DE2610717B2 - Hepatitis-B-Impfstoff und Verfahren zu seiner Herstellung - Google Patents
Hepatitis-B-Impfstoff und Verfahren zu seiner HerstellungInfo
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Description
Epidemiologische Untersuchungen sowie Versuche an Freiwilligen, die in den Jahren 1939 und 1967
ausgeführt wurden, erbrachten den Nachweis der Existenz zwei Hauttypen von Hepatitiviren: des Virus A
und des Virus B. Zunehmend wurde deutlich, daß für das weitere Verständnis der Virologie dieser Viren und die
Verhütung der von ihnen verursachten Krankheiten die Entwicklung immunologischer Methoden erforderte.
Zahlreiche Untersuchungen konzentrierten sich auf diese Viren, insbesondere auf das Virus B. Das Virus B
wurde bei Patienten gefunden, die Injektionen oder Bluttransfusionen erhalten hatten, weshalb die von
diesem Virus hervorgerufene Krankheit auch als Serumhepatitis bezeichnet wurde. Nach der Entdeckung
von Antigenen, die für Injekliunen mit dem ! !epatitisvirus
B spezifisch waren (Prince und Mitarbeiter, Am. J. Hyg. 79, 365, 1964; Blumberg und Mitarbeiter, JAMA
191, 541,1965; Prince, Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 60,814,
1968), wurde offensichtlich, daß das »Serumhepatitis-Virus« unter bestimmten Umständen tatsächlich kontagiös
war. Es erschien daher zweckmäßig, die Terminologie zu ändern. Der Virushepatitis-Ausschuß der
Fachgruppe Medizinische Wissenschaften in der Akademie der Wissenschaften, National Research Council,
empfahl daher 1972, zur früheren Terminologie, nämlich Hepatitisvirus A für den Erreger der infektiösen
Hepatitis und Hepatitisvirus B für den Erreger der Serumhepatitis, zurückzukehren. Gleichzeitig empfahl
der Ausschuß die Benutzung der Bezeichnung Hepatitis- B-Antigen (HB-Ag) für das A.ntigen anstelle der
früher benutzten Bezeichnungen, z. B. Australia-Antigen
(Au-Ag) nach der erstmaligen Feststellung des Antigens australischer Ureinwohner, Serumhepatitis-Antigen
(SH), Hepatitis verursachendes Antigen (HAA) usw, zu verwenden.
In der Folgezeit konzentrierten sich die Untersuchungen auf Antigen-Besonderheiten bei Infektionen mit
dem Hepatitisvirus B und auf Antigen-Untertypen, die
heute als HBsAg/adywr usw, Hepatitis-b-Kernantigen (HBcAG), entdeckt von Almeida, e-Antigen, entdeckt
von Magnius und Espmark, sowie als Hepatitis-B-Oberflächenantigen
(HBoAG) bezeichnet werden. Antikörper für HBoAG werden als Anti-HBo bezeichnet
Viele der ersten Forscher, darunter Blumberg, glaubten, daß die Hepatitis-B-Antigene ihren genetisehen
Ursprung im Wirt hätten. Andere Forscher, darunter Prince und Vnek, waren der Ansicht daß die
Hepatitis-B-Antigene von dem Genom des Hepatitisvirus B bestimmt würden. Immer mehr wurde klar, daß zur
Verhinderung von Infektionen durch dieses Virus eine aktive Immunisierung nötig sein würde, und die
Forschungen konzentrierten sich deshalb auf die Herstellung eines Impfstoffs.
Gegenwärtig werden Teilchen im menschlichen Serum mit einer Teilchengröße im Bereich von etwa 20
bis 25 nm als die vorherrschender. Teilchen angesehen, die die Hepatitis-B-Oberflächenantigene tragen. Forschungen
konzentrieren sich auf die Trennung dieser Teilchen von anderen Prcteinstoffen im Blut insbesondere
von den größeren, 42 nm großen Dane-Psrtikel, die von vielen für das infektiöse Virion gehalten werden.
Es wird angenommen, daß man, falls es gelänge, das Antigen in dem erforderlichen Ausmaß zu reinigen und
die Dane-Partikel zu entfernen, ein Material erhalten könnte, das nach der Verdünnung mit einem physiologisch
unbedenklichen Medium und sicherheitshalber weiterer Inaktivierung einen Impfstoff für die aktive
Immunisierung darstellen würde. Um dies zu erreichen, wird von Blumberg in der US-PS 36 36191 die
Behandlung von Blutplasma von HBo-Ag-Trägern mit einem Gemisch von Enzymen vorgeschlagen, die die
neuen Teilchenproteine spalten sollen. Daran schließen sich bekannte Behandlungen in der Zentrifuge zur
Gewinnung des Hepatitis-B-Oberflächenantigens auf
Teilchen an, deren Größe etwa 22 nm beträgt Blumberg und Mitarbeiter hatten erkannt daß die zu dem
Hepatitis-B-Oberflächenantigen gehörenden 22 nm großen Teilchen die Form eines Hohlkörpers ohne
Kern hatten und gegen die bei dem Spaltverfahren verwendeten Enzyme im wesentlichen beständig waren.
Blumberg konnte so einen Impfstoff mit einer Dichte in der Größenordnung von 1,21 g/cm3 gewinnen, der —
nach Blumberg — mit einem physiologisch unbedenklichen Medium verdünnt und als aktives Immunisierungsmittel
verwendet werden kann. Der nach dem Verfahren von Blumberg erhältliche Impfstoff mag
hinsichtlich einer Anregung der Synthese von Antikörpern in einem V/irtskörper, wie in dem eines Menschen,
wirksam sein, doch ist heute bekannt, daß derartige Antikörper nur eine begrenzte Spezifität haben und
keine Antikörper gegen bestimmte Antigene, z. B. dem e-Antigen, das nur auf den größeren Teilchen, wie den
Dane-Partikeln (d. h. dem Virion) vorkommen, einschließen. Der von Blumberg vorgeschlagene Impfstoff
bietet daher keinen Schutz gegen hohe Virus-Dosen, b5
denen Patienten, z. B. bei Bluttransfusionen, ausgesetzt sind. (In den Fig. 1 und 2 sind die theoretischen
Grundlagen, für diese Folgerung angegeben.) Zwar wäre
es theoretisch möglich, sehr hohe Titer von HB-Antikörpern
zu erzeugen, doch stehen hierzu keine für den Menschen geeignete Mittel zur Verfugung. Theoretisch
könnte man das Freundsche Aöjuvans zur Stimulierung der Produktion hoher Mengen Antikörper anwenden.
Dann könnten die sehr hohen Konzentrationen der HB-Antikörper sowohl das Hepatitis-B-Oberflächenantigen
als auch das mit den Virionen verbundene e-Antigen wirksam neutralisieren (siebe F i g. 2). Wegen
der möglichen Carcinogenitat und anderer nachteiliger Nebenwirkungen des Freundschen und anderer bekannter
Adjuvantia ist jedoch gegenwärtig keine Methode für die Erzeugung derart hoher Titer von H B-Antikörpern
im Menschen bekannt.
Es stellt sich daher die Aufgabe, einen Virushepatitis-Impfstoff
zur Verfügung zu stellen, der nicht nur die Produktion von HB-Antikörpern, sondern auch die
Produktion von spezifisch gegen das Virion selbst d. h.
gegen das 42 nm große Dane-Partikel bzw. das e-Antigen, gerichteten Antikörpern anregt und stimuliert
Bisher war die Herstellung eines derartigen Impfstoffs aus gesammeltem menschlichen Blutplasma,
das HB-Oberflächenantigen enthielt nicht möglich, weil
derartiges gesammeltes Plasma einen Überschuß an e-Antikörpern enthält Diese Antikörper verbinden sich
mit den c-Antigen enthaltenden Teilchen, was zu deren Ausfällung führt Die das ausgefällte e-Antigen enthaltenden
Teilchen sind, wenn überhaupt nur sehr schwierig mit herkömmlichen Methoden zu reinigen
und kommen daher im Endprodukt nicht vor.
Es stellt sich daher die Teilaufgabe, ein Verfahren zur Isolierung des Hepatitis-B-Oberflächenantigens zusammen
mit freies, ungebundenes und nicht gefälltes e-Antigen enthaltenden Teilchen anzugeben, dessen
Endprodukt als Impfstoff für die aktive Immunisierung verwendet werden kann.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch die in den Ansprüchen 1 und 7 gekennzeichneten Maßnahmen
gelöst.
Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen 2 bis 6 angegeben.
Überraschenderweise wurde gefunden, daß einige wenige »ausgewählte« (etwa 2%) klinisch gesunder
Menschen, die Träger des Hepatitis-B-Oberflächenantigens
sind, im Blut Teilchen haben, die freies e-Antigen enthalten. Damit ist gemeint, daß ihr Blut nicht nur
HBo-Ag in Hohlkörperform mit einer Teilchengröße von etwa 22 nm (wie von Blumberg u. a. berichtet),
sondern auch größere Teilchen enthält die entweder fadenförmige Teilchen mit einem Durchmesser von 20
bis 45 nm oder Dane-Partikel von im allgemeinen zylindrischer Form mit einem durchschnittlichen Durchmesser
von 42 nm enthält die neben dem herkömmlichen HBo-Ag auch e-Antigen ohne Lücke (e) enthalten.
Es wurde gefunden, daß ein Impfstoff nur aus dem Blut dieser »ausgewählten« (d. h. e-Antigen-positiven,
e-Antikörper-negativen) Spendern hergestellt werden kann.
Eine wichtige Grundlage für diese Feststellung ist die Tatsache, daß die Dane-Partikel und die größeren
fadenförmigen Teilchen e-Antigen enthalten. Diese Feststellung bildet eine rationale Basis für die in den
Tabellen I und II aufgeführten Zusammenhänge.
Ferner wurde gefunden, daß das e-Antigen außer auf den größeren HBo-Ag-Teilchen im Serum auch in einer
»löslichen« Form mit einem Molekulargewicht von unter 1 Million, im allgemeinen 50 000 bis 200 000,
vorkommt. Das Blut solcher oositiven e-Antieen-Träeer
enthält natürlich auch die zum HBo-Ag gehörenden hohlkörperförmigen Teilchen mit einer Größe von etwa
22 nm, die kein e-Antigen aufweisen (siehe F i g. 1).
Der rationale und theoretische Vorteil dieses Impfstoffs wird durch das Schema der F i g. 2 veran- ■-,
schaulicht Man beachte, daß die mäßigen HB-Antikörpertiter,
die mit den bekannten Impfstoffen mit 20 nm großen Teilchen, wie der Impfstoff von Blumberg,
erhalten werden, nur Schutz bieten, wenn die Angriffsdosis außerordentlich niedrig ist; wenn größere Mengen
des H B-Virus und der zu ihm gehörenden HBo-Ag enthaltenden Teilchen auftreten, neutralisieren diese die
kleinen Mengen der HB-Antikörper, so daß die Dane-Partikel frei bleiben und die Leber des Wirtes
infizieren können. Wenn dagegen die Bildung von e-Antikörpern angeregt wird, können diese sich
spezifisch mit den infektiösen Virionen (Dane-Partikel) verbinden, ohne daß sie durch den großen Überschuß an
kleinen HBo-Ag-Teilchen (in der Regel 500 kleine Teilchen je 1 Dane-Partikel) neutralisiert werden.
Der Impfstoff gemäß der Erfindung zeichnet sich daher durch das Vorkommen von Teilchen im Bereich
von 30 bis 50 nm, vorzugsweise im Bereich von 35 bis 45 nm, aus. Bei diesen größeren Teilchen, die im
allgemeinen mit Teilchen der Größe von 16 bis 22 nm, die ebenfalls HBo-Ag enthalten, lassen sich im
allgemeinen zwei Hauttypen unterscheiden: Fadenförmige Teilchen und die oben beschriebenen Dane-Partikel.
