DE2517860A1

DE2517860A1 - Verbessertes verfahren zur analyse von endotoxingefaelltem limulus- lysat

Info

Publication number: DE2517860A1
Application number: DE19752517860
Authority: DE
Inventors: Rajiva Nandan
Original assignee: Baxter Laboratories Inc
Current assignee: Baxter International Inc
Priority date: 1974-05-01
Filing date: 1975-04-22
Publication date: 1975-11-13
Also published as: AU497873B2; FR2280083B1; CA1040081A; AU8069175A; DE2517860C3; DE2517860B2; GB1499846A; JPS50147989A; FR2280083A1

Description

HENKEL, KERN, FEILER & HÄNZEL

BAYERISCHE HYPOTHEKEN- UND

TELEX: 05 29 802 HNKL D ED U A R D-SC H M ID-STR ASSE ~> WECHSELBANK MÜNCHEN Nr.3!X-8Sll!

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München ^D-^8Ü00 MÜNCHEN 90 Postscheck, München ,62,« - »■

Baxter Laboratories, Inc.
Morton Grove, 111., V.St.A.

L J

uNSERZEicHEN: Dr.F/rm München, den

betrifft: Verbessertes Verfahren zur Analyse von endotoxingefälltem Limulus-Lysat

Aus der Literatur, z.B. "Thrombos. Diath. Hemorrage", Band 23, Seiten I70 bis 181 (197O), ist es bekannt, daß Amoebocytenblutkörperchen von Angehörigen der Gattung Limulus, insbesondere Limulus polyphemus, d.h. Königskrabben, beim Inberührunggelangen mit Pyrogenen, z.B. Bakterienendotoxin, Klümpchen bzw. Gerinnsel bilden. Diese Amoebocytenzellen schaffen einen wirksamen Blutgerinnungsmechanismus bei verletzten Königskrabben, wodurch eine weitere Proliferation und ein weiteres Vordringen von Bakterien in andere Körperteile verhindert wird.

Gegenwärtig werden parenteral zu verabreichende Lösungen in vivo auf Pyrogene mit Hilfe von Kaninchen getestet. Ein derartiges Teetprogramm ist sehr kostspielig und schwierig durchzuführen_o

Es wurde beträchtliche Forschungsarbeit aufgewandt, um Limulus-Amoebocyten- nach dem Auflösen in Wasser und dergleichen zum Aufbrechen der Zellenverbände - als Er-

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^m g^ ra

satztestmöglichkeit für Pyrogene in sterilen Produkten verwenden zu können· Eine Zusammenfassung dieser Forschungsarbeiten an Limulus findet sich in "Bulletin of the Parenteral Drug Association", Band 27, Nr. 3» Seiten 139 bis 148 (Mai/Juni 1973).

In typischer Weise werden Limulus-Amoebocytenzellen durch Einbringen in destilliertes Wasser oder nach sonstigen zum Aufbrechen der Blutkörperchen bekannten Maßnahmen lysiert bzw. in Lösung gebracht. Anschließend daran wird die erhaltene Lösung filtriert oder zentrifugiert, um Feststoffe, wie Zellwandbruchstücke und dergleichen, zu entfernen und um eine Proteinlösung, die üblicherweise als Limulus-Lysat bezeichnet wird, zu gewinnen·

Diese Proteinlösung (Limulus-Lysat) wird üblicherweise zum Nachweis von Bakterienendotoxin benutzt, indem sie mit dem zu untersuchenden Material in Berührung gebracht wird. Hierbei wird dann untersucht, ob sie einen bestimmten Mindeststabilitätsanforderungen genügenden Proteinklumpen bilden· Ein typischer Teststabilitätsstandard für den Klumpen besteht in einem Umdrehen des Teströhrchens, in dem sich der Klumpen gebildet hat, um 180 · Wenn der Klumpen intakt bleibt, ist es ein Zeichen für eine positive Endotoxinreaktion· Wenn der Klumpen aufbricht oder wenn sich überhaupt kein intakter Klumpen bildet, wird dies als negative Endotoxinreaktion angesehen.

