DE3323092A1

DE3323092A1 - Pharmazeutisches praeparat

Info

Publication number: DE3323092A1
Application number: DE19833323092
Authority: DE
Inventors: John L. 59840 Hamilton Montana Cantrell
Original assignee: Ribi Immunochem Research Inc
Current assignee: Ribi Immunochem Research Inc
Priority date: 1982-06-30
Filing date: 1983-06-27
Publication date: 1984-01-05
Also published as: IT1163624B; GB2122897B; IT8321854A0; JPS5917991A; DE3323092C2; CA1206415A; FR2529462A1; FR2529462B1; JPS6254774B2; GB2122897A; GB8317744D0

Description

PHARMAZEUTISCHES PRÄPARAT

Die Erfindung betrifft einen pyr.i.dinlöslichen j -. ■ ■ . aus Mikroorganismen, der in Verbj ndung mit Trehaidimycolat (TDM) und einem mit Azeton ausgefällt;' benprodukt von mit Chloroform-Methanol extrahier^·.;;: endotoxischen Glykolipiden (APC) ein pharmazeutisch Präparat mit antitumoralen Eigenschaften ergibt.

Mit Bakterien wie z.B. Corynebacterium parvum wur·::-. Versuche angestellt, um diejenigen Komponenten su isolieren und kennzeichnen, welche die Hemmung des Tumorwachstums bewirken (s„ ζ„Β= Anti Tumor Activity and Lymphoreticular Stimulation Properties of Fractions Isolated from C. parvum; Cantrell, et al. Cancer Research, Band 39, S. 3554-3563, September 1979). Abgesehen von seiner antitumoralen Wirkung hat .sich der C. parvum als wirkungsvolles Stimulans de? lymphoreticularen Systems, welches zu unerwünschter Gewichtszunahme der Milz und der Leber und zu Elaste-· genese führt, erwiesen. Es wurde herausgefunden, daß ein pyridinlöslicher Extrakt aus einem Mikroorganismus hohe antitumorale Eigenschaften ohne die mit den bekannten Erzeugnissen verbundenen unerwünschten toxischen Wirkungen aufweist.

Trehalosedimycolat .(TDM) kann aus Organismen wie z.B. M.avium, M.phlei, M.tuberculosis (Stamm H 37 RV und Ayoma B), M.bovis BCG, M.smegmatis, M.kansasii, No^. cardia rubra, M.bovinis und Corynebacterium diphtheriae hergestellt werden.

Die Bakterien, wie z.B. M.avium, werden gezüchtet, abgeerntet und dann durch Hitzeeinwirkung abgetötet. Die Zellmasse wird mit verschiedenen Lösungsmitteln extra-

hiert, wonach die aktive, in einem Lösungsmittel lösliche Fraktion extrahiert wird. Das Extrakt wird durch eine Reihe von Lösungsmittelextraktionen gereinigt, wodurch man TDM erhält (s. Biologically Active Components from Mycobacterial Cell Walls. I. Isolation and Compositions of Cell Wall Skeleton and Component P ₃; Azuma, et al., Journal of the National Cancer Institute, Band 52, S. 95-101, 1974). Wie in dieser Literaturstelle beschrieben wird, können die TDM dann weiter durch Zentrifugalchromatographie an feinverteiltem Silicagel gereinigt werden.

Das mit Azeton ausgefällte Nebenprodukt von mit Chloroform-Methanol extrahierten endotoxischen Glykolipiden (ACP) hat bei seiner alleinigen Verwendung oder bei der Verwendung kombiniert mit Trehalosedimycolat keine tumorrückbildenden Eigenschaften. Zwecks einer vollständigeren Untersuchung des ACP, seiner Eigenschaften und Herstellungsverfahren wird auf die Veröffentlichung "Peptides as Requirement for Immunotherapy of the Gui nea-Pig Line-10 Tumor with Endotoxins"(Ribi, et al, Cancer Immunol. Immunother., Band 7, S. 43-58, 1979) verwiesen. ACP erhält man aus Enterobacteriaciae folgender Gattungen, jedoch nicht ausschließlich aus diesen: Salmonella, Shiqella, Escherichia, Brucella, Bordetella, Citrobacter, Pseudomnas, Pasturella, Neisseria, Proteus, Klebsiella und Serratia.

Folgende Spezies eignen sich besonders für den Einsatz in vorliegender Erfindung:

S.minnesota, S.typhimurium, B.pertussis, B.abortus, S.enteritidis, E.coli, S.typhi, S.marcescens, S.typhosa, Shigella flexni und S.abortus equi.

