DE2365629C2 - Verfahren zur Herstellung von Limulina-Lysat oder dessen gefriergetrocknetem Pulver - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von Limulina-Lysat oder dessen gefriergetrocknetem PulverInfo
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Description
a) als Agglutinierungs-Inhibierungsmittel ein Methylderivat von Xanthin der nachstehenden
Formel
Rj
R.
N
C
C
C-
-N
j
R5
20
25
worin Ri, Rj und R3 jeweils ein Wasserstoffatom
oder eine Methylgruppe bedeuten, wobei wenigstens einer der Reste Ri, R2 und R3 eine
Methylgruppe ist, oder ein Salz hiervon verwendet wird, und
b) das Brechen des Amöbocyten ausgeführt wird, indem zu einem isolierten Amöbocyten 20 bis
50 ml eines Extraktionslösungsmittels mit einem pH-Wert von 6,0 bis 8,0, das wenigstens
eine Art von Erdalkaliionen in einer Konzentration von 2 bis 60 mM je 100 ml des abgenommenen Blutes enthält,
zugegeben wird.
2. Verfahren nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß als Erdalkaliionen Magnesiumionen
verwendet werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Extraktionslösungsmittel
ferner wenigstens eine Art von Alkaliionen in einer Konzentration von 10 bis 150 mM enthält.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Extraktionslösungsmittel
eine wäßrige Lösung verwendet wird, die 4 mM Calciumionen, 20 mM Magnesiumionen und 40 mM
Natriumionen enthält.
5. Verfahren nach Anspruch I bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Methylderivate von Xanthin oder deren Salze in einer Konzentration von 03
bis 2 mM in dem Gemisch aus isotonischer Pufferlösung und durch die Blutextraktion erhaltenem Blut verwendet werden.
6. Verfahren nach Anspruch I bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das erhaltene Limulina-Lysat
gefriergetrocknet wird.
7. Limulina-Lysat, hergestellt nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche I bis 6, gekennzeichnet
durch einen Gehalt an Calcium-, Magnesium- und Natriumsalzen in solchen Mengen, daß bei Auflösen
des Lysats in Wasser jeweils eine Konzentration von
2 bis 10 mM Ca+ +, 5 bis 50 mM Mg+ + und 10 bis
150 mM Na+ erhalten wird.
8, Limulina-Lysat nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es Calcium-, Magnesium- und
Natriumsalze in solchen Mengen enthält, daß bei Auflösen des Lysats in Wasser jeweils eine
Konzentration von 4 mM Ca++, 20 mM Mg++ und
40 mM Na+ erhalten wird.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Limulina-Lysat oder dessen gefriergetrocknetem
Pulver aus dem Blut von Königskrabben (Limulina) bei äußerst hoher Ausbeute.
In üblicher Weise erfolgt die Ermittlung von Si'purenmengen von Endotoxin, das in mit Keimen
infiziertem menschlichen Blut vorliegt oder von pyrogenhaltigen Arzneimitteln durch Anwendung des
bilogischen Ansprechvermögens. Jedoch Jtefert der in
vivo-Test für diesen Zweck viele Schwierigkeiten, die beispielsweise darin bestehen, daß er eine große Anzahl
von Versuchstieren zum Nachweis in nur einer zu untersuchenden Probe erfordert und daß er unter
Anwendung komplexer Maßnahmen durchgeführt werden muß. Beispielsweise erfolgt der Nachweis von
Pyrogen unter Verwendung des biotogischen Ansprechvermögens durch Injektion der Testflüssigkeit in
Versuchstiere, vorwiegend Ratten, und Beobachtung des Temperaturanstiegs der Tiere. Oder in bestimmten
Fällen wird der Epinephrinempfindlichkeitstest oder dergleichen angewendet Jedoch ist, da derartige
Methoden zu biologischen Versuchen unter Anwendung des biologischen Ansprechvermögens gehören, ein
Irrtum aufgrund individueller Unterschiede zwischen den Testtieren groß. Diese geringe Genauigkeit des
Tests zusammen mit der Kompliziertheit der Versuchsmaßnahmen macht die quantitative Bestimmung von
Pyrogen in der Testprobe praktisch unmöglich. Ferner erfordern die üblichen Methoden eine große Anzahl an
Versuchstieren, was mit erheblichen Kosten und Arbeitsaufwand auch für deren Fütterung und Unterhaltung verbunden ist.
In jüngster Zeit wurde von F.B. Bang festgestellt, daß
das Lysat (Amöbocytextrakt) aus dem aus dem Blut der amerikanischen Königskrabbe (Limulus polyphemus)
abgetrennten Amöbocyt eine einzigartige Gelierungsreaktion mit dem Endotoxin von gram-negativen
Bakterien anregt (Bull. Johns Hopkins Hosp„ 98, 325 (1956)), was Anlaß zu Untersuchungen hinsichtlich
einfacher und genauer Nachweis- oder Bestimmungsmittel auf Endotoxin gram-negativer bakterien gab.
Sobald das Blut der Königskrabbe aus dem Körper en'rahiert ist, wird das Amöbocyt klebrig und
agglutiniert und wird gebrochen, um seinen Inhalt abzugeben. Daher ist es zur sicheren Abtrennung des
aus dem Blut der Königskrabbe extrahierten Amöbocyts notwendig, ein die Amöbocyt agglutinierung hemmendes Mittel zu dem extrahierten Blut nach der
Extraktion zuzusetzen, um zu verhindern, daß das Amöbocyt koaguliert und agglutiniert. Das Amöbocyt
der Königskrabbe ist jedoch von den Erythrocyten warmblütiger Tiere vollkommen verschieden! und
Citronensäure, Heparin und dergleichen, die häufig als Anlikoagulierungsmiltel für Blut von warmblütigen
Lebewesen verwendet werden, sind für die Amöbocytkonservierung vollkommen unwirksam. N-Äthylmaleinsäureimid ist als wirksames Antiamöbocytagglutinierungsmittel für Königskrabbenblut vorgeschlagen worden (Science, 144,1147 - 8 (1964)).
