DE2701643A1 - Verfahren zur extraktion von antigenen, deren verwendung und sie enthaltende produkte - Google Patents
Verfahren zur extraktion von antigenen, deren verwendung und sie enthaltende produkteInfo
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Description
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Case 25,819
American Cyanamid Company, Wayne, New Jersey, USA
Verfahren zur Extraktion von Antigenen, deren Verwendung und sie enthaltende
Produkte
Die Erfindung liegt auf dem Gebiet der Serologie, der Mikrobiologie
und der Immunologie und betrifft insbesondere ein Verfahren zur Gewinnung eines Antigens aus ganzen Zellen oder
einem Kulturmedium, in dem diese Zellen gezüchtet wurden, die Verv/endung des in dieser Weise erhaltenen Antigens und dieses
Antigen enthaltende Produkte.
Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Gewinnung eines membranassoziierten oder Oberflächen-Antigens aus Bakterien,
Hefen, Schimmelpilzen, Protozoen etc. oder irgendwelchen vielzelligen Tieren. Das in dieser Weise erhaltene Antigen kann
bei Antigen-Antikörpar-Testverfahren zum Nachweis von Infektionen und Erkrankungen oder als immunisierendes Agens zur Vorhin-
7Of' η / ! H7
• s-
derung dieser Krankheiten dienen.
Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Gewinnung eines meinbranassoziierten oder Oberflächen-Antigens aus ganzen
Zellen oder einem Kulturmedium, in dem diese Zellen gezüchtet
wurden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man
a) die Zellen abtötet und fixiert;
b) die Zellen von dem Medium abtrennt;
c) das Antigen mit einer wäßrigen, alkalisch gepufferten Alkalimetallsalzlösung
mit einem pH-Wert von etwa 6,0 bis etwa 11,0 und einer Konzentration des Puffers und des Salzes von mindestens
0,01 Mol/l (0,01 molar) aus den Zellen oder dem Kulturmedium extrahiert;
d) das Antigen konzentriert;
e) das konzentrierte Antigen mit einer wäßrigen Säurelösung oder
sauren Pufferlösung mit einem pH-Wert von etwa 1,0 bis etwa 6,0 und einer Konzentration der Säure oder des Puffers
von mindestens 0,01 Mol/l (0,01 molar) im sauren Bereich ausfällt; und
f) das sauer ausgefällte Antigen mit einer wäßrigen alkalischen Pufferlösung mit einem pH-Wert von etwa 6,0 bis etwa 11,0 und
einer Konzentration des Puffers von mindestens 0,01 Mol/l (0,01 molar) solubilisiert und gewünschtenfalls das solubilisierte
Antigen während etwa 15 Minuten bis etwa 4 Stunden bei einer Temperatur von etwa 00C bis etwa 450C mit einem proteo-Iytischen
Enzym digeriert bzw. behandelt und dann die Behandlung des Antigens mit dem Enzym beendet.
Neisseria-Bakterien, auf die das erfindungsgemäße Verfahren angewandt
werden kann, sind: Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitis, Neisseria lactamicus, Neisseria sicca, Neisseria flava,
Neisseria flavescens, Neisseria pufava und Neisseria catarrhalis.
Andere Bakterien, auf die das erfindungsgemäße Verfahren angewandt
werden kann, sind:
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(ο '
Staphylokokkus, Streptokokkus, Diplokokkus, Vibrio, Salmonella,
Arizona, Citrobacter, Bethesda-Ballerup, Shigella, Escherichia, Klebsiella, Aerobacter, Serratia, Proteus, Providence, Bruceila,
Heniophilis, Pasteurella, Actinobazillus, Bordetella, Pseudomonas, Listeria, Erysiplothrix, Bacteriodes, Streptobazillus, Bartonella,
Mycoplasma, Donavania, Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Moycobacterium, Actinomycetes, Borellia, Treponema, Leptospira
und Spirillium.
Weiterhin kann man bei d^m erfindungsgemäßen Verfahren Rickellsia,
wie Chlanydia; Membranviren, ζ. B. Mycovirus, Arbovirus und Pockenvirus; Protozoen, wie Sarcodina, Ciliophora, Mastigophora und
Sporozoa; Metazoen, wie Trematoden, Cestoden und Nematoden; und neoblastische und andere eukaryotische Zellen verwenden.
Die Erfindung betrifft gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform,
auf die sie jedoch nicht beschränkt sein soll, ein Verfahren zur Gewinnung eines Antigens aus Zellen von Neisseria
gonorrhoeae und/oder dem Kulturmedium, in dem diese Zellen gezüchtet
wurden, die Verwendung des in dieser Weise erhaltenen Antigens sowohl bei Antigen-Antikörper-Testverfahren als auch als immunisierendes
Mittel und die das Antigen enthaltenden Produkte.
Bei der Durchführung einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens werden Antigene aus Zellen von Neisseria gonorrhoeae, die in einem flüssigen Kulturmedium gezüchtet wurden,
und aus dem Kulturmedium als solchem gewonnen und an Cholesterin-Lecithin-Teilchen
gebunden. Diese Teilchen dienen dann als Trägermaterial für die Agglutinierung des Antigens in Gegenwart eines
Serums, das Antikörper gegen Neisseria gonorrhoeae enthält. Die Sichtbarkeit der Agglutinierung des Antigen-Cholesterin-Lecithin-Komplexes
wird dadurch gesteigert, daß man den Komplex mit einem lipidlöslichen Farbstoff anfärbt. Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung einen auf Humanserum anzuwendenden
makroskopischen Test zum Nachweis von Antikörpern gegen Neisseria gonorrhoeae, dem Verursacher der Gonorrhöe. Diese Antikörper gebenen
einen Hinweis, daß die Gonorrhöe vorhanden ist oder vorhanden war. Bei dem erfindungsgemäßen Test wird aus venösem Blut ge-
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wonnenes und erhitztes Serum verwendet und gibt einen Hinweis auf an Gonorrhöe Erkrankte und auf Träger dieser Krankheit.
Die an warmblütigen Tieren erzielten Testergebnisse zeigen, daß das aus Zellen von Neisseria gonorrhoeae und dem Kulturmedium,
in dem diese Zellen gezüchtet worden sind, gewonnene Antigen eine
heftige Antikörper-Reaktion bei warmblütigen Tieren ergibt, und zeigen ferner, daß das Antigen als wirksames Immunisierungsmittel
gegen Gonorrhöe verwendet werden kann.
Ganz allgemein betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Gewinnung von Antigenen aus irgendwelchen Zellen oder Zellorganismen,
die ein mit der Membran assoziiertes Antigen oder ein Oberflächen-Antigen aufweisen, wobei das Antigen entweder aus
den Zellen oder dem flüssigen, halbfesten oder festen Züchtungsmedium, in dem die Zellen gezüchtet wurden, gewonnen wird;
das in dieser Weise erhaltene Antigen; ein Verfahren zur Herstellung eines Antigen —Reagens-Präparats, das einen spezifischen
Nachweis einer Infektion oder einer Erkrankung unter Verwendung des in dieser Weise erhaltenen Antigens ermöglicht,
das zusammen mit einem Farbstoff und Cholesterin-Lecithin-Teilchen eingesetzt wird; das in dieser Weise bereitete Antigen-Reagens;
ein Verfahren zur Durchführung von Agglutinations-Tests zum Nachweis von Infektionen unter Verwendung des in dieser
Weise bereiteten Antigen-Reagens, das auf einem Teststreifen vorliegt; eine Testanordnung zur Durchführung eines Agglutinationstests
zum Nachweis von Infektionen, welche Testanordnung das in dieser Weise bereitete Antigen-Reagens zusammen
mit anderen zur Durchführung des Tests notwendigen Komponenten enthält; und die Verwendung des in dieser Weise erhaltenen Antigens
zur Verhinderung von Antikörper-Reaktionen bei und als Immunisierungsmittel
für Warmblüter.
