JPS60258127A - Ｂ型肝炎ワクチンの製造方法 - Google Patents
Ｂ型肝炎ワクチンの製造方法Info
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- JPS60258127A JPS60258127A JP11518984A JP11518984A JPS60258127A JP S60258127 A JPS60258127 A JP S60258127A JP 11518984 A JP11518984 A JP 11518984A JP 11518984 A JP11518984 A JP 11518984A JP S60258127 A JPS60258127 A JP S60258127A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔技術分野〕
本発明は、遺伝子操作によって得られたＢ型肝炎表面抗
原（ＨＢｓＡｇ ）を主成分とするＢ型肝炎ワクチンの
製造方法に関する。
原（ＨＢｓＡｇ ）を主成分とするＢ型肝炎ワクチンの
製造方法に関する。
［発明の背景〕
Ｂ型肝炎ワクチンは、ＨＢｓＡｇ陽性のキャリアー血液
からＨＢｓＡｇ粒子を分離精製し、ポルマリン処理など
の不活化操作を行った後、ｌｌＢｓＡｇの免疫原性を高
めるために、アジュバントとしてアラム・ゲルを加えた
ものとして開発、実用化された。
からＨＢｓＡｇ粒子を分離精製し、ポルマリン処理など
の不活化操作を行った後、ｌｌＢｓＡｇの免疫原性を高
めるために、アジュバントとしてアラム・ゲルを加えた
ものとして開発、実用化された。
このようにして作られたＢ型肝炎ワクチンは感染発症の
予防だけでなく、感染源となるキャリアーの発生阻止に
も有効であることから、Ｂ型肝炎の絶滅も可能である。
予防だけでなく、感染源となるキャリアーの発生阻止に
も有効であることから、Ｂ型肝炎の絶滅も可能である。
しかし、Ｂ型肝炎ワクチンの生産についてはいくつかの
問題点がある。第１は、ｔｌＢｓＡｇの原材料をキャリ
アーの血液に依存していることから、ワクチンの供給が
制約されるということ。第２は、キャリアーの血液中に
は少量ながら感染性のＢ型肝炎ウィルス（ＨＢ Ｖ）が
含まれることから、唯一の感染しえる動物であるチンパ
ンジーを用いての安全試験が必要になるということであ
る。
問題点がある。第１は、ｔｌＢｓＡｇの原材料をキャリ
アーの血液に依存していることから、ワクチンの供給が
制約されるということ。第２は、キャリアーの血液中に
は少量ながら感染性のＢ型肝炎ウィルス（ＨＢ Ｖ）が
含まれることから、唯一の感染しえる動物であるチンパ
ンジーを用いての安全試験が必要になるということであ
る。
このようなワクチンの生産上の難点を克服する方法とし
て、遺伝子操作の技術が導入された。
て、遺伝子操作の技術が導入された。
組換えＤＮＡ技術は異種のＤＮＡをファージ又はプラス
ミドＤＮＡにつなぎ、大腸菌で増やすという方法で開始
された。そして、ＨＢＶ−ＤＮＡの全塩基配列の決定、
ワクチンとして使われるべき）ｌＢｓＡｇ遺伝子の同定
、大腸菌での形質発現を経て酵母でのＨＢｓＡｇの産生
へと発展していった。
ミドＤＮＡにつなぎ、大腸菌で増やすという方法で開始
された。そして、ＨＢＶ−ＤＮＡの全塩基配列の決定、
ワクチンとして使われるべき）ｌＢｓＡｇ遺伝子の同定
、大腸菌での形質発現を経て酵母でのＨＢｓＡｇの産生
へと発展していった。
たとえば、酵母由来ＨＢｓＡｇ （ｙ−ｌＩＢｓＡｇ
）は、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による
と、分子量２３，０００〜２５，０００のポリペプチド
のみからなり、これはヒト由来ＨＢｓＡｇ （ｈ−ＨＢ
ｓＡｇ ）のグリコジル化されていないポリペプチドと
一致するものである。また、ｈ−ＨＢｓＡｇと同じ２２
ｒ＋ｍの直径をもち、塩化セシウム溶液中での浮上密度
は、ｈ−ＨＢｓＡｇ と同しである。
）は、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による
と、分子量２３，０００〜２５，０００のポリペプチド
のみからなり、これはヒト由来ＨＢｓＡｇ （ｈ−ＨＢ
ｓＡｇ ）のグリコジル化されていないポリペプチドと
一致するものである。また、ｈ−ＨＢｓＡｇと同じ２２
ｒ＋ｍの直径をもち、塩化セシウム溶液中での浮上密度
は、ｈ−ＨＢｓＡｇ と同しである。
前述したＢ型肝炎ワクチンの生産上の難点を克服するた
めに、遺伝子操作の技術によりＨＢｓＡｇを大量に得、
それを高度精製することによりワクチンとする方法が確
立されつつある。
めに、遺伝子操作の技術によりＨＢｓＡｇを大量に得、
それを高度精製することによりワクチンとする方法が確
立されつつある。
ところが、遺伝子操作を経た菌よりＨＢｓＡｇを精製し
てＢ型肝炎ワクチンを製造する際には、原料中に蛋白質
