DE3048699C2 - Immuntherapeutisches Mittel gegen Tumore, enthaltend als wirksame Komponente ein Lipopolysaccharid - Google Patents
Immuntherapeutisches Mittel gegen Tumore, enthaltend als wirksame Komponente ein LipopolysaccharidInfo
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Description
Die Erfindung betrifft das In den Patentansprüchen beschriebene, immuntherapeutische Mittel gegen Tumore.
In der letzten Zelt wurden zahlreiche Versuche unternommen, wirksame Komponenten zur Hellung von
Krebs aus dem Zellkörper verschiedener Bakterien und aus Bakterienprodukten zu extrahieren. Insbesondere
wurde versucht, karzinostatlsche Mittel mit einer geringeren ToxlzltBt durch Extraktion von Bestandteilen mit
einer karzlnostatlschen Wirksamkeit aus dem Zellkörper von Mykobakterlen zu extrahieren.
Darüber hinaus wurden verschiedene klinische Untersuchungen zur Hellung von Krebs unternommen, unter
Verwendung von Komponenten des BCG-Zellkörpers oder des Zellkörpers anderer Mykobakterlen als Immuntherapeutische
Mittel für verschiedene tierische Krebserkrankungen. Jedoch weist der BCG-Zellkörper neben
wirksamen Komponenten Komponenten mit Nebeneffekten auf, und daher Ist die gesteigerte Verabreichung des
Zellkörpers an sich sehr gefahrlich. Es besteht daher ein Bedürfnis nach der Entwicklung von Immuntherapeutischen
Mitteln durch Entfernung von Bestandteilen, die zu Nebeneffekten führen, aus dem Zellkörper und durch
selektive Extraktion der wirksamen Bestandteile allein oder durch Forderung der Wirksamkeit der Bestandteile
durch verschiedene Behandlungen. So wurden eine Zellwandskeletlkomponente von BCG (offengelegte JP-Patentanmeldung
28 813/79), Muramyl-dlpeptld (DE-OS 27 28 324) und eine Glycollpld enthaltende langkettlge
Fettsäure In wachsartiger Substanz D (offengelegten JP-Patentanmeldungen 3514/1978 und 28 830/1979)
entwickelt. .. . - - -
■«ο Bacterium tuberculosis H)7R, beschrieben, die jedoch Nukleinsäuren enthalten können. Die DE-AS 10 73 105
lehn die Herstellung und Reinigung von reinem Llpold durch Spaltung von Lipopolysaccharlden gramnegatlver
Bakterien, bei denen es sich vorwiegend um Coll-Stamme handelt. Die GB-PS 20 15 876 beschreibt Bakterienextrakte
aus Mycobacterlum-Mlkroorganlsmen, die Proteine und Nukleinsäuren enthalten. Ein Hinweis auf das
anspruchsgemflße Immuntherapeutische Mittel findet sich In diesen Literaturstellen nicht.
Es hat sich gezeigt, daß das erfindungsgemäße Immuntherapeutische Mittel, das unter den anspruchsgemäßen
Bedingungen durch Extraktion von Mycobacterium tuberculosis Stamm ATCC 31726 und Stamm ATCC 25618
erhalten wird, eine Antltumorwlrkung ohne Nebenwirkungen ergibt. Es hat sich auch gezeigt, daß bei der
chemischen Modifizierung der In dem erflndungsgemflßen Immuntherapeutischen Mittel enthaltenen Arablnomannankomponente
in der anspruchsgemflßen Welse, ein chemisch modifiziertes Lipoarabinomannan erhalten
wird, das mit dem extrahierten und gereinigten Lipoarabinomannan aus dem Zellkörper In der Antitumorwlrksamkelt
vergleichbar oder überlegen Ist und keine Nebenwirkung aufweist.
In den folgenden Beispielen und Versuchen werden das Immuntherapeutische Mittel gegen Tumore, das
Verfahren zu dessen Herstellung und dessen therapeutischen Wirkungen genauer erläutert.
In diesem Beispiel wird das Verfahren zur Extraktion des Lipopolysaccharide veranschaulicht.
1.1 Ein Sauton-Kulturmedlum wird mit Mycobacterium tuberculosis. Stamm Aoyama B, Inokuliert, und es wird eine aerobe Kultur wahrend 14 Tagen durchgeführt. Der Zellkörper wird durch Filtrieren gewonnen und mit kaltem Wasser gewaschen, und destilliertes Wasser wird zu dem Zellkörper gefügt, um den Zellkörper In Wasser zu dotieren. Die Zellkörpersuspension wird 120 Minuten auf 100° C erwirmi und filtriert, unter Erzielung einer wäßrigen Lösung des Zellkörperextrakts. Sullbsallcylsäure wird zu der Lösung gefügt, um die Proteinkomponente auszufallen, und die Lösung wird durch Zentrlfugenabschcldung getrennt. Die überstehende Flüssigkeit wird dlalyslert, unter Verwendung einer Dialysemembran, und die Innere (Interne) Flüssigkeit wird mit Äthylalkohol In einer Menge vom 9fachen des Volumens der Inneren Flüssigkeit vermischt, und das Gemisch wird durch Zentrifugenabscheidung getrennt, und das ausgefällte rohe Llpopolysaccharld wird gewonnen.
