DE2610717A1 - Hepatitisvirus-vaccine und verfahren zu ihrer herstellung - Google Patents
Hepatitisvirus-vaccine und verfahren zu ihrer herstellungInfo
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Description
The Community Blood Council 10· März 1976
of Greater New York, Inc.
310 East 67th Street New York, N.Y. 10021 U.S.A.
Hepatitisvirus-Vaccine und Verfahren zu ihrer Herstellung
Die Erfindung betrifft eine Hepatitisvirus-Vaccine und ein Verfahren zu ihrer Herstellung.
Epidemiologische Untersuchungen sowie Versuche an Freiwilligen, die in den Jahren zwischen 1939 und 1967 ausgeführt wurden,
erbrachten den Nachweis der Existenz zwei Haupttypen von Hepatitisviren: des Virus A und des Virus B. Zunehmend wurde deutlich,
daß für das weitere Verständnis der Virologie dieser Viren und die Verhütung der von Ihnen verursachten Krankheiten
die Entwicklung immunologischer Methoden erforderte. Zahlreiche Untersuchungen konzentrierten sich auf diese Viren, insbesondere
auf das Virus B. Das Virus B wurde bei Patienten gefunden, die Injektionen oder Bluttransfusionen erhalten hatten, weshalb
die von diesem Virus hervorgerufene Krankheit auch als Serumhepatitis bezeichnet wurde. Nach der Entdeckung von Antigenen,
die für Infektionen mit dem Hepatitisvirus B spezifisch waren (Prince und Mitarbeiter, Am. J. Hyg. 79, 365, 1964; Blumberg
und Mitarbeiter, JAMA 191, 541, 1965; Prince, Proc.Nat. Acad. Sei. USA, 60, 814, 1968), wurde offensichtlich, daß das
30 032 _ 2_
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"Serumhepatitis-Virus" unter bestimmten Umständen tatsächlich
kontagiös war. Es erschien daher zweckmäßig, die Terminologie zu ändern. Der Virushepatitis-Ausschuß der Fachgruppe Medizinische
Wissenschaften in der Akademie der Wissenschaften, National Research Council, empfahl daher 1972, zur früheren
Terminologie, nämlich Hepatitisvirus A für den Erreger der infektiösen Hepatitis und Hepatitisvirus B für den Erreger der
Serumhepatitis, zurückzukehren. Gleichzeitig empfahl der Ausschuß die Benutzung der Bezeichnung Hepatitis-B-Antigen (HB-Ag)
für das Antigen anstelle der früher benutzten Bezeichnungen, z.B. Australia-Antigen (Au-Ag) nach der erstmaligen Feststellung
des Antigens australischer Ureinwohner, Serumhepatitis-Antigen (SH), Hepatitis verursachendes Antigen (HAA) usw.,
zu verwenden.
In der Folgezeit konzentrierten sich die Untersuchungen auf Antigen-Besonderheiten bei Infektionen mit dem Hepatitisvirus
B und auf Antigen-Untertypen, die heute als HBsAg/adywr usw., Hepatitis-B-Kernantigen (HBcAG), entdeckt von Almeida, e-Antigen,
entdeckt von Magnius und Espmark, sowie als Hepatitis-B-Oberflächenantigen
(HBoAG) bezeichnet werden. Antikörper für HBoAG werden als Anti-HBo bezeichnet.
Viele der ersten Forscher, darunter Blumberg, glaubten, daß die Hepatitis-B-Antigene ihren genetischen Ursprung im Wirt hätten.
Andere Forscher, darunter Prince und Vnek, waren der Ansicht, daß die Hepatitis-B-Antigene von dem Genom des Hepatitisvirus
B bestimmt würden. Immer mehr wurde klar, daß zur Verhinderung
von Infektionen durch dieses Virus eine aktive Immunisierung nötig sein würde, und die Forschungen konzentrierten sich deshalb
auf die Herstellung einer Vaccine.
Gegenwärtig werden Teilchen im menschlichen Serum mit einer Teilchengröße im Bereich von etwa 20 bis 25 nm als die vor-
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herrschenden Teilchen angesehen, die die Hepatitis-B-rOber'-flächenantigene
tragen. Forschungen konzentrieren sich auf die Trennung dieser Teilchen von anderen Proteinstoffen im Blut/
insbesondere von den größeren/ 42 nm großen Dane'-Teilchen, die
von vielen für das infektiöse Virion gehalten werden. Es wird angenommen, daß man, falls es gelängey das Antigen in dem erforderlichen
Ausmaß zu reinigen und die Dane-Teilchen zu entfernen, ein Material erhalten könnte, das nach der Verdünnung
mit einem physiologisch unbedenklichen Medium und sicherheitshalber weiterer Inaktivierung eine Vaccine für die aktive Immunisierung
darstellen würde. Um dies zu erreichen, wird von Blumberg in der US-PS 3 636 191 die Behandlung von Blutplasma von
HBo-Ag-Trägern mit einem Gemisch von Enzymen vorgeschlagen, die die neuen Teilchenproteine spalten sollen. Daran schließen sich
bekannte Behandlungen in der Zentrifuge zur Gewinnung des Hepatitis-B-Oberflächenantigens
auf Teilchen an, deren Größe etwa 22 nm beträgt. Blumberg und Mitarbeiter hatten erkannt, daß die
zu dem Hepatitis-B-Oberflächenantigen gehörenden 22 nm großen
Teilchen die Form eines Hohlkörpers ohne Kern hatten und gegen die bei dem Spaltverfahren verwendeten Enzyme im wesentlichen
beständig waren. Blumberg konnte so eine Vaccine mit einer
3 Dichte in der Größenordnung von 1,21 g/cm gewinnen, die nach
Blumberg - mit einem physiologisch unbedenklichen Medium verdünnt und als aktives Immunisierungsmittel verwendet werden
kann. Die nach dem Verfahren von Blumberg erhältliche Vaccine mag hinsichtlich einer Anregung der Synthese von Antikörpern
in einem Wirtskörper, wie in dem eines Menschen, wirksam sein, doch ist heute bekannt, daß derartige Antikörper nur eine be^-
grenzte Spezifität haben und keine Antikörper gegen bestimmte Antigene, z.B. dem e-Antigen, das nur auf den größeren Teilchen,
wie den Dane-Teilchen (d.h. dem Virion) vorkommen, einschließen. Die von Blumberg vorgeschlagene Vaccine bietet daher keinen
Schutz gegen hohe Virus-Dosen, denen Patienten, z.B. bei Blut·^
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transfusionen, ausgesetzt sind. (In den Figuren 1 und 2 sind
die theoretischen Grundlagen für diese Folgerung angegeben.) Zwar wäre es theoretisch möglich, sehr hohe Titer von HB-Antikörpern
zu erzeugen, doch stehen hierzu keine für den Menschen geeignete Mittel zur Verfügung. Theoretisch könnte man das
Freundsche Adjuvans zur Stimulierung der Produktion hoher
Mengen Antikörper anwenden. Dann könnten die sehr hohen Konzentrationen der HB-Antikörper sowohl das Hepatitis-B-Oberflächenantigen
als auch das mit den Virionen verbundene e-Antigen wirksam neutralisieren (siehe Fig. 2). Wegen der möglichen
Carcinogenität und anderer nachteiliger Nebenwirkungen des Freundschen und anderer bekannter Adjuvansien ist jedoch gegenwärtig
keine Methode für die Erzeugung derart hoher Titer von HB-Antikörperη im Menschen bekannt.
Es stellt sich daher die Aufgabe, eine Virushepatitis-Vaccine zur Verfügung zu stellen, die nicht nur die Produktion von
HB-Antikörpern, sondern auch die Produktion von spezifisch
gegen das Virion selbst, d.h. gegen das 42 um große Dane-Teilchen
bzw. das e-Antigen, gerichteten Antikörpern anregt und stimuliert. Bisher war die Herstellung einer derartigen Vaccine
aus gesammeltem menschlichen Blutplasma, das HB-OberfIachenantigen
enthielt, nicht möglich, weil derartiges gesammeltes Plasma einen Überschuß an e-Antikörpern enthält. Diese Antikörper
verbinden sich mit den e-Antigen enthaltenden Teilchen, was zu deren Ausfällung führt. Die das ausgefällte e-Antigen
enthaltenden Teilchen sind, wenn überhaupt, nur sehr schwierig mit herkömmlichen Methoden zu reinigen und kommen daher im
Endprodukt nicht vor.
Es stellt sich daher die Teilaufgabe, ein Verfahren zur Isolierung
des Hepatitis-B-Oberflachenantxgens zusammen mit freies,
ungebundenes und nicht gefälltes e-Antigen enthaltenden Teilchen anzugeben, dessen Endprodukt als Vaccine für die aktive
Immunisierung verwendet werden kann.
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Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe bei einer Virushepatitis-
Vaccine dadurch gelöst, daß
Ä. sie aus Antigen-Teilchen mit einer Teilchengröße im Bereich von 30 bis 50 nm besteht, die ungefällte
freie Hepatitis-B-Oberflächenantigene enthalten;
B. sie weniger als 10 Einheiten Antikörper für Hepatitis-B-Oberflächenantigene
je 1000 Einheiten Hepatitis-B-Oberflächenantigene enthält;
C. mindestens 5% der Teilchen in dem Größenbereich von 30 bis 50 nm ungefälltes e-Antigen enthalten; und
D. die Hepatitis-B-Oberflächenantigene und das e-Antigen
in einer solchen Menge vorhanden sind, daß bei der Einführung der Vaccine, deren Rest aus einem physiologisch
unbedenklichen Medium besteht, in einen Wirtskörper Antikörper erzeugt werden.
Das Verfahren zur Herstellung der Vaccine besteht darin, daß
A. Blutplasma eines chronischen Trägers des Hepatitis-B-Oberflächenantigens,
das zum Hepatitis-B-Oberflächenantigen gehörende Teilchen mit einer Größe von 16 bis
50 nm enthält, von denen mindestens einige im Größenbereich von 30 bis 50 nm liegen, und das im wesentlichen
frei von Hepatitis-B-Oberflächen- und Antikörpern ist, wobei mindestens 1% der Teilchen sich
durch die Gegenwart von freiem, ungebundenem und nicht gefälltem e-Antigen auszeichnen, gewonnen wird,
B. aus dem Plasma andere Proteinstoffe soweit entfernt werden, daß das Material weniger als 10% andere als
zu dem Hepatitis-B-Oberflächenantigen oder e-Antigen
gehörende Proteinstoffe enthält,
C. alle Viren in dem Material inaktiviert werden und
D. das Antigen enthaltende Material mit einem physiologisch unbedenklichen Medium verdünnt wird.
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Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen
angegeben.
Überraschenderweise wurde gefunden, daß einige wenige "ausgewählte"
(etwa 2%) klinisch gesunder Menschen, die Träger des Hepatitis-B-Oberflächenantigens sind, im Blut Teilchen haben,
die freies e-Antigen enthalten. Damit ist gemeint, daß ihr Blut nicht nur HBo-Ag in Hohlkörperform mit einer Teilchengröße von
etwa 22 nm (wie von Blumberg u.a. berichtet), sondern auch größere Teilchen enthält, die entweder fadenförmige Teilchen
mit einem Durchmesser von 20 bis 45 nm oder Dane-Teilchen von im allgemeinen zylindrischer Form mit einem durchschnittlichen
Durchmesser von 42 nm enthält, die neben dem herkömmlichen HBo-Ag auch e-Antigen ohne Lücke (e) enthalten.
Es wurde gefunden, daß eine Vaccine nur aus dem Blut dieser "ausgewählten" (d.h. e-Antigen-positiven, e-Antikörper-negativen)
Spendern hergestellt werden kann.
Eine wichtige Grundlage für diese Feststellung ist die Tatsache, daß die Dane-Teilchen und die größeren fadenförmigen Teilchen
e-Antigen enthalten. Diese Feststellung bildet eine rationale Basis für die in den Tabellen I und II aufgeführten Zusammenhänge.
Ferner wurde gefunden, daß das e-Antigen außer auf den größeren HBo-Ag-Teilchen im Serum auch in einer "löslichen" Form mit einem
Molekulargewicht von unter 1 Million, im allgemeinen 50 000 bis 2OO OOO, vorkommt. Das Blut solcher positiven e-Antigen-Träger
enthält natürlich auch die zum HBo-Ag gehörenden hohlkörperförmigen Teilchen mit einer Größe von etwa 22 nm, die kein
e-Antigen aufweisen (siehe Fig. 1).