を主とする菌体成分が夾雑してくるので、血液よりの精
製とは別個の方法が適用される。
てＢ型肝炎ワクチンを製造する際には、原料中に蛋白質
を主とする菌体成分が夾雑してくるので、血液よりの精
製とは別個の方法が適用される。
本発明者らは、かかる技術的背景の下に鋭意研究を重ね
た結果、遺伝子操作を経た菌体内・菌体外に産生された
ＨＢｓＡｇを効率よく精製して、Ｂ型肝炎ワクチンを大
量に製造する方法を見出した。
た結果、遺伝子操作を経た菌体内・菌体外に産生された
ＨＢｓＡｇを効率よく精製して、Ｂ型肝炎ワクチンを大
量に製造する方法を見出した。
本発明は、遺伝子操作を経た菌体からＩｆＢｓＡｇを効
率よく製造する方法を提供することを目的とするもので
ある。
率よく製造する方法を提供することを目的とするもので
ある。
その要旨は、遺伝子操作によって得られたＨＢｓＡｇを
、微生物菌体から抽出した後、次の■〜■を含む工程に
おいて精製することを特徴とするＢ型肝炎ワクチンの製
造方法に関する。
、微生物菌体から抽出した後、次の■〜■を含む工程に
おいて精製することを特徴とするＢ型肝炎ワクチンの製
造方法に関する。
■溶解度差に基づく分画
■コロイド珪酸塩による吸着
■ＨＢｓ抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィ
ー ■密度勾配遠心分離 」１ ■透析 〔発明の詳細な開示〕 （１）出発原扛 本発明における出発原料は、遺伝子操作を経てＨＢｓＡ
ｇ発現性となった菌を培養することによって産生させら
れた）ＩＢｓＡｇ含有物である。
ー ■密度勾配遠心分離 」１ ■透析 〔発明の詳細な開示〕 （１）出発原扛 本発明における出発原料は、遺伝子操作を経てＨＢｓＡ
ｇ発現性となった菌を培養することによって産生させら
れた）ＩＢｓＡｇ含有物である。
菌としては、大腸菌、酵母、枯草菌などが例示される。
遺伝子操作によってＨＢｓＡｇ産生菌を得る方法は、既
知の方法またはそれに準する方法に従えばよい。
知の方法またはそれに準する方法に従えばよい。
かかる方法としては、たとえば、大腸菌を使用する方法
としては、特開昭５８−１０４８８７号明細書に、又酵
母を使用する方法としては、特開昭５９−４８０８２号
明細書にその開示がある。
としては、特開昭５８−１０４８８７号明細書に、又酵
母を使用する方法としては、特開昭５９−４８０８２号
明細書にその開示がある。
（２）菌体からのＨＢｓＡｇの抽出
菌体を緩衝液（通常ｐＨ７〜Ｂ）〔例えば、１０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７，５）、あるいは、１ｍＭエチレン
ジアミン四酢酸酢酸ＤＴＡ） ４−１ ｍＭフフ化フェ
ニルメチルスルホニル含有１０ｍＭ）リス緩ｉＵ液（ｐ
１１７．５）など〕に懸濁後、菌体を粉砕することによ
って、ＨＢｓＡｇを菌体内外から抽出する。なお、・菌
体の粉砕に際しては、既知の方法、例えば、グラスビー
ズ法、超音波法なとが採用される。
ン酸緩衝液（ｐＨ７，５）、あるいは、１ｍＭエチレン
ジアミン四酢酸酢酸ＤＴＡ） ４−１ ｍＭフフ化フェ
ニルメチルスルホニル含有１０ｍＭ）リス緩ｉＵ液（ｐ
１１７．５）など〕に懸濁後、菌体を粉砕することによ
って、ＨＢｓＡｇを菌体内外から抽出する。なお、・菌
体の粉砕に際しては、既知の方法、例えば、グラスビー
ズ法、超音波法なとが採用される。
（３）ＨＢ ｓ Ａ Ｂの精製
以下の■〜■の工程を適宜組合せることによって効率よ
く精製される。
く精製される。
■溶解度差に基づく分画
硫安分画、あるいはアクリノール処理とヘントナイト処
理の組合せ等が好都合に用いられる。
理の組合せ等が好都合に用いられる。
硫安分画は、１０〜２０％飽和硫安分画工程と４０〜５
０％飽和硫安分画工程を組合せるごとによって実施され
る。
０％飽和硫安分画工程を組合せるごとによって実施され
る。
即ち、まず前記で得たｌｌＢｓＡｇ含有液を硫安１０〜
２０％飽和分画することによって沈澱する蛋白質を除去
する。当該分画は、たとえば菌体粉砕後の当該水溶液を
ｐＨ４〜８ （好ましくは塩酸、硫酸等にて調整する）
に調整し、硫安を１０〜２０％飽和になるように添加し
、たとえば１５〜２５℃にて３０〜１２０分間攪拌する
ことによって行われる。かくして沈澱した蛋白質は、た
とえば３０〜１２０分間静置して生成した沈澱を遠心分
離（通常、６０００〜８０００ｒ、ｐ、ｍ、、１０〜３
０分間）に付して除去し、遠心上清を回収することによ
って分離除去される。
２０％飽和分画することによって沈澱する蛋白質を除去
する。当該分画は、たとえば菌体粉砕後の当該水溶液を
ｐＨ４〜８ （好ましくは塩酸、硫酸等にて調整する）
に調整し、硫安を１０〜２０％飽和になるように添加し
、たとえば１５〜２５℃にて３０〜１２０分間攪拌する
ことによって行われる。かくして沈澱した蛋白質は、た
とえば３０〜１２０分間静置して生成した沈澱を遠心分
離（通常、６０００〜８０００ｒ、ｐ、ｍ、、１０〜３