1.1 Ein Sauton-Kulturmedlum wird mit Mycobacterium tuberculosis. Stamm Aoyama B, Inokuliert, und es wird eine aerobe Kultur wahrend 14 Tagen durchgeführt. Der Zellkörper wird durch Filtrieren gewonnen und mit kaltem Wasser gewaschen, und destilliertes Wasser wird zu dem Zellkörper gefügt, um den Zellkörper In Wasser zu dotieren. Die Zellkörpersuspension wird 120 Minuten auf 100° C erwirmi und filtriert, unter Erzielung einer wäßrigen Lösung des Zellkörperextrakts. Sullbsallcylsäure wird zu der Lösung gefügt, um die Proteinkomponente auszufallen, und die Lösung wird durch Zentrlfugenabschcldung getrennt. Die überstehende Flüssigkeit wird dlalyslert, unter Verwendung einer Dialysemembran, und die Innere (Interne) Flüssigkeit wird mit Äthylalkohol In einer Menge vom 9fachen des Volumens der Inneren Flüssigkeit vermischt, und das Gemisch wird durch Zentrifugenabscheidung getrennt, und das ausgefällte rohe Llpopolysaccharld wird gewonnen.
Das rohe Llpopolysaccharld wird In destilliertem Wasser gelöst und mit der gleichen Menge an Äthylalkohol
vermischt, und das Gemisch wird durch Zentrifugenabscheidung getrennt. Die überstehende Flüssigkeit wird
konzentriert und durch Molekularsieb-Behandlung nach der »high performancett-Flüsslgkeltschromatographle
gesiebt, unter Verwendung einer mit TSK Gel 4000 SW, TSK. Gel 3000 SW und TSK Gel 2000 SW, bei denen
es sich jeweils um Handelsprodukte der Toyo Soda K.K. handelt, gepackten Säule, und es wird eine Fraktion
mit dem Molekulargewicht von 10 000 bis 16 000 gesammelt. Die Fraktion wird dlalyslert und konzentriert und
welter durch Afilnitätschromatographle unter Verwendung von Agaroseperlen-Concanavalin A (Handelsprodukt
der E. Y. Laboratories) zur Erzielung eines gereinigten Llpopolysaccharids gereinigt.
1.2 Mycobacterium tuberculosis. Stamm Hi7R, wird unter den gleichen Bedingungen, wie In Beispiel 1.1
beschrieben, kultiviert. Der gewonnene Zellkörper wird in gleicher Weise, wie Im Beispiel 1.1 beschrieben, unter
Erzielung eines rohen Lipopolysaccharide behandelt, das nach den gleichen Methoden, wie Im Beispiel 1.1 zu
einem gereinigten Llpopolysaccharid gereinigt wird. ">
Versuch 1
1.1 Das Im Beispiel 1.1 erhaltene gereinigte Llpopolysaccturid wird mit Schwefelsäure hydrolysiert, mit
Amberllte IR-45 (Hydroxylform) neutralisiert und durch Dünnschichtchromatographie Identifiziert. Arablnose,
Mannose und Glucose (Arablnose : Mannose : Glucose = 6:4: Spuren) werden festgestellt. Das vorstehend
durch Hydrolyse und Neutralisation erhaltene Produkt wird nach bekannten bzw. üblichen Methoden reduziert
und acetyilert, und das resultierende Gemisch (Alditol acetat) wird gaschromatographisch bestimmt, unter
Verwendung drete Arten von gepackten Säulen. Es bestätigt sich, daß das Gemisch aus 61% Arablnose, 38%
Mannose und i% Glucose bestehi. Somit bestätigt sich, daß die Saccharidkompor.cr.ts dss Lipopclysaceharids
Arablnomannan Ist.
1.2 Der Monosaccharldgehalt des In Beispiel 1.2 erhaltenen gereinigten Llpopolysaccharids wird In gleicher
Welse, wie Im Versuch 1.1 beschrieben, analysiert. Als Ergebnis bestätigt sich, daß die raffinierte bzw. gereinigte
Probe zu 56% aus Arabinose und 44% aus Mannose besteht. Somit bestätigt es sich, daß es sich bei der
Saccharldkomponente dieses Lipopolysaccharide um Arablnomannan handelt.
