugesetzten (1→3)-β-D-Glucan zu erhöhen.
Zusammensetzung nach Anspruch 13, wobei das (1→3)-β-D-Glucan wie in Anspruch 4 oder Anspruch 5 beschrieben ist.
Verwendung einer Zubereitung nach Anspruch 12 oder einer Zusammensetzung nach Anspruch 13 oder 14 in einem Verfahren zum Nachweisen eines bakteriellen Endotoxins.