０分間）に付して除去し、遠心上清を回収することによ
って分離除去される。
上記遠心上清から硫安４０〜５０％飽和分画によって沈
澱する蛋白質を回収する。当該分画は、通常ｐ１１６〜
８にて行われ、ｐＨの調整には通常水酸化アルカリ金属
（例、水酸化ナトリウム）が使用される。また、温度条
件は１５〜２５℃であることが好ましく、また分画は３
０〜１２０分間攪拌することによって行うことが好まし
い。攪拌終了後、たとえば３０〜１２０分間静置するこ
とによって沈澱が生成する。この沈澱の回収は、好まし
くは遠心分ｌ１ｉｌｔ （通常、６０００〜８０００ｒ
、ｐ、ｍ、、１０〜３０分間）にて行われる。沈澱は、
ｐＨ６〜８の緩ｉ！ｉ液（例えば、リン酸緩衝液）に溶
解し、要すれば透析、清澄、除菌濾°過を行う。
澱する蛋白質を回収する。当該分画は、通常ｐ１１６〜
８にて行われ、ｐＨの調整には通常水酸化アルカリ金属
（例、水酸化ナトリウム）が使用される。また、温度条
件は１５〜２５℃であることが好ましく、また分画は３
０〜１２０分間攪拌することによって行うことが好まし
い。攪拌終了後、たとえば３０〜１２０分間静置するこ
とによって沈澱が生成する。この沈澱の回収は、好まし
くは遠心分ｌ１ｉｌｔ （通常、６０００〜８０００ｒ
、ｐ、ｍ、、１０〜３０分間）にて行われる。沈澱は、
ｐＨ６〜８の緩ｉ！ｉ液（例えば、リン酸緩衝液）に溶
解し、要すれば透析、清澄、除菌濾°過を行う。
アクリノール処理とヘントナイト処理を組合せて用いる
場合は以下の操作にて行う。まず、ＨＢｓＡｇ含有液に
アクリノールを０．２〜０．５％になるように加える。
場合は以下の操作にて行う。まず、ＨＢｓＡｇ含有液に
アクリノールを０．２〜０．５％になるように加える。
そして、１５〜２５℃で１５分〜１時間攪拌した後、３
０００〜５０００ｒ、ｐ、ｍ、で１５分〜１時間遠心分
離する。こうして得られた上清にヘントナイトを０．５
％加えた後、１５〜２５℃で１５分〜１時間攪拌させ、
更に３０００〜５０００ｒ、ｐ、ｍ、で１５分〜１時間
遠心分離し、上清を得る。
０００〜５０００ｒ、ｐ、ｍ、で１５分〜１時間遠心分
離する。こうして得られた上清にヘントナイトを０．５
％加えた後、１５〜２５℃で１５分〜１時間攪拌させ、
更に３０００〜５０００ｒ、ｐ、ｍ、で１５分〜１時間
遠心分離し、上清を得る。
■コロイド珪酸塩による吸着
コロイド珪酸塩としては、シリカゲル、ケイ酸アルミン
酸マグネシウム、ケイソウ土、酸性白土、カオリンなど
が用いられる。当該工程は、たとえば次の如くして行わ
れる。
酸マグネシウム、ケイソウ土、酸性白土、カオリンなど
が用いられる。当該工程は、たとえば次の如くして行わ
れる。
ＨＢｓＡｇ含有液にコロイド珪酸塩を、好ましくは１〜
４％（ｗ ／ ｖ ）となるように添加して攪拌する。
４％（ｗ ／ ｖ ）となるように添加して攪拌する。
攪拌温度は３６〜３８℃、攪拌時間は２〜４時間が好ま
しい。
しい。
ＨＢｓＡｇを吸着したコロイド珪酸塩は、たとえば遠心
分離（通常、２０００〜４０００ｒ、ｐ、ｍ、、１０〜
２０分間）によって回収される。回収された当該コロイ
ド珪酸塩は、ｐｌ＋７〜８の緩ｆｉ液（たとえば０．１
〜。、２゜。、や、７．ア、７□＠＄５７）＋ｕ−）
”□′剤、０．１〜０．２Ｍの塩化ナトリウム等の無機
塩等からなるｐＨ７〜８の緩衝液）等にて洗浄すること
が好ましい。
分離（通常、２０００〜４０００ｒ、ｐ、ｍ、、１０〜
２０分間）によって回収される。回収された当該コロイ
ド珪酸塩は、ｐｌ＋７〜８の緩ｆｉ液（たとえば０．１
〜。、２゜。、や、７．ア、７□＠＄５７）＋ｕ−）
”□′剤、０．１〜０．２Ｍの塩化ナトリウム等の無機
塩等からなるｐＨ７〜８の緩衝液）等にて洗浄すること
が好ましい。
こうしてコロイド珪酸塩に吸着させたＩ（ＢｓＡｇを０
．１〜１％デオキシコール酸塩を含有するｐ）１８．５
〜９．５のｙ重液（たとえば、ホウ酸緩ｉｈ液）を用い
て溶出させた後、遠心分離を通常、２０００〜４０００
ｒ、ｐ、ｍ、で１０〜２０分間行うごとにより、貼ｓＡ
ｇの溶出液を回収する。
．１〜１％デオキシコール酸塩を含有するｐ）１８．５
〜９．５のｙ重液（たとえば、ホウ酸緩ｉｈ液）を用い
て溶出させた後、遠心分離を通常、２０００〜４０００
ｒ、ｐ、ｍ、で１０〜２０分間行うごとにより、貼ｓＡ
ｇの溶出液を回収する。
■ｌ−！ＢｓＡｇｌｌＢｓＡｇ抗体ニティークロマトグ
ラフィー ｌｌＢｓＡｇを吸着せしめる工程であり、ｌｌＢｓＡｇ
抗体はモノクローナル抗体、ポリクローナルヒト抗体の
いずれでもよいが、モノクローナル抗体の場合は、抗Ｈ
Ｂ ｓ抗体を産生じているヒトのリンパ球から得たもの
が好ましい。かかる抗体は自体既知の方法にて調製する
ことができる。例えば、モノクローナル抗体は、細胞融
合（Ｎａｔｕｒｅ、 ２５６．４９５（１９７５） ）
、形質転換（特開昭５８−１２７１６７号明細書）な
どによって調製される。
ラフィー ｌｌＢｓＡｇを吸着せしめる工程であり、ｌｌＢｓＡｇ