Der Impfstoff enthält daher beide Antigen-Spezifitä- ao
ten. Proteine und Nucleinsäuren, die in dem Impfstoff gemäß der US-PS 36 36 191, die nur die kleineren
HBo-Ag-ertthaltenden Teilchen enthält, nicht vorkommen
(siehe Fi g. 1). Man beachte, daß die Dane-Partikel sowohl einen Kern als auch einen Mantel haben, wobei
der Kern DNS, DNS-Polymerase und HBcAg enthält. Der Mantel des Dane-Partikels enthält HBo-Ag sowie
e-Antigen (e) und ähnliche Dane-spezifische Antigene. Daher muß der Gesamtimpfstoff Teilchen mit einer
höheren Dichte als die Teilchen des Impfstoffs gemäß der US-PS 36 36 191 enthalten. Die Dichte des
Impfstoffs gemäß der Erfindung liegt im Bereich von 1,23 bis 134 g/cm3, vorzugsweise im Bereich von 1,24 bis
134 g/cm3, bestimmt durch Zentrifugieren mit isopyknischem
Dichtegefälle unter Verwendung von Caesiumchlorid-Lösungen abgestufter Dichte.
Der Impfstoff hat folgende Eigenschaften: Jede Dosis
enthält 20 bis 50 μg HBoAg-Teilchen-Protein mit 108 bis
1012 (vorzugsweise IO10 bis W2) Dane-Partikel, ferner
eine gleiche oder größere Anzahl fadenförmiger Teilchen. Selbstverständlich enthält der Impfstoff nur
solche größeren (30 bis 50 nm) Teilchen, in denen das e-Antigen frei, d.h. nicht an einem entsprechenden
e-Antigenkörper gebunden, ist.
Ein besonderes Kennzeichen des Impfstoffs ist das Vorkommen freien e-Antigens auf Dane- oder fadenförmigen
Teilchen. Der Impfstoff enthält jedoch in dem verwendeten physiologisch unbedenklichen Medium
auch noch e-Antigen in löslicher Form.
Das Vorhandensein von e-Antigen kann mit Hilfe einer Anzahl von Methoden festgestellt werden; die
nachstehend beschriebene Methode reicht für die Zwecke dieser Erfindung aus:
Unempfindlicher Test zur Bestimmung
der Gegenwart von freiem e-Antigen
der Gegenwart von freiem e-Antigen
Die mittlere Vertiefung einer Agar-Gel-Diffusionsplatte, die vorzugsweise, aber nicht notwendigerweise
aus einer Lösung von 0,5 bis 0,7% Agarose in einer Lösung hergestellt ist, die 0,1 -m NaCl, 0,01 -m Tris-Puffer
mit einem pH-Wert von 7,2, 0,001-m EDTA, 2,0
Gew.-Teilen/IOO Vol.-Teilen Dextran 250 und 0,1
Gew.-Teil/100 VoL-Teilen Protaminsulfat enthält wird
mit e-Antikörperserum gefüllt wie es beispielsweise von der Blood Derivatives Division des New York
Blood Center erhalten werden kann. Die Randvertiefungen werden entweder mit einem Bezugs-e-Antigen (von
Dr. Lars Magnius) für den Agar-Gel-Diffusions-wIdentitätstest«
oder Testserum gefüllt Eine Prözipitinlinie, die nach dreitägigem Bebrüten bei Raumtemperatur, 30
oder 37°C erscheint und auf einer Reaktion mit dem Bezugsantigen beruht, zeigt die Gegenwart einer
großen Menge e-Antigen an.
Die Merkmale von HBo-Ag-Trägern in Abhängigkeit von der Gegenwart oder Abwesenheit von e-Antigen
oder e-Antikörpern sind in den Tabellen 1 und 2 aufgeführt
Merkmale von HBo-Ag-Trägern in Abhängigkeit von der Gegenwart von e-Antigen oder
e-Antikörpera
Merkmale
Ergebnisse einer Agar-Gel-Difnisionsprüfüng
»e«-Ag+ »ee-Antikörper+
»e«-Ag+ »ee-Antikörper+
Anteil bei Blutspendern 1-5%
(symptomlosen HBo-AG-Trägem)
Anteil von HBo-AG-Trägem unter 20-70%
ständigen Benutzern von Dialysegeräten
Patienten mit chronischer Hepatitis, bei den meisten
festgestellt durch Leberbiopsie
Patienten mit chronischer Hepatitis, bei den meisten
diagnostiziert aufgrund erhöhter
SGPT-Werte
Kontakt- oder spontane Infektionen bei vielen
30-70%
5-20%
5-20%
bei sehr
wenigen
bei sehr
wenigen
wenigen
bei sehr
wenigen
wahrscheinlich
überhaupt
nicht
Merkmale des Plasmas von HBoAg-Trägern in Abhängigkeit von der Gegenwart von
e-Antigen oder e-Antikörpern
Merkmale
Ergebnisse einer Agar-Gel-Diffusionsprüfung
e-AG+ e-Antikörper+
e-AG+ e-Antikörper+
Dane-Partikel im Plasma
Mit HBo-Ag verbunden
DNS-Polymerase im Plasma
DNS-Polymerase im Plasma
Nachweisbares HBc-Ag
im Plasma (RIA oder IAHA Tests)
HBoAg-Titer
- 1O1VmI
nachweisbar
nachweisbar
nachweisbar
10" - 1014
Teilchen/ml
Teilchen/ml
10'*)
nicht nachweisbar
nicht nachweisbar
1012 - 10°
Teilchen/ml
Teilchen/ml
*) Bei der Elektronenmikroskopie nicht sichtbar.
Verfahren zur Herstellung des Impfstoffs
Die kritische Phase bei der Herstellung des Impfstoffs ist der erste Schritt, nämlich die Wahl eines als
Ausgangsmaterial geeigneten Plasmas von einem chronischen HBo-Ag-Träger, bei dem mit Hilfe des
vorstehend beschriebenen unempfindlichen Tests e-Antigen nachweisbar ist. Ein derartiges Plasma enthält
natürlich reichliche Mengen Dane-Partikel und Fäden, die nicht mit e-Antikörpern verbunden sind (siehe oben).
Ein Plasma dieser Art kann zweckmäßigerweise von klinisch symptomlosen menschlichen H B-Trägern oder
auch von Schimpansen erhalten werden, die eine natürliche oder künstliche Infektion mit dem H B-Virus
durchgemacht haben und chronische e-Antigen-positive HBo-Ag-Träger geworden sind. Ganz allgemein ist
Plasma brauchbar, das HBo-Ag des gewünschten Untertyps oder der gewünschten Untertypen enthält.
Das Ausgangsplasma muß durch die oben beschriebene Methode nachweisbares e-Antigen und darf keine durch
die oben beschriebene Methode nachweisbaren e-Antikörper enthalten. Derartiges Plasma ist verhältnismäßig
selten, für das Verfahren aber unerläßlich.
Unter der Voraussetzung, daß Ausgangsmaterial mit den oben beschriebenen Eigenschaften vorhanden ist,
läßt sich die Isolierung der e-Antigen enthaltenden größeren Teilchenfraktionen zusammen mit einer
geringeren Menge kleinerer HBo-Ag enthaltenden Teilchen und einer nur geringen Verunreinigung durch
Serumproteine nach folgendem einfachen Verfahren ausführen:
1. Fraktionierte Fällung des Antigens mit Polyäthylenglykol
und
2. Adsorption der Verunreinigungen an Hydroxylapatit
unter Bedingungen, die die Adsorption der größeren HBo-Ag enthaltenden Teilchen im
Größenbereich von 24 bis 50 nm verhindern.
Das erhaltene Produkt kann leicht konzentriert, mit kleinen Mengen menschlichem Serumalbumin stabilisiert,
in einem physiologischen Träger suspendiert und mit Hilfe einer Kombination bekannter Virus-Inaktivierungsmethoden
nichtinfektiös gemacht werden. Von diesem Impfstoff werden dann immunisierende Mengen
in solchen Intervallen injiziert daß eine ausreichende und lang dauernde Bildung von e-Antikörpern und
55
60
65 HB-Antikörpern hervorgerufen wird. Eine derartige
Immunisierung dürfte Schutz gegen Infektionen mit hohen und niedrigen Dosen des Hepatitisvirus B bieten.
Die Erzielung eines Schutzes gegen Infektionen durch solche niedrige und hohe Dosen mit Hilfe des bekannten
Hepatitis-B-Impfstoffs ist, wenn überhaupt möglich, sehr schwierig.
Ausgangsmaterial
Als Ausgangsmaterial für das nachstehend beschriebene Reinigungsverfahren geeignetes Plasma wird mit
Hilfe bekannter Plasmaphoreseverfahren aus dem Blut chronischer HBo-Ag-Träger gewonnen. Diese können
Menschen oder auch Tiere, wie Schimpansen, sein, in denen ein chronischer H B-Trägerzustand erzeugt
werden kann. Die Schimpansen bieten den praktischen Vorteil, daß sie mit menschlichen Hepatitis-B-Stämmen
jeden gewünschten immunologischen Untertyps infiziert werden können und dann chronische Infektionszustände
entwickeln, die nach bisher vorliegender Erfahrung besonders hohe HBo-Ag-Titer ergeben und
häufig hohe Konzentrationen von Dane-Partikel und e-Antigen im Plasma ergeben. Außerdem können diese
Tiere in kurzen Intervallen einer herkömmlichen Plasmapherese unterworfen werden, ohne daß sie
gesundheitlich geschädigt werden oder der HBo-Ag- oder e-Ag-Gehalt im Plasma abnimmt.
Das zur Herstellung des Impfstoffs als Ausgangsmaterial verwendete Sammelplasma muß folgenden
Anforderungen genügen:
A. Mit einer unempfindlichen Methode wie der Agar-Gel-Dtffusion muß e-Antigen nachweisbar
sein. Es ist zu beachten, daß bei einer Grundgesamtheit von Blutspendern nur 1 bis 5% der chronischen
HBo-Ag-Träger dieser Forderung genügen.
B. Es dürfen keine e-Antikörper nachweisbar sein. Man beachte, daß die Mehrzahl einer HBo-Ag-Träger
einer Grundgesamtheit von Blutspendern e-Antikörper haben. Falls derartiges Plasma mit
dem erwünschten Plasma vereinigt wird, tritt eine Ausfällung der e-Antigen enthaltenden Teilchen
ein, durch die deren Isolierung nach der beschriebenen Methode verhindert wird.
C. Dane-Partikel, die mit Hilfe bekannter Methoden der Elektronenmikroskopie (negative Färbung)
nachweisbar sind, sollen vorzugsweise in hoher Konzentration vorhanden sein.
D. Das HBo-AG soll hinsichtlich der Antigen-Untertypen eine Zusammensetzung haben, die den
Hauptuntertypen entspricht, die in dem geographischen Gebiet auftreten, für das der Impfstoff
bestimmt ist. Beispielsweise soll in einem Impfstoff, der in Südostasien verwendet werden soll, der
Untertyp r vorherrschen, während ein Impfstoff, der für Europa oder die Vereinigten Staaten
bestimmt ist, vorzugsweise HBo-Ag von überwiegend dem Untertyp w enthalten soll.
E. Um eine breite immunologische Schutzwirkung zu erzielen, ist Plasma von einer so großen Zahl von
Spendern zu verwenden, daß eine repräsentative Mischung der Untertypen erhalten wird, die in dem
geographischen Gebiet, für das der Impfstoff bestimmt ist, vorherrschen. In den meisten Fällen
sind mindestens 10 Spender erforderlich. Die Verwendung von »Hybridstämmen«, wie HBo-Ag/
adywr, bietet offensichtliche Vorteile. Solche Hybridstämme können in Schimpansen fortgepflanzt
werden.
F. Das Ausgangsmaterial muß innerhalb von 4 Stunden nach dem Sammeln bei — 700C eingefroren
und bis zum Einfrieren auf einer Temperatur von 4°C gehalten werden.