Versuch 2
2.1 Das im Beispiel 1.1 erhaltene gereinigte Llpopolysaccharid wird völlig nach der Hakomorl-Methode methyliert,
und das methyllerte Llpopc'ysaccharld wird mit Schwefelsäure hydrolysiert, mit Amberllte IR-45
(Hydroxylform) neutralisiert und bekannten bzw. üblichen Methoden reduziert und acetyilert. Das resultierende,
teilweise methyllerte Gemisch (AIdIH acetat) wird gaschromatographisch bestimmt, unter Verwendung von
vier Arten gepackter Säulen und einer SCOT-KaplIIarsäule. Die festgestellten maximalen Werte (Peaks) werden «
mit den Maximalwerten (Peaks) von teilweise methyllerten Standardaldltolacetaten, die getrennt synthetisiert
wurden, verglichen, und die jeweiligen, teilweise methyllerten Saccharldbestandtelle werden Identifiziert und
bestimmt. Darüber hinaus werden die jeweiligen Saccharldbestandtelle durch die jeweiligen Peaks durch GC-MS
bestätigt und Identifiziert.
Die quantitative Beziehung des teilweise methyllerten Alditolacetats, bestimmt durch Gaschromatographie, *o
und die angegebenen Bindungen sind In der Tabelle I aufgeführt.
2.2 Das Im Beispiel 1.2 erhaltene gereinigte Llpopolyscxcharld wird In gleicher Welse, wie im Versuch 2.1
beschrieben, behandelt. Die quantitative Beziehung des teilweise methyllerten Alditolacetats, bestimmt durch
Gaschromatographie, und die angezeigten Bindungen sind In der Tabelle II aufgeführt.
Verhältnis von 2-O-Methyl-Arabinose (= 1,0)
| 2,3,5-Tri-O-methyl- D-arabinose |
(Araf) 1 » | 8,0 | |
| !0 | 2,3-Di-O-methyl- D-araöinose |
—* 5 (Araf) 1 > | 1,4 |
| 3,5-Di-O-methyl- D-arabinose |
—> 2 (Araf) 1 —> | 1.0 | |
| Ii | 2-O-Methyl-D- arabinose |
H^(Ar3O 1—► | 2,5 |
| 2,3,4,6-Tetra-O- rnethyl-D-mannose |
(Manp) 1 —* | 1,2 | |
| 20 | 3,4,0-Tri-O-methyl- D-mannose |
—> 2 (Manp) I —> | 1,4 |
| 2J,4-Tri-O-methyl- D-mannose |
—><5 (Manp) 1 —> | 2,8 | |
| 25 | 3,4-Di-O-methyl- D-mannose |
\ I (Manp} 1 —> | |
| % Anmerkungen | 59,5% |
| 6,2 | |
| 41,0 7,2 |
40,5% |
| 5,1 12,8 |
|
| 6,1 7,2 |
|
| 14,4 | |
19.5
100,0
30
Verhältnis von 2-O-Meihyl-Arabinose
(= 1,0)
45
50
55
60
| 2,3,5-Tri-O-methyl- D-arabinose |
(AraO 1 —► | 0,9 | 3,0 |
| 2,3-Di-O-methyl- D-arabinose |
—> 5 (AraO 1 —► | 12,4 | 41,5 |
| 3,5-Di-O-methyl- D-arabinose |
—► 2 (AraO 1 ► | 2,3 | 7,7 |
| 2-O-Methyl-D- arabinose |
ZZ j (Araf) 1 —-* | i,0 | 3,3 |
| 2,3,4,6-Tetra-O- msthyl-D- mannose |
(Manp) 1 —» | 2,8 | 9,4 |
| 3,4,6-Tri-O-methyl- D-mannose |
—* 2 (Manp) 1 —» | 2,7 | 9,0 |
| 2,3,4-Tri-O-methyI- D-mannose |
> 6 (Manp) 1 —> | 5,3 | 17,7 |
| 3,4'Di-O-methyl- D-mannose |
* g (Manp) 1 —► | 2,5 | 8,4 |
| insgesamt | 29,9 | 100,0 | |
| Versuch 3 |
55,5%
44,5%
3.1 Zu 1 mg des Im Beispiel 1.1 erhaltenen gereinigten Llpopoly^accharlds werden 1 ml Methylalkohol, enthaltend
10 μg Methyllaurat als Innerer Standard und 3,3% Chlorwasserstoff gefügt, und das Gemisch wird durch
Methanolyse In einem verschlossenen Rohr, das mit Stickstoffgas gefüllt Ist, zersetzt. Das resultierende Gemisch
wird bei niedriger Temperatur konzentriert und In Methylcnchlorld gelost. Durch Gaschromatographie unter
Anwendung von zwei Arten gefüllter SSulen werden die FettsBurcbestandtelle Identlflzlerl und bestimmt durch
die Retentlor.szelt des Standard-FettsBurcmethybslers. Die Maximalwerte (Peaks) der jeweiligen FeUsäuremethylester
werden durch GC-MS Identifiziert.
