DE2658170C2

DE2658170C2 - Arzneimittel auf der Basis von Human-Gammaglobulinen zur Behandlung der durch den Hepatitisvirus B ausgelösten akuten oder chronischen Infektionen

Info

Publication number: DE2658170C2
Application number: DE2658170A
Authority: DE
Inventors: Christian Bron Trepo
Original assignee: Institut Merieux SA
Current assignee: Institut Merieux SA
Priority date: 1975-12-23
Filing date: 1976-12-22
Publication date: 1985-05-15
Also published as: DE2658170A1; ATA958876A; FR2336141B1; GB1569000A; US4087519A; NL7614367A; JPS5290620A; AT360643B; JPS6053009B2; CA1090701A; BE849615A; FR2336141A1

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Arzneimittel auf der Basis von Human-Gammaglobulinen in einem physiologisch verträglichen Milieu, das die Behandlung der akuten oder chronischen Infektionen, die durch den Hepatitisvirus B (der auch als Virus HB oder Virus B bezeichnet wird) verursacht werden, ermöglicht.

In der FR-PS 20 70 112 wird vorgeschlagen, ein offenbar für den Virus B-Hepatitis spezifisches, als Australia-Antigen bezeichnetes, gereinigtes und eventuell abgeschwächtes Antigen zur Herstellung einer Vakzine gegen die Virus B-Hepatitis zu verwenden.

Das Australia-Antigen stellt jedoch nicht den Hepatitisvirus B selbst dar. Der Hauptteil der Blutspender, die asymptomatische Träger des Australia-Antigens sind, weisen entweder nur wenig oder keinen in ihrem Serum zirkulierenden Virus auf.

Es ist aber bekannt, daß das Serum von zahlreichen Personen, die Träger des Australia-Antigens sind, ein anderes Antigen enthält, das als Antigen-e — abgekürzt Ag-e — bezeichnet wird (LO. Magnius und Äke Espmark, Acta path, microbiol. Scarid., Section B, 80, Seiten 335 bis 337 (1972)).

Es handelt sich um einen Antigenkomplex, der eine Gemeinschaft von löslichen Proteinen darstellt (die mit ei, e2 ... bezeichnet werden), die normalerweise im menschlichen Serum abwesend sind, jedoch im Serum von manchen Trägern des Australia-Antigens wiedergefunden werden, insbesondere solchen, die an der chronischen Hepatitis erkrankt sind, und auch noch bei Personen, die der Hämodialyse oder der Immunosuppression unterworfen worden sind, sowie bei an Mongolismus leidenden Menschen. Diese verschiedenen Antigen-Determinanten sind immunologisch vom Australia-Antigen deutlich unterschieden.

Im folgenden werden mit Antikörpern-Anti-e solche Antikörper bezeichnet, die mit den Proteinen, welche das Antigen-e bilden, reagieren. Diese Antikörper können im Serum von Personen gefunden werden, die mit dem Virus B verseucht sind, insbesondere im Serum von chronischen Trägern des Australia-Antigens, die nicht an Hepatitis-Erkrankungen leiden.

Es wurde gefunden, daß es durch Verfolgung von Antigen-e möglich ist eine Immunreaktion auszulösen, welche die Bildung von Antikörpern-Anti-e zur Folge

. hat

Es wurde gefunden, daß es durch Verab.olgung von Antikörpern-Anti-e bei Patienten, die an einer akuten oder chronischen Virus B-Infektion leiden, möglich ist die Symptome und die histnlogisehen Schäden der Hepatitis zum Verschwinden zu bringen.

Wie weiter gefunden wurde, ist es durch den Zusatz von Antikörpern-Anti-e zu biologischen Flüssigkeiten, welche Antigene-e und bzw. der Viren B enthalten, möglich, die Infektiosität dieser Flüssigkeiten zum Verschwinden zu bringen oder sie zumindest weitgehendst zu reduzieren.

Gegenwärtig existiert keine aktive Behandlungsmöglichkeit für die akute Hepatitis und kein therapeutisches Mittel, das imstande wäre, vornehmlich ihre zum plötzlichen Tod führende Verschlechterung oder ihre chronische Fortentwicklung zur Zirrhose zu verhindern.
Das gleiche ist der Fall bei chronischen Infektionen durch latente oder nicht-latente Viren HB (chronische Hepatitis, Periarteritis nodosa. Virus HB-Giomerulonephritis).

Die bei dieser zweiten Gruppe von Krankheiten verwendeten entzündungshemmenden Medikamente (Co

ticosteroide) und Immunosuppressiva üben nur insofern eine günstige Wirkung aus, als sie die Entzündungsreaktion abschwächen, aber sie sind ohne Einwirkung auf die virale Infektion, die für die Krankheit verantwortlich ist, ja sie fördern im Gegenteil die Fortdauer.

Zwar ist aus Helwig, Moderne Arzneimittel, Stuttgart, 1974 (Nachtrag) Seiten 236—237 die Verwendung eines unspezifischen Präparats aus Human-Gammaglobulin. das unter anderem zur Propylaxe der Serumhepatitis eingesetzt werden soil, bekannt. Dieses Präparat ist selbst dann, wenn es zufällig Anti-e-rtntikörper enthalten sollte, nicht gegen Hepatitis-B wirksam, weil es eine Anti-Au-Aktivität (Seite 237) aufweist.

