DE2954387C2

DE2954387C2 - Die tumorspezifische Immunität vergrößernder Bakterienzellenextrakt und Verfahren zu seiner Herstellung

Info

Publication number: DE2954387C2
Application number: DE2954387A
Authority: DE
Inventors: Yoshikazu Kamakura Kanagawa Fujisawa; Yoshio Yokohama Kanagawa Furutani; Hitoshi Mobara Chiba Inoue; Shizuo Shimada; Tadashi Sudo
Original assignee: Mitsui Toatsu Chemicals Inc
Current assignee: Mitsui Toatsu Chemicals Inc
Priority date: 1978-03-10
Filing date: 1979-03-02
Publication date: 1986-10-09
Also published as: JPS54140710A; GB2015876B; DE2908241C2; CA1146467A; DE2908241A1; GB2015876A; US4726947A; FR2419071B1; JPS6241214B2; IT7920841A0; IT1110450B; FR2419071A1

Description

Die Erfindung betrifft einen zum Vergrößern der tumorspezifischen Immunität von tumortragenden Tieren geeigneten Bakterienzellenextrakt, ein Verfahren zu seiner Herstellung sowie ein Tierarzneimittel, das diesen Bakterienzellenextrakt als aktiven Bestandteil enthält

Es ist gut bekannt, daß die Tuberkelbazillen eine starke Antitumoraktivität besitzen, und es wurden Versuche unternommen, lebende Zellen des Tuberkelbazillus Patienten mit bösartigem Tumor zu verabreichen. Die Verabreichung lebender Zellen des Tuberkelbazillus enthält jedoch ein großes Risiko der Infektion und erzeugt schwere Nebeneffekte wie Geschwürbildung und Fieber.

Zur Vermeidung dieses Infektionsrisikos wurde eine Anzahl vor. Versuchen unternommen, den Bestandteil

mit der Antitumoraktivität von dem Tuberkelbazillus zu extrahieren. Die aktiven Substanzen, die bisher von dem Tuberkelbazillus präpariert worden sind, umfassen Heißwasserextrakt, wasserlösliches Adjuvans, Wachs, Ribonucleinsäure, Zellwandgerüst, extrahierte Zellrückstände mit organischen Lösungsmitteln und dergleichen.

Jedoch lassen diese von dem Tuberkelbazillus abgeleiteten Substanzen noch viel zu wünschen übrig. Die

Substanzen, die nur geringe Nebenwirkungen besitzen, haben nicht immer hohe Antitumoraktivität, während diejenigen, die eine hohe Antitumoraktivität besitzen, dazu neigen, schwere Nebenwirkungen wie Leberschäden oder Nierenstörungen, Fieber, Erbrechen und Geschwürbildung (Ulzeration) zu erzeugen. Darüber hinaus machen einige Substanzen ein kompliziertes Verfahren zur Herstellung erforderlich, und die so erhaltenen Substanzen besitzen nicht immer hohe Antitumoraktivität.

Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben intensive und ausgedehnte Untersuchungen verschiedener

Extrakte angestellt, die von Zellen der Tuberkelbazillen und verwandter Mikroorganismen hergestellt worden waren, und haben ganz unerwartet gefunden, daß eine aktive Substanz mit einer hohen Antitumoraktivität und niedriger Toxizität reproduzierbar in einem einfachen Verfahren und mit guter Ausbeute hergestellt werden

Aufgabe der Erfindung ist es, einen Bakterienzellenextrakt aus Zellen der Tuberkelbazillen bzw. verwandter

Mikroorganismen herzustellen, der eine aktive Substanz mit hoher Antitumoraktivität und niedriger Toxizität liefert, sowie ein Verfahren zur Herstellung eines derartigen Bakterienzellenextraktes anzugeben. Außerdem soll ein die tumorspezifische Immunität von tumortragenden Tieren verbesserndes Tierarzneimittel hergestellt werden.

Diese Aufgabe wird durch einen zum Vergrößern der tumorspezifischen Immunität von tumortragenden

Tieren geeigneten Bakterienzellenextrakt gelöst, der dadurch gekennzeichnet ist, daß er einen Niederschlag umfaßt, der durch Herstellen eines wäßrigen zellfreien Extrakts von zerrissenen Zellen von Mycobacterium

so smegmatis ATCC 607 oder Mycobacterium avium IFO 3153 und Hinzugeben eines basischen Antibiotikums oder eines Salzes davon erhalten wird.