N-Äthylmaleinsäureimid ergibt jedoch nur unzureichende Antiamöbocy^gglutinierungswirkung und kann
beträchtliche Amöbocytagglutinierung während der Blutextraktion, Amöbocyttrennung und/oder der Wäsche von Amöbocyt je nach den einzelnen Unterschie-
den zwischen den Königskrabben nicht verhindern. Diese Agglutinierung macht die Lysatherstellung
unmöglich und somit erreicht die Menge der erfolgreichen Lysatherstellung normalerweise höchstens etwa
30% der insgesamt verwendeten Königskrabben. Ferner ist N-Äthylmaleinsäureimid äußerst flüchtig und
selbst eine wäßrige Lösung davon erzeugt toxisches Gas, das die Augen und Schleimhäute des Operateurs
reizt Vom Gesichtspunkt der Hygiene und Sicherheit ist es daher zu beanstanden. N-Äthylmaleinsäureimid ist
auch eine sehr aufwendige Chemikalie und aus diesem Grunde für den technischen Einsatz ungeeignet
Es wurden nun eingehende Untersuchungen hinsichtlich einer Methode durchgeführt, welche die medizinisch und pharmazeutisch wichtige Diagnose oder den
Nachweis und die Bestimmung von Pyrogen durch einfache Maßnahmen ermöglicht und die frei von den
vorstehenden Nachteilen der üblichen Methoden ist Es wurde nun gefunden, daß die Verwendung von
Methylderivaten von Xanthin und deren Salzen als 2s Agglutinierungs-Inhibierungsmittel für das Amöbocyt
ermöglicht, die Agglutinierung der Aifiöbocyten während der Blutextraktion, Amöbocytabtrennung und den
Waschvorgängen vollständig zu verhindern und die Gewinnung des gewünschten Limulina-Lysats in hoher Μ
Ausbeute gestattet, und daß die gleichzeitige Anwesenheit von Erdalkalimetallionen in dem Limulina-Lysat in
bestimmten Konzentrationen die Empfindlichkeit des Lysats für Endotoxin wesentlich verbessert
Die Aufgabe der Erfindung best iit in einem Verfahren zur Herstellung von Limulina-Lysat ausgezeichneter Empfindlichkeit auf Endotoxin aus dem Blut
der Königskrabben (Limulina) in hoher Ausbeute.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Limulina-Lysat oder dessen gefriergetrocknetem
Pulver, wobei das Blut von K.önigskrabben (Limulina) in
eine isotonische Pufferlösung, die ein Agglutinierungs-Inhibierungsmittel von Amöbocyt enthält extrahiert
wird, das Amöbocyt aus der Lösung abgetrennt das Amöbocyt gebrochen und Limulina-Lysat gewonnen
wird, ist dadurch gekennzeichnet, daß a) als Agglutinierungs-Inhibierungsmittel ein Methylderivat von Xanthin der nachstehenden Formel
so
55
60
worin Ri, R2 und Rj jeweils ein Wasserstoffatom oder
eine Methylgruppe bedeuten, wobei Wenigstens einer der Reste Ri, Rj und Rj eine Methylgruppe ist, oder ein
Salz hiervon verwendet wird, und b) das Brechen des Amöbocyten ausgeführt wird, indem zu einem isolierten es
Amöbocyten 20 bis 50 ml eines Extraktionslösungsmittel mit einem pH-Wert von 6,0 bis 8,0, das wenigstens
eine Art von Erdalkaliionen in einer Konzentration von
2 bis 6OmM je 100 ml des abgenommener? Blutes
enthält, zugegeben wird.
Vorzugsweise werden als Erdalkaliionen Magnesiumionen verwendet Gflnstigerweise enthält das Extraktionslösungsmittel ferner wenigstens eine Art Alkaliionen mit einer Konzentration von 10 bis 150 mM.
Vorteilhafterweise wird als Extraktionslösungsmittel eine wäßrige Lösung verwendet die 4 mM Calciumionen, 20 mM Magnesiumionen und 40 mM Natriumior =n
enthält Bevorzugt werden die Methylderivate von Xanthin oder deren Salze in einer Konzentration von
0,5 bis 2 mM in dem Gemisch aus isotonischer Pufferlösung und durch die Blutextraktion erhaltenem
Blut verwendet
Die Anwendung spezifischer Methylderivate des Xanthins oder deren Salze als Mittel zur Inhibierung der
Agglutinierung des Amöbocyten gemäß der Erfindung beseitigt praktisch die Agglutinierung des Amöbocyts
während der Blutextraktion, Amöbocyttrennung und/ oder des Waschverfahrens. Folglich kann das gewünschte Limulina-Lysat in hoher Ausbeute sehr
zufriedenstellend für den industriellen Gebrauch gewonnen werden.
Von den verwendbaren Methylderivaten des Xanthins der obigen Formel (I) sind
Theophyllin (1,3-Dinj5thylxanthin),
Theobromin (3,7-DimethyIxanthin) und
Coffein (13,7-Trimethylxanthin)
besonders bevorzugt Biese Methylderivate des Xanthins können auch in ihrer Salzform verwendet werden.