Aus Gastroent. 1974, Seite A - 98/752 und Lancet 1973, Seite 1347 ist bekannt, daß bei Antikörpern Anti-HB (die den Australia-Anti-Antigenen entsprechen) keine therapeutischen Wirkungen nachweisbar sind. Insbesondere zeigt die Literaturstelle Lancet, daß es sich um Australia-Anti-Antigene handelt, nachdem das auf Seite 1348, rechte Spalte genannte HB Ag Teilchen von 20 nm Durchmesser aufweist, was typisch für Anti-Au-aktive Antikörper ist. Demgegenüber hat das Anti-e-Antigen ganz andere Eigenschaften. Somit behandelt auch die Literaturstelle Gastroent lediglich die Verwendung von Antikörpern Anti-Au zur Behandlung der akuten Hepatitis-B. Gemäß dieser Literatairstelle gibt es keine Anhaltspunkte dafür, aufgrund einer Hepatitis-B Gammaglobuline zu verabreichen, die Antikörper des Hepatitis-B-Virus enthalten, da letztere weder günstige noch

nachteilige Wirkungen ausüben. Die gleichen Schlußfolgerungen werden in der Literaturstelle Lancet bezüglich der chronischen Hepatitis gezogen.

Bei Patienten mit erhöhtem Titer von Antigen-Au ist der Antigengehalt nicht in merklicher Weise vermindert Bei Patienten mit schwachem Gehalt an zirkulierendem Antigen-Au wird eine vorübergehende Verminderung dieser Antigene beobachtet, nachdem die letzte Auffrischung erfolg* ist. In der Literaturstelle Lancet deutet nichts darauf hin, daß eine Behandlung mit den Antikörpern-Anti-Au eine Bekämpfung der chronischen Hepatitis ermöglicht. Vielmehr zeigt der erneute Anstieg des Antigengehalts am 9. Tag, daß in diesen Fällen oder aber bei vermindertem Antigengehalt das Virus keineswegs verschwunden ist

Es war somit überraschend, daß eine Behandlung mit Antikörpern-Anti-e wirksam ist, weil die bekannten Behandlungen insbesondere gemäß den genannten Literaturstellen mit Antikörpern Anti-Au nicht zum Behandlungserfolg geführt haben und keine gezielte Wirkung gegen akute oder chronische Hepatitis B nachweisbar war. Insbesondere schlugen bisher alle Versuche fehl« beim Menschen oder Schimpansen Plasma zu injizieren, das Antikörper-Anti-HBs enthält, die gegen ein Oberflächenantigen des Hepatitisvirus B gerichtet sind (ein Antigen, das Ag HBs genannt wicr^), in der Hoffnung, eine Hepatitis oder eine chronische Virämie zu bessern. Die Transfusion von Plasma, die nach Maßgabe ihres hohen Gehalts an Antikörpern-Anti-HBs ausgewählt sind, ist offensichtlich ohne therapeutische Wirkung geblieben unter de,. Bedingungen, unter denen man sie anwenden kann (vgl. Reed und M^:*arbeiter, Lancet, 2, Seite 1347 (1973), C. G. Trepo The American Journal of the Medical Sciences, 270,248 (1975) -nd »Treatment of Fulminant hepatitis with hepatitis B immune globulin: a cooperative study«. Gastroenterology, 66, A 98—752 (1974).

Das erfindungsgemäße Arzneimittel auf der Basis von Human-Gammaglobulinen in einem physiologisch verträglichen Milieu ist dadurch gekennzeichnet, daß es eine Gammaglobulinfraktion aufweist, die Antikörper-Anti-e enthält und aus dem Serum oder Blutplasma oder Plazentaextrakten. die einen Gehalt an Antikörpern-Anti-e aufweisen, gewonnen worden ist

Die ^-Globulinfraktionen, die von einem Organismus als Reaktion auf die Verabfolgung eines Antigens gebildet werden, die Antikörper-Anti-e enthalten, können nach den klassischen Methoden der Herstellung von /-Globulinen aus Seren, Plasmas oder Plazentaextrakten gewonnen werden, in denen man vorher das Vorhandensein von Antikörpern-Anti-e entdeckt hat (vgl. z.B. J.A.C.S, 68, 459 (1949); J.A.C.S., 71, 541 (1949); J.A.C.S., 78, 1356 (1956): Acta Medica Scandinavia, Vol. CLV 65 (1956) und Vox Sang., 7. 414 (1962)). Die Antikörper-Anti-e können entweder bei den Personen gefunden werden, die spontan diese Antikörper entwickelt haben, oder bei den freiwilligen Versuchspersonen, die mit einem gereinigten und jedes Infektionsrisiko ausschließenden Antigen-e-Präparat immunisiert worden sind und ais immunologische Antwort Antikörper-Anti-e gebildet haben. Man kann das Vorhandensein von Antikörpern-Anti-e mit einem Reagens, das Antigen-e enthält, durch Immundiffusion oder durch Elektro-immunodiffusion oder jede andere klassische serologische Arbeitstechnik (radio-immunologische Dosierung etc.) entdecken.

Um die Bildung von Antikörpern-Anti-e durch eine immunologische Reaktion zu provozieren oder um das Vorhandensein der Antikörper zu entdecken, ist es zweckmäßig, partiell oder völlig gereinigte Antigen-e-Präparate vorzusehen, die z. B. durch Affinitätschromatographie auf einem Immuno-Adsorbens enthalten wurden, das aus einem Träger aus einem Dorösen Material besteht, dessen Oberfläche mit einem Oberzug von Partikeln des Antikörpers-Anti-e ausgekleidet ist, die an den Träger durch Vermittlung eines Kupplungsmittels gebunden sind.

ίο Der Träger kann z. B. aus Sepharose und das Kupplungsmittel z. B. aus einem Halogencyan bestehen. Man kann insbesondere einen Träger aus Sepharose 4 B benutzen, und als Kupplungsmittel dient vorzugsweise Bromcyan.