Vorzugsweise wird als Salz eines basischen Antibiotikums Streptomycinsulfat hinzugegeben.
Das Verfahren zur Herstellung des Bakterienzellenextraktes gemäß der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die vorstehend angegebenen Maßnahmen in der dort angeführten Reihenfolge durchgeführt werden.
Das gemäß der Erfindung weiterhin geschaffene Tierarzneimittel enthält als aktiven Bestandteil einen Bakterienzellenextrakt, wie er vorstehend angegeben wurde.

Der Mikroorganismus, von dem eine Substanz mit Antitumoraktivität (im folgenden als »N-l-Substanz« bezeichnet) nach der Erfindung hergestellt wird, ist aus der Gruppe von Bakterien ausgewählt, die zu dem Genus Mycobacterium gehört, und betrifft Mycobacterium smegmatis ATCC 607 und Mycobacterium avium IFO 3153.

'ϊΚΓΟΟΓςαΠίοΓΠϋα üiid ut€ HCfStCuüng CJHCr aktlVCH SubStutiZ dur

werden keine bestimmten Beschränkungen auferlegt, und es kann nach beliebigen herkömmlichen Verfahren gearbeitet werden, die für den verwendeten Mikroorganismus geeignet sind. Der Mikroorganismus wird beispielsweise (wie es z. B. mit einem anderen Mikroorganismus Mycobacterium bovis BCG praktisch durchgeführt wurde) in ein Kulturmedium wie Sauton's Medium oder Glycerin-Bouillon-Medium geimpft. Dieses Kulturmedium wird bei etwa 37° C drei bis acht Wochen stehen gelassen, und die entstehende Kultur wird filtriert, um eine Masse aus Zellen zu erhalten. Diese Zellen werden in Wasser oder vorzugsweise einer geeigneten Pufferlösung suspendiert und dann mittels einer geeigneten Vorrichtung wie einer Dyno-Mühle oder einer Pulver-Mühle oder französischen Presse zerrissen, um eine Suspension aus zerrissenen Zellen zu bilden. Es ist vorzuziehen, bei dem

Zerreissen der Zellen die Temperatur unterhalb 10° C₁ beispielsweise durch Abkühlen mit Eis, zu halten. Wenn die Temperatur der Suspension 10° C übersteigt, wird die Aktivität des extrahierten Bestandteils auf Grund der während des Zerreissens gebildeten Wärme durch die Wirkung von Enzymen herabgesetzt werden. Bevorzugte Beispiele für die Pufferlösung umfassen Phosphat-, Borat-, Acetat-, Zitrat-, Tartrat-, Succinat- und Tris(hydroxymethyl)-aminomethanpufferlösungen, und sie können in einer Konzentration von 0,001 bis 1 M und Vorzugsweise von 0,01 bis 0,1 M, eingesetzt werden.

Die so erhaltene Suspension aus zerrissenen Zellen wird dann filtriert oder zentrifugiert, um einen wäßrigen zellfreien Extrakt zu bilden, der für die Herstellung einer aktiven Substanz geeignet ist Der Ausdruck »wäßriger zellfreier Extrakt«, wie er hier verwendet wird, bedeutet die Suspension aus zerrissenen Zellen, aus der die verbliebenen unzerstörten Zellen und die Zellwandrückstände soweit wie möglich durch Filtrieren oder Zentrifugieren entfernt worden sind. Diese Abtrennung wird vorzugsweise so durchgeführt, daß der Gehalt des Zellwandgerüstes in der endgültigen N-I-Substanz 8% nicht überschreitet Beim Durchführen des Trennens ist es auch zu bevorzugen, die Temperatur unterhalb 10° C zu halten. Wenn die Temperatur 10° C überschreitet, wird der aktive Bestandteil des wäßrigen zellfreien Extrakts durch die Wirkung von Enzymen verschlechtert und die Trennfähigkeit desselben verringert

Dem wäßrigen zellfreien Extrakt gibt man ein Flockungsmittel zu, das verwendet wird, um die N-I-Substanz von dem zellfreien Extrakt auszufällen. Es kann aus einer breiten Vielfalt von Verbindungen ausgewählt werden. Bevorzugte Beispiele für die Flockungsmittel umfassen mehrwertige Metallsalze wie Aluminiumsulfat, Calziumchlorid, Magnesiumchlorid, Eisen(III)-Chlorid und Manganchlorid; synthetische polymere Flockungsmittel wie Polyacrylamid und Polyamin; natürliche wasserlösliche basische Polymere wie Chitosan und Protaminsulfat und Natriumalginat; wasserlösliches basisches Antibiotikum wie Streptomycin und Kanamycin oder ein Salz davon. Das wasserlösliche basische Antibiotikum wird in einer Konzentration von 0,1 bis 10% (G/V) und vorzugsweise 0,1 bis 1 % (G/V), verwendet