Der rationale und theoretische Vorteil dieser Vaccine wird durch
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das Schema der Fig. 2 veranschaulicht. Man beachte, daß die
mäßigen HB-Antikörpertiter, die mit den bekannten Vaeeinen
mit 20 nm großen Teilchen, wie der Vaccine von Blumberg7 erhalten
werden, nur Schutz bieten, wenn die Angriffsdosis außerordentlich niedrig ist; wenn größere Mengen des HB-Virus und
der zu ihm gehörenden HBo-Ag enthaltenden Teilchen auftreten, neutralisieren diese die kleinen Mengen der HB-Antikörper, so
daß die Dane-Teilchen frei bleiben und die Leber des Wirtes infizieren können. Wenn dagegen die Bildung von e-Antikörpern
angeregt wird, können diese sich spezifisch mit den infektiösen Virionen (Dane-Teilchen) verbinden, ohne daß sie durch den
großen Überschuß an kleinen HBo-Ag-Teilchen (in der Regel 500 kleine Teilchen je 1 Dane-Teilchen) neutralisiert werden.
Die Vaccine gemäß der Erfindung zeichnet sich daher durch das Vorkommen von Teilchen im Bereich von 30 bis 5O nm, vorzugsweise
im Bereich von 35 bis 45 nm, aus. Bei diesen größeren Teilchen, die im allgemeinen mit Teilchen der Größe von 16
bis 22 nm, die ebenfalls HBo-Ag enthalten, lassen sich im allgemeinen zwei Haupttypen unterscheiden: Fadenförmige Teilchen
und die oben beschriebenen Dane-Teilchen.
Die Vaccine enthält daher beide Antigen-Spezifitäten, Proteine und Nucleinsäuren, die in der Vaccine gemäß der US-PS 3 636 191,
die nur die kleineren HBo-Ag-enthaltenden Teilchen enthält, nicht vorkommen (siehe Fig. 1). Man beachte, daß die Dane-Teilchen
sowohl einen Kern als auch einen Mantel haben, wobei der Kern DNS, DNS-Polymerase und HBcAg enthält. Der Mantel
des Dane-Teilchens enthält HBo-Ag sowie e-Antigen(e) und ähnliche Dane-spezifische Antigene. Daher muß die Gesamtvaccine
Teilchen mit einer höheren Dichte als die Teilchen der Vaccine gemäß der US-PS 3 636 191 enthalten. Die Dichte der Vaccine
3 gemäß der Erfindung liegt im Bereich von 1,23 bis 1,34 g/cm ,
vorzugsweise im Bereich von 1,24 bis 1,34 g/cm , bestimmt durch
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Zentrifugieren mit isopyknischem Dichtegefälle unter Verwendung
von Caesiumchlorid-Lösungen abgestufter Dichte.
Die Vaccine hat folgende Eigenschaften: Jede Dosis enthält
Q "IO
20 bis 50 ytlq HBoAg-Teilchen-Protein mit 10 bis 10 (vorzugs-
10 12
weise 10 bis 10 ) Dane-Teilchen, ferner eine gleiche oder größere Anzahl fadenförmiger Teilchen. Selbstverständlich enthält die Vaccine nur solche größeren (30 bis 50 nm) Teilchen, in denen das e-Antigen frei, d.h. nicht an einem entsprechenden e-Antigenkörper gebunden, ist.
weise 10 bis 10 ) Dane-Teilchen, ferner eine gleiche oder größere Anzahl fadenförmiger Teilchen. Selbstverständlich enthält die Vaccine nur solche größeren (30 bis 50 nm) Teilchen, in denen das e-Antigen frei, d.h. nicht an einem entsprechenden e-Antigenkörper gebunden, ist.
Ein besonderes Kennzeichen der Vaccine ist das Vorkommen freien e-Antigens auf Dane- oder fadenförmigen Teilchen. Die Vaccine
enthält jedoch in dem verwendeten physiologisch unbedenklichen Medium auch noch e-Antigen in löslicher Form.
Das Vorhandensein von e-Antigen kann mit Hilfe einer Anzahl von Methoden festgestellt werden; die nachstehend beschriebene
Methode reicht für die Zwecke dieser Erfindung aus:
UNEMPFINDLICHER TEST ZUR BESTIMMUNG DER GEGENWART VON FREIEM E-ANTIGEN
Die mittlere Vertiefung einer Agar-Gel-Diffusionsplatte, die
vorzugsweise, aber nicht notwendigerweise aus einer Lösung von 0,5 bis 0,7% Agarose in einer Lösung hergestellt ist, die
0,1-m NaCl, 0,01-m Tris-Puffer mit einem pH-Wert von 7,2,
0,001-m EDTA, 2,0 Gew.-Teilen/100 Vol.-Teilen Dextran 250
und 0,1 Gew.-Teil / 100 Vol.-Teilen Protaminsulfat enthält, wird mit e-Antikörperserum gefüllt, wie es beispielsweise von
der Blood Derivatives Division des New York Blood Center erhalten werden kann. Die RandVertiefungen werden entweder mit einem
Bezugs-e-Antigen (von Dr. Lars Magnius) für den Agar-Gel-
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Diffusions-"Identitätstest" oder Testserum gefüllt. Eine
Prözipitinlinie, die nach dreitägigem Bebrüten bei Raumtemperatur, 30 oder 37 0C erscheint und auf einer Reaktion mit dem Bezugsantigen beruht, zeigt die Gegenwart einer großen Menge
e-Antigen an.
Prözipitinlinie, die nach dreitägigem Bebrüten bei Raumtemperatur, 30 oder 37 0C erscheint und auf einer Reaktion mit dem Bezugsantigen beruht, zeigt die Gegenwart einer großen Menge
e-Antigen an.
Die Merkmale von HBo-Ag-Trägern in Abhängigkeit von der Gegenwart oder Abwesenheit von e-Antigen oder e-Antikörpern sind
in den Tabellen 1 und 2 aufgeführt.
in den Tabellen 1 und 2 aufgeführt.
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MERKMALE VON HBo-Ag-TRÄGERN IN ABHÄNGIGKEIT VON DER GEGENWART VON
e-ANTIGEN ODER e-ANTIKÖRPERN
O CO CO NJ
O CO OO Oi
ERGEBNISSE EINER AGAR-GEL-DIFFUSIONSPRÜFUNG
Merkmale
"e"-Ag +
'e"-Antikörper +
Anteil bei Blutspendern (symptomlosen HBo-AG-Trägerη)
1 - 5% 30 - 70%
Anteil von HBo-Ag-Trägern unter _ _ „ „
ständigen Benutzern von Dialysegeräten 5 - 20%
Patienten mit chronischer Hepatitis, festgestellt durch Leberbiopsie
bei den meisten bei sehr wenigen
Patienten mit chronischer Hepatitis, diagnostiziert aufgrund erhöhter
SGPT-Werte
bei den meisten bei sehr wenigen
Kontakt- oder spontante Infektionen bei vielen wahrscheinlich überhaupt
nicht
MERKMALE DES PLASMAS VON HBoAg-TRAGERN
IN ABHÄNGIGKEIT VON DER GEGENWART VON
e-ANTIGEN ODER e-ANTIKÖRPERN
e-ANTIGEN ODER e-ANTIKÖRPERN
MERKMALE: ERGEBNISSE EINER AGAR-GEL-DIFFUSIONSPRÜFUNG
e-Ag +
e-Antikorper +
Dane-Teilchen im Plasma 108 - 1012/ml
10
6 +
Mit HBo-Ag verbunden DNS-Polymerase im Plasma nachweisbar
nicht nachweisbar
09 OO CO
Nachweisbares HBc-Ag
im Plasma (RIA oder IAHA Tests) nachweisbar
nicht nachweisbar
HBoAg-Titer 1013 - 1014
Teilchen/ml
1012 - 1013 Teilchen/ml
Bei: der Elektronenmikroskopie nicht sichtbar
Die kritische Phase bei der Herstellung der Vaccine ist der erste Schritt, nämlich die Wahl eines als Ausgangsmaterial
geeigneten Plasmas von einem chronischen HBo-Ag-Träger, bei
dem mit Hilfe des vorstehend beschriebenen unempfindlichen
Tests e-Antigen nachweisbar ist. Ein derartiges Plasma enthält natürlich reichliche Mengen Dane-Teilchen und Fäden, die nicht
mit e-Antikörpern verbunden sind (siehe oben). Ein Plasma dieser Art kann zweckmäßigerweise von klinisch symptomlosen
menschlichen HB-Trägern oder auch von Schimpansen erhalten werden, die eine natürliche oder künstliche Infektion mit dem
HB-Virus durchgemacht haben und chronische e-Antigen-positive HBo-Ag-Träger geworden sind. Ganz allgemein ist Plasma brauchbar,
das HBo-Ag des gewünschten Untertyps oder der gewünschten Untertypen enthält. Das Ausgangsplasma muß durch die oben beschriebene
Methode nachweisbares e-Antigen und darf keine durch die oben beschriebene Methode nachweisbaren e-Antikörper enthalten.
Derartiges Plasma ist verhältnismäßig selten, für das Verfahren aber unerläßlich,
.Unter der Voraussetzung, daß Ausgangsmaterial mit den oben beschriebenen
Eigenschaften vorhanden ist, läßt sich die Isolierung der e-Antigen enthaltenden größeren Teilchenfraktionen
zusammen mit einer geringeren Menge kleinerer HBo-Ag enthaltenden Teilchen und einer nur geringen Verunreinigung durch Serumproteine
nach folgendem einfachen Verfahren ausführen:
1. Differentialfällung des Antigens mit Polyäthylenglykol und
2. Adsorption der Verunreinigungen an Hydroxylapatit unter Bedingungen,
die die Adsorption der größeren HBo-Ag enthaltenden Teilchen im Größenbereich von 24 bis 50 nm verhindern.
Das erhaltene Produkt kann leicht konzentriert, mit kleinen
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Mengen menschlichem Serumalbumin stabilisiert, in einem physiologischen
Träger suspendiert und mit Hilfe einer Kombination bekannter Virus-Inaktivierungsmethoden nichtinfektiös
gemacht werden. Von dieser Vaccine werden dann immunisierende Mengen in solchen Intervallen injiziert, daß eine ausreichende
und lang dauernde Bildung von e-Antikörpern und HB-Antikörpern hervorgerufen wird. Eine derartige Immunisierung dürfte Schutz
gegen Infektionen mit hohen und niedrigen Dosen des Hepatitisvirus B bieten. Die Erzielung eines Schutzes gegen Infektionen
durch solche niedrige und hohe Dosen mit Hilfe der bekannten Hepatitis-B-Vaccine ist, wenn überhaupt möglich, sehr schwierig.
Als Ausgangsmaterial für das nachstehend beschriebene Reinigungsverfahren
geeignetes Plasma wird mit Hilfe bekannter Plasmaphoreseverfahren aus dem Blut chronischer HBo-Ag-Träger
gewonnen. Diese können Menschen oder auch Tiere, wie Schimpansen, sein, in denen ein chronischer HB-Trägerzustand erzeugt
werden kann. Die Schimpansen bieten:-.den praktischen Vorteil,
daß sie mit menschlichen Hepatitis-B-Stämmen jeden gewünschten immunologischen Untertyps infiziert werden können und dann
chronische Infektionszustände entwickeln, die nach bisher vorliegender Erfahrung besonders hohe HBo-Ag-Titer ergeben und
häufig hohe Konzentrationen von Dane-Teilchen und e-Antigen im Plasma ergeben. Außerdem können diese Tiere in kurzen Intervallen
einer herkömmlichen Plasmapherese unterworfen werden, ohne daß sie gesundheitlich geschädigt werden oder der HBo-Ag-
oder e-Ag-Gehalt im Plasma abnimmt.
Das zur Herstellung der Vaccine als Ausgangsmaterial verwendete Sammelplasma muß folgenden Anforderungen genügen:
A. Mit einer unempfindlichen Methode wie der Agar-Gel-Diffu-
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sioxi muß e-Antigen nachweisbar sein. Es ist zu beachten,
daß bei einer Grundgesamtheit von Blutspendern nur 1 bis 5% der chronischen HBo-Ag-Träger dieser Forderung genügen.
B. Es dürfen keine e-Antikörper nachweisbar sein. Man beachte, daß die Mehrzahl einer HBo-Ag-Träger einer Grundgesamtheit
von Blutspendern e-Antikörper haben. Falls derartiges Plasma mit dem erwünschten Plasma vereinigt wird, tritt eine Ausfällung
der e-Antigen enthaltenden Teilchen ein, durch die deren Isolierung nach der beschriebenen Methode verhindert
wird.