Erfindungsgemäß werden insbesondere die Organismen oder Zellen
in einem flüssigen Kulturmedium gezüchtet, worauf das Antigen aus den ganzen Zellen oder dem flüssigen Medium, in dem die Zellen
gezüchtet wurden, extrahiert wird. Das erfindungsgemäße Verfahren ist jedoch auch auf Organismen und Zellen anwendbar, die
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auf einer halbfesten oder festen Matrix, wie Gelatine, Agar, Agarose oder Mischungen davon gezüchtet worden sind, wobei in. diesem
Fall das Antigen sowohl aus den Zellen als auch der halbfesten oder festen Matrix, auf der die Zellen gezüchtet wurden,
extrahiert wird. In diesem Fall werden die Zellen von dem Züchtungsmedium, wie dem Agar, abgekratzt, worauf der Agar beispielsweise
mit Hilfe einer Mischeinrichtung verflüssigt wird und das Antigen dann in der beschriebenen Weise sowohl aus den
Zellen als auch aus dem verflüssigten Agar extrahiert wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Solubilisierung
von an die Membran gebundenes und/oder Oberflächen-Antigen unter Aufrechterhaltung der strukturellen Integrität der Zelle, wobei
nur eine minimale Menge der Bestandteile des Cytoplasmas extrahiert
werden. Die in roher Form (das heißt ohne saure Ausfällung und ohne Enzymbehandlung gewonnenen) verwendeten Antigene oder
die durch Säureausfällung und durch Enzymbehandlung weiterverarbeiteten Antigene können an Cholesterin-Lecithin-Teilchen absorbiert
werden und ergeben das erfindungsgemäße diagnostische Antigen-Reagenspräparat.
Die Antigene, die man zur Herstellung des Antigenreagens verwenden kann, schließen das rohe, aus den Zellen
gewonnene Antigen, das nicht sauer ausgefällt oder enzymatisch digeriert wurde, das aus den Zellen gewonnene, sauer ausgefällte
und enzymatisch digerierte Antigen, das aus dem Kulturmedium gewonnene, nicht sauer ausgefällte und enzymatisch
digerierte rohe Antigen und das aus dem Kulturmedium gewonnene, sauer ausgefällte und enzymatisch digerierte Antigen oder Mischungen
davon ein.
Die erfindungsgemäß bereiteten Antigene entfalten ihre Wirkung
sowohl in vivo als auch in vitro. Der hierin angesprochene Neisseria gonorrhoeae-Test ist ein Beispiel für die in vitro-
und in vivo-Aktivität eines erfindungsgemäß gewonnenen Antigens. Die Ergebnisse der an warmblütigen Tieren durchgeführten Untersuchungen
haben gezeigt, daß das erfindungsgemäß hergestellte Antigen bei warmblütigen Tieren eine Antikörper-Reaktion verursacht
und daß das Antigen für Menschen als Immunisierungsmittel,
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Λ"
beispielsweise als Impfstoff, verwendet werden kann. Aus Neisseria gonorrhoeae gewonnene und mit Enzym digerierte Antigene
sind zusammen mit dem unvollständigen Freund'sehen Adjuvans
an Mäuse und Kaninchen verabreicht worden. Sowohl Mäuse als auch die Kaninchen zeigten eine serologische Reaktion und
bilden Antikörper, die eine starke Agglutination des Antigens verursachen, wenn dieses an die Cholesterin-Lecithin-Teilchen
gebunden ist. Hieraus ergibt sich, daß das erfindungsgemäß aus Neisseria gonorrhoeae gewonnene und mit Enzymen digerierte Antigen
als Hauttest-Antigen zum Nachweis der Gonorrhöe beim Menschen verwendet werden kann. Das Antigen wird hierzu auf das gewünschte
Maß der Reaktivität eingestellt und in eine Tauchmischung eingearbeitet werden, ähnlich wie man sie für den Tuberkulose-Nadel-Test
verwendet. Die Nadeln werden dann in diese Mischung eingetaucht, wodurch die Dosis des Materials an der Spitze der Nadel
haften bleibt, die zur Verursachung einer Hautreaktion erforderlich ist. Wenn die Spitze der Nadel auf die Oberfläche
der Haut aufgebracht oder die Oberfläche der Haut damit durchstoßen wird, wird ein Teil des Antigens von dem Gewebe zurückgehalten.
Wenn eine Immunreaktion auf das Antigen erfolgt, ergeben sich, wie auch bei anderen Antigen-Hauttests, eine Schwellung
und ein Erythem-Bereich. Alternativ kann man das Antigen auch intradermal verabreichen und eine gleichartige Reaktion
verursachen.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform betrifft die
Erfindung ein Verfahren zur Gewinnung eines Antigens aus Zellen von Neisseria gonorrhoeae, die in einem flüssigen Kulturmedium
gezüchtet worden sind, wobei das Antigen entweder aus den Zellen oder dem Kulturmedium, in dem die Zellen gezüchtet
wurden, gewonnen wird; das in dieser Weise erhaltene Antigen, ein Verfahren zur Herstellung eines Antigen-Reagens-Präparats,
das den spezifischen Nachweis einer durch Neisseria gonorrhoeae verursachten Infektion ermöglicht, unter Verwendung des in dieser
Weise erhaltenen Antigens, das zusammen mit einem Farbstoff und Chlolesterin-Lecithin-Teilchen eingesetzt wird; das in dieser
Weise bereitete Antigenreagens; ein Verfahren zur Durchfüh-
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rung eines Agglutinationstests zum Nachweis von durch Neisseria gonorrhoeae verursachten Infektionen unter Verwendung des in
dieser Weise bereiteten Antigenreagens sowie dieses Verfahren, bei dem ein Teststreifen angewandt wird; und eine Testanordnung
zur Durchführung des Agglutinationstests zum Nachweis von durch Neisseria gonorrhoeae verursachten Infektionen, die das
in dieser Weise bereitete Antigenreagens und andere Bestandteile der Testanordnung enthält, die zur Durchführung des Tests
erforderlich sind; und die Verwendung des in dieser Weise erhaltenen Antigens zur Verhinderung einer Antikörper-Reaktion
und als Mittel zur Immunisierung von Menschen gegen durch Neisseria gonorrhoeae verursachte Infektionen.
Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Gewinnung eines Antigens aus ganzen Zellen von Neisseria gonorrhoeae,
die in einem flüssigen Kulturmedium gezüchtet worden sind, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man
(a) die Zellen von dem Züchtungsmedium abtrennt und
(b) das Antigen mit einer wäßrigen, alkalisch gepufferten Alkalimetallsalzlösung mit einem pH-Wert von etwa 6,0 bis
etwa 11,0 und einer Konzentration des Puffers und des Salzes
von mindestens 0,01 Mol/l extrahiert. Hierbei erhält man ein rohes Antigen, das man zur Herstellung des erfindungsgemäßen
Antigen-Reagens verwenden kann. Eine weiter bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft ein weiter
gereinigtes Antigen, das man durch die zusätzlichen Schritte erhält, daß man
(c) das extrahierte Antigen konzentriert;
(d) das konzentrierte Antigen mit einer wäßrigen Säurelösung oder sauren Pufferlösung mit einem pH-Wert von etwa 1,0
bis etwa 6,0 und einer Konzentration der Säure oder des Puffers von mindestens 0,01 Mol/l sauer ausfällt;
(e) das sauer ausgefällte Antigen mit einer wäßrigen alkalischen Pufferlösung mit einem pH-Wert von etwa 6,0 bis etwa 11,0
und einer Pufferkonzentration von mindestens 0,01 Mol/l solubilisiert
oder löslich macht;
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- Jk -
•ΛΛ-
(f) das solubilisierte Antigen während etwa 15 Minuten bis etwa 4 Stunden bei einer Temperatur von etwa 00C bis etwa
45°C mit einem proteolytischen Enzym digeriert; und
(g) die Behandlung des Antigens mit dem Enzym beendet.
