JPH0762033B2 - Ｂ型肝炎ワクチン - Google Patents
Ｂ型肝炎ワクチンInfo
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- JPH0762033B2 JPH0762033B2 JP61500430A JP50043086A JPH0762033B2 JP H0762033 B2 JPH0762033 B2 JP H0762033B2 JP 61500430 A JP61500430 A JP 61500430A JP 50043086 A JP50043086 A JP 50043086A JP H0762033 B2 JPH0762033 B2 JP H0762033B2
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- JP
- Japan
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- leu
- antibody
- thr
- polypeptides
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はヒト肝癌細胞系由来の細胞株huGK-14を無血清
培地で培養しその培養液から分離精製して得られるＢ型
肝炎ウイルス表面抗原（以下HBs抗原という）およりこ
れを有効成分として含有するＢ型肝炎ワクチンに関す
る。
培地で培養しその培養液から分離精製して得られるＢ型
肝炎ウイルス表面抗原（以下HBs抗原という）およりこ
れを有効成分として含有するＢ型肝炎ワクチンに関す
る。
従来の技術 Ｂ型肝炎は、日本を含む極東、東南アジア、アフリカに
おいて多発しているウイルス性疾患である。欧米におい
ても検出されるがその割合は比較的小さい。この病気の
原因はＢ型肝炎ウイルス（以下HBVまたはHBウイルスと
いう）であり、抗原決定基により４つ（adw,adr,ayw,aw
r）のサブタイプに分類される。日本で検出されるのはa
dr型とadw型であり、特にadr型が多いとされている。欧
米ではayw型とadw型が多い。
おいて多発しているウイルス性疾患である。欧米におい
ても検出されるがその割合は比較的小さい。この病気の
原因はＢ型肝炎ウイルス（以下HBVまたはHBウイルスと
いう）であり、抗原決定基により４つ（adw,adr,ayw,aw
r）のサブタイプに分類される。日本で検出されるのはa
dr型とadw型であり、特にadr型が多いとされている。欧
米ではayw型とadw型が多い。
HBウイルスは、生成物、分子生物学および免疫学的研究
から次第にその構造と機能が明らかにされてきている。
感染者の血液には完全なDNA型ウイルスの構造を持ったD
ane粒子と呼ばれる直径42nmの球形粒子、直径22nm前後
の小型球形粒子および管状粒子が見られる。Dane粒子の
脂質を含むエンベロープはHBs抗原を持ち、内側にはコ
ア抗原とHBs抗原さらには遺伝情報を担うDNA（長鎖、短
鎖）とDNAポリメラーゼを含んでいる。
から次第にその構造と機能が明らかにされてきている。
感染者の血液には完全なDNA型ウイルスの構造を持ったD
ane粒子と呼ばれる直径42nmの球形粒子、直径22nm前後
の小型球形粒子および管状粒子が見られる。Dane粒子の
脂質を含むエンベロープはHBs抗原を持ち、内側にはコ
ア抗原とHBs抗原さらには遺伝情報を担うDNA（長鎖、短
鎖）とDNAポリメラーゼを含んでいる。
HBs抗原を構成するタンパクは、HBV-DNAのＳ遺伝子と、
そのＳ遺伝子の上流に同一フレームで位置するpre-S（p
re-S1,pre-S2）遺伝子にコードされるポリペプチドより
なる。
そのＳ遺伝子の上流に同一フレームで位置するpre-S（p
re-S1,pre-S2）遺伝子にコードされるポリペプチドより
なる。
1970年頃から、HBs抗原に対する抗体がそのウイルス感
染の防御になると考えられることから（文献１〜４）HB
s抗原を精製してワクチンを生産しようとする試みが盛
んに行われるようになった。また1982年頃から、pre-S
遺伝子のコードするポリペプチドについてもワクチン効
果を高める可能性があるとして研究が始まった。
染の防御になると考えられることから（文献１〜４）HB
s抗原を精製してワクチンを生産しようとする試みが盛
んに行われるようになった。また1982年頃から、pre-S
遺伝子のコードするポリペプチドについてもワクチン効
果を高める可能性があるとして研究が始まった。
これらの研究開発は、1980年頃迄は主として感染者の血
液を原料としてHBs抗原を精製する方法で行われ、アメ
リカ、フランスに続いて日本でも1984年に血液由来のHB
s抗原がＢ型肝炎の予防ワクチンとして初めて認可され
た（文献５）。1980年頃からは分子生物学の進展を基盤
として、専ら組換えDNA法を用いたHBs抗原の研究開発に
目が向けられるようになった。現在迄に４つのサブタイ
プのうち既に３つのサブタイプ（ayw,adw,adr）につい
