CN102441162B - 结核病的治疗和预防 - Google Patents

Abstract

本发明属于免疫学和微生物学领域，更确切的说属于分枝杆菌学领域，并涉及结核及相关疾病的免疫治疗与预防。公开了用于这些目的的组合物，包括使用所述组合物的方法。

Description

结核病的治疗和预防

相关申请的交叉引用

本申请是美国申请12/102,564(2008年4月14日提交)的部分续接申请，美国申请12/102,564是美国申请09/935,344(2001年8月23日提交，已放弃)的分案申请，美国申请09/935,344要求美国临时申请60/227,520(2000年8月24日提交)的优先权，其公开的内容纳入本文作为参考。

发明领域

本发明涉及分枝杆菌导致的感染如结核或麻风的治疗和预防。特别是本发明涉及组合物及其使用方法。

发明背景

结核(TB)是一种主要由被称为结核分枝杆菌的细菌引起的传染性疾病。该细菌主要攻击肺(肺TB)，但其也可以攻击脊柱，脑，肾，和其他器官或组织。如果治疗不当，TB可能会致命。每年有九百二十万新结核病例并且有一百七十万结核导致的死亡。此外，这些胞内细菌是数百万例麻风的病因。其他主要由胞内物质传播的衰弱性疾病包括皮肤和内脏利什曼病，美洲锥虫病(恰加斯病)，疟疾，李斯特菌病，弓形体病，组织胞浆菌，沙眼，鹦鹉热，Q发热，和包括退伍军人症的军团病。此时，能预防暴露于这些生物体的易染个体衰弱性感染的办法相对很少。首诊出的结核分枝杆菌感染使用一线抗结核药物(ATT)超过90％的病例在6个月内便可治愈。

然而，当TB与HIV一起出现或者有复发TB或抗药形式TB，如多重抗药TB(MDR-TB)或广泛抗药TB(XDR-TB)时，现有药物效果较低，而且治疗患者耗时长达12-24个月且成功率比对药物敏感型TB低得多。根据不同来源三分之一到一半之间的TB患者是伴随HIV感染，其与预后非常差和高死亡率相关。与HIV合并感染的TB患者的治疗是一项有挑战性的任务。尽管有巨大的疾病负担，过去40年没有开发出新的抗TB化合物而现在的TB菌株对现有药物的抗性在变强。现在至少10％的TB病例是抗药形式。常规ATT难以治疗的TB的治疗需要开发二线TB药物。这是一个明显的挑战，特别是在资源贫乏的国家，因为治疗费用会增加100倍。显然需要替代的和改进的治疗选择。如果发现这样的干预方法，对于难治疗的，即抗药TB或复发TB和/或TB-HIV患者的医疗保健和临床处置的影响会是巨大的。明显的努力方向是寻找抗TB的新药物和疫苗。积极寻求基于免疫的干预方法作为常规ATT的辅助治疗。

抗TB的疫苗于1921年推出，由活卡介苗(BCG)-最初源于牛分枝杆菌的一种分枝杆菌的形式组成。BCG可以降低幼儿严重TB的风险但在青少年和成年人中预防肺TB不是非常有效，而青少年和成年人是这种疾病发病率最高的人群。由于BCG在这些情况下不算有效，有许多尝试以发展更好的基于BCG的重组疫苗(如美国专利号5,830,475)。BCG通常是注射的形式因而广泛使用有问题，需要专门的输药技能。活BCG也被用作口服疫苗。这是在RiodeJaneiro的 Ataulpho de Paiva(巴西抗结核联盟)生产的巴西液体BCG疫苗。其由独特的“Moreau Rio de Janeiro”BCG菌株组成。该菌株在巴西被确定和使用已经超过70年。由于分枝杆菌恢复到能引起疾病的有毒力状态的潜在危险，因此这样的口服疫苗的效果是不可预测的。本领域技术人员认识到的另一个不可预测因素是在通过胃的过程中，疫苗抗原成分被胃的pH和消化酶快速灭活，因此通过肠壁的系统性同化很少或不存在。

TB疫苗被同样的尝试作为治疗方式超过100年。回到1890年，RobertKoch，结核分枝杆菌的发现者，宣布注射结核菌素可以治愈该疾病。然而，随后包括接近2000名患者的临床试验显示只有2％从该方法中受益。有使用BCG作为TB治疗辅助手段的报导。在中国一项包括360名有TB的志愿者的研究中，接收BCG的患者阴性痰液转换率为98.3％而化疗对照中为97.2％。尽管这不显著，BCG组中5年后TB复发为2.3％，而对照组中为6.9％。相反，当在小鼠模型中尝试有BCG的治疗疫苗接种时，其导致了疾病的恶化——这是Koch首先观察到的一种现象。

显示更有前途的治疗疫苗是John Stanford发现和开发的一种杀灭母牛分枝杆菌制品(美国专利4,724,144)。该免疫治疗已经在世界许多国家中测试，且通常比单独化疗能取得更好的结果。例如，3个月后MDR-TB患者中所见阴性痰液转换率为43％，而在接收化疗的人群中为21％。母牛分枝杆菌在某些地理区域显示产生了可衡量的改善，但在其他区域没有，说明所治疗宿主不同的环境和免疫经历可能导致这种不一致。最近报导了一种包含脱毒的结核分枝杆菌细胞碎片的治疗疫苗，RUTI，但现在还没有关于其在人体中效果的数据，尽管在动物中该疫苗显示有前途的结果。其他分枝杆菌物种被尝试用于治疗TB。这包括草分支杆菌和M.w(一种最初开发用于麻风病的疫苗)。同样，TB患者中的临床结果中度且不可预期。由于诱导Koch样反应的潜在风险，本领域技术人员有共识需要极其谨慎以开发安全有效的暴露后疫苗。

因此，仍然有对更好的疗法或疫苗的长期需要。此外这样的疗法需没有不良属性，如患者毒性或甚至死亡，抗药性诱因，以及需要复杂的途径或方式来输药。尽管许多有前途的疫苗宣称在动物模型中成功，通常其没能被证明在人中是有效而安全的。因此，一种疫苗能否发展为有效的TB疫苗不明确。