抗体はモノクローナル抗体、ポリクローナルヒト抗体の
いずれでもよいが、モノクローナル抗体の場合は、抗Ｈ
Ｂ ｓ抗体を産生じているヒトのリンパ球から得たもの
が好ましい。かかる抗体は自体既知の方法にて調製する
ことができる。例えば、モノクローナル抗体は、細胞融
合（Ｎａｔｕｒｅ、 ２５６．４９５（１９７５） ）
、形質転換（特開昭５８−１２７１６７号明細書）な
どによって調製される。
アフィニティークロマトグラフィーの手法は、自体既知
の手法に従えばよい。すなわち、ＨＢｓＡｇ含有溶液を
水不溶性固定化ＨＢｓ抗体に接触させて）ＩＢｓＡｇを
吸着させた後、吸着されたＩ（ＢｓＡｇ；Ｉｉ：溶出さ
せる。
の手法に従えばよい。すなわち、ＨＢｓＡｇ含有溶液を
水不溶性固定化ＨＢｓ抗体に接触させて）ＩＢｓＡｇを
吸着させた後、吸着されたＩ（ＢｓＡｇ；Ｉｉ：溶出さ
せる。
ＨＢｓＡｇ抗体から水不溶性固定化ＨＩ３５抗体を得る
方法としては、たとえば、セファロース４Ｂ。
方法としては、たとえば、セファロース４Ｂ。
セファクリルｓ −１０００（以上ファルマシア社製）
などにＨＢｓＡｇ抗体を結合させる方法があげられる。
などにＨＢｓＡｇ抗体を結合させる方法があげられる。
吸着は、たとえばＨＢｓＡｇ含有水溶液と水不溶性固定
化ＨＢｓ抗体とを、好ましくは緩やかな攪拌下に、たと
えば室温程度で０．５〜２時間程度、混合（攪拌）する
方法、水不溶性固定化ＨＢｓ抗体をカラムに充填し、粗
製ＨＢｓＡｇ水溶液を流す方法（好適条件二室温）にて
行われる。
化ＨＢｓ抗体とを、好ましくは緩やかな攪拌下に、たと
えば室温程度で０．５〜２時間程度、混合（攪拌）する
方法、水不溶性固定化ＨＢｓ抗体をカラムに充填し、粗
製ＨＢｓＡｇ水溶液を流す方法（好適条件二室温）にて
行われる。
かくして、水不溶性固定化ＨＢｓ抗体にＨＢｓＡｇのみ
が特異的に吸着され、他の不純蛋白質は吸着されない。
が特異的に吸着され、他の不純蛋白質は吸着されない。
ＨＢｓｌｇの溶出は、好ましくは５Ｍ塩酸グアニジン、
３Ｍチオシアン酸アンモニウムなどにて行われる。
３Ｍチオシアン酸アンモニウムなどにて行われる。
（４）密度勾配遠心分離
塩化セシウム又はショ糖を用いた直線密度勾配ゾーナル
遠心分離法が好ましく、この方法は具体的には次の通り
である。
遠心分離法が好ましく、この方法は具体的には次の通り
である。
まず、塩化セシウムを用いる場合は、密度１．０５〜１
．３５ｇ／ｃｎ＋３の、ショ糖を用いる場合は、濃度２
０〜５５％の密度勾配を容量Ｌ７００ｗ１１のゾーナル
ローター内に作製する。作製後、ＨＢｓＡｇ画分を注入
し、ｐ１１６〜８のリン酸緩衝液等の緩衝液を５０〜１
００ｍ１注入し、３０，０００〜３４．００Ｏｒ、ｐ、
ｍ、で３５〜４０時間超遠心分離を行う。
．３５ｇ／ｃｎ＋３の、ショ糖を用いる場合は、濃度２
０〜５５％の密度勾配を容量Ｌ７００ｗ１１のゾーナル
ローター内に作製する。作製後、ＨＢｓＡｇ画分を注入
し、ｐ１１６〜８のリン酸緩衝液等の緩衝液を５０〜１
００ｍ１注入し、３０，０００〜３４．００Ｏｒ、ｐ、
ｍ、で３５〜４０時間超遠心分離を行う。
ＩＩ Ｂ ｓ Ａ ｇの回収は、粒子の大きさ１８〜２
４０ｍ、就中的２２ｎｍ、１．１８〜１．２４ ｇ ７
ｃｍ３の密度領域より行う。
４０ｍ、就中的２２ｎｍ、１．１８〜１．２４ ｇ ７
ｃｍ３の密度領域より行う。
（５）透析
ＨＢｓＡｇ画分を、好ましくはｐＨ６〜８．０．０１〜
０．０５Ｍの緩衝液（例えば、リン酸緩衝液など）を用
いて、好ましくは３０時間以上透析を行うλこうして精
製されたＨＢｓＡｇは、液状品としても凍結乾燥品とし
ても提供することが可能である。
０．０５Ｍの緩衝液（例えば、リン酸緩衝液など）を用
いて、好ましくは３０時間以上透析を行うλこうして精
製されたＨＢｓＡｇは、液状品としても凍結乾燥品とし
ても提供することが可能である。
この場合、その免疫能を高めるために免疫補助剤に吸着
させて使用することが好ましい。免疫補亀剤トしては、
水酸化アルミニウム、硫酸アルミニウムなどが用いられ
る。
させて使用することが好ましい。免疫補亀剤トしては、
水酸化アルミニウム、硫酸アルミニウムなどが用いられ
る。
液状品の場合ば、用製されたｌｌＢｓＡｇに水酸化アル
ミニウムなどの免疫補助剤を加えたものを小分は分注し
て得る。
ミニウムなどの免疫補助剤を加えたものを小分は分注し
て得る。
凍結乾燥品の場合は、精製されたＨＢｓＡｇにマンニッ
ト、乳酸、グリシンなど、この技術分野で既知の賦形剤
を１〜５％（Ｗ／Ｖ）添加し、小分は分注し、凍結乾燥
する。この場合、水酸化アルミニウムなどの免疫補助剤
を加えたものを凍結乾燥すると、水酸化アルミニウムゲ
ル粒子に変化かみられるので、凍結乾燥品を免疫補助剤
に吸着させて使用する場合、用時その凍結乾燥品をまず
溶媒（例えば、１．６％塩化ナトリウム液）で熔解し、
その後免疫補助剤水懸濁液（例えば、水酸化アルミニウ