Ein Nachteil der Klumpentechnik zur Ermittlung der Anwesenheit von Pyrogenen ist, daß die Ergebnisse in Abhängigkeit von der Art und Weise, in der die Untersuchungs-

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+/ oder nicht

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person das Teströhrchen umdreht, variieren kann. Eine weitere Fehlerquelle ist die subjektive Interpretation der Untersuchungsperson, ob der betreffende Niederschlag ein Klumpen ist oder nicht·

Die geschilderte Klumpenbildung zur Analyse von Endotoxin hat sich zwar in einigen Fällen als zufriedenstellend erwiesen, es gibt jedoch eine Reihe von sehr wichtigen und kritischen EndotoxinbeStimmungen, bei denen eine einfache Klumpenbildung (zur EndotoxinbeStimmung) nicht genügend genau und empfindlich ist, um eine hinreichend genaue Analyse auf die Anwesenheit eines Endοι oxins zu ermöglichen·

Ein sehr wesentliches Gebiet dieser Art ist die PyrogenbeStimmung in parenteral zu verabreichenden Lösungen» Hierbei wäre ein Ersatz für das gegenwärtig praktizierte, teure und aufwendige und mit lebenden Kaninchen durchgeführte Testprogramm, wie es von den Herstellern parenteral zu verabreichender Lösungen durchgeführt wird, von höchstem Interesse, d.h. es besteht ein erheblicher Bedarf für eine möglichst genaue, quantitative und empfindliche in-vitro-BeStimmung der Anwesenheit von Pyrogenen, z.B. von Bakterienendotoxin·

Erfindungsgemäß wird dem Fachmann nun eine quantitative, verbesserte Technik zur Bestimmung von Pyrogenen, z.B. von Bakterienendotoxin, mittels Limulus-Lysatmaterialien an die Hand gegeben. Durch das erfindungsgemäße Analysenverfahren wird eine Steigerung der Empfindlichkeit des Endotoxinnachweises erreicht. Weiterhin läßt sich die vorhandene Endotoxinkonzentration quantitativ bestimmen.

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Erfindungsgemäß wird eine gereinigte Lösung von durch Pyrogene fällbaren Anteilen des Lysats von Limulus-Arnoebocytenzellen zunächst geeicht und bezüglich ihrer quantitativen Empfindlichkeit auf die Anwesenheit von Pyrogenen, z.B. von Bakterienendotoxin, standardisiert, indem man

a) eine Verdünnungsreihe von Dispersionen eines das Protein in einem Limulus-Lysat fallenden Endotoxins ansetzt;

b) zu jeder Verdünnungsstufe der Verdünnungsreihen eine abgemessene Menge, vorzugsweise eine konstante Menge, eines gereinigten, fällbaren Proteins der Limulus -Ly sat lösung zusetzt und

c) das Reaktionsgemisch in typischer Weise 6o min lang bei einer Temperatur von 37°C inkufciert, worauf man

d) durch quantitative photometrische Bestimmung die gefällte Proteinmenge ermittelt, wobei ein abrupter Anstieg in der Menge des gefällten Proteins in einer Verdünnungsstufe der Verdünnungsreihe im Vergleich zur nächst-verdünnteren Verdünnungsstufe der Verdünnungsreihe eine positive Pyrogenempfindlichkeit anzeigt.

Hierauf analysiert man Materialien mit unbekanntem Pyrogenijehalt, indem man das jeweilige Material mit derselben abgemessenen Menge eines vorher nicht gebrauchten Anteils der gereinigten ϊ/imulus-ProteinlSsung unter den beim Verfahrensschritt h) eingehaltenen Bedingungen ver-

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setzt und schließlich durch quantitative photometrische Bestimmung die Menge des in dem betreffenden Material aus den pyrogenfällbaren Anteilen ausgefällten Proteins ermittelt.

Diejenige ausgefällte Proteinmenge pro ml Testlösung, die mindestens der in einer bestimmten Verdünnungsstufe der Verdünnungsreihe, in der der bei Stufe c) geschilderte abrupte Anstieg feststellbar war, gefällten Proteinmenge entspricht, stellt ein Anzeichen für eine positive Pyrogennachweisreaktion in dem Material unbekannten Pyrogengehalts dar.

In typischer Weise wird eine solche gereinigte Lösung des fällbaren Proteins von Limulus-Lysat verwendet, aus der überschüssige Mengen an Fremdprotein, die in Gegenwart von Pyrogenen nicht ausfallen, entfernt worden sind· Letztere Proteine können die Empfindlichkeit der erfindungsgemäß erhaltenen analytischen Ergebnisse verringern. So ist es zweckmäßig, die Zellwandbruchstücke und andere feste Anteile des Limulus-Lysats sowie mindestens einen Teil der wasserlöslichen, nicht-fällbaren Proteinfraktionen durch Filtrieren, Zentrifugieren und dergleichen zu entfernen. Ein bevorzugtes Verfahren zum Reinigen des Limulus-Lysatproteins wird in dem später folgenden Beispiel näher erläutert. Selbstverständlich können erforderlichenfalls auch andere Reinigungsmaßnahmen angewandt werden· Einfachere und weniger wirksame Reinigungemaßnahmen können in solchen Fällen angewandt werden, in denen weniger genaue Ergebnisse als im folgenden Beispiel in Kauf genommen werden können.