G. Das Ausgangsmaterial muß bakteriologisch steril und frei von fremden Viren sein, die nach
bekannten Isolierungsmethoden (Impfung angebrüteter Eier, Gewebekulturen, säugende Mäuse,
Meerschweinchen und Kaninchen), wie sie bei der Qualitätskontrolle anderer Virusimpfstoffe üblich
sind, nachgewiesen werden können.
Die Reinigung des Ausgangsmaterials kann nach einem bereits anderweitig (US-Patentanmeldung Ser.
No. 4 26 825) beschriebenen Verfahren ausgeführt werden. Hierbei wird das in dem flüssigen Blutplasma
enthaltene Antigen von den Verunreinigungen abgetrennt. Dazu wird das Plasma zunächst auf einen
pH-Wert im Bereich von etwa 4,4 bis 4,7 eingestellt. Dies führt zur Ausfällung einer kleinen Menge
Niederschlag, der zusammen mit restlichen Zellen und Zelltrümmern durch Zentrifugieren mit mäßiger Drehzahl,
z. B. 20 Minuten bei 10 000 U/min, entfernt werden kann. Danach wird das Material mit 2,5 bis 4,5 Gew.-%,
vorzugsweise 3,0 bis 4,5 Gew.-%, Polyäthylenglykol gemischt. Mit niedrigen Konzentrationen, etwa 3 bis
4%, kann man selektiv große Teilchenformen ausfällen. Sie sind daher unter bestimmten Umständen von
Vorteil. Die Gewichtsprozent-Menge des Polyäthylenglykols bezieht sich auf das Gesamtgewicht der
Mischung. Durch den Zusatz der angegebenen PoIyäthylenglykol-Menge
wird sowohl das Hepatitis-B-Antigenmaterial der großen Teilchen von z. B. 30 bis 50 nm
Größe als auch ein Teil des bekannten hohlkörperförmigen Hepatitis-B-Oberflächenantigen-Materials ausgefällt
Der Niederschlag wird abgetrennt und mit einer solchen Menge Wasser versetzt, daß ein flüssiges
Zwischenprodukt entsteht, dessen Antigen-Konzentration gleich oder größer als diejenige des ursprünglichen
Blutplasmas ist Das flüssige Zwischenprodukt wird auf einen pH-Wert im Bereich von etwa 4,9 bis 5,1, optimal
auf 5,0, eingestellt, wodurch ein Proteinstoffe und Polyäthylenglykol enthaltender Niederschlag und eine
flüssige Phase gebildet werden, die Hepatitis-B-Antigen enthält, das sich durch die Gegenwart von Dane-Partikel
und/oder fadenförmigem Material auszeichnet. Die flüssige Phase wird abgetrennt und auf einen pH-Wert
im Bereich von etwa 4,4 bis 4,7 eingestellt. Bei diesem pH-Wert wird die flüssige Phase mit 3,5 bis 4,5 Gew.-%
Polyäthylenglykol, bezogen auf das Gesamtgewicht der Mischung, gemischt, wobei ein Niederschlag ausfällt, der
folgende Bestandteile enthält:
A. Gereinigtes Hepatitis-B-Oberflächenantigen, das
hohlkörperförmige Teilchen mit einer Größe zwischen 20 und 30 nm enthält, sowie
B. 1. fadenförmige Teilchen mit einem Durchmesser
zwischen 20 und 50 nm, die HBo-Ag und e-Antigen enthalten, das frei von e-Antikörpern
ist, und
2. meist kugelförmige Dane-Partikel mit einer Größe von 40 bis 50 nm, die einen Außenmantel
aus Lipoprotein, der HBo-Ag und e-Antigene enthält, und einen Kern haben, der DNS,
DNS-Polymerasen und HBc-Ag enthält.
Das so gereinigte Antigenmaterial wird gewonnen und kann dann einer Behandlung zur Inaktivierung des
Virus unterworfen werden. Das Material ist nun fertig zur Verdünnung mit einem physiologisch unbedenklichen
Medium.
Vorzugsweise wird bei der Trennung die Temperatur einer jeden Mischung nach jedem Mischvorgang und
während der Bildung des Niederschlags im Bereich zwischen 0 und 8° C gehalten. Die Reinigung wird
erleichtert, wenn die Niederschläge nach dem Fällen durch Zentrifugieren gewonnen werden. Das Polyäthylenglykol
kann als solches oder in Form einer wäßrigen Lösung verwendet werden, vorzugsweise in einer
solchen, die etwa 30 Gew.-% Polyäthylenglykol enthält.
Im allgemeinen empfiehlt sich die Verwendung eines Polyäthylenglykols, das ein Molekulargewicht im
Bereich von 500 bis 50 000, vorzugsweise von etwa 6000, hat.
Eine weitere Reinigung der gereinigten Antigene kann durch Adsorption an Hydroxylapatit nach den
Methoden der Ansatz- oder Säulenchromatographie vorgenommen werden. Im letztgenannten Falle werden
die teilgereinigten Antigene durch eine Chromatographiesäule gegeben, die Hydroxylapatit enthält, das die
Antigene adsorbiert. Die weiter gereinigten Antigene werden dann durch eine mehrstufige, z. B. etwa
dreistufige, Elution wiedergewonnen. Teilchen der Größe von 25 bis 50 nm werden getrennt von einer
Fraktion kleinerer Teilchen (16 bis 22 nrn) und der Hauptmenge der Serumproteine wiedergewonnen.
Inaktivierung des Infizierungsvermögens
Die nach der Reinigung erhaltene Fraktion der großen Teilchen muß als infektiös angesehen werden.
w> Mit Hilfe chemischer und physikalischer Verfahren muß
daher das gesamte Infizierungsvermögen wirksam inaktiviert werden. Das Hepatitisvirus ist als sehr
beständig bekannt Dies ist wahrscheinlich auf die kleine Größe seiner Nucleinsäure sowie auf andere Eigenschäften
seiner tertiären und quartemären Struktur und seines morphologischen Aufbaus zurückzuführen.
Die Inaktivierung kann durch jede Kombination der verschiedenen in der Technik der Impfstoffherstellung
bekannten Methoden erfolgen. Durch die Anwendung von Kombinationen sollen »resistente Fraktionen«
beseitigt werden, die gegen eine einzige Inaktivierungsbehandlung beständig sein könnten. Diese werden durch
eine zweite oder dritte Behandlung inaktiviert, deren Inaktivierungsmechanismen von demjenigen der ersten
Behandlung verschieden sind. Dieses Vorgehen ist zur Vernichtung resistenter Fraktionen, z. B. bei der
Behandlung bestimmter bakterieller Infektionen, bei denen resistente Erregerformen häufig vorkommen, mit
einer Kombination verschiedener Antibiotika, gebräuchlich. Eine schematische Darstellung dieses Prinzips
ist in F i g. 3 veranschaulicht.
Jede Kombination der derzeit bekannten Inaktivierungsmethoden, die der vorstehenden Forderung
genügen, kann angewendet werden. Folgende Methoden, vorzugsweise in Kombination.-werden vorgeschlagen:
1. Bestrahlung mit einer Kobaltquelle von 2,5 Millionen rad;
2. Behandlung mit Formalin von einer Konzentration von 1 :2000 während einer Dauer von 4 Tagen bei
37°C nach den üblichen Methoden; dabei wird der Impfstoff vor dem Zusatz von Formalin (oder dem
nachstehend genannten j?-Propiolacton) zur Entfernung
von Aggregaten durch Filtration durch ein O,22^m-Milliporenfilterod. dgl. geklärt;
3. Behandlung imit 0-Propiolacton nach Methoden,
wie sie gegenwärtig bei der Inaktivierung von Tollwutimpfsiloff angewendet werden.
Nach der Inaktivierung wird das Endprodukt durch ein Amicon-Filter PM30 od. dgl. gegen 0,9°/oige
Natriumchlorid-Lösung, die Thiomerosal in einer Verdünnung von 1 :10 000 und einen gebräuchlichen
Stabilisator enthält, diafiltriert, um alle niedermolekularen Verbindungen, die zur Inaktivierung verwendet
oder bei dieser entstanden sind, zu entfernen. Das Amicon-Filter PM30 ist ein Cellulosefilter mit einem
durchschnittlichen Porendurchmesser, der nominell den Durchgang von Molekülen mit einem Molekulargewicht
von über 30 000 ausschließt. Thiomerosal ist die empfohlene Kurzbezeichnung für Natriumäthylquecksilberthiosalicyiat,
ein gebräuchliches antibakteriell wirksames Konservierungsmittel. Das filtrierte Produkt
wird sodann einer Sterilfiltration unterworfen und aseptisch in sterile Ampullen zur Gefriertrocknung oder
zum Tiefgefrieren abgefüllt
Sicherheitsprüfung
Danach muß jeder Ansatz auf Sicherheit, d. h. auf
Freiheit von Infizierungsaktivität, geprüft werden.
Solange es keine Gewebekultur- oder andere Standardmethode zur Bestimmung der Infektaktivität des
Hepatitisvirus B und ähnlicher Viren gibt, muß jede zu menschlichem Gebrauch bestimmte Impfstoff-Charge
durch Impfung Hlä-seronegativer empfänglicher Tiere,
wie Schimpansen oder Gibbonaffen, geprüft werden. Mindestens vier seronegative Tiere (von denen zwei mit
fünf 20^g-Dosen und zwei mit 500 20^g-Dosen intravenös geimpft werden) müssen für diesen Zweck
verwendet werden. Eine einwandfreie Charge führt weder zu einer Hepatitis noch zur Produktion von
HBo-Ag oder eimer HBc-Antikörperreaktion, auf die
jedes geimpfte Tier mit den derzeit empfindlichsten zur Verfugung stehenden Methoden zu untersuchen ist Auf
diese Weise kann die Sicherheit des Produktes, d. h. das
Fehlen jeglicher Infektaktivität, leicht festgestellt werden. Natürlich wird man vor der klinischen
Erprobung erster Chargen eine größere Anzahl Tiere für die Prüfung heranziehen.
Potenzprüfung
Der Impfstoff wird auf eine Konzentration von im allgemeinen etwa 5 bis 100 μg, vorzugsweise 20 bis
50 μg, HBo-Ag-Protein je Dosis eingestellt, um ihr eine
ίο geeignete Immunisierungswirkung zu erteilen. Im
allgemeinen beträgt die Menge der e-Antigen enthaltenden Teilchen in einer solchen Dosis etwa 2 bis 5 μg.
Die Potenz wird durch Bestimmung der Mindestkonzentration einer jeden Impfstoffcharge kontrolliert, die
bei Meerschweinchen, Mäusen oder anderen geeigneten Versuchstieren eine bestimmte spezifische HB- und
e-Antikörperreaktion hervorruft.
Der Impfstoff muß eine so hohe Potenz haben, daß er in mindestens 4 Schimpansen, die mit 2 Dosen des
Standardimpfstoffs nach den empfohlenen Richtlinien immunisiert worden sind, bei der Prüfung durch passive
Hämaglutination (standardisiert durch Prüfung an einer Kontrollprobe aus gefrorenem Antikörperserum) einem
HB-Antikörpertiter von mindestens 1 :100 ergibt Diese
HB-Antikörper müssen mindestens 1 Jahr vom Zeitpunkt der Immunisierung dieser Schimpansen ab mit
einem Titer von mehr als 1:10 nachweisbar sein. Außerdem müssen die Schimpansen eine meßbare
e-Antikörperreaktion zeigen.
