DE2617870A1 - Pili von neisseria genorrhoeae und verfahren zu deren herstellung - Google Patents

Description

PiIi von Neisseria Gonorrhoeae und Verfahren zu deren Herstellung

Die Erfindung betrifft kristalline und aus einzelnen Stäbchen bestehende Produkte, die abgeleitet sind von den PiIi von Neisseria Gonorrhoeae-Organismen Typ 1 und Typ 2. Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Züchtung dieser Organismen unter Bildung einer maximalen Ausbeute an PiIi und Verfahren zur Reinigung dieser PiIi unter Bildung des kristallinen Produktes. Die Erfindung betrifft ferner die Anwendung dieser PiIi zur Bestimmung des Vorhandenseins von Antikörpern gegen die PiIi dieser Mikroorganismen in Systemen, die durch W. Gonorrhoeae infiziert werden können und Verfahren zur Charakterisierung(serotyping) dieser PiIi. · Die Erfindung betrifft auch einen Impfstoff, enthaltend das kristalline Material mit Hilfe dessen im wesentlichen eine Immunisierung gegen eine Infektion durch W. Gonorrhoeae bei Säugetieren, die für eine solche Infektion anfällig sind, erreicht werden kann.

Die durch den Organismus Weisseria Gonorrhoeae verursachte Infektion, die üblicherweise als Gonorrhoe bekannt ist, ist eine venerische Erkrankung (Geschlechts-

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krankheit), die bei Menschen außerordentlich weit verbreitet ist. Die Erkrankung manifestiert sich üblicherweise durch eine sichtbare Veränderung beim Mann, aber ist häufig unerkannt und nicht nachweisbar durch äußere Symptome bei der damit infizierten Frau. Das einzig zuverlässige Verfahren zum Nachweis einer solchen Infektion bestand bisher darin, daß man Ausfluß oder Schleimflüssigkeiten, von denen angenommen wurde, daß sie den Organismus enthielten,unter Kulturbedingungen hielt (culturing discharges or mucus fluids). Solche Kulturen erforderten einen Zeitraum von mehr als einem Tag um zu wachsen. Ua diese Krankheit gesellschaftlich in der Regel als Makel angesehen wird und aufgrund des Widerstandes vieler damit infizierter Personen, nach der Untersuchung wieder in die Klinik bzw. zu dem Arzt zu gehen, war es lange Zeit erwünscht, ein Untersuchungsverfahren zu entwickeln, das einen zuverlässigen Hinweis auf eine mögliche Infektion oder Nichtinfektion innerhalb einer Zeit liefert, während der es für die untersuchte Person zumutbar ist, in der klinik zu bleiben.

Bisher war auch kein Verfahren zur Immunisierung gegen eine lni'ektion mit dem Organismus N. Gonorrhoeae bei Menschen bekannt, üiines der größten Probleme, das mit Untersuchungen auf diesem Gebiet verbunden war, war die Tatsache, daß der Organismus nur Menschen und Schimpansen zu infizieren schien und, obwohl eine verhältnismäßig hohe Übereinstimmung zwischen den Ergebnissen bei Schimpansen und Menschen besteht, diese Übereinstimmung nicht absolut ist. Schimpansen sind, obwohl sie als lintersuchungsmodelle angemessen geeignet sind, für Versuchszwecke extrem teuer und aufwendig.

Es sind vier voneinander verschiedene Kolonie variant en von Neisseria Gonorrhoeae charakterisiert. Diese vier Varianten zerfallen in zwei unterschiedliche Kategorien. Die Varianten T^ und Tp führen zu einer experimentellen Infektion

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bei Freiwilligen, während von den Varianten T, und T_; nicht bekannt ist, dai3 sie zu Infektionen führen. Die erste Gruppe kann von der zweiten Gruppe unterschieden werden durch die Beobachtung, daß die erste Gruppe auf den Kolonien der Varxanten fadenförmige Gebilde besitzt, während die zweite Gruppe keine derartigen Fäden bzw. Haare besitzt. Diese Fäden werden als Gonokokken-Pili (im folgenden als' G.C. PiIi abgekürzt) "bezeichnet. 1973 wurden zwei Aufsätze veröffentlicht, die angeblich die Isolierung von T^ und 1'₂ PiIi von N. Gonorrhoeae zeigen und ferner die Bildung einer Antikörperreaktion darauf (Buchanan, et al., J. Clin. Invest. Band 52, Seiten 2896 bis 2909 (1973) und Punsalang und Sawyer, Infect. Immun. Band 8, Seiten 255 bis 263 (1973), siehe auch Buchanan, et al., J.Clin. Invest. Band 51.. 17A (1972). Das von Buchanan angewandte grundlegende Verfahren ist als Literaturstelle 41 in der Veröffentlichung von 1973 angegeben und von Charles C. Brinton (CC' Brinton, Trans. N.Y. Acad. of Sei. Band 27, Seite 1003 (1965) sowie von Punsalang und Sawyer entwickelt worden. Das Brinton-Verfahren wurde entwickelt zur Untersuchung der PiIi von E. CoIi. Es wurde nun versucht, die Arbeiten von Buchanan et al zu wiederholen und es hat sich gezeigt, daß nach dem dort angegebenen Verfahren bei allen Bemühungen keine PiIi von N. Gonorrhoeae erhalten werden konnten.

Bei einem Vergleich der von Buchanan et al angewandten Verfahren mit den erfindungegemäß angewandten Verfahren zeigte sich, daß die· von Buchanan angewandten Verfahren und die von Punsalang und Sawyer angewandten tatsächlich ausgezeichnet.geeignet sind, um G.C. PiIi von dem nach diesen Verfahren erhaltenen Produkt zu entfernen und wenn zufällig irgendeine immunologische Reaktion auf das angebliche Pilus-Material von dem Buchanan-Produkt aufgetreten ist, kann das nur der Fall gewesen seift aufgrund von Artifalsten oder Fehlern bei dem Verfahren, das ausgeführt werden sollte. .

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Es wird angenommen, daß Buchanan die Fehler seiner Arbeit bereits erkannt hat, obwohl zur Zeit noch kein Widerruf veröffentlicht worden ist.

Die Erz. _duiig betrifft die . Zurverfügungstellung von gereinigten PiIi vom Typ T. und T₂ Neisseria Gonorrhoeae-Organismen sowie deren T„-Subvarianten_fsoweit erwünscht, in kristalliner Form (im folgenden als GC-Piluskristalle bezeichnet).

G.G. PiIi werden entweder von einer Oberflächenkultur oder einer Tauchkultur(deepculture) des entsprechenden Organismus isoliert. Die Oberflächenkultur und Tauchkultur von N. Gonorrhoeae-Zellen sind im wesentlichen bekannt. Bei einer Modifikation des Verfahrens der Tauchkultur wird ein gegenüber der Reaktion inertes Medium mit einer großen Oberfläche zu der r^ulrur zugegeben,um".die Reinigung zu unterstützen. Eine Diatomeenerde wie Celit hat sich als geeignet erwiesen.

Im Falle von Oberflächenwachstum wird das gesamte Wachstum, d.h. die Zellen und PiIivon dem Kulturmedium entfernt und in einem wäßrigen Medium bei einem vorbestimmten pH-Wert unter 9,2 suspendiert. Wenn nur T^-Pili isoliert v/erden sollen, ist irgendein pH-Wert über 5,5 und unter 9,2 geeignet. Wenn T₁-PiIi entweder allein oder in Gegenwart von T' -PiIi isoliert werden sollen, ist ein pH-Wert unter 7,7 günstigerweise um ungefähr 7,0 erforderlich. Im Falle einer -Tauchkultur ist ein solcher Suspensionsschritt nicht erforderlich.

Es hat sich auch gezeigt, daß Piluskristalle unterhalb von 4,5 löslich sind und im wesentlichen rekonstituierbar, wenn der pH-Wert wieder über diesen Wert erhöht wird, vorausgesetzt, daß er nicht unter 2,5 verringert worden ist.

Die löslichen Teile 'der Suspension werden dann von den unlöslichen Teilen abgetrennt. Obwohl diese Trennung durch Filtration erreicht werden kann, ist es im allgemeinen bevorzugt, zu zentrifugieren. Die überstehende Flüssigkeit beim Zentrifugieren (und das Filtrat beim Filtrieren) wird verworfen und der

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Rückstand weiter verarbeitet. Bei der nächsten Stufe des Reinigungsverfahrens werden die Bestandteile der Gonokokken PiIi in Lösung gebracht und von dem unlöslichen Material abgetrennt, Im Falle einer Oberflächenkultur enthält dieses unlösliche Material ganze Zellen und Zelltrümmer und im Falle der Tauchkultur zusätzlich die Substanz mit der großen Oberfläche wie Celit.

Die Lösung der Gonokokken Piluskristalle kann auf zwei unterschiedliche ,aber nahe verwandte, Arten erreicht werden. Die Lösung der Gonokokken Piluskristalle hängt ab von dem Aufbrechen der nicht- kovalenten Bindungen zwischen den Pilus-Stäbchen, die das Peptid-Material enthalten, das einen Hauptteil der PiIi ausmacht, während die kpvalenten Bindungen intakt bleiben. Das heißt, es muß um Lösung zu erreichen, ein Mittel angewandt werden, das das Peptid nicht denaturiert sondern nur die Kristalle zu den einzelnen Pilus-Stäbchen aufbricht. Derartige Mittel können unabhängig sein von dem pH-Wert wie wäßriger Harnstoff, ausreichend Wasser,um die lonenkonzentration.eines wäßrigen Suspensionsmediums unter 0,002 m herabzusetzen, ausreichend Salz, günstigerweise Salze von Alkali- oder Erdalkalimetallen und Anionen von Mineralsäuren, um die Ionenstärke auf über 4,4 zu erhöhen, Harnstoff auf eine Konzentration zwischen ungefähr 3 und ungefähr 5 ia und ausreichend Saccharose, um die Konzentration auf über ungefähr 50 % (Gew./Vol.) zu bringen. Die Piluskristalle werden wieder ausgefällt durch Erhöhung der Ionenstärke über ungefähr 0,05 durch Zugabe von Alkali- und Erdalkälisalzen mit Mineralsäureanionen, die Zugabe von ausreichend Wasser·, um die Salzkonzentration unter eine Ionenstärke von ungefähr 0,5 herabzusetzen, ausreichend Puffer, günstigerweise mit Tris gepufferte Salzlösung, um ein Medium mit einer Ionenstärke von ungefähr 0,05 bis ungefähr 0,5 bei einem pH-Wert von ungefähr 4,5 bis ungefähr 9,2 zu erhalten bzw. ausreichend Wasser, um die Saccharosekonzentration unter 40 Gew.-% zu senken. Die Mittel

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können auch pH-abhängig sein, wie "basische Puffer wie ein Trispuffer, der den pH-Wert von ungefähr 9,3 auf ungefähr 11 erhöht für Tp-PiIi oder von ungefähr 7 auf ungefähr 8,6 für T₁-PiIi. Dieser Bereich wird "bestimmt durch den Beginn der Lösung am unteren Ende und dem Beginn der Gefahr einer Denaturierung am oberen Ende. Es wurde jedoch beobachtet, daß selbst wenn die Pilusstruktur durch dieses oder andere Verfahren soweit denaturiert wird, daß die PiIi nicht wieder kristallisieren, ihre antigenen Eigenschaften offensichtlich im wesentlichen nicht angegriffen werden.

iiach Zugabe des soivatisierenden Mediums zu dem oben erwähnten festen Rückstand werden der lösliche und unlösliche Anteil der zweiten Suspension erneut getrennt. Wie oben kann diese Trennung durch Filtration oder Zentrifugieren,günstigerweise durch Zentrifugieren, erreicht v/erden.

Das Zentrifugierverfahren kann entweder einfach oder modifiziert sein. Bei dem einfachen Zentrifugierverfahren wird die Suspension in eine Zentrifuge geleitet, die mit geringer Geschwindigkeit läuft, die überstehende Flüssigkeit gewonnen und der Rückstand beiseite gestellt. Wenn die Ausbeute erhöht werden soll, wird der Rückstand erneut suspendiert und zentrifugiert und der Rückstand verworfen und die überstehende Flüssigkeit mit der zuerst erhaltenen zusamrnengegeben. Die vereinigten Flüssigkeiten werden dann einer Zentrifugation mit hoher Geschwindigkeit unterworfen, ■ um die letzten Spuren von Zelltrümmern in dem Rückstand zu entfernen und die überstehende Flüssigkeit wird dann für die folgende Ausfällstufe zur Seite gestellt.

Bei der modifizierten Form des Zentrifugierverfahrens werden die in Lösung gebrachten PiIi, d.h. entweder die Suspensionen mit einem erhöhten pH-Wert oder diejenigen in einem wäßrigen nicht-kovalente Bindungen aufbrechenden Medium wie Harnstoff mit wäßrigem Caesium-chlorid vermischt. Da das Caesium-chlorid—

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Gradientenverfahren ein Zentrifugieren umfaßt, ist eine vollständige Abtrennung der Zelltrümmer nicht notwendig. Es wird jedoch eine sauberere Lösung erhalten, wenn entweder vorher x^Itriert oder zentrifugiert wird. Das Gemisch mit Caesium-chlorid wird dann auf die für Caesium-chlorid-Trennungen übliche V/eise zentrifugiert und die Absorption bei verschiedenen Dichtegradienten gemessen. Die Lage des Maximums, günstigerweise bei 280 mn gemessen, zeigt die Lage der Piluslösung an.

Bei Anwendung irgendeines der Zentrifugierverfahren werden die wäßrigen Fraktionen, enthaltend die Piluslösungen, auf eine Weise behandelt, die zur Ausfällung der Piluskristalle führt. Das kann erreicht werden, indem man den pH-Wert verringert, wenn vorher ein erhöhter pH-Wert angewandt worden ist oder durch Entfernung des die nicht-kovalenten Bindungen aufbrechenden Mittels des Caesium-chlorideoder wahlweise durch Zugabe eines Ausfällmittels wie Ammoniumsulfat. Die Ausfällbedingungen können entweder durch Dialyse oder direkte Zugabe erreicht werden.

Bei Verringerung des pH-Wertes und Entfernung des die Bindungen aufbrechenden Mittels entstehen GC-Piluskristalle. Die GC-Piluskristalle werden dann von dem wäßrigen Medium entfernt, entweder durch Filtration oder günstiger durch Zentrifugieren bei niedriger Geschwindigkeit. Die überstehende Flüssigkeit

wird abgetrennt und die so erhaltenen Piluskristalle unter vermindertem Druck getrocknet, soweit das erwünscht ist,oder in einem geeigneten wäßrigen Medium aufbewahrt. Während es günstig ist,

Temperatur

die Kristalle bei verringerter/in einem sterilen Medium aufzubewahren, scheint das zu ihrer Stabilität in Abwesenheit von bakteriellen Verunreinigungen nicht erforderlich zu sein.

Es ist festzustellen, daß die Piluskristalle tatsächlich Agglomerationen von einzelnen Pilusstäbchen mit einem hohen Molekulargewicht sind. So können, wenn das die gelösten PiIi enthaltende Medium durch Zentrifugieren mit hoher Geschwindigkeit und wenn erwünscht Sterilisation durch ein- Millipore-Filter (günstigerweise ca. 0,45 /um) gereinigt worden ist, die

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einzelnen Pilusstäbchen durch Zentrifugieren mit ultrahoher Geschwindigkeit, günstigerweise über 40 kg, abgeschieden werden.

Es hat sich auch gezeigt, daß wenn keine PiIi höchster' Reinheit erforderlich sind, ein bequemes und schnelles verkürztes Reinigungsverfahren zu zufriedenstellenden Ergebnissen führt. Bei diesem Verfahren wird, der gesamte Gonokokken-Wuchs in einen Puffer mit hohem pH-Wert,günstigerweise einen Äthanolaminpuffer bei einem pH-Wert über dem Lösungspunkt der jeweiligen Variante (T. oder T^), vorzugsweise ungefähr pH- 10,0, gegeben, um eine vollständige Lösung sicherzustellen. Die Feststoffe werden durch Filtrieren oder Zentrifugieren abgetrennt und der pH-wert gesenkt, günstigerweise, aber nicht notwendigerweise durch Dialyse.

z.B.

Tatsächlich führt die pH-Einstellung auf/pH 8,6 im ersten

Falle zum Auskristallisieren von Tp-Piluskristallen und ein weiteres Absenken auf unter pH 7,7, z.B. 7 zum Auskristallisieren von T.,-Piluskristallen. So zeigt sich in einer Stufe,die Art der jeweiligen wachsenden Variante. Das ist nur eine Bestätigung, da ein erfahrener Bakteriologe zwischen den beiden Formen durch Untersuchung ihrer Kolonien unterscheiden kann.