Die in Stufe a) des beschriebenen Eichverfahrens verwendete Verdünnungsreihe von Pyrogendispersionen kann aus einer

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handelsüblichen Standardendotoxinlösung angesetzt werden. In typischer Weise wird eine Verdünnungsreihe mit 20 verschiedenen Bakterienendotoxinkonzentrationen angesetzt. Die erste Lösung mit der höchsten Konzentration enthält hierbei 100 Nanogramm Endotoxin pro ml, jede folgende Lösung enthält die Hälfte der Endotoxinkonzentration der vorhergehenden Lösung, so daß die 20. und letzte Lösung pro ml 0,00019 Nanogramm Endotoxin~/enthält.

Nun wird zu den einzelnen Lösungen der verschiedenen Verdünnunsstufen der Verdünnungsreihe, d.h. zu den verschieden verdünnten Pyrogendispersionen, eine abgemessene Menge, vorzugsweise dieselbe Menge pro Teströhrchen, des gereinigten fällbaren Proteins der Limulus-Lysatlösung zugegeben, worauf die Dispersion in der Regel eine gewisse Zeit lang, z.B. 60 min lang, in typischer Weise bei erhöhter Temperatur, beispielsweise bei einer Temperatur von 37 C, stehen gelassen wird. Die Tests können jedoch auch (wirksam) unter Einhaltung anderer Inkubationszeiten und innerhalb eines relativ breiten Temperaturbereichs durchgeführt werden. Vorzugsweise sollten jedoch sämtliche Proben bzw. Teströhrchen gleichmäßig behandelt werden.

Während der Inkubation kann sich in den Teströhrchen, die Endotoxin in höherer Konzentration enthalten, ein. Klumpen aus gefälltem Protein bilden. Dies stellt eine^wFrühanzeigeⁿ für eine positive Reaktion dar. Das Verfahren gemäß der Erfindung ist jedoch beträchtlich empfindlicher als das "Klumpenverfahren" und eignet sich zum Nachweis weit geringerer Endotoxinkonzentrationen als letzteres Verfahren.

Im Anschluß an die Inkubation wird die Menge an gefälltem Protein durch quantitative photometrische Bestimmung er-

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+/ pro ml

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mittelt. Hierbei wird in der Regel das gefällte Protein abzentrifugiert oder abfiltriert, tun es von der überstellenden Flüssigkeit zu befreien. Der Zweck dieses Trennvorgangs ist, soviel wie möglich nicht-gefälltes Protein aus der Lösung zu entfernen» um die quantitative Messung der Menge an zurückbleibendem gefälltem Protein zu erleichtern.

Daran anschließend kann das Protein in beliebiger Weise redispergiert und dann quantitativ auf photometrischem Wege, beispielsweise durch Absorptionsmessung, Fluoreszenzanalyse oder Lichtstreuung, bestimmt werden.

Xn der Regel bedient man sich zur quantitativen photometrischen Bestimmung einer Absorptionsmessung, wobei der Proteingehalt in einem elektromagnetischen Wellenlängenbereich von 450 bis 1000 Millimikron bestimmt wird. Insbesondere bedient man sich der von Oliver H. Lowry und Mitarbeitern in der Zeitschrift "Journal of Biological Chemistry¹¹, Band 193, Seiten 265 bis 275 (1951) beschriebenen Ana-Iys enmaßnahmen.

Vorzugsweise enthält jeder aliquote Teil der Testlösung genügend fällbares Protein, um eine Absorption von weniger als 0,2 bei im wesentlichen gegebener Abwesenheit von Endotoxin und eine Absorption von über 1 bei vollständiger Proteinfällung (bei der jeweiligen Meßwellenlänge) zu liefern.

Wenn die gefällten Proteinproben aus den einzelnen Verdünnungsstufen, d.h. aus den verschieden verdünnten Pyrogendispersionen, auf absorptivem Wege photometrisch analysiert

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werden, kann man für jede Probe einen speziellen Absorptionswert erhalten, der zu einer speziellen Endotoxinkonzentration jeder bekannten Probe in einer bestimmten Beziehung¹ steht.