Selbstverständlich kann man auch andere poröse Träger, von denen bekannt ist, daß sie für Immuno-Adsorptionsprozesse brauchbar sind, verwenden zusammen mit gleichfalls bekannten Kupplungsmitteln, die aus bifunktionellen Derivaten, z. B. Dialdehyden, bestehen.

Die gereinigten, das Antigen-e enthaltenden Fraktionen können ebenfalls nach einem Verfahren gewonnen werden, das zumindest eine der nachstehenden Stufen umfaßt, und zwar ggf. in Kombination mit der Stufe der Immuno-Adsorption:

Gelfiltration;

Ultrafiltration mittels einer Membran, deren Porendurchmesser so bemessen sind, daß die Moleküle mit einem Molekulargewicht von über 30 000 zurückgehalten werden;

präparative Zonen-UItrazentrifugierung, die z. B. in einem Zuckergradienten durchgeführt wird.

Vornehmlich kann man ein Verfahren anwenden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine Säule, welche die Sepharose — an die Antikörper-Anti-e gekoppelt — enthält, mit einem Boratpuffer bei pH 8,4 equilibnert, man in die Säule eine Lösung, welche das Antigen-e in dem gleichen Puffer enthält, gibt und diese eine solche Zeit lang, die ausreicht, um eine maximale Adsorption zu begünstigen, in Kontakt läßt und man dann das Antigen-e mit einem Phosphatpuffer vom pH etwa 10,8 bis 103eluiert.
Man sammelt danach die Fraktionen, welche das Antigen-e enthalten, wobei die Anwesenheit von Antigene-Proteinen z. B. durch Messen der optischen Dichte bei 280 nm bestimm: wird.

Darauf bringt man die gereinigten Fraktionen des Antigen-e durch Zusatz von Salzsäure auf einen physiologischen pH-Wert und konzenir crt dann gewünschtenfalls diese Fraktionen durch Ultrafiltration, und die Anwesenheit des Ag-e wird durch Immunodiffusion bestätigt.

Die Fraktion, die das Antigen-e enthält, kann auch durch Zonen-Ultrazentrifugieren in einem Zuckergradienten gewonnen werden. Hierzu wird das defibrinierte Ausgangsserum oder -plasma auf das 2- bis 1Ofache, vorzugsweise das 5fache, konzentriert, beispielsweise durch Fällung der Proteine mittels Polyäthylenglykol und Wiederauflösung in einer gepufferten wäßrigen Lösung. Die so erhaltene Lösung wird auf die Oberfläche von Zentrifugenröhrchen, die einen linearen Zuckergradienten von 10 bis 27% enthalten, aufgegeben und einer präparativen Zonen-Zentrifugierung bei 19 000 bis 22 000 Umdrehungen pro Minute und 4 bis 8°C 18 bis 25 Stunden lang unterworfen.Aian sammelt dann die Fraktionen vom Boden des Röhrchens und vereinigt die Fraktionen, welche das Antigen-e enthalten. Diese Ul-

trazentrifugation kann wiederholt werden, um eine noch größere Reinigung zu erzielen, und sie wird durch eine Gelfiltration ergänzt. Man kann danach die vereinigten Ag-e-Fraktionen gegen einen Phosphatpuffer dialysieren. Gewünschtenfalls kann man danach mittels einer Ultrafiltration unter Verwendung eines Filters weiter konzentrieren, das mit einer Membran versehen ist, deren Porendurchmesser so bemessen sind, daß sie die Produkte mit einem Molekulargewicht von über 30 000 zurückhalten.

Die erhaltene Lösung kann Menschen auf subkutanem Wege oder intramuskulär verabfolgt werden, nachdem man sie vorsichtshalber einer Behandlung unterworfen hat mit dem Ziel, eine eventuelle restliche Infektiosität mittels konventioneller Verfahrensweisen, wie is dem Erhitzen oder der Formalisierung oder der Bestrahlung mit ultravioletten Strahlen oder jeder anderen Strahlenart auszuschalten. Man erhält so eine physiologisch akzeptable Antigen-e-Fraktion.

Um bei den freiwilligen Versuchspersonen eine Antikörper-Antwort zu provozieren, kann die physiologisch akzeptable Antigen-e-Fraktion entweder für sich aHein oder in kombination mit einem Adjuvans, 2. B. Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat oder irgendeinem anderen natürlichen oder synthetischen Adjuvans, verabfolgt werden.

Das Ausgangsprodukt für die Herstellung der gereinigten Fraktion, die das Antigen-e enthält, ist eine aus dem Serum oder dem defibrinierten Plasma stammende Lösung, die mit dem Antikörper-Anti-e eint Fällungsreaktion gibt Die Veranschaulichung und Isolierung des Antikörpers-Anti-e kann in diesem Fall in der Weise erfolgen, wie es nachstehend angegeben ist

Das Antigen-e findet sich vorübergehend im Blut von Kranken, die von der akuten Hepatitis B befallen sind, und in persistenter Form im Blut von zahlreichen Patienten, die der Hämodialyse unterworfen werden oder an der chronischen Hepatitis B leiden, und einer schwankenden Menge anderer Träger des asymptomatischen Australia-Antigens, insbesondere bei gewissen wilden Volkerstämmen oder in bestimmten geographischen Regionen (Asien).

Zur Herstellung einer gereinigten A.itigen-e-Fraktion verwendet man also das Serum oder Plasma dieser Spender, eventuell durch Plasmapherese im voraus abgenommen.