てHBVのDNAの全一次構造が決定されている（文献６〜
８）。
液を原料としてHBs抗原を精製する方法で行われ、アメ
リカ、フランスに続いて日本でも1984年に血液由来のHB
s抗原がＢ型肝炎の予防ワクチンとして初めて認可され
た（文献５）。1980年頃からは分子生物学の進展を基盤
として、専ら組換えDNA法を用いたHBs抗原の研究開発に
目が向けられるようになった。現在迄に４つのサブタイ
プのうち既に３つのサブタイプ（ayw,adw,adr）につい
てHBVのDNAの全一次構造が決定されている（文献６〜
８）。
また一方では、細胞工学的手法を用いて、HBs抗原を産
生するヒト肝癌細胞を培養しその培養液からHBs抗原を
分離精製することが行われている（文献９）。
生するヒト肝癌細胞を培養しその培養液からHBs抗原を
分離精製することが行われている（文献９）。
発明が解決しようとする問題点。
しかしながらHBs抗原の量産は非常に困難であるとされ
ていた。まずHVBはヒトやチンパンジーにしか感染せず
他の動物や培養細胞に感染しない。このために主に不顕
性感染者（キャリアー）の血液を原料としてこれらのHB
s抗原を精製するわけであるが、ヒト感染者から採取で
きる量は限られており到底需要を満たすには至らない。
また血液中の夾雑物やウイルス等の混入を100％防止す
るための特別の配慮が必要である。
ていた。まずHVBはヒトやチンパンジーにしか感染せず
他の動物や培養細胞に感染しない。このために主に不顕
性感染者（キャリアー）の血液を原料としてこれらのHB
s抗原を精製するわけであるが、ヒト感染者から採取で
きる量は限られており到底需要を満たすには至らない。
また血液中の夾雑物やウイルス等の混入を100％防止す
るための特別の配慮が必要である。
そこで組換えDNA法を用いて大腸菌や酵母を宿主とした
形質転換体を得、所望のHBs抗原を量産する研究が盛ん
に行なわれている。これらの研究の成果については数多
くの報告があるが（文献10〜14）、同時に新しい問題点
も明らかにされてきた。例えば大部分の宿主において
は、HBs抗原をコードするDNAの発現はかなり小さいもの
とされている（文献13）。大腸菌を宿主とした場合には
HBs抗原は菌体内で壊れ易い性質のものであり、また産
生するHBs抗原によって大腸菌の増殖が困難になるとの
報告がある（文献14）。酵母を宿主とした場合について
も発現はかなり少ないほか、分離精製が難しく所望量の
HBs抗原の生産は難しいとされている。更に大腸菌や酵
母細胞から抽出されるHBs抗原は免疫原性が低いとの指
摘がある（文献15,16）。
形質転換体を得、所望のHBs抗原を量産する研究が盛ん
に行なわれている。これらの研究の成果については数多
くの報告があるが（文献10〜14）、同時に新しい問題点
も明らかにされてきた。例えば大部分の宿主において
は、HBs抗原をコードするDNAの発現はかなり小さいもの
とされている（文献13）。大腸菌を宿主とした場合には
HBs抗原は菌体内で壊れ易い性質のものであり、また産
生するHBs抗原によって大腸菌の増殖が困難になるとの
報告がある（文献14）。酵母を宿主とした場合について
も発現はかなり少ないほか、分離精製が難しく所望量の
HBs抗原の生産は難しいとされている。更に大腸菌や酵
母細胞から抽出されるHBs抗原は免疫原性が低いとの指
摘がある（文献15,16）。
当初、組換えDNA法を用いた研究における宿主として酵
母を選択することは、抗原を生産するのに最も適したも
のと思われていたが、生産された抗原は免疫原性が低い
ことから、その活性はかなりの部分宿主に依存している
ように考えられるようになってきた。例えば糖鎖の付加
はその免疫原性に影響があるとの見方が強まった。そし
て例数は少ないが、抗原性を持つポリペプタイドをコー
ドしているDNAを含む発現ベクターを用いて動物細胞の
培養サイクルに合わせて感染・発現させる方法（文献1
7）および抗原性を持つポリペプタイドをコードするDNA
を哺乳動物細胞に組込んで発現させる研究が注目されて
きている（文献18）。前者の場合産生方法が複雑であ
り、HBs抗原の生産量も高くない。後者の場合も組換え
体の維持が難かしく、産生量も到底所望量には達してい
るとは言えない（文献17,18）。またいずれの場合も細
胞培養に充分な血清を必要とすることから大量培養には
コストがかかりすぎる欠点がある。
母を選択することは、抗原を生産するのに最も適したも
のと思われていたが、生産された抗原は免疫原性が低い
ことから、その活性はかなりの部分宿主に依存している
ように考えられるようになってきた。例えば糖鎖の付加
はその免疫原性に影響があるとの見方が強まった。そし
て例数は少ないが、抗原性を持つポリペプタイドをコー
ドしているDNAを含む発現ベクターを用いて動物細胞の
培養サイクルに合わせて感染・発現させる方法（文献1
7）および抗原性を持つポリペプタイドをコードするDNA
を哺乳動物細胞に組込んで発現させる研究が注目されて
きている（文献18）。前者の場合産生方法が複雑であ
り、HBs抗原の生産量も高くない。後者の場合も組換え
