JP2721033B2 - プレ―ｓ ｂ型肝炎表面抗原の精製法に好適なコンプレックス - Google Patents

プレ―ｓ ｂ型肝炎表面抗原の精製法に好適なコンプレックス

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    • C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒトアルブミンが共有結合している不溶性
ポリマー担体、およびプレ−Ｓ Ｂ型肝炎表面抗原（プ
レ−Ｓ−HBsAg）からなるコンプレックス、並びにプレ
−Ｓ−HBsAgの精製方法に関するものである。
ヨーロッパ特許出願公開A2−0243103から、組換プレ
−Ｓ−HBsAgを発現している酵母細胞を破壊し、細胞内
容物からアフィニティークロマトグラフィーによってプ
レ−Ｓ−HBsAgを分離することからなる、プレ−Ｓ−HBs
Agの精製方法は知られている。マトリックスに共有結合
しているポリマー化ヒト血清アルブミン（ポリアルブミ
ン）は、プレ−Ｓ−HBsAgのための吸着剤として働く。
このポリアルブミンは、交差結合剤、例えばグルタルア
ルデヒドによって高分子形態で合成される生成物であ
る。プレ−Ｓ−HBsAgは、そのプレ−Ｓ（２）−領域に
よってポリアルブミンに吸着され、妨害物質を洗い流し
た後、マトリックスから溶離され、第２の精製工程に付
される。
効果的なポリアルブミン受容体はHBsAgのプレ−Ｓ領
域に存在し、それは55アミノ酸を含有するポリペプチド
からなり、Ｓ−領域のすぐ前の肝炎ウイルスDNAの断片
によってコードされている（“プレ−S2"）ことが明ら
かにされた（Valenzuela et al.,Bio/Technology Vol.
3:317−320,1985）。更に、Ｓ−領域については、この
すぐ前の領域（プレ−S2）と全プレ−Ｓ−領域（プレ−
S1）の両者が、Ｂ型肝炎ウイルス（HBV）が肝細胞の細
胞膜に結合するためのレセプターである表面タンパクを
コードしていることが証明された。
プレ−Ｓ領域を含有しているHBsAgは、1979年に、感
染したヒトの血漿から初めて得られ（Neurath and Stic
k,Arch.Virol.,60:79−81,1979）、後にバレンズエラ等
（Valenzuela et al.,Bio/Technology ３:317,1985およ
びNature 311:67,1984）およびパオレッティ等（Paolet
ti et al.,PNAS 81:193,1984）により、遺伝子工学によ
っても製造された。
次いで、種々の組換発現プレ−Ｓ−含有表面抗原が、
抗HBV抗体の産生を誘導するワクチンとして提示され
た。これらの抗体はウイルスのレセプターに対して導か
れ、肝細胞に対するその結合およびそれに随伴する感染
を妨げる。
ポリアルブミンを介するアフィニティークロマトグラ
フィーによる抗原の精製は、重合産生の製造において交
差結合剤を使用するために、グルタルアルデヒドの様な
不純物、更には毒性物質されも、溶出液に導入されると
いう欠点を有している。
この難点を排除し、プレ−Ｓ−HBsAgのアフィニティ
ークロマトグラフィー精製を迅速かつ効果的に行い得る
だけでなく、治療および診断目的への新規な適用を呈示
するコンプレックスを提供することが、本発明の目的で
ある。
本発明のコンプレックスは、モノマーヒトアルブミン
が共有結合している、とりわけアガロースまたはデキス
トランをベースとする不溶性ポリマー担体、およびその
プレ−Ｓ（２）−および／またはプレ−Ｓ（１）−領域
によってモノマーヒトアルブミンに溶離可能な形態で結
合しているプレ−Ｓ Ｂ型肝炎表面抗原を含有してな
る。
本発明によって、プレ−Ｓ−HBsAgは、モノマーヒト
アルブミンが担体に共有結合している場合のみ、アフィ
ニティークロマトグラフィー精製に十分な程度にモノマ
ーヒトアルブミンとコンプレックス形成するということ
が見いだされた。アルブミンが単に吸着によって結合す
る場合、プレ−Ｓ−HBsAgは、全くまたは非常にわずか