Verabreichung der Dosen
und Anwendung des Impfstoffs
und Anwendung des Impfstoffs
Der Impfstoff kann durch subcutane oder intramuskuläre Injektion verabreicht werden. Zwar steht der
bevorzugte Verabreichungsweg noch nicht fest doch wird angenommen, daß die intramuskuläre Injektion zu
bevorzugen ist. Die Häufigkeit der Verabreichung beträgt etwa 2 Dosen im Abstand von einem Monat
gefolgt von einer Auffrischungsdosis nach 6 Monaten bis zu einem Jahr nach der Erstimmunisierung. Die
Höhe der Dosis hängt natürlich von der Größe des zu impfenden Wirts ab. Die nachfolgenden Dosen und die
Auffrischungsdosis hängen von dem Antikörperspiegel im Blut nach der Erstimmunisierung ab. Zugelassene
Adjuvantia, wie sie üblicherweise bei der Impfstoffherstellung verwendet werden, können benutzt werden.
. Der Impfstoff empfiehlt sich für alle Personen, die dem Risiko einer Infektion mit dem Hepatitisvirus B ausgesetzt sind, insbesondere solche Personen, die, wie
. Der Impfstoff empfiehlt sich für alle Personen, die dem Risiko einer Infektion mit dem Hepatitisvirus B ausgesetzt sind, insbesondere solche Personen, die, wie
so Patienten und Personal von Hämodialysegeräten, medizinisches Personal, Personen, die sich in tropischen
Gebieten aufhalten oder diese besuchen, einem besonders hohen Risiko ausgesetzt sind. Bei der
Bevölkerung tropischer und subtropischer Gebiete, wie insbesondere Afrika, Asien, das Mittelmeergebiet und
Südamerika, wo ständig ein verbreitetes Vorkommen von Hepatitis-B-Infektionen beobachtet wird, sollte der
Impfstoff schon in einem frühen Lebensalter verabreicht werden- um die Entstehung eines chronischen
Infektionsträgerzustandes zu verhindern, der in diesen Gebieten bereits in den ersten 5 Lebensjahren
vorzukommen pflegt
Wenn ausreichende Mengen Impfstoff zur Verfügung stehen und ihre Wirksamkeit sich erwiesen hat, kann der
Impfstoff bei allen Personen angewendet werden, die nicht schon durch eine vorher erworbene Immunität
gegen Infektionen mit dem Hepatitisvirus B geschützt sind.
Die besondere Bedeutung des Hepatitisvirus-B-Impfstoffs ist in der Verhinderung eines chronischen
Hepatitisvirus-B-Trägc.-zustandes mit dem ständigen
Risiko einer Erkrankung an einem chronischen Leberleiden, wie chronisch aktiver Hepatitis, Leberzirrhose
und primärem Lebercarcinom. Ein Zusammenhang zwischen einem chronischen Hepatitisvirus-B-Trägerzustand
und diesen Erkrankungen kann heute als erwiesen gelten, und die Ro'le der durch das
Hepatitisvirus B hervorgerufenen chronischen Hepatitis als Cofaktor in der Ätiologie dieser Erkrankungen steht
ebenfalls fest (Prince, A. M„ in The Liver: Normal and Abnormal Funktions, herausgegeben von F. F. Becker,
M. Dekker-Verlag, New York, 1965).
Die Anwendung des neuen Hepatitisvirus-B-Impf-Stoffs
kann auf lange Sicht einen wesentlichen Einfluß auf die Verhütung dieser chronischen Leberleiden
haben, die in den genannten Gebieten, insbesondere in den Tropen, wo ein chronischer Hepatitisvirus-B-Trägerzustand
fast die Regel ist, so außerordentlich häufig sind. Beispielsweise ist in Senegal, wo 14% der
Bevölkerung chronische HBo-Ag-Träger sind, die Erkrankungsrate an primärem Leberkrebs 50 bis
lOOmal so hoch wie in den Vereinigten Staaten, wo nur durchschnittlich etwa 0,3% der Bevölkerung chronische
Träger des Hepatitisvirus B sind.
Ausdrücklich sei darauf hingewiesen, daß die hier beschriebenen Methoden zur Reinigung der die großen
Teilchen enthaltenden Fraktionen nicht die einzigen für diesen Zweck sind. Für bestimmte Zwecke und
Bedürfnisse lassen sich auch Abwandlungen und weitere Methoden entwickeln. Worauf es bei der Erfindung
ankommt, ist die Verwendung der große Teilchen und e-Antigun enthaltenden Fraktionen, die bisher stets
routinemäßig verworfen wurden, zur Herstellung eines Impfstoffs. Daher sind alle Impfstoffe in Erwägung zu
ziehen, die solche Teilchen, lösliche spezielle Komponenten solcher Teilchen oder synthetische spezielle
Untereinheiten dieser Teilchen mit Antigenwirkung enthalten, da sie bei einer aktiven Immunisierung gegen
e-Antigen oder ähnliche für Dane-Partikel spezifische Antigene brauchbar sind.
Beschreibung der Zeichnungen
F i g. 1 zeigt in graphischer Darstellung die verschiedenen morphologischen Formen, die zu dem Hepatitis-B-Oberflächenantigen
gehören. Zusammen mit dem Hepatitis-B-Obcrflächenantigen kommt noch ein e-Antigen
vor, das auf Dane-Partikel zugegen ist, die Hepatitis-B-Kernantigen (HBc-Ag) enthalten. Diese
Dane-Partikel zeichnen sich dadurch aus, daß sie Desoxyribonucleinsäure (DNS) und ihre Polymerase
enthalten. In der Figur sind ferner die möglichen Antikörper dargestellt: Antikörper gegen das Hepatitis-B-Oberflächenantigen,
gegen das Hepztitis-B-Kernantigen und gegen das e-Antigen.
Fig.2 ist eine graphische Darstellung der unterschiedlichen
Wirkungen der Antikörper gegen das e-Antigen und der Antikörper gegen das Hepatitis-B-Oberflächenantigen
bei der Neutralisation von Dane-Partikel in Abhängigkeit von der einwirkenden Dosis.
Aus dieser Darstellung ist ersichtlich, daß die von einem HBo-Ag-lmpfstoff, der frei von e-Antigen ist, erzeugten
Antikörper für eine völlige Neutralisation der antigenhaltigen Stellen unzureichend sind. Die von einem
Impfstoff, der sich durch die Gegenwart von e-Antigen auszeichnet, erzeugten Antikörper reichen jedoch auch
bei einer hohen Dosierung des Antigens aus, um praktisch alle Antigenstellen zu neutralisieren. Die;
zeigt, daß die Gegenwart von e-Antigen in einen Impfstoff erheblich das Ausmaß beeinflußt, in dem eine
Neutralisierung aller Antigene stattfindet
F i g. 3 veranschaulicht graphisch die Tatsache, dal;
bei jedem gegebenen Inaktivierungsverfahren eir kleiner Teil der infektiösen Viren gegenüber dei
Inaktivierung widerstandsfähig ist Wenn jedoch ver schiedene Inaktivierungsmethoden nacheinander ange
wendet werden, können auch diese resistenten Fraktio
nen inaktiviert werden.
Fig.4 spiegelt die Ergebnisse wider, die bei dei
säulenchromatographischen Fraktionierung eines mi Polyäthylenglykol gefällten H Bo-Ag-Ma terials in einei
500-ml-Säule aus Hydroxylapatit erhalten werden. Die
Ergebnisse stammen von einem in 50 ml Flüssigkei wiedersuspendierten mit Polyäthylenglykol gefällten
HBo-Ag/e-Ag bei der Chromatographie auf einei 500-ml-Hydroxylapatit-Säule. Das Antigen wurde mi:
einem diskontinuierlichen Gradienten von jeweils 1 Liter 0,02 m, 0,05-m und 0,10 m Natriumphosphat-Puf
ferlösung mit einem pH-Wert von 7,2 eluiert Fraktionen
von je 10 ml wurden aufgefangen und durch Messung der op.ischen Dichte bei 280 nm auf Proteir
( ) und durch CEP auf HBo-Ag (x-x-x
analysiert
F i g. 5 zeigt die Ergebnisse der Celluloseacetat-Elektrophorese
vereinigter konzentrierter Proben vor HBo-Ag/e-Ag, die durch Chromatographie an Hydroxylapatit
(Tabelle 4) gereinigt worden waren. Dei Streifen wurde nach dem Anfärben mit Ponceau-Rot ir
einem Beckman-Mikrozonendensitometer abgetastet.
Linie A: HBo-Ag/e-Ag enthaltendes Originalpias
ma;
Linie B: Wiedersuspendierter Niederschlag vor
Linie B: Wiedersuspendierter Niederschlag vor
HBo-Ag/e-Ag aus der Fällung mit Poly
äthylenglykol;
Linie C: Säuleneluat von HBo-Ag/e-Ag
Linie C: Säuleneluat von HBo-Ag/e-Ag
— Sammelprobe III;
Linie D: Säuleneluat von HBo-Ag/e-Ag
— Sammelprobe II;
Linie E: Säuleneluat von HBo-Ag/e-Ag
— Sammelprobe I.
Fig.6 ist eine graphische Darstellung der bei dei
Reinigung von mit Polyäthylenglykol ausgefällten HBo-Ag/e-Ag-Material durch Säulenchromatographu
an Hydroxylapatit erzielten Ergebnisse. Eine Menge von 200 ml des wiedersuspendierten PEG-Nieder
schlags aus HBo-Ag/e-Ag wurde auf eine lOOO-ml-Säuh
aus Hydroxylapatit aufgegeben. Das Antigen wurde mi einem diskontinuierlichen Gradienten von 041, 0,02-n
und einem Liter 0,05-m Natriumphosphat-Pufferlösunj mit einem pH-Wert von 7,2 eluiert Fraktionen von 12
und 13 ml wurden gesammelt und durch Messung dei
optischen Dichte auf Protein analysiert
F i g. 7 zeigt in graphischer Darstellung die Ergebnis
se der Säulenchromatographie eines HBo-Ag/e-Ag Materials an Hydroxyktpatit Die Sammelprobe I de:
von dem Hydroxylapatit II (Fig.6) eluierten HBo-Ag
e-Ag wurde auf 75 ml konzentriert und erneut auf ein< 600-ml-Hydroxylapatit-Säule aufgegeben. Das Antiger
wurde mit einem diskontinuierlichen Gradienten vor jeweils einem Liter 0,02-m, 0,05-m und 0,10-n
Natriumphosphat-Pufferlösung mit einem pH-Wert vor 7,2 eluiert Fraktionen von jeweils 18 ml wurdet
gesammelt und durch Messung der optischen Dichte be 28ö nm auf Proteine (· — ), durch CEP (x — χ — χ) um
10
RIA (ο — ο — ο) auf H Bo-Ag analysiert
F i g. 8 zeigt die Ergebnisse der Immunelektrophorese
von HBo-Ag/e-Ag-Fraktionen, die von Hydroxylapatit eluiert worden waren. D:e Proben wurden mit
Antiserum geprüft, das durch Immunisierung von Kaninchen mit normalem Schimpansenplasma hergestellt
worden war.
Proben: (1) Saramelprobe I; (2) Sammelprobe H;
(3) Sammelprobe III;
(4) Sammelprobe IV; (5) Sammelprobe V;
(6) Sammelprobe Vl;
(7) Sammelprobe VII-VIII.
Fig.9 zeigt die Ergebnisse der Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese
gereinigter H Bo-Ag/e-Ag-Präparate, die mit Coomassie-BIau angefärbt waren. Die Proben
wurden in einem 7,5°/oigen SDS-Acrylamid-Gel unter den oben beschriebenen Bedingungen laufengelassen.
Nach dem Anfärben der Gele mit Coomassie-BIau wurden sie in einem Joyce-Loebl-Mikrodensitometer
abgetastet:
A: 20— 22 nm große kugelförmige Teilchen von
HBo-Ag;
B: 22—28 nm große kugelförmige Teilchen von
B: 22—28 nm große kugelförmige Teilchen von
HBo-Ag; 2:>
C: HBo-Ag/e-Ag-Teilchen, die hauptsächlich aus
Fäden und Dane-Partikel bestehen.