Als· geignetes Salz können deren Säureadditionssalz mit anorganischer oder organischer Säure, wie beispielsweise Chlorwasserstoffsäure und Essigsäure und Alkalisalze, wie beispielsweise Natrium- und Kaliumsalze
genannt werden. Insbesondere werden die Methylderivate mit geringer Löslichkeit in Wasser, z. B. Theobromin, in der Salzform mit Vorteil verwendet
Als Königskrabben zur Abgabe von Blut für das gewünschte Verfahren kann jede spezifische ArI von
Krabben, die zum Genus Linfulina gehören, verwendet werden. Beispielsweise kann das aus
Limulus polyphemus (Linn6),
Tachypleus tridentatus (Leach),
Tachypleus gigas (Müller),
Tachypleus hocveni (Pocock) und
Carcinoscorpius rotundicanda (La Treille)
extrahierte Blut verwendet werden.
Nachfolgend wird das vorliegende Verfahren in der Reihenfolge der Maßnahmen näher erläutert.
Zunächst wird das Blut der Königskrabbe in eine
isaionische Pufferlösung, welche die Verbindung der Foirmel (I) enthält, extrahiert Die Blutextraktion kann
durch jedes beliebige an sich bekannte Mittel erfolgen. Beispielsweise wird die Herzpunktationsmethode mit
Vorteil verwendet. Die Cardialpunktationsmethode kann entweder durch die direkte Blutextraktion, bei der
din Injektionsnadel mit geeignetem Innendurchmesser mit: einem Siliconröhrchen verbunden ist und direkt in
das Herz der Krabbe von der Verbindung der Thorakal- und Abdominalstelle eingeführt wird, so daß das Blut
durch die Röhre in die das Antiagglutinierungsmittel enthaltende isotonische Pufferlösung geführt wird,
unterstützt vom Innendruck des Herzes (Kardialkammer) oder durch indirekte Blutextraktion durchgeführt
werden, wobei die injektionsspritze, die teilweise mit
einer vorbestimmten Menge der das Antiagglutinierungsmittel
enthaltenden isotonischen Pufferlösung gefüllt ist, in das Herz eingeführt wird und das Blut in die
Spritze gesaugt wird, wenn der Kolben zurückgezogen ϊ wird. Das Blut der Königskrabbe kann in die die
Verbindung der Formei (I) enthaltende isotonische Pufferlösung durch eißes der obigen Mittel extrahiert
werden. Das so erhaltene Gemisch aus isotonischer Pufferlösung und Königskrabbenblut ist äußerst stabil ι ο
und zeigt beim Stehenlassen über längere Zeiträume keinerlei Amöbocytagglutinierung.
Die isotonische Pufferlösung besitzt in geeigneter Weise einen pH-Wert im Bereich von 6,0 bis 8,0,
bevorzugt 7,2. Da das Königskrabbenblut etwa isoto- is
nisch mit Seewasser ist, wird die Lösung bevorzugt aus künstlichem Seewasser oder einer 2,8- bis 3,2gewichtsprozentigen
Natriumchloridlösung als Grundlage hergestellt. Eine derartige isotonische Pufferlösung kann
beispielsweise durch Zugabe einer Phosphorsäurepufferlösung mit einem pH-Wert von 6,0 bis 6,8 zu
künstlichem Seewasser oder zu einer wäßrigen Natriumchlondlösung
mit einer Konzentration von 2,8 bis 3,2 Gew.-% unter Bildung einer 0,01 molaren isotonischen
Pufferlösung oder durch Zugabe von Natriumchlorid zu einer 0,01 molaren Phosphorsäurepufferlösung zu einer
Konzentration von 2,8 bis 3,2 Gew.-% und dessen
Auflösung oder durch Ersatz der in den obigen Verfahren verwendeten Phosphorsäurepufferlösung
durch Trispufferlösung hergestellt werden.
Die Verbindung der Formel (I) soll in der isotonischen Pufferlösung vorher aufgelöst werden. Das quantitative
Verhältnis der Verbindung der Formel (I) kann so sein, daß seine Konzentration in dem wie bereits beschrieben
erhaltenen Gemisch aus isotonischer Pufferlösung und Blut 0,5 bis 2 mM, bevorzugt 1 mM wird. Um die
Konzentration der Verbindung der Formel (I) in dem Gemisch aus isotonischer Pufferlösung und Blut
beispielsweise auf I mM zu bringen, sollte die Verbindung der Formel (I) in der wie oben hergestellten
isotoniscnen Pufferlösung vorher zu einer Konzentration von 2 M gelöst werden und nachher der pH-Wert
der Lösung auf 6,0 bis 8,0 bevorzugt 72 eingestellt
werden, wobei eine dazu äquivalente Menge an Blut eingesaugt und vermischt werden kann.
Aus dem durch Extraktton des Blutes der Königskrabbe
erhaltenen so gebildeten Gemisch aus isotonischer Pufferlösung und Blut wird das Amöbocyt durch
geeignete Mittel isoliert Beispielsweise kann das Gemisch durch Einbringen des Gemisches aus isotoni·
scher Pufferlösung und Blut in ein Zentrifugalausfällungsröhrchen
und Durchführung der Zentrifugaltrennung normalerweise bei 1000 bis 3000 Upm während 2
bis 10 Minuten in vorteilhafter Weise in die aus isotonischer Pufferlösung und Blutserum bestehende
überstehende Lösung und die untere Schicht des Amöbocyts getrennt werden. Auf diese Weise kann das
Amöbocyt von der oberen Schicht durch Dekantieren oder andere bekannte Mittel abgetrennt werden.