しかアルブミンとコンプレックス形成し得ないので、ア
フィニティークロマトグラフィー精製は可能ではないで
あろう。本発明のコンプレックスのその他の利点は、プ
レ−Ｓ−HBsAgは容易に溶離することができ、従ってタ
ンパクをより穏やかな方法およびより高収率で回収する
ことができるという点にある。
モノマーヒトアルブミンが共有結合している不溶性ポ
リマー担体は、本発明のコンプレックスの製造に必要で
ある。従って、この不溶性ポリマー担体も、本発明の範
囲に包含される。本発明の不溶性ポリマー担体を製造す
るためには、タンパクと共有結合し得るいずれのポリマ
ーも、適当に活性化させて、使用することができる。以
下の担体物質を使用することができる： −ポリアミドおよびビニルポリマーの様な有機ポリマー
類（ポリアクリルアミド、ポリスチレンおよびポリビニ
ルアルコール類およびそれらの誘導体）、および −セルロース、デキストラン、アガロース、キチンおよ
びポリアミノ酸の様な天然のポリマー類、および −シリカゲル、ガラスおよび水酸化金属の様な無機ポリ
マー類。
これらの担体物質は、例えばモレキュラーシーブとして
粒子形態で、または膜形態で、または例えばマイクロタ
イタープレートとしてプレートの形態で使用することが
できる。
不溶性ポリマー担体は、アガロースまたはデキストラ
ンをベースとするのが好ましい。
本発明のコンプレックスは、担体が膨潤状態で（例え
ばアフィニティー樹脂として）存在する水相、および凍
結乾燥状態（例えば膜またはマイクロタイタープレート
として）の両者で長期間貯蔵可能である。凍結乾燥は、
グリシンまたはグルコースを含有している揮発性緩衝液
中で行われるのが好ましい。
プレ−Ｓ−HBsAgは、本発明によって、コンプレック
スから高純度で単離することができる。本発明はまた、
診断薬、およびＢ型肝炎に対する能動免疫のためおよび
この様なワクチンで免疫したドナーの特異的免疫グロブ
リンを得るための両者に適用可能なワクチンの製造のた
めの、本発明のコンプレックスの用途に関するものであ
る。
本発明の担体は、Ｂ型肝炎表面抗原の水溶液を担体と
接触させることにより、簡単な方法でプレ−Ｓ Ｂ型肝
炎表面抗原を負荷することができ、肝炎表面抗原のプレ
−Ｓ−含有画分はアルブミン分子に選択的に吸着され
る。
本発明のコンプレックスを使用することによるプレ−
Ｓ Ｂ型肝炎表面抗原の精製方法は、 −コンプレックスを緩衝液で洗浄して、存在し得る不純
物を除去し、 −モノマーヒトアルブミンに選択的に吸着されているプ
レ−Ｓ Ｂ型肝炎表面抗原をカオトロピック物質、例え
ば尿素、塩酸グアニジン、チオシアネート、塩化カリウ
ム、塩化マグネシウムまたはヨウ化カリウムを含有して
いる溶離剤でコンプレックスを処理するか、または界面
活性剤でコンプレックスを処理するか、またはpH調節剤
でコンプレックスを処理することによって解離させて回
収し、必要に応じ、第２の精製工程を行うことを特徴と
する。
本発明方法の好ましい実施態様は、イオン性界面活性
剤、とりわけデスオキシコール酸ナトリウムおよびタウ
ロデスオキシコール酸、または両性イオン性界面活性
剤、とりわけ３［（３−コールアミドプロピル）−ジメ
チル−アンモニオ］−１−プロパンスルホネートおよび
３［（３−コールアミドプロピル）−ジメチル−アンモ
ニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート、
または非イオン性界面活性剤、とりわけオクチル グル
コピラノシド類を、界面活性剤として使用することがで
きる。
これらの界面活性剤を使用する時、溶離されたプレ−
Ｓ−HBsAgの４次構造は影響されないということがわか
った。
溶離後の第２の精製工程は、ゲル濾過、超遠心、疎水
クロマトグラフィー、レクチンアフィニティークロマト
グラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーを含む
のが好ましい。これらのいずれの精製工程も、90％以上
の純度でプレ−Ｓ−HBsAgを与える。