Um oie Anwesenheit des Aniigeris-e festzustellen, kann man einem Tier ein gereinigtes Antigen-e-Präparat. wie es oben beschrieben ist, in Kombination mit dem kompletten Freund Adjuvans oder irgendeinem anderen Adjuvans mindestens einmal, vorzugsweise jedoch mehrmals verabfolgen, beispielsweise durch Injektion ungefähr alle Monate wiederholt, z. B. drei Monate lang. Man verabfolgt jedesmal die Kombination gereinigtes Antigen-e/Freund-Adjuvans. Auf diese Weise provoziert man bei dem Tier die Bildung des Antikörpers-Anii-e.

Man nimmt dann das Blut dej Tiers zum Teil oder in seiner Gesamtheit ab und sammelt das Serum. Man überzeugt sich davon, daß das Serum normale menschliehe Antiprotein-Antikörper nicht enthält.

Bei der Immunodiffusion ergibt das durch das erhaltene Serum gebildete Reagens eine Fällungslinie mit einem Serum menschlichen Ursprungs, wenn dieses das Antigen-e enthält.

Wenn das getestete Humanserum eine Fällungslir;ie mit dem Reagens ergibt, dann ist die Person infiziert und wahrscheinlich von einer persistenten Hepatitis befal

Der wiederholte und nach dieser Methode erbrachte Nachweis des Vorhandenseins von Antigen-e während der akuten Phase einer Hepatitis und vor allem die Persistenz des Antigen-e spricht dann dafür, daß die Gefahr der Weiterentwicklung zu einer chronischen Hepatitis gewachsen ist

Man kann auf diese Weise die infizierten, eine Anstekkungsgefahr bildenden Personen entdecken und im übrigen frühzeitig und auf einfache Art der Weiterentwicklung zu einer chronischen Hepatitis erkennen.

Der Antikörper-Anti-e, der dazu bestimmt ist, das Vorhandensein des Antigens-e offenbar zu machen, kann von einem menschlichen oder einem tierischen Lebewesen stammen. Zur Reinigung des Antigens-e, das für die Herstellung einer Vakzine für den Menschen in Aussicht genommen ist, verwendet man vorzugsweise einen Träger, der mit einem Antikörper-Anti-e menschlichen Ursprungs gekoppelt ist.

Der Nachweis des Antikörpers-Anti-e wird dann gzmäß Magnius und Espmark ode. nit Hilfe irgendeiner anderen serologischen Methode erbracht

Der Antikörper-Anti-e kann z. B. durch Zonen-Zentrifugieren eines Serums, in dem vorher das Vorhandensein dieses Antikörpers festgestellt worden ist, erhalten werfen, oder vorzugsweise nach den klassischen Methoden der Gewinnung von /-Globulinen, wozu auf die oben zitierte Literatur verwiesen wird. Man kann die bekannten Arbeitsmethoden der Fraktionierung mit Äthanol, Ammoniumsulfat und bzw. oder Rivanol anwenden. Man kann z. B. den Antikörper durch Zusatz einer Lösung von Ammoniumsuifat, die zu 40% gesättigt ist, fällen, die Fällung wieder lösen und sie einer Dialyse unterwerfen, um das Ammoniumsulfat zu eliminieren.

Das erfindungsgemäße Arzneimittel ist im allgemeinen eine gereinigte Antikörper-Anti-e-Fraktion, wobei die besagte Fraktion von allen anderen normalen Blutprotein-Bestandteilen (die keine /-Globuline sind) und von allen infektiösen Verunreinigungen befreH worden ist.

Aber das erfindungsgemäße Arzneimittel kann gleichermaßen aus dem gesamten Plasma oder dem gesamten Serum, in dem man das Vorhandensein dieses Antikörpers festgestellt hat, bestehen.

Die /-Globuline, welche die Antikörper-Anti-e enthalten, die als Wirkstoffe in dem erfindungsgemäßen Arzneimittel verwendbar sind, können ferner in bekannter Weise zu intravenös verabfolgbaren /-Globulinen umgewandelt werden.

Diese Behandlungen bestehen darin, die Antikomplementwirkung der /-Globuline zu unterdrücken oder zu reduzieren, eine Antikomplementwirkung, die durch die Anwesenheit von ^ggregaten zustande kommt, weich, das Komplement zu fixieren vermögen, wie es der Antigen-Antikörper-Komplex macht. Es sind verschiedene Verfahrensweisen bekannt, die es ermöglichen, /-Globuline zu gewinnen, die intravenös injiziert werden können. Diese Verfahrensweisen bestehen z. B. darin, die /^Globuline einer Inkubation bei pH 4 oder einer enzymatischen Digestion durch Pepsin oder Plasmin zu unterwerfen.

Das erfindüngsgemäße Arzneimittel kann, vornehmlich während der akuten Hepatitis oder Virus B-Infektion verabfolgt werden, um deren Heilung zu beschleunigen und jeder Gefahr einer Weiterentwicklung zu einer chronischen Erkrankung vorzubeugen.

Das Arzneimittel wird intramuskulär oder intravenös injiziert.

Die Behandlung mit den Anti-e-/-Globulinen kann als solche allein oder gemeinschaftlich mit mannigfaltigen antiallergischen, antiinflammatorischen oder anderen Medikationen durchgeführt werden. Je nach den biologischen und serologischen Ergebnissen wird eine oder werden mehrere Injektionen nacheinander verabreicht.

Das erfindungsgemäße Arzneimittel kann auch im Verlaufe der verschiedenen Hepatitisformen und aller chronischen Virus B-Infektionen verabfolgt werden. •Diese Erkrankungen werden nach den üblichen klinischen, biologischen, histologischen und serologischen Methoden, insbesondere anhand des Nachweises des Ag-HBs, diagnostiziert.

Diese krankhaften Zustände sind im übrigen serologisch durch das Fehlen einer genügenden Antikörper-Anti-e-Reaktion und sogar am häufigsten durch eine Persistenz des Ag-e gekennzeichnet.