目前13种新候选疫苗已进入人体临床试验，超过40种在准备中。绝大多数，即使不是所有这些疫苗，都计划通过注射施用，因为一般认为口服施用疫苗会导致其在消化道中的破坏。因此，现有技术没有教导，公开，或启示包含连同同种异型抗原的分枝杆菌病原体或多种病原体抗原或分枝杆菌抗原片段的口服组合物。

发明概述

本发明描述了一种片剂或丸剂形式的口服疫苗，包含病原抗原，如分枝杆菌抗原，和来自源于与宿主自身相同物种的病原体感染或非感染组织的抗原(同种异体组分或同种异型抗原)。这些被配制进有金属盐作载体的丸剂。本发明的组合物克服了之前输药系统固有的困难，并能引导健康改良剂，即疫苗，进入及穿过人或动物受试者的粘膜。本发明的组合物通过粘膜表面施用，如通过口服途径到达肠，以对需要其的受试者提供显著临床益处。

本发明背离了必需用复杂的组合物克服发展有效的分枝杆菌疾病免疫治疗和预防中的进展缺乏这一普遍观念。本发明特点在于惊人的发现水解的分枝杆菌抗原临床效果不逊于热灭活的细菌抗原。因此，该组合物可以作为治疗或预防分枝杆菌感染的疫苗。

增强本发现吸引力的另一个特点是要求的组合物以口服剂型是有效的。为在生物学上有效，本发明抗原被嵌入或埋入药学上可接受的基质中。而且，当组合物口服施用时不需要免疫佐剂来产生期望的效果。

一方面，本发明包括固体口服组合物，其包含治疗有效量的水解抗原，其中所述水解抗原源于感染了分枝杆菌的供体体液。固体口服组合物能方便的制成片剂或丸剂。体液可以包含分枝杆菌或分枝杆菌抗原。该组合物进一步包含嵌入基质如金属盐的同种异型抗原或异种抗原。本发明另一个更普遍的方面，本组合物包含嵌入金属基质的酸水解抗原，同种异型抗原，或其组合。

水解抗原可以被用作免疫治疗或者预防制品。具体说，本发明涉及组合物，以及制备和使用所述组合物的方法。

本发明进一步的方面是包含同种异型抗原和分枝杆菌抗原二者的组合物。这是另一个有助于本发明惊人方面的特征。该特征优选的实施方式是固体组合物，包含嵌入可口服金属盐基质的酸水解同种异型抗原，其中同种异型抗原或异种抗原是嵌入二价金属盐基质的人同种异型抗原，优选热处理的。优选该组合物施用方式为口服。

因此本发明优选的特点是组合物优选固体口服形式如片剂或丸剂。

本发明另一个方面是制备本组合物的工艺，其一般包括水解分枝杆菌，分枝杆菌碎片，或同种异型抗原，将水解产物嵌入固体基质，并将基质配制进口服施用的组合物。

本发明另一个方面，热处理水解的抗原以使本组合物安全并杀死任何剩余的，未水解的，可能成为感染源的偶然病原体。尽管该步骤很重要，其并不关键，因为水解和嵌入工艺在大幅升高的温度下完成，至少56℃，优选高于80℃，并进行延长时间如超过2小时。

本发明的另一个方面，组合物无免疫佐剂下施用。

尽管考虑组合物源于身体器官或体液，像全血，或血浆或血清，本发明也预期了重组的分枝杆菌和其抗原如本领域熟知的和医学文献引用的。这些可以是培养生长的分枝杆菌或其可以为重组形式。重组的生物体或其部分可以包括自然发生的组成这些抗原的氨基酸或核酸序列，或与自然发生序列大体相同的自然发生序列的衍生物，或以线性或三级形式模拟它们的序列，和可能有多于一种分枝杆菌的嵌合序列，例如在一个组合物中的BCG和结核分枝杆菌。这些和其他多种形式疫苗排列被不限制的考虑且本领域公知。

本发明进一步的方面包含治疗患者的方法，包括对患者施用治疗有效量水解的分枝杆菌感染细胞，分枝杆菌，或其碎片的步骤。除了治疗分枝杆菌感染患者，本发明包括预防性施用所述疫苗以降低最终分枝杆菌感染可能性或严重性的方法。

在额外的实施方式中，本发明涉及在脊椎动物受试者中引发适当的免疫反应(细胞或体液)的方法，包括对脊椎动物受试者施用治疗有效量的嵌入金属基质的选择的本发明大分子。

本发明也提供逆转宿主中TB感染引起的体重损失的方法，该方法包括对宿主施用本发明组合物。

本发明也提供逆转宿主中施用常规ATT治疗引起的抗结核(ATT)相关肝毒性的方法，该方法包括向宿主施用权利要求1的组合物。

在优选的实施方式中，除了用本领域接受的标准赋形剂配制，疫苗不受到任何旨在增强抗原在不利的消化环境中“生存”的特殊修饰。

创新的疫苗通过整个身体免疫及在关键重要粘膜组织提供保护，如在眼，肺，口，耳，肠，宫颈，子宫和直肠，病原体经常首先在这些位置进入身体，如通过气溶胶传播给要感染的人。在动物和患者的测试中，本发明的疫苗通过粘膜免疫细胞在中止感染需要的时间框内诱导强烈的反应。因此，作为口服疫苗，其在粘膜表面作用，也通过发起抗疾病免疫反应刺激系统免疫。本发明提供了一种惊人有效和广泛适用的方法，来治疗和预防从人到其他能受分枝杆菌感染的脊椎动物的多种宿主生物中的各种TB感染。