Der so abgetrennte Amöbocytanteil wird dann einige Male mit der isotonischen Pufferlösung, welche die
Verbindung der obigen Formel (I) enthält, gewaschen und anschließend mit der isotonischen Pufferlösung, die
nicht die Verbindung der Formel (I) enthält, wiederum einige Male gewaschen. h>
Es ist günstig, di: Wäsche rasch durchzuführen, um zu
verhindern, daß das Amöbocyt agglutiniert und bricht.
Falls das so isolierte Amöbocyt dann in pyrogenfreiem Wasser stehengelassen wird, zerreißt die Membran
des Amöbocyts aufgrund des Unterschieds im osmotischen Druck außerhalb und innerhalb des Amöbncyts,
und der Gehalt an Amöbocyt wird in das pyrogenfreie Wasser extrahiert
Wenn jedoch gemäß der Erfindung das vorstehende pyrogenfreie Wasser in dem obigen Extraktionsverfahren
durch ein Extraktionslösungsmittel mit einem pH-Wert von 6,0 bis 8,0, das wenigstens ein Erdalkalimetallen
in einer Konzentration von 2 bis 60 mM aufweist, ersetzt wird, wird ein Limulina-Lysat mit
weiter verbesserter endotoxinempfindlichkeit erhalten.
Das hier erwähnte pyrogenfreie Wasser bedeutet kein endotoxinhaltiges Wasser, das beispielsweise durch
Redestillation von destilliertem Wasser oder entionisiertem Wasser und, falls notwendig, weitere Sterilisierung
desselben in einem Autoklaven bei 1200C während
30 Minuten hergestellt werden kann. ,
In dem obigen Extraktionsverfahren können der Bruch C-er Amöbocytmembran und die Extraktion des
Amöbocytgehalts vorzugsweise durch mechanisches
Bewegen oder Gefrier-Auftauen des amöbocyihaitigen pyrogenfreien Wassers oder dadurch beschleunigt
werden, daß das System einer Ultraschallvibration unterworfen wird.
DiS pyrogenfreie Wasser wird zu dem Amöbocyt in
einem Mengenverhältnis von 20 bis 50 ml, bevorzugt 30 bis 40 ml je 100 ml des aus der Königskrabbe
extrahierten Blutes zugesetzt
Als Erdalkalimetallionen weruen Calcium- und
Magnesiumionen bevorzugt Insbesondere ergeben Magnesiumionen ausgezeichnete empfindlichkeitserhöhende
Wirkungen und werden daher besonders bevorzugt. Die Erdalkaliionen werden durch Auflösen
eines wasserlöslichen Erdalkalisalzes in Wasser zugeführt. Als derartiges wasserlösliches Erdalkalisalz
können anorganische Salze, wie beispielsweise Calciumchlorid, Magnesiumsulfat und dergleichen in vorteilhafter
Weise eingesetzt werden. Insbesondere wird ein Salz mit einem Zersetzungspunkt von 1700C oder
darüber bevorzugt, weil das Salz zunächst der r*yrogenbeseitigungsbehandlung unterzogen werden
muß. Das Salz kann einzeln oder in Kombination mehrerer Arten verwendet werden.
Das Erdalkalisalz wird in einer Menge angewendet, die eine Erdalkaliionenkonzentration in der wäßrigen
Lösung von 2 bis 60 mM ergibt Die optimale Menge ist je nach der Art des Ions, der Eigenart der blutabgebenden
Königskrabbe und dergleichen variabel, jedoch liegt normalerweise der bevorzugte Bereich für
Calciumionen bei 2 bis 10 mM, unter anderem 4 mM, und 5 bis 50 mM für Magnesiumionen, insbesondere
2OmM.
fis wurde weiterhin aufgrund der Erfindung festgestellt,
daß, wenn das Extraktionslösungsmittel Alkaliionen zusätzlich zu den Erdalkaliionen enthält, ein
Limulina-Lysat mit noch stärker verbesserter Endotoxinempfindlichkeit erhalten werden kann.
Als geeignete Alkaliionen werden Natriumionen und Kaliumionen, insbesondere Natriumionen, besonders
bevorzugt. Die Alkaliionen können in Konzentrationen im Bereich von 10 bis 15OmM Vorliegen. Die optimale
Konzentration differiert je nach der Art des Alkalimetalls und der Eigenart der blutabgebenden Königskrabbe.
Beispielsweise liegt sie bei 10 bis !5OmM, insbesondere 40 mM für Natriumionen.
Als Quelle für die Alkaliionenzufuhr können wasserlösliche anorganische Alkalisalze, beispielsweise Natri-
umchlorid. Kaliumchlorid und dergleichen in vorteilhafter
Weise verwendet werden.
Das Extraktionslösungsmittel, welches das Erdalkalisalz und gegebenenfalls das Alkalisalz als Gelöstes, wie
oben beschrieben, enthält, sollte einen pH-Wert etwa im Neutralbereich aufweisen, d. h. normalerweise einen
pH-Wert von 6,0 bis 8,0, insbesondere 6,5 bis 7,5. Wenn daher der pH-Wert des pyrogenfreien Wassers, in dem
das Erdalkalisalz und falls notwendig das Alkalisalz gelöst werden, außerhalb des oben angegebenen
Bereichs wandert, sollte er zweckmäßig mit einer entsprechenden Säure oder einem Alkali eingestellt
werden.
Die Extraktion kann bei Raumtemperatur erfolgen, falls notwendig kann jedoch eine etwas herabgesetzte
Temperatur, beispielsweise von 0 bis 5"C angewendet werden.