Die bevorzugteste Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens
zur Bewinnung eines Antigens aus Zellen von Neisseria gonorrhoeae, die in einem flüssigen Kulturmedium gezüchtet
worden sind, ist dadurch gekennzeichnet, daß man
(a) die ganzen Zellen von Neisseria gonorrhoeae abtötet und fixiert;
(b) die Zellen von dem flüssigen Kulturmedium abtrennt;
(c) das Antigen mit einer wäßrigen, alkalisch gepufferten Alkalimetallsalzlösung mit einem pH-Wert von etwa 8,2 bis
etwa 8,8 und einer Pufferkonzentration von etwa 0,1 Mol/l aus den Zellen extrahiert;
(d) das Antigen konzentriert;
(e) das konzentrierte Antigen mit einer wäßrigen Säurelösung oder sauren Pufferlösung mit einem pH-Wert von etwa 2,0
bis etwa 4,0 und einer Konzentration der Säure oder des Puffers von etwa 0,1 Mol/l im sauren Bereich ausfällt;
(f) das sauer ausgefällte Antigen mit einer wäßrigen, alkalischen Pufferlösung mit einem pH-Wert von etwa 8,2 bis etwa
8,8 und einer Pufferkonzentration von etwa 0,05 bis etwa 0,1 Mol/l solubilisiert;
(g) das solubilisierte Antigen während etwa 15 Minuten bis etwa 4 Stunden bei einer Temperatur von etwa 00C bis etwa 45°C
mit einem proteolytischen Enzym digeriert; und
(h) die Behandlung des Antigens mit dem Enzym beendet. Es hat sich gezeigt, daß das Antigen sehr stabil wird, wenn die
Zellen mit Formaldehyd fixiert werden. So kann es bei 4°C bei voller Aufrechterhaltung der Aktivität während längerer
Zeitdauern aufbewahrt werden.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung werden Stämme von Neisseria gonorrhoeae in einem belüfteten flüssigen Kulturmedium
während etwa 4 bis 72 Stunden gezüchtet. Dann werden die Zellen mit einem Fixiermittel abgetötet. Als bevorzugtes Fixier-
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•λ/
mittel verwendet man eine wäßrige Formaldehydlösung (Formalin). Andere geeignete Fixiermittel sind dem Fachmann bekannt und
schließen jene ein, die zur Fixierung von Zellen oder Geweben für die histologische und/oder mikroskopische Untersuchung angewandt
werden. Die Zellen von Neisseria gonorrhoeae werden dann durch Zentrifugieren, Filtrieren, Dekantieren oder in anderer
Weise von dem flüssigen Kulturmedium abgetrennt, das jedoch aufbewahrt wird. Die bevorzugte Abtrennmethode besteht darin, durch
Zentrifugieren Pellets zu bilden.
Die Extraktion des Antigens aus den abgetöteten und fixierten Zellen wird mit einer alkalisch gepufferten Salzlösung erreicht,
deren Konzentration sowohl bezüglich des alkalischen Puffers als auch des Salzes mindestens 0,01 Mol/1 oder mehr beträgt, wobei gemäß
einer besonders bevorzugten Ausführungsform die Konzentration des alkalischen Puffers 0,1 Mol/l oder mehr und die Konzentration
des Salzes 1,0 Mol/l oder mehr betragen. Ein bevorzugter alkalischer Puffer ist Natriumphosphat, obwohl man auch andere geeignete
alkalische Puffer verwenden kann, beispielsweise Tris(hydroxymethy1)-aminomethan,
Hepes(N-2-Hydroxymethyl-piperazin-N-2-äthansulfonsäure), Borate etc. Das bevorzugte Salz ist Kaliumchlorid,
wenngleich man auch andere Alkalimetallsalze, die Kalium, Natrium oder Lithium enthalten, verwenden kann. Der pH-Wert der alkalisch
gepufferten Salzlösung sollte zwischen etwa 6,0 und etwa 11,0, bevorzugter zwischen etwa 8,2 und 8,8 und am bevorzugtesten zwischen
8,2 und 8,5 liegen.
Nach der Extraktion des Antigens mit der wäßrigen, alkalisch gepufferten
Salzlösung aus den Zellen trennt man die Zellen von dem Extraktionsmittel ab und engt dieses ein (beispielsweise durch
Ultrafiltration, durch Trocknen und/oder durch Dialyse. Der konzentrierte Extrakt wird dann mit einer wäßrigen Säure oder einem
wäßrigen sauren Puffer behandelt, um das Antigen auszufällen. Das Antigen kann mit einer wäßrigen Säure, beispielsweise einer
1n-Chlorwasserstoffsäure, oder mit einem wäßrigen sauren Puffer
mit einem pH-Wert von etwa 1,0 bis etwa 6,0, optimal mit einem
pH-Wert von etwa 2,0 bis etwa 4,0 und insbesondere mit einem pH-
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'AV
Wert von etwa 3,6 ausgefällt werden. Die molare Konzentration des sauren Puffers kann etwa 0,01 bis etwa 1,0 Mol/l, optimal
etwa 0,1 Mol/l (0,1 molar) betragen. Geeignete saure Puffer sind beispielsweise Acetat-Puffer, Mcllvanine-Puffer, Barbitol-Acetat-Puffer
etc. Der bevorzugte saure Puffer ist ein Natriumacetat-Essigsäure-Puff
er. Das sauer ausgefällte Antigen wird dann beispielsweise durch Zentrifugieren von der Säure oder dem sauren
Puffer abgetrennt und einmal oder mehrfach mit der Säure oder dem sauren Puffer gewaschen, worauf das sauer ausgefällte Antigen
mit einer wäßrigen, alkalischen Pufferlösung mit einem pH-Wert von etwa 6,0 bis etwa 11,0, vorzugsweise mit einem pH-Wert
von 8,2 bis 8,8 und noch bevorzugter mit einem pH-Wert von 8,2 bis 8,5 solubilisiert oder löslich gemacht bzw. gelöstwird. Die molare
Konzentration dieses Puffers kann etwa 0,01 Mol/l bis etwa 1,0 Mol/l und noch bevorzugter etwa 0,05 Mol/l bis etwa 0,1 Mol/l
betragen. Wie im Fall der Extraktionsstufe kann man als geeignete alkalische Puffer beispielsweise Natriumphosphat, Kaliumphosphat
, Tris(hydroxymethyl)-aminomethan, Hepes(N-2-Hydroxymethylpiperazin-N-2-äthan-sulfonsäure),
Borate etc. verwenden. Der bevorzugte Puffer ist eine Mischung aus Chlorwasserstoffsäure und
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan, beispielsweise ein 0,05 molarer Tris(hydroxymethyl)-aminomethan-hydrochlorid-Puffer mit einem
pH-Wert von 8,2 bis 8,5.