• V/ahlweise können die Piluskristalle auch ausgefällt werden durch Zugabe von Ammoriiumsulfat. Eine Anionen-Konzentration von ungefähr k bis 7 % der zur Sättigung erforderlichen Menge (bei Raumtemperatur) führt zur Ausfällung von IV-PiIi als Kristalle, während T.-PiIi bei einer Konzentration zwischen 5 und 10 % der Sättigung ausgefällt werden.

Die GC-PiIi wurden der SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese unterworfen und zeigen ein Haupt- und ein Webenband. Das Hauptband, das als GC-Pilin bezeichnet wird, enthält Phosphoglykoproteininaterial.

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iCs konnte ferner gezeigt werden, daß das Tp GC-Pilin einen Peptid-Anteil mit 200 + 9 Aminosäuren, zwischen 2 und 3 Phosphatgruppen und zwischen 1 und 2 Hexosezucker umfaßt und im wesentlichen in wäßrigen Medien bei einein pH größer als 10,1 löslich ist und im wesentlichen unlöslich in wäßrigen Medien mit einem pH-V/ert von weniger als 8,6, jeweils bei 20⁰C gemessen.

Der Hauptanteil der T₂-GC-PiIi, nämlich T₂-GC-Pilin besitzt ein Molekulargewicht, bestimmt durch SDü-Acrylamidgelülektrophorese von 21 500 + 1000 DaIton.

Die von N. Gonorrhoeae Typ T. isolierten GC-PiIi scheinen immunologisch den von N. Gonorrhoeae Typ Tp isolierten äußerst ähnlich zu sein.

Bei einem Vergleich erweisen sich die T^-GC-PiIi in wäßrigen Medien oberhalb einem pH-viert von ungefähr 8,5 im wesentlichen als löslich und in wäßrigen Medien mit einem pH-Vvert von weniger als 7,7 im wesentlichen als unlöslich, wobei der pH-wert jeweils bei 20⁰C gemessen ist. Das T,, GC-Pilin besitzt ein Molekulargewicht von 22 000 + 1 000, bestimmt nach der SDo-Acrylamidgel-Elektrophorese.

GC-PiIi wurden von Kulturen von mehr als 20 unterschiedlichen Stämmen von N. Gonorrhoeae isoliert. GC-Piluskristalle sowie Dinzelstäbchenpili und das Uluat von der SDS Acrylaraid-

/pnorese
gel~.Elektrc/führen zur Bildung von Antikörpern im Serum von Versuchstieren, wenn sie diesen injiziert v/erden.

'Wenn GC-Piluskristalle entweder als solche oder in einem geeigneten Suspensionsmedium mit einem Serum, enthaltend Antikörper, zusammengebracht werden, agglutinieren die Kristalle. Diese Agglutination kann leicht beobachtet werden, am günstigten in einem Dunkelfeldmikroskop aber auch mit Hilfe anderer Vorrichtungen, und stellt einen einfachen und sofortigen Test

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auf das Vorhandensein von Pilus-Antikörpem in dem Testserum dar.

Als Anwendungsbereiche für diesen Test sind zu erwähnen Untersuchung auf Gonorrhoe ,um Personen zur Durchführung von Kulturversuchen auszuwählen, Identifizierung von Risiko-Personen zur Unterscheidung von neuen und alten Infektionen bei einzelnen Personen, Identifizierung des Stammes,der für örtliche Epidemie verantwortlich ist und von Stämmen, die für spezielle Symptome verantwortlich sind.

JSs ist zu bemerken, daß während dieser Versuch geeignet ist zur Bestimmung des Vorhandenseins von Antikörpern gegen GC-PiIi in einer Testprobe, es nicht möglich ist, direkt festzustellen, ob die Person, von der das Serum entnommen ist, augenblicklich an Gonorrhoe leidet oder früher damit infiziert war und nur ein Träger von Antikörpern ist. Es ist ferner zu bemerken, daß bei einer Person, die erst sehr kürzlich infiziert worden ist (d.h. vor 2 oder 3 Tagen) keine positive Reaktion auftreten kann, da die Zeit nicht ausgereicht haben kann, um im Körper eine ausreichende Konzentration an Antikörpern zu bilden, um einen nachweisbaren Titer zu ergeben.

Es wurde festgestellt, daß die PiIi von ti, Gonorrhoeaeürganismen eine oder mehrere immunologische Determinanten enthalten aus einer Gruppe von zumindest vier derartiger Determinanten. So tritt die Antikörperagglutinationsreaktion ein zwischen PiIi und einem Serum, enthaltend Antikörper gegen mindestens eine dieser immunologischen Determinanten. Die Stärke der Reaktion hängt ab von der Konzentration der Antikörper in der zu untersuchenden Serumprobe und gleichzeitig der Zahl von in Wechselbeziehung tretenden immunologischen Determinanten auf den PiIi und in dem Serum.

Es ist so möglich, wenn man beispielsweise vier unterschiedliche GC-Pilus-Proben hat, von denen bekannt ist, daß sie mindestens eine der oben erwähnten Determinanten enthalten, leicht das Vorhandensein der entsprechenden Antikörper gegen

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GC-PiIi in jedem Testserum nachzuweisen.

Ähnlich können, wenn eine Organismusquelle zur Verfügung steht und leicht gezüchtet werden kann, die PiIi von diesen Organismen isoliert werden. Da standardisierte Sera, enthaltend Antikörper, gegen irgendeine vorbestimmte der vier antigenen Determinanten von GC-PiIi durch das erfindungsgemäße Verfahren verfügbar sind, können diese PiIi von der unbekannten, zu untersuchenden Quelle auf ihre Identität und die Anzahl dieser Determinanten darauf untersucht und bestimmt v/erden, (serotyped).

Dieses Verfahren hilft sehr bei der epidemiologischen Untersuchung des Infektionsweges von Gonorrhoe.

PiIi können auf verschiedenen Trägern,die für immunologische Untersuchungen bekannt sind, absorbiert werden, wie Latex, gewaschenen roten Blutzellen, Aktivkohle, Polyacrylamid, Agarose und ähnlichen, um Substrate für Agglutinationstests in Serum oder Plasma zu erhalten.

Die Verfügbarkeit von PiIi stellt auch die Grundlage dar für Untersuchungen der Hämagglutination und Hämagglutinations-Hemiüung. Beide 'Versuche beruhen auf dem Prinzip, daß PiIi spezifische bindende Stellen enthalten, die mit roten Blutkörperchen in· Wechselwirkung treten. So ergeben die roten Blutkörperchen, wenn PiIi und Blutkörperchen zusammen inkubiert werden, eine diffuse agglutinierte Perle beim Absetzen durch Schwerewirkung. Wenn keine PiIi in dem Testmedium vorhanden sind, setzen sich die roten Blutkörperchen ab und ergeben eine klare > definierte Perle beim Absetzen unter Einwirkung der Schwerkraft. Das stellt ein Mittel dar zur Untersuchung auf das Vorhandensein von PiIi in einer Lösung.

Bei dem Hämagglutinations-Hemmtest wird ein zu untersuchendes Serum, von dem angenommen wird, daß es Antikörper ge- · gen GC-PiIi enthält, zu einer Lösung zugegeben, enthaltend eine

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vorher bestimmte kenge PiIi,und das Gemisch wird inkubiert und zentrifugiert. Dabei v/erden die mit Antikörpern in Wechselwirkung tretenden PiIi ausgefällt. Die überstehende Flüssigkeit wird dann zu roten Blutkörperchen gegeben. Wenn alle PiIi mit den Antikörpern in der Probe reagiert haben, entsteht eine scharfe Perle, d.h. keine Agglutination, iis ist für den Fachmann verständlich, daß ein.solcher Test Aussagekraft besitzt, wenn er gegen Vergleichsproben (d.h. ohne Antikörper) und bei vorher bestimmten Verdünnungen durchgeführt wird.

Die Genauigkeit dieses Tests wird erhöht, wenn das Serum zunächst mit gewaschenen roten Blutzellen behandelt wird (d.h. vor der Zugabe zu den PiIi). Durch dieses Verfahren werden B'aktoren in dem Serum entfernt, die ohne Rücksicht auf das Vorhandensein von PiIi zu einer Agglutination der roten Blutzellen führen würden.

Bisher war keinerlei Immunisierung gegen U. Gonörrhoeae bei Menschen möglich, üs hat sich gezeigt, daß wenn Freiwilligen eine ausreichende Menge GC-Piluskristalle injiziert worden ist, günstigerweise in einer Menge von ungefähr 2 bis ungefähr 100 /Ug/kg Körpergewicht, um den Antikörpergehalt des Serums auf einen Titer von mindestens 100 bam PAT (Pilusagglutinationstest) zu erhöhen,- ein Schutz von mindestens 1,6 log Zyklen erzielt wurde. Das bedeutet, daß die Person durch eine Zahl von Organismen des Stamms, von dem die injizierten GC-Piluskristalle abgeleitet waren, nicht infiziert wurde, die ungefähr 1,6 Größenordnungen größer war als die Zahl,die erforderlich ist, um bei Vergleichspersonen, die nicht immunisiert sind, zu einer Infektion zu führen. Bei der Injektion von GC-Piluskristallen wurden keine toxischen Wirkungen, die auf die PiIi zurückzuführen sind, beobachtet. Personen mit einem Titer von bis zu 200 scheinen nicht angegriffen (infiziert) zu v/erden und die Versuchsprimaten (Rhesusaffen) wurden Titern von ungefähr 1C 000 bei dem PAT-Test ausgesetzt, ohne daß irgendwelche Krankheitserscheinungen beobachtet wurden. Es wurde ferner festgestellt, daß es ratsam zu

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sein scheint, die Injektionen von GC-Piluskristallen in einem geeigneten Medium über einen etwas längeren Zeitraum, günstigerweise bis- zu 5bzwJ3V/ochen durchzuführen. Die Verabreichung kann in 1 bis 5 Anteilen von GC-Piluskristallen Einzelstäbchenpili oder irgendeiner geeigneten Quelle für GC-Pilin erfolgen. Eine über einen Zeitraum durchgeführte Verabreichung ist günstig, jedoch nicht wesentlich. Diese Verabreichung führt nach und nach zu einem Aufbau von Antikörpern in dem System.

Es ist festzustellen, daß keine lokale negative Reaktion gegen die Kristalle an dem Injektionspunkt beobachtet wurde bei Personen, denen die Kristalle schon vorher verabreicht worden waren.

Im Hinblick auf das Vorhandensein der verschiedenen,oben erwähnten Antikörperdeterminanten ist es günstig, Piluskristalle, Einzelstäbchenpili oder andere Quellen für GC-Pilin zu verabreichen, enthaltendjede der bekannten Determinanten, um einen maximalen Schutz zu erzielen.

Herstellung von GC-Piluskristallen

Züchtung von If. Gonorrhoeae-Qr^ariismen pberflächenkultur

ijeisseria Gonorrhoeae kommt in vier Kolonieformen vor, die willkürlich als Typen 1' , T₀, T, und IV bezeichnet worden sind. Diese Bezeichnung ist jedoch allgemein anerkannt. Die Organismen vom Typ T^ und Tp sind die verursachenden Organismen für die Krankheit Gonorrhoe bei Menschen und nur diese Formen besitzen PiIi. Die unten angegebenen Verfahren sind anwendbar, auf die Züchtung von Organismen von dem Typ T. und Tp. Es ist zu bemerken, daß die Stämme von N. Gonorrhoeae isoliert werden können aus Körpersekreten von Menschen. Diese Sekrete enthalten üblicherweise nicht nur die gewünschten Arten T,. und Tg sondern auch die keine PiIi bildenden Arten T₃ und T^, Ferner ist fest-

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zustellen, daß eine Kultur, die als beispielsweise verhältnismäßig reine Tp-Kultur angesetzt wird, im Laufe der Zeit bei der Bildung von Unterkulturen Organismen vom Typ T^ und Τλ, die ? \ , keine PiIi "bilden _χ sowie vom Typ T₁, bildet.

Bei der Kultur von T^-und Tp-Kolonievarianten wird eine dritte pilibildende Variante, die willkürlich als T_R bezeichnet wird, beobachtet. Diese Variante besitzt ein grobes Aussehen

nicht
und obwohl sie/vollständig charakterisiert ist, wird angenommen, daß sie eng mit den T.-und Tp-Arten verwandt ist und diese Arten erhalten worden sind durch Anlegen von Unterkulturen von Tß-Kolonien. Die Ausbeute an PiIi von T^-Arten ist die gleiche wie von Tp-Kulturen.

Um eine maximale Bildung von entweder T2~oder T₁-PiIi zu erreichen, sollten verschiedene vorausgehende Verfahren angewandt v/erden.

Die ursprünglichen Proben werden auf Thayer Martin (T-M)-Platten gezüchtet, die das Wachstum von ti. Gonorrhoeae ermöglichen und das Wachstum der meisten anderen Bakterien hemmen. Da T-M-Platten nicht geeignet sind zur Unterscheidung von · Koloniearten, werden Kolonien von den T-M-Platten auf geeignete Wachstumsmedien ausgestrichen (z.B. GC-Medium, Katalog Nr. 0289-1 Difco). Eine Folge von Unterkulturen wird dann aus einzelnen Kolonien auf dem Medium (im folgenden als GC-Medium bezeichnet) hergestellt, bis die Kolonien mehr als ungefähr 90 % der gewünschten Art umfassen. Während das Verfahren gleich gut für die Art T₁ angewandt v/erden kann wie für die Art Tp und wie gezeigt werden konnte die ArIaIC₁ und IV, immunologisch ähnlich sind, ist es bevorzugt, die Arten getrennt zu halten. Im folgenden wird Tp diskutiert. Soweit nicht ausdrücklich Unterschiede angegeben sind, sind die Züchtungsverfahren für T^ gleichermaßen anwendbar auf T₁. Wenn der Wuchs . auf einer Platte zu mehr als 90 % aus beispielsweise Tp-Kolonien besteht, wird der gesamte Wuchs von der Platte entfernt und in einem

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geeigneten Medium zum Gefrieren z.B. BSA-Glutamin suspendiert, in gleiche Anteile aufgeteilt und unter verminderter Temperatur günstigerweise bei ungefähr -70 bis -196⁰C aufbewahrt.

Es ist zu beachten, daß,wie oben gesagt, Proben mit einem anfangs hohen Anteil Tp dazu neigen, bei der Züchtung von Unterkulturen instabil zu werden und geringere Mengen an Tp zu er- · geben. Daher muß bei der Züchtung der Kulturen einerseits darauf geachtet werden, einen hohen Anfangsgehalt an Tp-Organismen . sicherzustellen und andererseits einen ausreichend "jungen" Stamm zu verwenden, d.h. einen, der noch nicht zu oft in Unterkulturen gezüchtet worden ist, um das Auftreten von Instabilität zu vermeiden. Wenn T^-PiIi gebildet werden sollen, ist es noch wichtiger als im Falle von Tp, ein Inokulum zu verwenden, das mehr als 90 % T₁ enthält.

Das Inokulum für die Pilusbildung wird hergestellt durch Ausstreichen der ersten, günstigerweise aber nicht notwendigerweise gefrorenen Anteile auf ein GC-Medium in Petri-Schalen und 12 bis 24 Stunden langes Inkubieren; 12 bis 15 Stunden für Stämme mit instabileren Tp-Arten und 12 bis 24 Stunden für Stämme mit stabileren Tp-Arten. Es ist bevorzugt, das Inokulum bei einer Temperatur von 35 bis 37⁰C zu züchten, obwohl 35⁰C bevorzugt sind. Eine hohe Feuchtigkeit ist ebenfalls bevorzugt. Bei Feuchtigkeitsgehalten von weniger als 70 % hat es sich gezeigt, daß die Pilusausbeute geringer wird als bei höheren Feuchtigkeitswerten. Es scheint daher günstig zu sein, bei einer Feuchtigkeit zwischen 70 und 90 % zu arbeiten. Während die Einwirkung der Atmosphäre auf das Wachstum noch nicht ganz geklärt ist und ältere N. Gonorrhoeae-Kulturen ohne Zusatz von Kohlendioxid wachsen, hat sich eine Atmosphäre mit einem Gehalt von 5 bis 10 % Kohlendioxid und 90 bis 95 % Luft als äußerst ge- . eignet erwiesen.

