DE2823750C3

DE2823750C3 - Verfahren zur Gewinnung mindestens eines Hydrolyseprodukts eines Endotoxins von Bordetella Pertussis

Info

Publication number: DE2823750C3
Application number: DE2823750A
Authority: DE
Inventors: Ladislas Prof. Verrieres-Le-Buisson Szabo
Original assignee: Institut Merieux SA
Current assignee: Institut Merieux SA
Priority date: 1977-05-31
Filing date: 1978-05-31
Publication date: 1982-05-13
Also published as: FR2393065B1; US4242270A; GB1601870A; JPS5437817A; FR2393065A1; DE2823750A1; DE2823750B2

Description

a) das Produkt A einer Extraktion mit einem Gemisch aus Toluol und Methanol im Verhältnis 1 :Tr unterwirft, wobei der erhaltene Rückstand das Produkt B darstellt

b) das extrahierte Gemisch nach der Verdampfung des Lösungsmittels als Produkt X erhält,

c) das Produkt X einer Extraktion mit Methanol unterwirft,

wobei man

1) einerseits einen Rückstand (Produkt X 2) und

2) andererseits nach dem Verdampfen des Extrakts ein Produkt X 1 erhält, und außerdem

d) das Produkt B einer Hydrolyse mittels Salzsäure bei einem pH-Wert gleich oder unterhalb 1 bei einer Temperatur von 100⁰C über eine Zeitdauer von 15-60 Minuten unterwirft, nach dem Abzentrifugieren, Waschen und Eliminieren der überstehenden Flüssigkeit den Rückstand gefriertrocknet, welcher das Produkt Z bildet und

e) das Produkt Z einer Extraktion mittels Hexan unterwirft und einerseits nach dem Verdampfen des Lösungsmittels einen Extrakt (Produkt Z 1) und andererseits einen Rückstand (Produkt Z 2) isoliert.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das Produkt Z 2 zusätzlich durch Extraktion mittels eines Gemisches von Toluol und Methanol im Verhältnis 1 : I und Eliminierung des Rückstandes reinigt.

4. Intraperitoneal verabreichbares, immunologisch wirksames Arzneimittel, dadurch gekennzeichnet, daß es als Wirkstoff eins oder mehrere der nach einem der Ansprüche 1 bis 3 erhaltenen Produkte enthält.

5. Impfstoff aus Bakterien oder Viren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß er eines der Produkte X, X₁ oder X₂, die nach den Ansprüchen 2 und 3 erhalten worden sind, als Adjuvans enthält.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung eines Hydrolyseprodukts eines gegebenenfalls gereinigten Endotoxins von Bordetella Pertussis (Keuchhusten) sowie ein Arzneimittel und insbesondere einen Impf stoff, der eine oder mehrere der erhaltenen Lipoidfrak- tionen enthält.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Fraktionen stellen biologisch aktive Stoffe dar, die insofern unterschiedlich zu bekannten Fraktionen sind,

ίο daß sie eine Wirksamkeit als Adjuvans aufweisen und eine nicht spezifische Wirkung auf die Immunität ausüben. Insbesondere sind bestimmte Fraktionen toxisch und fiebererzeugend, während andere Fraktionen diese Eigenschaften nicht aufweisen.

Während bisher im Fall anderer Gram-negativer Bakterien die biologischen Wirkungen einheitlich einem einzigen Makromolekül zugeschrieben v-urden, das gemäß der Terminologie von O. Westphal als Lipoid A bezeichnet wurde, wurde überraschenderweise festge stellt, daß die biologische Aktivität nicht einheitlich in diesem Makromolekül lokalisiert ist Vielmehr wurde gefunden, daß es tatsächlich Lipoidfraktionen des Endotoxins sind, die für die biologische Wirksamkeit, insbesondere von Bordetella Pertussis verantwortlich sind.

Die Erfindung erlaubt es, bestimmte Lipoidfraktionen von Endotoxinen von Bordetella Pertussis zu entgiften, aber bestimmte biologische Eigenschaften dieses Endotoxins zu bewahren oder sogar zu verbessern, insbesondere die Adjuvans-Aktivität

Diese Fraktionen erlauben daher eine Verwendung auf dem pharmazeutischen Gebiet zur Verstärkung der Wirkung von Vaccinen aus Bakterien und Viren, zur Verstärkung der Abwehrkräfte des Organismus und zur Bekämpfung verschiedener infektiöser Krankheiten, die durch Bakterien hervorgerufen werden (Salmonella, Pseudomonas, Staphylokokken, Klebsieila) sowie solcher, die durch Viren hervorgerufen werden, insbesondere den Virus von Semliki Forest und der Encephalo- myocarditis.