Das Digerieren des Antigens erreicht man mit einem proteolytischen
Enzym, wie einer Proteinase, beispielsweise mit Pepsin, Trypsin, Chymotrypsin, Papain, Chymopapain etc. Das bevorzugte
Enzym ist Pepsin. Bezüglich der Enzymkonzentration besteht keine obere Grenze, abgesehen von dem, was die Praxis erfordert. Die
untere Grenze der Enzymkonzentration sollte etwa 0,01 Mol/l pro OD-Einheit des Antigens bei 280 nm betragen. Das Digerieren kann
während einer Zeit von etwa 1/4 Stunde bis etwa 4 Stunden und bei Temperaturen von etwa 00C bis etwa 45°C erfolgen. Im Fall von
Pepsin behandelt man vorzugsweise während etwa 1 Stunde und 15 Minuten bei einer Temperatur von etwa 37°C. Der pH-Wert des alkalisch
solubilisierten Antigens wird erforderlichenfalls und/oder
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geeigneterweise auf das für das Digerieren eingesetzte besondere Enzym eingestellt. Beispielsweise stellt man beim Digerieren
mit Pepsin das solubilisierte Antigen auf einen sauren pH-Wert ein, d. h. einen pH-Wert von etwa 1,0 bis etwa 6,
vorzugsweise auf einen pH-Wert von etwa 3,2.
Zur Beendigung der Digerierung stellt man den pH-Wert des Pepsins alkalisch, d. h. auf einen pH-Wert von etwa 6,0 bis etwa
11,0 und insbesondere auf einen pH-Wert von 8,2 bis 8,8. Im
Fall von anderen Enzymen kann man, wenn die Einstellung des pH-Wertes nicht geeignet ist, das Digerieren dadurch beenden,
daß man ein Enzymgift, wie Quecksilber oder Cyanid, zusetzt.
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Gewinnung des Antigens von Neisseria gonorrhoeae aus dem flüssigen Kulturmedium,
in dem die Zellen von Neisseria gonorrhoeae gezüchtet wurden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man
(a) die Zellen von dem Medium abtrennt und
(b) das Medium konzentriert. Das in dieser Weise erhaltene Antigen
ist ein rohes Antigen, das man zur Herstellung des erfindungsgemäßen Antigen-Reagens verwenden kann. Ein weiterer
und bevorzugterer Gegenstand der Erfindung betrifft jedoch ein weiter verarbeitetes Antigen, das man durch die
zusätzlichen Schritte erhält, die darin bestehen, daß man
(c) das Antigen mit einer wäßrigen Säurelösung oder einer wäßrigen
sauren Pufferlösung mit einem pH-Wert von etwa 1,0 bis etwa 6,0 und einer Konzentration der Säure oder des Puffers
von mindestens 0,01 Mol/l sauer ausfällt;
(d) das sauer ausgefällte Antigen mit einer wäßrigen, alkalischen Pufferlösung mit einem pH-Wert von etwa 6,0 bis 11,0 und
einer Puffer-Konzentration von mindestens 0,01 Mol/l solubilisiert;
(e) das solubilisierte Antigen während etwa 15 Minuten bis etwa 4 Stunden bei einer Temperatur von etwa 00C bis etwa 45°C
mit einem proteolytischen Enzym digeriert; und
(f) die Behandlung des Antigens mit dem Enzym beendet.
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Gemäß einer bevorzugtesten Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens zur Gewinnung eines Antigens aus dem flüssigen Kulturmedium, in dem Zellen von Neisseria Gonorrhoeae gezüchtet
wurden, besteht darin, daß man
(a) die Zellen von dem Medium abtrennt;
(b) das Medium konzentriert;
(c) das Antigen mit einer wäßrigen Säurelösung oder sauren Pufferlösung
mit einem pH-Wert von etwa 2,0 bis etwa 4,0 und einer Konzentration der Säure oder des Puffers von etwa
0,1 Mol/l sauer ausfällt;
(d) das Antigen aus dem im sauren Bereich gebildeten Niederschlag mit einer wäßrigen, alkalisch gepufferten Alkalimetallsalzlösung
oder einer wäßrigen alkalischen Pufferlösung mit einem pH-Wert von etwa 8,2 bis etwa 8,8 und einer Pufferkonzentration
von etwa 0,1 Mol/l und einer Salzkonzentration von etwa 1,0 Mol/l extrahiert;
(e) die Stufe (c) wiederholt;
(f) das sauer ausgefällte Antigen mit einer wäßrigen, alkalischen Pufferlösung mit einem pH-Wert von etwa 8,2 bis etwa 8,8 und
einer Pufferkonzentration von etwa 0,05 bis etwa 0,1 Mol/l solubilisiert;
(g) das solubilisierte Antigen während etwa 15 Minuten bis etwa 4 Stunden bei einer Temperatur von etwa 00C bis etwa 45°C
mit einem proteolytischen Enzym digeriert; und
(h) die Behandlung des Antigens mit dem Enzym beendet.
Bei der Gewinnung des Antigens von Neisseria gonorrhoeae aus dem flüssigen Kulturmedium, in dem die Zellen gezüchtet wurden, wird
das Medium beispielsweise durch Ultrafiltration, durch Trocknen oder durch Dialyse gewonnen. Wenn das Material getrocknet worden
ist, wird das Konzentrat mit einem wäßrigen sauren Puffer mit einem pH-Wert von etwa 1,0 bis etwa 6,0 und noch bevorzugter
mit einem pH-Wert von 2,0 bis 4,0 und am bevorzugtesten mit einem pH-Wert von etwa 3,6 rehydratisiert. Das in dieser Weise erhaltene
Antigen ist direkt verwendbar oder kann weiter gereinigt werden. Hierzu wird das unlösliche Material von der Flüssigkeit
abgetrennt und mehrfach mit dem sauren Puffer gewaschen, um das
lösliche Material abzutrennen. Dor Niederschlag wird in dem sau-
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ORIGINAL INSPECTED
ren Puffer suspendiert, worauf er abzentrifugiert, abfiltriert oder in anderer Weise abgetrennt wird. Man löst den Niederschlag
in einem alkalischen Puffer mit einem pH-Wert von etwa 6,0 bis 11,0, vorzugsweise mit einem pH-Wert von 8,2 bis 8,8.
Das Digerieren mit dem Enzym wird in der oben beschriebenen Weise durchgeführt. Wenn das Material nicht getrocknet worden
ist, wird es erschöpfend gegen eine Salzlösung (0,001 bis 3 Mol/l, vorzugsweise 0,15 Mol/l) dialysiert. Dieses Material
kann als Antigen verwendet werden oder kann auch weiter gereinigt werden. Hierzu wird der pH-Wert mit einer Säure, vorzugsweise
mit Chlorwasserstoffsäure auf einen Wert von 4,8 bis 5,5 eingestellt. Man verwirft den Niederschlag und stellt die
überstehende Flüssigkeit auf einen pH-Wert von 3,6 ein. Man entfernt den Niederschlag und wäscht mit einem sauren Puffer
mit einem pH-Wert von 3,6. Man löst den Niederschlag in einem alkalischen Puffer mit einem pH-Wert von 6,0 bis 11,0, vorzugsweise
mit einem pH-Wert von 8,2 bis 8,8. Dann wird das Digerieren mit dem Enzym in der oben beschriebenen Weise durchgeführt.
Geeignete saure und alkalische Puffer sind weiter oben angegeben.
Ein besonderer Gegenstand der Erfindung ist das in der obigen Weise extrahierte Antigen. Man kann irgendeines der entweder
aus den Zellen oder dem Kulturmedium, in dem die Zellen gezüchtet
wurden,gewonnenen Antigene als solches oder nach der Vereinigung dieser Antigene zur Herstellung des erfindungsgemäßen
Antigen-Reagens verwenden.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung
ein Verfahren zur Herstellung eines Antigen-Reagens, das den spezifischen Nachweis von durch Neisseria gonorrhoeae verursachten
Infektionen ermöglicht, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man
(a) das in der obigen Weise erhaltene Antigen oder die in der obigen Weise erhaltenen Antigene auf Cholesterin-Lecithin-Teilchen
adsorbiert und
(b) die in dieser Weise erhaltenen Antigen-Cholesterin-Lecithin-
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Teilchen mit einem lipidlöslichen Farbstoff färbt. Zur Herstellung
des Antigen-Reagens kann man das Antigen in einer Menge von etwa 0,01 bis etwa 4,0 OD (280 nm), das Cholesterin
in einer Menge von etwa 0,7 bis etwa 1,4 % und das Lecithin in einer Menge von etwa 0,1 bis etwa 2,0 % verwenden.