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Wach der anfänglichen Beimpfung, wenn die Platte mit ungefähr 50 bis ungefähr 75 % Wuchs bedeckt ist, wird dieses Wachstum entfernt. Bei einem geeigneten Verfahren wird eine kleine Menge einer sterilen Casaminosäurenlösung zu der das Inokulum enthaltenden Platte zugegeben und der Wuchs mit einem sterilen Glasspachtel abgekratzt. Ss hat sich als günstig erwiesen, 5 bis 6 ml Lösung pro Platte zu verwenden und 2 bis 3 ml der so hergestellten Suspension reichen aus, um die größeren Wachstumsschalen mit dem GC-Medium zu beimpfen. Die Schalen werden dann etwa die gleiche Zeit unter den gleichen Bedingungen wie die Petri-Schalen mit dem Inokulum inkubiert und die PiIi davon gewonnen.

Zu diesem Zeitpunkt des Verfahrens ist es nicht mehr erforderlich, unter sterilen Bedingungen zu arbeiten, obwohl es natürlich, wie bei allen Verfahren, günstig ist, saubere Geräte und reine Reagenzien zu verwenden und alle Operationen bei so niedrigen Temperaturen wie möglich durchzuführen, um ein unerwünschtes Bakterienwachstum zu verhindern.

Der Gonokokkenbewuchs wird mit Hilfe eines geeigneten Puffers gewonnen. Während die chemische Natur des Puffers nicht kritisch ist, ist der pH-Bereich wichtig. Aus Gründen, die noch deutlich werden, kann zur Reinigung von Tp-PiIi kein Puffer angewandt werden mit einem pH-Bereich über 9,3. Es ist bevorzugt, in einem pH-Bereich zwisehen 5,5 und 9,2 zu arbeiten. Am günstigsten im Bereich von 7,0 bis 8,6. Wenn eine überwiegend aus T^·bestehende Kultur angewandt w rd , sollte der pH-Wert nicht über 7,7 hinausgehen- sondern sollte im Bereich von 5,5 bis 7,5, günstigerweise 7,0 bis 7,2 liegen. Diese Bereiche stellen sicher, daß das gesamte pilierte (mit PiIi bzw. Haaieiversehene) Material im festen Zustand verbleibt. Als am besten geeigneter Puffer ist mit Tris(2-Amino-2-hydroxymethyl-1,3-propandiol) gepufferte Salzlösung zu erwähnen.

Bei einer bevorzugten Arbeitsweise wird der zum Waschen verwendete Puffer auf die Oberfläche des Vachstumsmediums ge-

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geben und der Bewuchs mit einem geeigneten Instrument von dem Medium abgenommen und die wäßrige Suspension auf geeignete V/eise, z.B. mit Hilfe einer Pipette oder einer Vakuumansaugvorrichtung entfernt. Wenn es erwünscht ist, kann ein zwei- ' ter Waschvorgang auf die gleiche Weise durchgeführt werden und die wäi3rigen Suspensionen zusammengegeben werden.

Um die Ausbeute zu erhöhen, kann ein dritter Waschvorgang durchgeführt v/erden mit einem Puffer mit hohem pH-Wert, das heißt,eineaPuffer mit einem pH-Wert über 9,3» günstigerweise zwischen 10,1 und 10,3. Die Anwendung eines solchen Puffers führt zur Lösung des gesamten restlichen Pilimaterials. Wenn die Isolierung von- T.-PiIi infrage kommt, muß der pH-Wert nur über ungefähr 8,6 hinaus gehen. Es treten jedoch bei höheren Werten keine Nachteile auf. Diese basische Suspension wird nicht mit den beiden ersten Waschsuspensionen zusammengegeben sondern für eine spätere Stufe des Reinigungsverfahrens aufbewahrt. Es ist zu bemerken, daß wenn die PiIi gut gewachsen sind, der Bev/uchs eine charakteristische orange-rosa oder warniv -rosa Farbe besitzt und das Wachstumsmedium einen Geruch, der an das Kochen von Lebensmitteln erinnert. Es wird bemerkt, daß der Bewuchs zu klebri-

/seilartigen

gen/Aggregaten zusammenklumpt und leicht von dem Wachstumsmedium abgestreift werden kann, wenn er mit einem^eigneten Instrument, z.B. einem Glasspachtel weggeschoben wird.

Während die oben angegebenen Verfahren günstig sind, wenn hohe Ausbeuten an sehr reinen PiIi erwünscht sind, werden auch annehmbare Ergebnisse erhalten durch ein wesentlich kürzeres Verfahren. Bei diesem Verfahren werden die oben angegebenen ersten und zweiten Waschvorgänge nicht durchgeführt. Der gesamte Bewuchs wird mit einem Puffer mit wesentlich höherem pH-Wert, günstigerweise einem Athanolaminpuffer entsprechend der dritten waschstufe, behandelt. Das Waschmedium enthält neben den gelösten PiIi viele Verunreinigungen, die sonst entfernt werden. Es hat sich jedoch gezeigt, daß diese Verunreinigungen beim Ausfällen des Pilusrnaterials auf

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C - 18 -

die unten beschriebene Weise in Lösung gehalten werdttf? « /870

-Tauchkultur von N. Gonorhoeae-Organismen

Die Tauchkultur der Organismen vom Typ T^·und T₂ in flüßigem Medium wird auf übliche Weise durchgeführt unter Anwendung eines Mediums und einer Umgebung, die identisch sind mit denjenigen, wie sie für die Oberflächenkultur angewandt werden, außer daß das Medium keinen Agar als Verfestigungs- ■ mittel enthält. Es hat sich gezeigt, daß die Organismen kontinuierlich PiIi bilden und wachsen. So enthält einTauclikulturmedium viel suspendiertes Pilimaterial. Wenn Tp-KuItüren bei einem pH-Wert gezüchtet werden, der üblicherweise unter 9,3 liegt, tritt keine unerwünschte Lösung der PiIi ein. Bei der Züchtung yon T^-Organismen kann der pH-Wert über 7,7 steigen, da vor dem Aufarbeiten, wie später beschrieben, der pH-Wert auf einen Bereich von 5,5 bis 7,7, vorzugsweise ungefähr 7,0 bis 7,2 eingestellt werden sollte. Obwohl es nicht kritisch ist, ist es bevorzugt, eine solche Einstellung einige Stunden, beispielsweise 8 bis 20 Stunden, vor dem Aufarbeiten durchzuführen, um eine Kristallisation der teilweise gelösten T,,-PiIi sicherzustellen.

Sowohl bei T.-als auch bei Tp-KuItüren ist es günstig, aber keinesfalls wesentlich, das Wachstum in einem leicht bewegten Medium in Gegenwart einer kleinen Menge Diatomeenerde, wie Celit, stattfindenzulasseii. Die Menge an beispielsweise Celit sollte günstigerweise zwischen ungefähr 0,1 und ungefähr 0»5 %, günstigerweise bei ungefähr 0,3 Gew.-/&, bezogen auf das Wachstumsmedium, liegen.

Reinigung der PiIi Trennung von Piluskristallen von dem Wachstumsmedium

Es ist zu bemerken, daß die Waschflüssigkeiten von dem Oberflächenwachstum von N. Gonorrhoeae-Organismen Substanzen enthalten, die darin löslich sind und die für die Isolierung der GC-Piluskristalle nicht von Interesse sind. Ähnlich trifft das

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Gleiche für das Tiefen-Wachsturn von flüssigen Kulturen'zu. Im Falle von Überflächenwachstum ist die Flüssigkeitsmenge von den Waschlösungen (nur erste und zweite Waschlösung), bezogen auf die Menge der gewachsenen Organismen, verhältnismäßig ·. ■ · klein. Es ist bevorzugt, die gesamte Waschsuspension bei verhältnismäßig geringer Geschwindigkeit zu zentrifugieren. Die Zentrifugiergeschwindigkeit und die Drehzeit sind keineswegs kritisch. Es hat sich jedoch als günstig erwiesen, bei ungefähr 1000 bis 12000g (im folgenden als 1 kg und 12 kg geschrieben) ungefähr 5 bis ungefähr 30 Minuten, vorzugsweise bei 3 kg ungefähr 10 bis ungefähr 15 Minuten zu zentrifugieren. Der Rückstand in der Perle enthält sowohl Zellmaterial als auch Pilimaterial, die beide in dem festen Rückstand vorliegen und die überstehende Flüssigkeit wird verworfen. Die überstehende Flüssigkeit enthält wesentliche Mengen an Verunreinigungen sowie kleine Mengen an PiIi, die zu gewinnen, sich nicht lohnt.

Wenn eine Tauchkultur angewandt

wird, ist das Flüssigkeitsvolumen ziemlich groß und daher kann ein Zentrifugieren mühsam sein. Die Anwendung eines Diatomeenerde-Sandwich-Filters hat sich zum Konzentrieren der gewachsenen Produkte aus Tauchkul türen als geeignet erwiesen. Bei diesem Verfahren wird ein sehr grobes Filterpapier auf die Filterunterlage, günstigerweise eine Sinterglasscheibe oder eine Buchner-Oberfläche gelegt, eine Schicht von Diatomeenerde, günstigerweise Celit mit einer Dicke von ungefähr 2 bis ungefähr 5 mm auf das Papier gegeben und mit einem zweiten groben Filterpapier bedeckt. Das Celit dient als tatsächliches Filtermedium, während das obere Filterpapier nur als Schutz für die Oberfläche dient. Die Kulturbrühe,deren pH-Wert überprüft worden ist, um sicherzustellen, daß die PiIi in kristalliner Forin voi\Liegen, wird durch das Filterkissen filtriert und das Filtrat verworfen. Die vereinigten Rückstände werden in beispielsweise einem Puffer mit hohem pH-vVert, der ähnlich ist demjenigen, wie er für den dritten Waschvorgang bei der Oberflächenkultur angewandt wird, aufgenommen und diese Suspension mit ungefähr 1 bis ungefähr 12 kg zentrüugjet In diesem Falle enthält die Zentrifugierperle natürlich

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den Diatomeenerdeträger und die Zelltrümmer und das Pilusmaterial findet sich in der überstehenden Flüssigkeit.

Zu diesem Zeitpunkt ist es günstig, das GC-Pilusmaterial von den Zelltrümmern abzutrennen und im Falle einer Tauchkultur aucfcrvon der Diatomeenerde.

Im Falle einer Oberflächenkultur kann eine Perle von den Waschflüssigkeiten mit'niedrigem pH-Wert abzentrifugiert werden durch Zugabe eines wäßrigen Mediums, das die nicht kovalenten Bindungen zwischen den Pilusstäbchen in dem System aufbricht, während die kovalenten Bindungen intakt bleiben. Dadurch werden die Piluskristalle zu in Lösung gebrachten Einzelstäbchenpili gelöst. Ein solches Medium kann eine Erhöhung des pH-Werts erforderlich machen oder kann es erlauben, daß der pH-Wert unverändert bleibt. Wenn das Lösen durch eine pH-Änderung erreicht v/erden soll, wird zu dem Rückstand ein geeigneter Puffer mit mäßig hohem pH-Wert zugesetzt. Es ist günstig, daß der Puffer einen pH-Wert zwischen 9,3 und 11, vorzugsweise zwischen 10,0 und 10,4 besitzt. Bei höheren pH-Werten besteht die Gefahr der Denaturierung der Peptidet'Wenn T.,-PiIi von Tp-PiIi in der ursprünglichen Feststoffperle getrennt werden sollen, wird zunächst ein Puffer angewandt, dessen pH-V/ert größer ist als ungefähr 7,7 aber kleiner als ungefähr 9»3. Die Suspension wird dann zentrifugiert und die dabei entstehende überstehende Flüssigkeit kann zur Seite gestellt oder verworfen v/erden, je nach den Anforderungen des Verfahrens. Wenn angenommen wird, daß die ursprüngliche feste Perle wesentliche Hengen an Tp-PiIi enthielt, wird frischer Puffer mit einem höheren pH-Wert, nämlich über ungefähr 9,3 zugesetzt, wobei eine flüssige Phase, enthaltend die T₂-PiIi, jedoch frei von T^-PiIi, entsteht. Die tatsächliche Zusammensetzung des in dieser Stufe angewandten Puffers ist nicht kritisch. Ein Puffer von Tris in Salzlösung ist jedoch besonders bevorzugt. Bei den beiden"oben angegebenen Modifikationen wird zu den Gesamtfeststoffen ein Puffervolumen zugesetzt, das ungefähr dreimal so groß ist,- wie das Volumen der Feststoffe. Diese Menge ist v/ieder nicht kritisch, hat sich je-

+) Bei diesem pH-Wert gehen sowohl T₁- als

auch T₂-Pil^_§J^l^ ^g ^Lösung. .._/21

doch als ausreichend erwiesen, um das Pilusmaterial zu lösen,;'⁷ ohne daß übermäßige Volumina des wäßrigen Mediums angewandt^,.·', werden müssen. Wenn die PiIi von einer Qberfläch'enkultuivfstammen-un4 diese Kultur 'einer 'dritten 'Waschstufe mit 'einemiähnrfi;

^: /worden ^: '" '·'■·' ·" '&$& liehen Puffer mit hohem pH-Wert unterworfen'ist, kann diese v$ V/aschflüssigkeit jetzt zugegeben werden. Die Perle wird dann''"·" in dem wäßrigen Medium suspendiert. Das Verfahren, nach^;jdem'^fe die Perle in Suspension gebracht wird, ist nicht kritisch^uncl·* es kann eine kurze leichte Beschallung (Sonication), einr^;'^ langes magnetisches Rühren, Handpipettieren, Handmischen, T-":. Turbulenzerzeugung öden !mechanisches Rühren angewandt werden.,-

Es hat. sich als günstig erwiesen, einige Sekunden'λ-v··-^^'' mechanisch zu rühren. Während die Art, in der die Suspension ·. hergestellt wird, nicht kritisch ist, ist es wichtig,' daß,'■'"-■"? welches Verfahren auch immer angewandt wird, die Zellen nicht' aufgebrochen werden, da ein Aufbrechen der Zellen zu einem
Eindringen unerwünschter Substanzen in die wäßrige Schicht .
'führen.würde. Wenn Zellen aufgebrochen sind, wird das bemerkt, indem eine schichtförmige Perle mit einer roten Schicht,über"
dem weißen Anteil bei dem anschließenden Zentrifugieren auftritt. Das suspendierte Material wird dann zentrifugiert. Die
Art des Zentrifugierens ist nicht kritisch. Die oben für die
erste Zentrifugeerung angegebenen Bedingungen haben sich jedoch als geeignet erwiesen. Statt zu zentrifügiere^kann man auch
filtrieren.

Die gelösten PiIi finden sich in der überstehenden
Flüssigkeit oder in dem Filtrat, woraus sie durch Erniedrigung des pH-Wertes ausgefällt werden können. Der Grad der pH-Wert-Erniedrigung hängt natürlich davon ab, ob T^-oder T^-PiIi anwesend' sind. Wahlweise kann die Ausfällung erreicht werden
durch Zugabe von ausreichend Ammoniumsalz, günstigerweise
einem Salz einer Mineralsäure, wie dem Sulfat, vorzugsweise in • wäßriger Lösung_t um eine Ainmoniumsulfatkonzentration von .ungefähr 4 5ό, bezogen auf die Sättigung ,bis ungefähr 10 56, bezogen auf die Sättigung, zu erreichen. Um jedoch die Ausbeute und die

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Reinheit zu verbessern, hat es sich als günstig erwiesen,-.vor--." der Ausfällung noch weitere Stufen durchzuführen. '-^v'-VVri*::;:/;

Bei der Durchführung dieser zusätzlichen Stufen-'-zui;^Er-v-l "höhung'der Ausbeute und Reinheit werden sowohl die überstehen— de'Flüssigkeit als auch die Perle (der abgesetzte Feststoff)/' von dem Zentrifugieren bei hohem pH-Wert oder der Filtration zurückgehalten; Die Perle von dem Zentrifugieren bei.hohem ";': pH-Wert wird erneut suspendiert, günstigerweise in dem glei- . chen wäßrigen Medium bei dem gleichen pH-Wert auf die gleiche Weise und die· Suspension erneut auf die gleiche Weise zentrifugiert. Nach diesem Zentrifugieren wird die Perle verworfen/ und die überstehenden Flüssigkeiten von den beiden Zentrifugierschritteri zusammengegeben und erneut zentrifugiert.

Der Grund für das erneute Zentrifugieren besteht darin, restliche suspendierte Verunreinigungen zu entfernen. Das Zentrifugieren wird daher mit höherer Geschwindigkeit durchgeführt als vorher. Geschwindigkeiten zwischen 12 und.70 kg ■ innerhalb von 30 bis 60 Minuten sind geeignet. Es ist im allgemeinen jedoch bevorzugt, mit Geschwindigkeiten von ungefähr 27 bis ungefähr 40 kg 60 Minuten zu zentrifugieren.