Andererseits zeigen diese Fraktionen eine Wirkung gegen Krebskrankheiten (Ehrlich Ascites und Lymphom YC8). Das erfindungsgemäße Verfahren zur Gewinnung

.ι, mindestens eines Hydrolyseprodukts eines gegebenenfalls gereinigten Endotoxins von Bordetella Pertussis ist dadurch gekennzeichnet, daß man das gegebenenfalls gereinigte Endotoxin mittels Trifluoressigsäure bei einem pH-Wert zwischen 2 und 4 bei einer Temperatur

-.o zwischen 40 und 60°C über einen Zeitraum von 50 bis 150 Stunden hydrolisiert, die überstehende Flüssigkeit abtrennt und den Bodensatz gefriertrocknet und gegebenenfalls das als Produkt A isolierte Hydrolyseprodukt in weitere Fraktionen aufspaltet.

v-, Die Aufspaltung des erfindungsgemäß erhaltenen Produktes A wird insbesondere durchgeführt, indem man

a) das Produk: A einer Extraktion mit einem Gemisch aus Toluol und Methanol im Verhältnis I : I unterwirft, wobei der erhaltene Rückstand das Produkt B darstellt

λ-, c) das Produkt X einer Extraktion mit Methanol unterwirft, wobei man 1) einerseits einen Rückstand (Produkt X 2) und

2) andererseits nach dem Verdampfen des Extrakts ein Produkt X1 erhält, und außerdem

d) das Produkt B einer Hydrolyse mittels Salzsäure bei einem pH-Wert gleich oder unterhalb 1 bei einer Temperatur von 100⁰C übier eine Zeitdauer von 15—60 Minuten unterwirft, nach dem Abzentrifugieren, Waschen und Eliminieren der überstehenden Flüssigkeit den Rückstand gefriertrocknet, welcher das Produkt Z bildet und

e) das Produkt Z einer Extraktion mittels Hexan unterwirft und einerseits nach dem Verdampfen des Lösungsmittels einen Extrakt (Produkt Z 1) und andererseits einen Rückstand (Produkt Z 2) isoliert.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird das Produkt Z 2 zusätzlich durch Extraktion mittels eines Gemisches von Toluol und Methanol im Verhältnis 1:1 und Eliminierung des Rückstandes gereinigt

Die unterschiedlichen Stufen des Verfahrens sind in ίο dem folgenden Schema dargestellt

ENDOTOXIN B. P.

Reinigung

ENDOTOXIN B. P. (gereinigt)

a) Hydrolyse CF₃COOH pH: 2-4

b) Zentrifugierung

PRODUKT A (gefriergetrocknet)

Rückstand

überstehende Flüssigkeit

Extraktion Toluol/Methanol

Extrakt

	Produkt B	a) Hydrolyse (HCI 0.25 η	Extraktion Hexan Extrakt
übersteh		Produkt Z
	b) Zentrifu gierung endp.	Rückstand
	Flüssigkeit
	Produkt Z2
		Produkt 7.1

DaJ Endotoxin von Bordetella Pertussis, dessen Herstellung an sich bekannt ist, kann nach den in der Literatur beschriebenen Verfahren erhalten werden, wobei insbesondere auf folgende Publikationen verwiesen wird: Biochem. J. 74, Seite 398-409 (1960), Japan J. Mtcrobiol 14, Seite 1 -8 (1070), Camid.). Microbioi 19, Seite 231-237(1973).

Die Reinigung des Endotoxins kann nach unterschiedlichen an sich bekannten Methoden erfolgen. Gemäß der Erfindung ist diese Reinigung fakultativ und kann gegebenenfalls durch eine Reihe von Extraktionen mit Hilfe verschiedener Lösungsmittel erreicht werden, insbesondere einer anfänglichen Extraktion mit Chlora

	Extraktion
Produkt X	Methanol
Rück	Extrakt
stand

Produkt X2

Produkt X1

form, gefolgt durch eine Extraktion mit einem Gemisch aus Toluol und Methanol im Verhältnis 1 : 1 und schließlich mit Methanol. Eine derartige Reinigung erlaubt die Entfernung von 1 - 2% löslicher Bestandteile.