以下に、本発明をより詳細に説明する： プレ−Ｓ−HBsAgは、プレ−Ｓ−HBsAgの遺伝情報を有
する組換ワクシニアウイルスから発現させることができ
る。この方法は、文献に記載されている（モス等（Moss
et al.,Nature 311:67（1984））。
先ず、vero細胞を1PFU/細胞で感染させることによっ
て、組換ワクシニアウイルスの高力価ウイルスストック
を調製した。37℃で２〜３日間インキュベートした後、
感染細胞を培地に振り入れ、5,000gで20分間遠心するこ
とによってペレット化する。上清を除去し、４℃で貯蔵
する。細胞をPBSで３回洗浄し、その後、トリプシンの
終濃度が0.025重量％に達するまで、細胞懸濁液にトリ
プシン溶液を加える。その後、懸濁液を37℃で30分間穏
やかに攪拌し、上清とともにプールし、アンプルに分注
し、−80℃で凍結させる。この方法によって、ウイルス
力価は、細胞培地で通常得られる力価と比較して約10倍
上昇する。
６−リットルの発酵槽に接種し得る十分量の細胞を調
製するために、プラスチック製ラウクス・アンド・ロー
ラー（Roux and Roller）びん（Nunc）中で細胞を継代
接種することによりvero細胞接種物を調製し、次いで、
これを40−リットル容器用接種物として使用する。この
ために、まず、一定の継代数のvero細胞のアンプル１本
を解凍し、継代して、全面成長したローラーびん12本を
得る。
細胞をトリプシン処理し、５重量％のウシ胎児血清を
加えた199培地に再懸濁し、マイクロキャリヤー（Cytod
ex 3,Pharmacia）の懸濁液と混合し、発酵槽に入れて、
１リットル当たり２×108個細胞および5gマイクロキャ
リヤーの終濃度を得る。この段階で、更に培地を最終発
酵容量の３分の１量加える。
懸濁液を穏やかに攪拌しながら、細胞を３時間マイク
ロキャリヤーに付着させる。この後、最終発酵容量を得
るために、更に培地（５重量％ウシ胎児血清含有DMEM）
を加える。８×108／リットルの細胞密度に達したらす
ぐに、DMEM（５重量％ウシ胎児血清含有）の連続注入を
開始する。約５×109／リットルの細胞密度に達した
ら、マイクロキャリヤーをトリプシン処理し、細胞およ
びマイクロキャリヤーを、１リットル当たり更に5gのマ
イクロキャリヤーを含有する40−リットル発酵槽に入れ
る。吸着したら、発酵槽を40リットル容量まで満たし、
前記と同様にして培養を続ける。
５×109／リットルの細胞密度に達したら、マイクロ
キャリヤーが沈殿した後、培地を除去する。組換微生物
を含有している培地５リットルを発酵槽に入れ、組換細
胞１個当たり約2PFUのm.o.i.−値を得る。ウイルスの吸
着後、発酵槽に、40リットル容量まで199培地（５重量
％ウシ胎児血清含有）を満たし、同一培地40リットルを
40時間かん流させる。この後、約80％の細胞をマイクロ
キャリヤーから剥離させ、培地と共に取り出す。
まだマイクロキャリヤーに付着している残存細胞を、
急速攪拌下、培地で洗浄することによってそれから剥離
させて取り出し、最初の画分と一緒にプールする。マイ
クロキャリヤーを70mymふるいによって除去する。Beckm
ann JFC−Ｚ連続流ローターで遠心することによって、1
6,000gで細胞をペレット化する。ペリコン・システム
（Pellikon system,Millipore−Waters）で限外濾過す
ることによって、培地を濃縮する。この濃縮培地に、8M
溶液に調節されるまで尿素を加える。この溶液を透析す
る。
濃縮されたvero細胞上清を、ヒト血清アルブミンが共
有結合している不溶性ポリマー担体物質を充填したカラ
ムに加える。カップリング法は、担体の化学的特性に依
存することが知られている。セファロースを使用する場
合、CNBrで活性化し、例えば、その後、モノマーヒト血
清アルブミンをこの活性化セファロースとカップリング
させる。
カラムを、0.2M酢酸ナトリウム（pH4.0）および0.5M
NaClからなる緩衝液１、0.1Mトリス（pH8.0）および0.5