Auf diese Weise wird das Lysat aus dem Amöbocyt in die wäßrige Phase cxlrshicri und nach Abtrennung und
Entfernen der Amöbocytmembranstücke durch bekannte Trennmittel, beispielsweise eine Zentrifuge, kann das
gewünschte Limulina-Lysat oder das Prägel erhalten
werden.
Das I.ysat kann zum Nachweis und/oder zur Bestimmung von Endotoxin, so wie es ist, verwendet
werden oder es kann gefriergetrocknet und pulverisiert werden, um ihm eine verbesserte Lagerbeständigkeit zu
erteilen.
Obgleich eine bevorzugte Praxis darin besteht, die F.rdalkaliionen und gegebenenfalls Alkaliionen in das
Lysat einzuführen, indem ihre vorherige Anwesenheit in der Extraktionslösung, wie oben beschrieben, bewirkt
wird, wurde ferner im Verlauf der Untersuchungen festgestellt, daß das Erdalkalisalz und gegebenenfalls
das Alkalisalz in dem durch die Extraktion mit pyrogenfreiem Wasser in der oben beschriebenen
Weise erhaltenen Lysat zu einer Konzentration im oben angegebenen Bereich zugesetzt und darin gelöst
werden können, wobei ein Limulina-Lysat erhalten wird, das in gleicher Weise erhöhte Empfindlichkeit auf
Endotoxin liefert.
Das gefriergetrocknete Pulver des wie oben hergestellten Lysats wird in die ursprüngliche Lysatform
durch pyrogenfreies Wasser unmittelbar vor dem Gebrauch zurückgeführt. Es ist auch möglich, Erdalkaliionen
und gegebenenfalls Alkaliionen in das, wie es war, reproduzierte Lysat einzuführen, um dessen
Empfindlichkeit auf Endotoxin zu erhöhen, und es ist auch möglich, diese Endotoxine zu untersuchen.
Es ist klar, daß bei Durchführung des vorliegenden Verfahrens sämtliche Chemikalien und instrumente, die
mit dem Blut oder dem Amöbocyt in Berührung kommen, wie beispielsweise die Geräte und Behälter,
Reagenzien, Lösungsmittel und dergleichen, vorher sterilisiert und der Pyrogenentfernungsbehandlung
unterworfen werden müssen, um eine bakterielle Verunreinigung durch das gesamte Verfahren zu
verhindern.
Das oben beschriebene Verfahren der Erfindung besitzt eine Reihe verschiedener Vorteile, die nachfol
gend beschrieben werden.
(1) Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird
unter Verwendung der Methylderivate des Xanthins oder deren Salzen der Formel (I) als
Agglutinierungs-Inhibierungsmittel für das Amöbocyt,
die Amöbocytagglutinierung im Blut der Königskrabbe während der Blutextraktion und der
Amöbocytabtrennung und den Waschvorgängen praktisch vollständig verhindert, unabhängig von
den individuellen Unterschieden unter den blutspendenden Köfigskrabben. Folglich kann das
Gewinnungsverhaltnis von Limulina-Lysat oder Prägel zu den blutabgebenden Königskrabben
erheblich verbessert werden.
(2) Die für das crfindungsgemäße Verfahren geeigneten
Methylderivate des Xanthins sind unveränderlich nicht flüchtig und bei Berührung nicht toxisch.
Scm;! ksnn nach dem Vrrfahrpn ripr F.rfindunfiT das
Lysat durch die gesamten Maßnahmen, die sicher und nicht nachteilig für den menschlichen Körper in
irgendeiner Weise bei sämtlichen Stufen sind, hergestellt werden. Ferner sind sowohl die
Derivate als auch deren Salze billig und das Lysat kann mit Kosten von etwa '/ioo der Kosten des
üblichen Verfahrens unter Verwendung von N-Ättiylmaleinsäureimid hergestellt werden. Das
vorliegende Verfahren ist wirtschaftlich und industriell einsetzbar.
(3) Nach dem Verfahren der Erfindung kann unter Verwendung ein^s Erdalkaliionen enthaltenden
Extraktionslösungsmittel!; ein Lysat mit ausgezeichneter Endotoxinempfindlichkeit erhalten werden,
das wesentlich erhöhte Empfindlichkeit gegenüber derjenigen des nach dem üblichen Verfahren
hergestellten Lysats (Biochem. Biophys. Acta. 261 284 (1972)), nicht zu erwähnen derjenigen des
nach der Amöbocytextraktion mit pyrogenfreiem Wasser allein hergeste"'en Lysats, liefert.
Die obigen Angaben können durch einen nachfolgend beschriebenen Vergleichsversuch belegt werden.
Zur Ermittlung Her Aktivität des Lysats wurden zu 0,1 ml des jeweiligen Lysats. das durch Brechen des
Amöbocyts in der in Tabelle Ii für jeden Versuch in der vorstehend beschriebenen Weise angegebenen Lösung
erhalten wurde, 0,1 ml der Testflüssigkeit, welche das Endotoxin aus Salmonella enteritidis enthielt, zugegeben,
und man ließ das Gemisch während einer Stunde bei 37°C und weiterer 5 Minuten bei Raumtemperatur
stehen. Danach wurde die Aktivität des Lysats bewei .;t. Wenn die Bewertung + + beirug, wurde der Versuchskörper weiter verdünnt und dem gleichen Test
unterworfen, bis die Bewertung + wurde. Auf diese Weise wurde bestätigt dall die Anwesenheit von
Erdalkalimetallionen in dem Extraktionslösungsmittel die Empfindlichkeit des Lysats auf Endotoxin erheblich
steigert Die Ergebnisse des Versuchs sind gleichfalls in Tabelle I wiedergegeben.