| Tabelle III | 699 | 42,9 | I erhalten wurde. | liriu Lu bestimme | x 10-" Mol | 5 | |
| Methyllaurat (innerer Standard) | 330,9 | x 10" Mol | |||||
| Methylmyristat | (100 Mg) | 1,8 | 3.2 Das in Beispiel 1.2 erhaltene gereinigte Llpopolysaccharld wird In | X 10-" Mol | |||
| Methylpalmitai | 10,4 Mg | 125,0 | behandelt, um die Fettsaurebestandteiie zu identifizieren | X 10-" Mol | |||
| Methylheptudecanoat | 89,5 Mg | 0,7 | In der Tabelle IV gezeigt. | X 10-" Mol | 10 ' | ||
| Methylstcarat | 0,5Mg | 41,0 | x 10-" Mol | ||||
| Methyloleat | 37,3 Mg | 542 | x 10" Mol | ||||
| Methylubereulostearat | 0,2Mg | Die vorstehenden experimentellen Ergebnisse bestätigen, dall der Fettsäuregehalt | der Llpopolysaccarldprobe | 15 | |||
| insgesamt | 12,8 Mg | etwa 15% beträgt (150,7 μ% pro 1 mg Polysaccharide und es ergibt sich. | daß das Llpopolysaccacharld (durch- | ||||
| 150.7 Mg | schnittliches Molekulargewicht 13 000), das In Beispiel 1 | etwa 7,6 Fettsauren (1950 g-Äqulva- | |||||
| lent) enthält. | |||||||
| glelcher Welse, wie In Beispiel 3.1 | 20 | ||||||
| Γι. LsiC luCr | |||||||
| 30 48 | |||||||
insgesamt 79,6 Mg 282,6 x 10"" Mi>!
Aus den vorstehenden experimentellen Ergebnissen Ist ersichtlich, daß der Fettsäuregehalt der Llpopolysaccharldprobe
etwa 8* (79,6 \ig pro I mg Polysaccharld) beträgt, und es ergibt sich, daß das Llpopolysacchavld
(mittleres Molekulargewicht 12 000), das Im Beispiel 1.2 erhalten wurde, etwa 3.9 Fettsäuren (1000 g-Äqulvaicnt)
enihäii.
Versuch 4
Im folgenden wird die Analyse Fettsäuieblndungsstruktur In dem Llpopolysaccharld beschrieben.
4.1 Das Im Beispiel 1.1 erhaltene gereinigte Llpopolysaccharld wird mit Methylvlnyiather In Dimethylsulfoxld
In Anwesenheit von p-Toluolsulfonsäure als Katalysator behandelt zur Methoxyäthyllerung freier Hydroxylgruppen.
Die Fettsäuren werden durch Verselfen entfernt, und die Hydroxylgruppen, die freigesetzt wurden,
werden nach der Hakomorl-Methode methyllert. Anschließend werden die methoxyäthylierten Gruppen durch -»5
Hydrolyse entfernt unter Anwendung einer Säure, die Methylalkohol enthält, und das teilweise methyllerte
Monosaccharldgemlsch wird durch Hydrolyse mit einer Säure erhalten. Das Gemisch wird reduziert und acetyllert
nach bekannten bzw. üblichen Methoden, und die Acetate werden gaschromatographlsch analysiert, unter
Anwendung dreier Arten von gepackten Säulen und von Xylit als Internem Standard, und die Identifizierung
und Bestimmung werden unter Vergleich mit Standard-Aldltolacetaten von freien und teilweise methyllerten
Monosaccharlden durchgeführt.
| 30 48 699 | |
| Tabelle V | |
| 5-Methyl-D-arabinit | 6,14% |
| 2-Methyl-D-arabinit | 2,48% |
| 3-Methyl-D-arabinit | 0,33% |
| D-Arabinit | 50,27% |
| 2-Methyl-D-mannit | 0,02% |
| 3- oder 4-Methyl-D-mannit | 0,22% |
| 6-Methyl-D-mannit | 1,04% |
| D-Mannit | 39,50% |
| insgesamt | 100,0 % |
59,22%
40,78%
(einschließlich 10,23% Monosaccharidfett- säureester)
Aus den vorstehenden Ergebnissen ergibt sich, daß etwa eine Fettsaure pro 10 Moleküle der Monosaccharldbestandtelle
gebunden Ist, und die meisten BindungS3teiien, die 5-Steiiungen der ArabinOsccirmeiien und der
Rest, die 2-Stellungen der Arablnoseelnhclten, die 6-Stellungen der Mannoseelnhelten und andere Stellungen
sind.
Aus den In den Versuchen 1.1, 2.1, 3.1 und 4.1 erhaltenen Ergebnissen, laßt sich schließen, daß das Im
Beispiel 1.1 erhaltene Llpopolysaccharld ein Llpopolysaccharld mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa
13 000 Ist, das aus Arablnomannan mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 11 000 besteht, zusammengesetzt
aus etwa 47 Arablnoseelnheiten und etwa 30 Mannoseelnhelten und etwa 8 Fettsäuren mit 14 bis 19
Kohlenstoffatomen (Palmltlnsäure In der Hauptsache), die an das Arablnomannan gebunden sind.
