DE3048699C2 - Immuntherapeutisches Mittel gegen Tumore, enthaltend als wirksame Komponente ein Lipopolysaccharid - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft das In den Patentansprüchen beschriebene, immuntherapeutische Mittel gegen Tumore. In der letzten Zelt wurden zahlreiche Versuche unternommen, wirksame Komponenten zur Hellung von Krebs aus dem Zellkörper verschiedener Bakterien und aus Bakterienprodukten zu extrahieren. Insbesondere wurde versucht, karzinostatlsche Mittel mit einer geringeren ToxlzltBt durch Extraktion von Bestandteilen mit einer karzlnostatlschen Wirksamkeit aus dem Zellkörper von Mykobakterlen zu extrahieren.

Darüber hinaus wurden verschiedene klinische Untersuchungen zur Hellung von Krebs unternommen, unter Verwendung von Komponenten des BCG-Zellkörpers oder des Zellkörpers anderer Mykobakterlen als Immuntherapeutische Mittel für verschiedene tierische Krebserkrankungen. Jedoch weist der BCG-Zellkörper neben wirksamen Komponenten Komponenten mit Nebeneffekten auf, und daher Ist die gesteigerte Verabreichung des Zellkörpers an sich sehr gefahrlich. Es besteht daher ein Bedürfnis nach der Entwicklung von Immuntherapeutischen Mitteln durch Entfernung von Bestandteilen, die zu Nebeneffekten führen, aus dem Zellkörper und durch selektive Extraktion der wirksamen Bestandteile allein oder durch Forderung der Wirksamkeit der Bestandteile durch verschiedene Behandlungen. So wurden eine Zellwandskeletlkomponente von BCG (offengelegte JP-Patentanmeldung 28 813/79), Muramyl-dlpeptld (DE-OS 27 28 324) und eine Glycollpld enthaltende langkettlge Fettsäure In wachsartiger Substanz D (offengelegten JP-Patentanmeldungen 3514/1978 und 28 830/1979)

entwickelt. .. . - - -

In der DE-AS 12 45 037 wird die Herstellung von proteinfreien Lipopolysaccharlden durch Extraktion von

■«ο Bacterium tuberculosis H)₇R, beschrieben, die jedoch Nukleinsäuren enthalten können. Die DE-AS 10 73 105 lehn die Herstellung und Reinigung von reinem Llpold durch Spaltung von Lipopolysaccharlden gramnegatlver Bakterien, bei denen es sich vorwiegend um Coll-Stamme handelt. Die GB-PS 20 15 876 beschreibt Bakterienextrakte aus Mycobacterlum-Mlkroorganlsmen, die Proteine und Nukleinsäuren enthalten. Ein Hinweis auf das anspruchsgemflße Immuntherapeutische Mittel findet sich In diesen Literaturstellen nicht.

Es hat sich gezeigt, daß das erfindungsgemäße Immuntherapeutische Mittel, das unter den anspruchsgemäßen Bedingungen durch Extraktion von Mycobacterium tuberculosis Stamm ATCC 31726 und Stamm ATCC 25618 erhalten wird, eine Antltumorwlrkung ohne Nebenwirkungen ergibt. Es hat sich auch gezeigt, daß bei der chemischen Modifizierung der In dem erflndungsgemflßen Immuntherapeutischen Mittel enthaltenen Arablnomannankomponente in der anspruchsgemflßen Welse, ein chemisch modifiziertes Lipoarabinomannan erhalten wird, das mit dem extrahierten und gereinigten Lipoarabinomannan aus dem Zellkörper In der Antitumorwlrksamkelt vergleichbar oder überlegen Ist und keine Nebenwirkung aufweist.

In den folgenden Beispielen und Versuchen werden das Immuntherapeutische Mittel gegen Tumore, das Verfahren zu dessen Herstellung und dessen therapeutischen Wirkungen genauer erläutert.