ム懸濁液）を加えてＨＢｓＡｇを吸着させ、注射剤とし
て投与することが好ましい。 、１従って、この場合は
、ワクチン凍結乾燥品、溶剤、免疫補助剤よりなるキッ
トの形態としておくことが好ましい。
ト、乳酸、グリシンなど、この技術分野で既知の賦形剤
を１〜５％（Ｗ／Ｖ）添加し、小分は分注し、凍結乾燥
する。この場合、水酸化アルミニウムなどの免疫補助剤
を加えたものを凍結乾燥すると、水酸化アルミニウムゲ
ル粒子に変化かみられるので、凍結乾燥品を免疫補助剤
に吸着させて使用する場合、用時その凍結乾燥品をまず
溶媒（例えば、１．６％塩化ナトリウム液）で熔解し、
その後免疫補助剤水懸濁液（例えば、水酸化アルミニウ
ム懸濁液）を加えてＨＢｓＡｇを吸着させ、注射剤とし
て投与することが好ましい。 、１従って、この場合は
、ワクチン凍結乾燥品、溶剤、免疫補助剤よりなるキッ
トの形態としておくことが好ましい。
なお、ＨＢｓＡｇはその９８％以上が水酸化アルミニウ
ム懸濁液添加後２０秒以内に水酸化アルミニウムに吸着
される。
ム懸濁液添加後２０秒以内に水酸化アルミニウムに吸着
される。
凍結乾燥したことによる利点は以下の通りである。
■長期保存が可能である。
■ヂメロザール（水銀防腐剤）を含有しない。
■水酸化アルミニウムで懸濁されていないので、保存中
に析出した不溶性異物を確認できる。
に析出した不溶性異物を確認できる。
■濃度をかえて用いることができる。
なお、本発明ワクチンは、筋肉、皮下等に（好ましくは
皮下）非経口投与される。
皮下）非経口投与される。
実施例Ｉ
ＨＢｓＡｇを発現した酵母を集菌し、これの５ ｋｇを
５ｐの１ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ） 、
１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニルを含む１０ｍＭ
トリス緩（ｈ液、ｐｌ＋７．５に懸濁し、グラスビーズ
法（ロｙｎｏ−旧１１使用）により酵母からｌｌＢｓＡ
ｇを抽出した。抽出液にアクリノールを終濃度で０．３
％（ｗ ／ ｖ ）加え、室温で３０分攪拌後、生成し
た沈澱を遠心分離（４０００ｒ、ｐ、ｍ、、３０分間）
により除去し上清を得た。この上清にヘントナイトを０
．５％（Ｗ／Ｖ）加え、室温で３０分攪拌後、遠心分Ｍ
ｌ （４０００ｒ、ｐ、ｍ、、 ３０分間）し、得られ
た上清にケイ酸アルミン酸マグネシウム〔エアロジルＲ
３８０゜Ｄｅｇｕｓａ社製〕を２．５％（Ｗ／Ｖ）にな
るように添加し、３７℃で３時間攪拌した。攪拌後、ｙ
−ＨＢｓＡｇを吸着したケイ酸アルミン酸マグネシウム
を遠心分ｌ１ｌＩ （３０００ｒ、ｐ、ｍ、、１５分間
）により回収し、回収したｙ −１（ＢｓＡｇ吸着ケイ
酸アルミン酸マグネジラムを０．１５ＭＥＤＴ八と０．
１５Ｍ塩化ナトリウムより成るｐｌ＋７．５の緩衝液で
洗浄した。洗浄後、０．５％（Ｗ／Ｖ）デオキシコール
酸ナトリウムを含有するｐＨ９，０の緩衝液で吸着され
たｙ ＝ＨＢｓＡｇを溶出した。遠心分離（３０００ｒ
、ｐ、ｍ、、］ ５５分間により回収した溶出液はＩＮ
塩酸でｐＨ７に調整した後、ヒト由来のＨＢｓ抗体を結
合したセファロース４Ｂに室温で１時間接触させること
により、ｙ−ＨＢｓＡｇを抗体カラムに吸着させた。次
いでｙ−ＨＢｓＡＢを吸着した抗体カラムを、０．１５
Ｍリン酸緩（ｈ液、ｐｌ＋７．５で洗浄した後、５Ｍ塩
化グアニジンにより溶出してｙ −ＨＢｓＡｇ画分を得
た。得られたＩｔ Ｂ ｓ Ａ ｇ画分は塩化セシウム
直線密度勾配（１，０５〜１．３５ｇ ／Ｃｍ３ ）ゾ
ーナル遠心分Ｍｔｔ （４３，０００ｒ、ｐ、ｍ、 。
５ｐの１ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ） 、
１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニルを含む１０ｍＭ
トリス緩（ｈ液、ｐｌ＋７．５に懸濁し、グラスビーズ
法（ロｙｎｏ−旧１１使用）により酵母からｌｌＢｓＡ
ｇを抽出した。抽出液にアクリノールを終濃度で０．３
％（ｗ ／ ｖ ）加え、室温で３０分攪拌後、生成し
た沈澱を遠心分離（４０００ｒ、ｐ、ｍ、、３０分間）
により除去し上清を得た。この上清にヘントナイトを０
．５％（Ｗ／Ｖ）加え、室温で３０分攪拌後、遠心分Ｍ
ｌ （４０００ｒ、ｐ、ｍ、、 ３０分間）し、得られ
た上清にケイ酸アルミン酸マグネシウム〔エアロジルＲ
３８０゜Ｄｅｇｕｓａ社製〕を２．５％（Ｗ／Ｖ）にな
るように添加し、３７℃で３時間攪拌した。攪拌後、ｙ
−ＨＢｓＡｇを吸着したケイ酸アルミン酸マグネシウム
を遠心分ｌ１ｌＩ （３０００ｒ、ｐ、ｍ、、１５分間
）により回収し、回収したｙ −１（ＢｓＡｇ吸着ケイ
酸アルミン酸マグネジラムを０．１５ＭＥＤＴ八と０．
１５Ｍ塩化ナトリウムより成るｐｌ＋７．５の緩衝液で
洗浄した。洗浄後、０．５％（Ｗ／Ｖ）デオキシコール
酸ナトリウムを含有するｐＨ９，０の緩衝液で吸着され