| 9 | MgSO4 | 23 65 | 629 | HjO | pH | 10 | Empfindlich- | |
| (mM) | (ml) | keitsindexh) | ||||||
| Tabelle I | Zusammensetzung des | — | 1000 | 6,8 | Endotoxinermitt- | |||
| Versuch | CaCI2 | - | Amöbocytextraktionslösungsmitlels | 1000 | 6,8 | lungsempfindlich- keila) |
I | |
| Nr. | (mM) | NaCI | 1000 | 6,8 | 2 | |||
| _ | - | (mM) | 1000 | 6.8 | I XlO3 | 4 | ||
| 1 | 1 | 20 | _ | 1000 | 6,8 | 5 X 10 -4 | 10 | |
| 2 | 1 | 20 | - | 1000 | 6,8 | 2,5 X 10 4 | 20 | |
| 3 | 4 | 20 | 154 | 1000 | 6,8 | I XIO' | 200 | |
| 4 | - | - | - | 1000 | 6,8 | 5 XIO' | 1000 | |
| 5 | 4 | 20 | - | 1000 | 6,8 | 5 x 10" | 16 | |
| 6 | 4 | - | 1 XlO" | 40 | ||||
| 7 | 4 | 40 | 0,625 X 10 4 | |||||
| 8 | - | 40 | 2,5 X 10"' | |||||
| 9 | 40 | |||||||
Der Endotoxingehalt der Tesiflüssigkeit. welche die Bewertung + ergab, wenn sie dem Endotoxin-(Salmonella-enteritidis)
Bestimmungslcxt unterworfen wurde, wobei das Lysatnach Brechen des Amöbocyts in einer wäßrigen Lösung, welche die für
jeden Versuch angegebenen Ionen enthielt, erhalten wurde.
Empfindlichkeilsindex des Lysats. das durch Brechen des Amöbocyts mit der für jeden Versuch angegebenen lonenart enthaltenden
wäürigen Lösung erhallen wurde, bezogen auf den Wert des Lysats, das durch Brechen des Amöbocyts mit Wasser
erhalten wurde, das mit 1 bezeichnet ist.
Wie sich aus der Tabelle ergibt, liefert das Lysat der
Erfindung, dessen Empfindlichkeit durch Erdalkaliionen und gegebenenfalls Alkaliionen erhöht ist, eine mehr als ι»
lOmal größere Endotoxinnachweisfähigkeit als das
Lysat normaler Empfindlichkeit und wiederum eine 2,5mal größere als diejenige eines Lysats, das durch das
übliche Verfahren (Versuch Nr. 3) hergestellt wurde. Das Lysat der Erfindung besitzt somit sehr hohe r>
Qualität.
Da nach dem vorliegenden Verfahren hergestellte Limulina-Lysat eignet sich zum Nachweis und zur
Bestimmung von Endotoxin.
Es ist medizinisch und pharmazeutisch besonders wichtig, Endotoxin zu ermitteln und zu bestimmen. Mit
dem Lysat der Erfindung kann der Nachweis und die Bestimmung von gram-negativen Bakterien und deren
Endotoxin, was die Ursache für Sepsis und Infektionsschock ist, und auch der Nachweis und die Bestimmung
von Endotoxin in verschiedenen Testflüssigkeiten, wie beispielsweise Blutplasma zur Transfusion, Glukoselösung,
Ringer-Lösung und andere venöse Injektionsflüssigkeiten, mit Einfachheit und Leichtigkeit durchgeführt
werden.
Der Endotoxinnachweis kann durch Zugabe des Lysats der Erfindung zu der Testprobe und Beobachtung
des Auftretens der Gelatinierung erfolgen. Auch kann der Nachweis von Endotoxin durchgeführt
werden, indem die enge- Beziehung der Intensität der Gelierungsreaktion der Testprobe, welche nach Zugabe
einer feststehenden Menge des erfindungsgemäßen Lysats auftritt, zu der Menge an Endotoxin angewendet
wird. Wenn daher das Reaktionsergebnis in dem oben unter (1) beschriebenen Test + + beträgt, kann durch W)
aufeinanderfolgende Verdoppelung des Grades der Verdünnung und Widerholung der obigen Nachweisreaktion,
bis die Bewertung + erhalten wird, die mit dem Lysat nachweisbare Mindestendotoxinmenge aus dem
Grad der Verdünnung ermittelt werden. Auch kann der Nachweis von in einer unbekannten Probe enthaltendem
Endotoxin in einfacher Weise durchgeführt werden, indem zunächst die Testflüssigkeit mit dem
Limulina-Lysat der Erfindung zur Ermittlung des maximalen Grades der Verdünnung, bei dem als
Reaktionsergebnis + erhalten wird, umgesetzt wird, und dieser Verdünnungsgrad mit der Mindestmenge des
Lysats, welche Endotoxin nachweisen kann, multipliziert wird.
Das Verfahren der Erfindung wird nachfolgend anhand der Beschreibung von Ausführungsbeispielen
erläutert.
In einer isotonischen Pufferlösung, die durch Zugabe einer Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 6,8
zu künstlichem Seewasser zu einer Konzentration vov< 0,01 m erhalten wurde, wutfe Theobrominnatriumacetat
zu einer Konzentration von 2 mM gelöst und der pH-Wert der Lösung wurde wieder auf 6,8 eingestellt.