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Erfindungsgegenstand ist daher die Bereitste Llung
eines pharmazeutischen Präparats, das einen pyriuinlöslichen Extrakt aus einem Mikroorganismus in Verbindung mit Trehalosedimycolat (TDM) und einem mit
Azeton ausgefällten Nebenprodukt von mit Chloroform-Methanol extrahierten endotoxischen Glykolipiden
enthält.

Ein weiterer Erfindungsgegenstand ist die Bereitsteilung eines Verfahrens zur Tumorbehandlung von Warmblütern und Menschen unter Verwendung des den aus

Mikroorganismen erhaltenen pyridinlöslichen Extrakt, TDM und APC enthaltenden Präparats.

Die Erfindung betrifft ein pharmazeutisches Präparat aus einem aus Mikroorganismen erhaltenen pyridinlösliehen, zwischen etwa 7 und 20 Gew.-% Protein, etwa 10 bis 16 Gew.-% Zucker und etwa 35 bis 55- Gew.-% Fett säuren enthaltenden Extrakt, TDM und APC. Der pyridinlösliche Extrakt enthält vorzugsweise etwa 12
Gew.-% Protein, etwa 12 Gew.-% Zucker und etwa 45

Gew.-% Fettsäuren.

Zur Herstellung des pyridinlöslichen Extraktes kön-' nen alle Mikroorganismen einschl. M.bovis BCG, M. phlei, M. smeqmatis, M.kansasii, Nocardia rubra, Corynebacterium diphtheriae und Corynebacterium parvum verwendet werden. Corynebacterium parvum ist besonders vorzuziehen.

Vollzellen des Mikroorganismus, vorzugsweise in Form einer' Paste, werden mit Pyridin gemischt. Das erhaltene Gemisch wird abgetrennt, um eine Überstandsfraktion enthaltend den pyridinlöslichen Extrakt und einen Pyridinrückstand zu erhalten. Der Pyridinrückstand

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kann fakultativ wiederholt dem oben beschriebenen Abtrennungsverfahren unter Verwendung von Pyridin zur Entfernung von weiteren Mengen des gewünschten Extraktes unterzogen werden.

Nachfolgend wird das Pyridin aus dem Extrakt entfernt und der getrocknete Extrakt wird gegen eine geeignete Flüssigkeit, wie z.B. destilliertes Wasser, dialysiert. Das Fehlen von Vollzellen oder Zellfragmentverunreinigungen wird elektronenmikroskopisch festgestellt. Der erhaltene gereinigte Extrakt kann anschließend nach bekannten Verfahren lyophilisiert werden, um ein beständiges Produkt zu erhalten.

Das erfindungsgemäß hergestellte pyridinlösliche Extrakt kann mit TDM und ACP kombiniert werden, um so ein Präparat mit hoher antitumoraler Wirkung zu ergeben, das keine Milz- und Lebervergrößerungen verursacht.

Mit dem erfindungsgemäßen Präparat können unter anderem Krebsarten wie die folgenden tierischen Tumore, z.

B. Rinder-Schuppenzell-Karzinom, Rinder-Fibrosarkom, Pferde-Sarkoid, Pferde-Melanom, Pferde-Schuppenzell-Karzinom, Hunde-Mamma-Tumore, Hunde-Adenom und Hunde-Melanom, sowie menschliche Tumore, wie z.B. Brusttumore, Lungentumore, Colon-Tumore, malignes Melanom, Schuppenzell-Karzinome und Ovarial-Tumore, behandelt werden.

Das Präparat wird vorzugsweise durch Injektion in einem pharmazeutisch geeigneten Mittel, wie z.B. in einer Öltröpfchenemulsion, unter den nachfolgend näher beschriebenen Bedingungen direkt in den Tumor verabreicht. Das besagte Präparat kann, beispielsweise mittels eines LyophilisatJonsverfahrens, stabilisiert und nachfolgend ohne Verlust an Wirksamkeit in den ursprünglichen Zustand zurückversetzt werden.

Die Menge an pyridinlöslichem Extrakt an einer «■ ι r. fachen Injektion für die Behänd 1 uncj von Tinen 1; ..-.· zwischen etwa . 37.^cj und 2 i>UO yucj/iiil. . Die Menqe <ιι. Λ1\ und TDM betragt je zwischen etwa 375 und 125Oyug/n,i.

Die Anzahl an Millilitern des biologisch in den Tumor zu injizierenden Präparats wird von der Tumorgröße bestimmt, wobei im Einzelnen auf die Werte in der nachstehenden Tabelle verwiesen wird.