Beispiel)

In diesem Beispiel wird das Verfahren zur Extraktion des Lipopolysaccharide veranschaulicht.
1.1 Ein Sauton-Kulturmedlum wird mit Mycobacterium tuberculosis. Stamm Aoyama B, Inokuliert, und es wird eine aerobe Kultur wahrend 14 Tagen durchgeführt. Der Zellkörper wird durch Filtrieren gewonnen und mit kaltem Wasser gewaschen, und destilliertes Wasser wird zu dem Zellkörper gefügt, um den Zellkörper In Wasser zu dotieren. Die Zellkörpersuspension wird 120 Minuten auf 100° C erwirmi und filtriert, unter Erzielung einer wäßrigen Lösung des Zellkörperextrakts. Sullbsallcylsäure wird zu der Lösung gefügt, um die Proteinkomponente auszufallen, und die Lösung wird durch Zentrlfugenabschcldung getrennt. Die überstehende Flüssigkeit wird dlalyslert, unter Verwendung einer Dialysemembran, und die Innere (Interne) Flüssigkeit wird mit Äthylalkohol In einer Menge vom 9fachen des Volumens der Inneren Flüssigkeit vermischt, und das Gemisch wird durch Zentrifugenabscheidung getrennt, und das ausgefällte rohe Llpopolysaccharld wird gewonnen.

Das rohe Llpopolysaccharld wird In destilliertem Wasser gelöst und mit der gleichen Menge an Äthylalkohol vermischt, und das Gemisch wird durch Zentrifugenabscheidung getrennt. Die überstehende Flüssigkeit wird

konzentriert und durch Molekularsieb-Behandlung nach der »high performancett-Flüsslgkeltschromatographle gesiebt, unter Verwendung einer mit TSK Gel 4000 SW, TSK. Gel 3000 SW und TSK Gel 2000 SW, bei denen es sich jeweils um Handelsprodukte der Toyo Soda K.K. handelt, gepackten Säule, und es wird eine Fraktion mit dem Molekulargewicht von 10 000 bis 16 000 gesammelt. Die Fraktion wird dlalyslert und konzentriert und welter durch Afilnitätschromatographle unter Verwendung von Agaroseperlen-Concanavalin A (Handelsprodukt der E. Y. Laboratories) zur Erzielung eines gereinigten Llpopolysaccharids gereinigt.

1.2 Mycobacterium tuberculosis. Stamm Hi₇R, wird unter den gleichen Bedingungen, wie In Beispiel 1.1 beschrieben, kultiviert. Der gewonnene Zellkörper wird in gleicher Weise, wie Im Beispiel 1.1 beschrieben, unter Erzielung eines rohen Lipopolysaccharide behandelt, das nach den gleichen Methoden, wie Im Beispiel 1.1 zu einem gereinigten Llpopolysaccharid gereinigt wird. ">

Versuch 1

Im folgenden wird die Analyse der Monosaccharidbestandtelle des Llpopolysaccharids beschrieben.

1.1 Das Im Beispiel 1.1 erhaltene gereinigte Llpopolysaccturid wird mit Schwefelsäure hydrolysiert, mit Amberllte IR-45 (Hydroxylform) neutralisiert und durch Dünnschichtchromatographie Identifiziert. Arablnose, Mannose und Glucose (Arablnose : Mannose : Glucose = 6:4: Spuren) werden festgestellt. Das vorstehend durch Hydrolyse und Neutralisation erhaltene Produkt wird nach bekannten bzw. üblichen Methoden reduziert und acetyilert, und das resultierende Gemisch (Alditol acetat) wird gaschromatographisch bestimmt, unter Verwendung drete Arten von gepackten Säulen. Es bestätigt sich, daß das Gemisch aus 61% Arablnose, 38% Mannose und i% Glucose bestehi. Somit bestätigt sich, daß die Saccharidkompor.cr.ts dss Lipopclysaceharids Arablnomannan Ist.

1.2 Der Monosaccharldgehalt des In Beispiel 1.2 erhaltenen gereinigten Llpopolysaccharids wird In gleicher Welse, wie Im Versuch 1.1 beschrieben, analysiert. Als Ergebnis bestätigt sich, daß die raffinierte bzw. gereinigte Probe zu 56% aus Arabinose und 44% aus Mannose besteht. Somit bestätigt es sich, daß es sich bei der Saccharldkomponente dieses Lipopolysaccharide um Arablnomannan handelt.

Versuch 2

Im folgenden wird die Analyse der Saccharldkettenstruktur des Llpopolysaccharids beschrieben. -^w

2.1 Das im Beispiel 1.1 erhaltene gereinigte Llpopolysaccharid wird völlig nach der Hakomorl-Methode methyliert, und das methyllerte Llpopc'ysaccharld wird mit Schwefelsäure hydrolysiert, mit Amberllte IR-45 (Hydroxylform) neutralisiert und bekannten bzw. üblichen Methoden reduziert und acetyilert. Das resultierende, teilweise methyllerte Gemisch (AIdIH acetat) wird gaschromatographisch bestimmt, unter Verwendung von vier Arten gepackter Säulen und einer SCOT-KaplIIarsäule. Die festgestellten maximalen Werte (Peaks) werden « mit den Maximalwerten (Peaks) von teilweise methyllerten Standardaldltolacetaten, die getrennt synthetisiert wurden, verglichen, und die jeweiligen, teilweise methyllerten Saccharldbestandtelle werden Identifiziert und bestimmt. Darüber hinaus werden die jeweiligen Saccharldbestandtelle durch die jeweiligen Peaks durch GC-MS bestätigt und Identifiziert.