Die Hydrolyse des Endotoxins mittels Trifluoressigsäure, erfolgt unter schonenden Bedingungen bei einem pH-Wert zwischen 2 und 4, vorzugsweise beim pH-Wert 2,4.

Nach dem Zentrifugieren wird die überstehende Flüssigkeit eliminiert und der Rückstand wird gefriergetrocknet und bildet das Produkt A.

Gemäß einer ersten Variante wird das Produkt A

einer Extraktion mit Hilfe eines organischen Lösungsmittels, vorzugsweise eines Lösungsmittelgemisches, wie einem Gemisch aus Toluol und Methanol im Verhältnis I : 1 unterworfen. Der erhaltene Rückstand stellt das Produkt B dar und das extrahierte Gemisch nach der Verdampfung des Lösungsmittels führt zum Produkt X, das gleichfalls einer neuen Extraktion mit Hilfe von Methanol unterworfen wird, wobei einerseits ein Rückstand (Produkt X 2) und andererseits nach dem Verdampfen des Extrakts ein Produkt X 1 erhaiten wird.

Das Produkt Z₁ das durch Hydrolyse des Produkts B, welches den Extraktionsrückstand des Produkts A darstellt, gewonnen wurde, kann nach dem Abzentrifugieren und Eliminieren der überstehenden Flüssigkeit, gegebenenfalls durch Waschen mittels einer 0,25 n-Salzsäure und mittels Wasser und erneutem Zentrifugieren gereinigt werden. Es ergibt nach Extraktion mittels Hexan einerseits nach dem Verdampfen des Lösungsmittels einen Extrakt (Produkt Z 1) und andererseits einen Rückstand (Produkt Z 2), wobei gemäß einer Variante dieses Verfahrens diese Produkte in gereinigter Form durch Extraktion vorzugsweise mittels eines Gemisches von Lösungsmitteln, wie einem Gemisch von Toluol und Methanol im Verhältnis 1 : 1 und Eliminierung des Rückstands erhalten werden können.

Im folgenden beziehen sich die Hinweise auf das Produkt Z 2 auf das gereinigte Produkt.

Die erste Stufe bzw. Hauptstufe, die das wesentlichste Kennzeichen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, besteht in der schonenden Hydrolyse, die am Endotoxin, das gegebenenfalls zuerst gereinigt worden war, durchgeführt wird.

Die Erfindung ist aber auch auf die unterschiedlichen Fraktionen gerichtet, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten werden, insbesondere auf die Produkte A, B, X, X 1, X 2, Z, Z 1 und Z 2.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird durch folgendes Beispiel erläutert.

Beispiel

Es werden 5,5 g Endotoxin von Bordetella Pertussis (BP35-Stamm 1414 Phase I) zur Reinigung einer Reihe von Extraktionen unterworfen.

Das Endotoxin wird zunächst einer Extraktion mit 100 cm³ Chloroform unterworfen. Nach dem Eliminieren des Extrakts wird der Rückstand erneut mit 2 χ 100 cm³ eines Lösungsmittelgemisches aus Toluol und Methanol im Verhältnis 1 :1 extrahiert. Wie vorher wird der Extrakt elimi/iiert und der Rückstand wird erneut extrahiert unter Verwendung von 100 cm³ Methanoi als Lösungsmittel.

Der erhaltene Rückstand von 5,345 g besteht aus dem gereinigten Endotoxin. Die beschriebene Extraktionsreihe gestattet die Eliminierung von etwa 75 mg löslicher Bestandteile.

Es wird das gereinigte Endotoxin auf einen geeigneten Rezipienten gebracht und hierzu 1360 cm³ Trifluoressigsäure gegeben (pH-Wert des Milieus 2,43).

Das Gemisch wird 115 Stunden lang auf 50° C gehalten.

Nach d?m Abkühlen wird mittels einer Zentrifuge

MSF. Typ MR 25 mit 3000 U/min 20 Minuten lang -mnfi'giert. Die überstehende Flüssigkeit, die haupt-"•hiich aus Poly.acchariden zusammengesetzt ist. wird

i'Ti'nii" ■ Dn Rückstand wird gefriergetrocknet und s:_c;: ··.·' . ·.· rVoHtik! ' Jar.