Jeweils 100 ml c"es so erhaltenen Anti-Amöbocyt-Agglutinierungsmittels
wurden in eine 200 ml Injektionsspritze, an der eine Injektionsnadel von 33 μ angebracht
war, eingesaugt und darin wurden 100 ml Königskrabbenblut aus dem Krabbenherz nach der Punkturmethode
extrahiert Die Anzahl der Injektionsspritzen wurde zweckmäßig entsprechend der extrahierten Blutmenge
erhöht Das Blut wurde mit dem Anti-Amöbocyt-Agglutinierungsmittel
in jeder Spritze leicht vermischt und in tOO ml Zentrifugalröhrchen verteilt Unmittelbar danach
wurde das Gemisch der Zentrifugaltrennung während 10 Minuten bei 3000 Upm unterworfen und der
Anteil des blauen Serums wurde verworfen. Der restliche Amöbocytanteil wurde mit dem gleichen
Anti-Amöbocyt-Agglutinierungsmittel wie zuerst verwendet
gut gewaschen. Die obige Zentrifugierung und Wäsche wurden wiederholt und das Amöbocyt wurde
weiter in 60 ml der isotonischen Pufferlösung, die kein Theobrominnatriumacetat enthielt, gewaschen und aus
der Waschlösung durch Zentrifugieren abgetrennt Die Wäsche und das Zentrifugieren wurden zweimal
wiederholt und danach wurden 30 ml einer pyrogenfreien wäßrigen Lösung, die 40 mM NaCI, 20 mM MgSO4
und 4 mM CaCb je 100 ml des extrahierten Königskrab-
benblutes enthielt, zu dem Amöbocyt zugegeben, wobei sich kein Anzeichen einer Agglutinierung zeigte. Das
System wurde während 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt und dann an einem kalten Platz über Nacht
stehengelassen. Daraufhin wurde der Amöbocytgehalt >
in die angegebene Salzlösung eluiert und zentrifugiert, wodurch ein transparentes Lysat erhalten wurde. Das
Lysat wurde das Verwendung als ein Endotoxinnnchweismittel gefrif getrocknet, das kleine Mengen von
nur lxlO-^g/mf Endotoxin noch nachweisen und
bestimmen konnte.
Die als Versuchstiere dienenden Königskrabben (Limulus polyphemus) wurden mit 70%igem Äthanol an ''
der Rückseite und der Thorakal-Abdominal-Verbindungsstelle desinfiziert und in ihre Herzen wurden
Injektionsnadel von 3,3 μ die mit einem etwa 20 cm langen Siliconröhrchen verbunden waren, direkt eingeführt.
In einer isotonischen Pufferlösung, die durch -'°
Auflösen von Natriumchlorid in 0,01 m Trispufferlösung mit einem pH-Wert von 7.2 auf eine Konzentration von
2.95 Gew.-% hergestellt worden war, wurde Theophyllin zu einer Konzentration von 2 mM gelöst und der
pH-Wert der Lösung wurde wieder auf 7,2 eingestellt. -">
50 ml des auf diese Weise hergestellten Anti-Amöbocyt-Agglutinierungsrrittels wurden in 100 ml Zentrifugalfallungsröhrchen
aufgenommen, in die jeweils 50 ml des Königskrabbenblutes, das aus dem Herzen aufgrund des
Innendruckes ausströmte, durch das Siliconröhrchen !"
zugegeben wurden. Das Blut wurde mit dem Anti-Amöbocyt-Agglutinierungsmittel
in jedem Fällungsröhrchen leicht vermischt rnd unmittelbar während 10 Minuten
bei 3000 Upm zentrifugiert. Nach Verwerfen des transparenten blauen Serumanteils wurde das gleiche ^
Anti-Amöbocyt-Agglutinierungsmittel wie oben verwendet,
zu dem restlichen System zugegeben und der Amöbocytanteil wurde damit gründlich gewaschen. Das
System wurde wiederum zentrifugiert und die die Waschlösung bildende obere Schicht wurde verworfen. w
Das Amöbocyt wurde noch einmal mit dem Anti-Amöbocyt-Agglutinierungsmittel
gewaschen, mit anschließender ähnlicher Zentrifupierung. In der Zwischenzeit
wurden die Amöbocyten in den Zentrifugalröhrchen in einem einzigen Zentrifugalröhrchen gesammelt und 4-dazu
wurden 60 ml der isotonischen Pufferlösung, die kein Theophyllin enthielt, zugegeben. Die Reihe der
Wasch- und Zentrifugiermaßnahmen wurde zweimal wiederholt und zu dem erhaltenen Amöbocyt, das
keinerlei Anzeichen einer Agglutinierung zeigte, wurden 30 ml einer wäßrigen 20 mM MgSO4-Lösung je
100 ml Blut zugesetzt. Das System wurde während einer
Stunde bei Raumtemperatur kräftig gerührt und man ließ es an einem kalten Platz über Nacht stehen. Die
Amöbocytmembranen wurden zerstört und der Gehalt wurde in die wäßrige MgSO<-Lösung eluiert. Das
System wurde zentrifugiert, um die Amöbocytmembranstücke von der transparenten oberen flüssigen
Phase abzutrennen. Das so erhaltene Lysat wurde gefriergetrocknet und als Endotoxinnachweismitte!
verwendet, das 5xlO-^g/ml Endotoxin nachweisen
und bestimmen konnte.
50
55
60
In eine isotonische Pufferlösung, die durch Auflösen von Natriumchlorid in 0,01 m Trispufferlösung mit
einem pH-Wert von 7,2 zu einer Konzentration von 2,95 Gew.-% hergestellt worden war, wurde Cottein zu
einer Konzentration von 2 mM gelöst und der pH-Wert wurde wieder auf 7,2 eingestellt. 50 ml des so
hergestellten Antiamöbocyt-Agglutinierungsmittels v/urden in 100 ml Zentrifugalröhrchen aufgenommen, in
die wieder jeweils 50 ml Königskrabbenblut aufgrund der Cardialpunkturmethode ähnlich Beispiel 1 durch die
Siiliconröhrchen extrahiert wurden. Das Blut wurde mit dem Anti-Amöbocyt-Agglutinierungsmittel in jedem
der Zentrifugalröhrchen leicht vermischt und unmittelbar während 10 Minuten bei 3000 Upm zentrifugiert.