たｙ ＝ＨＢｓＡｇを溶出した。遠心分離（３０００ｒ
、ｐ、ｍ、、］ ５５分間により回収した溶出液はＩＮ
塩酸でｐＨ７に調整した後、ヒト由来のＨＢｓ抗体を結
合したセファロース４Ｂに室温で１時間接触させること
により、ｙ−ＨＢｓＡｇを抗体カラムに吸着させた。次
いでｙ−ＨＢｓＡＢを吸着した抗体カラムを、０．１５
Ｍリン酸緩（ｈ液、ｐｌ＋７．５で洗浄した後、５Ｍ塩
化グアニジンにより溶出してｙ −ＨＢｓＡｇ画分を得
た。得られたＩｔ Ｂ ｓ Ａ ｇ画分は塩化セシウム
直線密度勾配（１，０５〜１．３５ｇ ／Ｃｍ３ ）ゾ
ーナル遠心分Ｍｔｔ （４３，０００ｒ、ｐ、ｍ、 。
２０時間）により、密度約１．２ ｇ ７ｃｍ”の単一
ピークとして回収され、このピークと吸光度のピークは
一致した。
ピークとして回収され、このピークと吸光度のピークは
一致した。
回収したｙ −ｔｌＢｓＡｇ画分は、ｐ１１７のリン酸
！３１ ｆｆｉ液で透析した後、アジュバントとして水
酸化アルミニウムを加えてワクチンを得た。
！３１ ｆｆｉ液で透析した後、アジュバントとして水
酸化アルミニウムを加えてワクチンを得た。
次に精製ｙ−１１８ｓＡｇの性状分析を行った。精製ｙ
−ＨＢｓＡｇ中の酵母成分の有無を、酵母成分に対する
抗体とｌｌＢｓＡｇを含まない酵母成分を感作ヒツジ赤
血球による血球凝ｓｍ止法（ＨＡＩ法）、および箱間ｙ
−ｌｌ［１ｓＡｇと酵母成分に対する抗体を用いてモ
ルモット皮膚波動性アナフィラキー（ＰＣＡ）反応で検
討した結果、いずれの方法でも酵母成分ば検出されなか
った。５ＤＳ−ポリアクリルアミドケル電気泳動の分析
によれば、精製ｙ −ｌｌＢｓＡｇはｈ −ＨＢｓＡｇ
の分子量２５，０００に相当するペプチドのみから成る
ものであった。電子顕微鏡観察では、精製Ｖ−ＨＢ様ｇ
はｈ −ＨＢｓＡｇとほぼ同じ直径、形状を持った均一
な球形粒子として認められた。
−ＨＢｓＡｇ中の酵母成分の有無を、酵母成分に対する
抗体とｌｌＢｓＡｇを含まない酵母成分を感作ヒツジ赤
血球による血球凝ｓｍ止法（ＨＡＩ法）、および箱間ｙ
−ｌｌ［１ｓＡｇと酵母成分に対する抗体を用いてモ
ルモット皮膚波動性アナフィラキー（ＰＣＡ）反応で検
討した結果、いずれの方法でも酵母成分ば検出されなか
った。５ＤＳ−ポリアクリルアミドケル電気泳動の分析
によれば、精製ｙ −ｌｌＢｓＡｇはｈ −ＨＢｓＡｇ
の分子量２５，０００に相当するペプチドのみから成る
ものであった。電子顕微鏡観察では、精製Ｖ−ＨＢ様ｇ
はｈ −ＨＢｓＡｇとほぼ同じ直径、形状を持った均一
な球形粒子として認められた。
実施例２
実施例１で使用したのと同し酵母の１ ｋｇを１７！の
１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７，５に懸濁し、グラスビー
ズ法（Ｉｌｙｎｏ−Ｍｉｌｌ使用）と超音波法により酵
母からＨＢｓｌｌｅを抽出した。抽出液に硫安を１５％
飽和になるように添加し、室温で３０分間攪拌した。
１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７，５に懸濁し、グラスビー
ズ法（Ｉｌｙｎｏ−Ｍｉｌｌ使用）と超音波法により酵
母からＨＢｓｌｌｅを抽出した。抽出液に硫安を１５％
飽和になるように添加し、室温で３０分間攪拌した。
次いで３０分間静置後、生成した沈澱を遠心分離（７０
００ｒ、ｐ、ｍ、、２０分間）により除去し、上清を得
た。さらに、この上清に硫安を４５％飽和になるように
添加し、室温で３０分間攪拌した。次いて３０分間静置
した後、生した沈澱を遠心分離（７０００ｒ、ｐ、ｍ、
、２０分間）により回収した。回収した沈澱をｐＨ７の
リン酸緩衝液に熔解し、熔解後、１酸７７１ｚｔ７酸′
グ２″”を２°５１″／“））。
００ｒ、ｐ、ｍ、、２０分間）により除去し、上清を得
た。さらに、この上清に硫安を４５％飽和になるように
添加し、室温で３０分間攪拌した。次いて３０分間静置
した後、生した沈澱を遠心分離（７０００ｒ、ｐ、ｍ、
、２０分間）により回収した。回収した沈澱をｐＨ７の
リン酸緩衝液に熔解し、熔解後、１酸７７１ｚｔ７酸′
グ２″”を２°５１″／“））。
になるように添加し、実施例１と同様にして吸着、洗浄
、溶出を行った。溶出液はＩＮ塩酸でｐｔ＋７に調整し
た後、ヒト由来のＨＢｓ抗体を結合した七フアクリルＳ
−１０００に室温で１時間接触させることにより、ｙ
−ＩＩ １１ ｓ Ａ ｇを抗体カラムに吸着させた。
、溶出を行った。溶出液はＩＮ塩酸でｐｔ＋７に調整し
た後、ヒト由来のＨＢｓ抗体を結合した七フアクリルＳ
−１０００に室温で１時間接触させることにより、ｙ
−ＩＩ １１ ｓ Ａ ｇを抗体カラムに吸着させた。
次いでｙｌＩＢｓＡｇを吸着した抗体カラムを０．１５
Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７，ｓで洗浄した後、３Ｍチオン
アン酸アンモニウムにより溶出して、ｙ−１１ＢｓＡｇ