Gewinnung der Fraktionen X₁X 1 und X 2 und der Fraktionen B₁Z, Z 1 und Z 2

Das Produkt A (3,422 g) wird einer Extraktion unter Verwendung von 4 χ 100 cm³ eines Lösungsmittelgemisches aus Toluol und Methanol im Verhältnis 1 :1 unterworfen. Nach dem Eliminieren des Lösungsmittels unter vermindertem Druck werden 226,8 mg eines Extrakts (Produkt X) erhalten, und der Rückstand der ίο Extraktion Stellt das Produkt B (3,180 g).

(1) Gewinnung der Fraktionen X 1 und X 2

Das Produkt X in der Menge von 226,8 mg wird mit is 100 cm³ Methanol extrahiert, wobei nach dem Verdampfen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck das Produkt Xl (100,2 mg) erhalten wird. Der Rückstand der Extraktion von 107,2 mg stellt das Produkt X 2 dar.

(11) Gewinnung der Fraktionen Z. Z 1 und Z 2

Die oben gewonnenen 3,180 g Produkt B werden in einen geeigneten Behälter gebracht und einer Hydroly-

2" se in Gegenwart von 1600 cm³ Salzsäure 0,25 η bei einer Temperatur von 100° C 30 Minuten lang unterworfen.

Nach dem Abkühlen wird zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit, die die Polysaccharidsubstanzen enthält, eliminiert Der Rückstand wird gegebenen-

Ji) falls nach Waschen mit 0,25 η-Salzsäure und mit Wasser erneut unter den gleichen Bedingungen zentrifugiert und der erhaltene Rückstand gefriergetrocknet, wobei 1,23 g Produkt Z erhalten werden.

Nach Extraktion des Produkts Z mittels 100 cm³

Ji Hexan und Eliminieren des Lösungsmitteln unter vermindertem Druck wird das Produkt Z 1 (50,45 mg) erhalten. Der Extraktionsrückstand wird einer Extraktion mit 100 cm-> eines Lösungsmittelgemisches aus Toluol und Methanol im Verhältnis 1 : 1 unterworfen.

■»» Nach der Eliminierung des Lösungsmittels unter vermindertem Druck werden 823 mg Produkt Z 2 erbalten.

Biologische Auswertung der erhaltenen verschiedenen ■>', Fraktionen

1. Fiebererzeugende Kraft und Toxizität

Die Säugetiere sind gegenüber Endotoxinen empfindlich, jedoch hängt die Empfindlichkeitsreaktion davon

i'i ab, auf welche Weise das Mittel verabreicht wird, welche Spezies Tier verwendet wird, welches Individuum behandelt wird und von der verwendeten Dosierung. Eine schwache Dose kann beim Tier höchstens leiciite Krankheitserscheinungen wie eine Temperaturerhö-

i'> dung oder einen Gewichtsabfall hervorrufen. Eine stärkere Dosis des Endotoxins kann schwere K;ankheitserscheinungen hervorrufen, wie das Schwartzmann-Phänomen und kann zum Tode des Tieres führen.

a) Fiebererzeugende Wirkung

Die fiebererzeugende Wirkung von verschiedenen Fraktionen kann für jedes Produkt an drei Hasen getestet werden. Die Resultate sind durch die Summe der Temperatursteigerungen (ZAf) ausgedrückt. hi Es ist festzustellen, daß ein Produkt als fiebererzeugend einzustufen '.?t, wenn die Größe IAf>\.5° ist (gemäß der europäischen Pharmacopoe).

Die Ergebnisse sind in folgender Tabelle dargestellt:

Produkte
Dosis 2 "ig ml

AHX

kg ' intravenös
Xl \2 /

/I

/2

5 6.(0 5 2 4.3 1.2 0.75 I.

Die Ergebnisse zeigen, daß das Produkt Z und die daraus resultierenden Fraktionen (Produkte Z 1 und Z 2) nur wenig oder gar nicht fiebererzeugend sind, während die anderen Fraktionen Fieber hervorrufen.