M NaClからなる緩衝液２、8M尿素からなる溶液３、最後
に0.02Mトリス（pH7.4）からなる緩衝液３で洗浄した
後、カラムにvero細胞上清を負荷する。上清がカラムに
吸着されたらすぐに、0.02Mトリス（pH7.4）およひ0.5M
NaClからなる緩衝液４で洗浄し、吸着されなかったタ
ンパクをカラムから除去する。吸着されたプレ−Ｓ
（２）−HBsAgを、pH6〜約８の緩衝液４（１〜約4M、好
ましくは3M）中チオシアン酸ナトリウム、好ましくはpH
7（緩衝液５）中のチオシアン酸ナトリウム、または緩
衝液４中8M尿素、好ましくは4M尿素（緩衝液６）で溶離
させる。本発明のこの分離法とモノマーヒトアルブミン
によって、プレ−Ｓ−HBsAgは145−倍濃縮される。その
同一性を、イムノブロッティング法（Burnette,Anal.Bi
ochem.,112,195,1981）および銀染色したポリアクリル
アミドゲル（銀染色法;Morrissey,Anal.Biochem.,117,3
07,1981）によって調べると、純度は少なくとも80％に
達する。
プレ−Ｓ（２）−HBsAgは、例えばセファロース（フ
ァルマシア）でゲル濾過することによって、更に精製す
ることができる。上で得た画分を、0.02Mトリス（pH7）
からなる緩衝液に対して透析し、0.02Mトリス（pH7）で
活性化したセファロースカラムに負荷する。プレ−Ｓ−
HBsAgの純度は、銀染色法およびイムノブロッティング
法によって、90％以上であると示される。
以下の例示態様によって、本発明の方法の実施を更に
説明する。
実施例１ モノマーヒトアルブミンアフィニティークロ
マトグラフィーによるプレ−Ｓ（２）−HBsAgの精製 モス等（Moss et al.,Nature 311:67,1984）によって
記載された方法を使用し、プレ−Ｓ（２）−HBsAgのた
めの遺伝情報を有する組換ワクシニアウイルスを得た。
前記と同様にして、組換ワクシニアウイルスの高力価ス
トックを調製した。組換ウイルスで感染させるためのve
ro細胞を、前記と同一条件下で増殖させた。プレ−Ｓ
（２）−HBsAgを有する濃縮および透析した培地を前記
の方法で得た。
製造業者の指示に従ってCNBr−活性化したセファロー
ス4B（ファルマシア）に、モノマーヒトアルブミンを共
有結合させた。その後、カラムに50ml容量のマトリック
スを充填し、緩衝液１（500ml）、緩衝液２（500ml）、
緩衝液３（500ml）、最後に緩衝液４（500ml）で洗浄し
た。
不純物を除去したvero細胞上清は、タンパク8500mgお
よびプレ−Ｓ（２）−HBsAg95mgを含有しており、調製
したカラムに100ml/時の流速で注入した。総量をカラム
に入れた時点で、緩衝液４を用い、吸着されなかったタ
ンパクをカラムから洗い流した。プレ−Ｓ（２）−HBsA
gを3Mチオシアン酸ナトリウム、pH7（緩衝液５）で溶離
させた。ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、銀染色法
およびイムノブロッティング法によって同定および純度
の分析を行った。
カラムから溶出した画分の２回分を、２重量％ドデシ
ル硫酸ナトリウム（SDS）、0.125Mトリス−HCl（pH6.
8）および100mMジチオスレイトールからなる緩衝液中、
100℃で15分間インキュベートした。この試料を、12.5
重量％ポリアクリルアミド分離用ゲルにて、65mA/ゲル
で2.5時間電気泳動した（ラエムリ（Laemmli,Nature 22
7:680,1971））。１組のゲル試料を硝酸銀で染色し、ポ
リペプチドを可視化した。他の組の試料を、ウサギ抗血
清を使用し、イムノブロッティングすることによって検
定した。
溶出画分は、タンパク42mgおよびプレ−Ｓ（２）−HB
sAg68mgを含有した。従って、プレ−Ｓ（２）−HBsAgの
145−倍の濃縮が達成された。
以下の実施例２および３によって、実施例１で得た画
分の２次精製を説明する。