Die quantitative Beziehung des teilweise methyllerten Alditolacetats, bestimmt durch Gaschromatographie, *o und die angegebenen Bindungen sind In der Tabelle I aufgeführt.

2.2 Das Im Beispiel 1.2 erhaltene gereinigte Llpopolyscxcharld wird In gleicher Welse, wie im Versuch 2.1 beschrieben, behandelt. Die quantitative Beziehung des teilweise methyllerten Alditolacetats, bestimmt durch Gaschromatographie, und die angezeigten Bindungen sind In der Tabelle II aufgeführt.

Tabelle I Festgestelltes Saccharid Angezeigte Bindung

Verhältnis von 2-O-Methyl-Arabinose (= 1,0)

	2,3,5-Tri-O-methyl- D-arabinose	(Araf) 1 »	8,0
!0	2,3-Di-O-methyl- D-araöinose	—* 5 (Araf) 1 >	1,4
	3,5-Di-O-methyl- D-arabinose	—> 2 (Araf) 1 —>	1.0
Ii	2-O-Methyl-D- arabinose	H^(Ar3O 1—►	2,5
	2,3,4,6-Tetra-O- rnethyl-D-mannose	(Manp) 1 —*	1,2
20	3,4,0-Tri-O-methyl- D-mannose	—> 2 (Manp) I —>	1,4
	2J,4-Tri-O-methyl- D-mannose	—><5 (Manp) 1 —>	2,8
25	3,4-Di-O-methyl- D-mannose	\ I (Manp} 1 —>

% Anmerkungen	59,5%
6,2
41,0 7,2	40,5%
5,1 12,8
6,1 7,2
14,4

19.5

100,0

30

Tabelle II Festgestelltes Saccharid Angezeigte Bindung

Verhältnis von 2-O-Meihyl-Arabinose (= 1,0)

Anmerkungen

45

50

55

60

2,3,5-Tri-O-methyl- D-arabinose	(AraO 1 —►	0,9	3,0
2,3-Di-O-methyl- D-arabinose	—> 5 (AraO 1 —►	12,4	41,5
3,5-Di-O-methyl- D-arabinose	—► 2 (AraO 1 ►	2,3	7,7
2-O-Methyl-D- arabinose	ZZ j (Araf) 1 —-*	i,0	3,3
2,3,4,6-Tetra-O- msthyl-D- mannose	(Manp) 1 —»	2,8	9,4
3,4,6-Tri-O-methyl- D-mannose	—* 2 (Manp) 1 —»	2,7	9,0
2,3,4-Tri-O-methyI- D-mannose	> 6 (Manp) 1 —>	5,3	17,7
3,4'Di-O-methyl- D-mannose	* g (Manp) 1 —►	2,5	8,4
insgesamt		29,9	100,0
		Versuch 3

55,5%

44,5%

Im folgenden wird die Analyse der Fettsauren in den Llpopolysaccharlo beschrieben.

3.1 Zu 1 mg des Im Beispiel 1.1 erhaltenen gereinigten Llpopoly^accharlds werden 1 ml Methylalkohol, enthaltend 10 μg Methyllaurat als Innerer Standard und 3,3% Chlorwasserstoff gefügt, und das Gemisch wird durch Methanolyse In einem verschlossenen Rohr, das mit Stickstoffgas gefüllt Ist, zersetzt. Das resultierende Gemisch wird bei niedriger Temperatur konzentriert und In Methylcnchlorld gelost. Durch Gaschromatographie unter Anwendung von zwei Arten gefüllter SSulen werden die FettsBurcbestandtelle Identlflzlerl und bestimmt durch die Retentlor.szelt des Standard-FettsBurcmethybslers. Die Maximalwerte (Peaks) der jeweiligen FeUsäuremethylester werden durch GC-MS Identifiziert.

Die Ergebnisse der Identifizierung durch Gaschromatographie sind In der Tabelle Ui aufgeführt.