Bezüglich der injizierten Dosis sind die stärker fiebererzeugenden Fraktionen sehr wenig von einem Vergleichsendotoxin verschieden, welches aus Escherichia coli in einer Dosis von I jig kg ' angewendet wird und einen Wert IAf = 1.35" hat.

b) Gewichts-Gewinn-Test bei Mäusen (MWGT)

Der Test MWGT besteht darin, daß man einigen Gruppen Mäusen, die voll ausgewachsen sind. (12-14 g) intraperitoneal unterschiedliche Dosierungen der Versuchsprodukte verabreicht. Fine Kontrollgruppe wird mit physiologischer Kochsalzlösung gespritzt. Die einzelnen Mäuse werden am Tage der

Injektion (| 0), danach jede Gruppe am ersten Tag (J I).

am dritten Tag (| 3) und am siebten Tag () 7) anschließend gewogen. Für jede Dosis wird für jedes

Produkt die Variation der Gewichte hinsichtlich der > Kontrollgruppe als Funktion der Zeit aufgezeichnet und die entsprechenden Kurven werden gezeichnet und

hieraus die Flächenwerte (4S,Jbestimmt.
Hieraus wird die Dosis Ai des Produkts bestimmt.

welche einem Wert OS gleich Null entspricht. Diese ίο Dosis reicht nicht aus, eine Störung der Gewichtskurve bei den durch das Produkt in okulierten Tieren bezüglich der Kontrollgruppe hervorzurufen.

In der folgenden Tabelle sind die Dosierungen (Ιλ).

die bei den verschiedenen Produkten erhalten wurden. ii wiedergegeben.

Produkte

/)., /U/M.1US 6 21 öl 183 48 58 58 68

Die erhaltenen Ergebnisse /eigen, daß die Produkte Λ und B bei den sehr schwachen Dosierungen toxisch sind und daß das Produkt X 1 das am wenigsten toxische ist.

c) Schwartzmann-Phänomen

Die Schwartzmann-Reaktion ist eine Blutungs-Nekrose bestimm'.er Organe, die nach der Injektion eines Endotoxins beim Tier oder beim Menschen beobachtet wird, die durch eine erste Endotoxin-Injektion 6-48 Stunden vorher sensibilisiert worden waren. Die nekrotische Reaktion kann lokal in der Haut sein, wenn die erste Dosis des Endotoxins in die Haut und die zweite Dosis intravenös gespritzt worden ist.

Die Reaktion ist dann generalisiert, wenn die beiden Injektionen intravenös vorgenommen werden. Die Reaktion kann mit zwei Endotoxinen ohne verwandte Antigene erhalten werden.

Bei der folgenden Untersuchung erfolgte die erste Injektion intradennal (die Injektion der verschiedenen aus dem Produkt A erhaltenen Fraktionen) und die zweite Injektion erfolgte 17 Stunden später intravenös (diese letztere Injektion erfolgte mit einem Vergleichs endotoxin).

In der folgenden Tabelle sind die Werte der nekotischen Reaktion ( + ) bzw. die negative Reaktion (-) wiedergegeben.

Produkte
A

Nekrotische Reaktion

Xl

x:

/1

Die Analyse der Ergebnisse zeigt eine Auftrennung der biologischen Eigenschaften bei dem Niveau der Produkte X, X 2 einerseits und der Produkte Z. Z 2 andererseits. Die Produkte X, X 2 haben eine pyrogene Wirkung und sind Schwartzniann-positiv während He Produkte Z und Z 2 nicht pyrogen sina und keine nekrotische Reaktion beim Schwartzmann-Test ergeben.

2. Nicht-spezifische Immunisierungswirkung

Die unterschiedlichen erhaltenen Fraktionen gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren wurden in folgen- der Weise geprüft:

Es wurden Mäuse mit einem mittleren Gewicht vor, 20 g intraperitoneal mit verschiedenen Dosierungen von jedem zu prüfenden Produkt injiziert. Nach einem Zeitzwischenraum von drei Tagen bei den bakteriellen -Drnkon tittrt fs-trt air!Am Ton Ue; /lon V^rinicnn">hi3r. «-«ir-Hi^ri

auf dieselbe Weise eine ietaie bakterielle Dosis (I) oder Virusdosis (Ii) verabreicht mit der Ausnahme der Probe beim Vimsstamm SF oder bei der subkutanen Injektion. Die in folgender Tabelle dargestelhen Ergebnisse sind ausgedrückt hinsichtlich der Prozentzah! der überlebender. Mäuse. Es wurden folgende Antigene verwendet:

(!) Salmonella t.vphi: ST.