Dosis bei Tieren je nach Tumorqröße

Durchmesser des Tumors (cm) Menge des zu injizierenden biologischen Präparats

0-1 bis zu 0,5 ml

1-2 O₇ 5 bis 2, 5 rrJ

2-3 2,5 bis 5 ml

3-5 5 bis 10 ml

5-8 10 bis 15 ml

größer als 8 15 bis 20 ml

Die maximale Dosis pro Injektion beträgt etwa 40 mg an pyridinlöslichem Extrakt, etwa 6 mg TDM und etwa 20 mg ACP. Die Behandlung sieht bis zu sechs, in 2-Wochenintervallen zu verabreichende Injektionen vor.

Die Verabreichung des erfindungsgemäßen Präparats einem geeigneten injizierbaren Mittel, wie z.B. einer Öltröpfchenemulsion, kann direkt in den menschlichen Tumor erfolgen. Die Menge an pyridinlöslichem Extrakt in einer einzigen Injektion liegt zwischen etwa 2GG und 5000 /ag, vorzugsweise zwischen etwa 800 und 1200 lag. Die Menge an ACP beträgt zwischen etwa 150 und 1000 Aig, wahrend die Mengt¹ an TDM :-*w i; i'hc-ir uiKjri iihi - 50 und 1000 Jag liegt. Die bevorzugte Menge an ACP und

TDM pro Injektion beträgt je zwischen etwa 475 und yug. Bei sämtlichen obengenannten Dosierungsmengen wird von der Verabreichung an einem Durchschnittser- - wachsenen mit einem Ge\-/icht von 70 kg ausgegangen. Die Injektionen werden höchstens 15 Mal etwa einmal wöchentlich verabreicht.

Wie oben beschrieben, kann das Präparat bei der Behandlung von Warmblütern und Menschen in Form einer öltropfchenemulsion verwendet werden. Die verv/endete Ölmenge liegt zwischen etwa 0,5 und 3,0 Vol.-?», bezogen auf das Gesamtvolumen des Präparats. Die bevorzugte Menge des zu verwendenden Öls beträgt zwischen ungefähr 0,75 und 1,5 VoI.-λ. Beispiele für solche Öle sind leichtes Mineralöl, Squalan, Squalen, 7-n-Hexyloctadecan, Conoco Superöl und Drakeol 6 VR Mineralöl (hergestellt von der Pennreco Company, Butler, Pennsylvania).

Das homogenisiertes Öl enthaltende Gemisch wird anschließend mit einem Detergens, das vorher gegebenenfalls in einer Salzlösung gelöst wird, vermischt. Die durchschnittliche Menge des Detergens beträgt zwischen etwa 0,02 und 0,25 Vol.-X, und die bevorzugte Menge liegt zwischen etwa 0,10 und 0,20 Vol.-%, jeweils bezogen auf das Gesamtvolumen des Präparats. Es können alle üblichen Detergentien, wie z.B. Tween-80 und Arlacel (hergestellt von der Atlas Chemical Company) , verwendet v/erden.

Das nach dem Zusatz des Reinigungsmittels erhaltene Gemisch wird dann homogenisiert-, wodurch man eine Suspension mit einem hohen Pr02.cnt.sat2 an mit Wirkst οίίι·η über zogi.'iioü öl t röpichen erhält, was sich unter dem Mikroskop nächweisen läßt.

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Die nachfolgenden Beispiele dienen lediglich cut Illustration und schränken die in den Ansprüchen bc anspruchte Erfindung nicht ein.

Beispiel 1

Herstellung von pyridinlöslichem Extrakt aus Corvnebacterium Parvum

Corynebacterium parvum (P.acnes, Stamm 4182) wurde bei 37°C während 48 bis 72 Stunden in NIH-Thioglykolatbrühe gezüchtet und abgeerntet, woraufhin eine Vollzellpaste erhalten wurde. Die Paste wurde anschließend mit 500 ml destilliertem Wasser gewaschen. 90 Gramm (Feuchtgewicht) der gewaschenen Paste wurden mit 200 ml reinem Pyridin gemischt und bei 4 C während einer Stunde mit der 1700-fachen