	Tabelle III	699	42,9	I erhalten wurde.	liriu Lu bestimme	x 10-" Mol	5
	Methyllaurat (innerer Standard)		330,9			x 10" Mol
	Methylmyristat	(100 Mg)	1,8	3.2 Das in Beispiel 1.2 erhaltene gereinigte Llpopolysaccharld wird In		X 10-" Mol
	Methylpalmitai	10,4 Mg	125,0	behandelt, um die Fettsaurebestandteiie zu identifizieren		X 10-" Mol
	Methylheptudecanoat	89,5 Mg	0,7	In der Tabelle IV gezeigt.		X 10-" Mol	10 '
	Methylstcarat	0,5Mg	41,0	x 10-" Mol
	Methyloleat	37,3 Mg	542	x 10" Mol
	Methylubereulostearat	0,2Mg	Die vorstehenden experimentellen Ergebnisse bestätigen, dall der Fettsäuregehalt	der Llpopolysaccarldprobe	15
	insgesamt	12,8 Mg	etwa 15% beträgt (150,7 μ% pro 1 mg Polysaccharide und es ergibt sich.	daß das Llpopolysaccacharld (durch-
	150.7 Mg	schnittliches Molekulargewicht 13 000), das In Beispiel 1	etwa 7,6 Fettsauren (1950 g-Äqulva-
		lent) enthält.
		glelcher Welse, wie In Beispiel 3.1	20
	Γι. LsiC luCr
30 48

Tabelle IV Methyllaurat (innerer Standard) (100 Mg) Methylmyrislat 6,6 Mg 27,2 x 10-" Mol " Methylpalmilat 39,6 Mg »46,4 x 10"" Mol Methylheptadecanoat 0,4 Mg 1,4 x 10-" Mol Methylsiearat 13,2 Mg 44.2 x 10"" Mol Methyliuberculoslearat 19,8 Mg 63,4 x IQ-" Mol

insgesamt 79,6 Mg 282,6 x 10"" Mi>!

Aus den vorstehenden experimentellen Ergebnissen Ist ersichtlich, daß der Fettsäuregehalt der Llpopolysaccharldprobe etwa 8* (79,6 \ig pro I mg Polysaccharld) beträgt, und es ergibt sich, daß das Llpopolysacchavld (mittleres Molekulargewicht 12 000), das Im Beispiel 1.2 erhalten wurde, etwa 3.9 Fettsäuren (1000 g-Äqulvaicnt) enihäii.

Versuch 4

Im folgenden wird die Analyse Fettsäuieblndungsstruktur In dem Llpopolysaccharld beschrieben. 4.1 Das Im Beispiel 1.1 erhaltene gereinigte Llpopolysaccharld wird mit Methylvlnyiather In Dimethylsulfoxld In Anwesenheit von p-Toluolsulfonsäure als Katalysator behandelt zur Methoxyäthyllerung freier Hydroxylgruppen. Die Fettsäuren werden durch Verselfen entfernt, und die Hydroxylgruppen, die freigesetzt wurden, werden nach der Hakomorl-Methode methyllert. Anschließend werden die methoxyäthylierten Gruppen durch -»5 Hydrolyse entfernt unter Anwendung einer Säure, die Methylalkohol enthält, und das teilweise methyllerte Monosaccharldgemlsch wird durch Hydrolyse mit einer Säure erhalten. Das Gemisch wird reduziert und acetyllert nach bekannten bzw. üblichen Methoden, und die Acetate werden gaschromatographlsch analysiert, unter Anwendung dreier Arten von gepackten Säulen und von Xylit als Internem Standard, und die Identifizierung und Bestimmung werden unter Vergleich mit Standard-Aldltolacetaten von freien und teilweise methyllerten Monosaccharlden durchgeführt.

	30 48 699
Tabelle V
5-Methyl-D-arabinit	6,14%
2-Methyl-D-arabinit	2,48%
3-Methyl-D-arabinit	0,33%
D-Arabinit	50,27%
2-Methyl-D-mannit	0,02%
3- oder 4-Methyl-D-mannit	0,22%
6-Methyl-D-mannit	1,04%
D-Mannit	39,50%
insgesamt	100,0 %

59,22%

40,78%

(einschließlich 10,23% Monosaccharidfett- säureester)

Aus den vorstehenden Ergebnissen ergibt sich, daß etwa eine Fettsaure pro 10 Moleküle der Monosaccharldbestandtelle gebunden Ist, und die meisten BindungS3teiien, die 5-Steiiungen der ArabinOsccirmeiien und der Rest, die 2-Stellungen der Arablnoseelnhclten, die 6-Stellungen der Mannoseelnhelten und andere Stellungen sind.