Fig. 10 zeigt die Ergebnisse einer Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese
von Proben aus gereinigtem jo HBo-Ag/e-Ag, die parallel zu der Elektrophorese
gemäß F i g. 9 vorgenommen wurde. Nach dem Anfärben mit Schiffscher Base wurden die Gele in
einem Joyce-Loebl-Mikrodensitometer abgetastet.
F i g. 11 zeigt eine Reihe clcktronenmikroskopischer
Aufnahmen von HBo-Ag/e-Ag-Teilchen, die durch chargenweise Elution von Hydroxylapatit und Zonen-Ultrazentrifugieren
gereinigt worden waren. Die Bilder wurden nach negativem Anfärben mit Phosphorwolframat
in einem Cleatron-Mikroskop JEOL 100 B bei 67 OOOfacher Vergrößerung aufgenommen.
a: Zonen-Ultrazentrifugation — Sammelprobe I:
Dane-Partikel und große Fäden;
b: Zonen-Ultrazentrifugation — Sammelprobe II:
b: Zonen-Ultrazentrifugation — Sammelprobe II:
Fäden und 22—28 nm kugelförmige Teilchen;
c: Zonen-Ultrazentrifugation— Sammelprobe III:
c: Zonen-Ultrazentrifugation— Sammelprobe III:
20—28 nm große kugelförmige Teilchen.
Die Fig. 12A und 12B sind graphische Darstellungen der Ergebnisse, die bei der isoelektrischen Dünnschichtfokussierung
vereinigter konzentrierter Proben von HBo-Ag/e-Ag in Sephadex G-75, die in l°/oigem
Ampholin von pH 3—6 gelöst waren. Die Fraktionen wurden in der oben beschriebenen Weise durch RIA
(· — · — ·) auf HBo-Ag und auf den pH-Wert (x —x —x)
analysiert.
A: Sammelprobe I: 22—28 nm große kugelförmige
Teilchen von HBo-Ag;
B: Sammelprobe II: 22—28 nm große kugelförmige Teilchen, Fäden und einige Dane-Partikel.
B: Sammelprobe II: 22—28 nm große kugelförmige Teilchen, Fäden und einige Dane-Partikel.
Die Fig. 13A und 13B sind graphische Darstellungen
weiterer Ergebnisse, die bei der isoelektrischen Dünnschichtfokussierung des gleichen Materials aus
vereinigten konzentrierten Proben von HBo-Ag/e-Ag (Tabelle 4) in l%igem Ampholin von pH 3,5 bis 10,0
nach der Behandlung mit Triton X-IOO erhalten wurden. Die Fraktionen wurden in tier u'ueii besciii iebcncn
45
60
Weise durch RIA ( ) auf HBo-Ag und auf den
pH-Wert (x—χ—χ) untersucht.
A: Sammelprobe I: 22—28 nm große kugelförmige
Teilchen;
B: Sammelprobe II: 22—28 nm große kugelförmige Teilchen, Fäden und einige Dane-Partikel.
B: Sammelprobe II: 22—28 nm große kugelförmige Teilchen, Fäden und einige Dane-Partikel.
Anhand der folgenden Beispiele wird die Erfindung
näher veranschaulicht.
Zunächst werden die allgemeinen Maßnahmen zur Reinigung des Hepatitis-B-Oberflächenantigens aus
Human- oder Schimpansenplasma durch Fällung mit Polyäthylenglykol (PEG) und nachfolgende Reinigung
an Hydroxylapatit beschrieben. Danach werden die Ergebnisse der Anwendung dieser Verfahrensmaßnahmen
bei der Reinigung und Fraktionierung von Schimpansen-Hepatitis-B-Oberflächenantigen, das
e-Antigen aufweisende Teilchen enthält, in größerem Maßstab mitgeteilt Die in den einzelnen Reinigungsstufen
erhaltenen Proben wurden mit Hilfe elektrophoretischer und chromatographischer Verfahren eingehend
analysiert. Mit Fraktionen verschiedener morphologischer Formen der zusammen mit dem gereinigten
Schimpansen-HBo-Ag auftretenden Teilchen wurden Vergleichsuntersuchungen durch isoelektrische Dünnschichtfokussierung
und Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese
ausgeführt.
Reinigung und Charakterisierung
der zum Hepatitisvirus B gehörenden Teilchen
aus 7,8 Liter Plasma eines einzigen
HBo-Ag-Träger-Schimpansen
Materialien und Methoden Herkunft des HBo-Ag
Das Antigen wurde aus dem gesammelten Plasma eines Träger-Schimpansen gewonnen, der zuvor mit
HBo-Ag-positivem Humanplasma vom Untertyp ADW geimpft worden war. In dem verwendeten Plasma
befand sich an der Oberfläche identifizierbarer Dane-Partikel das e-Antigen.
Reinigung des HBo-Ag und des e-Antigens
Das HBo-Ag und das e-Antigen wurden aus dem Plasma durch Fällung mit Polyäthylenglykol (PEG)
isoliert. Der wiedersuspendierte Niederschlag aus HBo-Ag und e-Antigen wurde durch Säulenchromatographie
an Hydroxylapatit gereinigt. Die abschließenden Reinigungsmaßnahmen bestanden in Zentrifugieren
mit einem Dichtegefälle. Nachstehend werden diese Verfahrensmaßnahmen kurz beschrieben:
In einer Vorreinigungsstufe wurden 7800 ml HBo-Ag und freies e-Antigen enthaltendes Plasma auf einen
pH-Wert von 4,6 eingestellt und mit einer 30%igen Lösung von PEG in destilliertem Wasser bis zu einer
Konzentration von etwa 2% versetzt. Die Flüssigkeit wurde über Nacht bei 40C stehengelassen und dann
durch Zentrifugieren geklärt. Das HBo-Ag in der überstehenden Flüssigkeit wurde durch Erhöhung der
PEG-Konzentration auf 4% ausgefällt. Die nach dem Stehenlassen der Probe über Nacht bei 4°C überstehende
Flüssigkeit wurde abdekantiert und verworfen. Das e-Antigen enthaltende Sediment von HBo-Ag wurde in
500 in! desiiiiiei ieni Wasser i ücksuSDeiidici i. Die
Hauptmenge des PEG wurde zusammen mit einigen Verunreinigungen durch Einstellen der Lösung auf
einen pH-Wert von 5,0 ausgefällt, und der Niederschlag
wurde durch Zentrifugieren entfernt Die klare überstehende Flüssigkeit wurde erneut auf einen pH-Wert von
4,6 eingestellt, und das HBo-Ag sowie die zu dem e-Antigen gehörenden Teilchen (HBo-Ag/e) wurden
durch Zusatz einer 3O°/oigen Lösung von PEG bis zu einer Endkonzentration von 4% ausgefällt Das
HBo-Ag/e wurde nach dem Stehenlassen der Probe über Nacht bei 4° C durch Zentrifugieren abgetrennt
Danach wurde der Niederschlag von HBo-Ag/e erneut in 320 ml destilliertem Wasser suspendiert
Säulenchromatographie an Hydroxylapatit
In einem Vorversuch wurden *>0 ml der Suspension
aus dem mit PEG gefällten HBo-Ag/e auf eine Hydroxylapatit-Säule von 6,5 χ 16,5 cm aufgegeben
und mit einem diskontinuierlichen Gradienten von Phosphatpuffer eluiert. In einem nachfolgenden Versuch
wurden 200 ml der Probe auf eine Hydroxylapatit-Säule von 6,5 χ 35 cm teilgereinigt Das eluierte
HBo-Ag mit dem ersten Protein-Peak wurde ein zweites Mal durch eine Hydroxylapatit-Säule gegeben.
15
20
Dichtegefälle-Zentrifugation
Fraktionen des durch Säulenchromatographie isolierten HBo-Ag wurden durch Zonen-Ultrazentrifugieren
gereinigt. Aus 3 ml 60%iger und 7 ml 40%iger Sucrose in 0,02-m Natriumphosphat-Pufferlösung mit einem
pH-Wert von 7,2 (die 0,02% NaNj enthielt) wurde ein diskontinuierlicher Gradient gebildet In jedes Röhrchen
wurde eine 20-ml-Probe gefüllt und in einer Spinco-Zentrifuge SW 25.1 18 Stunden bei 18 000 U/min
zentrifugiert. Aus dem Unterteil der Röhrchen abtropfende Flüssigkeit wurde in Fraktionen von 1 ml
gesammelt und auf HBo-Ag analysiert Die Peak-Fraktionen mit Antigenwirkung wurden vereinigt, gründlich
dialysiert und durch Ultrafiltration unter Verwendung einer Membran mit einer Sperre bei einem Molekulargewicht
von 30 000 (Amicon PM-30) konzentriert. Die konzentrierten HBo-Ag-Fraktionen wurden anschließend
einer Endreinigung durch isopyknisches Banding in einem linearen CsCl-Gradienten und Zonen-Ultrazentrifugation
in einem kontinuierlichen Sucrose-Gradienten unter den normalerweise angewendeten Bedingungen
unterworfen.
Untersuchungsmethoden
Der Gehalt an HBo-Ag wurde durch Gegenelektrophorese (CEP) oder den Radioimmunversuch (Ausria I
oder II, Abbot Laboratories) in fester Phase verfolgt Die Proteinkonzentration wurde durch Messung der
optischen Dichte bei 280 nm und durch Bestimmung des Stickstoffs nach einem Mikro-Kjehldahl-Verfahren
abgeschätzt Die Methoden waren die gleichen, wie sie in der schon erwähnten US-Patentanmeldung Serial No.
4 26 825 beschrieben sind.
Kriterien 4er HBo-Ag-Reinheit
Nach jeder Reinigungsstufe wurden die Proben durch Celluloseacetat-EIektrophorese, Immunelektrophorese
und Agar-Gel-Diffusionstests gegen polyvalentes Antinormalhumanplasmaprotein
Antiserum analysiert.
Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese
Aliquote Teile der Proben, die 0,01-m Natriumphosphat-Pufferlösung
mit einem pH-Wert von 7,2, 1% Natriumdodecylsulfat, 1% /S-Mercaptoäthanol und 10%
Glycerin enthielten, wurden 2 Minuten in einem siedenden Wasserbad erhitzt, auf 7,5- oder 10%ige
Natriumdodecylsulfat-Acrylamid-Gele aufgetragen und
einer Elektrophorese nach Maizel unterworfen. Die Proteine im Gel wurden mit Coomassie-Blau, die
Kohlenhydrate mit Schiffscher Base nach der Methode von Glossman und Neville angefärbt
Ergebnisse
Die Ergebnisse der Reinigung der HBo-Ag/e-positiven Seren durch die Fällung mit Polyäthylenglykol sind
in Tabelle III aufgeführt. Anscheinend wurden 87% des ursprünglichen Plasmaproteins be' der ersten Fällung
des HBo-Ag (zu der auch die Vorreinigung mit einer 2%igen PEG-Konzentration gehörte) entfernt. Das
nach zwei aufeinanderfolgenden Fällungen mit PEG erhaltene Endpräparat zeigte eine quantitative Gewinnung
des HBo-Ag mit nur 4% der ursprünglichen Proteine.
Reinigung von vereinigtem Schimpansen-HBo-Ag durch Fällung mit PEG 6000
Volumen
(ml)
HBo-Ag CEP-Titer1) Gesamtprotein
(B)
% Ausbeute2)
HBo-Ag
HBo-Ag
Fache3)
Reinigung
Reinigung
Ursprüngliches HBo-Ag-Plasma
Erster 4%-PEG Niederschlag
Zweiter 4%-PEG-Niederschlag
Erster 4%-PEG Niederschlag
Zweiter 4%-PEG-Niederschlag
7800 | 512 | 429,0 | 100 | 6,9 |
500 | 7 080 | 55,0 | 89 | 20,7 |
320 | 10000 | 16,6 | 80 | |
X 100.
1I Kjehldahl.