Die aktiven chronischen Hepatitis-Erkrankungen steilen hierunter die schwerste Form dar und müssen auf das energischste mit den Antikörpern-Anti-e behandelt werden.

Die Verabfolgung der Antikörper-Anti-e muß zwangsläufig bei den chronischen Formen der Erkrankungen länger fortgesetzt werden, und manchmal wird der Rückgriff auf die intravenöse Verabfolgung erforderlich sein und man wird an Stelle der zur intravenösen Injektion geeigneten /-Globuline ein Plasma, das die Antikörper-Anti-e enthält, verwenden können. In dem Fall, in dem ein Antigen-e in beträchtlicher Menge im Blut kreist, kann mai so vorgehen, daß man eine vorherige Eliminierung dieses zirkulierenden Antigens-e vermittels einer vorangehenden Blutaustauschtransfusion oder eine forclaufende Plasmaphorese durchführt, in deren Verlauf das Plasma, welches das Ag-e enthält, durch ein Isogruppenplasma ersetzt wird, das von Ag-e und dem Australia-Antigen befreit ist, oder es wird das Ag-e auf einem zweckenis~rechendcv! Filter zurückschalten das ζ. B. aus einem porösen Träger, an den Antikörper-Anti-e gekoppelt sind, besteht.

Am Schluß der Behandlung wird man eine Plasmafraktion des Kranken durch ein Plasma ersetzen, das reich an Antikörpern-Anti-e ist, oder irgendeine andere Lösung von menschlichem Protein (Albumin ...) oder irgendeine andere Lösung, die /-Globuline-Anti-e, die für eine intravenöse Verabfolgung behandelt worden sind, enthält. Durch die Verabfolgung von antiallergischen und antiinflammatorischen Medikamenten (Corticosteroide, Antihistamine etc.) unterbindet man jede unangenehme Reaktion während dieser Behandlung, die im Falle des Versagens wiederholt und außerdem vor allem durch eine behandlung mit /-Globulinen-Anti-e komplettiert werden kann.

Diese Therapie kann mit unterstützenden Begleitbehandlungen aller Art, chemotherapeutischen und immunotherapeutischen Mitteln verbunden werden.

Die Indikation für die Behandlung der chronischen Hepatitis-Erkrankungen mit den Antikörpern-Anti-e in irgendeiner ihrer Formen, sei es durch intravenöse oder intramuskuläre Verabfolgung, mit oder ohne Blutaustauschtransfusion, isoliert oder mit anderen Behandlungen wird letztlich durch das Ergebnis einer klinischen und immunobiologischen Generaluntersuchung des Erkrankten bestimmt

Das Vorhandensein des Virus HB und seiner Partikel und assoziierten Antigene (Australie-Ag, Ag-HBC, Age) im Serum und in der Leber des Erkrankten wird genau bestimmt durch serologische Untersuchungen und durch Untersuchung der Leberbiopsien mittels der Immunofluoreszenz oder Elektronenmikroskopie.

Die Untersuchung der humoralen und zellulären Immunantworten, die gegen diese drei Antigevie gerichtet sind, kann überprüft bzw. bestätigt oder ergänzt werden durch die serologische Titration der Antikörper und durch Hypersensibilitäts-Tests, die gegenüber diesen gleichen Antigenen verlangsamt sind (Inhibierung der Migration der Leukozyten und eventuell Intradermoreaktion mit den drei Antigenen Australia-Antigen, HBC ίο und e, gereinigt, nichtinfektiös).

Die Ergebnisse all dieser Tests und ebenso derjenigen, welche den Stand der globalen Immunantworten des Kranken sorgfältig erforschen, dienen als Unterlage für die Entscheidung bezüglich des anzuwendenden Bets handlungstyps, wobei die Anwendungsbedingungen im einzelnen bestimmt werden von den üblichen therapeutischen Bestimmungsmethoden bei Behandlungen mit Hilfe von /-Globulinen.

Die/-Globuline Anti-e können in zweckentsprechenden Dosen für die Präventivbehandlung von spontanen, posttransfusionellen und anderen Virus HB-Infektionen verwendet werden, indem sie entweder den gefährdeten Personen injiziert werden oder dem Blut und seinen Derivaten vor oder nach der eventuellen Fraktionierung für die injektive Verabfolgung an Menschen zugesetzt werden, um den Virus HB zu neutralisieren.

Wie bereits oben bemerkt wurde, handelt es sich bei

dem Anugen-e in Wirklichkeit um einen Antigenkomplex. der eine Gemeinschaft von Proteinen repräsentiert. Zwei dieser Proteine sind mit Ag-ei und Ag-e2 bezeichnet worden, und zwar von Williams Allan und Georges Le Bouvier auf dem »Symposium international sur les sous-types de l'antigene HBs«. das im »Centre National de Transfusion Sanguine« in Paris in der Zeit vom 14. bis 18. April 1975 stattfand und worüber in der »Bibiiotheca Hematologica«, 42, Seiten 65 bis 70 (1976)

Es existieren auch noch andere, die z. B. mit ej... etc. bezeichnet werden können. Es ist festgestellt worden, daß bei den Antigen-e-Trägern die relativen Mengenverhältnisse der verschiedenen Antigene-e schwanken. In gleicher Weise sind auch die relativen Mengenverhältnisse der verschiedenen Antikörper-Antt-ei, Anti-e2 ... usw. variabel. Wenn man Personen mit einem Ag-e-Präparat immunisiert, das reich an einem der Bestandteile des Antigenkomplexes ist, oder wenn man die Plasmas von Personen, die bereits Träger von Anti-e-Antikörpern und reich an einem der entsprechenden Antikörper sind, selektioniert, so kann man /-Globulinfraktionen gewinnen, die reich an einem dieser Antikörper sind.