Aus den In den Versuchen 1.1, 2.1, 3.1 und 4.1 erhaltenen Ergebnissen, laßt sich schließen, daß das Im Beispiel 1.1 erhaltene Llpopolysaccharld ein Llpopolysaccharld mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 13 000 Ist, das aus Arablnomannan mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 11 000 besteht, zusammengesetzt aus etwa 47 Arablnoseelnheiten und etwa 30 Mannoseelnhelten und etwa 8 Fettsäuren mit 14 bis 19 Kohlenstoffatomen (Palmltlnsäure In der Hauptsache), die an das Arablnomannan gebunden sind.
4.2 Das Im Beispiel 1.2 erhaltene gereinigte Llpopolysaccharld wird In gleicher Welse, wie Im Beispiel 4.1 behandelt. Die Maximalwerte (Peaks) des resultierenden teilweise methyllerten Aldltolacetats sind In der Tabelle VI Identifiziert.

Tabelle Vl

5-Methyl-D-arabinit	3,29%
2-Methyl-D-arabinit	1,60%
3-Methyl-D-arabinit	0,03%
D-Arabinit	50,57%
2-Methyl-D-mannit	0,01%
3- oder 4-Methyl-D-mannit	0,03%
6-Methyl-D-mannit	1,00%
D-Mannit	43,47%
insgesamt	100,0 %

55,49%

44,51%

(einschließlich 5,96% Monosaccharid fettsäureester)

Aus den vorstehenden Ergebnissen ISBt sich schließen, daß etwa eine Fettsaure pro 16 Moleküle der Monosaccharldbestandtelle gebunden Ist, und die meisten der Blndungsstellen, die 5- und 2-Stellungen der Arablnoseeinhelten und die 6-Stellungen der Mannoseelnhelten Und.

Aus den In den Versuchen 1.2, 2.2, 3.2 und 4.2 erhaltenen Ergebnissen ISBt sich schließen, daß das im Beispiel !.2 erhaltene Llpopolysaccharld ein Llpopolysaccharld mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 12 000 Ist, das aus Arablnomannan mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa Il 000 besteht, das zusammengesetzt ist aus etwa 42 Arablnoseelnheiten und etwa 34 Mannoseelnhelten und im Durchschnitt 4 oder 5 Fettsauren mit 14-19 Kohlenstoffatomen (Paimltlnsaure In der Hauptsache), die an das Arablnomannan gebunden sind.

Ein Verfahren zur Herstellung eines Lipopolysaccharlds durch Binden einer Fettsaure an ein Polysaccharld Ist bekannt. Erfindungsgemäß kann Llpoarablnomannan, das wirksamer zur Immuntherapie von Tumoren geeignet 1st, hergestellt werden durch Binden einer geeigneten Fettsäure an lipldfreles Arablnomannan oder Arablnomannan mit niedrigen Llpldgehalt, nach dem bekannten bzw. üblichen Verfahren.

Beispiel 2

Dieses Beispiel veranschaulicht das Verfahren zur Herstellung von Lipcarabincrnannan aus llpidfrelem Arablnomannan.
2.1 Der Im Beispiel 1.1 verwendete Zellkörper wird alkalisch extrahiert, und man erhall Arablnomannan mit

einem Molekulargewicht von etwa 8500 bis 14 000 durch Siebbehandlung In gleicher Welse, wie Im Beispiel 1.1 beschrieben. Das so erhaltene Arablnomannan wird welter gereinigt bzw. raffiniert durch Afflnllätschromatographle und getrocknet und 10 mg des getrockneten Arablnomannans werden mit 10 mg Palmltlnsäureanhydrid bei 50° C während 20 h In Ν,Ν-Dlmelhylformamld-Pyrldln umgesetzt. Äthyläther wird zu dem Reaktionsgemisch gefügt, und die Ausfällung wird durch Zentrifugenabscheidung gewonnen, mit Äther gewaschen und getrocknet, unter Erzielung von 11 mg Llpoarablnomannan.

Als Analysenergebnis bestätigt sich, daß die Saccharldkettenstruktur des vorstehend erhaltenen Llpoarablnomannans Im wesentlichen die gleiche Ist, wie die In den Beispielen 1.1 und 2.1 festgestellte. Insbesondere hat sich bestätigt, daß die Palmltlnsäure hauptsächlich an die 5-Stellung der Arablnoseelnhelt In der Arablnomannankette In einer Menge von etwa 9,8 Gew.-* gebunden Ist und das mittlere Molekulargewicht etwa 12 500 beträgt.