Die für die Herstellung des Antigen-Reagens verwendete Menge des lipidlöslichen Farbstoffs kann etwa 1 mg-%
bis etwa 100 mg-% betragen. Repräsentative Farbstoffe sind beispielsweise Sudan Black B, Basic Brown, Amethyst Violet,
Nile Blue A, Azocarmine G und Mischungen davon. Die Farbstoffe und deren Mischungen sind zusammen mit üblichen Lösungsmitteln,
Puffern etc. in dem erfindungsgemäßen Antigen-Reagens
vorhanden. Diese Lösungsmittel, Puffer etc. bilden als solche keinen Gegenstand der Erfindung und werden in
der Weise eingesetzt, wie es für bekannte Antigensysterne der Fall ist.
Die beiden Bestandteile des erfindungsgemäßen Antigen-Reagens, d. h. der Antigen-Cholesterin-Lecithin-Komplex und
der Farbstoff, werden im Fall des Antigens in Konzentrationen von etwa 0,1 mg-Gew.-% bis etwa 1 g-Gew.-% und im Fall
des Farbstoffs in Konzentrationen von etwa 1 mg-Gew.-% bis etwa 100 mg-Gew.-% eingesetzt, wobei diese Gewichtsmengen
auf das Gesamtgewicht der erhaltenen Mischung, einschließlich der Lösungsmittel, d. h. des Wassers, des Alkohols
etc., und des Puffers bezogen sind.
Zur Herstellung der Cholesterin-Lecithin-Teilchen oder -Mischung löst man handelsübliches, aschefreies Cholesterin
in absolutem Alkohol (200 proof). Üblicherweise löst man eine solche Menge des aschefreien Cholesterins in dem absoluten
Alkohol, daß man eine 1,2 %ige Lösung erhält. Dann löst man handelsübliches Ei-, Rinder- oder Pflanzen-Lecithin,
beispielsweise Sojabohnen-Lecithin, in absolutem Alkohol. Man vermischt die beiden Bestandteile dann mit absolutem Alkohol
in einem solchen Verhältnis, daß sich eine Endkonzentration des Cholesterins von etwa 0,7 bis 1,1 %, vorzugsweise
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-Vi-
♦ AB"
von etwa 0,9 %, und eine Endkonzentration des Lecithins von etwa 0,10 bis etwa 2,0 %, vorzugsweise von etwa 0,22 % ergibt.
Die optimale Lecithin-Menge für die Antigen-Suspension ermittelt
man dadurch, daß man zunehmende Mengen von Lecithin in 0,9 %igem Cholesterin zusetzt. Man bereitet Antigen-Suspensionen
mit jeder dieser Cholesterin-Lecithin-Mischungen, wozu man die oben beschriebene Verfahrensweise anwendet. Zur
Herstellung der Antigen-Suspension wendet man ein Verhältnis von Lecithin zu dem 0,9 %igen Cholesterin an, das eine optimale
Reaktivität gegenüber Seren von in Kulturen positiven Individuen und von nichtbefallenen Individuen ergibt.
Man beschickt einen Behälter mit dem in der obigen Weise extrahierten
Antigen und gibt dann die in der oben beschriebenen Weise bereiteten Cholesterin-Lecithin-Teilchen zu. Man schüttelt
den Behälter und läßt dann die Mischung während mindestens 5 Minuten stehen. Man zentrifugiert die teilchenförmige Masse
ab und suspendiert sie erneut in einem USR-Suspendiermedium. Man
färbt die Suspension dann mit dem gewünschten lipidlöslichen Farbstoff oder der Mischung aus den lipidlöslichen Farbstoffen.
Gegenstand der Erfindung ist insbesondere ein in dieser Weise bereitetes Antigen-Reagens.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Durchführung eines Agglutinations-Tests zum Nachweis von durch Neisseria
gonorrhoeae verursachten Infektionen, das darin besteht, daß man ein Testserum mit dem in der obigen Weise bereiteten Antigen-Reagens
vermischt. Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Durchführung eines
Agglutinations-Tests zum Nachweis von durch Neisseria gonorrhoeae verursachten Infektionen, bei dem ein Teststreifen verwendet
wird, auf dem ein Testflecken, beispielsweise ein von einem Kreis eingeschlossener Bereich, zur Aufnahme einer Testprobe
und ein in der obigen Weise bereitetes Antigen-Reagens vorhanden ist, welches Verfahren darin besteht, daß man den Testflekken
mit (a) einem Testserum und (b) dem in der obigen Weise be-
709831/1017
reiteten Antigen-Reagens in Kontakt bringt.
Der Test unter Verwendung des erfindungsgemäßen Antigen-Reagens
umfaßt vorzugsweise die Anwendung eines Teststreifens. Der Teststreifen sollte glatt sein, um die Testergebnisse ohne weiteres
erkennen zu lassen. Obwohl bereits in der Literatur beschrieben wurde, daß die Oberfläche benetzbar sein muß, hat es sich gezeigt,
daß dies nicht der Fall ist und daß eine benetzbare Oberfläche lediglich bevorzugt ist. Der Teststreifen kann aus gut kalandriertem
Papier oder Karton bestehen und kann absorbierbar sein, wenngleich ein lediglich geringes Ausmaß der Absorbierbarkeit bevorzugt
ist. Ein Merkmal des erfindungsgemäßen Antigen-Reagens ist darin zu sehen, daß man das Testergebnis ablesen kann, gleichgültig,
ob der Test-Flecken feucht oder trocken ist, so daß man die Ergebnisse schneller als mit anderen Methoden ermitteln kann.
Der Teststreifen oder die Testkarte kann auch aus einem Schichtstoff bestehen, der ein Grundmaterial aus Papier oder Karton und
eine darauf aufgebrachte Schicht aus einem wasserdurchlässigen oder wasserundurchlässigen Material, wie Polyäthylen, umfaßt. Das
Papier als solches oder der Oberzug sollten jedoch eine Färbung besitzen, die gegenüber der Farbe des in dem Test-Reagens verwendeten
Farbstoffs einen Kontrast darstellt. Im Prinzip kann man irgendeinen Teststreifen oder eine Testkarte ähnlichen Aufbaus und
ähnlicher Zusammensetzung verwenden, wie es in der US-PS 3 074 853 beschrieben ist.
Bei der Durchführung des Tests unter Verwendung des Teststreifens trägt man etwa 0,05 ml Serum, das man während etwa 1/2 Stunde auf
62 bis 630C erhitzt hat, und etwa 1/60 ml des Antigen-Reagens auf
den von einem Kreis (mit einem Durchmesser von beispielsweise etwa 18 mm), der auf einem im Handel erhältlichen, mit Kunststoff beschichteten
Streifen aufgedruckt ist, umschlossenen Bereich auf. Dann rotiert man den Teststreifen oder die Testkarte während 4 bis
20 Minuten bei 80 bis 180 min auf einer mechanischen Dreheinrichtung, obwohl man auch von Hand schütteln kann. Dann untersucht man
den Teststreifen auf das Vorhandensein oder die Abwesenheit einer charakteristischen Klumpenbildung.
709" 3 1 / ■ 017
Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung eine Testanordnung oder Testpackung zur Durchführung eines
Agglutinationstests zum Nachweis von durch Neisseria gonorrhoeae verursachten Infektionen, die im wesentlichen mindestens einen
Teststreifen oder eine Testkarte mit einer Vielzahl von Testflecken, beispielsweise durch Kreise definierten Bereichen,
die zur Aufnahme des Antigen-Reagens und des Kontrollserums
geeignet sind; einen Behälter mit dem in der obigen Weise bereiteten Antigen-Reagens; einen Behälter mit reaktivem Serum;
einen Behälter mit schwach-reaktivem Kontrollserum und einen Behälter mit nichtreaktivem Kontrollserum umfaßt. Die Anordnung oder
Packung kann auch andere Bestandteile enthalten, wie Probenröhrchen, Gummiblasen etc.
Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung des extrahierten Antigens als immunisierendes Mittel. Wie bereits angegeben,
haben Untersuchungen an warmblütigen Tieren gezeigt, daß das mit Enzym digerierte, aus Nesseria gonorrhoeae gemäß der obigen
Weise gewonnene Antigen in warmblütigen Tieren zur Bildung des den Antigen entsprechenden Antikörpers führt, so daß das
Antigen als immunisierendes Mittel zur Behandlung von Menschen verwendet werden kann. Demzufolge umfaßt die Erfindung
auch ein Verfahren zum Immunisieren von Menschen gegen durch Neisseria gonorrhoeae verursachten Infektionen, das darin besteht,
daß man eine immunologisch wirksame Menge eines erfindungsgemäß bereiteten Antigens an Menschen verabreicht. Die
Verabreichung kann parenteral erfolgen. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Verhinderung der Reaktion von warmblütigen
Tieren auf das erfindungsgemäß bereitete Antigen durch Inokulieren der warmblütigen Tiere mit dem Antigen.
Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.
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27016A3
Herstellung von Antigen aus den Zellen und dem Zuchtmedium
von Neisseria gonorrhoeae
Aus einem gefriergetrockneten aliquoten Anteil bildet man eine Saatkultur von Neisseria gonorrhoeae, Stamm B370, der unter
der Hinterlegungsnummer 21824 bei der American Type Culture Collection hinterlegt ist. Nach dem Rehydratisieren mit sterilem,
destilliertem Wasser überträgt man die Flüssigkeit auf ein Schokolade-Eugon-Agar und inkubiert in einem Kerzen-Extraktions-Gefäß
während 24 Stunden bei 360C. Dann inokuliert
man 2 1 Pepton-Medium und überführt es in eine Schütteleinrichtung, die mit 100 min in einem auf 600C erwärmten Raum betrieben
wird. Dann verwendet man 1300 ml des flüssigen Peptonmediums zum Inokulieren des Fermenters (30 1 Fassungsvermögen).
Sämtliche Bestandteile des Mediums werden in dem Fermenter sterilisiert, mit Ausnahme der Glukose, die getrennt zugesetzt
wird. Nach einer Züchtungszeit von etwa 24 Stunden tötet man die Kultur ab und fixiert sie durch Zugabe von Formaldehyd
bis zu einer Endkonzentration von 2 % (Volumen/Volumen).
Man trennt die Zellen durch Zentrifugieren von der flüssigen Kultur ab und bewahrt die überstehende Flüssigkeit auf. Man
extrahiert die Zellen über Nacht bei 40C mit 10 Volumen (Gewicht/Volumen)
einer 1,0 m KCL-Lösung in 0,01 m Na-HPO.-Lösung mit einem pH-Wert von 8,8, worauf man die Zellen abzentrifugiert.
Man vermindert das Extraktvolumen durch Ultrafiltration um etwa den Faktor 100 und bringt dann das Material durch Dialysieren
gegen Polyäthylenglykol 6000 zur scheinbaren Trockne. Die Dialysebeutel spült man gut und bringt sie in einen 0,1 m
Natriumacetat-Essigsäure-Puffer mit einem pH-Wert von 3,6, um
das Antigen zu rehydratisieren und auszufällen. Nach dem Abzentrifugieren solubilisiert man das sauer ausgefällte Antigen
in einem 0,05 m Tris(hydroxymethyl)-aminomethan-Puffer mit einem
pH-Wert von 8,5.
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Nach dem Aufkonzentrieren um etwa den Faktor 70 durch Ultrafiltration
dialysiert man die überstehende Flüssigkeit der Kultur zur Trockne unter Verwendung von Polyäthylenglykol
6000. Die Dialyseröhrchen bringt man mehrfach in einen0,1 m
Natriumacetat-Essigsäure-Puffer ein, um den Inhalt teilweise zu rehydratisieren und um das Antigen auszufällen. Das ausgefällte
Material zentrifugiert man ab, worauf man den abzentrifugierten Feststoff mit 10 Volumen 1 m KCL-Lösung, die 0,1 m
Na2HPO4 enthält (pH-Wert =8,8) extrahiert. Man säuert die
überstehende Flüssigkeit mit Chlorwasserstoffsäure auf einen pH-Wert von 3,6 an und zentrifugiert das sauer ausgefällte
Antigen ab. Die Solubilisierung des Antigens erreicht man durch die Verwendung eines 0,1 m Tris(hydroxymethyl)-aminomethan-Puffers
mit einem pH-Wert von 8,5.
Man vereinigt das aus den Zellen gewonnene/ mit dem Tris(hydroxymethyl)-aminomethan-Puff
er solubilisierte Antigen bzw. die aus den Zellen gewonnenen, in dem Tris(hydroxymethyl)-aminomethanpuffer
solubilisierten Antigene mit der überstehenden Flüssigkeit der Kultur und digeriert das Material mit Pepsin. Man
stellt den pH-Wert der Antigenlösung durch Zugabe von 12 η Chlorwasserstoffsäure auf einen pH-Wert von 3,2 ein. Dann gibt
man 10 mg Pepsin (in 0,2 m Essigsäurelösung in einer Konzentration
von 1 mg/ml) zu 56 ml der Antigenlösung (36 OD-Einheiten bei 280 nm) und inkubiert während 1 1/4 Stunden bei 36°C.
Man beendet die Reaktion durch Zugabe einer 10 η NaOH-Lösung, bis der pH-Wert 8,5 erreicht. Nach dem Inaktivieren des Pepsins
verdünnt man das digerierte Antigen bzw. die digerierten Antigene im Verhältnis 1:1 mit einem 0,05 m-Tris(hydroxymethyl)-aminomethan-Puffer
mit einem pH-Wert von 8,5. Das in dieser Weise bereitete Antigen kann direkt zur Herstellung des Antigen-Reagens
verwendet werden.
Bereitung des Antigens aus dem Kulturmedium von Neisseria
qonorrhoeae
Durch Zentrifugieren entfernt man die mit Formalin fixierten
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27016A3
- a* XY
Zellen aus der Kulturflüssigkeit. Man engt 50 1 der überstehenden
Flüssigkeit durch Ultrafiltration um den Faktor 100 ein. Das Konzentrat dialysiert man gegen eine 0,85 %ige
Salzlösung und bringt dann das Volumen durch Ultrafiltration erneut auf 500 ml. Man stellt den pH-Wert auf 5,2 ein
und zentrifugiert den gebildeten Niederschlag ab. Die überstehende Flüssigkeit stellt man auf einen pH-Wert von 3,8 ein
und zentrifugiert den Niederschlag ab. Der Niederschlag wird erneut in 100 ml eines Tris(hydroxymethyl)-aminomethan-Puffers
mit einem pH-Wert von 8,5 suspendiert.
Herstellung eines in vitro-Antigen-Reagens aus Neisseria
gonorrhoeae
Man vereinigt das gemäß Beispiel 1 aus den Zellen und dem
überstehenden Kulturmedium gewonnene Antigen und adsorbiert es wie folgt an Cholesterin-Lecithin-Teilchen.