Dadurch wird die N-I-Substanz aus dem wäßrigen zellfreien Extrakt ausgefällt Der Niederschlag wird von der Mutterlauge durch ein geeignetes Verfahren wie beispielsweise Filtrieren oder Zentrifugieren abgetrennt Während der Bildung eines Niederschlags und seiner Abtrennung von der Mutterlauge ist es auch zu bevorzugen, die Temperatur unterhalb 10°C zu halten. Nach der Zugabe des Antibiotikums wird die Mischung vorzugsweise einige Stunden stehen gelassen, damit sich der Niederschlag gut bildet. Die N-I-Substanz, die von der Mutterlauge durch Filtrieren oder Zentrifugieren abgetrennt worden ibt, kann direkt verwendet werden.

Die N-I-Substanzen, die gemäß dieser Erfindung hergestellt worden sind, besitzen eine komplizierte Zusammensetzung und bestehen im wesentlichen aus Zucker, Protein, Lipiden und Nucleinsäure. Sie zeigen keine merklichen Unterschiede in der Zusammensetzung und haben alle übereinstimmend hohe Antitumoraktivitäten und nur einen leichten Grad an Toxizität und Nebenwirkungen, so daß sie als die aktiven Bestandteile von antitumoraktiven Zubereitungen verwendet werden können. Darüber hinaus können sie leicht mit guter Ausbeute hergestellt werden. Daher wird die N-I -Substanz als ein antitumoraktives Mittel brauchbar sein.

Die N-I -Substanzen können Tieren in Form von injizierbaren Lösungen, entweder allein oder in Kombination mit einer antigenischen Substanz verabreicht werden. Die N-I-Substanzen können sowohl in Wasser als auch in öl suspendiert werden.

Sie können beispielsweise entweder in Form von Suspensionen in physiologischer Kochsalzlösung oder Emulsionen (vom Wasser-in-öl-Typ) durch Dispergieren dieser Suspensionen in einem pflanzlichen oder einem mineralischen öl oder Emulsionen (vom öl-in-Wasser-Typ) durch ihre Suspension direkt in einem pflanzlichen oder einem mineralischen öl und dann Dispergieren der entstehenden Suspensionen in physiologischer Kochsalzlösung verwendet werden.

Die Dosierung der N-I-Substanzen kann in Abhängigkeit von der Tierart, dem Verabreichungsweg und dem Verabreichungszeitplan geeignet bestimmt werden. Bei Mäusen können sie intraperitoneal in einer Dosis von 1 bis 50 mg pro kg Körpergewicht oder subcutan in einer Dosis von 2 bis 200 mg pro kg Körpergewicht verabreicht werden. Bei Meerschweinchen können sie intraperitoneal in einer Dosis von 1 bis 100 mg pro kg Körpergewicht oder subcutan in einer Dosis von 0,05 bis 100 mg pro kg Körpergewicht verabreicht werden.

Die Stellen, an denen die N-I-Substanzen verabreicht werden, können entweder innerhalb des Tumors oder entfernt von dem Tumor liegen.

Für verschiedene Arten von Tumoren können die N-I-Substanzen in einer Dosis verwendet werden, die von einem Zehntel bis zu dem gleichen Wert wie die Dosis der lebenden Zellen von BCG reicht, wobei eine antitumoraktive Wirkung ähnlich der von lebenden Zellen von BCG erreicht wird. Beispielsweise ist die bevorzugte Dosis, die gegen Line 10 hepatoma in Stamm 2 Meerschweinchen wirksam ist, 100 μg pro Tier für die N-I-Substanzen und 1 mg pro Tier für lebende Zellen von BCG. Dies legt nahe, daß der aktive Bestandteil von lebenden Zellen von BCG in den N-I-Substanzen konzentriert ist.

Darüber hinaus haben die N-I-Substanzen eine kräftige Antitumoraktivität sowohl an festen Tumoren als auch an Aszites-Tumoren.