Die Erfindung umfaßt auch solche /-Globulinfraktionen, die reich z. B. an Antikörpem-Anti-ei oder Anti-e2 sind.

Eine andere Anwendung der /-Globulinfraktionen, die Antik5rper-Anti-e enthalten, ist die Eliminierung der kompletten, infektiösen Viren HB und der Antigene-e aus allen diese enthaltenden biologischen Flüssigkeiten oder allen Flüssigkeiten, die einem Gehalt daran zugänglich sind, und zwar durch Agglutination und bzw. oder Neutralisation, die durch das Inkontaktbringen mit den Antikörpern-Anti-e herbeigeführt wird, indem man z. B. Antikörper-Anti-e den besagten Flüssigkeiten zusetzt So kann man z. B. die /-Globuiinfraktion, welche die Antikörper-Anti-e enthält, den Blut- oder Plasmaflaschen oder jeder anderen im Notfall zur Perfusion bestimmten biologischen Flüssigkeit zusetzen, wenn die Zeit zur Prüfung der Unschädlichkeit, & h. im vorliegen-

den Fall zur Prüfung auf die Abwesenheit des Virus HB, fehlt. Man kann auch die genannten biologischen Flüssigkeiten über ein Immuno-Adsorbens laufen lassen, dessen Oberfläche mit Antikörper-Anti-e-Partikeln überzogen ist. Hierzu kann man z. B. eine Affinitäts-Chromatographie durchführen, die jener analog ist, die oben im Zuge der Erläuterung der Gewinnung von partr-räOder vollständig gereinigten Antigen-e-Präparaten angeführt ist, d. h. eine Chromatographie auf einem porösen Träger der an Antikörper-Anti-e gekuppelt ist. Die Regeneration des Trägers durch Eiütion des adsorbierten Antigens ermöglicht im übrigen die Gewinnung von Ag-e-Präparaten, deren Verwendbarkeit oben erwähnt ist.

In diesem Fall wird das erfindungsgemäße Arzneimittel aus dem Blut, dem Plasma oder irgendeiner anderen, zu perfundicrenden biologischen Flüssigkeit gebildet, der man die >«-Globulinfraktion zugesetzt hat, welche die Ämikörper-Anü-e ciiüiäii, oder die man über ein Immuno-Adsorbens, das mit Antikörper-Anti-e-Partikein beschichtet ist, hat laufen lassen.

Selbstverständlich haben die ^-Globulinfraktionen, die den biologischen Flüssigkeiten zugesetzt worden sind, eine Behandlung durchgemacht, die ihre Verabfolgung auf intravenösem Wege gestattet.

Erfindungsgemäß wurden insbesondere bei der akuten Form der Hepatitis in einer Form mit 90% Sterblichkeit gute Erfolge erzielt, während die Literaturstelle Gastroent zeigt, daß eine Behandlung mit Antikörpern Anti-Au wirkungslos bleibt. Es wurde in klinischen Ver-Sachen gefunden, daß von 5 Kranken, die mit Antikörper-Anti-e Präparat gemäß der Erfindung behandelt wurden, 3 überlebten und die beiden anderen wesentlich länger überlebten als dies bei üblichen Behandlungen, einschließlich solcher mit Immunoglobulinen möglich gewesen wäre.

Die Erfindung wird durch folgende Beisoiele erläutert:

B e i s ρ i e 1 1

Reinigung des Antigens-e durch
Zonen-Ultrazentrifugierung

Man selektioniert in der oben angegebenen Weise das Plasma von Personen, die Träger des Antigens-e sind, z. B. vorzugsweise durch eine Identitätsreaktion bei der Immunodiffusion gegen das Antigen-ε.

Man gibt zum Plasma Calciumchlorid und läßt das Ganze 24 Stunden stehen, um das Fibrin zu eliminieren. Danach setzt man Polyäthylenglykol von einem Molekulargewicht zwischen 6000 und 7500 (»Carbowax 6000«) bis zu einer Endkonzentration von 13% (Gewicht/Volumen) in einem Dinatriumphosphat-Puffer, 0,02%, bei pH 7 zu.

Nach 24stündigem Stehen bei +4° C wird die Fällung durch sorgfältiges Abdekantieren von der überstehenden Flüssigkeit getrennt Man entledigt sich dann des größten Teils des Polyäthylenglykols, indem man das pH der Fällung in einem Natriumacetat-Puffer, 025 M, auf 5 einstellt Man trennt die Fällung nach 24stündigem Stehen bei +4"C vermittels einer Zentrifugation mit 4000 Umdrehungen pro Minute ab. Die überstehende Flüssigkeit, die das Ag-e enthält, wird auf eine mit »Sephadex G 200« gefüllte Säule gegeben, und die Fraktionen werden gesammelt

Die Fraktionen, die sich in bezug auf das Ag-e als positiv erwiesen haben, und zwar entweder anhand der Immunodiffusion und bzw. oder der Elektro-lmmunodiffusion, werden miteinander vereinigt und durch Ultrafiltration auf »Amicon«, das mit dem Filter PM 30 000 versehen ist, konzentriert.