4.2 Das Im Beispiel 1.2 erhaltene gereinigte Llpopolysaccharld wird In gleicher Welse, wie Im Beispiel 4.1 behandelt. Die Maximalwerte (Peaks) des resultierenden teilweise methyllerten Aldltolacetats sind In der Tabelle VI Identifiziert.
4.2 Das Im Beispiel 1.2 erhaltene gereinigte Llpopolysaccharld wird In gleicher Welse, wie Im Beispiel 4.1 behandelt. Die Maximalwerte (Peaks) des resultierenden teilweise methyllerten Aldltolacetats sind In der Tabelle VI Identifiziert.
| 5-Methyl-D-arabinit | 3,29% |
| 2-Methyl-D-arabinit | 1,60% |
| 3-Methyl-D-arabinit | 0,03% |
| D-Arabinit | 50,57% |
| 2-Methyl-D-mannit | 0,01% |
| 3- oder 4-Methyl-D-mannit | 0,03% |
| 6-Methyl-D-mannit | 1,00% |
| D-Mannit | 43,47% |
| insgesamt | 100,0 % |
55,49%
44,51%
(einschließlich 5,96% Monosaccharid fettsäureester)
Aus den vorstehenden Ergebnissen ISBt sich schließen, daß etwa eine Fettsaure pro 16 Moleküle der Monosaccharldbestandtelle
gebunden Ist, und die meisten der Blndungsstellen, die 5- und 2-Stellungen der Arablnoseeinhelten
und die 6-Stellungen der Mannoseelnhelten Und.
Aus den In den Versuchen 1.2, 2.2, 3.2 und 4.2 erhaltenen Ergebnissen ISBt sich schließen, daß das im
Beispiel !.2 erhaltene Llpopolysaccharld ein Llpopolysaccharld mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa
12 000 Ist, das aus Arablnomannan mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa Il 000 besteht, das zusammengesetzt
ist aus etwa 42 Arablnoseelnheiten und etwa 34 Mannoseelnhelten und im Durchschnitt 4 oder 5
Fettsauren mit 14-19 Kohlenstoffatomen (Paimltlnsaure In der Hauptsache), die an das Arablnomannan gebunden
sind.
Ein Verfahren zur Herstellung eines Lipopolysaccharlds durch Binden einer Fettsaure an ein Polysaccharld Ist
bekannt. Erfindungsgemäß kann Llpoarablnomannan, das wirksamer zur Immuntherapie von Tumoren geeignet
1st, hergestellt werden durch Binden einer geeigneten Fettsäure an lipldfreles Arablnomannan oder Arablnomannan
mit niedrigen Llpldgehalt, nach dem bekannten bzw. üblichen Verfahren.
Dieses Beispiel veranschaulicht das Verfahren zur Herstellung von Lipcarabincrnannan aus llpidfrelem Arablnomannan.
2.1 Der Im Beispiel 1.1 verwendete Zellkörper wird alkalisch extrahiert, und man erhall Arablnomannan mit
2.1 Der Im Beispiel 1.1 verwendete Zellkörper wird alkalisch extrahiert, und man erhall Arablnomannan mit
einem Molekulargewicht von etwa 8500 bis 14 000 durch Siebbehandlung In gleicher Welse, wie Im Beispiel 1.1
beschrieben. Das so erhaltene Arablnomannan wird welter gereinigt bzw. raffiniert durch Afflnllätschromatographle
und getrocknet und 10 mg des getrockneten Arablnomannans werden mit 10 mg Palmltlnsäureanhydrid
bei 50° C während 20 h In Ν,Ν-Dlmelhylformamld-Pyrldln umgesetzt. Äthyläther wird zu dem Reaktionsgemisch gefügt, und die Ausfällung wird durch Zentrifugenabscheidung gewonnen, mit Äther gewaschen und
getrocknet, unter Erzielung von 11 mg Llpoarablnomannan.
Als Analysenergebnis bestätigt sich, daß die Saccharldkettenstruktur des vorstehend erhaltenen Llpoarablnomannans
Im wesentlichen die gleiche Ist, wie die In den Beispielen 1.1 und 2.1 festgestellte. Insbesondere hat
sich bestätigt, daß die Palmltlnsäure hauptsächlich an die 5-Stellung der Arablnoseelnhelt In der Arablnomannankette
In einer Menge von etwa 9,8 Gew.-* gebunden Ist und das mittlere Molekulargewicht etwa 12 500
beträgt.
2.2 Der Im Beispiel 1.2 verwendete Zellkörper wird alkalisch extrahiert, und man erhalt Arablnomannan,
das In der gleichen Welse, wie Im Beispiel 2.1 beschrieben, raffiniert wird. 10 mg des getrockneten Arablnomannans
werden mit 8 mg Palmltoylchlorld bei .17° C während 16 h In Ν,Ν-Dlmethylformamld-Pyrldln umgesetzt.
Äthanol wird zu dem Reaktlonsgemlsch gefügt, und die Ausfällung wird durch Zentrifugenabscheidung gewonnen,
mit Äthylälher gewaschen und getrocknet, unter Erzielung von IO mg Llpoarablnomannan.