Die Perlen werden verworfen und die überstehende Flüssigkeit gewonnen.

In dieser Stufe ist es üblicherweise günstig, die Piluslösung zu sterilisieren. Durch bestimmte FDA-Regeln für bestimmte Zwecke ist das erforderlich. Eine derartige Sterilisierung kann leicht erreicht werden, indem man die Piluslösung unmittelbar vor der Ausfällung durch ein Mülipore-Filter leitet, wobei sich ein Filter mit einer Porengröße von 0,45 /um als besonders geeignet erwiesen hat. Anschließend müssen die Produkte selbstverständlich unter aseptischen Bedingungen gehandhabt werden, wenn die Sterilität aufrechterhalten bleiben soll.

Unter bestimmten Umständen kann es günstig sein, die PiIi in Form von einzelnen Stäbchen zu isolieren und nicht in Kristall-

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form. In diesem Falle wird die überstehende Flüssigkeit erneut in einer Zentrifuge mit ultrahoher Geschwindigkeit zwischen 60 und 166, günstigerweise 106 kg 2 bis 4 Stunden zentrifu-' -;ΐ , giert, wobei die PiIi in Form einzelner Stäbchen eine Perle -,*.;■·>; bilden. - . . · -. r- ;-_;,i^rJ

Die PiIi werden erneut ausgefällt durch Herabsetzung des pH-Wertes der überstehenden Flüssigkeit auf unter 9,1.. Es hat . sich gezeigt, daß die besten Ergebnisse bezüglich der Art des.7 kristallinen Materials erhalten wurden durch Dialyse 'gegen ?. j;]:;I, einen Puffer mit entsprechend niedrigem pH-Wert. Es 'hat sich.'-' als günstig erwiesen, einen Puffer mit einem Anfangs-pH-Wert.--^.'. zwischen 8,3 und 8,6 für T₂-PiIi anzuwenden, während die ehe- ^v mische Natur des Puffers nicht kritisch ist. Mit Tris gepufferte Salzlösung hat sich als geeignet erwiesen. Die Dialyse wird" günstigerweise durchgeführt, indem man einen etwa 30-bis 60-fachen, günstigerweise ungefähr 40-fachen Überschuß anwendet. Die Dialyse wird unter magnetischem Rühren des äußeren Dialysemediums ungefähr 12 bis ungefähr 18 Stunden lang durchgeführt. Es ist bevorzugt, die Dialyse bei verminderter Temperatur d.h.;., einer Temperatur von ungefähr O bis ungefähr 10⁰C durchzufüh- .·' ren. Dieser niedrigere Temperaturbereich verringert das Auftreten von unerwünschten bakteriellen Verunreinigungen. Es ist auch zu bemerken, daß der pH-Wert des Puffers temperaturabhängig ist, d.h., wenn der pH-Wert des Puffers gemessen " wird nachdem das System auf die Arbeitstemperatur abgekühlt ist, kann es sich zeigen, daß der pH-Wert bis auf 9,1 gestiegen ist. Es werden jedoch immer noch befriedigende Ergebnisse erhalten. Es ist ferner festzustellen, daß es nicht allgemein notwendig ist, den Puffer zu wechseln, wenn ein Überschuß an· Puffer in dem angegebenen Bereich angewandt wird. Die Kristallsuspension wird dann weiterverarbeitet, um die Piluskristalle abzutrennen. Die günstigste Abtrennung wird durch Zentrifugieren bei.mäßiger Geschwindigkeit erreicht. Ungefähr 60 Minuten langes Zentrifugieren mit ungefähr 3 bis ungefähr 8 kg hat sich als geeignet erwiesen. Die überstehende Flüssigkeit wird dann verworfen.

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. 809853/1057 :;^κλιτ«psctsd '

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Wenn die Piluskristalle noch weiter gereinigt werden sollen, kann das Lösen, Zentrifugieren mit hoher Geschwin-digkeit, Dialyse und erneutes Zentrifugieren zwei- oder. ■. dreimal wiederholt werden. · ■'""'"-

Wenn die Piluskristalle nicht sofort verwendet wer- .·.- „ den sollen, hat sich ungeachtet der Sterilisierung durch Filtration die Zugabe von Konservierungsmitteln als gün- ' : stig erwiesen. Es ist günstig, daß das Konservierungsmittel nicht zu den Piluskristallen selbst oder zu einer Lösung, in der sie enthalten sind, zugesetzt wird, sondern zu dem Dialysepuffer zur Herabsetzung des pH-Wertes der Lösung. Wenn das zugesetzte Konservierungsmittel mit dem Puffer unverträglich ist, kann nachdem die Piluskristalle kristallisiert sind, der unverträgliche Puffer durch Dialyse gegen einen verträglichen Puffer entfernt* werden und eine weitere Dialyse durchgeführt werden mit Hilfe des Konservierungsmittels und des neuen Puffers. Zu den Konservierungsmitteln, die angewandt werden können, gehören Formaldehyd, Merthiolat und Azid. Diese Konservierungsmittel werden in Mengen von ungefähr 0,02 bis ungefähr 0,05 % angewandt.

Jedes der angegebenen Konservierungsmittel besitzt bestimmte nachteilige Wirkung. Formaldehyd führt zu einer Vernetzung zwischen den Pilusstäbchen. Sie können dadurch nicht mehr wie vorher gelöst v/erden. Merthiolat besitzt keine Vernetzungswirkung und die Kristalle können erneut gebildet werden. Solch erneut gebildeten Kristalle besitzen jedoch eine verringerte Fähigkeit, in Gegenwart von Antikörpern gegen die PiIi zu agglutiniereii. Die Antigenwirkung wird jedoch nicht beeinflußt, d.h., wenn sie Versuchspersonen injiziert werden, führen sie zur Bildung von anscheinend normalen Antikörpern gegen die PiIi. Azid ist ein sehr günstiges' Konservierungsmittel, da es weder die Kristallstruktur angreift noch die Antigenwirkung oder die Agglutination. Ungünstigerweise ist es toxisch und kann nicht ange-

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wandt werden, wenn die Piluskristalle Menschen injiziert werden sollen. Die Kristallzubereitung wird günstigerweise bei niedrigen Temperaturen, d.h. bei ungefähr 1 bis 4⁰C aufbewahrt. Wenn jedoch eine längere Lagerung infrage kommt, ist es bevorzugt, die Kristalle in einem geeigneten Puffer mit hohem pH-Wert zu -.'·,.

zu filtrieren -*f'^

lösen, durch ein Millipore-Filter/und in Losung unter sterilen;;^; Bedingungen aufzubewahren. Wenn die PiIi in Kristallform erforderlich sind, ist es bevorzugt, die Kristalle dadurch wieder zu bilden, daß man den pH-Wert auf einen für die T.-oder T₂-PiIi entsprechenden Wert für die Kristallisation erniedrigt.Wenn möglichst gute Bedingungen für eine Konservierung erzielt werden sollen, können Sterilisierung und Konservierung gleichzeitig angewandt werden. . .-".·■

Reinigung der PiIi durch Lösen bei konstantem pH-Wert

Das zur Reinigung der PiIi bei konstantem pH-Wert angewandte Verfahren ist im wesentlichen das gleiche wie es oben für. unterschiedliche pH-Werte angegeben ist. Als Mittel zum Lösen ^können wäßrige Lösungen von beispielsweise Salzen, günstigerweise Alkali- und lOrdalkali salzen mit Anionen von Mineralsäuren mit einer lonenstärke über 0,5, günstigerweise zwischen ungefähr 4,0 und ungefähr 5,0, besonders von ungefähr 4,4,Harnstoff mit einer Konzentration zwischen 3 und ungefähr 5 m, Saccharose mit einer Konzentration über 50 Gew.-^c/o und schließlich Wasser selbst angewandt werden, wenn die Ionenstärke der Lösung unter 0,002 m herabgesetzt wird.

Bei einer Modifikation dieser Arbeitsweise wird statt die beim ersten Zentrifugieren erhaltene Perle,die ZelLen, PiIi und Zelltrümmer enthält, in einem Medium mit hohem pH-Wert zu suspendieren, irgendeines der oben genannten Mittel unter den angegebenen Bedingungen angewandt. Die Suspension wird wie oben mit geringer Geschwindigkeit zentrifugiert. Wenn eine höhere Ausbeute erwünscht ist, wird die überstehende Flüssigkeit von der langsamen Zentrifugation zur Seite gestellt, die Perlen

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erneut in einem ähnlichen Medium suspendiert, erneut .zentrifugiert und die dabei erhaltene überstehende Flüssigkeit mit der vorhergehenden überstehenden Flüssigkeit zusammengegeben.und mit hoher Geschwindigkeit zentrifugiert. Die Perlen von dem/' Zentrifugieren bei hoher Geschwindigkeit werden verworfen und ^ die überstehende Flüssigkeit gegen einen geeigneten Puffer,^:,'■■-'-■■;« dialysiert, um das Lösungsmittel zu entfernen. ·

So wird, wenn das die Lösung ermöglichende Mittel Saccharose oder Salz hoher Konzentration ist, die Ionenstärke auf einen Wert unter 0,5 für das Salz und unter 40 % für Saccharose herabgesetzt. Im Falle von Harnstoff wird der Harnstoff gegen einen geeigneten Puffer,z.B. mit Tris gepufferte . Salzlösung dialysiert, um eine Ionenstärke zwischen 0,05 und 0,3 bei einem pH von 7,0 oder 8,3 zu erhalten, je nachdem ob T,- oder Tp-PiIi verarbeitet werden. Ähnliche Verfahren werden angewandt, wenn das die Lösung herbeiführende Mittel Wasser ist, um die Ionenstärke auf mindestens 0,05 zu erhöhen.

Die für diesen Zweck angewandten Puffer sind die gleichen wie sie bei der Reinigung bei verschiedenen pH-Werten angewandt v/erden und sie werden auf die gleiche weise angewandt.

Reinigung von GC-PiIi durch Zentrifugieren mit einem Dichtegradienten

Das Zentrifugieren unter Ausnutzung des Dichtegradienten wird durchgeführt, indem man ein Gemisch von PiIi und wäßrigem Caesiuin-chlorid zusammen zentrifugiert und die optische Dichte bei einer vorgegebenen "Wellenlänge ausnutzt, um nachzuweisen,' in welchem Teil des Röhrchens die PiIi enthalten sind.

Während bei einem pH-V/ert unter 9 zentrifugiert werden kann, werden bessere Ergebnisse erzielt, wenn man das Zentrifugieren bei einem pH-Bereich von 10,0 bis 10,4, günstigerweise 10,1 durchfülirt. Bei diesem Verfahren wird die rohe Perle, die Zellmaterial, PiIi und Zelltrümmer enthält, in einem Puffer mit

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hohem pH-Wert suspendiert, wie oben angegeben, und -eine ge- · eignete Menge Caesium-chlorid zugesetzt. Zum Beispiel hat es sich als günstig erwiesen, ein Medium herzustellen,■ent-- , haltend ungefähr 2 bis ungefähr 5 g trockenes Caesium- ,.-■■ ^; . ■ ; chlorid pro 10 ml wäßriges Medium. So hat es sich am gün- i ^:,£

■£-■■ i,;-^* stigsten erwiesen, ungefähr 7,5 g Caesium-chlorid auf 20 ·Λΐ--^?'

wäßriges Medium anzuwenden. ' Vif"-·

Das Gemisch wird dann ungefähr 30 bis ungefähr 60 Stunden, günstigerweise ungefähr 42 Stunden mit ungefähr 110 bis ungefähr 250 kg, günstigerweise ungefähr 200 kg zentrifu- ' ■ giert und die optische Dichte der Fraktionen an einem vorbestimmten Punkt in dem Röhrchen gemessen. Die Messung der " optischen Dichte" bei 280 nm zeigt ein einziges Maximum. Die Dichtefraktionen unter diesem Maximum werden abgetrennt und gegen einen Puffer mit niedrigem pH-Wert dialysiert, um die Piluskristalle auf die oben beschriebene Weise zu erhalten. Der tatsächliche Dichtebereich, der an diesem Punkt bei 20⁰C gesammelten Fraktionen der Lösung,liegt zwischen 1,35 bis 1,33 bei pH 10,1.

ΡΑΐ-Test auf Antikörper gegen N. Gonorrhoeae

Die grundlegende Fähigkeit von GC-Piluskristallen oder Einzelpilusstäbchen in Gegenwart von Antikörpern gegen N. Gonorrhoeae zu agglutinieren, ist die Grundlage für den FAT-Test. Bei diesem Test werden Blutsera von Personen, von denen vermutet wird, daß sie N. Gonorrhoeae ausgesetzt gewesen sind, mit GC-Piluskristallen oder ilinzelpilusstäbchen vermischt und beobachtet, ob eine Agglutination der Kristalle oder Stäbchen eintritt.

Um diesen Test voll bewerten zu können, müssen drei wichtige Faktoren in Betracht gezogen werden. Zunächst ist der.Test nicht dafür gedacht, die Standard "Kulturⁿ-Tests zu ersetzen, aber er kann für eine schnelle Untersuchung, ob die.

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fragliche Person U. Gonorrhoeae ausgesetzt gewesen, ist, dienen. Der Test zeigt auch · positive Ergebnisse sowohl für Personen, die seit mehr als einigen Tagen eine aktive Infektion haben'als auch für Personen, die die Krankheit früher einmal gehabt haben, aber inzwischen geheilt sind. Die dritten Einschränkung besteht darin, daß Personen, die erst vor sehr kurzer Zeit infiziert worden sind, noch nicht ausreichend Antikörper gebildet haben können, um eine positive Reaktion zu erhalten. Bei Personen, bei denen der Test positiv ausfällt, sollte der übliche Kulturtest durchgeführt werden. Es hat sich gezeigt, wie später näher diskutiert wird, daß die PiIi von infektiösen Formen von Ii. Gonorrhoeae eine Anzahl spezifischer immunologischer Determinanten besitzen. PiIi bestimmter Stämme besitzen eine oder mehrere dieser Determinanten. Daher müssen, um eine Untersuchung wirksam durchzuführen, Piluskristalle angewandt werden, die das gesamte Spektrum immunologischer Determinanten umfassen.

Die für den Test angewandten GC-Piluskristalle werden auf die oben beschriebene vveise hergestellt.

Der Test kann durchgeführt werden unter Verwendung von entweder Serum oder Plasma von der zu untersuchenden Person. Im Zusammenhang mit diesem Test können daher die Ausdrücke"Serum" und "Plasma" gegeneinander vertauscht v/erden. Die erforderliche Menge an Serum oder Plasma ist außerordentlich gering. Bs hat sich als ausreichend erwiesen, einige Tropfen Blut aus der Fingerspitze des Patienten zu entnehmen und diese in einem kleinen (ca. 250 /ul) Zentrifugenglas zu zentrifugieren, um zwischen 10 und 20 ,ul Plasma zu erhalten, das ausreicht, um den Test durchzuführen.

JLJs ist üblich, derartige Tests bei verschiedenen Verdünnungen durchzuführen. Das Serum wird daher in vorbestimmter Weise (üblicherweise durch Serienverdüniiuiag) mit einem vorbestimmten geeigneten Verdünnungsmittel vordünnt. Die Art des Verdünnungsmittels ist nicht kritisch, vorausgesetzt, daß es die Arbeitsweise des Tests nicht stört. Irgendein wäßriger

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Puffer, wie mit Phosphat gepufferte Salzlösung oder mit Tris gepufferte Salzlösung mit einem pH-Y/ert zwischen 7,0 und 7,5., kann angewandt werden. Mit Tris gepufferte Salzlösung mit einem pH- .' Wert von 7,2 ist bevorzugt. Bei der Durchführung des Tests wird die Pilussuspension zu dem verdünnten Serum zugegeben, um eine Endkonzentration zwischen 10 und 50 /ug/ml Kristalle in der
Suspension zu erhalten. Es hat sich gezeigt, daß die besten Ergebnisse bei niedrigen Konzentrationen an Piluskristallen erhalten werden, und daher wird zur Standardisierung von Pilus-Antikörper-Gehalten in den Testsera, die willkürliche Konzentration für Vergleichszwecke von 20 /Ug Piluskristalle pro ml verdünntes Serum (oder Plasma) als Standard angenommen.