Die so konzentrierte Lösung wird auf die Oberfläche von 3 Zentrifugenröhrchen gegeben, die einen linearen Saccharose-Gradienten von 10 bis 30% (Gew./Gew.) in einem Phosphatpuffer vom pH 7,4 enthalten, und 18 Stunden lang bei 4° C einer präparativen Zonen-Zentrifugalion bei 20 000 Umdrehungen pro Minute unterworfen. Es werden Fraktionen von 3 ml vom Boden des Röhrchens aus gesammelt. Die Fraktionen, die sich als positiv in bezug auf das Antigen-e erweisen (z. B. anhand des Immunodiffusionstests) werden miteinander vereinigt. Man kann das Zentrifugieren in analoger Weise mit diesen Fraktionen, die sich als positiv in bezug auf das Ag-e erwiesen haben, wiederholen, um den Reinigungsgrad zu erhöhen. Man dialysiert dann 24 Stunden lang gegen einen Phcsphatpuffer vom pH 7,4 und konzentriert danach vermittels Ultrafiltration mittels eines Filters, das eine Membran aufweist, deren Porengröße so bemessen ist, daß sie Moleküle mit einem Molekulargewicht von über 30 000 zurückhält.

Die erhaltene Antigen-e-Lösung kann zur Auslösung der Bildung von Antikörper-Anti-e verwendet werden, nachdem sie vorsichtshalber einer Abschwächung durch Einwirkung von Wärme, Formol, /?-Propiolacton oder Ultraviolettstrahlung unterworfen v/urde, die so dosiert und abgestimmt ist, daß jede eventuell vorhandene restliche Infektiosität eliminiert ist, ohne die Antigenizität zu beseitigen.

Beispiel 2

Reinigung des Antigens-e durch
Affinitätschromatographie

(a) Herstellung eines
Immuno- Adsorbens Sepharose/Anti-e

Es wird die /-Globuünfraktion eines Serums, das sich als anti-e-positiv erwiesen hat, durch Fällung mit Ammoniumsulfat bei pH 7 und einer Endkonzentration von 40% gewonnen. Die Fällung wird in einem 0,1 M NaHCO3-Puffer wieder gelöst und gegen eine 0,5 M NaCI - 0,1 M NaHCO₃-Lösung dialysiert

Die ^-Globuline Anti-e werden an Sepharose 4 B, die mit Bromcyan (Pharmacia-Fine, Upsala, Schweden) aktiviert ist, gemäß dem Verfahren, das von Cuatrecas und Afinsen in »Ann. Rev. Biochem.« 40,259 (1971) beschrieben ist, gekuppelt

7 g mit BrCN aktivierte Sepharose 4 B werden zum Quellen gebracht und auf einem Glasfilter 30 Minuten lang mit 0,001 M HCl gewaschen. Unmittelbar nach dem Waschen wird das Gel mit 200 mg ^-Globulinen Anti-e in Bicarbonatlösung gemischt und das Ganze 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt

Das Gel wird danach mit 600 ml einer 0,1 M NaHCO₃-Lösung, die 04 M NaCl enthält, gewaschen und mit 50 ml einer 1 M Äthanolaminlösung, pH 8, 2 Stunden bei 25° C behandelt Die so gekuppelte Sepharose wird hernach abwechselnd mit einem 1 M NaCI — 0,1 M Acetat-Puffer, pH 4,0, und einem 1 M NaCl 0,1 M Borat-Puffer, pH 8,4, gewaschen.

Das letzte Waschen wird mit einem 0,1 M Borat-Puffer, pH 8,4, der 0,5 M NaCI und 0,005 M EDTA enthält, durchgeführt

(b) Isolierung des Antigens-e

Es wird eine Säule von 2 χ 11 cm verwendet, die mit Sepharose, die an Anti-e gekuppelt ist, gefüllt ist. Die Säule wird mit dem Puffer bei Raumtemperatur equilibriert. Man gibt 25 ml der das Antigen-e enthaltenden Lösung, nach Beispiel 1 erhalten und zur Hälfte mit dem Puffer verdünnt, zu und beläßt das Ganze 1 Stunde bei 37°C, um eine maximale Adsorption zu begünstigen, die Säule wird dann auf 4°C gebracht und mit dem Borat-Puffer gewaschen, bis die optische Dichte der Fraktionen Null wird. Das Antigen-e wird aus der Säule mit einem 0,1 M Phosphat-Puffer, pH 10.8, eluiert. Die Fraktionen, die das Antigen-e enthalten — bestimmt durch Messen der optischen Dichte bei 280 nm —, werden unmittelbar durch Zusatz von 2 N HCl auf ein physiologisches pH gebracht.

Man vereinigt alle diese Fraktionen und konzentriert durch Ultrafiltration auf dem Filter »Amicon PM 30«.

Die durchgeführten Versuche zeigen, daß das erhaltene Produkt kein Australia-Antigen enthält.

Vorsichtshalber kann das Ag-e-Präparat einer Abschwächung durch Formol, /?-Propiolacton oder Ultraviolettbestrahlung unterworfen werden, um eine eventuelle restliche Infektiosität zu eliminieren, ohne die Antigenizität zu beseitigen.

Das Fehlen einer Infektionskraft und die Wirksamkeit dieses Präparats sind durch Versuche am Schimpansen bewiesen worden. Diese Versuche umfassen vornehmlich die Untersuchung einer viralen Replikation durch Bestimmung des Australia-Antigens und des Antikörpers-Anti-HBC, die Untersuchung der Transaminasen und die histologische Überwachung durch Leberbiopsie.

Die Verabfolgung dieses Präparats ermöglicht es, die Antikörper-Anti-e bei den freiwilligen Spendern in Erscheinung treten zu lassen, und das Blut, das von diesen

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die Gewinnung von gereinigten Fraktionen, welche die Antikörper-Anti-e enthalten, wie es nachstehend in Beispiel 3 erläutert ist.

Man muß ungefähr 2,35 Liter des Puffers bis zum pH 4 zusetzen.