実施例２ 実施例１に従って得たプレ−Ｓ（２）−HBsAg−含有
溶液を、セファロース4B（ファルマシア）カラムクロマ
トグラフィーによって更に精製した。まず、カラムを調
製し、0.02Mトリス（pH7.0）500mlにて30ml/時の流速で
洗浄した。プレ−Ｓ（２）−HBsAg含有溶液をこの緩衝
液に対して透析し、6.2mgタンパク/12ml以外に10mg/12m
lの濃度で存在している透析した抗原をカラムに加え
た。カラムを0.02Mトリス（pH7.0）で活性化すると、溶
出したプレ−Ｓ（２）−HBsAg−含有画分はタンパク4.8
mgおよびプレ−Ｓ（２）−HBsAg8.2mgを含有した。実施
例１に記載の方法で行ったポリアクリルアミドゲルの銀
染色およびイムノブロッティングから、プレ−Ｓ（２）
−HBsAgの純度は90％より大きいことがわかった。
実施例３ 実施例１に従って得たプレ−Ｓ（２）−HBsAg−含有
溶液を、レンチル−リクチン セファロース4B（ファル
マシア）カラムクロマトグラフィーによって更に精製し
た。まず、カラムを調製し、0.02Mトリス（pH7.0）100m
lにて50ml/時の流速で洗浄した。プレ−Ｓ（２）−HBsA
g−含有溶液をこの緩衝液に対して透析し、13mgタンパ
ク/25ml以外に21mg/25mlの濃度で存在している透析した
抗原を25ml/時の流速でカラムに負荷した。この後、吸
着されなかった物質をトリス緩衝液で洗い流し、プレ−
Ｓ（２）−HBsAgを、５重量％アルファ−メチルマンノ
シド含有トリス緩衝液で溶離した。溶出液は、タンパク
9.1mgおよびプレ−Ｓ（２）−HBsAg15.6mgを含有した。
実施例１の記載と同様にしてポリアクリルアミドゲルの
銀染色およびイムノブロッティングを行い、プレ−Ｓ
（２）−HBsAgの純度は90％より大きいことがわかっ
た。
プレ−Ｓ（２）−領域、またはプレ−Ｓ（２）−およ
びプレ−Ｓ（１）−領域の代わりにプレ−Ｓ（１）−領
域を有するＢ型肝炎表面抗原の精製は、前記実施態様と
同様にして行われる。本発明の方法は事実上、HBsAgの
プレ−Ｓ（１）−および／またはプレ−Ｓ（２）−領域
を担持しているいずれのタンパクを精製するためにも使
用することができる。
以下の実施例４〜６によって、種々の担体物質および
形態の使用、および要求される使用目的にかなうカップ
リング法を説明する。
実施例４ ケイ酸塩担体へのモノマーヒトアルブミンの
カップリング 使用し得る担体は、シリカゲルまたはガラスマイクロ
ビーズ（制御された孔を有するガラスビーズ＝CPG）で
ある。
アミノ化ガラス担体（アミノプロピルCPG,Pierce）10
gを、2.5％グルタルアルデヒド水溶液100mlと一緒に室
温で４時間振盪する。活性化したら、担体を脱イオン水
で十分洗浄し、アルデヒドを除去する。この様にして活
性化した担体を0.1Mリン酸緩衝液（pH8.0）中のヒト血
清アルブミン200mgと共に１時間インキュベートする。1
Mエタノールアミンでブロックしてリン酸緩衝液で十分
洗浄した後、担体はいつでも使用することができる。
プレ−Ｓ（２）−HBsAg−含有細胞培養上清200ml（プ
レ−Ｓ（２）−HBsAg11mg、タンパク950mg）をアフィニ
ティー担体10mlと共に14℃で２時間インキュベートす
る。焼結吸引フィルター上、緩衝液で洗浄することによ
って、結合しなかったタンパクを除去し、特異的に結合
したプレ−Ｓ（２）−HBsAgを、8M尿素溶液10ml中で、
充填された担体をインキュベートすることによって溶離
させる。この検定によって、高純度のプレ−Ｓ（２）−
HBsAg6.8mgを、全タンパク量5.4mgで得た（Bradfordに
よる試験法）。
実施例５ 膜へのモノマーヒトアルブミンのカップリン
グ 例えばナイロン、ポリビニリデンジフルオライドまた
はセルロースポリアクリルアミド混合ポリマーの様な膜
は、使用し得る担体である。ナイロン膜（例えば、Zeta
bind,CUNO）を、HCl/H2O中でインキュベートすることに
よって、部分加水分解する。解放されたアミノ基を、0.