両分を得た。得られた）ＩＲｓｌ１ｇ両分は２０〜５５
％のシヨ糖密度勾配遠心分Ａｌｔ （４３，００Ｏｒ、
ｐ、ｍ、、 ２４時間）により、密度約１．２ｇ／ｃｍ
３の単一 ピークとして回収され、このピークと吸光度
のピークは一致しノこ。
Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７，ｓで洗浄した後、３Ｍチオン
アン酸アンモニウムにより溶出して、ｙ−１１ＢｓＡｇ
両分を得た。得られた）ＩＲｓｌ１ｇ両分は２０〜５５
％のシヨ糖密度勾配遠心分Ａｌｔ （４３，００Ｏｒ、
ｐ、ｍ、、 ２４時間）により、密度約１．２ｇ／ｃｍ
３の単一 ピークとして回収され、このピークと吸光度
のピークは一致しノこ。
回収したｙ −）ＩＢｓＡｇ画分ば、ｐ１１７のリン酸
緩衝液で透析した後、アジュバントとして水酸化アルミ
ニウムを加えてワクチンを得た。
緩衝液で透析した後、アジュバントとして水酸化アルミ
ニウムを加えてワクチンを得た。
ここで得られた精製ＨＢｓＡｇは、実施例１で得られた
精製ＨＢｓＡｇと全く同様の性状を示した。
精製ＨＢｓＡｇと全く同様の性状を示した。
実験例
本発明ワクチンの免疫原性を確かめるために、モルモッ
トの背部皮下に本発明ワクチンの段階希釈液を１回投与
した。モルモットは１群当り５匹を使用し、対照として
は、ｈ４１ＢｓＡｇの段階希釈液を投与した。どちらも
水酸化アルミニウムを加え、５週後に採血し、モルモッ
ト血清中の抗ＨＢ ｓ抗体価をＰＨΔ法で測定した。
トの背部皮下に本発明ワクチンの段階希釈液を１回投与
した。モルモットは１群当り５匹を使用し、対照として
は、ｈ４１ＢｓＡｇの段階希釈液を投与した。どちらも
水酸化アルミニウムを加え、５週後に採血し、モルモッ
ト血清中の抗ＨＢ ｓ抗体価をＰＨΔ法で測定した。
結果は第１図に示すように、本発明ワクチンの投与によ
り定量的な抗体産生が認められ、また平行線検定でｈ−
ＨＢｓＡｇに対する相対力価をめたとごろ、本発明ワク
チンの免疫原性はｈ −ＨＢｓＡｇの約４倍高い値を示
した。
り定量的な抗体産生が認められ、また平行線検定でｈ−
ＨＢｓＡｇに対する相対力価をめたとごろ、本発明ワク
チンの免疫原性はｈ −ＨＢｓＡｇの約４倍高い値を示
した。
なお図中、○はｙ −ＨＢｓＡｇを、・はｈ−１１８ｓ
Ａｇを示す。
Ａｇを示す。
第１図は、本発明ワクチンの免疫原性を調べた結果を示
すグラフである。 ○ ：ｙ−ＨＢｓＡｇ ・ ： ｈ−ＩＩＢｓＡＩＢ
すグラフである。 ○ ：ｙ−ＨＢｓＡｇ ・ ： ｈ−ＩＩＢｓＡＩＢ
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 遺伝子操作によって得られたＨＢｓＡｇを、微生物菌体
から抽出した後、次の■〜■を含む工程において精製す
ることを特徴とするＢ型肝炎ワクチンの製造方法。 ■溶解度差に基づく分画 ■コロイド珪酸塩による吸着 ■ＨＢｓ抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィ
ー ■密度勾配遠心分離 ■透析
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11518984A JPS60258127A (ja) | 1984-06-04 | 1984-06-04 | Ｂ型肝炎ワクチンの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11518984A JPS60258127A (ja) | 1984-06-04 | 1984-06-04 | Ｂ型肝炎ワクチンの製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60258127A true JPS60258127A (ja) | 1985-12-20 |
Family
ID=14656553
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11518984A Pending JPS60258127A (ja) | 1984-06-04 | 1984-06-04 | Ｂ型肝炎ワクチンの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60258127A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2600341A1 (fr) * | 1986-06-18 | 1987-12-24 | Univ Osaka Res Found | Procede de purification d'un produit d'expression genetique obtenu par technique d'adn recombinant |