不受限制，人和其他动物中的TB疾病可能由除结核分枝杆菌外的分枝杆菌引起。这是由于所有分枝杆菌属于相同类的病原体，其中有些有毒而有些没有。有许多已知的分枝杆菌生物，包括但不限于BCG，结核分枝杆菌(M.tuberculosisM.)，鸟结核分枝杆菌(M.avium)，哈瓦那分枝杆菌(M.habana)，脓肿分枝杆菌(M.abscessus)，金色分枝杆菌(M.aurum)，牛分枝杆菌(M.bovis)，母牛分枝杆菌(M.vaccae)，非洲分枝杆菌(M.africanum)，龟分枝杆菌(M.chelonae)，偶然分枝杆菌(M.fortuitum)，fuerthensis分枝杆菌(M.fuerthensis)，胃分枝杆菌(M.gastri)，古地分枝杆菌(M.goodi)，戈登分支杆菌(M.gordonae)，免疫原分枝杆菌(M.immunogenum)，胞内分枝杆菌(M.intracellulare)，副结合分枝杆菌(M.paratuberculosis)，lufu分枝杆菌(M.lufu)，堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)，慢黄分枝杆菌(M.lentiflavum)，麻风分枝杆菌(M.leprae)，M.w，马德里分枝杆菌(M.mageritense)，玛尔摩分枝杆菌(M.malmoense)，海分枝杆菌(M.marinum)，马西里亚分枝杆菌(M.massiliense)，莫娜分枝杆菌(M.monacense)，产粘液分枝杆菌(M.mucogenicum)，新金分枝杆菌(M.neoaurum)，外来分枝杆菌(M.peregrinum)，草分枝杆菌(M.phlei)，猪分枝杆菌(M.porcinum)，腐败分枝杆菌(M.septicum)，猿分枝杆菌(M.simiae)，耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)，苏加分枝杆菌(M.szulgai)，土地分枝杆菌(M.terrae)，托斯卡纳分枝杆菌(M.tusciae)，不产色分枝杆菌(M.nonchromogenicum)，溃疡分枝杆菌(M.ulcerans)，龟型分枝杆菌(M.chelonei)，瘰疬分枝杆菌(M.scrofulaceum)，通俗分枝杆菌(M.triviale)，亚洲分枝杆菌(M.asciaticum)，微黄分枝杆菌(M.flavescens)，日内瓦分枝杆菌(M.genavense)，或蟾蜍分枝杆菌(M.xenopi)。这些分枝杆菌可以通过本领域已知的方法使用液体培养基，如Middlebrook 7H9或Saulton合成培养基来增殖。菌株可以保持为静止或摇动的培养物。不限于整个病原体，可以使用其片段。这样片段的例子是源自属于结核家族的细菌的多肽，如ESAT-6，TB10.4，CFP10，RD1-ORF5，RD1-ORF2，Rv1036，MPB59，MPB64，MPB70，MPB83，MPT32，MPT64，Ag85B(MPT59)，Ag85A，Ag85C，19kDa脂蛋白，和α-晶体蛋白，或任何上面提及抗原的至少一种T细胞表位。

本发明同样适用于细胞内病原体引起的疾病如麻风。其他通过血液传播的类似疾病包括皮肤和内脏利什曼病，锥虫病(恰加斯病)，弓形体病，组织胞浆菌病，沙眼，肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)，恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)(疟疾)，尿素分解尿素原体(Ureaplasmaurealyticum)，生殖器支原体(Mycoplasma genitalium)，军团杆菌病(军团病)，嗜肺性军团杆菌(Legionella pneumophilia)，鼠疫耶尔森氏菌(Yersiniapestis)，钩端螺旋体病，利斯特菌病，鼠咬热(黑弗里尔热)，念珠状链杆菌(Streptobacillus moniliformis)，蜱传疾病。螺旋体：博氏疏螺旋体(Borreliaburgdorferi)，游走性红斑，萎缩性肢皮炎(Acrodermatitis Atrophicans)，疏螺旋体淋巴细胞瘤，回归热，埃立克体病，兔热病。衣原体感染如肺炎衣原体(Chlamydiapneumoniae)，鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)，鸟疫，鹦鹉病，鹦鹉热，巴尔通体感染，Q热，立克次氏体感染如落基山斑疹热，斑疹伤寒，流行性虱传丛林斑疹伤寒，梅毒密螺旋体(Treponema pallidum)，弧菌感染等。

热灭活的分枝杆菌抗原被配制入适合对人和动物有效疫苗施用的口服丸剂中。除了这样的抗原，需要同种异体抗原，即来自与计划的宿主相同物种但不是分枝杆菌抗原的同种异型抗原。同种异型抗原最方便的来源是外周血，但其他的来源也可以采用，包括天然来源或重组来源或细胞系。

此外，优选抗原被配制进有金属盐赋形剂的丸剂。这些盐与抗原非共价结合。代表性的金属盐例子包括，但不限于硼化铝镁，醋酸钙镁，磷酸二镁，镁加铝，铝化镁，天冬氨酸镁，苯甲酸镁，溴化镁，碳酸镁，氯化镁，六水合氯化镁，柠檬酸镁，二硼化镁，二谷氨酸镁，重铀酸镁，氟化镁，葡萄糖酸镁，六水合镁，氢化镁，氢氧化镁，碘化镁，乳酸镁，乙酰丙酸镁，硝酸镁，氮化镁，乳清酸镁，氧化镁，氯氧化镁，含氧硫酸镁，高氯酸镁，过氧化镁，磷酸镁，吡咯烷酮酸镁(Magnesium pidolate)，硅化镁，硬脂酸镁，硫酸镁，硫化镁，亚硫酸镁，三硅酸镁，磷酸一镁，柠檬酸三镁等。

本领域技术人员同样可以使用与其他酸反应得到的盐，包括但不限于甲苯磺酸盐，甲磺酸盐，醋酸盐，柠檬酸盐，丙二酸盐，酒石酸盐，琥珀酸盐，苯甲酸盐，抗坏血酸盐，α-酮戊二酸盐，α-磷酸甘油盐，甲酸盐，富马酸/延胡索酸盐，丙酸盐，乙醇酸盐，乳酸盐，丙酮酸盐，草酸盐，氯氧化物，马来酸盐，水杨酸盐，硫酸盐，磺酸盐，硝酸盐，氢溴酸盐，氢溴化物，氢碘化物等。