1Mシアノホウ水素化ナトリウムの存在下、pH7で、1Mオ
キサルジアルデヒドと２時間反応させる。脱イオン水で
洗浄後、ヒト血清アルブミン（10mg/ml0.1Mリン酸緩衝
液、pH7）を、0.1Mシアノホウ水素化ナトリウムの存在
下、反応性アルデヒド基で活性化したこの膜にカップリ
ングさせる。1Mエタノールアミンの添加によって、過剰
の反応性基をブロックする。リン酸緩衝液（0.1M;pH8）
で洗浄後、プレ−Ｓ（２）−含有タンパクと選択的に結
合させるためにこの膜を使用することができる。
この様にして調製した膜の結合力は、５〜10mygプレ
−Ｓ（２）−HBsAg/cm2である。
実施例６ マイクロタイタープレートへのモノマーヒト
アルブミンのカップリング この目的のために、例えばアミノ−プレート（Amino
−Plate,1級アミノ基を含有する）またはカルボ−プレ
ート（Carbo−Plate,カルボキシル基を含有する）（Nis
sho Iwai Corp.,TOKYO）の様な機能化されたポリスチレ
ンプレートまたは同様の物質を使用することができる。
Ｎ−エトキシカルボニル−２−エトキシ−1,2−ジヒ
ドロ−キノリンの溶液（50％エタノール水溶液中40mM）
200mylを、96−ウエルマイクロタイタープレートの各ウ
エルにピペットで入れ、２時間40℃でインキュベートす
る。エタノールおよび脱イオン水で注意深く洗浄した
後、ヒト血清アルブミンの１％水溶液200mylを各々ウエ
ルにピペット注入し、＋４℃で一夜インキュベートす
る。1Mエタノールアミンまたは1M酢酸緩衝液pH4でブロ
ックし、次いで洗浄した後、プレートはいつでも使用す
ることができる。
プレ−Ｓ（２）−HBsAg−含有細胞培養上清100myl
を、調製したマイクロタイタープレートに漸増希釈率で
ピペット注入し、＋４℃で２時間インキュベートする。
緩衝液で洗浄後、既知のELISA法に従い、酵素標識した
抗−プレ−Ｓ（２）−HBsAg（モノクローナル抗体）と
共にインキュベートし、基質を添加して、既知の吸収ス
ペクトル法により、プレ−Ｓ（２）−タンパクの結合割
合を調べる。
マイクロタイタープレートに、SH−変性させたプレ−
Ｓ（２）−HBsAgまたは合成プレ−Ｓ（２）−ペプチド
を負荷した場合は、抗−プレ−Ｓ（２）−抗体（例えば
患者の血清由来）を検定するために、この様にして処理
したプレートを使用することができる。
リン酸緩衝液（0.1M;pH7.0）10ml中のプレ−Ｓ（２）
−HBsAg10mgを、10％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）中
のメルカプトエタノール100mylと共に５分間、100℃で
インキュベートする。この間に、HBsAgの免疫学的に活
性なＳ−抗原は破壊される（ミリッチ等（Milich D.R.e
t al.,Enhanced Immunogenicity of the Pre−Ｓ−Regi
on of Hepatitis B Surface Antigen,Science 227:1195
−1199（1985））。ヨウドアセトアミド500mgで１時
間、SH−基をブロックした後、過剰量の反応生成物を透
析によって除去し、プレ−Ｓ（２）−抗原をリン酸緩衝
液（pH7.4）で100mygタンパク/mlに希釈する。
調製したHSAマイクロタイタープレートをこのプレ−
Ｓ（２）溶液で被覆し、次いで洗浄する。この様にして
調製したプレートは、乾燥状態でも貯蔵することができ
る。
抗−プレ−Ｓ（２）−含有ウサギ血清100mylを漸増希
釈率で各々ウエルにピペット注入する。＋４℃で一夜イ
ンキュベートした後、結合したプレ−Ｓ（２）−抗体
を、酵素標識した抗ウサギ血清と共にインキュベート
し、次いで基質を加えることにより、吸収スペクトルに
よって検定する。
実施例７ 種々のアルブミン担体コンプレックスを使用
した時のプレ−Ｓ（２）−HBsAgの結合能力および収率 ヒト血清アルブミン（HSA）およびポリマー化ヒト血
清アルブミン（ポリ−HSA）を共有結合的に、また吸着
結合的に、比較するのに適当な量で種々の担体物質に結
合させた。溶離後、プレ−Ｓ（２）−HBsAgの結合能力
および収率を、HBsAg−特異的ELISA法によって調べた。
結果を以下の表に示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 17/10 Ｃ０７Ｋ 17/10 (56)参考文献 特開 昭61−43991（ＪＰ，Ａ) 米国特許4855055（ＵＳ，Ａ) 西独国特許出願公開2530247（ＤＥ, Ａ)

Claims (14)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】モノマーヒトアルブミンが共有結合してい
    る不溶性ポリマー担体、およびプレ−Ｓ（２）−領域お
    よびプレ−Ｓ（１）−領域を有し、該プレ−Ｓ（２）−
    領域および該プレ−Ｓ（１）−領域の少なくとも一方に