2) [HBo-Ag] Probe X Volumen
[HBo-Ag] Plasma X Volumen
') [Protein] Plasma % Ausbeute HBo-Ag
') [Protein] Plasma % Ausbeute HBo-Ag
IProteinl Probe 100
Hydroxylapatit-Chormatographie I
Bei einem Vorversuch wurden 50 ml der Suspension aus dem rücksuspendierten, mit PEG gefällten HBo-Ag
durch Säulenchromatographie an Hydroxylapatit fraktioniert Die Ergebnisse der chromatographischen
Trennung sind in Fig.4 wiedergegeben. Das Eluat
wurde in 7 Fraktionen getrennt, die gegen eine 0,02-m
Natriumphosphat-Pufferlösung mit einem pH-Wei i von 7,2 (die 0,02% Natriumazid enthielt) dialysiert und durch
Ultrafiltration konzentriert. Die konzentrierten Proben wurden durch Messung der optischen Dichte bei 280 nm
auf Proteine und durch Gegenelektrophorese auf HBo-Ag analysiert. Die Ergebnisse der Fraktionierung
sind in Tabelle 4 zusammengestellt.
Hydroxylapatit-Chromatographie I Reinigung des zweiten 4%-PEG-Niederschlags von HBo-Ag
Nr. | Probe | Volumen | HBo-Ag | Gesamt-1) | % Ausbeute2) | 12 | Fache3) |
CEP-Titer | protein | HBo-Ag | 10 | Reinigung | |||
(ml) | (mg) | 1 | |||||
1 | Zweiter 4%-PEG- | 50 | 10000 | 2 600,0 | 100 | 1 | 0 |
Niederschlag von HBo-Ag | 40 | ||||||
2 | Ottapatit I: | 14 | |||||
Sammelprobe I | 4 | 10000 | 63,2 | B | 3,3 | ||
3 | Sammelprobe II | 6 | 10000 | 87,2 | 3,6 | ||
4 | Sammelprobe III | 5 | 10 000 | 183,9 | 1,4 | ||
5 | Sammelprobe IV | 6 | 800 | 110,0 | 0,2 | ||
6 | Sammelprobe V | 6 | 800 | 72,6 | 0,3 | ||
7 | Sammelprobe VI | 10 | 20000 | 984,0 | 1,1 | ||
8 | Sammelprobe VII | 7 | 10 000 | 338,3 | 1,1 |
') #lKjehldahl
# s 2-8 O.D. 280 nm E^-J* = 1,143.
2) [HBo-Ag] Probe X Volumen
[HBo-Ag] Plasma X Volumen
3) [Protein] Plasma % Ausbeute HBo-Ag
[Protein] Probe 100
Die Celluloseacetat-Elektrophorese (Fig.5) zeigte
im Vergleich zu dem ursprünglichen Plasma (F i g. 5A) zwei Proteinbande in den Fraktionen I (Fig.5E) und
Fraktion II (Fig.5D), die zwischen den Bereichen Aiphai, Alpha2 sowie den Fibrinogen- und Beta-Globulin-Bereichen
wanderten. Die Fraktion III (Fig.5C) zeigte zwei zusätzliche Komponenten im Bereich des
Beta-Globulins und Albumins. Der suspendierte PEG-Niederschlag
von HBo-Ag (bei 24facher Konzentration) zeigte kräftige Linien zwischen den Bereichen Aiphai
und Alpha2 sowie dem Ursprung (Fibrinogen) und zwei zusätzliche Bande in dem Bereich des Albumins und
Gamma-Globuüns (F i g. 5B).
Wie in F i g. 4 angegeben, wurde das HBo-Ag in drei Antigen-Peaks zerlegt. Die Untersuchung der Proben
mit Hilfe der Elektronenmikroskopie ergab hauptsächlich kugelförmige Teilchen von 22 bis 28 nm Durchmesser
im ersten Peak (Fraktion 1) und Teilchen verschiedener Größe, darunter Dane-Partikel und
große Fäden, im zweiten Peak (Fraktion II). Der dritte Antigen-Peak (Fraktion VI) enthielt hauptsächlich 16 bis
22 nm große kugelförmige Teilchen.
Hydroxylapatit-Chromatographie 11
Weitere 200 ml der Suspension aus dem resuspendierten PEG-Niederschlag des HBo-Ag wurde auf einer
1000-ml-Hydroxylapatit-Säule fraktioniert. Die Ergebnisse
der chromatographischen Trennung sind in F i g. 6 wiedergegeben. Die HBo-Ag-Fraktionen des ersten
60 Protein-Peaks (Sammelprobe I: Fraktionen 38 bis 83)
und das Resteluat (Sammelprobe II: Fraktionen 84—110) wurden jeweils vereinigt und durch Ultrafiltration
auf 75 ml konzentriert.
Hydroxylapatit-Chromatographie III
Die konzentrierte Sammelprobe I aus der vorstehend beschriebenen Trennung wurde erneut auf einer
1000-ml-Hydroxylapatit-Säule Chromatographien. Die Ergebnisse dieser chromatographischen Trennung sind
in Fig. 7 dargestellt. Das Eluat wurde zu 8 Fraktionen
gemäß der Figur vereinigt. Die vereinigten Proben
wurden durch Ultrafiltration konzentriert und mit 0,02-m Natriumphosphat-Pufferlösung mit einem
pH-Wert von 7,2 (die 0,02% Natriumazid enthielt)
gewaschen. Dann wurden die Proben auf Proteine und HBo-Ag analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5
zusammengestellt.
Hydroxylapatit-Chromatographie III
Reinigung der Sammelproben aus der Hydroxylapatit-Chromatographie II
Volumen
(ml)
HBo-Ag | Gesamt·!) | % Ausbeute2) | Fache3) |
CEP-Titer | protein | HBo-Ag | Reinigung |
(mg) |
0 Hydroxylapatit II: | 75 | v inn | 10000 | 706,0 | 100 | - |
Sammelprobe I | A IUU. | |||||
0 Hydroxylapatit III: | 5 | 3) [Protein] Hydroxylapatit-Sammelprobe I | 8000 | 51,8 | 5,3 | 0,12 |
Sammel probe I | 5 | [Protein] Probe | 2000 | 14,2 | 1,3 | 0,65 |
Sammelprobe II | 4 | 1600 | 11,4 | 0,9 | 0,56 | |
Sammelprobe III | 4 | 3 200 | 7,3 | 1,7 | 1,64 | |
Sammelprobe IV | 12 | 16000 | 181,6 | 25,6 | 1,00 | |
Sammelprobe V | 7 | 8000 | 79,6 | 7,5 | 0,61 | |
Sammelprobe VI | 45 | 4000 | 332,8 | 24,0 | 0,51 | |
Sammelprobe VII | ||||||
') O.D.280 nm E1J-J* = 3,16 | ||||||
2) [HBo-Ag] Probe X Volumen | ||||||
[HBo-Ag] Plasma X Volumen | % Ausbeute HBo-Ag | |||||
100 | ||||||
Eine Analyse der Proben auf Verunreinigungen durch Immunelektrophorese (F i g. 8) zeigte eine sehr schwache
Präzipitinlinie bei der Fraktion I, eine stärkere Linie bei den Fraktionen II bis V! und eine sehr breite Linie
bei den vereinigten Fraktionen VIl und VIII. Alle wanderten zwischen dem AIpha2- und Albumin-Bereich.
Die Elektronenmikroskopie der Proben ergab bei den Fraktionen I bis III hauptsächlich kugelförmige Teilchen
von 22—28 nm Durchmesser, bei den Fraktionen IV bis VI kugelförmige Teilchen und Fäden und bei den
Fraktionen VII und VIII meist kleine kugelförmige Teilchen.
Die konzentrierten Proben dieser Reinigungsstufe wurden einer vollständigen Reinigung durch dichte
Gradienten-Zentrifugation unter den im Abschnitt »Methoden« beschriebenen Bedingungen unterworfen.
Die gereinigten HBo-Ag-Präparate bestanden hauptsächlich aus 20—22 nm großen kugelförmigen Teilchen,
22—28 nm großen kugelförmigen Teilchen, Fäden verschiedener Größe sowie Dane-Parlikel, wobei jedes
Präparat 100 μg Protein enthielt dessen Polypeptid-Zu
50
55 sammensetzung durch Polyacrylamid-Gel- Elektrophorese
untersucht wurde (F i g. 9). Bei den Protein-Peaks der einzelnen Proben konnten anscheinend quantitative
Unterschiede beobachtet werden. Weitere Unterschie de wurden bei dem Peak 5 gefunden, der bei derr
Präparat mit 20—22 nm großen Teilchen nur eine klein« Schulter zeigte (Fig.9A), die bei dem Präparat mii
22—28 nm großen Teilchen (Fig.9B) und der haupt
sächlich Fäden und Dane-Partikel (F i g. 9C) ausgeprägt war. Aliquote Teile der 20-22 nm (Fig. 10A) unc
22—28 nm große kugelförmige Teilchen (Fig. 1OB
enthaltende Präparate wurden parallel zu den vorste hend beschriebenen Untersuchungen durch Anfärber
mit Schiffscher Base auf Kohlenhydrate geprüft Es isi ersichtlich, daß die Peaks Pi, P2, P* und P6 Kohlenhydra
te enthalten.
Die niedermolekularen Kohlenhydrate der Peak; (rechts in Fig. 10) sind wahrscheinlich Glycolipide, fr,
sie sich mit Coomassie-Blau nicht anfärben lassen. DU
ungefähren Molekulargewichte der Polypeptide sind ii
Tabelle 6 aufgeführt
Molekulargewicht (X 103) der Polypeptide der HBo-Ag/e-Teilchen
Untertyp: adwx
Peak-Nummer
Pl
P2 P3
P4
P6
P7
P8
P9
Schimpansen-HBo-Ag/e 23-24 26-27 — 44-45 68-69 103-105 108-110 115-118
10
Aus den die großen Teilchen enthaltenden Fraktionen wurde ein Impfstoff hergestellt, indem 0,5 mg/ml
Humanserum-Albumin zugesetzt und anschließend eine Inaktivierung durch Kobaltbestrahlung (mit 2,5 Millionen
rad), Inaktivierung mit Formalin nach herkömmlichen Methoden (96 h bei 37°C, Konzentrationen
1 :2000) und Behandlung mit Beta-Propiolacton nach den bei der Herstellung von Tollwut-Impfstoff gebräuchlichen
Verfahren ausgeführt wurde.
Modifiziertes, verbessertes PEG-Verfahren zur Isolierung von H Bo-Ag/e
Ein modifiziertes Verfahren zur PEG-Fällung wurde
auf 2,6 Liter vereinigtes Plasma angewandt, das von einem einzigen Träger-Schimpansen stammte und
HBo-Ag sowie e-Antigen in ungebundener, nicht gefällter Form enthielt. Das Plasma wurde auf einen
pH-Wert von ungefähr 4,6 eingestellt und unmittelbar danach mit einer 3O°/oigen Lösung von PEG bis zu einer
Endkonzentration von 2% versetzt. Die Flüssigkeit wurde auf Eis 30 Minuten abgekühlt (statt sie wie bei
dem Verfahren des Beispiels 1 über Nacht bei 4°C stehenzulassen), und der Niederschlag wurde durch
Zentrifugieren entfernt.
Die das HBo-Ag enthaltende überstehende Flüssigkeit wurde durch Zusatz von 6,6 Teilen einer 30%igen
PEG-Lösung je 100 Teile Flüssigkeit bei Raumtemperatur auf eine PEG-Konzentration von 4% (statt auf 4,5%
wie im Beispiel 1) gebracht. Die Suspension wurde erneut 30 Minuten auf Eis gekühlt, und das ausgefällte
H Bo-Ag/e wurde durch Zentrifugieren abgetrennt. Der Niederschlag wurde erneut in 200 ml destilliertem
Wasser suspendiert. Die Hauptmenge des PEG und einige begleitende Verunreinigungen wurden durch
Einstellung des pH-Wertes auf 5,0, 30 Minuten Abkühlen der Flüssigkeit auf Eis und Abtrennen des
ausgefallenen Niederschlages durch Zentrifugieren entfernt. Der pH-Wert der klaren überstehenden
Flüssigkeit wurde erneut auf 4,6 eingestellt, und 30%iges PEG wurde bis zu einer Endkonzentration von 3% (statt
4,0 bis 4,5% wie im Beispiel 1) zugesetzt. Das Material wurde erneut 30 Minuten auf Eis abgekühlt, und der aus
HBo-Ag/e bestehende Niederschlag wurde durch Zentrifugieren abgetrennt.