2.2 Der Im Beispiel 1.2 verwendete Zellkörper wird alkalisch extrahiert, und man erhalt Arablnomannan, das In der gleichen Welse, wie Im Beispiel 2.1 beschrieben, raffiniert wird. 10 mg des getrockneten Arablnomannans werden mit 8 mg Palmltoylchlorld bei .17° C während 16 h In Ν,Ν-Dlmethylformamld-Pyrldln umgesetzt. Äthanol wird zu dem Reaktlonsgemlsch gefügt, und die Ausfällung wird durch Zentrifugenabscheidung gewonnen, mit Äthylälher gewaschen und getrocknet, unter Erzielung von IO mg Llpoarablnomannan.

Als Analysenergebnis bestätigte sich, daH die Saccharldkettenstruktur des vorstehend erhaltenen Llpoarablnomannans Im wesentlichen die gleiche Ist, wie sie In den Versuchen 1.1 und 2.2 festgestellt wurde. Insbesondere hat sich bestätigt, daß Palmltlnsäure hauptsächlich an die 5-Stellung der Arablnoseelnhelt In der Arablnomannankette gebunden Ist, In einer Menge von etwa 7,6 Gcw.-sm, und dall das Molekulargewicht etwa Ί2ϋϋΰ betrügt.

Beispiel 3

Dieses Beispiel veranschaulicht das Verfahren zur Herstellung von Llpoarablnomannan aus Arablnomannan 2' mit geringem Llpldgchalt.

3.1 5 mg Arablnomannan mit einem Fettsäuregehalt von etwa 3%, das In gleicher Welse, wie Im Beispiel 1.1 beschrieben, erhalten wurde, werden einer Ultraschallbehandlung mit 10 mg Palmltoylchlorld In Pyrldln unterzogen, und die Reaktion wird bei 37° C wahrend 18 h durchgeführt. Zu dem Reaktlonsgemlsch fügt man Äthylalkohol, und die Ausfüllung wird gesammelt, mit Äthyläther gewaschen und getrocknet unter Erzielung von 4,3 ·"> mg Llpoarablnomannan.

Als Analysenergebnis bestätigte sich, daß die Saccharldkettenstruktur Im wesentlichen die gleiche wie In den Beispielen 1.1 und 2.1 festgestellt Ist. Insbesondere bestätigte sich, daß Palmltlnsäure hauptsächlich an die 5-Stellung der Arablnoseelnhelt und die 6-Stellung der Mannoseelnhelt In der Arablnomannankette In einer Menge von etwa 28 Gew.-% gebunden Ist und das mittlere Molekulargewicht etwa 14 000 betrügt. ^}i

3.2 5 mg Arablnomannan mit einem Fettsäuregehalt von etwa 2%, die In gleicher Welse, wie Im Beispiel 1.2 beschrieben, erhalten wurden, werden einer Ultraschallbehandlung mit 8 mg Palmltoylchlorld In Pyrldln unterzogen, und die Reaktion wird 18 h bei 37° C durchgeführt. Zu dem Reaktionsgemisch wird Äthyiaikohoi gefügt, und die Ausfällung wird gewonnen, mit Äthyläther gewaschen und getrocknet unter Erzielung von 3,8 g Llpoarablnomannan.

Das Analysenergebnis bestätigte, daß die Saccharldkettenstruklur Im wesentlichen die gleiche wie In den Versuchen 1.2 und 2.2 testgestellt 1st. Insbesondere bestätigte es sich, daß die Palmltlnsäure hauptsächlich an die 5-Stellung der Arablnoseelnhelt und die 6-Stellung der Mannoseelnhelt In der Arablnomannankette In einer Menge von etwa 18 Gew.-% gebunden und das durchschnittliche Molekulargewicht etwa 13 500 beträgt.

Anstelle der Palmltlnsäure kann In den Beispielen 2 oder 3 auch Stearinsäure verwendet werden.

Versuch 5

Bei diesem Versuch wird die Antltumorwlrksamkelt untersucht.

Zellen (1 χ 10') des Sarcoma- 180-Tumors werden ddY-Mäusen (weiblich, 10 Wochen alt), die mit BCG senslblllsiert wurden, subkutan transplantierl. Vom nächsten Tag an wird Llpoarablnomannan, angegeben in der Tabelle VII, das steril In einer physiologischen Salzlösung gelost Ist, hypodermisch an zwei Mäusegruppen (jede' aus 8 Mäusen) in einer Menge von 0,02 μg bis 2,0 μg pro Maus pro Tag während achtmal insgesamt verabreicht. Nach 30 Tagen nach der Transplantation der Tumorzellen werden die Testtiere getötet, und die Tumorgewichte werden gemessen. Die Antltumorwlrksamkelt jedes Lipoarablnomannans wird auf der Basis des gemessenen Tumorgewichts bewertet.