体の維持が難かしく、産生量も到底所望量には達してい
るとは言えない（文献17,18）。またいずれの場合も細
胞培養に充分な血清を必要とすることから大量培養には
コストがかかりすぎる欠点がある。
一方ヒト肝癌細胞培養による場合、HBs抗原の生産量が
低く実用化が困難である。
低く実用化が困難である。
問題点を解決するための手段 本発明者らはかかる欠点を解消し、Ｂ型肝炎に対する予
防ワクチンとして有効なHBs抗原を大量に生産すべく研
究を行ったところ、ヒト肝癌細胞株の中から、pre-S1お
よびpre-S2遺伝子の発現産物であるポリペプチドを含む
HBs抗原を著量産生する変異細胞株huGK-14をクローニン
グすることに成功した。huGK-14は、先に小池らによっ
て樹立されたヒト肝癌細胞huSP（文献19）をHBs抗原の
産生量の高いコロニーのセレクトを繰り返し、さらに数
多くのクローニングの結果得られたものであり、huSPと
比べて極めてHBs抗原産生量が高く、かつhuSPが高い血
清要求性細胞株であるのに対してhuGK-14は無血清でも
培養できる性質を有する。この血清要求性については次
の試験により証明される。
防ワクチンとして有効なHBs抗原を大量に生産すべく研
究を行ったところ、ヒト肝癌細胞株の中から、pre-S1お
よびpre-S2遺伝子の発現産物であるポリペプチドを含む
HBs抗原を著量産生する変異細胞株huGK-14をクローニン
グすることに成功した。huGK-14は、先に小池らによっ
て樹立されたヒト肝癌細胞huSP（文献19）をHBs抗原の
産生量の高いコロニーのセレクトを繰り返し、さらに数
多くのクローニングの結果得られたものであり、huSPと
比べて極めてHBs抗原産生量が高く、かつhuSPが高い血
清要求性細胞株であるのに対してhuGK-14は無血清でも
培養できる性質を有する。この血清要求性については次
の試験により証明される。
培地はDM-160を基礎培地とし、血清を添加した場合と添
加しない場合とを比較する。各々の培地にhuGK-14を24
穴プレートに１×104cells/cm2〜４×104cells/cm2とな
るように接種する。増殖の結果、細胞密度が飽和状態に
なった時点で常法に従いトリプシン処理し、細胞を新た
なプレートに接種する。同様な方法で以後14日〜16日の
単位で継代培養を繰り返す。
加しない場合とを比較する。各々の培地にhuGK-14を24
穴プレートに１×104cells/cm2〜４×104cells/cm2とな
るように接種する。増殖の結果、細胞密度が飽和状態に
なった時点で常法に従いトリプシン処理し、細胞を新た
なプレートに接種する。同様な方法で以後14日〜16日の
単位で継代培養を繰り返す。
結果を図１に示す。図１からhuGK-14は、無血清培地で
の培養が可能で、しかも継代数が増加しても増殖が認め
られる。
の培養が可能で、しかも継代数が増加しても増殖が認め
られる。
huGK-14は−190℃にほぼ永久的に凍結保存が可能であっ
て、財団法人癌研究会研究会に登録保管されており、頒
布可能な状態にある。
て、財団法人癌研究会研究会に登録保管されており、頒
布可能な状態にある。
huGK-14の生物学的性質は次の通りである。
1.ヒト肝癌由来細胞株huGK-14 （１）ヒト肝癌細胞由来変異株である。
（２）染色体モード数は51である。
（３）adr型HBs抗原をコードする遺伝子を含むDNAフラ
グメントが、染色体ハプロイド当り約８ヶ所組み込まれ
ている。
グメントが、染色体ハプロイド当り約８ヶ所組み込まれ
ている。
（４）adr型HBs抗原を著量生産する。
（５）細胞は不正円形で上皮性である。
（６）接着型の細胞である。
（７）生育温度は36.5±１℃が適している。
（８）HBs抗原の産生量は、細胞密度が飽和状態に達し
た後急激に増加する。
た後急激に増加する。
（９）細胞の増殖はDM-160基礎培地に４％以上の血清を
添加したものが適当である。
添加したものが適当である。
（10）無血清培地でも良好な分裂増殖を示す。
（11）細胞密度が飽和状態に達した後の維持培地として
はウィリアムＥ基礎培地が最も適しており、培地交換の
みで長期にわたりHBs抗原の回収が可能である。
はウィリアムＥ基礎培地が最も適しており、培地交換の
みで長期にわたりHBs抗原の回収が可能である。
（12）デキサメサゾン添加により、adr型HBs抗原の産生
量を増加させることができる。
量を増加させることができる。
2.細胞培養方法 huGK-14は前記したごとく無血清培養が可能であるため
その培養液からHBs抗原をきわめて高純度で精製するこ
とが容易である。
その培養液からHBs抗原をきわめて高純度で精製するこ
とが容易である。
huGK-14は最初シャーレで培養し適当な細胞数に達した
時点でセルフアクトリー（Nunc社）、マイクロキャリア
ー等大量培養に適した培養装置に植継ぎ接着培養を行な
う。huGK-14は、アミノ酸を主成分とする基礎培地だけ
でも分裂増殖が可能である。しかしHBs抗原を効率的に
生産するためには、血清添加したDM-160培地でhuGK-14