C. Dane-Teilchen, die mit Hilfe bekannter Methoden der Elektronenmikroskopie
(negative Färbung) nachweisbar sind, sollen vorzugsweise in hoher Konzentration vorhanden sein.
D. Das HBo-AG soll hinsichtlich der Antigen-Untertypen eine Zusammensetzung
haben, die den Hauptuntertypen entspricht, die in dem geographischen Gebiet auftreten, für das die Vaccine
bestimmt ist. Beispielsweise soll in einer Vaccine, die in Südostasien verwendet werden soll, der Untertyp r vorherrschen,
während eine Vaccine, die für Europa oder die Vereinigten Staaten bestimmt ist, vorzugsweise HBo-Ag von überwiegend
dem Untertyp w enthalten soll.
E. Um eine breite immunologische Schutzwirkung zu erzielen, ist Plasma von einer so großen Zahl von Spendern zu verwenden,
daß eine repräsentative Mischung der Untertypen erhalten wird, die in dem geographischen Gebiet, für das die Vaccine
bestimmt ist, vorherrschen. In den meisten Fällen sind mindestens 10 Spender erforderlich. Die Verwendung von"Hybridstämmen",
wie HBo-Ag/adywr, bietet offensichtliche Vorteile. Solche Hybridstämme können in Schimpansen fortgepflanzt
werden.
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F. Das Ausgangsmaterial muß innerhalb von 4 Stunden nach dem Sammeln bei -7O 0C eingefroren und bis zum Einfrieren auf
einer Temperatur von 4 0C gehalten werden.
G. Das Ausgangsmaterial muß bakteriologisch steril und frei von fremden Viren sein, die nach bekannten Isolierungsmethoden
(Impfung angebrüteter Eier, Gewebekulturen, säugende Mäuse,
Meerschweinchen und Kaninchen), wie sie bei der Qualitätskontrolle
anderer Virusvaccinen üblich sind, nachgewiesen werden können.
Die Reinigung des AusgangsmateriaJs kann nach einem bereits anderweitig
(US—Patentanmeldung Ser.No. 426 825) beschriebenen Verfahren ausgeführt werden. Hierbei wird das in dem flüssigen
Blutplasma enthaltene Antigen von den Verunreinigungen abgetrennt. Dazu wird das Plasma zunächst auf einen pH-Wert im
Bereich von etwa 4,4 bis 4,7 eingestellt. Dies führt zur Ausfällung einer kleinen Menge Niederschlag, der zusammen mit
restlichen Zellen und Zelltrümmern durch Zentrifugieren mit mäßiger Drehzahl, 2.B. 20 Minuten bei 100OO U/min, entfernt
werden kann. Danach wird das Material mit 2,5 bis 4,5 Gew.-%,
vorzugsweise 3,0 bis 4,5 Gew.-%, Polyäthylenglykol gemischt.
Mit niedrigen Konzentrationen, etwa 3 bis 4%, kann man selektiv große Teilchenformen ausfällen. Sie sind daher unter bestimmten
Umständen von Vorteil. Die Gewichtsprozent-Menge des Polyäthylenglykols bezieht sich auf das Gesamtgewicht der Mischung,
Durch den Zusatz der angegebenen Polyäthylenglykol-Menge wird sowohl das Hepatitis-B-Antigenmaterial der großen
Teilchen von z.B. 3O bis 50 nm Größe als auch ein Teil des bekannten
hohlkörperförmigen Hepatitis-B-Oberflächenantigen-Materials
ausgefällt. Der Niederschlag wird abgetrennt und mit einer solchen Menge Wasser versetzt, daß ein flüssiges Zwischenprodukt
entsteht, dessen Antigen-Konzentration gleich oder
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größer als diejenige des ursprünglichen Blutplasmas ist. Das flüssige Zwischenprodukt wird auf einen pH-Wert im Bereich
von etwa 4,9 bis 5,1, optimal auf 5,0, eingestellt, wodurch ein Proteinstoffe und Polyäthylenglykol enthaltender Niederschlag
und eine flüssige Phase gebildet werden, die Hepatitis-B-Antigen enthält, das sich durch die Gegenwart von Dane-Teilchen
und/oder fadenförmigem Material auszeichnet. Die flüssige Phase wird abgetrennt und auf einen pH-Wert im Bereich
von etwa 4,4 bis 4,7 eingestellt. Bei diesem pH-Wert wird die flüssige Phase mit 3,5 bis 4,5 Gew.-% Polyäthylenglykol, bezogen
auf das Gesamtgewicht der Mischung, gemischt, wobei ein Niederschlag ausfällt, der folgende Bestandteile enthält:
A. Gereinigtes Hepatitis-B-Oberflächenantigen, das hohlkörperförmige
Teilchen mit einer Größe zwischen 20 und 30 im enthält j sowie
B. 1. fadenförmige Teilchen mit einem Durchmesser zwischen
20 und 50 nm, die HBo-Ag und e-Antigen enthalten, das
frei von e-Antikörpern ist, und
2. meist kugelförmige Dane-Teilchen mit einer Größe von 40 bis 50 nm, die einen Außenmantel aus Lipoprotein, der
HBo-Ag und e-Antigene enthält, und einen Kern haben, der DNS, DNS-Polymerasen und HBc-Ag enthält.
Das so gereinigte Antigenmaterial wird gewonnen und kann dann einer Behandlung zur Inaktivierung des Virus unterworfen werden,
Das Material ist nun fertig zur Verdünnung mit einem physiologisch unbedenklichen Medium.
Vorzugsweise wird bei der Trennung die Temperatur einer jeden Mischung nach jedem Mischvorgang und während der Bildung des
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Niederschlags im Bereich zwischen O und 8 0C gehalten. Die
Reinigung wird erleichtert, wenn die Niederschläge nach dem Fällen durch Zentrifugieren gewonnen werden. Das Polyäthylenglykol
kann als solches oder in Form einer wäßrigen Lösung verwendet werden, vorzugsweise in einer solchen, die etwa
30 Gew.-% Polyäthylenglykol enthält. Im allgemeinen empfiehlt sich die Verwendung eines Polyäthylenglykols, das ein Molekulargewicht
im Bereich von 500 bis 50000, vorzugsweise von etwa 6000, hat.
Eine weitere Reinigung der gereinigten Antigene kann durch Adsorption an Hydroxylapatit nach den Methoden der Ansatz- oder
Säulenchromatographie vorgenommen werden. Im letztgenannten Falle werden die teilgereinigten Antigene durch eine Chromatographiesäule
gegeben, die Hydroxylapatit enthält, das die Antigene adsorbiert. Die weiter gereinigten Antigene werden
dann durch eine mehrstufige, z.B. etwa dreistufige, Elution wiedergewonnen. Teilchen der Größe von 25 bis 50 nm werden getrennt
von einer Fraktion kleinerer Teilchen(16 bis 22 nm) und
der Hauptmenge der Serumproteine wiedergewonnen.
Die nach der Reinigung erhaltene Fraktion der großen Teilchen muß als infektiös angesehen werden. Mit Hilfe chemischer und
physikalischer Verfahren muß daher das gesamte Infizierungsvermögen
wirksam inaktiviert werden. Das Hepatitisvirus ist als sehr beständig bekannt. Dies ist wahrscheinlich auf die
kleine Größe seiner Nucleinsäure sowie auf andere Eigenschaften seiner tertiären und quarternären Struktur und seines
morphologischen Aufbaus zurückzuführen.
Die Inaktivierung kann durch jede Kombination der verschiedenen in der Technik der Vaccineherstellung bekannten Methoden erfol-
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gen. Durch die Anwendung von Kombinationen sollen "resistente
FraktionenI! beseitigt werden, die gegen eine einzige Inaktivierungsbehandlung
beständig sein könnten. Diese werden durch eine zweite oder dritte Behandlung inaktiviert, deren Inaktivierungsmechanismen
von demjenigen der ersten Behandlung verschieden sind. Dieses Vorgehen ist zur Vernichtung resistenter Fraktionen,
z.B. bei der Behandlung bestimmter bakterieller Infektionen, bei denen resistente Erregerformen häufig vorkommen, mit einer Kombination
verschiedener Antibiotika, gebräuchlich. Eine schematische Darstellung dieses Prinzips ist in Fig. 3 veranschaulicht.
Jede Kombination der derzeit bekannten Inaktivierungsmethoden,
die der vorstehenden Forderung genügen, kann angewendet werden. Folgende Methoden, vorzugsweise in Kombination, werden vorgeschlagen:
1. Bestrahlung mit einer Kobaltquelle von 2,5 Millionen rad?
2. Behandlung mit Formalin von einer Konzentration von 1:2OOO
während einer Dauer von 4 Tagen bei 37 0C nach den üblichen
Methoden? dabei wird die Vaccine vor dem Zusatz von Formalin (oder dem nachstehend genannten^-Propiolacton) zur Entfernung
von Aggregaten durch Filtration durch ein O,22-/^m-MiIIiporenfilter
od.dgl. geklärt?
3. Behandlung mit β -Propiolacton nach Methoden, wie sie gegenwärtig
bei der Inaktivierung von Tollwutvaccine angewendet werden.
Nach der Inaktivierung wird das Endprodukt durch ein Ämicon-Filter
PM3O od. dgl. gegen 0,9%ige Natriumchlorid-Lösung, die
Thiomerosal in einer Verdünnung von 1:1OOOO und einen gebräuchlichen
Stabilisator enthält, diafiltriertP um alle niedermole-
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kularen Verbindungen, die zur Inaktivierung verwendet oder bei
dieser entstanden sind, zu entfernen. Das Amicon-Filter PM3O ist ein Cellulosefilter mit einem durchschnittlichen Porendurchmesser,
der nominell den Durchgang von Molekülen mit einem Molekulargewicht von über 30000 ausschließt. Thiomerosal ist die
empfohlene Kurzbezeichnung für Natriumäthylquecksilberthiosalicylat, ein gebräuchliches antibakteriell wirksames Konservierungsmittel.
Das filtrierte Produkt wird sodann einer Sterilfiltration unterworfen und aseptisch in sterile Ampullen zur
Gefriertrocknung oder zum Tiefgefrieren abgefüllt.
Danach muß jeder Ansatz auf Sicherheit, d.h. auf Freiheit von
Infizierungsaktivität, geprüft werden. Solange es keine Gewebekultur-
oder andere Standardmethode zur Bestimmung der Infektaktivität des Hepatitisvirus B und ähnlicher Viren gibt, muß
jede zu menschlichem Gebrauch bestimmte Vaccine-Charge durch
Impfung HB-seronegativer empfänglicher Tiere, wie Schimpansen oder Gibbonaffen, geprüft werden. Mindestens vier seronegative
Tiere (von denen zwei mit fünf 20-,/tfg-Dosen und zwei mit 500
20-^g-Dosen intravenös geimpft werden) müssen für diesen Zweck verwendet werden. Eine einwandfreie Charge führt weder zu einer
Hepatitis noch zur Produktion von HBo-Ag oder einer HBc-Antikörperreaktion,
auf die jedes geimpfte Tier mit den derzeit empfindlichsten zur Verfügung stehenden Methoden zu untersuchen
ist. Auf diese Weise kann die Sicherheit des Produktes, d.h. das Fehlen jeglicher Infektaktivität, leicht festgestellt werden.
Natürlich wird man vor der klinischen Erprobung erster Chargen eine größere Anzahl Tiere für die Prüfung heranziehen.
Die Vaccine wird auf eine Konzentration von im allgemeinen etwa 5 bis 100^Ag, vorzugsweise 20 bis 50/tg, HBo-Ag-Protein je Dosis
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eingestellt, um ihr eine geeignete Immunisierungswirkung zu
erteilen. Im allgemeinen beträgt die Menge der e-Antigen enthaltenden Teilchen in einer solchen Dosis etwa 2 bis SJtq. Die
Potenz wird durch Bestimmung der Mindestkonzentration einer jeden Vaccinecharge kontrolliert, die bei Meerschweinchen,
Mäusen oder anderen geeigneten Versuchstieren eine bestimmte spezifische HB- und e-Antikörperreaktion hervorruft.