Nach dem Vennischen der Piluskristalle mit den verdünnten Sera, wird das Gemisch inkubiert. Die Inkubationszeit ist nicht kritisch und kann von so geringen Zeiten wie 15 Minuten bis zu so langen Zeiten wie 48 Stunden betragen, wobei die Änderungen der Ableswerte vernachlässigbar sind. Bei einer schnellen
Form des PAT-Tests wird das Serum-Pilus-Gemisch mit der Hand
eine bis drei Minuten auf einem Objektträger gerührt, dabei
werden ähnliche Ergebnisse erzielt, jedoch mit einer etwas geringeren Empfindlichkeit. Die Temperatur, bei der das Gemisch gehalten wird, ist auch nicht wesentlich, solange sie zwischen 0 und ungefähr 45⁰C liegt, mit der Ausnahme, daß es günstig zu sein scheint, das Gemisch auf einer Temperatur zwischen 22 und 40⁰C, vorzugsweise bei ungefähr 22⁰C, mindestens 15 Minuten zu halten. Eine Aufbewahrung des Gemisches bei Temperaturen von
so geringen v/erten wie 4⁰C bis zu 24 Stunden scheint keine
deutliche Änderung des Titers herbeizuführen. Zufriedenstel- . lende Ergebnisse wurden erhalten durch 30 Minuten langes Inkubieren bei 37°C. Wach Ablauf der Inkubationszeit wird ein Anteil unter ein Dunkelfeld-Mikroskop gegeben und die Agglutination beobachtet und notiert. Die Notierung wird auf die für
derartige Tests übliche willkürliche relative Weise durchgeführt, nämlich 4+, 3+, 2+, 1+-*+ und -. Zur Bestimmung des

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Titers einer gegebenen Probe wird die letzte Verdünnung, die · eine Agglutination von 1+ ergibt, als Endablesung herangezogen. Der Wert 1+ ist derjenige Wert, der die minimale bemerkbare Agglutination gegenüber einer Standardvergleichsprobe anzeigt.

Da die Ablesungen für den Titer von Ansatz zu Ansatz der Piluskristalle,entsprechend ihrem Zustand,variieren können, ist es ratsam, den Test bei der Ausführung zu überwachen, indem man Kristalle mit Antisera mit bekanntem PAT-Titer zusammenbringt neben den üblichen Vergleichsversuchen gegen Verdünnungsmittel ohne Serum und Verdünnungsmittel mit normalem Serum.

Es hat sich gezeigt, daß unter den angewandten Bedingungen der Test innerhalb der Titerableswerte mit dem Faktor 2 (times 2 (X 2) factor) reproduzierbare Vierte ergibt.

Serotypierung von ΙΊ. Gonorrhoeae

Bisher war es nicht möglich, N. Gonorrhoeae-Organismen in ein geeignetes und aussagekräftiges System einzuordnen (Serotypieren). Diese Antikörperreaktionen charakterisieren die Stämme und die Identifizierung dieser Charakteristika stellt eine wesentliche Hilfe dar für epidemiologische Untersuchungen des Fortschreitons und Ursprungs eines speziellen Ausbrechens der Krankheit. Es ist von besonderem Interesse bei venerischen Erkrankungen, daß die Ausschaltung der Krankheit sehr häufig vom Aufspüren des Personen-Personen-

Kontakts abhängt. So kann der Infektionsweg leichter verfolgt werden, wenn die Infektionsquelle durch Serotypieren identifiziert werden kann.

Es hat sich gezeigt, daß durch Untersuchen von 21 Stämmen, die gewonnen worden sind von Quellen, die über die Vereinigten Staaten verteilt sind, mindestens vier unterschiedliche immunologische Determinanten in den PIIi dieser Stämme

+) Es ist nicht unüblich, daß Organismen ver schiedener Stämme der gleichen Art 4 verschiedene Antikörperreaktionen hervorrufen.

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vorhanden sind. Eine oder mehrere dieser Determinanten sind in jedem Stamm vorhanden. Daher kann, wenn die Determinanteneigenschaften einer speziellen Probe identifiziert werden können, · der Ursprung der Infektion leichter gefunden werden. . '■

Wenn N. Gonorrhoeae-Organismen. : von einer infizierten Person gewonnen und zur Bildung von Piluskristallen gezüchtet worden sind, können die in den Piluskristallen vorhandenen immunologischen Determinanten leicht nachgewiesen werden, indem man sie einem PAT-Test mit den oben erwähnten Untersuchungssera unterwirft, von denen bekannt ist, daß sie Antikörper enthalten, jedoch jeweils nur für eine Determinante. So kann das serologische Profil eines Organismus in einer gegebenen Probe bestimmt werden.

Gonorrhoeae-Impfstdf- Sicherheit und Wirksamkeit

GC-Piluskristalle und Einzelstäbchenpili wurden Versuchstieren bzw«-personen in vivo injiziert und es zeigte sich, daß sie keinerlei toxische Wirkung besaßen. Die einzige negative Wirkung wurde bei der intravenösen Injektion an Huhnerembryos beobachtet. Kaninchen wurden drei subkutane Injektionen von 100 bis 200 /Ug/kg verabreicht, was einer Gesamtdosis von 300 bis 600 /Ug/kg entsprach. Ratten wurden ähnlich zweimal üOOO /Ug/kg., entsprechend einer Gesamtdosis von 16000 ,ug/kg, injiziert. Rhesusaffen erhielten drei Injektionen von je 100 /Ug/kg intramuskulär und Menschen 2 bis 10 /ug/kg und anschließend einmal 50 /Ug/kg intramuskulär. Keines der Versuchstiere starb oder zeigte irgendwelche lokale oder systemische toxische Wirkungen. Die Hühnerembryoε zeigten einen LD-50-Wert von 60 /ug pro . 0,454 kg. Die Reaktionen bei den Menschen variierten zwischen keinerlei systemischen Wirkungen und flüchtigen Kälteschauern und Fieber bei einer Versuchsperson. Der PAT-Titer bei Kaninchen erreichte 1000 bis 3000 und bei Rhesusaffen 10000+. Der PAT-Titer bei Menschen variierte zwischen 100 und 200.

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Die erforderliche Dosis urn 50 % der Versuchspersonen

zu infizieren (ID^₀) liegt in der Größenordnung von 5,0 χ 10 Organismen. Erste Vorversuche zeigen, daß die ID₅₀ eines Menschen mit einem PAT-Titer von 100 bis 200 2,0 χ 10 Organismen beträgt. Das bedeutet einen Schutz von 1,6 log Zyklen oder mit anderen Worten: Bei einem Menschen mit einem PAT-Titer von 100 bis 200 besteht nur 0,86 % Gefahr bei einmaligem Kontakt infiziert zu werden, während bei einem nichtimmunisierten Menschen die Gefahr ungefähr 30 % beträgt.

Aufgrund dieser Befunde sollte einem Menschen um einen angemessenen Schutz zu erreichen, eine ausreichende Menge GC-Piluskristalle, günstigerweise gegen alle bekannten Determinanten (bestimmenden Faktoren) verabreicht werden, um den PAT-Gehalt gegen jede dieser Determinanten auf mindestens 100, vorzugsweise mindestens 200 zu erhöhen. Solche Gehalte werden erreicht durch Verabreichung von ungefähr 2 bis ungefähr 100 /Ug/kg Körpergewicht GC-Piluskristalle für jede Dererminante. Es ist jedoch zu bemerken, daß ein Titer von 100 auch schon mit so geringen Mengen wie 1 /Ug/kg erreichbar ist. Die Verabreichungsart hängt von der Empfindlichkeit der jeweiligen Person ab, soweit eine solche gegeben ist, aber der Impfstoff kann günstigerweise in 1 bis 5 Dosen über einen Zeitraum bis zu 8 Wochen verabreicht v/erden.

Die GC-Piluskristalle, Einzelpilusstäbchen oder andere Quellen für GC-Piliii können in irgendeinem geeigneten Medium zur intramuskulären Injektion verabreicht werden.

Versuche

Angewandte Quelle für N. Gonorrhoeae

21 Stämme von il. Gonorrhoeae wurden von Menschen mit Gonorrhoe isoliert und folgendermaßen bezeichnet:

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Pittsburgh 1-2

Pittsburgh 3-2 . .

Pittsburgh 4-2 Pittsburgh 6-2 Pittsburgh 7-2 CDC B-2 CDC C-2 CDC M-2 CDC T-2 CDC F62-2 Atlanta 4-2 Atlanta 6-2 Atlanta 9-2 Atlanta 10-2 " Seattle 1-2 Seattle 3-2 Seattle 9-2 Norfolk 2-2 Norfolk 7-2 Dayton 8-2 CDC 005-2

In allen folgenden Beispielen wird speziell auf den
Stamm Pittsburgh 3-2 Bezug genommen, wenn die anderen aufge-, führten Organismen bei dem gleichen Verfahren angewandt werden v;ie der Stamm Pittsburgh 3-2,werden ähnliche Ergebnisse erhalten.

Beispiel 1 Reinigung des Stammes

Die Primärkulturen des Stammes Pittsburgh 3-2 werden
auf Thayer-Hartin-Platten aufgebracht, enthaltend Thayer-Martin-Agar (Manual of Clinical Microbiology, Ausg. 2, Amer. Soc·. Microbiol, Lenette, et al. (Ed.) 1974, S. 920). Die
Platten werden ungefähr 1U Stunden bei 35⁰C und einer Feuch-

■"•o^x

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tigkeit von 90 ^ in oinor Atmosphäre, bestellend zu 95% cms Luft und. 5 ><j Kohlendioxid inkubiert. Die Platten werden untersucht und die Kolonien, die an die stark "behaarte" (pilierte) T₂-I' orm erinnern , werden erneut auf GC-Mediurn ausgestrichen.-i-iach Inkubieren unter den oben angegebenen Bedingungen werden die iiolonien vom ΐ,-,-ΐνρ abgenommen und erneut auf GC-Mediura aufgestrichen.

Entsprechend dem oben angegebenen Verfahren, wenn jedoch die Züchtung von Organismen vom Typ ϊ\ erwünscht ist, v/erden älmlich iiolonien, bei denen der weniger pilierte Typ T. überwiegt, erneut aufgestrichen.

Beispiel 2 Herstellung von GC-Wachstumsmedium

a) Herstellung von DSF-Zusatz

wäßrige Lösung von Cocarboxylase (0,2 Gew.-/6) in

destilliertem Wasser wird bei Raumtemperatur hergestellt und durch Filtrieren durch ein 0,45 /um iiillipore-Filter sterilisiert, üine wäßrige Lösung, enthaltend Glukose (40 g), Glutamin (1,0 g), Eisen-HI-iiitrat (0,5 Gew.->e 10 ml in destilliertem Wasser) und destilliertes Wasser (90 ml) wird 10 Minuten in einem Autoclaven bei 121⁰C unter einem Druck von 1,12 kg/cm (16 ρsi) erhitzt und die Lösung abgekühlt. Zu dieser Lösung wird 1 ml der vorher hergestellten Cocarboxylase Lösung gegeben, um die DSF-Lösung zu erhalten.

b) Herstellung des .Vaclistumsinediums

Bacto-GC-i-iediuia-Grundsubstanz (Difco Mannual 19. Ausgabe, Seite 122)(Difco Laboratories, Detroit, Michigan) (10,Ü g) und destilliertes wasser "(300 ml) v/erden in einem geeigneten Behälter gerührt und das Gemisch in diesem Behälter 15 Minuten bei 121⁰C unter einem Druck von 1,12 kg/cm erhitzt. Der Behälter wird aus dem Autoclaven entnommen, auf 50 bis 60⁰C abgekühlt und 3 ml dos wie oben hergestellten DSF-Zusätzes zugegeben. - ·

.../35

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Herstellung der Inokulumplatten und V/achstumsschalen . ..

Wachstumsschalen aus Pyrex oder Aluminium und Petri-· ■ schalen zum Beimpfen werden gewaschen, mit destilliertem V/asser gespült mit Aluminiumfolie bedeckt und 30 Minuten bei 121⁰C unter einem Druck von 1,12 kg/cm erhitzt. In die so vorbereiteten Schalen wird das entsprechend Beispiel 2 hergestellte geschmolzene Wachstumsmedium gegossen. Das Wachstumsmedium sollte vorsichtig in einem geschlossenen staubfreien Raum unter aseptischen Bedingungen in die Schalen gegossen werden, um eine Verunreinigung mit unerwünschten Bakterien zu vermeiden.

Beispiel 5 ■ Wachstum des Inokulums

Die Tp-Kolonien von den Thayer-Martin-Platten (Beispiel 1) werden erneut auf Inokulumplatten ausgestrichen, die wie oben hergestellt worden sind , und bei 35°C und 90 $ Feuchtigkeit in einer Atmosphäre von 5 % Kohlendioxid und 95 /o Luft gezüchtet. Die Platten werden nach und nach in Unterkulturen weiter gezüchtet, bis mehr als 90 % des Bewuchses von dem Kolonietyp Tp sind, der Haare bildet. In Abhängigkeit von der Stabilität des Stammes beträgt die Wachstumszeit zwischen 12 und 24 Stunden. Nach dieser Zeit ist die.Platte zwischen 50 und 75 % mit dem Wuchs bedeckt.

Beispiel 4 Bildung von GC-PiIi durch Oberflächenkultur

Die Petrischalen des Beispiels 3, enthaltend die Tp-KuItür, werden mit wäßriger Casaminosäurelösung (5 ml, 0,7 Gew.->ü) gewaschen. Der Bewuchs wird von dem Medium mit einem sterilen Glasspachtel abgelöst, die Suspension des Bewuchses in der Casaminosäurelösung von der Platte abpipettiert und in zwei Wachsturnsschalen (ca. 35,6 χ 25,4 cm) verteilt. Diese Schalen werden auf die oben angegebene Weise hergestellt. Die Suspension wird gleichmäßig über der Oberfläche ausgestrichen und die Schalen 20 Stunden bei 35°C und 90 Feuchtigkeit in einer Atmosphäre von 5 % Kohlendioxid und 95 % Luft inkubiert.

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Gewinnung des Bewuchses der Oberflächenkultur

Eine mit Tris gepufferte Salz-Vorratslösung wird hergestellt durch Lösen von Natriumchlorid (510 g), Tris,(Hydroxymethyl)-aminornethan (363 g) und konzentrierter Salzsäure (100 ml) zusammen mit ausreichend destilliertem V/asser, um eine Vorratslösung mit einem Volumen von 10 1 zu erhalten. Der pH-Wert wird durch Zugabe von weiterer konzentrierter Salzsäure auf einen Arbeitsbereich von 8,5 eingestellt. Wenn eine Erhöhung des pH-Werts erforderlich ist, wird konzentrierte (10 n) wäßrige Natriumhydroxidlösung zugesetzt. Vor •der "Anwendung wird die Vorratslösung auf 1/6 der ursprünglichen Konzentration verdünnt. Die mit Tris gepufferte Salzlösung (im folgenden als TBS bezeichnet), besitzt einen Ausgangs-pH-Wert von 8,5. 10 ml der TBS-Lösung v/erden auf die Wachstuinsobe rf lache der Kulturschalen gegeben, der Wuchs mit einem Glasspachtel abgelöst und die Suspension in einen Vorratsbehälter pipettiert. Das Waschen und Ablösen wird mit einer zweiten Menge (10 ml) TBS wiederholt und die beiden Waschflüssigkeiten zusammengegeben. Die Wachstumsoberfläche wird ein drittes Hai mit Äthanolaminpuffor (10 ml, pH 10,1) gewaschen und die Suspension aufbewahrt aber nicht zu den ersten beiden Waschflüssigkeiten gegeben, (uer Äthanolaminpuffer wird hergestellt aus flüssigem Äthanolamin, 37,3 ml,· wäßriger Salzsäure, 1 n, 147,0 ml und destilliertem Wasser auf 1 1).

Wenn bei dem oben angegebenen Verfahren Ί\,- statt T^- PiIi gezüchtet werden sollen, liegt der pH-Wert von TBS zwischen 7,0 und 7,2.

Bei einem guten Ansatz besitzt der Bewuchs eine .charakteristische orange-rosa oder warm-rosa Farbe und einen Geruch, der an gekochte Lebensmittel erinnert·. Der Bewuchs klumpt zu klebrigen fadenartigen Aggregaten zusammen und kann mit einem Glasspachtel leicht von der Oberfläche des Mediums abgelöst werden.

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Die Schalen, die das Wachstumsmedium enthalten, werden dann gereinigt, gewaschen und sterilisiert, wie oben angegeben, und erneut ait ',Yachstumsmediuni gefüllt.