を増殖させ、細胞の増殖が定常期に入る手前で血清無添
加のデキサメサゾン（10-6Ｍ）を含むウィリアムＥ培地
（無血清培地）に交換するのが望ましい。HBs抗原の産
生は細胞の増殖期には殆どみられず、細胞密度が飽和状
態に達した後急激に増加する。このため最初のシャーレ
での増殖および大量培養装置での増殖フェーズにおける
培地としてはDM-160（極東製薬）に牛胎児血清４％以上
添加したものが適しており、２〜３日間隔で培地交換を
行なうのが良い。大量培養装置でのHBs抗原生産フェー
ズでは、前記したごとくウィリアムＥ基礎培地（F1ow
社）に抗原物質のインデューサーであるデキサメサゾン
および、細胞接着因子であるファイブロネクチン（Sigm
a社）等を加えた無血清培地を用いるのが望ましく、６
日間隔で培地を交換して３ヶ月以上にわたってHBs抗原
を取得する。デキサメサゾンによりHBs抗原の産生は、
デキサメサゾン無添加の場合と比較して有意に増大す
る。細胞増殖フェーズ、HBs抗原生産フェーズいずれの
場合も培養温度、気相条件は厳密に限定されるものでは
ないが、36.5±１℃、５％程度の炭酸ガスを含む空気が
適当である。
時点でセルフアクトリー（Nunc社）、マイクロキャリア
ー等大量培養に適した培養装置に植継ぎ接着培養を行な
う。huGK-14は、アミノ酸を主成分とする基礎培地だけ
でも分裂増殖が可能である。しかしHBs抗原を効率的に
生産するためには、血清添加したDM-160培地でhuGK-14
を増殖させ、細胞の増殖が定常期に入る手前で血清無添
加のデキサメサゾン（10-6Ｍ）を含むウィリアムＥ培地
（無血清培地）に交換するのが望ましい。HBs抗原の産
生は細胞の増殖期には殆どみられず、細胞密度が飽和状
態に達した後急激に増加する。このため最初のシャーレ
での増殖および大量培養装置での増殖フェーズにおける
培地としてはDM-160（極東製薬）に牛胎児血清４％以上
添加したものが適しており、２〜３日間隔で培地交換を
行なうのが良い。大量培養装置でのHBs抗原生産フェー
ズでは、前記したごとくウィリアムＥ基礎培地（F1ow
社）に抗原物質のインデューサーであるデキサメサゾン
および、細胞接着因子であるファイブロネクチン（Sigm
a社）等を加えた無血清培地を用いるのが望ましく、６
日間隔で培地を交換して３ヶ月以上にわたってHBs抗原
を取得する。デキサメサゾンによりHBs抗原の産生は、
デキサメサゾン無添加の場合と比較して有意に増大す
る。細胞増殖フェーズ、HBs抗原生産フェーズいずれの
場合も培養温度、気相条件は厳密に限定されるものでは
ないが、36.5±１℃、５％程度の炭酸ガスを含む空気が
適当である。
デキサメサゾンの抗原産生促進物質としての効果は次の
試験により判断できる。デキサメサゾンの添加濃度は、
10-6Ｍとする。ウィリアムＥ基礎培地を使用してデキサ
メサゾン無添加と添加の場合を比較すると表１の通りで
ある。
試験により判断できる。デキサメサゾンの添加濃度は、
10-6Ｍとする。ウィリアムＥ基礎培地を使用してデキサ
メサゾン無添加と添加の場合を比較すると表１の通りで
ある。
表１ 培地 産生量（ng/ml） デキサメサゾン無添加ウィリアムスＥ 1,340 デキサメサゾン添加ウィリアムスＥ 2,400 3.精製 精製方法は、回収したhuGK-14培養液を限外ロ過、アフ
ィニティークロマトグラフィー、遠心分離等を適宜組み
合わせて行う。HBs抗原に対するモノクローナル抗体
（株式会社シノテスト研究所）（抗HBs抗体）を結合し
たアフィニティークロマトグラフィー用いると非常に高
い純度でHBs抗原が得られ、回収率もよい。精製の手順
は次の通りである。
ィニティークロマトグラフィー、遠心分離等を適宜組み
合わせて行う。HBs抗原に対するモノクローナル抗体
（株式会社シノテスト研究所）（抗HBs抗体）を結合し
たアフィニティークロマトグラフィー用いると非常に高
い純度でHBs抗原が得られ、回収率もよい。精製の手順
は次の通りである。
培養上清を限外ロ過膜（Amicon社）により10-30倍に濃
縮し、抗HBs抗体を結合したカラムに負荷する。抗HBs抗
体結合カラムは、このモノクローナル抗体のIgG分画を
セファロース4B（Phamacia社）にCNBr活性化法で結合さ
せることによって得られる。その後KSCNを含むリン酸緩
衝液で溶出しHBs抗原分画を濃縮し、ついでHbs抗原の組
成物分画を塩化セシウム（CsCl）を用いた平衡密度勾配
遠心法を使用して超遠心分離し、更にロ過膜に通すこと
でHBs抗原の精製標品が得られる。
縮し、抗HBs抗体を結合したカラムに負荷する。抗HBs抗
体結合カラムは、このモノクローナル抗体のIgG分画を
セファロース4B（Phamacia社）にCNBr活性化法で結合さ
せることによって得られる。その後KSCNを含むリン酸緩
衝液で溶出しHBs抗原分画を濃縮し、ついでHbs抗原の組
成物分画を塩化セシウム（CsCl）を用いた平衡密度勾配
遠心法を使用して超遠心分離し、更にロ過膜に通すこと
でHBs抗原の精製標品が得られる。