Die Vaccine muß eine so hohe Potenz haben, daß sie in mindestens 4 Schimpansen, die mit 2 Dosen der Standardvaccine nach
den empfohlenen Richtlinien immunisiert worden sind, bei der Prüfung durch passive Hämaglutination (standardisiert durch
Prüfung an einer Kontrollprobe aus gefrorenem Antikörperserum) einem HB-Antikörpertiter von mindestens 1:1OO ergibt. Diese
HB-Antikörper müssen mindestens 1 Jahr vom Zeitpunkt der Immunisierung dieser Schimpansen ab mit einem Titer von mehr als
1:10 nachweisbar sein. Außerdem müssen die Schimpansen eine meßbare e-Antikörperreaktion zeigen.
Verabreichung der Dosen und Anwendung der Vaccine Die Vaccine kann durch subcutane oder intramuskuläre Injektion
verabreicht werden. Zwar steht der bevorzugte Verabreichungsweg noch nicht fest, doch wird angenommen, daß die intramuskuläre
Injektion zu bevorzugen ist. Die Häufigkeit der Verabreichung beträgt etwa 2 Dosen im Abstand von einem Monat, gefolgt
von einer Auffrischungsdosis nach 6 Monaten bis zu einem Jahr nach der Erstimmunisierung. Die Höhe der Dosis hängt natürlich
von der Größe des zu impfenden Wirts ab. Die nachfolgenden Dosen und die Auffrischungsdosis hängen von dem Antikörperspiegel
im Blut nach der Erstimmunisierung ab. Zugelassene Adjuvansien, wie sie üblicherweise bei -der Vaccinehersteilung
verwendet werden, können benutzt werden.
Die Vaccine empfiehlt sich für alle Personen, die dem Risiko
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einer Infektion mit dem Hepatitisvirus B ausgesetzt sind, insbesondere
solchen Personen, die, wie Patienten und Personal
von Hämodialysegeräten, medizinisches Personal, Personen, die
sich in tropischen Gebieten aufhalten oder diese besuchen,
einem besonders hohen Risiko ausgesetzt sind. Bei der Bevölkerung tropischer und subtropischer Gebiete, wie insbesondere
Afrika, Asien, das Mittelmeergebiet und Südamerika, wo ständig ein verbreitetes Vorkommen von Häpatitis-B-Infektionen beobachtet wird, sollte die Vaccine schon in einem frühen Lebensalter verabreicht werden, um die Entstehung eines chronischen Infektionsträgerzustandes zu verhindern, der in diesen Gebieten bereits in den ersten 5 Lebensjahren vorzukommen pflegt.
von Hämodialysegeräten, medizinisches Personal, Personen, die
sich in tropischen Gebieten aufhalten oder diese besuchen,
einem besonders hohen Risiko ausgesetzt sind. Bei der Bevölkerung tropischer und subtropischer Gebiete, wie insbesondere
Afrika, Asien, das Mittelmeergebiet und Südamerika, wo ständig ein verbreitetes Vorkommen von Häpatitis-B-Infektionen beobachtet wird, sollte die Vaccine schon in einem frühen Lebensalter verabreicht werden, um die Entstehung eines chronischen Infektionsträgerzustandes zu verhindern, der in diesen Gebieten bereits in den ersten 5 Lebensjahren vorzukommen pflegt.
Wenn ausreichende Mengen Vaccine zur Verfügung stehen und ihre Wirksamkeit sich erwiesen hat, kann die Vaccine bei allen- Personen
angewendet werden, die nicht schon durch eine vorher erworbene Immunität gegen Infektionen mit dem Hepatitisvirus B
geschützt sind.
geschützt sind.
Die besondere Bedeutung der Hepatitisvirus-B-Vaccine ist in der Verhinderung eines chronischen Hepatitisvirus-B-Trägerzustandes
mit dem ständigen Risiko einer Erkrankung an einem chronischen Leberleiden, wie chronisch aktiver Hepatitis, Leberzirrhose
und primärem Lebercarcinom. Ein Zusammenhang zwischen einem
chronischen Hepatitisvirus-B-Trägerzustand und diesen Erkrankungen kann heute als erwiesen gelten, und die Rolle der durch das Hepatitisvirus B hervorgerufenen chronischen Hepatitis als Cofaktor in der Ätiologie dieser Erkrankungen steht ebenfalls
fest (Prince, A.M., in The Liver: Normal and Abnormal Funktions, herausgegeben von F.F. Becker, M.Dekker-Verlag, New York, 1965).
und primärem Lebercarcinom. Ein Zusammenhang zwischen einem
chronischen Hepatitisvirus-B-Trägerzustand und diesen Erkrankungen kann heute als erwiesen gelten, und die Rolle der durch das Hepatitisvirus B hervorgerufenen chronischen Hepatitis als Cofaktor in der Ätiologie dieser Erkrankungen steht ebenfalls
fest (Prince, A.M., in The Liver: Normal and Abnormal Funktions, herausgegeben von F.F. Becker, M.Dekker-Verlag, New York, 1965).
Die Anwendung der neuen Hepatitisvirus-B-Vaccine kann auf lange Sicht einen wesentlichen Einfluß auf die Verhütung dieser chronischen
Leberleiden haben, die in den genannten Gebieten, insbe-
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-ar-
sondere in den Tropen, wo ein chronischer Hepatitisvirus-B-Trägerzustand
fast die Regel ist, so außerordentlich häufig sind. Beispielsweise ist in Senegal, wo 14% der Bevölkerung chronische
HBo-Ag-Träger sind, die Erkrankungsrate an primärem Leberkrebs
50 bis lOOmal so hoch wie in den Vereinigten Staaten, wo nur durchschnittlich etwa O,3% der Bevölkerung chronische Träger
des Hepatitisvirus B sind.
Ausdrücklich sei darauf hingewiesen, daß die hier beschriebenen Methoden zur Reinigung der die großen Teilchen enthaltenden
Fraktionen nicht die einzigen für diesen Zweck sind. Für bestimmte Zwecke und Bedürfnisse lassen sich auch Abwandlungen
und weitere Methoden entwickeln. Worauf es bei der Erfindung ankommt, ist die Verwendung der große Teilchen und e-Antigen enthaltenden
Fraktionen, die bisher stets routinemäßig verworfen wurden, zur Herstellung einer Vaccine. Daher sind alle Vaccinen
in Erwägung zu ziehen, die solche Teilchen, lösliche spezielle Komponenten solcher Teilchen oder synthetische spezielle Untereinheiten
dieser Teilchen mit Antigenwirkung enthalten, da sie bei einer aktiven Immunisierung gegen e-Antigen oder ähnliche
für Dane-Teilchen spezifische Antigene brauchbar sind.
Fig. 1 zeigt in graphischer Darstellung die verschiedenen morphologischen
Formen, die zu dem Hepatitis-B-Oberflächenantigen gehören.
Zusammen mit dem Hepatitis-B-Oberflächenantigen kommt noch ein e-Antigen vor, das auf Dane-Teilchen zugegen ist, die
Hepatitis-B-Kernantigen (HBc-Ag) enthalten. Diese Dane-Teilchen
zeichnen sich dadurch aus, daß sie Desoxyrxbonuclexnsaure (DNS) und ihre Polymerase enthalten. In der Figur sind ferner die
möglichen Antikörper dargestellt: Antikörper gegen das Hepatitis-B-Oberflächenantigen,
gegen das Hepatitis-B-Kernantigen und gegen das e-Antigen.
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709821/0885
Fig. 2 ist eine graphische Darstellung der unterschiedlichen Wirkungen der Antikörper gegen das e-Antigen und der Antikörper
gegen das Hepatitis-B-Oberflächenantigen bei der Neutralisation
von Dane-Teilchen in Abhängigkeit von der einwirkenden Dosis. Aus dieser Darstellung ist ersichtlich, daß die von einer
HBo-Ag-Vaccine, die frei von e-Antigen ist, erzeugten Antikörper für eine völlige Neutralisation der antigenhaltigen
Stellen unzureichend sind. Die von einer Vaccine, die sich durch die Gegenwart von e-Antigen auszeichnet, erzeugten Antikörper
reichen jedoch auch bei einer hohen Dosierung des Antigens aus, um praktisch alle Antigenstellen zu neutralisieren. Dies zeigt,
daß die Gegenwart von e-Antigen in einer Vaccine erheblich das Ausmaß beeinflußt, in dem eine Neutralisierung aller Antigene
stattfindet.
Fig. 3 veranschaulicht graphisch die Tatsache, daß bei jedem gegebenen Inaktivierungsverfahren ein kleiner Teil der infektiösen
Viren gegenüber der Inaktivierung widerstandsfähig ist. Wenn jedoch verschiedene Inaktivierungsmethoden nacheinander
angewendet werden, können auch diese resistenten Fraktionen inaktiviert werden.
Fig. 4 spiegelt die Ergebnisse wider, die bei der säulenchromatographischen
Fraktionierung eines mit Polyäthylenglykol gefällten HBo-Ag-Materials in einer 500-ml-Säule aus HydroxyI-apatit
erhalten werden. Die Ergebnisse stammen von einem in 50 ml Flüssigkeit wiedersuspendierten mit Polyäthylenglykol
gefälltem HBo-Ag/e-Ag bei der Chromatographie auf einer 500 ml-Hydroxylapatit-Säule.
Das Antigen wurde mit einem diskontinuierlichen Gradienten von jeweils 1 Liter 0,02-m, 0,05-m und
0,10 m Natriumphosphat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,2 eluiert. Fraktionen von je 10 ml wurden aufgefangen und durch
Messung der optischen Dichte bei 280 nm auf Protein ( ·)
und durch CEP auf HBo-Ag (x-x-x) analysiert.
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Fig. 5 zeigt die Ergebnisse der Celluloseacetat-Elektrophorese vereinigter konzentrierter Proben von HBo-Ag/e-Ag, die durch
Chromatographie an Hydroxylapatit (Tabelle 4) gereinigt worden waren. Der Streifen wurde nach dem Anfärben mit Ponceau "τ- Rot
in einem Beckman-Mikrozonendensitometer abgetastet.
Linie A: HBo-Ag/e-Ag enthaltendes Originalplasma;
Linie B: Wiedersuspendierter Niederschlag von HBo-Ag/e-Ag
aus der Fällung mit PοIyäthylengIykol;
Linie C: Säuleneluat von HBo-Ag/e-Ag - Sammelprobe III; Linie D: Säuleneluat von HBo-Ag/e-Ag - Sammelprobe II;
Linie E: Säuleneluat von HBo-Ag/e-Ag - Sammelprobe I.
Fig. 6 ist eine graphische Darstellung der bei der Reinigung von mit Polyäthylenglykol ausgefälltem HBo-Ag-e-Ag-Material
durch Säulenchromatographie an Hydroxylapatit erzielten Ergebnisse. Eine Menge von 200 ml des wiedersuspendierten PEG-Niederschlags
aus HBo-Ag/e-Ag wurde auf eine 1000-ml-Säule aus Hydroxylapatit
aufgegeben. Das Antigen wurde mit einem diskontinuierlichen Gradienten von 0,5 1 0,02-m und einem Liter
0,05-m Natriumphosphat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,2
eluiert. Fraktionen von 12 und 13 ml wurden gesammelt und durch
Messung der optischen Dichte auf Protein analysiert.
Fig. 7 zeigt in graphischer Darstellung die Ergebnisse der Säulenchromatographie eines HBo-Ag/e-Ag-Materials an Hydroxylapatit.
Die Sammelprobe I des von dem Hydroxylapatit II (Fig.6) eluierten HBo-Ag/e-Ag wurde auf 75 ml konzentriert und erneut
auf eine 600-ml-Hydroxylapatit-Säule aufgegeben. Das Antigen
wurde mit einem diskontinuierlichen Gradienten von jeweils einem Liter 0,02-m, 0,05-m und 0,10-m Natriumphosphat-Pufferlösung
mit einem pH-Wert von 7,2 eluiert. Fraktionen von jeweils 18 ml wurden gesammelt und durch Messung der optischen
Dichte bei 280 nm auf Proteine (* ), durch CEP (x-x-x) und
RIA (o-o-o) auf HBo-Ag analysiert.
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Fig. 8 zeigt die Ergebnisse der Immunelektrophorese von HBo-Ag/ e-Ag-Fraktionen, die von Hydroxylapatit eluiert worden waren.
Die Proben wurden mit Antiserum geprüft, das durch Immunisierung von Kaninchen mit normalem Schimpansenplasma hergestellt
worden war.
Proben: (1) Sammelprobe I; (2) Sammelprobe II;
(3) Sammelprobe III;
(4) Sammelprobe IV; (5) Sammelprobe V;
(6) Sammelprobe VI;
(7) Sammelprobe VII-VIII.