Die Arten von Tumoren, gegen die die N-I-Substanzen wirksam sind, umfassen beispielsweise Ehrlich-Aszites-Tumor und festen Tumor, Sarcoma 180 Aszites-Tumor und festen Tumor, Melanoma B-16 und die anderen. Besonders für Line iö Hepatoma in Stamm 2 mcci'sc-hwciric-hcn hindern die N-!-Substanzen nicht nur das Wachstum des primären Tumors, sondern verhindern auch Metastasen zu den regionalen Lymphknoten, was so zu einer vollständigen Heilung führt. Darüber hinaus wehren die Meerschweinchen die zweite Impfung von Line 10 ab, was die Bildung der tumorspezifischen Immunität durch die Behandlung mit N-I-Substanzen nahelegt.

Wenn die N-1-Substanzen an Tiere mit bösartigem Tumor subcutan verabreicht werden, sollte die effektive Dosis nicht größer als 1 oder 2 mg pro einzelner Injektion sein.

;js Da die N-I-Substanzen von einem wäßrigen zellfreien Extrakt von Mycobacterium wie BCG hergestellt

ft werden, bringen sie kein Risiko der Infektion mit sich. Wenigstens so weit es Tiere betrifft, bewirken die

|5 N-1-Substanzen keine Nebenwirkungen wie Geschwürbildung an der Stelle der Verabreichung und Leberschä-

ß den oder Niarenstörungen, wie das bei lebenden Zellen von BCG üblich ist. Darüber hinaus verursachen die

ίΐ 5 N-I-Substanzen selten eine allergische Reaktion in auf Tuberkulin empfindlich gemachten Tieren. Weiterhin ist,

|J auch wenn die N-1-Substanzen Tieren über einen Monat in einer täglichen Dosis, die gleich dem Zehnfachen

|iij derjenigen der lebenden Zeilen von BCG ist, intraperitoneal verabreicht werden, das Auftreten von toxischen

|i.; Wirkungen wie Hemmung des Wachstums, Tod, Anämie, Leberstörungen und Entzündung selten.

I; Zusätzlich besitzen die N-1-Substanzen eine Adjuvansaktivität, die gleich oder höher wie diejenige von

ι·. ίο getöteten Zellen von BCG ist. Wie allgemein bekannt ist, ist ein Adjuvans eine Substanz, die mit einem Antigen

ι;.' einem Tier injiziert wird und sein immunologisches Ansprechen auf das Antigen verstärkt Verschiedene Mikro-

!;. Organismen und zellulare Bestandteile sind bisher auf Adjuvansaktivität untersucht worden. Unter anderem ist

|λ weitgehend bekannt, daß der Tuberkelbazillus eine starke Adjuvansaktivität besitzt und für immunologische

ty Experimente verwendet worden ist Kürzlich sind Versuche unternommen worden, um die Adjuvansaktivität der

§? is Tuberkelbazillen oder ihrer zellularen Bestandteile in der Immuntherapie von Tumoren auszunutzen.

•(3 Die N-1-Substanzen besitzen eine hohe Adjuvansaktivität und sehr niedrige Toxizität Die N-1-Substanzen

Il mit diesen Eigenschaften sind sehr brauchbar zum Vergrößern der tumorspezifischen Immunität von tumortragenden Tieren.

Wenn die N-1-Substanzen als Adj-vans verwendet werden, werden sie den Tieren in Form von injizierbaren 20 Lösungen mit antigenischen Substanzen verabreicht Wie oben angegeben wurde, sind die N-1-Substanzen in der Lage, entweder in Wasser oder in Öl suspendiert zu werden.

Beispielsweise können die N-1-Substanzen als Adjuvans in Form von entweder Suspensionen, die durch ihr Dispergieren zusammen mit einer antigenischen Substanz in physiologischer Kochsalzlösung erhalten werden, oder Emulsionen (vom Wasser-in-Öl-Typ), die durch Dispergieren dieser Suspensionen in einem pflanzlichen 25 oder einem mineralischen öl erhalten werden, oder Emulsionen (vom öl-in-Wasser-Typ), die durch ihr Suspendieren zusammen mit einer antigenischen Substanz in einem pflanzlichen oder einem mineralischen öl und nachfolgendem Dispergieren der entstehenden Suspension in physiologischer Kochsalzlösung erhalten werden, verwendet werden.