4.HBs抗原の物理化学的特性 本発明のHBs抗原の物理化学的特性は以下の通りであ
る。
る。
ａ）電子顕微鏡像 HBs抗原を電子顕微鏡で観察するといずれも均一な粒径
を示し、Dane粒子や管状構造の粒子は全く認められな
い。平均粒子径は23.2±2.9nmである。
を示し、Dane粒子や管状構造の粒子は全く認められな
い。平均粒子径は23.2±2.9nmである。
ｂ）比重 CsCl平衡密度勾配遠心で1.202g/cm3。
ｃ）構成ポリペプチドおよび分子量 HBs抗原１μｇを還元下でSDS-PAGE（文献20に準じる）
にかけ銀染色（文献21）すると主要な４本のバンドが認
められる。
にかけ銀染色（文献21）すると主要な４本のバンドが認
められる。
しかしHBs抗原の負荷量を増大した後抗pre-S1抗血清お
よび抗pre-S2抗血清を用いてウエスタンブロッドを行う
と、前記４本のバンドとは異なった移動度を示す位置に
抗pre-S1抗血清および抗pre-S2抗血清のそれぞれで染色
されたバンドが明らかに認められる。抗pre-S1抗血清お
よび抗pre-S2抗血清は、pre-S1領域の部分合成ペプチド
とpre-S2領域の部分合成ペプチドに対するウサギの抗血
清をNew York Blood Centerより入手した。これらの２
つのバンドは（pre-S1＋pre-S2＋Ｓ）遺伝子および（pr
e-S2＋Ｓ）遺伝子の発現産物のポリペプチドである。
よび抗pre-S2抗血清を用いてウエスタンブロッドを行う
と、前記４本のバンドとは異なった移動度を示す位置に
抗pre-S1抗血清および抗pre-S2抗血清のそれぞれで染色
されたバンドが明らかに認められる。抗pre-S1抗血清お
よび抗pre-S2抗血清は、pre-S1領域の部分合成ペプチド
とpre-S2領域の部分合成ペプチドに対するウサギの抗血
清をNew York Blood Centerより入手した。これらの２
つのバンドは（pre-S1＋pre-S2＋Ｓ）遺伝子および（pr
e-S2＋Ｓ）遺伝子の発現産物のポリペプチドである。
分子量の測定はLaemmliらの方法（文献20）に準じ還元
下のSDS-PAGEより前記の主要な４つのポリペプチドにつ
いて行った。分子量測定用マーカタンパク質として牛血
清アルブミン（66000）、卵白アルブミン（45000）、β
−ラクトグロブリン（18400）を用いた。その結果前記
４つのポリペプチドの分子量はそれぞれ22000（22K）、
26000（26K）、43000（43K）および46000（46K）であっ
た（図２）。これら４つのポリペプチドは、抗HBs抗体
とは反応するがpre-S1およびpre-S2抗血清とは反応しな
い。
下のSDS-PAGEより前記の主要な４つのポリペプチドにつ
いて行った。分子量測定用マーカタンパク質として牛血
清アルブミン（66000）、卵白アルブミン（45000）、β
−ラクトグロブリン（18400）を用いた。その結果前記
４つのポリペプチドの分子量はそれぞれ22000（22K）、
26000（26K）、43000（43K）および46000（46K）であっ
た（図２）。これら４つのポリペプチドは、抗HBs抗体
とは反応するがpre-S1およびpre-S2抗血清とは反応しな
い。
ｄ）糖鎖 精製HBs抗原（１μｇ）と、huGK-14をツニカマイシン
（３μg/ml）存在下で培養して得られる培養液から粗精
製したHBs抗原（１μｇ）とを還元下でSDS-PAGEにかけ
銀染色すると前記26Kと46Kのバンドが殆ど消失すること
から26Kと46Kのバンドは22Kおよび43Kに糖鎖のついたも
のと考えられる。
（３μg/ml）存在下で培養して得られる培養液から粗精
製したHBs抗原（１μｇ）とを還元下でSDS-PAGEにかけ
銀染色すると前記26Kと46Kのバンドが殆ど消失すること
から26Kと46Kのバンドは22Kおよび43Kに糖鎖のついたも
のと考えられる。
43Kのポロペプチドは、抗HBs抗体との反応性および還元
剤の濃度を濃くしたSDS-PAGEにおいて43Kのバンドが22K
に対して相対的に減少することなどから、22Kの２量体
と考えられる。
剤の濃度を濃くしたSDS-PAGEにおいて43Kのバンドが22K
に対して相対的に減少することなどから、22Kの２量体
と考えられる。
ｅ）Ｎ末端アミノ酸およびＣ末端アミノ酸 Ｎ末端アミノ酸は、470A型アミノ酸シークエンサー（Ap
plied Biosystems,USA）を用いて決定した（図３）。
plied Biosystems,USA）を用いて決定した（図３）。
Ｃ末端はHBs抗原をアルキル化した後、カルボキシペプ
チダーゼを作用させ、反応生成物をA-5500アミノ酸分析
計（医理化、京都）を用いて求めた。
チダーゼを作用させ、反応生成物をA-5500アミノ酸分析
計（医理化、京都）を用いて求めた。
その結果Ｎ末端より35残基のアミノ酸配列はadr型Ｓ遺
伝子のDNA配列（文献22）から予想される配列と一致し
た。またＣ末端アミノ酸はIleであることが判明した。
伝子のDNA配列（文献22）から予想される配列と一致し