一般来说，金属盐可以是：硼化物，醋酸盐，磷酸盐，铝化物，天冬氨酸盐，苯甲酸盐，溴化物，碳酸盐，氯化物，六水合氯化物，柠檬酸盐，二硼化物，二谷氨酸盐，重铀酸盐，氟化物，葡萄糖酸盐，六水合物，氢化物，氢氧化物，氧化物，碘化物，乳酸盐，乙酰丙酸盐，硝酸盐，氮化物，乳清酸盐，氯氧化物，含氧硫酸盐，高氯酸盐，过氧化物，吡咯烷酮酸盐，硅化物，硬脂酸盐，硫酸盐，硫化物，亚硫酸盐，三硅酸盐等。

本发明另一方面，两种或更多种金属可以同时使用。例如，可以以各种可接受的比率混合氯化钙和氯化镁并向其中嵌入水解的抗原。不限于两种金属来源，显然多数来源包含多种金属或其合金的少量混合物。例如镁砂可能包含少量钙和其他金属。混合物中的钙如碳酸钙不干扰固体物质的环境，因为高比例的反应性镁砂起主导作用。反应性镁可以方便的与其他混合物组合以创造固体物质如铝酸钙，或其他成分例如有显著优势的石膏或水泥样组合物。在另一个实施方式中，自然产生的矿物如粘土，高岭石，白垩，硅石，石膏，长石，钠长石，钙长石，正长石，磷灰石，岩盐，方解石，白云石，碳酸钠，菱铁矿，黑云母，膨润土，白云母，绿泥石，辉沸石，黄铁矿，赤铁矿等可以被分散并制备进抗原被混合并水解的浆体中。

要求保护组合物，制备疫苗组合物的方法以及疫苗接种或治疗哺乳动物/人抗结核的方法。特别地，本发明提供了一种保护非感染哺乳动物，包括人，免受TB感染的方法，包括对非感染的哺乳动物/人施用有效量的口服疫苗制剂，其含有伴有同种异型抗原的热灭活感染TB的细胞，TB分枝杆菌，或其碎片。本发明另一种方法提供了治疗TB感染的方法，包括对需要其的哺乳动物/人施用有效量的口服组合物，所述口服组合物包含伴有同种异型抗原的热灭活感染TB的细胞，TB分枝杆菌，或其碎片。本发明也提供了生产用于治疗或预防TB细菌引起感染的口服疫苗的方法，包括热灭活源于感染TB动物的组织，TB细菌，或其片段，以及配制进有金属盐的口服组合物。

发明详述

对非感染宿主施用疫苗被称为“预防疫苗接种”，而对已感染宿主施用被称为“治疗疫苗接种”。术语“预防”包括在疾病或病症发生前试图中止其出现。术语“治疗”包括试图缓解受折磨受试者的疾病或临床状况。

在实验过程中发现当结核分枝杆菌，如在三分之一健康人血液中发现的结核分枝杆菌，被配制进片剂中时，当其施用给有结核的个体或作为预防感染的方式时，这样的制品获得了导致更有利临床结果的生物活性。制造这样制剂的步骤简单且直接。步骤之一是所谓的水解，其可以容易的通过按优选水解方式酸处理来完成。pH范围优选低于6并更优选介于0.5和5.5，更优选介于1和4，更优选介于1.0和3.0，并甚至更优选介于1.0和2.0。尽管这些范围被给作最佳范围，其并不阻碍本领域技术人员确定其他范围，这仍然在本发明范围内。水解的抗原，如蛋白的比例，占未水解的天然抗原重量的至少10％，优选至少20％，优选至少30％，优选至少40％，优选至少50％，优选至少60％，优选至少70％，优选至少80％，且可以是至少90％。100％水解的含义是水解反应后所有蛋白被水解成游离氨基酸，没有任何较大残留物，如肽残留的情况。

水解持续时间可以是5分钟到数小时间的任意时间，更优选其在10分钟到5小时之间，甚至更优选在20分钟到3小时之间。持续时间可以是更短的小时数，其由本领域技术人员熟悉的常规水解条件下简单试验确定。因此水解持续时间可以是30分钟，1小时，1.5小时，2小时，2.5小时，或3小时，或中间时间。

用于水解的酸可以是，但不限于，无机酸，如盐酸，氢溴酸，硫酸，硝酸，碳酸，磷酸等。有机酸的例子包括但不限于，例如，醋酸，柠檬酸，丙酸，乙醇酸，丙酮酸，草酸，苹果酸，丙二酸，丁二酸/琥珀酸，马来酸，富马酸/延胡索酸，酒石酸，苯甲酸，肉桂酸，苦杏仁酸，甲磺酸，乙磺酸，水杨酸，对甲苯磺酸等。

结核抗原来源不一定需要来自血液或血液衍生物如血浆或血清。痰或其他体液像尿液，胃肠分泌物，组织或肿瘤的液体，滑液，唾液，痰，囊液，羊水，脑脊液，腹腔积液，肺灌洗液，精液，淋巴液，泪液，汗液，和前列腺液可以用作结核抗原来源。这些液体可能包含白细胞，巨噬细胞或同样有利的其他细胞。不限于液体，固体组织如肺，肝，胰腺，骨骼肌，心，肾，脑，骨髓，肿瘤组织，皮肤，髓鞘，胶原，粪便和其他组织也可以使用。

全血，或血清或血浆，或其中存有分枝杆菌病原细胞的培养液，或重组获得的包含分枝杆菌的抗原优选用酸或碱处理。细胞系，例如像HeLa，同样可以被用于培养分枝杆菌。本领域技术人员可以使用其他水解剂像酶或去垢剂。水解的样品被合并或来自一个个体，或作为独立的批次保存。