Hierauf kann man unter Benutzung desselben geeichten Limulus -Ly satmaterials und Einhaltung derselben Reaktionsbedingungen Materialien unbekannten Pyrogengehalts analysieren, indem man das betreffende Material mit einer abgemessenen Menge eines vorher nicht gebrauchten Anteils derselben gereinigten Limulus-Proteinlösung versetzt und auf entsprechende photometrische Weise die Menge an gefälltem Protein bestimmt. Folglich stellt der jeweils abgelesene optische Dichtewert, der dem bei einem speziellen Teströhrchen bekannter und gleichzeitig mit gemessener Endotoxinkonzentration abgelesenen optischen Dichtewert ähnlich ist, ein Maß dafür dar, daß in dem unbekannten Material eine ähnliche Pyrogenkonzentration vorliegt.

Andererseits kann die Abnahme der Lichtabsorption und dergleichen in der überstehenden Lösung nach Entfernung der gefällten Proteine ermittelt und aus dem ermittelten Wert die Menge der gefällten Proteine bestimmt werden.

Gemäß einer modifizierten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung kann man die Konzentration und Wirksamkeit eines gegebenen Limulus-Proteins bestimmen, indem man eine Verdünnungsreihe des Limulus-Proteins ansetzt und die verschieden verdünnten Proteindispersionen mit einer abgemessenen und zur vollständigen Fällung des gesamten fällbaren Lysatproteins ausreichenden überschüssigen Menge Bakterienendotoxin bekannter Konzentration versetzt.

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Hierauf ermittelt man auf quantitativem photometrischen Wege die Menge an gefälltem Protein, die dann die Menge des vorhandenen fällbaren Limulus-Proteins wiedergibt.

Folglich kann man also den Gehalt einer gegebenen Probe Limulus-Lysat durch quantitative Bestimmung der Fällmenge in Gegenwart eines bekannten Überschusses an Endotoxin bestimmen.

Das folgende Beispiel soll das Verfahren gemäß der Erfindung näher erläutern.

Beispiel

Königskrabben (Limulus polyphemus) aus dem Atlantischen Ozean wurden gesammelt und derart in einem Gestell fixiert, daß ihre Unterseite nach oben zeigte. Das Gelenk zwischen den ersten beiden Segmenten der Krabben (Prosthoma und Opisthoma) wurde durch Betupfen mit Alkohol präpariert. Hierauf wurde in das Gelenk eine Blutsammeinadel eingestochen. Die Blutsammeinadel war am Ende eines handelsüblichen Blutbeutels, dessen Blutsammeirohr jedoch lediglich 12,7 cm lang war, befestigt. Der Blutbeutel enthielt 300 ml einer 3%igen (Gewicht/Volumen in g pro l) Natriumchloridlösung mit 2,87 g an gelöstem Äthylendiamintetraacetat.

Es wurden so viele Königskrabben nacheinander ausgeblutet, bis 300 ml Blut in den ein Fassungsvermögen von 600 ml aufweisenden Blutbeutel gelangt waren. Das 12,7-cm-Blutspenderohr wurde dann nahe seiner Eintrittsöffnung in den Beutel auf dielektrischem Wege heißversiegelt.

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Schließlich, wurde das Blutsammeirohr nahe dem hitzeversiegelten Abschnitt abgeschnitten, um die Nadel zu entfernen.

Zwei der in der geschilderten Weise vorbereiteten Beutel wurden ausgewählt, erforderlichenfalls mit Gewichten austariert und schließlich 7 min in einer handelsüblichen Zentrifuge mit einer Schwerkraft von 1000 (etwa 1800 Upm) rotieren gelassen, damit sich die Amoebocytenzellen aus dem Limulus-Blut absetzen konnten. In den Fällen, in denen das Blut offensichtlich gut sedimentiert, reicht es in der Regel aus, 7 min lang lediglich eine Schwerkraft von 600 (etwa I5OO Upm) einzuhalten.

Im Anschluß an das Abzentrifugieren der Zellen wurde jeder Blutbeutel auf eine 10 geneigte Ebene gelegt, wobei der versiegelte Stutzen des Blutsammeirohrs nach unten zeigte. Nun wurde das Sammelrohr durch Aufschneiden wieder geöffnet. Die überstehende Flüssigkeit wurde sorgfältig abdekantiert, um die abgesetzten Zellen im Beutel zurückzuhalten. Nach dem Dekantieren wurde das Sammelrohr erneut in der geschilderten Weise hitzeversiegelt.