Die Dosierung der N-1-Substanzen, die als Adjuvans verwendet werden, kann in Abhängigkeit von der 30 Tierart, dem Verabreichungsweg und dem Verabreichungszeitplan richtig bestimmt werden. Bei Mäusen können sie in einer Dosis von 0,5 bis 50 mg pro kg Körpergewicht subcutan verabreicht werden und bei Meerschweinchen können sie in einer Dosis von 0,05 bis 100 mg pro kg Körpergewicht subcutan verabreicht werden.

Die vorliegende Erfindung wird deutlicher und besser durch die folgenden Beispiele und Experimente verständlich werden.

35 Die Beispiele beschreiben die Verfahren zur Herstellung von N-1-Substanzen und zur Bildung von antitumoraktiven und Adjuvanszubereitungeri aus solchen N-1-Substanzen. Die Experimente zeigen die Brauchbarkeit

'"'■' dieser N-1-Substanzen.

Beispiel 1

(Aktive Substanz, hergestellt von Mycobacterium smegmatis)

Mycobacterium smegmatis ATCC 607 wurde in ein Glycerin-Bouilloh-Medium (Bouillon 20,0 g; Kaliumphosphat 0,5 g; Zitronensäure 2,0 g; Ammoniumeisen(III)-citrat 0,05 g; Magnesiumsulfat 0,5 g; Glycerin 60,0 g; Was-45 ser ad 1000 ml) eingeimpft und drei Tage lang bei 37° C kultiviert.

Die Kultur wurde zentrifugiert, und die aufgesammelten Zellen wurden zweimal mit destilliertem Wasser gewaschen.

Dann wurden 350 g dieser Zellen in 1,75 1 einer 10 mM Phosphat-Pufferlösung (pH 7,0) suspendiert und mit einer Dyno-Mühle unter Kühlung mit Eis aufgerissen. Die Suspension aus den zerrissenen Zellen wurde mit 50 10 000 χ g 20 Minuten lang bei 4⁰C zentrifugiert, um 1,51 eines wäßrigen zellfreien Extraktes zu erhalten.

Zu 100 ml des so erhaltenen wäßrigen zellfreien Extraktes wurde jeweils eines der verschiedenen Antibiotika in der angegebenen Menge hinzugegeben. Trotz der verschiedenen Arten der verwendeten Antibiotika zeigten die aktiven Substanzen keine merklichen Unterschiede in der Ausbeute oder der Zusammensetzung.

Tabelle 1 Aktive Substanzen, hergestellt mit verschiedenen Antibiotika	Menge (g)	Aktive Substanz Ausbeute (g)	Bezeichnung
Antibiotikum	0,3 0,3	1,15 1,02	N-S-I N-S-2
Streptomycinsulfat Kanamycinsulfat

Beispiel 2
(Aktive Substanzen, hergestellt von Mycobacterium avium)

Mycobacterium avium IFO 3153 wurde in ein Glyzerin-Bouillon-Medium mit der gleichen Zusammenset- ι zung, wie sie in Beispiel 1 beschrieben ist, eingeimpft und 6 Wochen lang bei 37°C kultiviert. Die Kultur wurde durch Mullgewebe filtriert, und die aufgesammelten Zellen wurden zweimal mit destilliertem Wasser gewaschen.

Dann wurden 293 g dieser Zellen in 1,5 I einer 10 mM Phosphat-Pufferlösung (pH 7,0) suspendiert und mit einer Dyno-Mühle unter Kühlen zerrissen. Die Suspension aus zerrissenen Zellen wurde mit 20 000 χ g 20 Minuten lang bei 4°C zentrifugiert, um 1,2 I eines wäßrigen zellfreien Extraktes zu erhalten.

Zu diesem Extrakt wurden 3,6 g Streptomycinsulfat hinzugegeben.

Diese aktive Substanz wird hier im folgenden als »N-A-l« bezeichnet.

Experiment 1

(Zusammensetzung von N-I-Substanzen)

Die Zusammensetzung der N-I-Substanzen ist in Tabelle 2 angegeben. Sie wurden durch die folgenden Verfahren analysiert.

(1) Zucker: Bestimmt durch die Phenol-Sulfat-Reaktion (M. Dubois, K. A. Gilles, J. K. Hamilton,

P. A. Rebers, und F. Smith: Analytical Chemistry 28,350,1956).

(2) Protein: Bestimmt durch das modifizierte Verfahren von Lowry (C. D. Stauffer: Analytical

Biochemistry, 69,646,1975).