た。またＣ末端アミノ酸はIleであることが判明した。
つぎに実施例を示すが本発明はこれによりなんら制限さ
れるものではない。
れるものではない。
実施例 培養・回収・精製 増殖用培地にはDM-160基礎培地（極東製薬）に非働化し
た牛胎児血清（GIBCO社）４％を加え、硫酸カナマイシ
ン（明治製菓）60μg/lを添加したものをもちいた。培
養条件は、５％炭酸ガスを含む空気、37℃で行なった。
huGK-14の接種密度は、2.5×104cells/cm2とした。最
初、φ15cmのプラスチックシャーレに接種して増殖させ
た後、細胞密度が飽和状態になる直前（１×105cells/c
m2）でプラスチックシャーレ６枚分（細胞数約1.5×108
以上）を多段式接着培養装置セルファクトリー（Nunc
社）１台に植え継ぎ、更に増殖させた。セルファクトリ
ーは接着面積6000cm2をもつプラスチック製の接着培養
器である。各段階の接種密度は2.5×104cells/cm2程度
であって１×105cells/cm2程度で植え継ぎをした。無血
清培地への転換はセルファクトリーで約１×105cells/c
m2を超えた時点を適期とした。無血清培地としては、デ
キサメサゾン（Sigma社）10-6Ｍ、硫酸カナマイシン60
μg/ml、接着因子ファイブロネクチン（Sigma社）を添
加したウィリアムＥ基礎培地（Flow社）を使用した。こ
の培養状態を維持したまま６日間毎の培地交換を15回繰
り返して上清を回収した。
た牛胎児血清（GIBCO社）４％を加え、硫酸カナマイシ
ン（明治製菓）60μg/lを添加したものをもちいた。培
養条件は、５％炭酸ガスを含む空気、37℃で行なった。
huGK-14の接種密度は、2.5×104cells/cm2とした。最
初、φ15cmのプラスチックシャーレに接種して増殖させ
た後、細胞密度が飽和状態になる直前（１×105cells/c
m2）でプラスチックシャーレ６枚分（細胞数約1.5×108
以上）を多段式接着培養装置セルファクトリー（Nunc
社）１台に植え継ぎ、更に増殖させた。セルファクトリ
ーは接着面積6000cm2をもつプラスチック製の接着培養
器である。各段階の接種密度は2.5×104cells/cm2程度
であって１×105cells/cm2程度で植え継ぎをした。無血
清培地への転換はセルファクトリーで約１×105cells/c
m2を超えた時点を適期とした。無血清培地としては、デ
キサメサゾン（Sigma社）10-6Ｍ、硫酸カナマイシン60
μg/ml、接着因子ファイブロネクチン（Sigma社）を添
加したウィリアムＥ基礎培地（Flow社）を使用した。こ
の培養状態を維持したまま６日間毎の培地交換を15回繰
り返して上清を回収した。
次にモノクローナル抗体を用いて精製を行う。回収培養
液に0.01％アジ化ナトリウムを添加し、ついで連続遠心
機（11500×ｇ、滞留時間10分）に供給し、細胞等を除
去し、上清液を得た。
液に0.01％アジ化ナトリウムを添加し、ついで連続遠心
機（11500×ｇ、滞留時間10分）に供給し、細胞等を除
去し、上清液を得た。
この上清液を濃縮装置（限外ロ過、平膜式、カットオフ
分子量10万、ミリポア社）で循環濃縮し、約30倍の濃縮
液を得た。この濃縮液を連続遠心機11500×g 10分に再
度かけ、不溶物を除去した後、抗HBs抗体（株式会社シ
ノテスト研究所調整）結合セファロース4Bカラム（φ５
×5.5cm Pharmacia社）に負荷した。
分子量10万、ミリポア社）で循環濃縮し、約30倍の濃縮
液を得た。この濃縮液を連続遠心機11500×g 10分に再
度かけ、不溶物を除去した後、抗HBs抗体（株式会社シ
ノテスト研究所調整）結合セファロース4Bカラム（φ５
×5.5cm Pharmacia社）に負荷した。
次いで、0.5M NaCl含リン酸緩衝液で洗浄し、続いて3MK
SCN含リン酸緩衝液で溶出した。ついで溶出液を透析
後、CsCl平衡密度勾配遠心法を用いて超遠心機にかけ
（130000×ｇ、48hrs）、抗原画分を取り出し、緩衝液
で透析した後、0.22μｍ膜で無菌ロ過し精製標品とし
た。HBs抗原の定量には、オースザイムHBs抗原キット
（ダイナボット社）を使用した。定量はポジティブコン
トロールを希釈して測定し、OD492における吸光度とHBs
抗原との相関を求めた標準曲線から換算によって求め
た。各階段での精製度を表２に示す。
SCN含リン酸緩衝液で溶出した。ついで溶出液を透析
後、CsCl平衡密度勾配遠心法を用いて超遠心機にかけ
（130000×ｇ、48hrs）、抗原画分を取り出し、緩衝液
で透析した後、0.22μｍ膜で無菌ロ過し精製標品とし
た。HBs抗原の定量には、オースザイムHBs抗原キット
（ダイナボット社）を使用した。定量はポジティブコン
トロールを希釈して測定し、OD492における吸光度とHBs
抗原との相関を求めた標準曲線から換算によって求め
た。各階段での精製度を表２に示す。
試験例 ワクチンとしての免疫原性試験 モルモット（guinea pig）に本発明のHBs抗原を皮下注
射することにより抗体産生能を調べた。