Nun wurde einer der beiden sterilen Einlasse (Medikationsöffnungen) der Blutbeutel mit einer Injektionsnadel durchstochen, wobei auf jeden Gewichtsteil an in dem Beutel enthaltenen Zellen zu deren Auflösung 6 Gewichtsteile destillierten, pyrogenfreien Wassers in den Beutel eingespritzt wurden. Das Zellengewicht konnte in üblicher bekannter Weise durch Subtrahieren des Standardtrockengewichts des Blutbeutels vom tatsächlichen Gewicht des speziellen Beutels und der darin enthaltenen Zellen ermittelt werden.

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Das destillierte Wasser wurde in dem Blutbeutel bewegt und dann Zh h bei einer Temperatur von 4°C stehen gelassen. Dann wurde der Beutel 7 min lang- mit einer Schwerkraft von 1OOO zentrifugiert.

Hierauf wurde der flüssige Inhalt jeden Beutels durch ein handelsübliches 170-Mikron-Filter filtriert, um die Flüssigkeit von den abgesetzten Feststoffen zu trennen. Dann wurde die Lösung bis zum Festwerden gefroren.

Die gefrorene Limulus-Lysatlösung wurde hierauf sorgfältig aufgetaut, wobei darauf geachtet wurde, daß die Lösung kalt blieb, d.h. bei einer Temperatur unterhalb 20°C blieb. Nach dem Auftauen wurde die Limulus-Lysatlösung durch ein weiteres handelsübliches 170-Mikron-Filter in eine Sammelflasche vorfiltriert.

Der auf dem Filter verbliebene Filterrückstand bestand aus einem nicht-verwertbaren Material, das während des Gefrierens ausgefallen war. Hierauf wurde das Filtrat in typischer Weise erneut durch ein handelsübliches Vorfilter einer nominalen Porengröße von 1,5 Mikron und dann durch ein Membranfilter einer angegebenen absoluten Porengröße von 1,2 Mikron und einer nominalen Porengröße von weniger als 1,2 Mikron filtriert. Die nominale Porengröße ist definiert als derjenige Porendurchmesser, bei dem mindestens 98$ sämtlicher Teilchen der genannten Teilchengröße entfernt werden.

Vor Gebrauch wurden sämtliche Filter mit 1 1 sterilen, pyrogenfreien Wassers gespült. Die letzte Filtrationsstufe wurde derart durchgeführt, daß die Lysatlösung unter

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einem Stickstoffgasdruck von etwa 907 g nach, oben durch den Filter gedrückt wurde. Andererseits konnte zur Erleichterung des Filtriervorgangs im Sammelgefäß ein Vakuum angelegt werden·

Nach dem letzten Filtriervorgang wurde die Lösung in aliquote Teile von 2,0 ml geteilt, die dann in 6 ml fassende Phiolen oder Teströhrchen gefüllt wurden. DiePhiolen oder Teströhrchen waren vorher gründlich mit sterilem, pyrogenfreiem Wasser gewaschen und h h bei einer Temperatur von 2k5°G entkeimt worden. Hierauf wurden die Teströhrchen in üblicher Weise versiegelt, worauf der Röhrcheninhalt in einer handelsüblichen Lyophilisierungsvorrichtung so weit gefriergetrocknet wurde, bis in den Röhrchen ein trockenes Pulver erhalten wurde.

In einer Reihe von in der geschilderten Weise vorbereiteten Teströhrchen wurde der Röhrcheninhalt durch Zusatz von 5 ml eines gleichen Volumengemischs aus 1 Gew.-^ Magnesiumchloridlösung und 0,1 Gew.-# Natriumthioglykolatlösung wieder aufbereitet.

Um das Limulus-Lysat zu eichen, wurde 0,1 ml pyrogenfreien Wassers in eine Reihe leerer Teströhrchen (mit Ausnahme des ersten Röhrchens) gefüllt. In das erste Teströhrchen wurde 0,2 ml handelsübliche Escherichia-coli-S-fcandardendotoxinlösung gefüllt. Die Konzentration des verwendeten Escherichia-coli-Endotoxins betrug 100 Nanogramm Endotoxin pro ml. Hierauf wurde 0,1 ml der Lösung aus dem ersten Teströhrchen in das zweite Teströhrchen überführt, worauf aus dem zweiten Teströhrchen 0,1 ml Lösung in das dritte Teströhrchen überführt wurde.