Beispiel 5 Tauchkultur von GC-PiIi

Entsprechend dem in Beispiel 4 angegebenen Verfahren unter Anwendung des gleichen Wachstumsmediums und Nährstoffzusatzes, aber ohne Agar, und Verwendung von löslicher Stärke,anstelle der unlöslichen Stärke,wird Inokulum zu dem Wachstumsmedium gegeben und in einer Atmosphäre von 95 % Luft und 5 % CO₂ in Gegenwart von 0,5 % (bezogen auf das Volumen des flüssigen Mediums) Celit 18 Stunden unter leichtem Bewegen bei 35 bis 37°C inkubiert.

Das Kulturmedium wird dann durch ein Sandwich-Filterkissen auf einem groben Sinterglasfilter filtriert. Das Filterkissen bestand aus grobem Filterpapier, einer 5-mm-Schicht von Celit und erneut einer Lage von grobem Filterpapier.

Das Filtrat wird verworfen und der Rückstand, entsprechend dem dritten Waschverfahren des Beispiels 4 (Äthanolaminpuffer), behandelt und anschließend entsprechend Beispiel 6 Absatz III weiterverarbeitet.

Beispiel 6 Trennung der PiIi von Zellen und Zelltrümmern

I. Die in den vorhergehenden Beispielen erhaltenen TBS-Suspensionen werden in Zentrifugenröhrchen (deren Volumen abhängt von der Anzahl der zusammengegebenen Ansätze) gegeben und 15 Minuten mit 3 kg zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird verworfen und die Perle weiterverarbeitet.

II. Zu der Perle wird die Athanolaminsuspension von dem dritten Waschvorgang der Wachstumsschalen gegeben und weiterer Äthanolaminpuffer mit einem pH-Wert von 10,1 auf ein Volumen entsprechend ungefähr dem dreifachen Perlenvolumen in dem Zentrifugenröhrchen. Die flüssige Schicht wird 5 Minuten mit

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einem mechanischen Rührer schnell gerührt, um den löslichen Anteil der Perle in Suspension zu bringen.

III. Die Suspension wird dann 15 Minuten mit 3 kg zentrifugiert, die überstehende Flüssigkeit von der Perle abdekantiert und aufbewahrt. Die Perle wird dann erneut in dem dreifachen ihres Volumens an Äthanolaminpuffer, pH 10,1, wie oben angegeben suspendiert und 15 Minuten mit 3 kg zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird abdekantiert und mit dem überstehenden Äthanolaniinpuffer aus der unmittelbar vorangehenden Stufe zusammengegeben und die Perle verworfen.

Die vereinten Athanolaminpufferlösungen werden 60 Minuten mit 31 kg zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird abdekantiert und weiterverarbeitet und die Perle verworfen.

Beispiel 7 Kristallisation von GC-PiIi

Herstellung von Dialyseschläucheriund mit Tris gepufferter Salzlösung

Eine Rolle Dialyseschlauch (30,48 m Fisher Scientific Catalog Nr. 8-677 B) wird nacheinander in a) destilliertem Wasser (2 χ je 4 l), b) wäßrigerNatriumbicarbonatlösung (2 χ 4 1 destilliertes Wasser, enthaltend jeweils 2 Teelöffel Natriumbicarbonat), c) wäßrigem Natriumäthylendiamintetraacetat (2 x_;4 1 destilliertes Wasser, enthaltend jeweils 2 Teelöffel Na-EDTA), d) wäßrigem Äthanol (2 χ je 4 1 Äthanol/ Wasser 1:1), e) destilliertem Wasser (2x je 4 1) gewaschen. Der Dialyseschlauch wird dann in destilliertem Wasser, enthaltend jeweils eine Spur Benzoesäure (1 Teelöffel Benzoesäure auf 4 1 destilliertes Wasser) aufbewahrt. Mit Tris gepufferte Salzvorratslösung (TBS), die entsprechend Beispiel 4 hergestellt worden ist, wird mit destilliertem Wasser verdünnt, um die Dialyselösung zu erhalten (166 ml Vorratslösung werden mit destilliertem Wasser auf 1 1 verdünnt).

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Dialyse der GC-Pili-Lösung

100 ml Athanolaminpuffer, enthaltend GC-PiIi in Lösung wie in den vorhergehenden Beispielen hergestellt, werden gegen 4 1 TBS (pH 8,5 bei 20⁰C) dialysiert mit Hilfe der wie oben vorbereitetenDialyseschläuche: unter Anwendung des oben angegebenen TBS. Die Dialyse wird in einem kalten Raum (ca. 4⁰C) durchgeführt. Die äußere Dialysepufferlösung wird magnetisch gerührt. Die Dialyse wird 18 Stunden lang durchgeführt. In dem Dialysemedium wird ein pH-Anstieg auf ungefähr 8,7 beobachtet. Es entsteht ein wolkiger blau-weißer, doppelbrechender Niederschlag (Präcipitat ) von GC-Piluskristallen am Ende der Dialysezeit. Das so ausgefällte Material wird 60 Minuten mit 7500 UpM (7,5 Krpm) zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit verworfen, wobei GC-Piluskristalle des Stammes Pittsburgh 3-2 N. Gonorrhoeae als Zentrifugenperle entstehen. Entsprechend dem oben angegebenen Verfahren, wenn jedoch T^- statt T₂-PiIi isoliert werden sollen, ist der Anfangs-pH-Wert von TBS 7,0 bis 7,2.

Beispiel 8 Weitere Reinigung der PiIi

Die nach Beispiel 7 erhaltene Perle wird in ungefähr dem Dreißigfachen ihres Volumens Athanolaminpuffer (pH 10,1) suspendiert. Die Röhrchen werden leicht geschwenkt, um die Perle zu lösen und die Suspension 60 Minuten mit 31 kg zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird abdekantiert und die Perle verworfen. Die überstehende Flüssigkeit wird entsprechend dem Verfahren des Beispiel 7 gegen TBS dialysiert und das so erhaltene kristalline Material ebenfalls entsprechend Beispiel 7 abzentrifugiert. Die Perle wird erneut in Äthanolamin,entsprechend, dem oben erwähnten Verfahren,suspendiert, durch ein 0,45-/um-Filter filtriert, wenn eine Sterilisation erwünscht ist,und ähnlich wie oben erneut zentrifugiert und dialysiert und durch Zentrifugieren isoliert.

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Entsprechend dem oben angegebenen Verfahren wird, wenn die so erhaltenen GC-Piluskristalle für eine gewisse Zeit aufbewahrt werden sollen, ein Konservierungsmittel zu der Dialyse TBS-Lösung zugesetzt, das damit verträglich ist. Verträgliche Konservierungsmittel, die nach dem Verfahren angewandt werden können, sind 0,05 % (Gew./Vol.) neutraler wäßriger Formaldehyd, 0,01 % (Gew./Vol.) Merthiolat oder 0,02 % (Gew./Vol.) Natriumazid.

Wenn entsprechend dem oben angegebenen Verfahren das Konservierungsmittel mit dem TBS nicht verträglich ist, wird nachdem die PiIi auskristallisiert sind, der Tris-Puffer durch Dialyse gegen Salzlösung entfernt (0,15 m wäßriges Natriumchlorid, 18 Stunden). Das Konservierungsmittel wird zu einem frischen Ansatz Salzlösung zugesetzt und gegen die Suspension der GC-Piluskristalle 18 Stunden dialysiert. Die Kristalle werden in diesem Medium bei 40⁰C aufbewahrt. Wahlweise kann das die Kristalle enthaltende Medium gefroren und bei -70⁰C aufbewahrt werden.

Ausbeute

Die Ausbeute an GC-Piluskristallen der in Beispiel 1 angegebenen N. Gonorrhoeae-Stämme liegt, wenn das Inokulum mindestens 90 % Kolonien vom Typ T„ enthält, im Bereich von

2 5 bis 15 /ug/cm Wachstumsfläche.

Ähnliche aber etwas geringere Ausbeuten werden erreicht, von Kolonien vom Typ T^.

Beispiel 9 Caesium-chlorid-Dichtegradienten-Isolierung von GC-PiIi

1 ml der TBS-Waschflüssigkeit (pH 8,5), enthaltend die GC-Piluskristallsuspension aus Beispiel 6, wird mit Trispuffer mit einem pH-Wert von 8,5 auf 20 ml verdünnt, der pH-Wert durch Zugabe von Natriumhydroxid (0,1 n) auf 10,1 erhöht und 7,5 g trockenes Caesium-chlorid zugegeben. Die Lösung wird 42 Stunden mit 200 kg zentrifugiert (SW41 Rotor einer Beckman L-265-Zentrifuge). Bs werden Fraktionen von dem Zentri-

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iugenröhrchen geswnQlt und die flptieehe DithU h&i QQO nm und der Brechungsindex für jede Probe gemessen. Der Brechungsindex hängt ab von der Caesium-chlorid-Dichte, in die die Ablesungen für den Brechungsindex umgerechnet werden. Die Brechungszahl wird auf der X-Achse gegen die Dichte der Lösung auf einer Y-Achse und die optische Dichte auf einer zweiten Y-Achse aufgetragen. Ein einziges Hauptmaximum, entsprechend den GC-PiIi, findet sich bej^₌1,3422 + 0,0038? Die Fraktionen, entsprechend 1,35 bis 1,33» werden zusammengegeben und dialysiert und gereinigt, um GC-Piluskristalle zu erhalten, entsprechend dein Verfahren der Beispiele 7 und 8,

Beispiel 10 Gel-Elektrophorese von GC-PiIi (Verfahren nach

Ornstein und Davis - Disc Electrophoresis 1S62 Distillation Products Industries, Rochester, N.Y.)

Standardzylinder aus 10 % Acrylamidgel (9,7 % Acrylamid und 0,3 % Ν,Ν'-Methylen-bis-acryl, copolymerisiert mit TEMED) und Ammoniumpersulfat werden hergestellt und zwischen Gel und Puffer in Vorratsbehältern angeordnet, bestehend aus Trishydrochlorid, pH 8,0, und 0,1 % SDS. Die Geloberfläche wird mit 20 /Ug T₂-Piluskristallen,20 /Ug Clelands-Reagenz (0,01 m), 1 ml SDS^ 20 /ul Glykol und 20 nil Bromphenolblau (0,002 %) beladen. Vor dem Aufbringen werden die PiIi mit dem SDS und dem Clelands-Reagenz 2 Minuten auf 100⁰C erhitzt. Die Elektrophorese wird bei 5 ωΑ (ca. 170 V) durchgeführt bis das Bromphenolblau sich 6 cm vorwärts bewegt hat. Die Gele werden entfernt und durch den Farbstoffring durchgeschnitten und zwei Gele mit Coomassieblau (0,2 %) angefärbt, wobei zwei Bereiche auftreten, (ein Hauptbereich und ein geringerer Bereich) .

Die nichtgefärbten Gele werden gefroren und Bereiche, die in der Lage den angefärbten Bereichen entsprechen, herausgeschnitten. Der Hauptbereich wird mit dem Vorratspuffer bei 37⁰C 24 Stunden in einer Rotationsvorrichtung extrahiert, der

⁺) Buoyant-Dichte

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Puffer abgezogen und der Rückstand nahezu zur Trockne eingedampft. Ein erneuter Ansatz des Produktes

ergab einen einzigen Bereich mit dem gleichen Rf-Wert. Diese Substanz wird als GC-Pilin bezeichnet.

Untersuchung der Antigenwirkung von GC-Pilin

Das Gel, enthaltend den Hauptbereich, wurde mit ungefähr 10 ml Salzlösung homogenisiert und drei Versuchskaninchen subkutan injiziert. Die Versuchstiere p_ und P_TT erhielten 3»1 ml der Suspension und die Tiere P₁₁₁ nur 2 ml.

Zweite und dritte Injektionen wurden ungefähr 15 und ungefähr 30 Tage später vorgenommen« Die Substanzen für die zweite und dritte Injektion wurden hergestellt durch Extrahieren des Hauptproteins in Vorratspuffer (0,8 ml) 24 Stunden bei 37⁰C. Der sus B;strshi®r©ii verwendete Puffer wurde dann mit einem gleichen Volumen Freund^!s unvollständigem Zusatz (Freund's Incomplete adjuvant) zusanMsngegeben und ein Drittel jedes Gemisches jedem Kaninchen injiziert.

Eine Woche nach der letzten Injektion zeigten alle Kaninchen Titer von mehr als 1000 bei dem PAT-Test gegen Pittsburgh 3-2 Typ Tp-PiIi, wie aus der folgenden Tabelle hervorgeht.

PCA-Test unter Verwendung von 50 /Ug/ml "3-2" PiIi

Kaninchen PI PI PI Pll Pll Pll Pill Pill PIII

Blutentnahme 1 15 29 1 15 29 1 15 29 nach Tagen

senden" ^{16 16} ^ 16 16 35 16 16 35 35

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Verdünnung	+	+/H	H- 3+	3+	3+	4+	+	++	3+	0
1/2	+	+	3+	3+	5+	5+	0	3+	3+	0
1/4	0	+	3+	3+	5+	5+	0	3+	4+	0
1/8	0	0	3+	3+	5+	4+	0	++	4+	0
1/16	0	0	3+	+	4+	4+	0	+	4+	0
1/32	0	0	+	0	4+	3+	0	0	0	0
1/64	0	0	+	0	4+	3+	0	0	++	0
1/128			+			3+			+	0
1/256			+			++			+	0
1/512			+			++			+	0
1/1024			0			+			+	0
1/2048			0			+			0	0
1/4096	<2	4	1024	32	>128	>4096	<2	16	2048	<2
Endpunkt

Elektrophorese gegen Myoglobin, Chymotrypsinogen und
Human- ^"-globulin an Gelschrägen ergab die Hauptfraktion mit einem Molekulargewicht von 20500 bis 21500 und das in geringerer Menge vorhandene Protein mit einem Molekulargewicht von ungefähr 28000.

Beispiel 11 Kohlenhydratanalyse - Phenol-Schwefelsäure-Test

Eine Standardkurve wurde hergestellt durch Behandlung
von Glukosevorratslösung mit 0,1 η wäßriger Natriumhydroxidlösung und Messung der UV-Absorption bei 485 nm. Untersuchungen von Pittsburgh 3-2-Pili und den CDC B-2-Pili zeigten im wesentlichen den gleichen Kohlenhydratgehalt, nämlich 1,49 + 0,56 %_f entsprechend 1 bis 2 Hexoseresten pro Protein
Subeinheit.

Beispiel 12 Phosphoranalyse

(Verfahren nach Chen, et al, Anal. Chem, 28. 1756 (1956))

Die PiIi wurden in Schwefelsäure gelöst und nach dem
Ammoniummolybdat-Ascorbinsäure-Bestimmungsverfahren gegen eine Kaliumdihydrogenphosphatlösung untersucht. Der Mittelwert für

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die Pittsburgh 3-2-PiH betrug 0,332 + 0,026 % und für die CDC-B-2-Pili 0,366 + 0,048 %, entsprechend 2,5 bzw. 2,3 Phosphoratomen pro Protein Subeinheit.

Beispiel 13 Aminosäureanalyse für Piluskristalle vom Typ Tp

(Modifiziertes Verfahren nach Spackman et al, Anal. Chem. Band 30, Seite 1190 (1958))

Die Analyse wurde mit Hilfe eines Aminosäureanalysators (Beckman Spinco Model 120 B) mit Hilfe von Norlucein und 2-Amino-3-guanidino-propionsäure als innerem Standard durchgeführt. Die Proteinprobe (10 mg) wurde mit konzentrierter Salzsäure bei erhöhter Temperatur (6 n, 11O⁰C) 24 Stunden in evakuierten Flaschen (0,025 mm Hg) hydrolysiert. Die Tryptophananalyse wurde abgeschätzt nach dem Spektralverfahren nach Bence et al (Anal. Chem. Band 29, Seite 1193, (1957))

Aspartinsäure + Asparagin 26

Alanin 23

Glutaminsäure + Glutamin 21

Lysin 20

Glycin . 17

Valin 17

Serin 14

Leucin 12

Threonin 9

Isoleucin 9

Arginin 8

Tyrosin 7

Prolin 6

Tryptophan 4-5

Histidin 3

1/2 Cystin 2

Methionin 2

Phenylalanin 2

Anzahl der Aminosäuren- 200 + 9, Mol-Gew. 21, 500 + 1000 Dalton.