(3) Lipide: Bestimmt durch das Verfahren von Bleigh und Dyer (E. G. Bleigh und W. J. Dyer:

Can. J. Biochem. PhysioU 37,911,1959).

(4) Nucleinsäure: Fraktioniert nach dem Verfahren von Schmidt, Thannhauser und Schneider (W. C.

Schneider: J. Biol. Chem.. 164,747,1946) und bestimmt durch die Diphenylaminreak-

tion (K. Burton: Biochem. J_ 62, 315, 1956) und durch die Orcinolreaktion (W.

Mejbaum: Z. Physiol. Chem., 258,117,1939).

Tabelle 2

Zusammensetzung von N-I-Substanzen

Beispiel Proben- Zusammensetzung (%)

bezeichnung Zucker Protein Lipide Nucleinsäure

1 N-S-I 14,8 33,0 23,5 10,5

2 N-A-I 14,6 35,0 18,3 8,9

Aus den in Tabelle 2 angegebenen Daten ist deutlich ersichtlich, daß die N-I-Substanzen aus Zucker, Protein, Lipiden und Nucieinsäure in im wesentlichen konstanten Verhältnissen bestehen, unabhängig von den verschiedenen verwendeten Antibiotika.

Experiment 2
(Antitumorwirkung an Mäuse-Sarcoma)

Verschiedene antitumoraktive Zubereitungen wurden aus den aktiven Substanzen der Erfindung folgendermaßen hergestellt: 10 mg N-I-Substanzen wurden mit 04 ml physiologischer Kochsalzlösung in einem Mörser fein gemahlen und dann nach Zugabe von 25 ml physiologischer Kochsalzlösung unter Bildung einer Suspension gut gerührt Dann wurden jeweils 0,5 ml von jeder Zubereitung 6 weiblichen Mäusen des ICR-Stammes intraperitoneal verabreicht und nach 3 Tagen wurden 2 χ 10⁴ Zellen von Mäuse-Sarcoma 180 in die Peritonealhöhle jedes Tieres eingeimpft Nach weiteren 3 Tagen wurde die gleiche Zubereitung in der angegebenen Dosis intraperitoneal verabreicht Die Anzahl der überlebenden Tiere wurde 30 Tage nach der Einimpfung von Tumorzellen untersucht Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 angegeben.

Es wurde gefunden, daß die aktiven Substanzen der Erfindung das Wachstum von Tumorzellen unterdrücken und die Oberlebensdauer von tumortragenden Tieren verlängern. Darüber hinaus wurden keine Nebenwirkun- ω gen beobachtet

Die physiologische Kochsalzlösung wurde als Vergleich verwendet

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Tabelle 3

Antitumorwirkungan Mäuse-Sarcoma

Probenbezeichnung Dosis Anzahl der Überlebenden/

^g/Tier) Gesamte Anzahl der Tiere

N-S-I 200 χ 2 6/6

N-A-I 200 χ 2 5/6

Kontrolle — 0/6

Experiment 3

(Antitumorwirkung an Meerschweinchen-Hepatoma)

Unter Verwendung des Verfahrens von Beispiel A und B (nachstehend) wurden verschiedene antitumoraktive Zubereitungen von aktiven Substanzen der Erfindung hergestellt. Dann wurden 1 χ 10⁶ Zellen von Line 10 Hepatoma syngenetisch (d. h. gleichzeitig entstanden) mit Stamm 2 Meerschweinchen intradermal an der linken Flanke von Stamm 2 Meerschweinchen in einer Gruppe von fünf eingeimpft. Als der Durchmesser des Tumors etwa 10 mm erreicht hatte, wurde die angegebene Menge jeder Zubereitung in den Tumor injiziert. 6 Wochen nach der Einimpfung von Tumorzellen wurden die mittleren Durchmesser des primären Tumors und der Metastasen in dem regionalen Lymphknoten gemessen. Zusätzlich wurde die Anzahl der überlebenden Tiere 8 Wochen nach der Impfung untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 angegeben.

Die aktiven Substanzen der Erfindung verhinderten die Wucherung des gebildeten Tumors und verhinderten Metastasen und führten so zu einer vollständigen Heilung. Es wurden keine Nebenwirkungen beobachtet.

Lebende Zellen (die als »WC« bezeichnet werden) des Mikroorganismus wurden zum Vergleich getestet. Die öl-in-Wasser- und die Wasser-in-öl-Zubereitungen ohne die aktive Substanz wurden als Vergleich verwendet.