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Dies wurde in der Weise, daß das jeweils folgende Teströhrchen die Hälfte der Endotoxinkonzentration des vorhergehenden Teströhrchens enthielt, so lange fortgesetzt, bis das 20. und letzte Teströhrchen eine Lösung mit 0,00019 Nanogramm Endotoxin pro ml enthielt. Die Lösungen der 6. bis 16. Verdünnungsstufe der angesetzten Verdünnungsreihe wurden zum eigentlichen Test verwendet.

Einige der Lösungen in den Teströhrchen wurden mit 0,1 ml der in der geschilderten Weise zubereiteten filtrierten Lysatlösung versetzt.

Die Verdünnungsreihe wurde dann 60 min bei einer Temperatur von 37 C inkubiert. Hierauf wurde jedes Teströhrchen umgedreht, wobei die An- oder Abwesenheit eines intakten Proteinklumpens notiert wurde.

Hierauf wurden sämtliche Klumpen aufgespalten und die Röhrchen 15 min lang mit einer Umdrehungsgeschwindigkeit von 4000 Upm zentrifugiert. Dann wurde aus jedem Röhrchen zur Entfernung des gelösten Proteins die überstehende Flüssigkeit ausgegossen, der abgesetzte Niederschlag durfte im Röhrchen verbleiben.

Nun wurden die Röhrchen zur Lösung des gefällten Proteins mit 0,2 ml einer O,75n.-Natriumhydroxidlösung versetzt.

Dann wurde der Proteingehalt in jedem Teströhrchen bzw. in jederPhiole in der von Oliver H. Lowry und Mitarbeitern in der Zeitschrift "Journal of Biological Chemistry", Band 193, Seiten 265 bis 275 (1951) beschriebenen Methode quantitativ analysiert.

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Bei dem im folgenden beschriebenen Test wurden folgende Reagentien verwendet t

Reagens A 20 g/l Natriumcarbonat in 0,In-Natriumhydroxidlösung

Reagens B 5 g/l CuSOj₄/ 5HgO in 10 g/l Kaliumtartratlösung

Reagens C alkalische Kupferlösung, die durch Vermischen von h9 ml Reagens A mit 1 ml Reagens B zubereitet worden war. Dieses Reagens wurde täglich frisch zubereitet.

Reagens D verdünntes Folin-Reagens, das durch Verdünnen von Folin/Ciocalteu-Phenolreagens auf 1n trit destilliertem Wasser hergestellt worden war.

Zu jeder Probe Proteinlösung in den verschiedenenPfoLolen bzw. Teströhrchen wurde 1 ml Reagens C zugesetzt. Hierauf wurde die jeweilige Mischung gründlich durchgemischt und dann etwa 10 min lang bei Raumtemperatur stehen gelassen. Dann wurde rasch 0,1 ml Reagens D zugesetzt und mit dem Röhrcheninhalt in weniger als*s gemischt. Dann wurde das Ganze mindestens 30 min lang bei Raumtemperatur stehen gelassen.

Ein handelsübliches Spektralphotometer wurde derart eingestellt, daß die Absorption auf einer optischen Dichteskala bei einer Wellenlänge von 500 mix abgelesen werden konnte. Das Spektralphotometer war in Anpassung an das geringe Probenvolumen mit einer 0,5-ml-Mikrodurchf lußküvette ausgestattet. Die Spektralphotometereinstellung reichte in typischer Weise von ^50 bis 1000 mn , vorzugsweise von 500 bis 750 mn .

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Das Spektralphotometer wurde mittels einer Blindprobe, bestehend aus einer Lösung von O,75n-NaOH und ähnlichen Konzentrationen an den Lösungen C und D, wie sie auch für die tatsächlichen Tests verwendet wurden, auf eine O-Absorptionsablesung eingestellt. Bei dieser Technik ist die Konzentration an zugesetastem Lysat groß genug, um nach beendeter Fällung des Proteins eine Absorptionsablesung von über 1 und (im wesentlichen) in Awesenheit einer Fällung (und von Endotoxin) eine Absorptionsablesung von unter 0,2 zu gewährleisten.