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Beispiel 14 Physikalische Eigenschaften Löslichkeit

Piluskristalle, die in einem Elektronenmikroskop als Bündel von Pilusstäbchen erscheinen, sind in kristallinem Zustand ungefähr bei pH 5!»5 bis ungefähr 9 $3 beständige Die Kristalle der T -Varianten beginnen sich zwischen. pH 9₉3 V-nd pH 10,1 in einzelne Stäbchen aiifsutrennea„ Oberhalb pH 10,1 liegen sie als einseine Pilusstäbchen vor_o iühnlich beginnen sich die Kristalls von T^-PiIi bei pH 7?7 isa einzelne Pilusstäbchsn aufsutrennsn und liegen oberhalb pH 8_D6 als @ins@lae Stäbchen. ¹⁷IQr₅ öLh_o eli® Kristalle sind vollständig aufgebrochen₀ Oberhalb pH 1I₅O ter-echen die Tp-Pilusstäbchen in kleiner® oligoiaere Eiaheiten mit» eines⁸ Sedimentatioaskonstaaten ¥on ungefähr 5₉5 auf.

Die Piluskristalle sind auch bei pH 8_S5 in 4 m wäßriger Natriumchloridlösungj 50 ?oiger wäßriger Saccharoselösung und . 20 %iger gesättigter wäßriger Calciumchloridlösung (jeweils bezogen auf das Gewicht) löslich» Die Kristalle sind auch löslich in Harnstoff bei 3 μ und darüber·» Eine Behandlung mit Harnstoff in einer Konzentration von 3₉5 m-oder darüber innerhalb von mehr als 2 Tagen, führt jedoch zu einer Denaturierung der GC-PiIi.

Ultrazentrifugation

Eine GC-Piluszubereitung (1 mg/ml) in Äthanolpuffer (0,147 Ionenstärke, pH 10,1) wurde hergestellt. Die Lösung wurde in einer Ultrazentrifuge (Beckman Spinco Model E) mit 20000 UpM mit Hilfe eines AN-D-Rotors zentrifugiert. Die nichtkorrigierte Sedimentationsgeschwindigkeit S ist gleich 37 Svedberg.

Dimensionen der Pilusstäbchen

GC-Piluskristalle wurden in Äthanolaminpuffer bei pH 10,0 aufgenommen mit gestapelten scheibenförmigen Stäbchen von TMV-Protein mit negativer Anfärbung und in einem Elektronen-

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mikroskop untersucht. Der mittlere Durchmesser der GC-PiIi beträgt 83,4 + 2,3 L

Beispiel 15 PAT-Test

Piluskristalle werden in TBS bei pH 7_SO in einer Konzentration zwischen 30 und 60 /Ug/ml suspendierte Es wird kein trübes bzw* wolkiges Testserum angewandt«, Wenn das Testserum v/olkig ist_f viLz-z-. es 30 Minuten mit 30 kg zentrifugiert und die übsr-stehenäs Flüssigkeit Engev/andto Is werden Reihenverdünnungen n«r-gestellt uni Q₅ 025 si gsit Ssramprobeia und O₅025 ml der Siispsnsic^. ds:? Pll^sfcristsill® ^Sv:2ils in di® Höhlung eijisr Mikrotiterplatts gegsfeszi isd ds.« Gsaisch 30 Minuten bsi Raustssp2i*at!2r g2"liLr-^- D^j Tsi^-is^i^gsL:, ^syäsja dama mit Hilf®-eines Dur.l-celfeldr:il;r-c;sl:op3 ει::: Bü&jelj to™ Es³Istalüsliaapen untsrsuoht.

Bis TsrtisfüngQD, "v/srlssi dsn^ siif der Basis einer maxi-ΠΙΕ.12Π. Veriürsüng bswsrtst₅ dis sisiä EriStallagglutination gibt_s dis affensiÄtlish größsr ist als ssd dem ¥©rgl@ich,

Probenversnsh

Weißet,-«-eiblicheiiCaninchen (Heuseeland) mit einem Gewicht von 1,8 bis 2_S7 kg (4 bis 6 pounds) wurden subkutan gereinigte Piluszubereitungen von CDCM-2-» Pittsburgh 3-2-? CDCT-S·* CDC005-2-und Pittsburgh 4-2-Stämmen in einem 1:1-Gemisch mit Freund·s-Incomplete-Zusatz und in der Spritze emulgiert injiziert. Ungefähr 100 bis 200 /Ug/kg der PiIi wurden in 3 Injektionen ungefähr in 2-wöchigem Abstand injiziert und den Kaninchen 1 bis 2 V/ochen nach der dritten Injektion Blut entnommen. Man ließ das Blut Klumpen bilden und das Serum wurde auf übliche V/eise entfernt. Die ersten drei Testsera wurden dann gegen PiIi von 21 N. Gonorrhoeae-Stämmen untersucht. Die Versuchsergebnisse sind in der folgenden Tabelle angegeben.

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Tabelle I

Pilus-Kristall-Agglutination-Titer von PiIi von 21 verschiedenen Stämmen gegen Sera mit PiIi von 3 verschiedenen Stämmen

Pilus- \ stamm ?ilu^· Serum-V Stamm >.	Pittsburgh 3-2	Pittsburgh 1-2	Pittsburgh 4-2	• Pittsburgh 6-2	Ci)C B-2	CDC C-2	CDC M-2	CDC T-2	Atlanta 4-2	Af.lanta 6-2	Atlanta 9-2	Seattle 1-2	Seattle 3-2	Atlanta 10--2	CDC (Kellog) F62	•
CDCM-2	16	256	16	64	8	32	128	8	16	<8	8	16	32	32	8
Pittsburg co 3-rZ-	h 256	16	8	64	512	<8	8	<8	16	64	8	16	16	32	8
CO oßDC-T-2 cn	4	16	<4			32	Ite	512	32		32	64		%	128
CO

	Pittsburgh 7-2	Norfolk 2-2	Norfolk 7-2	Dayton 8-2	Seattle 9-2	XT •α ι	CDC *C05-2
m ^N. Pilus- -J \stamm Pilus -\ Serum — N. Stamm \	16	64	8	16	16.	32 to 64
CDC M-2	128	64	16	64	128	XJ) 128 ^J
Pittsburgh 3-2'		32	8	*	16	64 S
CDC T-2

*005 ist ein CDC-Stamm, der von einem Patienten mit abgeheilter GC-Infektion isoliert worden war

Entsprechend dem oben angegebenen Verfahren wurde ein 7 x 7-Serotyp-Pilus-Agglutinationstest durchgeführt unter Anwendung der PiIi und der Sera, die abgeleitet sind von 7 bezeichneten Stämmen. Zur leichteren Interpretation der in der folgenden Tabelle I a angegebenen Ergebnisse sind die Werte für die Kreuzreaktion (Pili gegen Sera des gleichen Stammes) auf 100 normalisiert und die anderen Werte entsprechend eingestellt worden.

Tabelle 1 a

Serum Pilus- Stamm	Pitts burgh 3-2	Pitts burgh 4-2	CDC M-2	CDC T-2	CDC 339-2	CDC C-2	Norfolk 2-2
Pittsburgh 3-2	100		8,3	O717	1,6	<0,008	0?52
Pittsburgh 4-2	0,16	100	44T2	0j086	0T20	40,008	0f 065
CDC M-2	< 0T039	,40,024	100	40r02	0?20	Oy 13	0.016
CDC T-2	^-0,3I	•40,024	*4,2	100	0^20	<0j 008	0?032
CDC 339-2	2F5	40f024	4 2	^0-02	100	0f 016	0f 260
CDC C-2	<0f003S	<0,78	*£4 2	0.17	4Λ,10	100	04065
Norfolk 2-2	<0,31	0f78	<4,2	0,04	0r78	<0f008	100

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Beispiel 16 Serotypie

Die PAT-Tests des Beispiels 14 zeigten, daß 3 oder 4 Stämme PiIi besaßen, die nur eine Determinante enthielten. Das wurde bestätigt, indem man Sera, die abgeleitet waren von PiIi von 4 ausgewählten Stämmen gegen die entsprechenden PiIi,untersuchte. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle angegeben. Die maximale Reaktion wurde mit 100 angegeben, um die unterschiedlichen Titer zu bestimmen.

Antisera Pittsburgh CDC CDC Pittsburgh Antigene-PiIi 3-2 M-2 T-2 4-2 Determinante

Pittsburgh 3-2	100	3	2	1
CDC M-2	3	100	1	2
CDC T-2	0,4	2	100	2
Pittsburgh 4-2	2	2	1	100

a b c d

Serotypie von Stämmen unbekannter Determinanten-Zusammensetzung

Es wurden PiIi aus den zu untersuchenden Stämmen gezüchtet und gegen Antisera gegen die PiIi, die nur eine Determinante a, b,c,d,e,f oder g.enthielten, untersucht. Bei dem PAT-Test zeigten die PiIi Agglutination mit einer oder mehreren einzelnen Determinanten, wie in der folgenden Tabelle angegeben ist.

Stamm Se ro typ

Pittsburgh 3-2 a

CDC M-2 - b

CDC T-2 c-

Pittsburgh 4-2 d

Norfolk 7-2 d

CDC B-2 - b

Pittsburgh 6-2 - b

CDC C-2 - e

CDC 005-2 abcd

Norfolk 2-2 .- - f

../49 609853/1057

Seattle	1-2	- - c	3
Seattle	3-2	Ά ·» ·■·	durch GC-Pili-Zubereitungen
Dayton	8-2	-bed
Atlanta	4-2	- b
Atlanta	6-2	- b -
Atlanta	10-2	a b -
Atlanta	9-2	- b - d ■
CDC	339-2
Beispiel 17 Hämaeelutination
Allgemeine Verfahren

Menschliches Blut der Gruppe 0, enthaltend EDTA als Antikoagulans,wurde von einer Blutbank erhalten. Rote Blutzellen wurden frisch hergestellt durch 4-maliges Waschen eines Blutanteils mit 15 Volumina mit mit Phosphat gepufferter Salzlösung, pH 7,3_f 0,01 m, und Herstellung einer 3 %igen (Volumen) Suspension in dem gleichen Puffer.

Lösungen von 1,0 mg/ml Pittsburgh 3-2 und CDC-M-2-PiIi wurden hergestellt durch Anwendung der UV-Absorption der Zubereitungen bei 280 nm,korrigiert für die Streuung als Maß für die Konzentration. Gleiche Anteile (50 /ul) der Pililösungen (1,0 mg/ml) wurden in die erste Höhlung einer Cooke-Mikrotiterplatte mit einem U-förmigen Boden gegeben und in die anderen Aushöhlungen 25 /ul mit Tris gepufferte Salzlösung + 0,02 % Azid und die PiIi wurden mit einem 25 /ul-HandmikrοVerdünner in der zwölften Vertiefung verdünnt.

Mit Tris gepufferte Salzlösung (25 /ul) und 25 /Ul 3 %ige Suspension von roten Blutkörperchen wurde in jede Aushöhlung gegeben und die Platte leicht bewegt,um den Inhalt zu vermischen und bei 4°C stehengelassen. Die Ergebnisse wurden nach 1 bis 2 Stunden mit Hilfe einer Lichtkammer abgelesen.

Ergebnisse

Der Grad der beobachteten Hämagglutination wurde folgendermaßen bewertet: ,

609853/1057 "^/5°

5+ keine Perle oder Klumpen der Zellen, gleichmäßige rote Farbe,

Spuren einer Zellperle _{Rand VQn}

3+ kleine Zellperle mit sehr deutlichen/Zellklumpen

2+ deutliche Zellperle.. mit einer mäßigen Anzahl Rändern von Klumpen

+ deutliche Zellperle mit einigen wenigen Klumpen an den Seiten der Höhlung

Die Titer von CDCM-2 und Pittsburgh 3-2-Pili wurden bei zwei verschiedenen Gelegenheiten bestimmt und sind in der folgenden Tabelle angegeben und stellen Vergleichsversuche dar.

../51

609853/1057

Ergebnisse der Hämagglutination

Endkonzentration PiIi in der Höhlung 3-2 und M-2

1. Ansatz

Grad der
Agglutination 3-2- M-2-PiIi PiIi

Endkonzentration Grad der der PiIi in der Aggluti-Höhlung nation 3-2 3-2-Pili

2. Ansatz

Endkonzentration M-2 in der Höhlung

Grad der Agglutination M-2-Pili

CD O CO OO

1 2 3 4 5

7 8

10 11 12

333 /ug/ml 166,6 /ug/ml /ug/ml

83,3 41,6 20,8

10,4

1,3 0,6

0,3 0,15

/ug/ml /Ug/ml

/Ug/ml /Ug/ml /Ug/ml /ug/ml /Ug/ml /Ug/ml

/ug/ml

O O O O O O O

450 /ug/ml 5+

225 /ug/ml 5+

112,5 /ug/ml 5+

56 /Ug/ml 4+

28 /ug/ml +

14 /Ug/ml O

78 /ug/ml O

3,5 /ug/ml O

1,75 /ug/ml O

0,88 /ug/ml O

0,44 /ug/ml 0

0,22 /ug/ml 0

92 /Ug/ml 5+ 46 /Ug/ml 5+ 23 /ug/ml 5+ 11,5 /Ug/ml 4+

⁵'⁸ /ug/ml +

2,9 /ug/ml +

1,4 /Ug/ml 0

0,7 /ug/ml 0

0,35 /ug/ml 0

0,17 /ug/ml 0

Hemmung der Hämagglutination:

Entfernung des Antikörper-Antigen-Komplexes von Antiserumpili-Gemisehen vor der Bestimmung des Titers für die Hämagglutinati on

Verfahren:

Um die Hintergrund-Hämagglutination durch Sera allein auszuschalten, wurde 0,1 ml unverdünnter gewaschener roter Blutzellen (RBCs) zu 1 ml Antisera in Zentrifugengläser mit rundem Boden gegeben. Die Röhrchen wurden dicht mit Parafilm verschlossen und senkrecht in das Gestell eines Yankee Rotators "bei 4⁰C gestellt. Nach einer Stunde und 10 Minuten wurden die Sera mit 2400 UpM in einer gekühlten International-Centrifuge zentrifugiert und auf die Fähigkeit zur Hämagglutination untersucht. Die Sera wurden weiter geklärt durch Zentrifugieren mit 12000 g in einer Sorvall RC-2-Zentrifuge.

Die Absorption von Hintergrund-Hämagglutinationsfaktoren bei verschiedenen Verdünnungen vor und nach der Behandlung des Antiserums mit RBC ist in der folgenden Tabelle angegeben.

Voradsorption Nachadsorption

Glas	Se rumve rdünnung
1	1/2
2	1/4
3	1/8
4	1/16
5	1/32
6	1M
7	1/128
8	1/256
9	1/512
10	1/1024
11	1/2048
12	1/4096

4+
3+
3+

3+
2+

2+

O O O O O O O O O

../53

609853/1057

Entfernung von Antikörper-Anti^en-Komplexen

Es wurden Reih en Verdünnungen von RBC-adsorbierten Sera von präimmunen"uiiä lßti-CDCM-2-Sera, wie oben angegeben,in Salzlösung hergestellt. Jeweils 0,1 ml Anteile jeder Verdünnung wurden zu 0,1 ml 100 /ug/ml M-2-Pili in 1,5 ml Mikrofugenröhrchen gegeben. Die Röhrchen wurden senkrecht in einem Yankee-Rotator eine Stunde bei 37°C inkubiert. Sie wurden dann eine Minute in der Beckman-Mikrofuge zentrifugiert. Etwas mehr als die Hälfte der überstehenden Flüssigkeit wurde entfernt und 50 /Ul jeder Antiserumverdünnung in jede von 2 Höhlungen einer Mikrotiterplatte gegeben. Ein Anteil von 25 /Ul von 3 % RBCs in mit Phosphat gepufferter Salzlösung wurde zugegeben und die Platte leicht bewegt, um den Inhalt in den Höhlungen zu vermischen und eine Stunde bei 4°C stehengelassen.

Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle ange-. geben. Wenn anstelle der CDC-M-2-Pili andere PiIi angewandt werden, werden ähnliche Ergebnisse erhalten mit Sera, enthaltend Antikörper gegen diese PiIi.

Konzentration des Serums gegen

CpCM-2-Pili

während der Inkubation

mit50 /ug/ml M-2-Pili

1/10

1/20

1/40

1/80

1/160

1/320

1/640

1/1280

1/2560

1/10 präimmunes

Kaninchen

*Das Anti-CDCM-2-Serum allein besitzt eine +Hämagglutination bei 1/8 Verdünnung

Hämagglutinations-Titer in doppelter Reihe G H

+	+ *
O	O
O	O
2+	+ CNJ
3+	3+
2+	2+
2+	2+
2+/3+	2+/3+

../54

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2817870

Versuch bei Menschen

T₂-Piluskristalle von Pittsburgh-3-2-Organismen wurden
hergestellt mit 0,01 % Merthiolat konserviert und mit
Freund's unvollständigem Adjuvans emulgiert. Männlichen Versuchspersonen wurde die Pilussuspension injiziert. Die Person B erhielt drei Injektionen von 2,2 /Ug/kg, 2,2 yug/kg
und 55 /Ug/kg in Intervallen von 2 Wochen. Die Person R erhielt drei Injektionen von 11 /Ug/kg, 11 /Ug/kg und 55 /Ug/kg in den gleichen Abständen. Die PAT-Titer der beiden Versuchspersonen stiegen auf 100 nach der ersten Injektion und auf
über 200 innerhalb der nächsten vier Monate.