射することにより抗体産生能を調べた。
精製HBs抗原12.8μｇ、25.6μｇを含む生理食塩水1mlを
抗原として各々健康モルモット（400〜500g）に２週間
間隔で３回注射し、その２週間後に採血した。採血した
血液は、室温で凝固させ遠心分離で血清を分離し測定用
サンプルとした。このサンプルをStavitskyらの方法
（文献23）を用いて受身赤血球凝集反応により抗体価を
測定した。結果は表３に示す。
抗原として各々健康モルモット（400〜500g）に２週間
間隔で３回注射し、その２週間後に採血した。採血した
血液は、室温で凝固させ遠心分離で血清を分離し測定用
サンプルとした。このサンプルをStavitskyらの方法
（文献23）を用いて受身赤血球凝集反応により抗体価を
測定した。結果は表３に示す。
表３ 注射量／回 抗体価 本発明物質 12.8μｇ 1:128 26.6μｇ 1:362 文献 1.Blumberg et.al. N.Y.Acad.Med.40 377（1964） 2.Blumberg et.al. JAMA 191 540（1965） 3.Prince et.al. Proc.Natl.Acad.Sci.USA.60 814（1968） 4.WHO Technical Report Series 5.昭59年10月30日 厚生省告示第196号 「沈降Ｂ型肝炎ワクチン」 6.Galibert et.al Nature 281 646-650（1979） 7.Valenzuela et.al Academic press 57-70（1981） 8.Matsubara et.al Nucleic Acids Research 11 4601-4610（1983） 9.特開昭56-150020 Ｂ型肝炎表面抗原の増殖方法 10.Pasek et.al Nature 282 575-579（1979） 11.Charnay et.al. Nature 286 893-895（1980） 12.Valenzuela et.al. Nature 298 347-350（1982） 13.McIeer et.al. Nature 307 178-184（1984） 14.Matsubara et.al. Proc.Natl.Acad.Sci.USA.80 1-5（1983） 15.特開昭60-69030 Ｂ型肝炎ウイルス感染に対するワクチンおよび組成物 16.特開昭60-89431 形質転換酵母から誘導される免疫原性HBsAg 17.特開昭58-56685 脊椎動物細胞におけるポリペプチドの製造方法 18.特開昭59-80615 DNAおよびその用途 19.特開昭60-45535 Ｂ型肝炎ワクチンの製造方法 20.Laemmli et.al. Nature 227 6808（1970） 21.Oakley et.al. Anal.Biochem.105 361（1980） 22.Fujiyama et.al. Necleic Acids Res（1983）11,4601-4610 23.Stavistsky et.al. Proc.Soc.Exp.Biol.Med.124 1166（1967） 図面の簡単な説明 図１はhuGK-14の血清培地および無血清培地での継代培
養結果を示す。図２は本発明のadr型HBs抗原のSDSポリ
アクリルアミド電気泳動結果を示す。図３は本発明のHB
s抗原を構成する主要なポリペプチドのＮ末端アミノ酸
配列を示す。
養結果を示す。図２は本発明のadr型HBs抗原のSDSポリ
アクリルアミド電気泳動結果を示す。図３は本発明のHB
s抗原を構成する主要なポリペプチドのＮ末端アミノ酸
配列を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 片柳 滋 神奈川県小田原市栢山1123 第１清流荘 114号 (72)発明者 藤森 隆夫 神奈川県横浜市瀬谷区阿久和町3839−10 (56)参考文献 特開 昭59−74985（ＪＰ，Ａ) 長崎医学会雑誌 Ｖｏｌ．55，Ｎｏ．１ （1980）Ｐ．８−16
Claims (2)
- 【請求項１】ヒト肝癌細胞由来の細胞株huGK-14の無血
清培地培養液から分離精製された下記の性質を有するad
r型Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原。 １）平均粒子径が約23nmの均一な表面抗原。 ２）塩化セシウム平衡密度勾配遠心で比重が1.20/cm3。 ３）還元下のSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で
抗HBs抗体と反応するが抗pre-S1抗体および抗pre-S2抗
体とは反応しない下記の４つの主要なポリペプチドに分
離。 ａ）分子量が22000（22K）および43000（43K）のポリペ
プチド。 ｂ）前記22000（22K）および43000（43K）のポリペプチ
ドに糖鎖の結合した分子量26000（26K）および46000（4
6K）のポリペプチド。 ４）抗pre-S1抗血清および抗pre-S2抗血清と反応するポ