Fig. 9 zeigt die Ergebnisse der Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese
gereinigter HBo-Ag/e-Ag-Präparate, die mit Coomassie-Blau angefärbt
waren. Die Proben wurden in einem 7,5%igen SDS-Acrylamid-GeI
unter den oben beschriebenen Bedingungen laufengelassen. Nach dem Anfärben der Gele mit Coomassie-blau wurden sie in
einem Joyce-Loebl-Mikrodensitometer abgetastet:
A: 20-22 nm große kugelförmige Teilchen von HBo-Ag; B: 22-28 nm große kugelförmige Teilchen von HBo-Ag;
C: HBo-Ag/e-Ag-Teilchen, die hauptsächlich aus Fäden
und Dane-Teilchen bestehen.
Fig. 10 zeigt die Ergebnisse einer Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese
von Proben aus gereinigtem HBo-Ag/e-Ag, die parallel zu der Elektrophorese gemäß Fig. 9 vorgenommen wurde. Nach dem
Anfärben mit Schiffscher Base wurden die Gele in einem Joyce-Loebl-Mikrodensitometer
abgetastet.
Fig. 11 zeigt eine Reihe elektronenmikroskopischer Aufnahmen
von HBo-Ag/e-Ag-Teilchen, die durch chargenweise Elution von Hydroxylapatit und Zonen-Ultrazentrifugieren gereinigt worden
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waren. Die Bilder wurden nach negativem Anfärben mit Phosphorwolf ramat in einem Cleatron-Mikroskop JEOL 100B bei 6700Ofacher
Vergrößerung aufgenommen.
a: Zonen-Ultrazentrifugation - Sammelprobe I:
Dane-Teilchen und große Fäden;
b: Zonen-Ultrazentrifugation - Sammelprobe II: Fäden und 22-28 nm große kugelförmige Teilchen;
c: Zonen-ültrazentrifugation - Sammelprobe III: 20-28 nm große kugelförmige Teilchen.
Die Figuren 12A und 12B sind graphische Darstellunen der Ergebnisse,
die bei der isoelektrischen Dünnschichtfokussierung vereinigter konzentrierter Proben von HBo-Ag/e-Ag in Sephadex G-75f
die in 1%igem Ampholin von pH 3-6 gelöst waren. Die Fraktionen
wurden in der oben beschriebenen Weise durch RIA ( ) auf
HBo-Ag und auf den pH-Wert (x-x-x) analysiert.
A: Sammelprobe I: 22-28 nm große kugelförmige Teilchen von HBo-Ag;
B: Sammelprobe II: 22-28 nm große kugelförmige Teilchen, Fäden und einige Dane-Teilchen.
Die Figuren 13A und 13B sind graphische Darstellungen weiterer Ergebnisse, die bei der isoelektrischen Dünnschichtfokussierung
des gleichen Materials aus vereinigten konzentrierten Proben von HBo-Ag/e-Ag (Tabelle 4) in 1 %igem Ampholin von pH 3,5
bis 10,0 nach der Behandlung mit Triton X-100 erhalten wurden.
Die Fraktionen wurden in der oben beschriebenen Weise durch RIA (· ) auf HBo-Ag und auf den pH-Wert (x-x-x) untersucht.
A: Sammelprobe I: 22-28nm große kugelförmige Teilchen; B: Sammelprobe II: 22-28 nm große kugelförmige Teilchen,
Fäden und einige Dane-Teilchen.
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5*
Anhand der folgenden Beispiele wird die Erfindung näher veranschaulicht
.
Zunächst werden die allgemeinen Maßnahmen zur Reinigung des
Hepatitis-B-Oberflächenantigens aus Human- oder Schimpansenplasma
durch Fällung mit Polyäthylenglykol (PEG) und nachfolgende
Reinigung an Hydroxylapatit beschrieben, Danach werden die Ergebnisse der Anwendung dieser Verfahrensmaßnahmen bei der
Renigung und Fraktionierung von Schimpansen-Hepatitis-B-Oberflächenantigen,
das e-Antigen aufweisende Teilchen enthält, in größerem Maßstab mitgeteilt. Die in den einzelnen Reinigungsstufen
erhaltenen Proben wurden mit Hilfe elektrophoretischer und chromatographischer Verfahren eingehend analysiert. Mit
Fraktionen verschiedener morphologischer Formen der zusammen mit dem gereinigten Schimpansen-HBo-Ag auftretenden Teilchen
wurden Vergleichsuntersuchungen durch isoelektrische Dünnschichtfokussierung und Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese ausgeführt.
BEISPIEL 1: REINIGUNG UND CHARAKTERISIERUNG DER ZUM HEPATITISVIRUS B GEHÖRENDEN TEILCHEN AUS 7,8 LITER PLASMA EINES
EINZIGEN HBoAg-TTRAGER-SCHIMPANSEN
Das Antigen wurde aus dem gesammelten Plasma eines Träger-Schimpansen
gewonnen, der zuvor mit HBo-Ag-positivem Humanplasma
vom Untertyp ADW geimpft worden war. In dem verwendeten Plasma befand sich an der Oberfläche identifizierbarer Dane-Teilchen
das e-Antigen.
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Das HBo-Ag und das e-Antigen wurden aus dem Plasma durch Fällung mit Polyäthylenglykol (PEG) isoliert. Der wiedersuspendierte
Niederschlag aus HBo-Ag und e-Antigen wurde durch Säulenchromatographie an Hydroxylapatit gereinigt. Die abschließenden
Reinigungsmaßnahmen bestanden in Zentrifugieren mit einem Dichtegefälle. Nachstehend werden diese Verfahrensmaßnahmen kurz beschrieben:
In einer Vorreinxgungsstufe wurden 7800 ml HBo-Ag und freies
e-Antigen enthaltendes Plasma auf einen pH-Wert von 4,6 eingestellt und mit einer 30%igen Lösung von PEG in destilliertem
Wasser bis zu einer Konzentration von etwa 2% versetzt. Die Flüssigkeit wurde über Nacht bei 4 °C stehengelassen und dann
durch Zentrifugieren geklärt. Das HBo-Ag in der überstehenden
Flüssigkeit wurde durch Erhöhung der PEG-Konzentration auf 4%
ausgefällt. Die nach dem Stehenlassen der Probe über Nacht bei 4 0C überstehende Flüssigkeit wurde abdekantiert und verworfen.
Das e-Antigen enthaltende Sediment von HBo-Ag wurde in 500 ml destilliertem Wasser rücksuspendiert. Die Hauptmenge des PEG
wurde zusammen mit einigen Verunreinigungen durch Einstellen der Lösung auf einen pH-Wert von 5,0 ausgefällt, und der Niederschlag
wurde durch Zentrifugieren entfernt. Die klare überstehende Flüssigkeit wurde erneut auf einen pH-Wert von 4,6 eingestellt,
und das HBo-Ag sowie die zu dem e-Antigen gehörenden Teilchen (HBo-Ag/e) wurden durch Zusatz einer 30%igen Lösung
von PEG bis zu einer Endkonzentration von 4% ausgefällt. Das HBo-Ag/e wurde nach dem Stehenlassen der Probe über Nacht bei
4 0C durch Zentrifugieren abgetrennt. Danach wurde der Niederschlag
von HBo-Ag/e erneut in 320 ml destilliertem Wasser suspendiert.
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Säulenchromatographie an Hydroxylapatit:
In einem Vorversuch wurden 50 ml der Suspension aus dem mit PEG gefällten HBo-Ag/e auf eine Hydroxylapatit-Säule von
6,5 χ 16,5 cm aufgegeben und mit einem diskontinuierlichen Gradienten von Phosphatpuffer eluiert. In einem nachfolgenden
Versuch wurden 200 ml der Probe auf eine Hydroxylapatit-Säule von 6,5 χ 35 cm teilgereinigt. Das eluierte HBo-Ag mit dem ersten
Protein-Peak wurde ein zweites Mal durch eine Hydroxylapatit-Säule gegeben.
Dichtegefälle-Zentrifugation;
Fraktionen des durch Säulenchromatographie isolierten HBo-Ag wurden durch Zonen-Ultrazentrifugieren gereinigt. Aus 3 ml
60%iger und 7 ml 40%iger Sucrose in 0,02-m Natriumphosphat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,2 (die 0,02% NaN3 enthielt)
wurde ein diskontinuierlicher Gradient gebildet. In jedes Röhrchen wurde eine 20-ml-Probe gefüllt und in einer Spinco-Zentrifuge
SW 25.1 18Stunden bei 18000 U/min zentrifugiert. Aus dem Unterteil der Röhrchen abtropfende Flüssigkeit wurde in Fraktionen
von 1 ml gesammelt und auf HBo-Ag analysiert. Die Peak-Fraktionen mit Antigenwirkung wurden vereinigt, gründlich
dialysiert und durch Ultrafiltration unter Verwendung einer Membran mit einer Sperre bei einem Molekulargewicht von 30000
(Amicon PM-30) konzentriert. Die konzentrierten HBo-Ag-Fraktionen wurden anschließend einer Endreinigung durch isopyknisches
Banding in einem linearen CsCl-Gradienten und Zonen-Ultrazentrifugation
in einem kontinuierlichen Sucrose-Gradienten unter den normalerweise angewendeten Bedingungen unterworfen.
Untersuchungsmethoden:
Der Gehalt an HBo-Ag wurde durch Gegenelektrophorese (CEP) oder
den Radioimmunversuch (Ausria I oder II, Abbot Laboratories) in fester Phase verfolgt. Die Proteinkonzentration wurde durch
Messung der optischen Dichte bei 280 nm und durch Bestimmung
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des Stickstoffs nach einem Mikro-Kjehldahl-Verfahren abgeschätzt.
Die Methoden waren die gleichen, wie sie in der schon erwähnten US-Patentanmeldung Serial No. 426 825 beschrieben
sind.
Kriterien der HBo-Ag-Reinheit:
Nach jeder Reinigungsstufe wurden die Proben durch Celluloseacetat-Elektrophorese,
Immunelektrophorese und Agar-Gel-Diffusionstests gegen polyvalentes Antinormalhumanplasmaprotein-Antiserum
analysiert.
Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese:
Aliquote Teile der Proben, die 0,01-m Natriumphosphat-Pufferlösung
mit einem pH-Wert von 7,2, 1% Natriumdodecylsulfat,
1 % β-Mercaptoäthanol und 10% Glycerin enthielten, wurden
2 Minuten in einem siedenden Wasserbad erhitzt, auf 7,5- oder 10%ige Natriumdodecylsulfat-Acrylamid-Gele aufgetragen und einer
Elektrophorese nach Maizel unterworfen. Die Proteine im Gel wurden mit Coomassie-Biau, die Kohlenhydrate mit Schiffscher
Base nach der Methode von Glossman und Neville angefärbt.
Die Ergebnisse der Reinigung der HBo-Ag/e-positiven Seren durch die Fällung mit Polyäthylenglykol sind in Tabelle III aufgeführt.
Anscheinend wurden 87% des ursprünglichen Plasmaproteins bei der ersten Fällung des HBo-Ag (zu der auch die Vorreinigung
mit einer 2%igen PEG-Konzentration gehörte) entfernt. Das
nach zwei aufeinanderfolgenden Fällungen mit PEG erhaltene Endpräparat zeigte eine quantitative Gewinnung des HBo-Ag mit
nur 4% der ursprünglichen Proteine.
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REINIGUNG VON VEREINIGTEM SCHIMPANSEN-HBo-Ag
DURCH FÄLLUNG MIT PEG 6000
OO w CO I
| ?ROBE | VOLUMEN (ml). |
HBo-Ag 1 CEP-TITER |
GESAMT PROTEIN (g) |
%AUSBEUTE2 HBo-Ag |
FACHE3 REINIGUNG |
| Jrsprüngliches HBO-AG-Plasma | 7800 | 512 | 429,0 | 100 | |
| Srster 4%-PEG Niederschlag | 500 | 7080 | 55,0 | 89 | 6,9 |
| Zweiter 4%-PEG-Niederschlag | 320 | 10000 | 16,6 | 80 | 20,7 |
Kjehldahl
2' * £ HBo^AgJ Probe xr Volumen
Plasmax Volumen
χ
3 fcProteinJ Plasma % Ausbeute HBo-Ag CProteinJ Probe 1OO
Sb
Bei einem Vorversuch wurden 50 ml der Suspension aus dem rücksuspendierten,
mit PEG gefällten HBo-Ag durch Säulenchromatographie an Hydroxylapatit fraktioniert. Die Ergebnisse der
chromatographischen Trennung sind in Fig. 4 wiedergegeben. Das Eluat wurde in 7 Fraktionen getrennt, die gegen eine 0,02-m
Natriumphosphat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,2 (die 0,02% Natriumazid enthielt) dialysiert und durch Ultrafiltration
konzentriert. Die konzentrierten Proben wurden durch Messung der optischen Dichte bei 280 nm auf Proteine und durch
Gegenelektrophorese auf HBo-Ag analysiert. Die Ergebnisse der Fraktionierung sind in Tabelle 4 zusammengestellt.