Der das HBo-Ag/e enthaltende Niederschlag wurde erneut in 100 ml destilliertem Wasser gelöst. Die
Hauptmenge des PEG wurde wiederum durch Einstellen des pH-Wertes auf 5,0 ausgefällt. Nach Stehenlassen
über Nacht bei 4° C wurde die Suspension durch Zentrifugieren geklärt. Die das HBo-Ag/e enthaltende
klare überstehende Flüssigkeit wurde mit einer 0,5-m Natriumphosphat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von
7,2 bis zu einer Endkonzentration von 0,02-m versetzt, und die Flüssigkeit wurde mit destilliertem Wasser auf
ein Endvolumen von 120 ml gebracht.
Die in Tabelle 7 zusammengestellten Ergebnisse dieser Reinigung zeigen, daß dadurch eine über 33fache
Reinigung des HBo-Ag (gegenüber einer 24fachen Reinigung bei dem Verfahren des Beispiels 1) erreicht
werden konnte.
Reinigung des HBo-Ag durch Fällung mit PEG 6000
Volumen | HBo-Ag | Gesamt |
1/CEP-Titer | protein | |
(ml) | (g)1) | |
2600 | 80 | 130,0 |
1200 | 160 | • 22,8 |
120 | 1600 | 3,6 |
% Ausbeute
HBo-Ag2)
HBo-Ag2)
Fache
Reinigung3)
Reinigung3)
Ursprüngliches Plasma
Erste 4%-PEG-Fällung
Zweite 3%-PEG-Fällung
Erste 4%-PEG-Fällung
Zweite 3%-PEG-Fällung
') Kjehldahl.
2) [HBo-Ag] Probe X Volumen
[HBo-Ag] Plasma X Volumen
[HBo-Ag] Plasma X Volumen
3) [Protein] Plasma % Ausbeute HBo-Ag
XlOO.
[Protein] Probe
100
100,0
92,3
92,3
92,3
92,3
0,0
5,3
33,3
33,3
Zu dem besseren Ergebnis des Verfahrens gemäß Beispiel 2 tragen folgende Faktoren bei:
1. Das Abkühlen der Flüssigkeiten 30 Minuten auf Eis statt des Stehens über Nacht verkürzt die
Reinigung auf einen Arbeitstag, während bei dem eo Verfahren des Beispiels 1 mehrere Tage nötig sind.
2. Die Verkürzung der Abkühlzeit führt zu einer spezifischeren Fällung des HBo-Ag/e und zu einer
geringeren Verunreinigung durch Plasmaproteine.
3. Durch die Verringerung des Volumens der Probe nach der ersten Fällung des ABo-Ag/e können in
den nachfolgenden Stufen kleinere Mengen PEG für die selektive Fällung verwendet werden, und es
kann eine zweite Fällung bei einem pH-Wert von 5,0 zur Entfernung der Hauptmenge des PEG aus
der Probe vorgenommen werden.
Aus dem Produkt wird Impfstoff durch Zusatz von Albumin und anschließende Inaktivierung in der
gleichen Weise hergestellt, wie in Beispiel 1 beschrieben.
Fraktionierung von HBo-Ag/e durch
chargenweise Behandlung mit Hydroxylapatit
chargenweise Behandlung mit Hydroxylapatit
Der wiedersuspendierte Niederschlag von HBo-Ag/e aus der PEG-Fällung (Beispiel 2) wurde chargenweise
mit Hydroxylapatit statt nach dem Verfahren der Säulenchromatographie behandelt. Eine Menge von
500 ml Füllkörper-Hydroxylapatit wurde in 800 ml einer 0,02-m Natriumphosphat-Pufferlösung mit einem
pH-Wert von 7,2 suspendiert, und die Suspension wurde nach Zusatz des oben beschriebenen HBo-Ag/e-Präparates
30 Minuten bei Raumtemperatur mit einem Magnetrührer gerührt. Die Aufschlämmung wurde in
zwei gleiche aliquote Teile geteilt, die in 1-1-Bechern 10
Minuten bei 4000 U/min in einer Sorvall-Zentrifuge RC-3 geschleudert wurden. Die überstehende Flüssigkeit
wurde abdekantiert und das Sediment nacheinander mit jeweils 1 Liter 0,02-m und 0,05-m Natriumphosphat-Pufferlösung
mit einem pH-Wert von 7,2 gewaschen. Die Eluate wurden vereinigt, durch Ultrafiltration unter
Verwendung einer Membran PM-30 konzentriert, mit 0,02-m Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von
7,2, die 0,02% NaN3 enthielt, diafiltriert und mit der gleichen Pufferlösung auf ein Volumen von 60 ml
eingestellt.
Die konzentrierte Probe wurde weiter durch Zonen-Ultrazentrifugation in einem diskontinuierlichen
Sucrosegradienten gereinigt.
Die abgetrennten HBo-Ag/e-Teilchen wurden zu drei
Fraktionen vereinigt, dialysiert und durch Ultrafiltration in der oben beschriebenen Weise konzentriert. Eine
Untersuchung der Proben mit Hilfe der Elektronenmikroskopie ergab hauptsächlich große Fäden und
Dane-Partikel in der Fraktion I (Fig. 11a), Fäden, Dane-Partikel und 22—28 nm große kugelförmige
Teilchen in der Fraktion II (Fig. lib) und 20—28 nm
große kugelförmige Teilchen in der Fraktion III (Fig. lic).
Die chargenweise Behandlung des rücksuspendierten PEG-Niederschlags von HBo-Ag/e hat gegenüber dem
zuvor beschriebenen Verfahren der Säulenchromatographie den Vorteil, daß die Fraktionierung an einem
Tag ausgeführt werden kann, während bei der Säulenchromatographie zur Eluierung 5 Tage erforderlich
sind.
Aus dem Produkt wird Impfstoff durch Zusatz von Albumin und Inaktivierung in der gleichen Weise
hergestellt, wie im Beispiel 1 beschrieben.
Desaggregation der HBo-Ag/e-Teilchen
mit ionenaktiven und nichtionogenen Tensiden
mit ionenaktiven und nichtionogenen Tensiden
HBo-Ag/e-Teilchen wurden bei Raumtemperatur (5 Minuten bis 2 Stunden) mit folgenden Tensiden
behandelt: 0,5- bis 2%ige Lösungen von Nonidet NP-40 (einem grenzflächenaktiven Produkt der Shell Oil Co.),
0,5- bis 2%igen Lösungen von Tween 80 (grenzflächenaktives Mittel), 5- bis 10%igen Lösungen von Triton
X-100 (grenzflächenaktives Mittel), 0,1- bis l,0°/oigen Lösungen von Natriumdodecylsulfat usw. Dadurch
sollten folgende Ziele erreicht werden: 1. Potenzierung der Antigenaktivität in den mit den Tensiden behandelten
Proben und 2. Inaktivierung des Infizierungsvermögens der Proben.
Die optimalen Behandlungsbedingungen wurden anhand von Analysen der Proben vor und nach der
Tensidbehandlung mit Hilfe der isoelektrischen Dünnschichtfokussierung bestimmt Die einzelnen Komponenten
der desaggregierten Proben können mit Hilfe verschiedener Methoden isoliert werden, beispielsweise,
durch Molekularexklusion, Adsorption, Ionenaustausch, Chromatographie, Ultrazentrifugation, verschiedene
20
25
30
35 Elektrophorese-Methoden usw. Eine dieser hochwirksamen Methoden ist die nachstehend beschriebene
isoelektrische Fokussierung mit Zonenkonvektion.
Isoelektrische Fokussierung
Aus dem Cellulose-Gel Sephadex G-75 (Pharmacia,
Uppsala, Schweden) in einer 1%igen Ampholin-Lösung mit einem pH-Wert von 4,0—6,0 oder 3,5 bis 10,0
wurden nach der Methode von Radola dünne Trägerschichten hergestellt. Die Versuche mit diesen
Platten wurden in einem LKB-Multiporenapparat ausgeführt. Prints of Whatmann-Chromatographiepapier
3 MM wurden längs der Linie der getrennten Proben unterteilt und in 0,5 bis 1 cm breite Zonen
geschnitten. Die einzelnen Zonen wurden wiederum in kleinere Teile zerschnitten, mit 0,2 ml gepufferter
Kochsalzlösung angefeuchtet und mit 0,2 ml normalem Humanserum (frei von HBo-Ag und H B-Antikörpern)
eluiert. Ein aliquoter Teil von 200 μΙ eines jeden Eluats wurde für den Radioimmunversuch verwendet. Die
Streifen zwischen den getrennten Proben wurden ebenfalls zerschnitten und mit 0,4 ml entgastem
destilliertem Wasser eluiert; dieses Eluat wurde zu pH-Messungen verwendet. Soweit zwei Prints aufgenommen
wurden, wurde ein Print zum Anfärben des Proteins und der andere für den HBo-Ag-Radioimmunversuch
sowie die pH-Messungen verwendet. Ein aliquoter Teil einer jeden Probe wurde vor dem
Auftragen auf das Gel mindestens 20 Minuten bei Raumtemperatur mit einer 5- bis 10%igen Lösung eines
nichtionogenen Tensids (Triton X-100) behandelt und zusammen mit einer unbehandelten Vergleichsprobe
unter den oben beschriebenen Bedingungen dem Versuch unterworfen.
Isoelektrische Fokussierung
mit Zonenkonvektion
mit Zonenkonvektion
Nach den von Valmet (US-PS 36 16 456) angegebenen Grundsätzen wurde ein Gerät aus Lucit gebaut. Es
bestand aus 32 Kammern mit einem Gesamtvolumen von 50 ml. Bestimmte Modifikationen führten zu
Verbesserungen. Der Trog wurde mit 50 ml einer Lösung gefüllt, die 1% Ampholin (LKB) des gewünschten
pH-Bereichs und 10% Glycerin enthielt. Die Lösung in den Kammern 4,5 und 6 (von der Anode aus gezählt)
wurde durch 1,5, 3,0 oder 4,5 ml der Probe ersetzt, die 1% Ampholin und 10% Glycerin enthielt. Die
Elektrofokussierung wurde 4 Tage bei 4° C mit einer Spannung von 1000 bis 1500V ausgeführt. Nach
Abnahme des Deckels wurden die Fraktionen aus den einzelnen Kammern herausgenommen, durch Zentrifugieren
geklärt und durch Messung der optischen Dichte bei 280 nm auf Proteine, durch RIA auf HBo-Ag und auf
den pH-Wert untersucht
Analyse der mit Triton X-100
behandelten HBo-Ag/e-Präparate
behandelten HBo-Ag/e-Präparate
Unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen wurden Fraktionen der durch Säulenchromatographie
an Hydroxylapatit (Fig.4) isolierten HBo-Ag/e-Teilchen
mit Hilfe der isoelektrischen Dünnschichtfokussierung analysiert Ein Präparat, das hauptsächlich aus
22—28nm großen kugelförmigen Teilchen (Fig. 12A)
bestand, und ein heterogenes Gemisch, das hauptsächlich aus größeren Teilchen (Fäden, Dane-Partikel)
(Fig. 12B) bestand, ergaben eine verhältnismäßig
geringe Heterogenität bei den Oberflächenladungen der Teilchen. Ein Hauptpeak der Antigenaktivität
wurde bei einem pH-Wert von 4,8 gefunden, und zwei kleinere Aktivitätspeaks wurden bei pH-Werten im
Bereich von 4,0 bis 4,1 sowie 4,4 bis 4,6 beobachtet. Die mit Triton X-100 behandelten Proben zeigten bei
planimetrischer Auswertung eine zweifache Verstärkung der Antigenaktivität (Fig. 13). Bei anderen
Versuchen schwankte die Verstärkung der Aktivität zwischen 2- und 8fach. Abgesehen von einer geringen
Antigen-Restaktivität in dem ursprünglichen niedrigen oH-Bereich (pH 4,1—5,0), wurden die Hauptpeaks der
Antigenaktivität in einem höheren pH-Bereich von 5,3 und 5,8 bis 5,9, ein kleinerer Peak auch bei pH 7,1 bis 7,2
gefunden. Eine Aktivität des e-Antigens wurde nur in dem pH-Bereich 5,6 bis 7,4 beobachtet. Dieses Antigen
wurde in dem Bereich durch den unempfindlichen Agar-Gel-Diffusionstest nachgewiesen. Die Menge des
e-Antigens in diesem Bereich ist als offensichtlich hoch. Der Peak beim Radioimmunversuch in diesem Bereich
könnte daher gut eine Verunreinigung der bei der Ausria-Methode (Abbott Laboratories) verwendeten
mit J-125 markierten »HBo-Antikörper« durch eine
sehr kleine Menge e-Antikörper darstellen.