2
Erdbeschleunigung g (9,81 m/s ) zentrifugiert. Ein pyridinlöslieher Extrakt wurde als Überstandsfraktion entfernt.

Der verbliebene Rückstand wurde mit zusätzlichem Pyridin unter den gleichen Bedingungen, wie oben beschrieben, extrahiert. Nach erfolgter Filtrierung unter Verwendung von Whatman No. 1-Papier wurden die Pyridin-Fraktionen vereinigt, und das Lösungsmittel durch Verdampfung bei 50 C in einem Buchi-Rotationsverdampfer (Brinkmann Instruments, Westbury, New York) entfernt. Der getrocknete Pyridin-Extrakt wurde eingehend gegen destilliertes Wasser dialysiert und anschließend lyophilisiert. Der erhaltene gereinigte Pyridin-Extrakt enthielt etwa 12 Gew.-% Protein, etwa 12 Gew.-SS Zucker und etwa 45 Gew.-% Fettsäuren. Der Extrakt vnirde elektronenmikroskopisch untersucht, und es wurde festgestellt, daß er frei von Verunreinigungen in Form von Vollzellen und Zellwandfragmenten war. Die Ausbeute an pyridinlöslichem Extrakt betrug 9% (8,1 g).

Beispiel 2

Herstellung von pyridinlöslichem Extrakt aus M.bovis 'Stamm

B.bovis Stamm BCG wurde in Sautons-Medium bei 37°C während etwa 3 bis 4 Wochen gezüchtet und abgeerntet, woraufhin eine gewaschene, in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 hergestellte Vollzellpaste erhalten wurde. 50 g (Feuchtgewicht) der gewaschenen Paste wurden anschließend in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 behandelt, woraufhin ein pyridinlöslicher Extrakt in einer Ausbeute von 1% (3,5 g) erhalten wurde. Der Extrakt enthielt 15 Gew.-% Protein, 10 Gew.-% Zucker und 52 Gew*-% Fettsäuren.

Der pyridinlösliche Extrakt besitzt in Verbindung mit TDM und ACP in einem pharmazeutisch geeigneten Mittel eine hohe Wirksamkeit bei der Behandlung von Tumoren, wobei in den meisten Fällen eine totale Rückbildung des Tumors erreicht wird.

Claims

F α ν ε R ε." β "θ "ι ;ν : Cj γη' :-\ λχ S F PATENTANWALT !' F U UO Γ» t A N CAIENI ATtO ti M I MARIAHIlFPLATi: 'J Ä 3, MUNCHTN <K> POSTADRtSSE: PUuTFACH 9b CU HCl, D-HCH)D MDNCHtN Hi. RIBI IMMUNOCHEM RESEARCH, INC= 27. Jura 198? DEAA-31161-. 5 PHARMAZEUTISCHES PRÄPARAT

1. Pharmazeutisches Präparat, dadurch gekennzeichne-t , - daß es eine therapeutisch wirkungsvolle Menge an gereinigtem, aus einem Mikroorganismus erhaltenem, pyridinlöslichem Extrakt mit zwischen etwa 7 und 20 Gew„-% Protein, zwischen etwa 10 und 16 Gew.-% Zucker und zwischen etwa 35 und 55 Gew.-% Fettsäuren, Trehalosedimycolat, ein mit Azeton ausgefälltes Nebenprodukt von mit Chloroform-Methanol extrahierten ehdotoxischen Glykolipiden und einen pharmazeutisch geeigneten Träger enthält=

2. Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß der Extrakt aus den Mikroorganismen M. bovis BCG, H.phlei,

M. smeqmatis, M.Kansasii, Nocardia rubra, Corynebacterium diphtheriae oder Corynebacterium parvura, vorzugsweise aus Corynebacterium parvum, erhalten wird.

3. Präparat nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet daß der Extrakt etwa 12 GeWo-% Protein, etwa 12 Gev„ -·' Zucker und etwa 45 Gew.-% Fettsäuren enthält und daß die Menge an pyridinlöslichem Extrakt bis zu etwa 4O mg, die Menge an Trehalosedimycolat bis zu etwa 6 mg und die Menge des mit Azeton ausgefällten Neben-

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Produktes von mit Chloroform-Methanol extrahierten endotoxischen Glykolipiden bis zu etwa 20 mg beträgt, wobei das Präparat in lyophilisierter Form oder in Form einer Öltröpfchenemulsion vorliegt.

4. Präparat nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet , daß es sich bei dem Öl um ein leichtes Mineralöl, Squalan, Squalen, 7-n-Hexyloctadecan, Conoco Superöl oder Drakeol 6VR Mineralöl handelt, wobei das Öl in einer Menge von zwischen et\^a 0,5 und 3,0 Vol„-%, bezogen auf das Gesamtvolumen des Präparats, vorliegt.

5. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet , daß die Menge an Extrakt zwischen etwa 200 und 5000 /ü.g, die Menge an Trehalosedimycolat zwischen etwa 50 und 1000 yüg und die Menge an mit Azeton ausgefälltem Nebenprodukt zwisehen etwa 150 und lOOO ng beträgt.