■ Tabelle 4
Antitumorwirkung von N-I-Substanzen an Meerschweinchen-Hepatoma

Verwendeter Probe Dosis Anzahl ' Mittlerer Mittlerer

Mikroorganismus ^g/Tier) der Überlebenden/ Durchmesser Durchmesser

Gesamte Anzahl des primären von metastasischem

der Tiere Tumors (mm) . Tumor (mm)

ABABAB

Mycobacterium smegmatic

40 ATCC-607 N-S-I 200

WC 2000

Kontrolle — —

Beispiel A:

10 mg N-S-I wurden mit einer kleinen Menge Drakeoi 6 VR homogenisiert. Nach Zugabe von 5 ml physiologischer Kochsalzlösung, die 0,2% Tween 80 enthielt, wurde nochmals homogenisiert.
Beispiel B:

10 mg N-S-I wurden mit 2,5 ml physiologischer Kochsalzlösung in einem Mörser fein gemahlen. Nach Zugabe von 2,5 ml flüssigem Paraffin, das 15% Arlacel A enthielt, wurde homogenisiert.

Experiment 4

(Antitumorwirkung an Ehrlich'schem Mäusetumor)

Unter Verwendung des Verfahrens von Experiment 2 wurden verschiedene antitumoraktive Zubereitungen von aktiven Substanzen der Erfindung hergestellt 0,5 ml jeder Zubereitung wurde intraperitoneal 6 weiblichen Mäusen vom ddY Stamm verabreicht, und 3 Tage später wurden 2 χ 10⁴ Zellen von Ehrlich'schem Tumor in die Peritonealhöhle jedes Tieres eingeimpft Nach weiteren 3 Tagen wurden die gleichen Zubereitungen in der angegebenen Dosis intraperitoneal verabreicht Die Anzahl der überlebenden Tiere wurde 30 Tage nach der Einimpfung von Tumorzellen untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 angegeben.

Die aktiven Substanzen der Erfindung hemmten das Wachstum von Tumorzellen und verlängerten die Überlebensdauer von tumortragenden Tieren. Es wurden keine Nebenwirkungen beobachtet
Die physiologische Kochsalzlösung wurde als Vergleich verwendet

3/5	4/5	14	10	14	11
1/5	2/5	21	16	40	25
0/5	0/5	23	25	52	60

Tabelle 5

Anütuniorwirkung an Ehrlich'schem Mäusetumor

N-S-I	300 χ 2
N-A-I	300 χ 2
Kontrolle

Probe Dosis Anzahl der Überlebenden/ -

(Hg/Tier) Gesamtzahl der Tiere

3/6
4/6
0/6 i»

Experiment 5
(Adjuvanswirkung auf verzögert-artige Überempfindlichkeit)

Unter Verwendung des nachstehenden Verfahrens wurden verschiedene Adjuvans-Zubereitungen von aktiven Substanzen der Erfindung hergestellt: 5 mg N-S-I und 5 ml flüssiges Paraffin, das 15% Tween 80 enthielt, wurden homogenisiert.

Eine Lösung von 100 mg vom Rind stammenden Serumalbumin in 5 ml physiologischer Kochsalzlösung wurde Tropfen um Tropfen zu 5 ml jeder Zubereitung hinzugegeben, und die entstandene Mischung wurde homogenisiert, um eine Wasser-in-öl-Emulsion herzustellen. Dann wurden 0,5 ml der Emulsion intramuskulär 4 weiblichen Meerschweinchen vom Hartley Stamm mit einem Alter von 5 Wochen verabreicht. Vier Wochen später wurde eine Lösung von 100 μg vom Rind stammendes Serumalbumin in 0,05 ml physiologischer Kochsalzlösung in die Rückenhaut injiziert, und die Größe (größerer Durchmesser χ kleinerer Durchmesser in mm) der Rötung an der Stelle der Injektion wurde nach 48 Stunden gemessen. Die durchschnittliche Größe der Rötung für jede Gruppe ist in Tabelle 6 angegeben.

Eine ähnliche Wasser-in-öl-Emulsion ohne aktive Substanz wurde in der Kontrollgruppe verwendet.

Es wurde gefunden, daß die aktiven Substanzen der Erfindung alle eine bemerkenswerte Adjuvanswirkung besaßen.