Die erhaltenen Ergebnisse sind In der Tabelle VIl aufgeführt. Tabelle VII

Gruppe

verabreichte
Menge ^g)

Tumorgewicht ± S.E. (g)

Kontrolle	—
ArMn-l·')	0,02
ArMn- ]■>)	0,2
ArMn-I")	2,0
Kontrolle	-
ArMn-2b)	0,02
ArMn-2b)	0,2
ArMn-2h)	2,0
Kontrolle	-
ArMn-3c)	0,02
ArMn-3c)	0,2
ArMn-3l)	2,0
Kontrolle	-
ArMn-4d)	0,02
ArMn-4ü)	0,2
ArMn-4ü)	2,0
Kontrolle	-
ArMn-5c)	0.02
ArMn-5e)	0.2
ArMn-5e)	2,0
Kontrolle	-
ArMn-6r)	0.02
ArMn-6r)	0,2
ArMn-öO	2.0
Kontrolle	-
ArMn-7«)	0,02
ArMn-7»)	0,2
ArMn-7*)	2,0
Anmerkung:

2,71 ±0,32 2,54 ± 0,43 1,78 ±0,26*)

2.82 ± 0,40 1,90 ±0,52

1.62 ±0,24**) 1,74 ±0,25**)

2,53 ± 0,33 1,87 ±0,40

1.53 ±0,27*)

1.54 ±0,27*)

2,85 ±0,21 1,52 ±0,82**) 1,40 ±0,15**)

1.83 ±0,17**)

3,24 ± 0,46 2,21 ±0,22**)

1.63 ±0,21**) 1,77 ±0,24**)

3,12 ±0,32 1.95 ±0,19**) 1,51 ±0,14**) 1,80 ± 0,20**)

3,35 ± 0,34 2,34 ± 0,22**) 1,49 ±0,36**) 1,67 ±0,34**)

100
93.7 65,7 62,7

100
67.4 57,4 61,7

100
73,9 60,5 60,9

100
53,3 49,1 64,2

100
68,2 50,3 54,6

100
62,5 48,4 57,7

100
69,9 44,8 49,9

') Lipoarabinomannan. extrahiert und gereinigt nach dem im Beispiel 1.1 beschriebenen Verfahren (l'ell-5'· Säuregehalt - 3%).

^b) Lipoarabinomannan, extrahiert und gereinigt wie im Beispiel 1.1 (l^;cllsäurcgehalt *- 15%).

^c) Lipoarabinomannan, erhalten durch Binden von Palmitinsäurc an lipidfrcics Arabinomannan über eine Esterbindung im Beispiel 2.1

(Palmitinsäuregehalt = 10%).

^d) Lipoarabinomannan. gebildet durch Binden vnn Palmitinsäurc an Lipoarabinomannan mit niedrigem 55 Lipidgehalt über eine Esterbindung im Beispiel 3.1 (Palmitinsäuregehalt - 28%).

^e) Lipoarabinomannan, extrahiert und gereinigt wie im Beispiel 1.2 (Fettsäuregehalt - 8%).

^r) Lipoarabinomannan, gebildet durch Binden von Palmitinsäurc an lipidfreies Arahinomannan durch

eine Esterbindung im Beispiel 2.2 (Palmitinsäuregehalt - 7.6%). *) Lipoarabinomannan, gebildet durch Binden von Palmilinsäurc an Lipoarabinomannan mit niedrigem

Lipidgehalt, durch eine Esterbindung im Beispiel 3.2 (Palmilinsäurcgehalt = 18%).

j^lj 77C"(%): Verhältnis des Tumorgewichts der lipopolysaccharidvcrabrcichten Gruppe zum Tumorgewicht der

Konlrollgruppe

·) P < 0.05
·*) P < 0.01

f>5 Wie aus den In der Tabelle VII gezeigten Ergebnissen ersichtlich Ist, weisen die crflndungsgemäßen Lipopolysaccharide, d. h. sowohl das Llpqaramlnomannan, das durch Binden von Fettsäuren an lipidfreies Arabinomannan oder Areblnomannan mit geringem Lipidgehalt erhalten wurde, als auch das aus dem Zellkörper extrahierte und gereinigte Lipoarabinomannan eine große Inhlbllorlschc Wirksamkeit gegenüber dem Wachstum des