Als Analysenergebnis bestätigte sich, daH die Saccharldkettenstruktur des vorstehend erhaltenen Llpoarablnomannans
Im wesentlichen die gleiche Ist, wie sie In den Versuchen 1.1 und 2.2 festgestellt wurde. Insbesondere
hat sich bestätigt, daß Palmltlnsäure hauptsächlich an die 5-Stellung der Arablnoseelnhelt In der Arablnomannankette
gebunden Ist, In einer Menge von etwa 7,6 Gcw.-sm, und dall das Molekulargewicht etwa Ί2ϋϋΰ
betrügt.
Dieses Beispiel veranschaulicht das Verfahren zur Herstellung von Llpoarablnomannan aus Arablnomannan 2'
mit geringem Llpldgchalt.
3.1 5 mg Arablnomannan mit einem Fettsäuregehalt von etwa 3%, das In gleicher Welse, wie Im Beispiel 1.1
beschrieben, erhalten wurde, werden einer Ultraschallbehandlung mit 10 mg Palmltoylchlorld In Pyrldln unterzogen,
und die Reaktion wird bei 37° C wahrend 18 h durchgeführt. Zu dem Reaktlonsgemlsch fügt man Äthylalkohol,
und die Ausfüllung wird gesammelt, mit Äthyläther gewaschen und getrocknet unter Erzielung von 4,3 ·">
mg Llpoarablnomannan.
Als Analysenergebnis bestätigte sich, daß die Saccharldkettenstruktur Im wesentlichen die gleiche wie In den
Beispielen 1.1 und 2.1 festgestellt Ist. Insbesondere bestätigte sich, daß Palmltlnsäure hauptsächlich an die 5-Stellung
der Arablnoseelnhelt und die 6-Stellung der Mannoseelnhelt In der Arablnomannankette In einer
Menge von etwa 28 Gew.-% gebunden Ist und das mittlere Molekulargewicht etwa 14 000 betrügt. }i
3.2 5 mg Arablnomannan mit einem Fettsäuregehalt von etwa 2%, die In gleicher Welse, wie Im Beispiel 1.2
beschrieben, erhalten wurden, werden einer Ultraschallbehandlung mit 8 mg Palmltoylchlorld In Pyrldln unterzogen,
und die Reaktion wird 18 h bei 37° C durchgeführt. Zu dem Reaktionsgemisch wird Äthyiaikohoi gefügt,
und die Ausfällung wird gewonnen, mit Äthyläther gewaschen und getrocknet unter Erzielung von 3,8 g Llpoarablnomannan.
Das Analysenergebnis bestätigte, daß die Saccharldkettenstruklur Im wesentlichen die gleiche wie In den
Versuchen 1.2 und 2.2 testgestellt 1st. Insbesondere bestätigte es sich, daß die Palmltlnsäure hauptsächlich an
die 5-Stellung der Arablnoseelnhelt und die 6-Stellung der Mannoseelnhelt In der Arablnomannankette In einer
Menge von etwa 18 Gew.-% gebunden und das durchschnittliche Molekulargewicht etwa 13 500 beträgt.
Versuch 5
Zellen (1 χ 10') des Sarcoma- 180-Tumors werden ddY-Mäusen (weiblich, 10 Wochen alt), die mit BCG senslblllsiert
wurden, subkutan transplantierl. Vom nächsten Tag an wird Llpoarablnomannan, angegeben in der
Tabelle VII, das steril In einer physiologischen Salzlösung gelost Ist, hypodermisch an zwei Mäusegruppen (jede'
aus 8 Mäusen) in einer Menge von 0,02 μg bis 2,0 μg pro Maus pro Tag während achtmal insgesamt verabreicht.
Nach 30 Tagen nach der Transplantation der Tumorzellen werden die Testtiere getötet, und die Tumorgewichte
werden gemessen. Die Antltumorwlrksamkelt jedes Lipoarablnomannans wird auf der Basis des
gemessenen Tumorgewichts bewertet.