Pseudomonas aenjg;p.osa: PA.
(I!) Virus der Eucephainrnvoearditis: EMC.

Virus »Semiiki Forest": SF.

	Tesldosis	Dose	Λ	28 23	750	Xl	10	Χ2	/	/I	ι

\ ersuchs-	[)E : 0%	1/1	90	B	χ	40	100	80	40	/2 I
intigen	DF/5 : 10	1/4	30			0	40	20	0
ST	Dh/25 : 80	1/16	IO	90	90	0	0	30	0	70 :
	DE : 0%		90	60	20	0	60	0	0	30
	DE/5 : 20		0	0	10	0	10	0	0	0
PA	1)1-725 : 90		0	70	60	0	0	0	0	10
	I)I : 25"«	I/I	90	20	10	70	100	80	70	0
	I)I- : IO	I/I	90	0	0	40	100	50	50	ο ;;
IMC			H)O	70				KM)
SI·			90	80			70 'ι

III·" Vcrsuchsdnsis.

l/l 1/4 tinil I/Id: Verdünnuni! auf das Vierfache b/w. Sechsfache, hinsichtlich der stärksten Dosis l/l von 2(XI y.g je Maus.

Die erhaltenen Ergebnisse bei den Versuchsmäusen /eigen, daß die Proben, die aus den Bakterien erhalten wurden, schwerwiegendere Wirkungen hatten und wesentlich signifikantere Werte zeigen als die Proben aus den Viren. Die Mäuse, welche die Versuchsdosierungen erhielten, überlebter, nicht, während im Falle der Virusproben ein bestimmter Prozentsatz der Mäuse am Leben blieb.

Die Ergebnisse zeigen, daß das Produkt X 2 in der L ige ist, einen totalen Schutz zu gewähren.

Die wiedergegebenen Ergebnisse zeigen ebenfalls die signifikanten Unterschiede der biologischen Eigenschaften der Produkte X 2 und Z 2. Diese Ergebnisse scheinen die Auftrennung zu belegen, die hinsichtlich der biologischen Eigenschaften bei der fiebererzeugenden Wirkung und bei der nekrotischen Wirkung der Fraktionen Z 2 und X 2 beobachtet wurden.

3. Adjuvans-Aktivität

Die Adjuvans-Aktivität kann durch die Dosis gemessen werden, durch welche eine Erhöhung der Antikörperbildung bewirkt wird. Der Antikörper-Titer wird in jedem Fall durch die Technik der passiven Hämagglutination bewirkt. Hierbei wird der Antikörper-Titer durch den umgekehrten Wert der äußersten Verdünnung ausgedrückt, durch welche man noch eine positive Reaktion beobachten kann. Bei den verschiedenen Produkten wird eine Erhöhung der Antikörper als Antwort auf eine Injektion einer Grippevaccine (Vaccine A und B) bei Mäusen gemessen. Es wird die minimale Dosis der Vaccine gemessen, durch welche noch eine spezifische Antikörper-Reaktion des Grippevirus erhalten wird, die noch mit der passiven Hämagglutinationstechnik aufspürbar ist. Dieses Maß stellt den Kontrollwert dar. Es wird bei Mäusen diese Minimaldosis (Kontrollwert) der Vaccine (A oder B) injiziert und das Produkt, das man zu testen wünscht Die beiden Produkte, nämlich die Vaccine und das Adjuvans, werden in der Spritze gemischt und danach gleichzeitig injiziert 21 Tage nach der Injektion wird der gebildete Antikörper-Titer bestimmt

Die Ergebnisse sind durch den Kehrwert der äußersten Verdünnung ausgedrückt Die injizierten Dosierungen der unterschiedlichen Fraktionen betragen 200 μg je Maus.

Injiziertes Material	Titer	Vaccine H
bei Mäusen		<20
	Vaccine A
Physiologische	<20	101
Kochsalzlösung		320
Antigen allein	201	4(X)
Λ	806	640
Ii	506	160
X	1613	506
Xl	1280	201
X 2	806	400
Z	806	201
Zl	806
Z2	806

Bei den Grippevaccinen A und B zeigen die angegebenen Ergebnisse, daß die Lipoidfraktionen X und X 1 eine stark erhöhte Adjuvans-Aktivität hervorbringen, die derjenigen des Endotoxins überlegen ist. Die Produkte Z, Z 1, Z 2 zeigen die gleiche Adjuvans-Aktivität wie das Endotoxin. Wie jedoch in der Tabelle angegeben, sind die Produkte weder toxisch noch schwach toxisch. '

Hinsichtlich der Vaccine B ist die Adjuvans-Aktivität der verschiedenen Produkte noch schwächer. Indessen sind die Produkte X und X 2 hinsichtlich der Adjuvans-Aktivität die stärksten.