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HYDROXYLAPATIT-CHROMATOGRAPHIE I REINIGUNG DES ZWEITEN 4%-PEG-NIEDERSCHLAGS VON HBo-Ag
PROBE
VOLUMEN (ml)
HBO-Ag CEP-TITER
GESAMT-1 %AUSBEUTE'
PROTEIN (mg) HBo-Ag
PROTEIN (mg) HBo-Ag
FACHE
REINIGUNG
REINIGUNG
| 1 | Zweiter 4%-PEG-Niederr. ._ schlag von HBo-Ag |
I | "50 | 1O.000 | 2.600,0 | 100 | O |
| 2 | Ottapatit I: Sammelprobe |
II | 4 | 10.000 | 63,2 | B | 3,3 |
| 3 | Sammelprobe | III | 6 | 1O.000 | 87,2 | 12 | 3,6 |
| 4 | Sammelprobe | IV | 5 | 10.000 | 183,9 | 10 | 1,4 |
| 5 | Sammelprobe | V | 6 | 800 | 110,0 | 1 | 0,2 |
| 6 | Sammelprobe | VI | 6 | 800 | 72,6 | 1 | 0,3 |
| 7 | Sammelprobe | VII | 10 | 20.000 | 984,0 | 40 | 1,1 |
| 8 | Sammelprobe | 7 | 10.000 | 338,3 | 14 | 1,1 |
# 1 Kjehldahl 0,1%
#s 2-8 O.D. 280 nm E1 = 1,143
I Olli
^HBo-AgJ Probe χ Volumen
£HBo-Agj Plasma χ Volumen
£HBo-Agj Plasma χ Volumen
χ 100
QproteinJ Plasma %
^Protein} Probe
χ -
Ausbeute HBo-Ag 100 ro
CD
IS
Die Celluloseacetat-Elektrophorese (Fig. 5) zeigte im Vergleich
zu dem ursprünglichen Plasma (Fig. 5A) zwei Proteinbande in den Fraktionen I (Fig. 5E) und Fraktion II (Fig. 5D),
die zwischen den Bereichen Alpha., , Alpha,, sowie den Fibrinogen-
und Beta-Globulin-Bereichen wanderten. Die Fraktion III (Fig.5C)
zeigte zwei zusätzliche Komponenten im Bereich des Beta-Globulins
und Albumins. Der suspendierte PEG-Niederschlag von
HBo-Ag (bei 24facher Konzentration) zeigte kräftige Linien zwischen
den Bereichen Alpha, und Alpha2 sowie dem Ursprung (Fibrinogen)
und zwei zusätzliche Bande in dem Bereich des Albumins und Gamma-Globulins (Fig. 5B).
Wie in Fig. 4 angegeben, wurde das HBo-Ag in drei Antigen-Peaks zerlegt. Die Untersuchung der Proben mit Hilfe der Elektronenmikroskopie
ergab hauptsächlich kugelförmige Teilchen von 22 bis 28 nm Durchmesser im ersten Peak (Fraktion I) und Teilchen
verschiedener Größe, darunter Dane-Teilchen und große Fäden, im zweiten Peak (Fraktion II). Der dritte Antigen-Peak (Fraktion
VI) enthielt hauptsächlich 16 bis 22 nm große kugelförmige Teilchen.
Weitere 200 ml der Suspension aus dem resuspendierten PEG-Niederschlag
des HBo-Ag wurde auf einer 1000-ml-Hydroxylapatit-Säule
fraktioniert. Die Ergebnisse der chromatographischen Trennung
sind in Fig. 6 wiedergegeben. Die HBo-Ag-Fraktionen des ersten Protein-Peaks (Sammelprobe I: Fraktionen 38 bis 83) und das Resteluat
(Sammelprobe II: Fraktionen 84-110) wurden jeweils vereinigt
und durch Ultrafiltration auf 75 ml konzentriert.
Die konzentrierte Sammelprobe I aus der vorstehend beschriebenen Trennung wurde erneut auf einer 1000-ml-Hydroxylapatit-Säule
chromatographiert. Die Ergebnisse dieser chromatographi-
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sehen Trennung sind in Fig. 7 dargestellt. Das Eluat wurde zu
8 Fraktionen gemäß der Figur vereinigt. Die vereinigten Proben wurden durch Ultrafiltration konzentriert und mit 0,02-m
Natriumphosphat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,2 (die 0,02% Natriumazid enthielt) gewaschen. Dann wurden die Proben
auf Proteine und HBo-Ag analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 zusammengestellt.
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HYDROXYLAPATIT-CHROMATOGRAPHIE III REINIGUNG DER SAMMELPROBEN AUS DER HYDROXYLAPATIT-CHROMATOGRAPHIE II
| PROBE | VOLUMEN (ml) |
I | 75 | HBo-Ag CEP-TITER |
GESAMT PROTEIN (mq) |
%AUSBEUTE2 HBo-Ag |
FACHE3 REINIGUNG |
| O Hydroxylapatit II: Sammelprobe |
• • I |
5 | 1O.000 | 706,0 | 100 | ___ | |
| O Hydroxylapatit III Sammelprobe |
II | 5 | 8.000 | 51 ,8 | 5,3 | 0,12 | |
| Sammelprobe | III | 4 | 2.000 | 14,2 | 1,3 | 0,65 | |
| Sammelprobe | IV | 4 | 1 .600 | 11,4 | 0,9 | 0,56 | |
| Sammelprobe | V | 12 | 3.200 | 7,3 | 1,7 | 1,64 | |
| Sammelprobe | VI | 7 | 16.000 | 181,6 | 25,6 | 1 ,00 | |
| Sammelprobe | VII | 45 | 8.000 | 79,6 | 7,5 | 0,61 | |
| Sammelprobe | 4.000 | 332,8 | 24,0 | 0,51 |
O.D.28O nm
= 3,16
CHBo-AgJ Probe χ Volumen v 1nn
-""- *-" Plasma χ Volumen
ÜProteinJ Hydroxylapatit-Sammelprobe I „ % Ausbeute HBo-Ag
CProteinJ Probe
CT) CD
Eine Analyse der Proben auf Verunreinigungen durch Immunelektrophorese
(Fig. 8) zeigte eine sehr schwache Präzipitinlinie bei der Fraktion I, eine stärkere Linie bei den Fraktionen II
bis VI und eine sehr breite Linie bei den vereinigten Fraktionen VII und VIII. Alle wanderten zwischen dem Alpha-- und
Albumin-Bereich.
Die Elektronenmikroskopie der Proben ergab bei den Fraktionen I bis III hauptsächlich kugelförmige Teilchen von 22-28 nm
Durchmesser, bei den Fraktionen IV bis VI kugelförmige Teilchen und Fäden und bei den Fraktionen VII und VIII meist kleine kugelförmige
Teilchen.
Die konzentrierten Proben dieser Reinigungsstufe wurden einer vollständigen Reinigung durch dichte Gradienten-Zentrifugation
unter den im Abschnitt "Methoden" beschriebenen Bedingungen unterworfen.
Die gereinigten HBo-Ag-Präparate bestanden hauptsächlich aus 20-22 nm großen kugelförmigen Teilchen, 22-28 nm großen kugelförmigen
Teilchen, Fäden verschiedener Größe sowie Dane-Teilchen, wobei jedes Präparat 100,/^-g Protein enthielt, dessen Polypeptid-Zusammensetzung
durch Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese untersucht
wurde (Fig. 9). Bei den Protein-Peaks der einzelnen Proben konnten anscheinend quantitative Unterschiede beobachtet werden.
Weitere Unterschiede wurden bei dem Peak 5 gefunden, der bei dem Präparat mit 20-22 nm großen Teilchen nur eine kleine Schulter
zeigte (Fig. 9A), die bei dem Präparat mit 22-28 nm großen Teilchen (Fig. 9B) und der hauptsächlich Fäden und Dane-Teilchen
(Fig. 9C) ausgeprägt war. Aliquote Teile der 20-22 nm (Fig. 10A) und 22-28nm große kugelförmige Teilchen (Fig. 10B)
enthaltende Präparate wurden parallel zu den vorstehend beschriebenen Untersuchungen durch Anfärben mit Schiffscher Base
auf Kohlenhydrate geprüft. Es ist ersichtlich, daß die Peaks
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und Pg Kohlenhydrate enthalten.
Die niedermolekularen Kohlenhydrate der Peaks (rechts in Fig.10)
sind wahrscheinlich Glycolipide, da sie sich mit Coomassie-Blau
nicht anfärben lassen. Die ungefähren Molekulargewichte der Polypeptide sind in Tabelle 6 aufgeführt.
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MOLEKULARGEWICHT (X 1O3) DER POLYPEPTIDE
DER HBo-Ag/e-TEILCHEN UNTERTYP: adwx
Peak-Nuinmer
Schimpansen-HBo-Ag/e
| P1 23-24 |
P2 26-27 |
P3 | P4 44-45 |
P5 55 |
68-69
P7
103-105
P8
P9
108-110 1115-118
Aus den die großen Teilchen enthaltenden Fraktionen wurde eine Vaccine hergestellt, indem 0,5 mg/ml Humanserum-Albumin zugesetzt
und anschließend eine Inaktivierung durch Kobaltbestrahlung (mit 2,5 Millionen rad), Inaktivierung mit Formalin nach
herkömmlichen Methoden (96 h bei 37 0C, Konzentrationen 1:2000)
und Behandlung mit Beta-Propiolacton nach den bei der Herstellung
von Tollwut-Vaccine gebräuchlichen Verfahren ausgeführt
wurde.
BEISPIEL 2: MODIFIZIERTES, VERBESSERTES PEG-VERFAHREN ZUR
ISOLIERUNG VON HBo-Ag/e
Ein modifiziertes Verfahren zur PEG-Fällung wurde auf 2,6 Liter
vereinigtes Plasma angewandt, das von einem einzigen Träger-Schimpansen stammte und HBo-Ag sowie e-Antigen in ungebundener,
nicht gefällter Form enthielt. Das Plasma wurde auf einen pH-Wert von ungefähr 4,6 eingestellt und unmittelbar danach mit
einer 30%igen Lösung von PEG bis zu einer Endkonzentration von 2% versetzt. Die Flüssigkeit wurde auf Eis 30 Minuten abgekühlt
(statt sie wie bei dem Verfahren des Beispiels 1 über Nacht bei 4 0C stehenzulassen),und der Niederschlag wurde durch Zentrifugieren
entfernt.
Die das HBo-Ag enthaltende überstehende Flüssigkeit wurde durch Zusatz von 6,6 Teilen einer 30%igen PEG-Lösung je 100 Teile
Flüssigkeit bei Raumtemperatur auf eine PEG—Konzentration von
4% (statt auf 4,5% wie im Beispiel 1) gebracht. Die Suspension wurde erneut 30 Minuten auf Eis gekühlt, und das ausgefällte
HBo-Ag/e wurde durch Zentrifugieren abgetrennt. Der Niederschlag wurde erneut in 200 ml destilliertem Wasser suspendiert.
Die Hauptmenge des PEG und einige begleitende Verunreinigungen wurden durch Einstellung des pH-Wertes auf 5,0, 30 Minuten
Abkühlen der Flüssigkeit auf Eis und Abtrennen des ausgefallenen Niederschlages durch Zentrifugieren entfernt. Der pH-Wert der
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klaren überstehenden Flüssigkeit wurde erneut auf 4,6 eingestellt,
und 30%iges PEG wurde bis zu einer Endkonzentration von 3% (statt 4,0 bis 4,5% wie im Beispiel 1) zugesetzt. Das
Material wurde erneut 30 Minuten auf Eis abgekühlt, und der aus HBo-Ag/e bestehende Niederschlag wurde durch Zentrifugieren
abgetrennt.