Tabelle 6

Adjuvanswirkung

auf verzögerte Überempfindlichkeit

35

Gruppe Probe Größe der Rötung

(mm χ mm)

Experimentelle Gruppe N-S-I 17 χ 16

N-A-I 15 χ 18

Kontrolle — 5x6

Experiment 6
(Adjuvanswirkung auf humorale Antikörperproduktion)

Es wurden verschiedene Wasser-in-Öl-Emulsionen in der gleichen Weise wie in Experiment 5 hergestellt. Dann wurden 0,5 ml jeder Emulsion 4 weiblichen Meerschweinchen vom Hartley-Stamm mit einem Alter von 5 Wochen intramuskulär verabreicht Vier Wochen nach der Injektion wurde der Antikörper-Titer in Serum gegen vom Rind stammendes Serumalbumin durch die quantitative Präzipitin-Reaktion bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 angegeben.

55 Tabelle 7

Adjuvanswirkung

auf humorale Antikörperproduktion

—

Gruppe Probe Antikörper-Titer

(Hg N/ml)

Experimentelle Gruppe N-S-I 947

N-A-I 939

Kontrolle — 230

Experiment 7
(Test von N-I-Substanzen auf Tuberkelbazillen)

5 Verschiedene N-I-Substanzen wurden auf die Anwesenheit von lebenden Tuberkelbazillen gemäß dem Verfahren getestet, das in »A Guide to Tubercle Bacillus Test (1972)« (herausgegeben unter Überwachung des Ministry of Health and Welfare, japan) beschrieben ist.

Zu einer Suspension jeder N-I-Substanz in steriler physiologischer Kochsalzlösung wurde eine 1% Natriumhydroxidlösung hinzugegeben. Die entstandene Mischung wurde 30 Minuten lang bei 37°C stehen gelassen und

10 dann mit 15% Schwefelsäure neutralisiert. 0,1 ml der Mischung wurden auf eine schräg im Reagenzglas angelegte Agarkultur eingeimpft, die Ogawa's Medium enthielt, und 3 Wochen lang bei 37° C stehen gelassen, und dann wurde das Vorhandensein von Kolonien untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 angegeben.

' Es ist deutlich ersichtlich, daß die aktiven Substanzen der Erfindung keine lebenden Zellen des Tuberkelbazil-

25 les enthalten.

Experiment 8
(Akute Toxizität)

, ) Die N-1-Substanzen wurden in physiologischer Kochsalzlösung suspendiert und 6 männlichen Mäusen vom

ddY-Stamm mit einem Alter von 6 Wochen intraperitonea! verabreicht. Dann wurde die LD50 (oder mittlere

[?■■ letale Dosis) bestimmt.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 angegeben.

Tabelle 9

Akute Toxizität von N-1-Substanzen

Tabelle 8 Test von N-1-Substanzen auf Tuberkelbazillen	20 20	Anzahl von Kolonien	Beurteilung
Probenbezeichnung Konzentration (mg/ml)		0 0	Negativ Negativ
N-S-I N-A-I

₄₀ Probe LD50

(mg/kg)

N-S-I 1200

N-A-I 1000

45 Abgetötetes Mycobacterium smegmatis 200—400

Claims

PatentaasprQche:

1. Zum Vergrößern der tumorspezifischen Immunität von tumortragenden Tieren geeigneter Bakterienzellenextrakt, dadurch gekennzeichnet, daß er einen Niederschlag umfaßt, der durch Herstellen eines wäßrigen zellfreien Extraktes von zerrissenen Zellen von Mycobacterium smegmatis ATCC 607 oder Mycobacterium avium IFO 3153 und Hinzugeben eines basischen Antibioticums oder eines Salzes davon erhalten wird.

Z Bakterienzellenextrakt nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Salz eines basischen Antibiotikums Streptomycinsulfat hinzugegeben wird.

ίο 3. Verfahren zur Herstellung des Bakterienzellenextraktes des Anspruchs 1, dadurch gekennzeichnet, daß

man die im Anspruch 1 angegebenen Maßnahmen in der dort angeführten Reihenfolge durchführt

4. Verfahren zur Herstellung des Bakterienzellenextrakts des Anspruchs 2, dadurch gekennzeichnet, daß man im Verfahren des Anspruchs 3 als Salz eines basischen Antibiotikums Streptomycinsulfat einsetzt

5. Tierarzneimittel, enthaltend als aktiven Bestandteil einen Bakterienzellenextrakt gemäß Anspruch 1 oder 2.