Gruppe
verabreichte
Menge ^g)
Menge ^g)
Tumorgewicht ± S.E. (g)
| Kontrolle | — |
| ArMn-l·') | 0,02 |
| ArMn- ]■>) | 0,2 |
| ArMn-I") | 2,0 |
| Kontrolle | - |
| ArMn-2b) | 0,02 |
| ArMn-2b) | 0,2 |
| ArMn-2h) | 2,0 |
| Kontrolle | - |
| ArMn-3c) | 0,02 |
| ArMn-3c) | 0,2 |
| ArMn-3l) | 2,0 |
| Kontrolle | - |
| ArMn-4d) | 0,02 |
| ArMn-4ü) | 0,2 |
| ArMn-4ü) | 2,0 |
| Kontrolle | - |
| ArMn-5c) | 0.02 |
| ArMn-5e) | 0.2 |
| ArMn-5e) | 2,0 |
| Kontrolle | - |
| ArMn-6r) | 0.02 |
| ArMn-6r) | 0,2 |
| ArMn-öO | 2.0 |
| Kontrolle | - |
| ArMn-7«) | 0,02 |
| ArMn-7») | 0,2 |
| ArMn-7*) | 2,0 |
| Anmerkung: |
2,71 ±0,32 2,54 ± 0,43 1,78 ±0,26*)
2.82 ± 0,40 1,90 ±0,52
1.62 ±0,24**) 1,74 ±0,25**)
2,53 ± 0,33 1,87 ±0,40
1.53 ±0,27*)
1.54 ±0,27*)
2,85 ±0,21 1,52 ±0,82**) 1,40 ±0,15**)
1.83 ±0,17**)
3,24 ± 0,46 2,21 ±0,22**)
1.63 ±0,21**) 1,77 ±0,24**)
3,12 ±0,32 1.95 ±0,19**) 1,51 ±0,14**) 1,80 ± 0,20**)
3,35 ± 0,34 2,34 ± 0,22**) 1,49 ±0,36**) 1,67 ±0,34**)
100
93.7 65,7 62,7
93.7 65,7 62,7
100
67.4 57,4 61,7
67.4 57,4 61,7
100
73,9 60,5 60,9
73,9 60,5 60,9
100
53,3 49,1 64,2
53,3 49,1 64,2
100
68,2 50,3 54,6
68,2 50,3 54,6
100
62,5 48,4 57,7
62,5 48,4 57,7
100
69,9 44,8 49,9
69,9 44,8 49,9
') Lipoarabinomannan. extrahiert und gereinigt nach dem im Beispiel 1.1 beschriebenen Verfahren (l'ell-5'·
Säuregehalt - 3%).
b) Lipoarabinomannan, extrahiert und gereinigt wie im Beispiel 1.1 (l;cllsäurcgehalt *- 15%).
c) Lipoarabinomannan, erhalten durch Binden von Palmitinsäurc an lipidfrcics Arabinomannan über eine
Esterbindung im Beispiel 2.1
(Palmitinsäuregehalt = 10%).
d) Lipoarabinomannan. gebildet durch Binden vnn Palmitinsäurc an Lipoarabinomannan mit niedrigem
55 Lipidgehalt über eine Esterbindung im Beispiel 3.1 (Palmitinsäuregehalt - 28%).
e) Lipoarabinomannan, extrahiert und gereinigt wie im Beispiel 1.2 (Fettsäuregehalt - 8%).
r) Lipoarabinomannan, gebildet durch Binden von Palmitinsäurc an lipidfreies Arahinomannan durch
eine Esterbindung im Beispiel 2.2 (Palmitinsäuregehalt - 7.6%).
*) Lipoarabinomannan, gebildet durch Binden von Palmilinsäurc an Lipoarabinomannan mit niedrigem
j^lj 77C"(%): Verhältnis des Tumorgewichts der lipopolysaccharidvcrabrcichten Gruppe zum Tumorgewicht der
·) P < 0.05
·*) P < 0.01
·*) P < 0.01
f>5 Wie aus den In der Tabelle VII gezeigten Ergebnissen ersichtlich Ist, weisen die crflndungsgemäßen Lipopolysaccharide,
d. h. sowohl das Llpqaramlnomannan, das durch Binden von Fettsäuren an lipidfreies Arabinomannan
oder Areblnomannan mit geringem Lipidgehalt erhalten wurde, als auch das aus dem Zellkörper extrahierte
und gereinigte Lipoarabinomannan eine große Inhlbllorlschc Wirksamkeit gegenüber dem Wachstum des
Tumors bei geringer verabreichter Menge auf. Das Ardbinomannan mit einem größeren Feiisäuregehali weist
eine besonders hohe Antltumorwlrksamkelt IxI geringerer verabreichter Menge auf.
Wird das erfindungsgemäße Llpopolysacchartd dem menschlichen Körper als ein immun-therapeutisches Mittel
gegen Tumore verabreicht, so wird es zu einer hypodermlschen Injektion formuliert. Ein Beispiel für ein Präparat
für eine hypodermisch Injektion Ist Im folgenden angegeben. s
! mg des erfindungsgemäßen Lipopolysaccharide (erhalten In den Beispielen 1, 2 oder 3) wird In einer geeigneten
Menge einer physiologischen Salzlösung zur Injektion unter Bildung von 100 ml einer Lösung gelöst. Die
Lösung wird zu einer hypodermen Injektion formuliert, die 10 ug/ml des Lipopolysaccharlds enthält, wobei man
sich üblicher Verfahrensweisen bedient. Die Injektion wird hypodermisch 1- bis 3mal pro Woche (10 bis 30 μg
als Llpopolysaccharid) verabreicht.
Ein Zellkörper des Tuberkelbaclllus oder ein Extrakt davon, dessen Antltumorwlrksamkelt bewertet wurden.