Man gibt 130 ml einer Lösung, die 0,9 % Cholesterin und 0,225 % Ei-Lecithin in absolutem Äthanol enthält, tropfenweise zu
'130 ml solubilisiertem Antigen, das bei 160 min in einem Behälter mit flachem Boden gerührt wird. Dann inkubiert man
die Reaktionsmischung während 15 Minuten bei Raumtemperatur. Anschließend zentrifugiert man das ausgefällte Material bei
3000 g während 1/2 Stunde bei 40C ab. Das abzentrifugierte
Material suspendiert man in 1040 ml USR-Puffer und gibt 4,55 ml eines Farbstoffs (Sudan Black B, 10 mg/ml in absolutem
Äthanol) zu, währenddem man mit Hilfe eines Magnetrührers rührt. Man lagertdas angefärbte, ausgefällte Antigen in einer
verschlossenen Glasflasche bei 4°C. Das in der obigen Weise bereitete Antigen-Reagens kann ohne weiteres für den in vitro-Test
verwendet werden.
In vitro-Test zum Nachweis von Antikörpern gegen Neisseria
gonorrhoeae
709;: -M / 'i D 1 7
Man führt den Test unter Verwendung von Serum durch, das man während 1/2 Stunde auf 62 bis 63°C erhitzt hat. Man breitet
0,05 ml Serum und 1/60 ml des gemäß Beispiel 2 bereiteten Antigen-Reagens in dem Kreis mit einem Durchmesser von 18 mm aus,
der auf einem handelsüblichen, weißen Teststreifen angeordnet ist. Man bringt den Teststreifen während 8 Minuten in eine bei
130 min betriebene Klinik-Rotiereinrichtung ein. Bei einer positiven Reaktion sind unter dem einfallenden Licht hellblaue
Aggregate sichtbar, wenn in dem Serum Antikörper für das Antigen vorhanden sind. Eine negative Reaktion läßt sich daran ablesen,
daß das Antigen sich nicht zu diskreten Teilchen zusammenballt, sondern in Form einer homogenen Suspension verbleibt.
Im folgenden sei eine erfindungsgemäße Testanordnung zum in vitro-Nachweis
von durch Neisseria gonorrhoeae verursachten Infektionen erläutert. Die Testanordnung enthält Material für 500 Bestimmungen.
Jede Testanordnung oder Packung enthält: 10 ml des Antigen-Reagens
1 ml reaktives Kontrollserum
1 ml schwach reaktives Kontrollserum 1 ml nichtreaktives Kontrollserum 35 Teststreifen
500 Proberöhrchen
1 ml reaktives Kontrollserum
1 ml schwach reaktives Kontrollserum 1 ml nichtreaktives Kontrollserum 35 Teststreifen
500 Proberöhrchen
Die zur Durchführung des Tests notwendigen Materialien sind als Wegwerfartikel in der Testanordnung enthalten, die so ausgelegt
ist, daß sie einen minimalen Raumbedarf besitzt. Die zu kühlenden Materialien können von jenen getrennt werden, die bei Raumtemperatur
gelagert werden können. In dem Laboratorium müssen eine mechanische Rotiervorrichtung (die auf 130 min eingestellt
werden kann) und eine gute Lichtquelle vorhanden sein. Es wird empfohlen, das Antigen-Reagens zu kühlen. Es hat sich gezeigt,
daß das Antigen bei 2 bis 100C während mehr als 6 Monaten gelagert
werden kann. Es sollte vermieden werden, daß das Antigen dem hellen Sonnenlicht ausgesetzt wird. Das Antigen sollte man vor der
7 0b -JI/ Q 1 7
Verwendung sich auf Raumtemperatur (22,2 bis 25,60C (72 bis 780F))
erwärmen lassen. Das unmittelbar aus dem Kühlschrank entnommene Antigen kann weniger empfindlich sein als das in geeigneter Weise
erwärmte Antigen. Nach Beendigung der täglichen Untersuchungen bringt man den speziellen Verschluß auf der Spitze der Verteilernadel
auf. Dann stellt man die verschlossene Flasche in den Kühlschrank .
Zur öffnung der das Antigen-Reagens enthaltenen Flasche dreht
man den Deckel in Pfeilrichtung. Hierdurch wird eine federbelastete Nadel ausgelöst, die die Membran durchsticht. Jetzt kann
das Antigen aus der Flasche entnommen und verwendet werden, wie es im folgenden erläutert ist.
Die Teststreifen oder Testkarten besitzen einen speziellen Oberzug,
der es ermöglicht, daß die Antigen-Serum-Mischung sich ohne weiteres in dem Testbereich ausbreitet. Die Teststreifen sollten
an den Rändern angefaßt werden, damit die Testbereiche nicht von den Fingern berührt werden, da das an den Fingern anhaftende öl
bzw. Fett dazu führen kann, daß sich das Material in dem Testbereich nicht in der entsprechenden Weise ausbreitet.
Die Probenröhrchen dienen zur übertragung des Serums bei der
Durchführung des Übersichtstests. Die Röhrchen sind so ausgelegt, daß sie etwa 0,05 ml des Serums übertragen. Für jede Testprobe
muß ein frisches Probenröhrchen verwendet werden.
Eine Rotiereinrichtung, wie sie für den VDRL-Objektträger-Test
verwendet wird, ist erfindungsgemäß geeignet, wenn die Geschwin-
703331/1017
digkeit auf 130 min eingestellt werden kann. (Die Betriebsbedingungen
müssen so gehalten sein, daß die Plattform auf einer horizontalen Ebene einen Kreis mit einem Durchmesser von
19,05 mm (3/4 inch) durchläuft.)
Eine Lampe, beispielsweise eine Schreibtischlampe mit Leuchtstoffröhren,
die zwei 15 Watt-Birnen enthält, oder eine Lanpe mit stark intensivem Licht sind zufriedenstellend. Praktisch
sämtliche Reaktionen sind in dem Licht sichtbar, das in einem angemessen beleuchteten Laboratorium zur Verfügung steht. Jedoch
können geringfügige Reaktionen übersehen werden, wenn kein angemessenes Licht angewandt wird.
Es wird empfohlen, daß zur überprüfung der Reaktivität de3
Antigens Kontrollseren verwendet werden. Man verwendet dia folgenden Seren:
NR nicht reaktiv
WR schwach reaktiv
SR stark reaktiv
Man entnimmt das Blut aus der Vene in saubere, trockena
Röhrchen und läßt es gerinnen. Erforderlichenfalls zentrifugiert man die Proben mit einer solchen Drehzahl, daß die
zellförmigen Elemente sedimentiert werden. Dann entnimmt man das Serum aus dem geronnenen Blut und überführt es in ein sauberes,
trockenes Röhrchen. Unmittelbar vor der Durchführung des Tests erhitzt man es während 1/2 Stunde auf 62 bis 63°C.
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1. Man hält das Kunststoffprobenröhrchen in der Nähe des verschlossenen
Endes zwischen Daumen und Zeigefinger. Dann preßt man das Röhrchen zusammen und führt das offene Ende
in die Probe und vermindert den von den Fingern ausgeübten Druck, um die Probe aufzuziehen, wobei man Sorge dafür trägt,
daß die ausgefallenen oder sedimentierten Materialien nicht berührt werden.
2. Man hält das Kunststoffprobenröhrchen senkrecht über den kreisförmigen
Testbereich, wobei man die Oberfläche des Teststreifens oder der Testkarte nicht berührt. Dann drückt man das Probenröhrchen
zusammen und läßt einen Tropfen auf den Testbereich fallen. Man entleert den Rest der Probe wieder in das Probenröhrchen
.
3. Man dreht das Kunststoffprobenröhrchen um und breitet die Probe
innerhalb des kreisförmigen Bereiches mit dem Rührerende (dem verschlossenen Ende) des Kunststoffprobenröhrchens aus.