Tumors bei geringer verabreichter Menge auf. Das Ardbinomannan mit einem größeren Feiisäuregehali weist eine besonders hohe Antltumorwlrksamkelt IxI geringerer verabreichter Menge auf. Wird das erfindungsgemäße Llpopolysacchartd dem menschlichen Körper als ein immun-therapeutisches Mittel gegen Tumore verabreicht, so wird es zu einer hypodermlschen Injektion formuliert. Ein Beispiel für ein Präparat für eine hypodermisch Injektion Ist Im folgenden angegeben. ^s

Beispiel 4

! mg des erfindungsgemäßen Lipopolysaccharide (erhalten In den Beispielen 1, 2 oder 3) wird In einer geeigneten Menge einer physiologischen Salzlösung zur Injektion unter Bildung von 100 ml einer Lösung gelöst. Die Lösung wird zu einer hypodermen Injektion formuliert, die 10 ug/ml des Lipopolysaccharlds enthält, wobei man sich üblicher Verfahrensweisen bedient. Die Injektion wird hypodermisch 1- bis 3mal pro Woche (10 bis 30 μg als Llpopolysaccharid) verabreicht.

Ein Zellkörper des Tuberkelbaclllus oder ein Extrakt davon, dessen Antltumorwlrksamkelt bewertet wurden. Ist ein Gemisch komplizierter chemischer Komponenten. Im Gegensatz hierzu handelt es sich bei dem erfln- ί> dungsgemäßen Llpoarabinomannan um ein Llpopolysacchartd mit einer definierten chemischen Zusammensetzung, das Isolllert und gereinigt wird. Darüber hinaus 1st das erfindungsgemäße Llpopolysaccharid dadurch gekennzeichnet daß die Nebenwirkungen des Zellkörpers ausgeräumt werden können. Dementsprechend kann man darauf schließen, daß das erflndungsgemaße Lipopolysaccharid ein wertvolles Immuntherapeutisches" Mittel gegen Tumore sein kann.

Proben von den erflndungsgemäß verwendeten Stämmen Mycobacterium tuberculosis. Stamm Aoyama B und Mycobacteilumi tuberculosis. Stamm H₁₇R, sind am Anmeldetag allgemein zugänglich gewesen. Sie sind bei der American Type; Culture Collection unter den Nos. ATCC 31726 und ATCC 25618 hinterlegt.

Claims (2)

Patentansprüche:

1. Immuntherapeutisches MIttel gegen Tumore, enthaltend als wirksame Komponente ein Llpopolysaccharld, das Arabinomannan als Polysaccharld mit einer Monosaccacharldzusammensetzung von 30 bis 74 Gew-% Arablnose, 20 bis 50 Gew.-% Mannose, 0 bis 10 Gew.-« Glucose und 0 bis 13 Gew.-« Galactose aufweist und an das Arabinomannan durch Esterbindungen gebundene Fettsäuren, die Paimltinsaure, Stearinsaure, Tuberculosteartnsflure, Heptadecansäure, ölsäure und Llnolsflure sind mit einem Fettsauregehalt von 1 bis 28 Gew.-« Fettsäuren in dem Llpopolysaccharld enthält, wobei das Llpopolysaccharid erhältlich 1st durch Heißwasserextraktion der Zellkörper von aerob gezüchteten Kulturen von Mycobacterium tuberculosis

ίο Stamm ATCC 31726 und Stamm ATCC 2S618, mit anschließender Dsproteinlerung und Alkoholbehandlung des Extraktes, Fraktionierung des so erhaltenen rohen Lipopolysaccharides mit FlOsslgkeltschromatographle und Konzentration der Fraktion mit einem Molekulargewicht von 10000 bis 16000 mittels Affinitätschromatographie.

2. immuntherapeutisches Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Im Llpopolysaccharld enthaltene Fettsauregehalt von 1 bis 28 Gew.-% einstellbar 1st durch Einfahren von Fettsauren Insbesondere PaImItIn- und Stearinsaure Ober Esterbindungen In das Arabinomannan, das gegebenenfalls durch vorausgehende alkalische Extraktion des Zellkörpers von Mycobacterium tuberculosis Stamm ATCC 31726 und Stamm ATCC 25618 mit anschließender Reinigung und Konzentrieren gemäß Anspruch 1 erhalten ^:-;t