Nun wurden die Absorptionswerte der in der geschilderten Weise gewonnenen Proben als optische Dichtewerte gemessen und aufgezeichnet. Hierbei wurden folgende Ergebnisse erhalten;

Tabelle

Konzentration an zu der Lysat· lösung zugesetztem Endotoxin (Nanogramm pro ml)

Absorption
des gefällten Proteins

Berechnete Menge an gefälltem Protein (Mikrogramm pro 0,1 ml Lysat-Lösung)

3,12 (Lösung Nr. 6) 1,56 (Lösung Nr. 7) 0,^78 (Lösung Nr. 8)

0,39 (Lösung Nr. 9) 0,195 (Lösung Nr. 10) 0,097 (Lösung Nr. 11) (Lösung Nr. 12)

1,031

1,110
1,386

0,913

0,958*

0,814

425

475

(Absorption ist zu hoch, um eine genaue Proteinberechnung durchführen zu können)

370 350

375 287

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Fortsetzung Tabelle

Konzentration an zu der Absorption Berechnete Menge an Lysatlösung zugesetztem des gefäll- gefälltem Protein Endotoxin (Nanogramm pro ml) ten Proteins (Mikrogramm pro 0,1

ml Lysatlösung)

(Lösung Nr. 13)

0,^012 (Lösung Nr. 14)

0,#006 (Lösung Nr. 15)

(Lösung Nr. 16)

Vergleichs-Lysatlösung ohne zugesetztes Endotoxin

0,682

0,535 0,350 0,378

0,136

210
132

77,5 82,5

37,5

* Dies war die geringste Konzentration an Endotoxin, mit der eine übliche positive Proteinklumpenreaktion erreichbar

war.

Aus der Tabelle geht hervor, daß ein scharfer Anstieg in der Menge an ausgefälltem Protein im Bereich zwischen der Lösung Nr. Ik und der Lösung Nr. 11 zu beobachten ist. Wenn man bei dieser Reihe von Lösungen die Menge an in jeder Verdünnungsstufe ausgefallenem Protein mit der nächsten, stärker verdünnten Probe dieser Reihe vergleicht, ist ein deutlicher Anstieg in der Menge an ausgefallenem Protein feststellbar. Dies ist ein klarer Hinweis darauf, daß die größeren Gehalte an Endotoxin größere Mengen an Protein ausfallen lassen. Weiterhin ist dies ein eindeutiger Hinweis auf das typische Verhalten von gereinigtem Limulus-Protein in Gegenwart von Endotoxin.

Es zeigt sich folglich, daß der im vorliegenden Beispiel durchgeführte Test für die Anwesenheit von Endotoxin

in Konzentrationsgehalten bis herunter zu 0,0012 Nanogramm/ml

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Testlösung empfindlich ist, da das in Lösung Nr. lh ausgefallene Protein mengenmäßig weit größer ist als das in Lösung Nr. 15 ausgefallene Protein. Die Endotoxinnachweisreaktion wird durch weitere Zunahme an der in den Lösungen Nr. 13» 12 und 11 ausgefallenen Proteinmenge bestätigt. Ferner hat es sich gezeigt, daß eine Endotoxinreaktion vermutlich bis zu Konzentrationen von 0,0003 Nanogramm/ml (Lösung Nr. 16) erfolgte, da die ausgefallene Proteinmenge selbst bei dieser extrem verdünnten Probe beträchtlich über dem Wert der Vergleichslysatlösung ohne zugesetztes Endotoxin liegt.

Wenn folglich eine unbekannte Probe unter zu den geschilderten Bedingungen identischen Bedingungen unter Verwendung eines nicht-gebrauchten Anteils derselben Charge an gereinigter Lysatlösung getestet wird, läßt sich die Konzentration an vorhandenem Pyrogen, insbesondere Endotoxin, durch Korrelation mit der Absorptionsablesung für die unbekannte Probe quantitativ analysieren. Wenn man beispielsweise bei einer in der geschilderten Weise behandelten unbekannten Probe eine Absorption von etwa 0,535 abgelesen hat, läßt sich daraus schließen, daß ihre Endotoxinkonzentration in etwa so groß ist wie die Endotoxinkonzentration der Lösung Nr. Ik (der Tabelle). Höhere abgelesene Werte entsprechen den höheren Endotoxingehaltert der stärker konzentrierten Lösungen. Es sei jedoch darauf hingewiesen, daß sich bei stärker konzentrierten Lösungen (Lösung Nr. 11 und größer) aufgrund der abgelesenen Werte quantitative Fehler einstellen können. Diese Ablesungswerte sind jedoch grob gesagt - noch genau genug, um als qualitativer Nachweis für die Anwesenheit von Endotoxin dienen zu können.