4. Vor der Verwendung schüttelt man die das Antigen enthaltende
Flasche vorsichtig. Man hält sie in vertikaler Richtung und trägt 3 Tropfen in einer Ecke des Teststreifens auf. Dann
bringt man einen freifallenden Tropfen auf jeden Testbereich auf. Das Antigen von der Ecke des Teststreifens nimmt man wieder
auf.
5. Man bringt den Teststreifen unter einen Feuchtigkeitsdeckel auf eine mechanische Dreheinrichtung auf und läßt während
8 Minuten bei 130 min rotieren.
6. Man untersucht die Probe unter hellem Licht. Stark und mäßig
reaktive Seren lassen sich durch die Anwesenheit von hellblauen Aggregaten erkennen. Minimal reaktive Seren können dadurch
erkannt werden, daß man den Tropfen der Probe hin und her bewegt, um die kleinen Aggregate zu beobachten.
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7. Die Ablesung des Tests ergibt sich wie folgt:
Reaktiv: Charakteristische Klumpenbildung, die von minimal reaktiv bis stark reaktiv erstreckt (im Vergleich
zu den Kontrollseren).
Nichtreaktiv: Keine Klumpenbildung oder Zusammenballung.
In vivo-Antikörper-Reaktion des aus Neisseria gonorrhoeae ge-
wonnenen Antigens
Man behandelt zwei Kaninchen durch subkutane Injektion des mit
Enzym digerierten, aus Neisseria gonorrhoeae gewonnenen Antigens. Man verwendet ein Inokulum, das vor der Verwendung gegen 0,85 %ige
NaCl-Lösung dialysiert worden ist. Man verabreicht 0,5 ml des Antigens subkutan an verschiedenen Stellen in unterschiedlicher
Dosierung. Das Tier wird ferner mit einer Verstärkungsinokulierung behandelt. Vierzehn Tage nach der letzten Inokulierung untersucht
man das aus den Tieren gewonnene Serum unter Verwendung des mit Enzym digerierten, aus Neisseria gonorrhoeae gewonnenen
Antigens, das auf Cholesterin-Lecithin-Teilchen vorliegt. Es ergeben sich Titer von bis zu 1:128. Dieses Beispiel verdeutlicht
somit die in vivo-Antikörper-Reaktion gegen das erfindungsgemäße Antigen und dessen mögliche Verwendung als Immunisierungsmittel
für Menschen.
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Claims (9)
1) Verfahren zur Gewinnung eines membranassoziierten oder
Oberflächen-Antigens aus ganzen Zellen oder einem Kulturmedium, in dem diese Zellen gezüchtet wurden, dadurch gekennzeichnet,
daß man
(a) die Zellen abtötet und fixiert;
(b) die Zellen von dem Medium abtrennt;
(c) das Antigen mit einer wäßrigen, alkalisch gepufferten Alkalimetallsalzlösung mit einem pH-Wert von etwa 6,0
bis zu etwa 11,0 und einer Konzentration des Puffers und des Salzes von mindestens 0,01 Mol/l aus den Zellen
oder dem Kulturmedium extrahiert;
(d) das Antigen konzentriert;
(e) das konzentrierte Antigen mit einer wäßrigen Säurelösung oder einer sauren Pufferlösung mit einem pH-Wert
von etwa 1,0 bis etwa 6,0 und einer Konzentration der Säure oder des Puffers von mindestens O,O1 Mol/l
im sauren Bereich ausfällt; und
(f) das sauer ausgefällte Antigen mit einer wäßrigen, alkalischen Pufferlösung mit einem pH-Wert von etwa 6,0
bis etwa 11,0 und einer Konzentration des Puffers von mindestens 0,01 Mol/l solubilisiert und gewünschtenfalls
das solubilisierte Antigen während etwa 15 Minuten bis etwa 4 Stunden bei einer Temperatur von etwa
00C bis etwa 45°C mit einem proteolytischen Enzym digeriert
und dann die Behandlung des Antigens mit dem Enzym beendet.
2. Antigen erhältlich nach dem Verfahren des Anspruchs 1.
3. Verfahren zur Gewinnung eines Antigens aus Neisseria-Zellen
oder einem Kulturmedium, in dem diese Zellen gezüchtet wurden, dadurch gekennzeichnet, daß man
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ORIGINAL INSPECTED
(a) die Zellen abtötet und fixiert;
(b) die Zellen von dem flüssigen Kulturmedium abtrennt;
(c) das Antigen mit einer wäßrigen, alkalisch gepufferten Alkalimetallsalzlösung mit einem pH-Wert von etwa 6,0
bis etwa 11,0 und einer Konzentration des Puffers und des Salzes von mindestens 0,01 Mol/l aus den Zellen
oder dem Kulturmedium extrahiert;
(d) das Antigen konzentriert;
(e) das konzentrierte Antigen mit einer wäßrigen Säurelösung oder einer sauren Pufferlösung mit einem pH-Wert
von etwa 1,0 bis etwa 6,0 und einer Konzentration der Säure oder des Puffers von mindestens 0,01 Mol/l im
sauren Bereich ausfällt; und
(f) das sauer ausgefällte Antigen mit einer wäßrigen, alkalischen Pufferlösung mit einem pH-Wert von etwa 6,0 .
bis etwa 11,0 und einer Konzentration des Puffers von
mindestens 0,01 Mol/l solubilisiert und gewünschtenfalls
das solubilisierte Antigen während etwa 15 Minuten bis
etwa 4 Stunden bei einer Temperatur von etwa 00C bis etwa
450C mit einem proteolytischen Enzym digeriert und
dann die Behandlung des Antigens mit dem Enzym beendet.
4. Antigen erhältlich nach dem Verfahren des Anspruchs 3.
5. Verfahren zur Herstellung eines Antigen-Reagens zum Nachweis von Infektionen, dadurch gekennzeichnet, daß man
(a) das nach dem Verfahren des Anspruchs 1 bereitete Antigen an Cholesterin-Lecithin-Teilchen adsorbiert und
(b) den Antigen-Cholesterin-Lecithin-Komplex mit einem lipidlöslichen
Farbstoff anfärbt-
6. Antigen-Reagens erhältlich nach dem Verfahren des Anspruchs
7. Verfahren zur Durchführung eines Agglutinationstests zum Nachweis
von durch Neisseria gonorrhoeae verursachten Infektionen, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Testflecken auf einem
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Teststreifen oder einer Testkarte mit einer glatten Oberfläche
mit
(a) einem Testserum und
(b) dem nach dem Verfahren des Anspruchs 5 bereiteten Antigen-Reagens
in Kontakt bringt.
8. Testanordnung zur Durchführung eines Agglutinationstests
zum Nachweis von durch Neisseria gonorrhoeae verursachten Infektionen, dadurch gekennzeichnet, daß sie im wesentlichen
mindestens einen Teststreifen oder mindestens eine Testkarte mit einem Testflecken zur Aufnahme des Testserums und des
Antigen-Reagens; einen Behälter mit dem nach dem Verfahren des Anspruchs 5 erhältlichen Antigen-Reagens; einen Behälter
mit einem reaktiven Kontrollserum; einen Behälter mit einem schwach-reaktiven Kontrollserum und einen Behälter mit einem
nichtreaktiven Kontrollserum umfaßt.
9. Verfahren zur Verhinderung einer Antikörperreaktion in warmblütigen
Tieren gegen das nach dem Verfahren des Anspruchs 1 erhältiche Antigen, dadurch gekennzeichnet, daß man die
Tiere mit dem Antigen inokuliert.
. e zsieese gonorrhoeae verursachte Infektionen, dadurcjx-gekelinzeichnet,
daß man den Menschen mit eijiej^_-i«mrtrn75Togisch wirksamen Menge
des nach demJ/exfahrSH^des Anspruchs 1 erhältlichen Antigen
batwtntleXtT
7 0 Π " ■! 1 / 'i Ί 1 7
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