Den Versuchspersonen wurde eine vorher bestimmte Anzahl von Organismen des gleichen Stammes intraurethral eingeführt, deren Virulenz vorher untersucht worden war. Der
gleiche Organismus wurde drei nicht-immunisierten Vergleichspersonen T, S und M verabreicht.

Die Ergebnisse der Versuche sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt:

Widerstands- und Infektionsdosis von Pittsburgh-3-2-Gonokokki bei pilus-immunisierten und nicht-immunisierten Versuchspersonen

	X	101	4 nicht-immunisierte Personen	^immunisiert	B*, R*, S
	X	102	Dosis	Infizierte Personen Widerstandsfähige Personen	B*, R*, S
•	X	103		T	B*, R*
Infektiöse	X	104
8				S
3	X	101		B*, R*	M
8	X	102	1 weitere	Versuchsperson	M
3	X	102			M
	X	103
8
3		M
8
1

/55 609853/1057

S6

2617370

Entsprechend den oben angegebenen Verfahren kann anstelle von PiIi mit nur einer einzigen Determinante ein Gemisch von PiIi, enthaltend alle Determinanten angewandt werden.

Analyse der Ergebnisse

Eine Wahrscheinlichkeitsanalyse der oben angegebenen

Ergebnisse zeigt, daß die ID^_n für eine nicht-immunisierte

2 -" 4

Person 50 χ 10 Organismen beträgt und 2,0 χ 10 Organismen

für immunisierte Personen.

Andere Versuche haben gezeigt, daß die Wahrscheinlichkeit eines Mannes durch eine infizierte Frau infiziert zu werden ungefähr 30 % beträgt, wenn ungefähr 250 Organismen während des Verkehrs in die männliche Harnröhre eindringen.

Die Ergebnisse der Versuche zeigen, daß die Wahrscheinlichkeit für eine Infektion eines Hannes durch eine infizierte Frau während des Verkehrs von 30 auf 0,86 % absinkt aufgrund einer Immunisierung auf einen PAT-Titer von 100 bis 200.

	3-2	Stamm	31149	PiIi	SD83	Antiserum	SD79
Pittsburgh	4-2	ATCC.	31151	ATCC	SD86	ATCC	SD82
Pittsburgh		ATCC	31148	ATCC	SD84	ATCC	SD80
CDCM-2		ATCC	31150	ATCC	SD85	ATCC	SD81
CDC-T-2	ATCC	ATCC	ATCC

../Patentansprüche

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Claims (32)

1. Patentansprüche

   PiIi.von Neisseria Gonorrhoeae.
2. 2. PiIi nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß sie abgeleitet sind von Kulturen von N. Gonorrhoeae vom Typ T. und in einem wäßrigen Puffer mit einem pH-Wert über 8,6 löslich und bei einem pH-Wert unter 7,7 unlöslich sind.und in Form von Kristallen vorliegen.
3. 3. PiIi nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie abgeleitet sind von Kulturen von N. Gonorrhoeae vom Typ Tp und in einem wäßrigen Puffer bei einem pH-Wert über 9,2 löslich und bei einem pH-Wert unter 8,7 unlöslich sind und in Form von Kristallen vorliegen.
4. 4. PiIi · nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß sie im Elektronenmikroskop wie einzelne Stäbchen aussehen, eine Sedimentationsgeschwindigkeit von ungefähr 37 S bei pH 10,1 in Athanolaminpuffer besitzen und einen Durchmesser von ungefähr 83,4 + 2,3 A* haben,
5. 5. PiIi nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet , daß sie abgeleitet sind von Stämmen der Art

   Pittsburgh 3~2 (ATCC 31149)

   Pittsburgh 4-2 (ATCC 31151)

   CDCM-2 (ATCC 31148)

   CDC C-2 (ATCC )

   CDC-T-2 (ATCC 31150)

   Norfolk 2-2 (ATCC )

   CDC 339-2 (ATCC )

   609853/1057

   si
6. 6. Verfahren zur Herstellung der Piluskristalle nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet , daß man

   a) die Kultur von pilierten N. Gonorrhoeae-Zellen in einem wäßrigen Medium mit einem pH-Wert unter 9,2 und über 5,5 suspendiert,

   b) den löslichen vom unlöslichen Teil der Suspension trennt,

   c) den unlöslichen Teil der Stufe b) in einem wäßrigen Medium mit einem pH-Wert im Bereich von 7,7 bis 11,0 suspendiert,

   d) den unlöslichen vom löslichen Teil der nach Stufe c) erhaltenen Suspension trennt,

   e) den pH-Wert des in Stufe d) erhaltenen löslichen Teils auf unter 9,2 und über 4 erniedrigt und

   f) die entstehenden Piluskristalle von dem wäßrigen Medium abtrennt.
7. 7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet , daß man von einer Kultur von dem Typ T₂ ausgeht und diese in Stufe b) mit geringer Geschwindigkeit zentrifugiert,

   c) die erhaltene Perle in einem wäßrigen Medium mit einem pH-Wert zwischen 9,3 und 11,0 suspendiert,

   d) die Suspension mit geringer Geschwindigkeit zentrifugiert,

   e) den pH-Wert der überstehenden Flüssigkeit unter 9,2 erniedrigt und

   f) die Piluskristalle mit geringer Geschwindigkeit abzentrifugiert.
8. 8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet , daß man die in Stufe d) erhaltene Perle bzw. den Feststoff

   i) in dem Medium der Stufe c) erneut suspendiert, ii) diese Suspension mit geringer Geschwindigkeit zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit mit der beim ersten Zentrifugieren in der Stufe d) erhaltenen Flüssigkeit zusammengibt, und iii) die vereinigten überstehenden Flüssigkeiten mit hoher Geschwindigkeit zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit entsprechend Stufe e) weiterverarbeitet.

   ../3 609853/1057

   SS
9. 9. Verfahren nach Anspruch 6 Ms 8, dadurch gekennzeichnet , daß man von N. Gonorrhoeae-Zellen vom Typ Tp ausgeht,

   a) die pilierte Kultur in einem Medium mit einem pH-Wert von 8,0 bis 8,9 suspendiert,

   b) die Suspension mit 1 bis 12 kg zentrifugiert,

   c) den Feststoff in einem wäßrigen Medium mit einem pH-Wert zwischen 10,0 und 10,4 suspendiert,

   d) die Suspension mit 1 bis 12 kg zentrifugiert,

   i) erneut in einem Medium mit einem pH-Wert zwischen 10,0 und

   10,4 suspendiert, ii) diese Suspension mit 1 bis 12 kg zentrifugiert und

   iii) die vereinigten überstehenden Flüssigkeiten mit 12 bis

   kg zentrifugiert,

   e) den pH-Wert der überstehenden Flüssigkeiten durch Dialyse gegen einen Puffer mit einem pH-Wert von 8,2 bis 8,7 bei 20⁰C erniedrigt und

   f) durch Zentrifugieren des Dialysats mit 1 bis 10 kg die Piluskristalle gewinnt.
10. 10. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet , daß man von einer Kultur vom Typ T^ ausgeht und

    b) die Suspension mit niedriger Geschwindigkeit zentrifugiert,

    c) den Feststoff in einem wäßrigen Medium mit einem pH-Wert zwischen 8,6 und 11,0 suspendiert,

    d) die Suspension mit geringer Geschwindigkeit zentrifugiert,

    e) den pH-Wert der überstehenden Flüssigkeit unter 7,7 herabsetzt und

    f) die Piluskristalle durch Zentrifugieren bei niedriger Geschwindigkeit gewinnt.
11. 11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man den in Stufe d) erhaltenen Feststoff i) wieder in dem Medium der Stufe c) suspendiert,

    ../4 609853/1057

    ii) diese Suspension mit geringer Geschwindigkeit zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit mit der beim ersten Zentrifugieren erhaltenen zusammengibt und

    iii) die vereinigten überstehenden Flüssigkeiten mit hoher Geschwindigkeit zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit entsprechend Stufe e) weiterverarbeitet.
12. 12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet , daß man

    a) die pilierte Zellkultur in einem Medium mit einem pH-Wert von 7,0 bis 7,7 suspendiert,

    b) die Suspension mit 1 bis 12 kg zentrifugiert,

    c) den Feststoff in einem wäßrigen Medium mit einem pH-Wert zwischen 8,6 und 10,4 suspendiert,

    d) die Suspension mit 1 bis 12 kg zentrifugiert,

    i) den Feststoff wieder in einem Medium mit einem pH-Wert

    zwischen 8,6 und 10,4 suspendiert, ii) die Suspension mit 1 bis 12 kg zentrifugiert,

    iii) die zusammengegebene überstehende Flüssigkeit mit

    12 bis 70 kg zentrifugiert,

    e) den pH-Wert der überstehenden Flüssigkeit durch Dialyse gegen einen Puffer mit einem pH-Wert von 5,5 bis 7,7 bei 20⁰C herabsetzt und

    f) die Piluskristalle durch Zentrifugieren des Dialysats mit 3000 bis 10000 UpM (3 bis 10 Krpm) gewinnt.
13. 13. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet , daß man den pH-Wert in Stufe a) auf einen Wert unter 7,7 aber-über 5,5 einstellt, wobei die Piluskristalle vom Typ T.. und T₂ in der festen Phase verbleiben.
14. 14. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet , daß man in Stufe a) den pH-Wert auf nicht weniger als 8,6 herabsetzt, wobei die Piluskristalle vom Typ T^ in Lösung gehen.
15. 15. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man in Stufe e) den pH-Wert auf unter 7,7 aber über 5,5 einstellt, wodurch die Piluskristalle vom

    609853/1057 ../5

    Typ T. und Tp ausgefällt werden.
16. 16. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man in Stufe e) den pH-Wert auf nicht weniger als 8,6 herabsetzt, wodurch nur die Piluskristalle vom Typ Tp ausfallen.
17. 17· Verfahren zur Herstellung der Piluskristalle nach Anspruch 2 oder 3,dadurch gekennzeichnet, daß man

    a) eine Kultur von pilierten N, Gonorrhoeae-Zellen in einem wäßrigen Puffer mit einem pH-Wert über 10 suspendiert,

    b) die Zellen von der Suspension abtrennt und

    c) die Piluskristalle durch Zugabe von Ammoniumionen ausfällt.
18. 18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet , daß man die ausgefällten Piluskristalle abtrennt.
19. 19· Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, dadurch g e kennzeichnet , daß man in Stufe a) einen Äthanolaminpuffer und in Stufe c) Ammoniumsulfat verwendet.
20. 20. Verfahren nach Anspruch 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet , daß man eine Konzentration an Ammoniumionen,berechnet als Ammoniumsulfat, von mehr als 3 Gew.-%, vorzugsweise 3 bis 6 Gew.-%, bezogen auf das wäßrige Medium,anwendet.
21. 21. Verfahren zur getrennten Herstellung von Piluskristallen nach Anspruch 2 und 3, dadurch gekennzeichnet , daß man

    a) ein Gemisch, enthaltend Piluskristalle von N. Gonorrhoeae Typ T₁ und Tp,in einem Puffer mit einem pH-Wert von mehr als 10 löst,

    609853/1057

    2817870

    b) den pH-Wert auf weniger als 9,2 aber mehr als 8,5 verringert,

    c) die ausgefallenen Piluskristalle vom Typ T₂ von der Pufferlösung abtrennt und

    d) den pH-Wert der Lösung auf 7,7 bis 7,0 verringert und gegebenenfalls

    e) die ausgefallenen Piluskristalle vom Typ T₁ abtrennt.
22. 22. Verfahren zur getrennten Herstellung von Piluskristallen nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Gemisch, enthaltend die beiden Arten von Piluskristallen, mit einem Puffer mit einem pH-Wert über 8,5 aber unter 9,2 behandelt und

    b) die nicht gelösten Kristalle vom Typ Tp von dem Gemisch abtrennt .
23. 23· Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet , daß man

    c) den pH-Wert der in Stufe b) verbleibenden Lösung auf einen Wert zwischen 7,7 und 5,5 einstellt und

    d) die so entstehenden Kristalle vom Typ T. von der Lösung abtrennt .
24. 24. Verfahren zur Herstellung von PiIi nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß man

    a) die PiIi aus einem heterogenen, wäßrigen Gemisch löst, indem man

    i) ausreichend Wasser zusetzt, um die Salzionenstärke unter 0,002 herabzusetzen,

    ii) ausreichend Alkali- oder Erdalkalisalz einer Mineralsäure zusetzt, um die Ionenstärke über 4,4 zu erhöhen, iii) den pH-Wert des wäßrigen Gemisches unter 4,5 aber über 2,5 verringert oder

    iv) ausreichend Sucrose zusetzt, um die Suerosekonzentration über 50 Gew.-% zu erhöhen.

    b) den festen von dem flüssigen Anteil der Lösung abtrennt und

    c) zur Ausfällung der PiIi aus der Lösung

    ../7 609853/1057

    i) ausreichend Alkali- oder Erdalkalisalze von Mineralsäuren zusetzt, um die Salzionenkonzentration über 0,05 Ionenstärke zu erhöhen,

    ii) ausreichend Wasser zusetzt, um die Salzionenstärke auf weniger als 0,5 herabzusetzen, iii) ausreichend mit Tris gepufferte Salzlösung zusetzt, um ein Medium mit einer Ionenstärke von 0,05 bis 0,5 bei einem pH-Wert zwischen 4,5 und 9,2 zu erhalten oder iv) ausreichend Wasser zusetzt, um die Sucrosekonzentration unter 40 Gew.-% zu verringern.
25. 25· Verfahren zur Herstellung der PiIi nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß man

    a) den pH-Wert eines heterogenen oder homogenen Gemisches,in dem sie enthalten sind, auf 10,0 bis 11,0 einstellt,

    b) ausreichend Caesium-chiorid zugibt, um die Salzkonzentration auf einen Wert zwischen 0,2 und 0,5 g/cm CsCl zu erhöhen

    c) das Gemisch mit 100 bis 300 kg 30 bis 60 Stunden zentrifugiert bis das gewünschte Gleichgewicht erreicht ist,

    d) die Fraktion mit einer Dichte zwischen 1,35 und 1,33 g/cnr abtrennt und

    e) das Caesium-chlorid von der Lösung entfernt.
26. 26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch g e k e η η zeic'hnet , daß man in Stufe e) gegen einen Puffer mit einem pH-Wert unter 8,6 dialysiert.
27. 27. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß man in Stufe e) gegen einen Puffer mit einem pH-Wert unter 7,7 dialysiert.
28. 28. PiIi nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus mindestens 92 % GC-Pilin und 6 bis 8_% eines Proteins bestehen, das abgeleitet werden kann von den PiIi von N. Gonorrhoeae-Kultüren vom Typ T^ und T₂ mit einem Molekulargewicht von ungefähr 28000 Dalton und in Einzelstäbchen zerfallen können, bestehend aus diesem Protein und

    ../8 609853/1057

    -JB-

    dem Pilin bei einem pH-Wert über 9,3.
29. 29. Verwendung der Kristalle nach Anspruch 1 bis 5 zum Nachweis von Antikörpern gegen N. Gonorrhoeas, wobei man die Kristalle mit einem Serum zusammenbringt, in dem die Antikörper vermutet werden und das Auftreten von Agglutinationen der Kristalle oder Stäbchen, die das Vorhandensein von Antikörpern anzeigen, beobachtet.
30. 30. Verwendung nach Anspruch 29 zur Bestimmung der relativen Konzentration von Antikörpern in dem Serum, wobei man das Serum mit vorherbestimmten Mengen eines immunologisch inaktiven Verdünnungsmittels verdünnt und diejenige Verdünnung bestimmt, bei der keine beobachtbare Agglutination mehr auftritt.
31. 31. Verwendung nach Anspruch 30, wobei man als Verdünnungsmittel mit Tris oder Phosphatpuffer gepufferte Salzlösung mit einem pH-Wert von 7,0 bis 8,0 verwendet.
32. 32. Impfstoff gegen N. Gonorrhoeae, enthaltend die Piluskristalle nach Anspruch 1 bis 5 in einem pharmakologisch geeigneten Medium zur subkrutanen oder intramuskulären Injektion.

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