在一个实施方式中当组合物仍然在液体溶液中及进行水解过程时，水解产物可以用金属盐或用形成盐的碱金属氢氧化物溶液沉淀。该步骤有效中止水解，因为抗原被埋入或嵌入固体物质基质并不能与水解剂反应。沉淀可以与水解同时进行，或在水解步骤后开始，依据最终产品的计划用途而定。例如，抗原和同种异型抗原组成的水溶液，优选约90％到约20％的蛋白，更优选约80％到约40％的蛋白溶液，使用酸处理，直到pH值为约1到约6，优选约1到约4，更优选约1到约2。低速搅拌溶液，优选在约10到约500rpm，更优选约30到约300，甚至更优选约60到约200rmp，约60分钟到约120分钟，优选约45到约80分钟，更优选约30到约60分钟。金属盐随后被加入搅拌中的溶液以产生凝固为固体团的浆。冲洗该团约1分钟到约60分钟，优选约5到约45分钟，更优选约10到约30分钟，随后在烤箱中在约56到约200℃，优选在约70到约150℃，更优选在约80到约140℃，更优选在约100到约120℃加热干燥约1小时到约72小时，优选约3到约48小时，更优选约5到约12小时。干燥的固体团随后被弄碎成粉末。

开始沉淀并在该步骤后加入水解剂同样有利。在另一个实施方式中金属盐在水解之前存在，蛋白在存在所述金属盐的情况下被水解，同时或伴随沉淀。将活性成分如抗原与同种异型抗原，或没有同种异型抗原的单独抗原，或没有抗原的单独同种异型抗原嵌入工艺的代表性步骤可以包括将同种异型抗原与金属盐溶液接触以产生浆，并通过将其与酸接触使之水解，以使混合物硬化并转变为固相或固体状态形式——也被知为固体物质凝固的过程。这种固体形式随后被弄碎成嵌入在活性成分中的粉末颗粒。这些步骤的顺序可以被很容易的提前确定，并可以无过度实验的实施，只要临床研究确定有活性成分的终产品临床有效。

水解的分枝杆菌抗原和同种异型抗原可以被嵌入盐中，包括但不限于：锂，铍，钠，硅，镁，铝，铝，钾，钙，钛，钒，铬，锰，钴，镍，铜，锌，砷，锆，钼，银，镉，锑，钡，锇，铂，或金。最适合的可溶盐包括氯化钠，氯化钾，氯化钙或氯化镁。代表性金属例如镁的盐的例子是硼化铝镁，醋酸钙镁，磷酸二镁，镁加铝，铝化镁，天冬氨酸镁，苯甲酸镁，溴化镁，碳酸镁，氯化镁，六水合氯化镁，柠檬酸镁，二硼化镁，二谷氨酸镁，重铀酸镁，氟化镁，葡萄糖酸镁，六水合镁，氢化镁，氢氧化镁，碘化镁，乳酸镁，乙酰丙酸镁，硝酸镁，氮化镁，乳清酸镁，氧化镁，氯氧化镁，含氧硫酸镁，高氯酸镁，过氧化镁，磷酸镁，吡咯烷酮酸镁，硅化镁，硬脂酸镁，硫酸镁，硫化镁，亚硫酸镁，三硅酸镁，磷酸一镁，柠檬酸三镁等。

在本发明进一步的方面，两种或更多金属可以被同时使用，例如氯化钙和氯化镁可以以各种可接受的比例混合，水解抗原嵌入其中。本组合物与现有技术中有主要吸附到免疫佐剂如氢氧化铝表面的抗原的组合物区别是本抗原被稳固的嵌入基质中，使其物理结构甚至在一般不利的条件中即较长时间的高温中，能保持完整。

众所周知暴露于高温，例如在56℃或更高加热，像80℃一小时或更长可用于破坏偶然的病原体，但不能用于制备疫苗。然而，令人惊讶的是，本组合物，当暴露于高温时没有失去其抗原性并显示出阳性临床好处。因此，本组合物可以被安全的使用，因为可能存在于组合物中的潜在感染病毒被暴露于高温1小时或更长有效杀灭。热处理的优势，尽管从消除感染性病毒的立场明显，是从保存抗原性的立场根本不明显——与本领域流行的共识相反的观察结果。

本组合物随后与片剂赋形剂组合。赋形剂通常被视为加入活性成分中提供体积的惰性物质，例如在片剂中。这可以是任何下面的成分，或相似性质的化合物：粘合剂如微晶纤维素，树胶或明胶；赋形剂如淀粉或乳糖，崩解剂如褐藻酸或玉米淀粉；润滑剂，如硬脂酸镁；助流剂如胶体二氧化硅；甜味剂如蔗糖或糖精；或风味剂如薄荷或其他一些调味剂。与赋形剂混合通过药剂专家熟知的湿式或干式造粒工艺进行，得到的混合物被压成片剂。对压缩有影响的赋形剂的各种性质，如水分含量，颗粒大小和分布，多态性，无定形性，晶体习性，水化状态，混合物的润滑剂和粘合剂水平在从业者常规知识内。压片速度和压片的机械方面如冲头/模具的选择，压片机器可以由技工无过度实验选择。此外，药剂可以含有改变其物理形式的其他各种材料，如糖，虫胶，或其他肠道剂包衣。片剂可以被主要溶于肠液，但基本不溶于胃液的肠道包衣材料覆盖。优选肠道包衣材料选自商业现有的，尽管新材料可以由有实践技能的技工选择。

优选的药剂形式是口服固体剂型如片剂或丸剂。而且，本发明描述的药物组合物可以被配制进任何合适的剂型中，包括但不限于，口服水分散体，口服水悬浮液，气雾剂，控释剂，速融剂，泡腾剂，自乳化分散体，固体溶液，脂质体分散体，冻干剂，胶囊，粉剂，延迟释放剂，立即释放剂，调释剂，延长释放剂，脉冲释放剂，复微粒剂，混合立即释放剂，控释剂等。