| WO2004092393A1 (en) * | 2003-01-09 | 2004-10-28 | Genentech, Inc. | Purification of polypeptides |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5290620A (en) * | 1975-12-23 | 1977-07-30 | Merieux Inst | Novel medicine for treating acute or chronic infection by hepatisis virus b |
| JPS55136233A (en) * | 1979-04-11 | 1980-10-23 | Green Cross Corp:The | Hb peptide vaccine |
| JPS5610119A (en) * | 1979-07-05 | 1981-02-02 | Alpha Therapeutic Corp | Manufacture of b type hepatitis infection preventive vaccine |
| JPS56158718A (en) * | 1980-04-09 | 1981-12-07 | Nat Res Dev | Monoclonal antibody against hepatitis b virus |
| JPS5848856A (ja) * | 1981-09-17 | 1983-03-22 | Green Cross Corp:The | ＨＢｅＡｇに対する特異抗体の製法及びＨＢｅＡｇの検出試薬 |
| JPS58104887A (ja) * | 1981-12-14 | 1983-06-22 | インベンテイオ・アクテイエンゲゼルシヤフト | 油圧昇降機の制動ストツパ |
| JPS58180430A (ja) * | 1977-04-20 | 1983-10-21 | メルク・エンド・カムパニ−・インコ−ポレ−テツド | 肝炎ｂ核抗原 |
-
1984
- 1984-06-04 JP JP11518984A patent/JPS60258127A/ja active Pending
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5290620A (en) * | 1975-12-23 | 1977-07-30 | Merieux Inst | Novel medicine for treating acute or chronic infection by hepatisis virus b |
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| JPS5848856A (ja) * | 1981-09-17 | 1983-03-22 | Green Cross Corp:The | ＨＢｅＡｇに対する特異抗体の製法及びＨＢｅＡｇの検出試薬 |
| JPS58104887A (ja) * | 1981-12-14 | 1983-06-22 | インベンテイオ・アクテイエンゲゼルシヤフト | 油圧昇降機の制動ストツパ |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2600341A1 (fr) * | 1986-06-18 | 1987-12-24 | Univ Osaka Res Found | Procede de purification d'un produit d'expression genetique obtenu par technique d'adn recombinant |
| JPS63297A (ja) * | 1986-06-18 | 1988-01-05 | Handai Biseibutsubiyou Kenkyukai | 遺伝子発現産物の精製法 |
| WO2004092393A1 (en) * | 2003-01-09 | 2004-10-28 | Genentech, Inc. | Purification of polypeptides |
| US7169908B2 (en) | 2003-01-09 | 2007-01-30 | Genentech, Inc. | Purification of polypeptides |
| US7579448B2 (en) | 2003-01-09 | 2009-08-25 | Genentech, Inc. | Purification of microbial cell fermentation homogenates |
| AU2004230670B2 (en) * | 2003-01-09 | 2010-11-25 | Genentech, Inc. | Purification of polypeptides |
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