    よって該モノマーヒトアルブミンに結合しているプレ−
    Ｓ Ｂ型肝炎表面抗原からなるコンプレックス。
  2. 【請求項２】該不溶性ポリマー担体が、アガロースおよ
    びデキストランからなる群から選択される物質をベース
    とする請求項１に記載のコンプレックス。
  3. 【請求項３】モノマーヒトアルブミンが共有結合してい
    る不溶性ポリマー担体、およびプレ−Ｓ（２）−領域お
    よびプレ−Ｓ（１）−領域を有し、該プレ−Ｓ（２）−
    領域および該プレ−Ｓ（１）−領域の少なくとも一方に
    よって該モノマーヒトアルブミンに結合しているプレ−
    Ｓ Ｂ型肝炎表面抗原からなるコンプレックスを使用す
    ることによるプレ−Ｓ Ｂ型肝炎表面抗原の精製方法で
    あって、 該コンプレックスを緩衝液で洗浄して、存在し得る不純
    物を除去し、 該コンプレックスを解離させて、該プレ−Ｓ Ｂ型肝炎
    表面抗原を回収することからなる精製方法。
  4. 【請求項４】該コンプレックスをカオトロピック物質含
    有溶離剤で処理することによって該プレ−Ｓ Ｂ型肝炎
    表面抗原を回収する請求項３に記載の方法。
  5. 【請求項５】該カオトロピック物質が尿素、塩酸グアニ
    ジン、チオシアネート、塩化カリウム、塩化マグネシウ
    ムおよびヨウ化カリウムからなる群から選択される請求
    項４に記載の方法。
  6. 【請求項６】該コンプレックスを界面活性剤で処理する
    ことによって該プレ−Ｓ Ｂ型肝炎表面抗原を回収する
    請求項３に記載の方法。
  7. 【請求項７】該コンプレックスをpH調節剤で処理するこ
    とによって該プレ−Ｓ Ｂ型肝炎表面抗原を回収する請
    求項３に記載の方法。
  8. 【請求項８】更に第２の精製工程を含む請求項３に記載
    の方法。
  9. 【請求項９】該界面活性剤がイオン性界面活性剤、両性
    イオン性界面活性剤および非イオン性界面活性剤からな
    る群から選択される請求項６に記載の方法。
  10. 【請求項１０】該イオン性界面活性剤がデスオキシコー
    ル酸ナトリウムおよびタウロデスオキシコール酸からな
    る群から選択される請求項９に記載の方法。
  11. 【請求項１１】該両性イオン性界面活性剤が３［（３−
    コールアミドプロピル）−ジメチル−アンモニオ］−１
    −プロパンスルホネートおよび３［（３−コールアミド
    プロピル）−ジメチル−アンモニオ］−２−ヒドロキシ
    −１−プロパンスルホネートからなる群から選択される
    請求項９に記載の方法。
  12. 【請求項１２】該非イオン性界面活性剤がオクチル グ
    ルコピラノシドである請求項９に記載の方法。
  13. 【請求項１３】該第２の精製工程が、ゲル濾過、超遠
    心、疎水クロマトグラフィー、レクチンアフィニティー
    クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィ
    ーからなる群から選択される工程を含む請求項８に記載
    の方法。
  14. 【請求項１４】請求項１に記載のコンプレックスを使用
    することを特徴とする、Ｂ型肝炎に対する能動免疫に適
    したワクチンの製造方法。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4515714A (en) * 1983-03-09 1985-05-07 Juridicial Foundation, The Chemo-Semo-Sero-Therapeutic Research Institute Method for purification of hepatitis B virus surface antigen
EP0174444B1 (en) * 1984-06-18 1992-03-11 Chiron Corporation Hepatitis surface antigen particle vaccine
JPS6137738A (ja) * 1984-07-31 1986-02-22 Tetsuo Nakamura Ｂ型肝炎ワクチン
EP0243103B1 (en) * 1986-04-25 1992-12-30 Merck & Co. Inc. Purification of pre-s hbsag by polymerized serum albumin affinity binding

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2530247A1 (de) 1974-07-11 1976-01-29 Yeda Res & Dev Wasserunloesliche proteinpraeparate und deren herstellung
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