在本发明其他实施方式中，片剂中活性成分，即通过固体剂型如片剂或丸剂施用给受试者的有同种异型抗原的抗原的量，为本领域已知的达到有需要的人或动物治疗有效浓度的药物。例如，一种或多种活性成分的量可以从约0.0001微克到约1克。在其他实施方式中，活性成分的量可以从约0.001微克到约100毫克。在其他实施方式中，活性成分的量优选可以从约0.01微克到约10000微克，从约0.5微克到约1000微克或从约1微克到约500微克。在另一个实施方式中，药剂以固体剂型施用，总蛋白浓度约10微克到约500微克。在另一个实施方式中，活性成分药剂以固体剂型施用，浓度约1-100微克。在其他实施方式中活性成分的量基于组合物总重从约0.00001％到约30％，优选量介于约0.001％到20％，优选量介于约0.01％到10％，优选量介于约0.1％到5％。含量也可以依据计划的用途改变。做治疗用途的含量可以比计划做预防用途的组合物含量高约一个数量级。例如，如果在治疗组合物中分枝杆菌抗原量是60微克，那在预防形式中，剂量可以减至5或10微克。然而，这不是绝对的要求。这些以及其他关于有效剂量的含义目的不是限制而是仅以例子的方式提供。“治疗有效”的活性成分的准确量通过标准临床试验确定，其中临床效果通过本领域技术人员熟知的方式监测。

在优选的实施方式中，分枝杆菌抗原与同种异型抗原一起存在于组合物中，其可以用于预防或治疗应用来预防或积极治疗结核。在多数疫苗制造中，做相当大的努力纯化疫苗抗原。这是由于考虑注射时，疫苗抗原以外的抗原会引起不良免疫反应，有时还可能危及生命。因此，要求同种异型抗原与疫苗抗原一同存在于组合物中与本领域流行的一般知识相悖。分枝杆菌抗原和同种异性抗原比例由本领域已知技术确定。优选，理想的比例是自然发现的比例，例如全血中的，即分枝杆菌的量和其他宿主分子如血液中发现的总蛋白量的比例。这同样适用于抗原在增殖的细胞，像酵母细胞或如CHO细胞的哺乳动物细胞中重组表达的情况。当组合物成分在非人物种的细胞中生长但不计划用于人的情况时，同种异型抗原则被称为异种抗原，其为本发明的目的可以被称为同种异型抗原。尽管上面有关于优选比例的推理，可以故意增加同种异型抗原或抗原的量。在任何情况下，同种异型抗原的量不应太低以至于使得其被考虑为污染物，如在标准疫苗，如血浆中制得的乙型肝炎疫苗中所发现的。尽管从合并血浆中制得的乙型肝炎疫苗中污染血浆蛋白，即同种异型抗原的量依批次或制造商而改变，其通常低于1％。在甲型肝炎疫苗情况下，WHO建议污染清蛋白的量低于50纳克每剂。因此，这些要求将本组合物与之前本领域中的经典疫苗组合物区分开，因为本发明中，各种同种异型抗原分子和抗原的比例总是高于1∶1，优选高于10∶1，理想的高于100∶1，且当清蛋白被用于计量同种异体材料的量时总是超过50纳克/克。按计划这里需要多于一种类型的同种异型抗原。优选需要尽可能的更广泛多样性。这些组合物，特别是口服输送形式中的，可以用于需要其的宿主，如人宿主或其他需要其的物种。

在某些实施方式中，施用后药剂按约3小时到约24小时间隔提供治疗有效量的组合物，可以是，例如根据需要的一天一次，一天两次(b.i.d.)，或一天三次(t.i.d.)施用。优选一或两片每天的简单用药计划。施用可以是单次的片剂施用，更优选至少一周上至一月至一年的重复施用，或如果认为必要进行多年。1-3个月后治疗可以被停止并在中断一个月后再次重复，尽管在某些患者中3或6个月长间隔的重复治疗是不必要的。在某些情况下，优选停止一年随后再重复。在某些个体中治疗根本不必重复，因为患者被治愈并不需要进一步的用药。

在本发明的另一个方面无免疫佐剂施用组合物。尽管这是施用的优选方式，本领域技术人员可以使用本领域已知的免疫佐剂施用组合物。免疫佐剂的例子包括但不限于细菌佐剂；细胞因子佐剂；植物衍生佐剂等。

本发明的组合物可以联合抗结核药物施用。本发明的组合物/疗法可以与任何其他生物活性物质联合使用如药学上有效的物质，包括，但不限于，抗炎药，镇痛剂，镇静剂，抗焦虑药，解痉药，抗抑郁药，抗精神病药，抗焦虑药，麻醉拮抗剂，抗帕金森剂，胆碱能激动剂，化疗药物，免疫抑制剂，抗病毒药物，抗微生物药如抗生素，食欲抑制剂，抗胆碱能剂，抗对称剂(antimetrics)，抗组胺剂，抗偏头疼剂，冠状动脉、脑或或外周血管舒张药，激素剂，避孕药，抗血栓药物，利尿剂，抗高血压药物，心血管药物，阿片类药物等。

本发明的其他特征和优势从下面提供的包含不同实施例的另外详细公开中显现。下面提供的实施例展示了用于实践本发明的不同成分和方法。实施例不限定要求的发明。基于现有的公开本领域技术人员可以识别并采用其他成分和方法来实践本发明，这也在本发明范围之内。

实施例

实施例1：

分析口服，治疗性肝炎疫苗2阶段研究结果，超过94.4％的有慢性丙型肝炎并伴有TB和HIV的患者在其痰液涂片中完全清除了杆菌(表1)。结果20名患者中的17名在治疗开始后一个月内出院。通过参数和非参数测试的统计分析显示该现象是具有高度显著性的。本发明的疫苗片每日一次经口服施用给20名患者一个月。每名加入研究的患者患有肝脏肿大和肝损伤指标升高，在研究结束时20名患者中19名(95％)改善。降低是高度显著的，ALT和总胆红素分别从172.1±34降低到18.2±28.2U/L(P＝5.0E-012)和从22.1±3.4降低到10.9±2.5μmol/L(P＝5.7E-009)。肝脏肿大从正常大小以上3.5±1.4降低到0.95±1.1cm(P＝2.9E-009)。由于患者在TB医院住院他们被使用标准抗TB疗法(ATT)治疗。令人惊讶的是，本发明的疫苗组合物显示出比期望的痰液转换率更高和更快；94.4％的涂片阳性患者一个月内变成阴性。TB相关的发热在均值/中值4.1/3天内消退；炎症指征如升高的红细胞沉降率和高白细胞计数回归正常，分别从32.3±11.4到9.9±6.4mm/h(P＝3.7E-008)和从14.3±3.9到4.7±1.4×10⁹L(P＝7.1E-010)。平均体重增加为7.7kg(P＝4.6E-007)并且血红蛋白水平从114±7.1增加到123.4±6.6g/L(P＝1.4E-007)。在任何时间都没有观察到有害事件。