リペプチドを含む。 ５）下記に示す末端アミノ酸配列を有する。 ａ）Ｎ末端アミノ酸配列 Met-Glu-Asn-Thr-Thr-Ser-Gly-Phe-Leu-Gly-Pro-Leu-Le
u-Val-Leu-Gln-Ala-Gly-Phe-Phe-Leu-Leu-Thr-Arg-Ile-
Leu-Thr-Ile-Pro-Gln-Ser-Leu-Asp-Ser-Trp ｂ）Ｃ末端アミノ酸 Ile ６）Ｂ型肝炎ウイルスに対する抗体産生能を有する。 - 【請求項２】ヒト肝癌細胞由来の細胞株huGK-14の無血
清培地培養液から分離精製された下記の性質を有するad
r型Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原を有効成分とするＢ型肝
炎ワクチン。 １）平均粒子径が約23nmの均一な粒子。 ２）塩化セシウム平衡密度勾配遠心で比重が1.20/cm3。 ３）還元下のSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で
抗HBs抗体と反応するが抗pre-S1抗体および抗pre-S2抗
体とは反応しない下記の４つの主要なポリペプチドに分
離。 ａ）分子量が22000（22K）および43000（43K）のポリペ
プチド。 ｂ）前記22000（22K）および43000（43K）のポリペプチ
ドに糖鎖の結合した分子量26000（26K）および46000（4
6K）のポリペプチド。 ４）抗pre-S1抗血清および抗pre-S2抗血清と反応するポ
リペプチドを含む。 ５）下記に示す末端アミノ酸配列を有する。 ａ）Ｎ末端アミノ酸配列 Met-Glu-Asn-Thr-Thr-Ser-Gly-Phe-Leu-Gly-Pro-Leu-Le
u-Val-Leu-Gln-Ala-Gly-Phe-Phe-Leu-Leu-Thr-Arg-Ile-
Leu-Thr-Ile-Pro-Gln-Ser-Leu-Asp-Ser-Trp ｂ）Ｃ末端アミノ酸 Ile ６）Ｂ型肝炎ウイルスに対する抗体産生能を有する。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61500430A JPH0762033B2 (ja) | 1984-12-28 | 1985-12-28 | Ｂ型肝炎ワクチン |
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CH462/84 | 1984-02-01 | ||
| JP27459284A JPS61158798A (ja) | 1984-12-28 | 1984-12-28 | Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原の製造法 |
| JP59-274592 | 1984-12-28 | ||
| CH54/85 | 1985-01-08 | ||
| PCT/JP1985/000733 WO1986003975A1 (en) | 1984-12-28 | 1985-12-28 | Hepatitis b virus vaccine and process for its preparation |
| JP61500430A JPH0762033B2 (ja) | 1984-12-28 | 1985-12-28 | Ｂ型肝炎ワクチン |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61501178A JPS61501178A (ja) | 1986-06-12 |
| JPH0762033B2 true JPH0762033B2 (ja) | 1995-07-05 |
Family
ID=26551097
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61500430A Expired - Lifetime JPH0762033B2 (ja) | 1984-12-28 | 1985-12-28 | Ｂ型肝炎ワクチン |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0762033B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5890989B2 (ja) * | 2011-09-20 | 2016-03-22 | Koa株式会社 | 薄膜抵抗体 |
-
1985
- 1985-12-28 JP JP61500430A patent/JPH0762033B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 長崎医学会雑誌Ｖｏｌ．５５，Ｎｏ．１（１９８０）Ｐ．８−１６ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS61501178A (ja) | 1986-06-12 |
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