Der das HBo-Ag/e enthaltende Niederschlag wurde erneut in 100 ml
destilliertem Wasser gelöst. Die Hauptmenge des PEG wurde wiederum durch Einstellen des pH-Wertes auf 5,0 ausgefällt. Nach
Stehenlassen über Nacht bei 4 0C wurde die Suspension durch
Zentrifugieren geklärt. Die das HBo-Ag/e enthaltende klare überstehende Flüssigkeit wurde mit einer 0,5-m Natriumphosphat-Pufferlösung
mit einem pH-Wert von 7,2 bis zu einer Endkonzentration von 0,02-m versetzt, und die Flüssigkeit wurde mit
destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 120 ml gebracht.
Die in Tabelle 7 zusammengestellten Ergebnisse dieser Reinigung zeigen, daß dadurch eine über 33fache Reinigung des HBo-Ag
(gegenüber einer 24fachen Reinigung bei dem Verfahren des Beispiels 1) erreicht werden konnte.
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TABELLE 7
REINIGUNG DES HBo-Äg DURCH FÄLLUNG MIT PEG 6000
VOLUMEN HBO-Ag GESAMT- %AUSBEUTE FACHE „
(ml) 1/CEP- PROTEIN HBo-Ag2 REINIGUNG
TITER (g) 1
Ursprüngliches Plasma Erste 4%-PEG-Fällung
2 Zweite 3%-PEG-Fällung
co
00 ' 1
—*■ LO
I
OO
| 2600 | 80 | 130 | ,0 | 100 | ,0 | O | ,0 |
| 1200 | 160 | 22 | ,8 | 92 | ,3 | 5 | ,3 |
| 120 | 1600 | 3 | ,6 | 92 | ,3 | 33 | ,3 |
Kjehldahl
σ ' 2 EHBo-Ag:? Probe χ Volumen . ^JJ $
CHBo-Ag-j plasma χ Volumen ι
3 £ProteinJ Plasma χ % Ausbeute HBo-Ag
jTProteinJ Probe 10O
jTProteinJ Probe 10O
Zu dem besseren Ergebnis des Verfahrens gemäß Beispiel 2 tragen folgende Faktoren bei:
1. Das Abkühlen der Flüssigkeiten 30 Minuten auf Eis statt des
Stehens über Nacht verkürzt die Reinigung auf einen Arbeitstag, während bei dem Verfahren des Beispiels 1 mehrere Tage
nötig sind.
2. Die Verkürzung der Abkühlzeit führt zu einer spezifischeren Fällung des HBo-Ag/e und zu einer geringeren Verunreinigung
durch Plasmaproteine.
3. Durch die Verringerung des Volumens der Probe nach der ersten Fällung des ABo-Ag/e können in den nachfolgenden Stufen kleinere
Mengen PEG für die selektive Fällung verwendet werden, und es kann eine zweite Fällung bei einem pH-Wert von 5,0
zur Entfernung der Hauptmenge des PEG aus der Probe vorgenommen werden.
Aus dem Produkt wird Vaccine durch Zusatz von Albumin und anschließende
Inaktivierung in der gleichen Weise hergestellt, wie in Beispiel 1 beschrieben.
BEISPIEL 3; FRAKTIONIERUNG VON HBo-Ag/e DURCH CHARGENWEISB
BEHANDLUNG MIT HYDROXYLAPATIT
Der wiedersuspendierte Niederschlag von Hbo-Ag/e aus der PEG-Fällung
(Beispiel 2) wurde chargenweise mit Hydroxylapatit statt nach dem Verfahren der Säulenchromatographie behandelt.
Eine Menge von 500 ml Füllkörper-Hydroxylapatit wurde in 8OO ml
einer 0,02~m Natriumphosphat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von -7,2 suspendiert, und die Suspension wurde nach Zusatz des
oben beschriebenen HBo-Ag/e-Präparates 30 Minuten bei Raumtemperatur mit einem Magnetrührer gerührt. Die Aufschlämmung wurde
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in zwei gleiche aliquote Teile geteilt, die in 1-1-Bechern
10 Minuten bei 4000 U/min in einer Sorvall-Zentrifuge RC-3 geschleudert
wurden. Die überstehende Flüssigkeit wurde abdekantiert und das Sediment nacheinander mit jeweils 1 Liter
0,02-m und 0,05-m Natriumphosphat-Pufferlösung mit einem pH-Wert
von 7,2 gewaschen. Die Eluate wurden vereinigt, durch Ultrafiltration unter Verwendung einer Membran PM-30 konzentriert,
mit 0,02-m Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7,2, die 0,02% NaN3 enthielt, diafiltriert und mit der gleichen
Pufferlösung auf ein Volumen von 60 ml eingestellt.
Die konzentrierte Probe wurde weiter durch Zonen-Ultrazentrifugation
in einem diskontinuierlichen Sucrosegradienten gereinigt.
Die abgetrennten HBo-Ag/e-Teilchen wurden zu drei Fraktionen
vereinigt, dialysiert und durch Ultrafiltration in der oben beschriebenen Weise konzentriert. Eine Untersuchung der Proben
mit Hilfe der Elektronenmikroskopie ergäbe hauptsächlich große Fäden und Dane-Teilchen in der Fraktion I (Fig. 11a), Fäden,
Dane-Teilchen und 22-28 nm große kugelförmige Teilchen in der Fraktion II (Fig. 11b) und 20-28 nm große kugelförmige Teilchen
in der Fraktion III (Fig. 11c).
Die chargenweise Behandlung des rücksuspendierten PEG-Niederschlags
von HBo-Ag/e hat gegenüber dem zuvor beschriebenen Verfahren der Säulenchromatographie den Vorteil, daß die Fraktionierung
an einem Tag ausgeführt werden kann, während bei der Säulenchromatograpie zur Eluierung 5 Tage erforderlich sind.
Aus dem Produkt wird Vaccine durch Zusatz von Albumin und Inaktivierung
in der gleichen Weise hergestellt, wie im Beispiel 1 beschrieben.
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BEISPIEL 4: DESAGGREGATION DER HBo-Ag/e-TEILCHEN MIT IONENAKTIVEN
UND NICHTIONOGENEN TENSIDEN
HBo-Ag/e-Teilchen wurden bei Raumtemperatur (5 Minuten bis
2 Stunden) mit folgenden Tensiden behandelt: 0,5- bis 2%ige Lösungen von Nonidet NP-40 (einem grenzflächenaktiven Produkt
der Shell Oil Co.), 0,5- bis 2%igen Lösungen von Tween 80 (grenzflächenaktives Mittel), 5- bis 10%igen Lösungen von
Triton X-100 (grenzflächenaktives Mittel), 0,1- bis 1,0%igen
Lösungen von Natriumdodecylsulfat usw. Dadurch sollten folgende
Ziele erreicht werden: 1. Potenzierung der Antigenaktivität in
den mit den Tensiden behandelten Proben und 2. Inaktivierung des Infizierungsvermögens der Proben.
Die optimalen Behandlungsbedingungen wurden anhand von Analysen der Proben vor und nach der Tensidbehandlung mit Hilfe der isoelektrischen
Dunnschichtfokussierung bestimmt. Die einzelnen Komponenten der desaggregierten Proben können mit Hilfe verschiedener
Methoden isoliert werden, beispielsweise durch Molekularexklusion, Adsorption, Ionenaustausch, Chromatographie, Ultrazentrifugation,
verschiedene Elektrophorese-Methoden usw. Eine dieser hochwirksamen Methoden ist die nachstehend beschriebene
isoelektrische Fokussierung mit Zonenkonvektion.
Aus dem Cellulose-Gel Sephadex G-75 (Pharmacia, Uppsala, Schweden)
in einer 1%igen Ampholin-Lösung mit einem pH-Wert von 4,0-6,0
oder 3,5 bis 10,0 wurden nach der Methode von Radola dünne Trägerschichten hergestellt. Die Versuche mit diesen Platten
wurden in einem LKB-MuItiporenapparat ausgeführt. Prints of
Whatmann-Chromatographiepapier 3MM wurden längs der Linie der getrennten Proben unterteilt und in 0,5 bis 1 cm breite Zonen
geschnitten. Die einzelnen Zonen wurden wiederum in kleinere Teile zerschnitten, mit 0,2 ml gepufferter Kochsalzlösung angefeuchtet
und mit 0,2 ml normalem Humanserum (frei von HBo-Ag
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und HB-Antikörpern) eluiert. Ein aliquoter Teil von 200/^1 eines
jeden Eluats wurde für den Radioimmunversuch verwendet. Die
Streifen zwischen den getrennten Proben wurden ebenfalls zerschnitten und mit 0,4 ml entgastem destilliertem Wasser eluiert;
dieses Eluat wurde zu pH-Messungen verwendet. Soweit zwei Prints aufgenommen wurden, wurde ein Print zum Anfärben
des Proteins und der andere für den HBo-Ag-Radioimmunversuch sowie die pH-Messungen verwendet. Ein aliquoter Teil einer jeden
Probe wurde vor dem Auftragen auf das Gel mindestens 20 Minuten bei Raumtemperatur mit einer 5- bis 10%igen Lösung eines
nichtionogenen Tensids (Triton X-100) behandelt und zusammen
mit einer unbehandelten Vergleichsprobe unter den oben beschriebenen Bedingungen dem Versuch unterworfen.
Isoelektrische Fokussierung mit Zonenkonvektion
Nach den von Valmet (US-PS 3 616 456) angegebenen Grundsätzen wurde ein Gerät aus Lucit gebaut. Es bestand aus 32 Kammern mit
einem Gesamtvolumen von 50 ml. Bestimmte Modifikationen führten zu Verbesserungen. Der Trog wurde mit 50 ml einer Lösung gefüllt,
die 1% Ampholin (LKB) des gewünschten pH-Bereichs und 10% Glycerin enthielt« Die Lösung in den Kammern 4, 5 und 6
(von der Anode aus gezählt) wurde durch 1,5, 3,0 oder 4,5 ml der Probe ersetzt, die 1% Ampholin und 10% Glycerin enthielt.
Die Elektrofokussierung wurde 4 Tage bei 4 0C mit einer Spannung
von 1000 bis 1500 V ausgeführt. Nach Abnahme des Deckels
wurden die Fraktionen aus den einzelnen Kammern herausgenommen, durch Zentrifugieren geklärt und durch Messung der optischen
Dichte bei 280 nm auf Proteine, durch RIA auf HBo-Ag und auf den pH-Wert untersucht.
Analyse der mit Triton X-100 behandelten HBo-Ag/e-Präparate
Unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen wurden Fraktionen der durch Säulenchromatographie an Hydroxylapatit(Fig.4)
isolierten HBo-Ag/e-Teilchen mit Hilfe der isoelektrischen
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Dünnschichtfokussierung analysiert. Ein Präparat, das hauptsächlich
aus 22-28 nm großen kugelförmigen Teilchen (Fig.12A)
bestand, und ein heterogenes Gemisch, das hauptsächlich aus größeren Teilchen (Fäden, Dane-Teilchen) (Fig. 12B) bestand,
ergaben eine verhältnismäßig geringe Heterogenität bei den Oberflächenladungen der Teilchen. Ein Hauptpeak der Antigenaktivität
wurde bei einem pH-Wert von 4,8 gefunden, und zwei kleinere Aktivitätspeaks wurden bei pH-Werten im Bereich von
4,0 bis 4,1 sowie 4,4 bis 4,6 beobachtet. Die mit Titron X-100 behandelten Proben zeigten bei planimetrischer Auswertung eine
zweifache Verstärkung der Antigenaktivität (Fig. 13). Bei anderen Versuchen schwankte die Verstärkung der Aktivität zwischen
2- und 8fach. Abgesehen von einer geringen Antigen-Restaktivität in dem ursprünglichen niedrigen pH-Bereich (pH 4,1-5,0),
wurden die Hauptpeaks der Antigenaktivität in einem höheren pH-Bereich von 5,3 und 5,8 bis 5,9, ein kleinerer Peak auch
bei pH 7,1 bis 7,2 gefunden. Eine Aktivität des e-Antigens wurde nur in dem pH-Bereich 5,6 bis 7,4 beobachtet. Dieses Antigen
wurde in dem Bereich durch den unempfindlichen Agar-Gel-Diffusionstest
nachgewiesen. Die Menge des e-Antigens in diesem Bereich ist als offensichtlich hoch. Der Peak beim Radioimmunversuch
in diesem Bereich könnte daher gut eine Verunreinigung der bei der Ausria-Methode (Abbott Laboratories) verwendeten
mit J-125 markierten"HBo-Antikörper" durch eine sehr kleine
Menge e-Antikörper darstellen.
Eine Desaggregation der HBo-Ag/e durch das nichtionogene Tensid Triton X-100 führt also zu einer Potenzierung der Antigenaktivität.