表1使用TB药物结合疫苗治疗一个月的有HIV和TB共感染的HCV感染患者的基线和结果特征。

该发现之后进行了两个安慰剂对照临床研究。这些结果示于表2-5并明确显示要求的组合物确实可以更快和更有效的治愈TB，无论TB是否抗药或带HIV存在。

实施例2：

在包括55名患者的临床试验中，在疫苗和安慰剂组中仅有1名(3.7％)和3名(10.7％)的受试者有首诊的，药物敏感的TB；剩余的患者有再治疗的TB，MDR-TB，或HIV-TB。根据匹配年龄，性别，基线体重，和临床表现，患者被分为免疫治疗组(N＝27)和安慰剂组(N＝28)。一个月后，疫苗组27名患者中的26名(96.3％)变成痰液涂片阴性(P＜0.0000001)，然而安慰剂组28名中的7名(25％)转变(P＝0.005)。如高白细胞计数，红细胞沉降率的正常化和相比对照组更快的退热所示，本发明的疫苗组合物有助于TB相关炎症的下调。两组中的患者经历了同样显著的血红蛋白水平升高，在疫苗和安慰剂组中对应128.9±17.6对133.1±14.7g/L(P＝0.03)以及112.6±14对117±11.7g/L(P＝0.03)。28名接受安慰剂患者中的19名(67.9％)平均增加了1.07kg(59.1±10对60.1±10.4kg；P＝0.003)。相比，每个疫苗治疗的患者平均增加3.4kg(59.7±8对63.1±9kg；P＝5.7E-007)。疫苗组中所有患者临床症状改善，而28.6％的安慰剂患者报告了满意的结果(P＝0.007)。在任何时间都没有观察到归于疫苗的不良或副作用。

表2 接受联合ATT的疫苗一个月的TB患者的基线和结果特征

表3 接受联合ATT的安慰剂一个月的TB患者的基线和结果特征

实施例3：

在34名成人中进行的第3项研究中，有18例首诊(52.9％)，6例复发TB(17.6％)，和10例MDR-TB(29.4％)。免疫治疗组(N＝24；表4)和安慰剂组(N＝10；表5)除了在直接观察治疗(DOT)下施用的常规抗TB治疗(ATT)外接受每日一次疫苗或安慰剂片剂。疫苗接受者中肝脏肿大，总胆红素，红细胞沉降率，淋巴细胞和白细胞计数显著改善(P分别等于0.002；0.03；8.3E-007；2.8E-005；和0.002)，但安慰剂组中保持统计学不变(0.68；0.96；0.61；0.91；和0.43)。血红蛋白和ALT水平的变化在两治疗组中都不显著。所有疫苗治疗的患者中体重平均增加了3.5±1.8kg(P＝2.3E-009)，而10名安慰剂患者中的6名平均增加了0.9±0.9kg(P＝0.01)。在78.3％和0％的疫苗和安慰剂患者中(P＝0.009)观察到痰液涂片中的分枝杆菌清除。接受疫苗的有MDR-TB的受试者中转变率(87.5％)似乎高于首诊TB(61.5％)，但差异不显著(P＝0.62)。基线和治疗后的痰液杆菌负载评分(范围0-3)在疫苗组中显示了极显著的降低(从均值/中值2.2/3到0.3/0；P＝6E-010)，但在安慰剂组中没有(1.9/1.5对1.8/1；P＝0.34)。随访在任何时间也没有观察到不利效果或TB再发。因此本发明的疫苗作为TB化疗处置的免疫辅助是安全的，并有潜力缩短治疗持续时间。

表4 接受联合TB药物的疫苗30天的TB患者的基线和结果特征

本组使用的TB药物缩写如下：异烟肼(H)，利福平(R)，吡嗪酰胺(Z)，乙胺丁醇(E)，链霉素(S)，氧氟沙星(O)，阿米卡星(A)，卷曲霉素(C)，对氨基水杨酸(Pas)，Cs(环丝氨酸)，西司他丁(Ci)，加替沙星(G)，甲硝唑(F)，丙硫异烟胺(Pt)。

表5 接受联合TB药物的安慰剂30天的TB患者的基线和结果特征

本组使用的TB药物缩写如下：异烟肼(H)，利福平(R)，吡嗪酰胺(Z)，乙胺丁醇(E)，链霉素(S)，阿米卡星(A)，对氨基水杨酸(Pas)，丙硫异烟胺(Pt)，氧氟沙星(O)。

表4和表5中的发现支持之前的在TB患者中展示了有利结果的疫苗临床试验(表1-3)。这些研究报导了一系列有益效果包括更好的生活质量，体重增加，ATT相关肝毒性的逆转，炎症降低，更快的退热，和更高的痰液涂片结核分枝杆菌清除率。而且，辅助免疫治疗得到了比接受标准ATT治疗的人中短得多的治疗持续时间。炎症指标的正常化被认为在TB疾病过程中有有利效果。与安慰剂组的结果相反，疫苗接受者中，炎症的指标如升高的白细胞计数和延长的红细胞沉降率已经被显著降低。血象中的有利变化由疫苗接受者中的总淋巴细胞百分数升高支持，但在对照组中没有。被抑制的淋巴细胞计数和白细胞计数降低的恢复与阳性治疗结果相关。因此，淋巴细胞和白细胞相对和绝对数目的改变有望作为治疗反应的替代标志。

抗TB药物引起的肝毒性对治疗的患者有严重的不良后果，给治疗选择加上了局限。相比安慰剂方案，本组合物的加入显示降低了基线胆红素和ALT水平，以及异常的肝脏大小。由于这个原因联合ATT的疫苗使用可以合理的防止或逆转医源性肝损伤。