Der so gebildete transparente blaue Serumanteil wurde verworfen und der verbleibende Amöbocytanteil wurde
gut mit frisch zugesct/teir Anti-Amöbocyt-Agglutinierungsmittel
identischer Zusammensetzung wie oben gewaschen. Die Zentrifugalabtrennung und anschließende
Wasche wurden zweimal wiederholt und in der Zwischenzeit wurden die Amöbocyte in den Zentrifugalröhrchen
in einem einzigen Zentrifugalröhrchen gesammelt. Dann wurde das Amöbocyt mit 60 ml der
isotonischen Pufferlösung, die kein Coffein enthielt,
gewaschen, von der Waschlösung durch Zentrifugieren abgetrennt und die Waschlösung wurde verworfen.
Diese Reihen von Maßnahmen wurde zweimal wiederholt und zu dem so gereinigten Amöbocyt das keinerlei
Anzeichen einer Agglutinierung zeigte, wurden 30 ml der wäßrigen 2OmM MgSd-4 mM CaCb-Lösung je
100 ml Königskrabbenblut zugesetzt. Das System wurde
während einer Stunde b^i Raumtemperatur kräftig
gerührt und man ließ es über Nacht an einem kalten Platz stehen. Dadurch wurden die Amöbocytmembranen
zerstört und der Inhalt wurde in die wäßrige Phase fluiert. Das System wurde der Zentrifugalabtrennung zu
einem Niederschlag aus den Amöbocytmembranstükken und der transparenten oberen llüssigkeitsschicht.
die das gewünschte Lysat darstellte, unterworfen.
Das Lysat wurde gefriergetrocknet und als Endotoxinnachweismittel verwendet, das geringe Mengen von
nur 5 χ 10-^ig/ml Endotovin nachweisen und bestimmen
konnte.
Es wurde ein Anti-Amöbocyt-Agglutinierungsmittel
hergestellt, indem eine Phosphatpufferlösung i.iit einem
pH-Wert von 6,8 zu künstlichem Seewasser auf eine Konzentration von 0,01 m unter Bildung einer isotonischen
Pufferlösung zugegeben wurde, darin Theobrominnatriumacetat zu einer Konzentration von 2 mM
gelöst wurde und der pH-Wert der Lösung wieder auf 6.8 eingestellt wurde. Jeweils 100 ml des Mittels wurden
in 200 ml Injektionsspritzen mit Nadeln von 3,3 μ eingesaugt und darin wurden jeweils 100 ml des
Königskrabbenblutes aus ihren Herzen durch eine ähnliche Punkturmethode wie in Beispiel 1 extrahiert.
Die Anzahl der Injektionsspritzen wurde zweckmäßig je nach der Menge des erhaltenen Blutes erhöht In
jeder Injektionsspritze wurde das Blut mit dem Anti-Amöbocyt-Agglutinierungsmittel leicht gemischt
und das Gemisch wurde in 100 ml Zentrifugalausfällungsröhrchen verteilt. Unmittelbar danach wurde das
Gemisch 10 Minuten bei 3000 Upm zentrifugiert und der der so abgetrennte Amöbocytanteil wurde mit frisch
zugesetztem Anti-Amöbocyt-Agglutinierungsmittel, das
in der gleichen Weise wie das erste hergestellt worden war, gewaschen. Die Zentrifugalabtrennung und Wäsche
wurden zweimal wiederholt und dann wurde das Amöbocyt mit 60 ml der isotonischen Pufferlösung, die
kein Theobrominnatriumaeeiat enthielt, gewaschen,
woran sich wieder die Zentrifugierung anschloß. Die
Wasche und das Zentrifugieren wurden auch zweimal wiederholt.
30 ml einer wäßrigen Lösung, die 4OmM NaCI und
4OmM CaCb je 100 ml extrahiertem Köngigskrabbenblut
enthielt, wurden zu dem so erhaltenen Amöbocyt zugesetzt, wobei sich kein Anzeichen einer Agglutinicrung
ergab und das System wurde während einer Stunde bei Raumtemperatur kräftig gerührt. Dann ließ man das
System an einem kalten Platz über Nacht stehen, worauf
der Amöbocytgehalt in die wäßrige Phase eluiert Viu^dc.
Die transparente überstehende Lösung wurde von den ausgefällten Amöbocytmembranteilchen durch Zentrifugieren
getrennt, um das gewitschte Lysat oder Prägel 7i! erzeugen, das gefriergetrocknet wurde und als
Rnlotoxinnachweismittcl verwendet wurde.
Das Lysat konnte geringe Mengen von nur 6,25 χ I0"5 μg/ml Endotoxin nachweisen und bestimmen.
Claims (1)
1. Verfahren zur Herstellung von Limulina-Lysat oder dessen gefriergetrocknetem Pulver, wobei das
Blut von Königskrabben (Limulina) in eine isotonische Pufferlösung, die ein Agglutinierungs-Inhibierungsmittel von Amöbocyt enthält, extrahiert wird,
das Amöbocyt aus der Lösung abgetrennt, das Amöbocyt gebrochen und Limulina-Lysat gewonnenwird,dadurch gekennzeichnet, daß
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