4. Tumor-Wirkung

Die verschiedenen gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Fraktionen wurden in folgender Weise hinsichtlich der Tumor-Wirkung geprüft:

Es wurden Mäuse mit einem Gewicht von 16—18 g intraperitoneal mit 400 μg jedes Versuchsprodukts injiziert 4 Stunden später wurden auf gleiche Weise 10³ Tumorzellen vom Ehrlich-Ascites Tumor (EA) oder des Lymphoms YC8 injiziert

Die Tiere wurden 2 Monate beobachtet und es wurden die überlebenden Tiere bei Zeitablauf aufgezeichnet

Es wurden die folgenden Ergebnisse erhalten, ausgedrückt in mittlerer Oberlebensdauer.

Tumor

I- Λ
YCX'

Konirolle

21 Tage
26 lage

>65

35

61

11

Xl

>65
62

X?

>65

/I

>65 49

Die dargestellten Ergebnisse beziehen sich auf die Aktivität der Produkte gegen die Entwicklung des Tumors.

Aus den Ergebnissen kann gefolgert werden, daß die Produkte X, X I und X 2 pyrogen, Schwartzmann-positiv (ausgenommen Produkt X 1) sind und eine Adjijvans-Aktivität aufweisen, die seir hoch ist, und Mäusen eine nicht-spezifische Immunität verleihen während die Produkte Z, Z I und Z 2 nicht pyrogen sind, Schwartzmann-negativ sind und eine \djuvans-Aktivitat im üblichen Rahmen des Produkts aufweisen und eine sehr schwache nicht-spezifische Immunitätswirkung zeigen.

Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf Arzneimittel, die Produkte enthalten, die nach dem erfindungsgemä-Den Verfahren hergestellt worden sind. Bezüglich der Adjuvans-Aktivität der unterschiedlichen Produkte, die bei den Fraktionen mehr oder weniger wesentlich ist, können diese Fraktionen bei Vacirinen gebraucht werden, um diese Wirkung zu verstärken. Vorzugsweise benutzt man Fraktionen, die eine überlegene Adjuvans-Aktivität aufweisen, insbesondere die Produkte X, X I und X 2.

Gleicherweise können die Produkte A, B, Z, Z I und Z 2 gut verwendet werden, bei denen die Adjuvans-Aktivität weniger ausgeprägt ist, da bei bestimmten dieser Produkte und insbesondere bei den Produkten Z, Z 1 und Z 2 keine pyrogenen Wirkungen auftreten und diese nur schwach toxisch sind.

Die Dosen der Produkte hängen von der Tierspezies oder von deren Nutzbarmachung für eine Vaccine für den Menschen ab. Die Antigendosis für jede Vaccine in der notwendigen Quantität soll ausreichen, bei der in Betracht genommenen Spezies, ein zufriedenstellendes Immunitätsniveau sicherzustellen.

Andererseits gestatten die bemerkenswerten Stimulationseigenschalten für die Immunitätsfunktionen gegenüber bakteriellen oder Virusinfektionen und gegenüber Tumorprozessen, daß die Produkte X und X 2 (und in gleicher Weise A und B) als immunostimulierende Arzneimittel verwendet werden.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Gewinnung mindestens eines Hydrolyseprodukts eines gegebenenfalls gereinigten Endotoxins von Bordetella Pertussis, dadurch gekennzeichnet, daß man das gegebenenfalls gereinigte Endotoxin mittels Trifluoressigsäure bei einem pH-Wert zwischen 2 und 4 bei einer Temperatur zwischen 40 und 60°C über .einen Zeitraum von 50 bis 150 Stunden hydrolysiert, die überstehende Flüssigkeit abtrennt und den Bodensatz gefriertrocknet, und gegebenenfalls das als Produkt A isolierte Hydrolyseprodukt in weitere Fraktionen aufspaltet

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Aufspaltung des gemäß Anspruch 1 erhaltenen Produktes A durchführt, indem man