免疫治疗在逆转体重损失上显示了清楚的疗效。疫苗组和安慰剂组平均增加是3.5kg和0.9kg，这几乎与包括55名TB患者的可比较组安慰剂对照试验结果相同，即分别3.4kg(59.7±8对63.1±9kg；P＝5.7E-007)和1.07kg(59.1±10对60.1±10.4kg；P＝0.003)。相比之下，早先进行的包括20名有HIV-TB患者的开放标签试验中观察到的平均体重增加为7.7kg(P＝4.6E-007)。这几乎两倍的差异或许是由于所有这些患者有HIV感染——一种与恶化的消耗相关的状况。

痰液涂片从阳性到阴性的转变是抗TB干预效果主要指征。与ATT对照组相比，疫苗加速并显著增强了杆菌清除。安慰剂和疫苗接受者间结果的不同也显著。在之前的安慰剂对照研究中，在安慰剂组25％患者中观察到转换，而在这个试验中0％转换。

本疫苗显示安全并能够逆转ATT相关肝毒性。此外，如几个血液学和生化指标证明的，疫苗似乎降低了炎症。与常规ATT相比，体重增加和痰涂片转变率已显著增强。如获得的改善所证明，疫苗和ATT的组合可以缩短治疗持续时间。

实施例4：

预防用途。来自携带有潜伏或活动的结核分枝杆菌的供体的合并血液被整体水解，热灭活，嵌入金属盐基质并被制入固体形式片剂，其随后以与治疗用途中被证明有效的剂量相等的剂量被喂给瑞士小鼠。一个月后通过雾化吸入用野生型H37Rv分枝杆菌菌株攻击瑞士小鼠。分析显示接种疫苗的13只小鼠中12只没有发生TB感染未显示出任何可检测的杆菌。相反，对照组中所有未接种疫苗的小鼠显示了急性TB感染。如2×2费雪精确检验所验证，对照和接种疫苗组结果间的差异高度显著。因此，使用本疫苗接种小鼠引发导致预防TB感染的保护性免疫反应。当用重组酵母表达分枝杆菌抗原和同种异形抗原代替天然来源分枝杆菌喂给小鼠时得到了同样的结果。

本说明书中引用的所有出版物，专利，和专利申请被整体纳入作为参考，像每个单独的出版物或专利申请被具体的和单独的指出以纳入作为参考。

本发明相关领域的熟练技术人员显然了解，本发明可以以上面具体公开过的形式外的形式实施，而不背离本发明的精神和本质特征。上面描述的本发明特定实施方式因此应被考虑为展示用，而不是限制性的。本发明范围由附加的权利要求阐述，而不限于上面描述中包含的实施例。

Claims (4)

1.口服施用于需要其的宿主的片剂组合物，所述组合物由以下三种组分组成：(1)至少一种水解的且热灭活的非重组分枝杆菌(mycobacterium)抗原；(2)至少一种水解的且热灭活的非重组同种异型抗原，其源自与宿主相同物种的合并血液，和(3)氯化镁，其结合所述抗原和同种异型抗原，以使所述组合物的施用导致有利的预防或治疗结果。

2.权利要求1的组合物，其中所述至少一种分枝杆菌抗原源自BCG，结核分枝杆菌(M.tuberculosis)，鸟结核分枝杆菌(M.avium)，哈瓦那分枝杆菌(M.habana)，脓肿分枝杆菌(M.abscessus)，金色分枝杆菌(M.aurum)，牛分枝杆菌(M.bovis)，母牛分枝杆菌(M.vaccae)，非洲分枝杆菌(M.africanum)，龟分枝杆菌(M.chelonae)，偶然分枝杆菌(M.fortuitum)，fuerthensis分枝杆菌(M.fuerthensis)，胃分枝杆菌(M.gastri)，古地分枝杆菌(M.goodi)，戈登分支杆菌(M.gordonae)，免疫原分枝杆菌(M.immunogenum)，胞内分枝杆菌(M.intracellulare)，副结合分枝杆菌(M.paratuberculosis)，lufu分枝杆菌(M.lufu)，堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)，慢黄分枝杆菌(M.lentiflavum)，麻风分枝杆菌(M.leprae)，M.w，马德里分枝杆菌(M.mageritense)，玛尔摩分枝杆菌(M.malmoense)，海分枝杆菌(M.marinum)，马西里亚分枝杆菌(M.massiliense)，莫娜分枝杆菌(M.monacense)，产粘液分枝杆菌(M.mucogenicum)，新金分枝杆菌(M.neoaurum)，外来分枝杆菌(M.peregrinum)，草分枝杆菌(M.phlei)，猪分枝杆菌(M.porcinum)，腐败分枝杆菌(M.septicum)，猿分枝杆菌(M.simiae)，耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)，苏加分枝杆菌(M.szulgai)，土地分枝杆菌(M.terrae)，托斯卡纳分枝杆菌(M.tusciae)，不产色分枝杆菌(M.nonchromogenicum)，溃疡分枝杆菌(M.ulcerans)，龟型分枝杆菌(M.chelonei)，瘰疬分枝杆菌(M.scrofulaceum)，通俗分枝杆菌(M.triviale)，亚洲分枝杆菌(M.asciaticum)，微黄分枝杆菌(M.flavescens)，日内瓦分枝杆菌(M.genavense)，或蟾蜍分枝杆菌(M.xenopi)。

3.用于治疗TB的疫苗，所述疫苗由与氯化镁一起配制成口服丸剂的水解的、热灭活的非重组分枝杆菌抗原和多种水解的、热灭活的来源于血液的同种异型抗原组成，所述疫苗与常规的TB化疗一起使用，使得所述TB治疗的持续时间缩短至少2倍。

4.生产用于治疗或预防结核的口服组合物的方法，其包括将完整的分枝杆菌以及来源于合并血液的同种异型抗原水解和加热到120℃，用镁盐或钙盐沉淀所述组合物并配制入固体口服组合物。