Dies hat bei der Herstellung von Antigenmaterial für die aktive Immunisierung einen offensichtlichen Vorteil.
Ein weiterer Vorteil der durch das Tensid hervorgerufenen Desaggregation ist der Umstand, daß dies zu einer physikalischen
Dissoziation der HB-Teilchen führt. Wenn überhaupt, so bleiben
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bei der Behandlung mit Triton X-1OO unter den beschriebenen
Bedingungen nur wenige Teilchen intakt. Schon dies allein ist ein wichtiger Schritt bei der Inaktivierung des Infizierungsvermögens.
Darüber hinaus kann, falls gewünscht, diese Maßnahme mit anderen Behandlungen, wie der Fällung mit HBc-Antikörpern
und/oder der Behandlung mit Desoxyribonuclease, kombiniert
werden, um alles zu dem Hepatitisvirus B gehörendes genetisches Material aus der Vaccine zu entfernen. Dies kann
sich wegen der (theoretischen) Möglichkeit einer Oncogenität als wünschenswert erweisen.
Dieser Versuch zeigt daher eine Methode zur Reinigung von e-Antigen
von den zu dem HBo-Ag/e gehörenden Teilchen durch eine Kombination einer Dissoziation durch Triton X-1OO und der isoelektrischen
Fokussierung mit Zonenkonvektion auf. Nachdem jetzt Geräte zur Ausführung dieser Methode im Mehrliter-Maßstab
zur Verfügung stehen (Roche Institute), eignet sich die beschriebene
Methode zur Herstellung einer e-Antigen enthaltenden Vaccine, die im wesentlichen frei von herkömmlichen HBo-Ag ist.
Wie vorstehend dargelegt, bietet eine derartige Vaccine offenkundige Vorteile.
Die fertige Vaccine wird aus der mit Tensid behandelten Fraktion durch Zusatz von Albumin und Inaktivierung nach der im
Beispiel 1 beschriebenen Weise hergestellt.
BEISPIEL 5: REINIGUNG VON LÖSLICHEM e-ANTIGEN AUS DEM PLASMA
CHRONISCHER HBo-Ag/e-TRÄGER ZUR VERWENDUNG ALS VACCINE
Wie vorstehend angegeben (siehe Fig. 2), enthält HBo-Ag/epositives
Plasma auch e-Antigen in löslicher Form (d.h. nicht in Verbindung mit Teilchen und mit einem Molekulargewicht von
unter 1 Million). Tatsächlich dominiert diese Form in vielen derartigen Plasmen, so daß diese eine ideale e-Antigenquelle
für die Immunisierung darstellen.
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Die Eigenschaften des löslichen e-Antigens sind von Magnius, Ohori und den Erfindern in vorläufiger Weise wie folgt bestimmt
worden: Dichte (CsCl) 1,28 bis 1,29 g/cm ; S0.- TT
/u, w
= 11,6;. Molekulargewicht 150.000 bis 900.000; isoelektrischer
Punkt 5,5 bis 6,6; Elution von Diäthylaminoäthylcellulose bei 0,15-m NaCl.
Auf der Grundlage dieser und anderer Eigenschaften wurde folgendes
Reinigungsverfahren entwickelt:
1. HBo-Ag/e enthaltendes Plasma wird zunächst mit PEG 6000
fraktioniert gefällt, wodurch die zu dem HBo-Ag gehörenden Teilchen und einige Serumproteine entfernt werden. Die Fällung
wird bei einer PEG-6000-Konzentration von 5 bis 9 Gew.-%,
vorzugsweise 8 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Mischung, bei einem pH-Wert von 7,0 und 20 0C ausgeführt.
Daran schließt sich die Fällung des e-Antigens und einiger Plasmaproteine mit PEG bei einer Konzentration von 9 bis 13%
an. Einzelheiten der fraktionierten Fällung, z.B. der pH-Wert, die Temperatur, die PEG-Konzentration usw. können geändert
werden; auch die Fällung bei einem pH-Wert von 5,0
zur Entfernung des PEG kann angewendet werden.
2. Der bei der Fällung mit PEG erhaltene Niederschlag wird in
destilliertem Wasser oder einer geeigneten Pufferlösung
(1/10 des ursprünglichen Volumens) rücksuspendiert und einer . isoelektrischen Fokussierung in 10%igem Glycerin, das 1 bis
2% Ampholyte des pH-Bereichs von 3,5 bis 10,0 enthält, unterworfen
.
3. Das Material des e-Ag-Peaks wird vereinigt, auf einem Amicon-Filter
PM 30 gegen eine 0,05-m Phosphatpufferlösung, die 0,01-m Triton X-100 enthält und einen pH-Wert von 7,6 hat,
diafiltriert und einer Säule aus Diäthylaminoäthylcellulose
- 50 -
70 9 821/088 8
aufgegeben, die mit dem gleichen Puffer äquilibriert
worden ist. Die Elution wird mit einem linearen Gradienten
von 0,0 bis 0,5-m NaCl in der gleichen Pufferlösung ausgeführt. Das e-Antigen wird bei etwa 0,15-m NaCl in hohem
Reinheitszustand eluiert. '
4. Nach Konzentrierung durch Diafiltration wie zuvor werden
die restlichen Verunreinigungen entfernt, falls gewünscht durch Zonen-Ultrazentrifugation in einem 10- bis 30%igen
Sucrose- oder äquivalenten Dichtegradienten, wobei das Material
des Peaks-11,6 s gewonnen wird.
5. Gereinigtes e-Antigen wird durch Zusatz von Humanserum-Albumin
bis zu einer Konzentration von etwa 0,5 mg/ml stabilisiert.
Die Konzentration und Natur des kolloidalen Stabilisators ist natürlich nicht kritisch.
Derartige Präparate können mit einer Konzentration von etwa 20/ g je Dosis anstelle der Teilchen enthaltenden HBo-Ag/e-Vaccine
verwendet und den beschriebenen Inaktivierung^- und
Sterilisierungsbehandlungen unterworfen werden.
- 51 -
70982-170-888
Claims (18)
- AnsprücheA. sie aus Antigen-Teilchen mit einer Teilchengröße im Bereich von 30 bis 50 nm besteht, die ungefällte freie Hepatitis-B-Oberflächenantigene enthalten;B. sie weniger als 10 Einheiten Antikörper für Hepatitis-B-Oberf lächenantigene je 1000 Einheiten Hepatitis-B-Oberflächenantigene enthält;C. mindestens 5% der Teilchen im dem Größenbereich von bis 50 nm ungefälltes e-Antigen enthalten; undD. die Hepatitis-B-Oberflächenantigene und das e-Antigen in einer solchen Menge vorhanden sind, daß bei der Einführung der Vaccine, deren Rest aus einem physiologisch unbedenklichen Medium besteht, in einen Wirtskörper Antikörper erzeugt werden.
- 2. Vaccine nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens 1,0% der Teilchen in dem Größenbereich von 30 bis50 nm Desoxyribonucleinsäure (DNS) enthalten.
- 3. Vaccine nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Teilchen in dem Größenbereich von 30 bis 50 nm ausa) fadenförmigen Proteinteilchen von länglicher Form mit einem Durchmesser von 20 bis 50 nm oderb) Dane-Teilchen mit einer Teilchengröße zwischen 40 und nm bestehen.
- 4. Vaccine nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Gemisch aus den fadenförmigen Proteinteilchen und den Dane-Teilchen enthält.30 032 - 52 -U/Be709821/0886
- 5. Vaccine nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie lösliches, freies und nicht gefälltes e-Antigen mit einer Dichte von 1,27-1,29 g/cm und einem Molekulargewicht von 50 000 bis 900 000 in einem physiologisch unbedenklichen Medium enthält.
- 6. Vaccine nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Hepatitis-B-Oberflächenantigene kugelförmige Teilchen mit einer Größe von 25 bis 50 nm enthalten.
- 7. Vaccine nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Teilchen DNS und Hepatitis-B-Kernantigen enthalten.
- Vaccine nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie bei der Differentialzählung mit dem Elektronenmikroskop 1,0 bis 25% Dane-Teilchen enthält.
- 9. Vaccine nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie bei der Differentialzählung mit dem Elektronenmikroskop 1,0 bis 50% fadenförmige Proteinteilchen enthält.
- 10. Vaccine nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Dichte von 1,23 bis 1,34 g/cm3 hat.
- 11. Vaccine nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß in ihr bei der Prüfung nach der Agar-Gel-Diffusionsmethode freies, ungefälltes und ungebundenes e-Antigen feststellbar ist,
- 12. Verfahren zur Herstellung der Vaccine nach Anspruch 1f da*- durch gekennzeichnet, daßA. Blutplasma eines chronischen Trägers des Hepatitis-B-Oberflächenantigens, das zum Hepatitis^B-Oberflächenantigen gehörende Teilchen mit einer Größe von 16 bis- 53 -709821/088050 nm enthält, von denen mindestens einige im Größenbereich von 30 bis 50 nm liegen, und das im wesentlichen frei von Hepatitis-B-Oberflächen- und Antikörpern ist, wobei mindestens 1% der Teilchen sich durch die Gegenwart von freiem, ungebundenem und nicht gefälltem e-Antigen auszeichnen, gewonnen wird,B. aus dem Plsma andere Proteinstoffe soweit entfernt werden, daß das Material weniger als 10% andere als zu dem Hepatitis-B-Oberflächenantigen oder e-Antigen gehörende Proteinstoffe enthält,C. alle Viren in dem Material inaktiviert werden undD das Antigen enthaltende Material mit einem physiologisch unbedenklichen Medium verdünnt wird.
- 13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß bei dem Verfahrensschritt B das Blutplasma auf einen pH-Wert im Bereich von 4,4-4,7 eingestellt, bei diesem pH-Wert zum Ausfällen eines Hepatitis-B-Antigen enthaltenden Hepatitis-B-Oberflächen- und e-Antigen enthaltenden Niederschlags mit etwa" 3,0-4,5 Gew.-% Polyäthylenglykol, bezogen auf das Gesamtgewicht der Mischung, gemischt, der Niederschlag abgetrennt, mit soviel Wasser versetzt, daß das freie Zwischenprodukt die gleiche oder eine höhere Konzentration an Hepatitis-B-Antigen als das ursprüngliche Blutserum hat, das Zwischenprodukt auf einen pH-Wert im Bereich von 4,9-5,1 eingestellt wird und dadurch die nicht zu dem Hepatitis-B-Antigen gehörenden Proteinstoffe sowie Polyäthylenglykol ausgefällt werden, die die Hepatitis-B- und e-Antigen-Teilchen enthaltende flüssige Phase abgetrennt, auf einen pH-Wert im Bereich von 4,4-4,7 eingestellt und zur Ausfällung eines Niederschlags, der gereinigtes Hepatitis-B-Oberflächen- und e-Antigen enthält, mit etwa 3,0 bis 4,5 Gew.-% Polyäthylenglykol, bezogen auf das Gesamtgewicht der Mischung, gemischt und der das gereinigte- 54 -709821/0888Hepatitis-B-Oberflachen- und e-Antigen enthaltende niederschlag, der fadenförmige Protein- und Dane-Teilchen enthält, die ihrerseits nicht gefälltes, ungebundenes, freies e-Antigen enthalten, gewonnen wird.
- 14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß eine infektiöse Restaktivität der Vaccine durch Behandlung der Vaccine mit mindestens drei Inaktivierungsmitteln mit verschiedenen Inaktivierungsmechanismen beseitigt wird.
- 15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Vaccine zur Beseitigung der infektiösen Restaktivität mit Röntgenstrahlen bestrahlt und/oder mit Formalin und/oderβ-Propiolacton behandelt wird.
- 16. Vaccine nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie bei der Anwendung bei Schimpansen nach einem vorschriftsmäßigen Immunisierungsplan einen Hepatitis-B-Antikörpertiter von mindestens 1:100 bei dem Hämagglutinationstest und eine nachweisbare e-Antikörper-Reaktion ergibt und daß die Hepatitis-B-Antikörper ein Jahr mit einem Titer von mindestens 1:10 nachweisbar bleiben.
- 17. Vaccine nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie in einem physiologisch unbedenklichen Medium e-Antigen in einer solchen Menge enthält, daß sie bei der Einführung in einen Wirtskörper die Bildung entsprechender Antikörper bewirkt.
- 18. Vaccine nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß sie im wesentlichen frei von Teilchen mit einer Größe von über 16 nm ist.709821/0888
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