Ist ein Gemisch komplizierter chemischer Komponenten. Im Gegensatz hierzu handelt es sich bei dem erfln- ί>
dungsgemäßen Llpoarabinomannan um ein Llpopolysacchartd mit einer definierten chemischen Zusammensetzung,
das Isolllert und gereinigt wird. Darüber hinaus 1st das erfindungsgemäße Llpopolysaccharid dadurch
gekennzeichnet daß die Nebenwirkungen des Zellkörpers ausgeräumt werden können. Dementsprechend kann
man darauf schließen, daß das erflndungsgemaße Lipopolysaccharid ein wertvolles Immuntherapeutisches" Mittel
gegen Tumore sein kann.
Proben von den erflndungsgemäß verwendeten Stämmen Mycobacterium tuberculosis. Stamm Aoyama B und
Mycobacteilumi tuberculosis. Stamm H17R, sind am Anmeldetag allgemein zugänglich gewesen. Sie sind bei der
American Type; Culture Collection unter den Nos. ATCC 31726 und ATCC 25618 hinterlegt.
Claims (2)
1. Immuntherapeutisches MIttel gegen Tumore, enthaltend als wirksame Komponente ein Llpopolysaccharld,
das Arabinomannan als Polysaccharld mit einer Monosaccacharldzusammensetzung von 30 bis 74
Gew-% Arablnose, 20 bis 50 Gew.-% Mannose, 0 bis 10 Gew.-« Glucose und 0 bis 13 Gew.-« Galactose
aufweist und an das Arabinomannan durch Esterbindungen gebundene Fettsäuren, die Paimltinsaure,
Stearinsaure, Tuberculosteartnsflure, Heptadecansäure, ölsäure und Llnolsflure sind mit einem Fettsauregehalt
von 1 bis 28 Gew.-« Fettsäuren in dem Llpopolysaccharld enthält, wobei das Llpopolysaccharid erhältlich 1st
durch Heißwasserextraktion der Zellkörper von aerob gezüchteten Kulturen von Mycobacterium tuberculosis
ίο Stamm ATCC 31726 und Stamm ATCC 2S618, mit anschließender Dsproteinlerung und Alkoholbehandlung
des Extraktes, Fraktionierung des so erhaltenen rohen Lipopolysaccharides mit FlOsslgkeltschromatographle
und Konzentration der Fraktion mit einem Molekulargewicht von 10000 bis 16000 mittels Affinitätschromatographie.
2. immuntherapeutisches Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Im Llpopolysaccharld
enthaltene Fettsauregehalt von 1 bis 28 Gew.-% einstellbar 1st durch Einfahren von Fettsauren Insbesondere
PaImItIn- und Stearinsaure Ober Esterbindungen In das Arabinomannan, das gegebenenfalls durch vorausgehende
alkalische Extraktion des Zellkörpers von Mycobacterium tuberculosis Stamm ATCC 31726 und
Stamm ATCC 25618 mit anschließender Reinigung und Konzentrieren gemäß Anspruch 1 erhalten :-;t
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3048699A DE3048699C2 (de) | 1980-12-23 | 1980-12-23 | Immuntherapeutisches Mittel gegen Tumore, enthaltend als wirksame Komponente ein Lipopolysaccharid |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3048699A DE3048699C2 (de) | 1980-12-23 | 1980-12-23 | Immuntherapeutisches Mittel gegen Tumore, enthaltend als wirksame Komponente ein Lipopolysaccharid |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE3048699A1 DE3048699A1 (de) | 1982-07-08 |
| DE3048699C2 true DE3048699C2 (de) | 1985-03-28 |
Family
ID=6120093
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE3048699A Expired DE3048699C2 (de) | 1980-12-23 | 1980-12-23 | Immuntherapeutisches Mittel gegen Tumore, enthaltend als wirksame Komponente ein Lipopolysaccharid |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE3048699C2 (de) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998056941A1 (en) * | 1995-12-12 | 1998-12-17 | Tai Ho Chung | Carbohydrate complex extracted from mycobacterium tuberculosis and process for the preparation thereof |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59161320A (ja) * | 1983-03-04 | 1984-09-12 | Maruyama Chisato | リポ多糖体およびその製造法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE1073150B (de) * | 1960-01-14 | |||
| DE1245037B (de) * | 1965-08-21 | 1967-07-20 | Schering Ag | Verfahren zur Herstellung von antigen-wirksamen Polysacchariden und Lipopolysacchariden |
| JPS54140710A (en) * | 1978-03-10 | 1979-11-01 | Mitsui Toatsu Chem Inc | Anti-tumor substance and its preparation |
-
1980
- 1980-12-23 DE DE3048699A patent/DE3048699C2/de not_active Expired
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998056941A1 (en) * | 1995-12-12 | 1998-12-17 | Tai Ho Chung | Carbohydrate complex extracted from mycobacterium tuberculosis and process for the preparation thereof |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3048699A1 (de) | 1982-07-08 |
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