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Die erfindungsgemäß erhältlichen Werte sind nun mit der üblichen Klumpenbildungsanalyse, bei der die Anwesenheit von Endotoxin durch die Bildung eines bei sorgfältigem Umdrehen des Teströhrchens um 180 in dem Reaktionsröhrchen gebildeten/Klumpens angezeigt wird, zu vergleichen. Bei letzterer Analysentechnik ist die am stärksten verdünnte Lösung, die eine positive Endotoxinreaktion ergab, die Lösung Nr. 11 mit einer Konzentration von 0,097 Nanogramm/ml. Folglich ermöglicht das gemäß dem vorliegenden Beispiel durchgeführte Verfahren der Erfindung eine achtmal empfindlichere Endotoxinbestimmung als die übliche KlumpenendotoxinbeStimmung.

+/ und nicht aufbrechenden

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Claims

Pat enta η sprüche

1.)Verfahren zum Eichen einer gereinigten Lösung von durch pyrogene Stoffe fällbaren Anteilen des Lysats von Limulus-Blutkörperchen hinsichtlich ihrer quantitativen Empfindlichkeit gegenüber der Anwesenheit von Pyrogenen, wie Bakterienendotoxin, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) eine Verdünnungsreihe von Dispersionen eines Limulus-Proteine fällenden Pyrogens ansetzt}

b) zu der angesetzten Verdünnungsreihe (von Dispersionen) eine abgemessene Menge des gereinigten, durch Pyrogene fällbaren Proteins der Limulus-Lysatlösung zugibt;

c) durch quantitative photometrische Bestimmung die Menge des gefällten Proteins ermittelt, wobei ein abrupter Anstieg in der Menge des gefällten Proteins in einer Verdünnungsstufe der Verdünnungsreihe im Vergleich zur nächst-verdünnten Verdünnungsstufe der Verdünnungsreihe eine positive Pyrogenempfindlichkeit anzeigt, und

d) ein Material mit unbekanntem Pyrogengehalt analysiert, indem man das betreffende Material mit einer abgemessenen Menge an einem zuvor nicht gebrauchten Anteil der gereinigten Limulus-Proteinlösung unter im wesentlichen entsprechenden Bedingungen wie beim Verfahrensschritt b) versetzt und dann durch quantitative photometrische Bestimmung die

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Menge an in dem betreffenden Material aus den
durch Pyrogene fällbaren Anteilen gefälltem Protein ermittelt, wobei die Fällung einer Proteinmenge bzw. -konzentration, die der Proteinmenge
oder -konzentration in derjenigen Verdünnungsstufe der Verdünnungsreihe, bei der eine abrupte Zunahme der Proteinfällung zu beobachten war, zumindest entspricht, ein Anzeichen für eine positive Pyrogenreaktion in dem betreffenden Material unbekannten Pyrogengehalts bildet.

2. Verfahren nach .Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Bestimmung des gefällten Proteins derart durchführt, daß man das gefällte Protein von der überstehenden Flüssigkeit, aus der es ausgefällt worden ist, befreit und anschließend die Menge des vorhandenen gefällten Proteins durch Messen der relativen Photoabsorption einer Lösung des gefällten Proteins mit Folin-Reagens bei einer Wellenlänge zwischen ^50 und 1000
Millimikron gegen ein Vergleichsprotein quantitativ
bestimmt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man bei einer Wellenlänge von 500 bis 750 Millimikron arbeitet.

k. Verfahren nach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet, daß man in jedem vorgegebenen aliquoten Teil der jeder Lösung der Verdünnungsreihe zugesetzten gereinigten Lösung so viel Protein zusetzt, daß man praktisch in Abwesenheit von Endotoxin eine Lichtabsorption im gemessenen Wellenlängenbereich von weniger als 0,2 und

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±n Gegenwart einer zum Ausfällen praktisch des gesamten fällbaren Proteins ausreichenden Endotoxinmenge eine Lichtabsorption im gemessenen Wellenlängenbereich von über 1 erreicht.

5· Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Anwesenheit von endotoxinfällbaren Substanzen in einem Material, dadurch gekennzeichnet, daß man das betreffende Material mit einer gegenüber der zum Ausfällen sämtlicher endotoxinfällbaren Substanzen erforderlichen Bakterienendotoxinmenge überschüssigen Bakterienendotoxinmenge versetzt und daß man anschließend die Menge an den gefällten Substanzen photometrisch bestimmt.

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