Eine Desaggregation der HBo-Ag/e durch das nichtionogene Tensid Triton X-100 führt also zu einer
Potenzierung der Antigenaktivität. Dies hat bei der Herstellung von Antigenmaterial für die aktive Immunisierung
einen offensichtlichen Vorteil. Ein weiterer Vorteil der durch das Tensid hervorgerufenen Desaggregation
ist der Umstand, daß dies zu einer physikalischen Dissoziation der HB-Teilchen führt
Wenn überhaupt, so bleiben bei der Behandlung mit Triton X-100 unter den beschriebenen Bedingungen nur
wenige Teilchen intakt. Schon dies allein ist ein wichtiger Schritt bei der Inaktivierung des Infizierungsvermögens.
Darüber hinaus kann, falls gewünscht, diese Maßnahme mit anderen Behandlungen, wie der Fällung
mit HBc-Antikörpern und/oder der Behandlung mit Desoxyribonuclease, kombiniert werden, um alles zu
dem Hepatitisvirus B gehörendes genetisches Material aus dem Impfstoff zu entfernen. Dies kann sich wegen
der (theoretischen) Möglichkeit einer Oncogenität als wünschenswert erweisen.
Dieser Versuch zeigt daher eine Methode zur Reinigung von e-Antigen von den zu dem HBo-Ag/e
gehörenden Teilchen durch eine Kombination einer Dissoziation durch Triton X-100 und der isoelektrischen
Fokussierung mit Zonenkonvektion auf. Nachdem jetzt Geräte zur Ausführung dieser Methode im Mehrliter-Maßstab
zur Verfügung stehen (Roche Institute), eignet sich die beschriebene Methode zur Herstellung eines
e-Antigen enthaltenden Impfstoffs, der im wesentlichen frei von herkömmlichen HBo-Ag ist. Wie vorstehend
dargelegt, bietet ein derartiger Impfstoff offenkundige Vorteile.
Der fertige Impfstoff wird aus der mit Tensid behandelten Fraktion durch Zusatz von Albumin und
Inaktivierung nach der im Beispiel 1 beschriebenen Weise hergestellt.
Reinigung von löslichem e-Antigen aus dem Plasma chronischer HBo-Ag/e-Träger
zur Verwendung als Impfstoff
Wie vorstehend angegeben (siehe Fig.2), enthält
HBo-Ag/e- positives Plasma auch e-Antigen in löslicher Form (d. h. nicht in Verbindung mit Teilchen und mit
einem Molekulargewicht von unter 1 Million). Tatsächlich dominiert diese Form in vielen derartigen Plasmen,
so daß diese eine ideale e-Antigenquelle für die Immunisierung darstellen.
Die Eigenschaften des löslichen e-Antigens sind von Magnius, Ohori und den Erfindern in vorläufiger Weise
wie folgt bestimmt worden: Dichte (CsCl) 1,28 bis 1,29 g/cm3; S20.W = 11,6; Molekulargewicht 150 000 bis
900 000; isoelektrischer Punkt 5,5 bis 6,6; Elution von Diäthylaminoäthylcellulose bei 0,15-m NaCl.
Auf der Grundlage dieser und anderer Eigenschaften wurde folgendes Reinigungsverfahren entwickelt:
1. HBo-Ag/e enthaltendes Plasma wird zunächst mit PEG 6000 fraktioniert gefällt, wodurch die zu dem
HBo-Ag gehörenden Teilchen und einige Serumproteine entfernt werden. Die Fällung wird bei
einer PEG-6000-Konzentration von 5 bis 9 Gew.-%, vorzugsweise 8 Gew.-%, bezogen auf das
Gesamtgewicht der Mischung, bei einem pH-Wert von 7,0 und 20° C ausgeführt Daran schließt sich die
Fällung des e-Antigens und einiger Plasmaproteine mit PEG bei einer Konzentration von 9 bis 13% an.
Einzelheiten der fraktionierten Fällung, z. B. der pH-Wert, die Temperatur, die PEG-Konzentration
usw. können geändert werden; auch die Fällung bei einem pH-Wert von 5,0 zur Entfernung des PEG
kann angewendet werden.
2. Der bei der Fällung mit PEG erhaltene Niederschlag
wird in destilliertem Wasser oder einer geeigneten Pufferlösung (1/10 des ursprünglichen
Volumens) rücksuspendiert und einer isoelektrischen Fokussierung in 10%igem Glycerin, das 1 bis
2% Ampholyte des pH-Bereichs von 3,5 bis 10,0 enthält, unterworfen.
3. das Material des e-Ag-Peaks wird vereinigt auf einem Amicon-Filter PM 30 gegen eine 0,05-m
Phosphatpufferlösung, die 0,01-m Triton X-100 enthält und einen pH-Wert von 7,6 hat diafiltriert
und einer Säule aus Diäthylaminoäthylcellulose aufgegeben, die mit dem gleichen Puffer äquilibriert
worden ist. Die Elution wird mit einem linearen Gradienten von 0,0 bis 0,5-m NaCl in der
gleichen Pufferlösung ausgeführt Das e-Antigen wird bei etwa 0,15-m NaCl in hohem Reinheitszustand
eluiert.
4. Nach Konzentrierung durch Diafiltration wie zuvor werden die restlichen Verunreinigungen
entfernt falls gewünscht durch Zonen-Ultrazentrifugation in einem 10- bis 30%igen Sucrose- oder
äquivalenten Dichtegradienten, wobei das Material des Peaks 11,6 s gewonnen wird.
5. Gereinigtes e-Antigen wird durch Zusatz von Humanserum-Albumin bis zu einer Konzentration
von etwa 0,5 mg/ml stabilisiert Die Konzentration und Natur des kolloidalen Stabilisators ist natürlich
nicht kritisch.
Derartige Präparate können mit einer Konzentration von etwa 20 μg je Dosis anstelle der Teilchen
enthaltenden HBo-Ag/e-Vaccine verwendet und den beschriebenen Inaktivierungs- und Sterilisierungsbehandlungen
unterworfen werden.
Hierzu 13 Blatt Zeichnungen
Claims (7)
1. Hepatitis-B-Impfstoff, der
A. Antigen-Teilchen mit einer Teilchengröße im Bereich von 30 bis 50 nm aufweist, die
ungefällte, freie Kepatitis-B-Oberflächenantigene
enthalten und aus
a) fadenförmigen Proteinteilchen von länglicher Form und einer Teilchengröße von 30
bis 50 nm und/oder
b) Dane-Partikel mit einer Teilchengröße zwischen 40 und 50 nm bestehen,
B. weniger als 10 Einheiten Antikörper für Hepatitis-B-Oberflächenantigene je 1000 Einheiten
Hepatitis-B-Oberflächenantigene enthält und
C. mindestens 5% der Teilchen in dem Größenbereich von 30 bis 50 nm ungefälltes e-Antigen
enthält,
erhältlich aus Blutplasma eines chronischen Trägers des Hepatitis-B-Oberflächenantigens, das zum Hepatitis-B-Oberflächenantigen
gehörende Teilchen mit einer Größe von 16 bis 50 nm enthält, von denen
mindestens einige im Größenbereich von 30 bis 50 nm liegen, und das im wesentlichen frei von
Hepatitis-B-Oberflächenantikörpern und e-Antikörpern ist, wobei mindestens 1% der Teilchen sich
durch die Gegenwart von freiem, ungebundenem und nicht gefälltem e-Antigen auszeichnen, gewonnen
durch Entfernen von Proteinstoffen aus dem Plasma, Inaktivieren aller Viren in dem Material und
Verdünnen des erhaltenen Materials mit physiologisch unbedenklichen Mitteln.
2. Impfstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens 1% der Teilchen in dem
Größenbereich von 30 bis 50 nm Desoxyribonucleinsäure (DNS) enthalten.
3. Impfstoff nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß er lösliches, freies und nicht
gefälltes a-Antigen mit einer Dichte von 1,28 bis 1,29 g/cm3 und einem Molekulargewicht von 50 000
bis 900 000 in einem physiologisch unbedenklichen Medium enthält.
4. Impfstoff nach Anspruch 1 oder 2, dadurch
gekennzeichnet, daß er eine Dichte von 1,23 bis
1,34 g/cm3 hat
5. Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß er weniger als 10%
andere als zu den Hepatitis-B-Oberflächenantigen oder e-Antigen gehörende Proteinstoffe enthält.
6. Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet daß er zu 20 bis 50 μg
Hepatitis-B-Oberflächenantigen-Teilchen-Protein
mit 108 bis 1012 Dane-Partikel und eine oder größere Anzahl fadenförmiger Teilchen dosiert ist
mit 108 bis 1012 Dane-Partikel und eine oder größere Anzahl fadenförmiger Teilchen dosiert ist
7. Verfahren zum Herstellen des Impfstoffes nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet
daß man das Blutplasma auf einen pH-Wert im Bereich von 4,4 bis 4,7 einstellt bei diesem pH-Wert
zum Ausfällen eines Hepatitis-B-Antigen, das Hepatitis-B-Oberflächenantigen und e-Antigen enthält,
enthaltenden Niederschlages mit 3,0 bis 4,5 Gew.-% Polyäthylenglykol, bezogen auf das Gesamtgewicht
der Mischung, mischt, den Niederschlag abtrennt, mit so viel Wasser versetzt, daß das
freie Zwischenprodukt die gleiche oder eine höhere Konzentration an Hepatitis-B-Amigen als das
ursprüngliche Blutserum hat, das Zwischenprodukt üuf einen pH-Wert im Bereich von 4,9 bis 5,1 einstellt
und dadurch die nicht zum Hepatitis-B-Antigen gehörenden Proteinstoffe sowie Polyäthylenglykol
ausfällt, die die Hepatitis-B- und e-Antigen-Teilchen enthaltende flüssige Phase abtrennt, auf einen
pH-Wert im Bereich von 4,4 bis 4,7 einstellt und zur Ausfällung eines Niederschlages, der gereinigtes
Hepatitis-B-Oberflächenantigen und e-Antigen enthält mit 3,0 bis 4,5 Gew.-% Polyäthylenglykol,
bezogen auf das Gesamtgewicht der Mischung, mischt und den das gereinigte Hepatitis-B-Oberflächenantigen
und e-Antigen enthaltenden Niederschlag, der fadenförmige Protein- und Dane-Teilchen
enthält, die ihrerseits nicht gefälltes, ungebundenes, freies e-Antigen enthalten, gewinnt, eine
infektiöse Restaktivität des Impfstoffs mit Hilfe von Inaktivierungsmitteln beseitigt und in üblicher
Weise zum Impfstoff konfektioniert.
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