Dann stellt man das pH auf 5,1, indem man ungefähr 4,5 Liter eines Puffers zugibt, der erhalten wurde durch Vermischen von einem Volumen 0,05 M Na2HPO₄ mit 0,83 Volumina 0,05 M Essigsäure, wobei ständig die Temperatur auf 5° C gehalten wird.

Man stellt die Ionenstärke ein vermittels Zusatz von 0,4 Liter eines Puffers vom pH 5,1, der sich zusammensetzt aus einem Volumen. 0,05 M Na2HPO₄ und 1,25 Volumina Essigsäure.

Die Suspension wird dann in 9,7 Liter Wasser verdünnt.

Man hat dann ein Gesamtlösungsvolumen von 19,45 Liter für jedes kg der Fällung.

Man gibt Äthanol zu bis zum Erreichen einer Äthanolkonzentration von 12%.

Nun wird zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit gesammelt. Man setzt Natriumchlorid zu, bis eine Ionenstärke zwischen 0,03 und 0,04 erreicht ist. Danach stellt man das pH auf 7,2 ein und setzt Äthanol zu bis zu einer Konzentration von 25% bei einer Temperatur von —7°C. Man erhält eine Fällung von /-Globulinen, die man durch Zentrifugieren sammelt. Man stellt dann das fertige Arzneimittel nach den üblichen Methoden her, d. h. durch Inlösungbringen, Klären und Gefriertrocknen und danach Herstellung einer wäßrigen Lösung von 16%. Um eine isotonische Lösung zu gewinnen, die eine bessere Löslichkeit und eine bessere Stabilität herbeiführt, gibt man 0,3 Mol/Liter Glycin zu. Als Konservierungsmittel setzt man gleichfalls 0,1 g/Liter Merthiolat zu.

Die ergänzenden Behandlungen zwecks Gewinnung von intravenös injizierbaren /-Globulinen können gemaß den üblichen Prozeduren durchgeführt werden.

Beispiel 4 Beispiel 3

Herstellung einer Antikörper-Anti-e
aufweisenden ^-Globulinfraktion

Als Ausgangsprodukt dient ein defibriniertes Plasma, das durch Plasmapherese erhalten wurde und von ausgewählten Spendern stammt, deren Blut Antikörper-Anti-e enthält. Man versetzt das Plasma mit Äthanol bis zu einer Konzentration von 19% bei pH 5,85 und einer Temperatur von — 5"C₁ wobei die Volumina so gewählt werden, daß eine Endkonzentration an Proteinen von ungefähr 5% erhalten wird. Man führt eine Zentrifugatton durch und isoliert eine Fällung, die sämtliche ^Globuline und einen Teil der ac- und ^"-Globuline enthält

Die Fällung wird in Wasser von 0⁰C suspendiert, und zwar in einem Verhältnis von 10 Liter Wasser auf jedes kg Fällung. Man stellt das pH auf 4,6 durch Zugabe eines Puffergemischs vom pH 4, das durch Vermischen eines Volumens 0,05 M Na₂KPO₄ mit 6 Volumina 0,05 M Essigsäure erhalten wurde.

Man gibt danach einen Puffer vom pH 4,8 zu, der sich aus einem Volumen 0,05 M NEjHPO₄ und 1,65 Volumina Essigsäure zusammensetzt, wobei die Essigsäure 0,05molar ist, um insgesamt die Ionenstärke zu erhöhen.

Herstellung einer ^-Globulinfraktion,
die reich an Antikörpern-Anti-ei ist

Arbeitet man wie in Beispiel 3, geht jedoch /on Plasmas aus, die wegen ihres Reichtums an Antikörpern-Anti-ei ausgewählt wurden, so erhält man eine ^-Globulinfraktion, die reich an Antikörpern-Anti-ei ist und die man in gefriergetrockneter Form aufbewahrt.

Beispiel 5

Herstellung einer ><-Globulinfraktion,

die reich an Antikörpern-Anti-e2 ist

Arbeitet man wie in Beispiel 3, geht jedoch von Plasmas aus, die wegen ihres Reichtums an Antikörpern-Anti-e2 ausgewählt wurden, so erhält man eine ^-Globulinfraktion, die reich an Antikörpern-Anti-e2 ist und die man in gefriergetrockneter Form aufbewahrt

Claims

Patentansprüche:

1. Arzneimittel auf der Basis von Human-Gammaglobulinen in einem physiologisch verträglichen Milieu, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Gammaglobulinfraktlon aufweist, die Antikörper-Anti-e enthält und aus dem Serum oder Blutplasma oder Plazentaextrakten, die einen Gehalt an Antikörpern-Anti-e aufweisen, gewonnen worden ist

2. Arzneimittel gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es aus einer gereinigten Fraktion von Antikörpern-Anti-e besteht, die von allen anderen normalen Blutprotein-Bestandteilen außer den Gammaglobulinen und von allen infektiösen Verunreinigungen befreit worden ist.

3. Arzneimittel gemäß Ansprach 1, dadurch gekennzeichnet, daß es aus einem ganzen Plasma oder ganzen Serum, in dem das Vorhandensein von Antikörpern-Anti-e festgestellt ist, besteht

4. Intravenös anplizierhares Arzneimittel gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Gammaglobuline zur Unterdrükkung oder Herabsetzung der Antikomplementwirkung vorbehandelt worden sind.

5. Arzneimittel gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es aus Blut, Plasma oder irgendeiner anderen biologischer Flüssigkeit besteht, dem bzw. der man eine zur Unterdrückung oder Herabsetzung der Antikomplementärwirkung vorbehandelte Gammaglobulinfraktion, die Antikörper-Anti-e enthält, zugesetzt hat

6. Arzneimittel gemäß den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Gammaglobulinfraktion reich an einem der Antikörper-Anti-ei und Anti-e2 ist