FI95726B - Diagnostiset menetelmät ja määrityssarjat, joissa käytetään yhdistelmä-DNA-tekniikalla muodostettua hepatitis B -viruksen pinta-antigeenia - Google Patents

Description

- 95726

Diagnostiset menetelmät ja määrityssarjat, joissa käytetään yhdistelmä-DNA-tekniikalla muodostettua hepatitis B -viruksen pinta-antigeenia Tämä keksintö kohdistuu bakteeriperäisiin plasmideihin, jotka käsittävät PreS2-PreS2-S-proteiinia koodaavan alueen, mutta joista puuttuvat hepatitis B -viruksen ytimen antigeeniä koodaavat ketjut ja joita plasmideja käytetään eukarioottis-ten solulinjojen transfektioon PreS!-PreS2-S-proteiinia koodaavan alueen koodaamia polypeptidejä sisältävien partikke-leiden tuottamiseksi.

Viime aikoina geenitekniikassa tehdyt kehitysaskeleet tekevät mahdolliseksi sen, että lukuisia peptidejä ja proteiineja voidaan ilmentää bakteeri-, hiiva- sekä nisäkässoluissa yhä suurempina määrinä. Vaikka monia proteiineja ja peptidejä onkin ilmennetty bakteereissa huomattavia määriä, niin kuitenkin erityisenä toiveena on ihmislääketieteessä käytettävien proteiinien ja polypeptidien ilmentäminen suurina määrinä nisäkässoluissa, jolloin voidaan välttää ne haitat, jotka johtuvat bakteerisoluista peräisin olevista, mahdollisesti kontaminoivista tuotteista tai jotka liittyvät bakteerisoluissa ilmentämiseen.

Erityisen mielenkiinnon kohteena on hepatitis B-viruksen pinnan antigeeniproteiinien ilmentäminen suurina määrinä nisäkässoluissa. Näiden proteiinien ilmentymistaso nisäkäs-soluissa ei toistaiseksi ole ollut niin korkea, että näiden polypeptidien taloudellinen tuotanto olisi ollut mahdollista .

Hepatitis B-virus siirtyy ihmisestä toiseen ja aiheuttaa kroonisen ja heikentävän infektion, joka johtaa maksan vakavaan vaurioitumiseen, pääasiassa karsinoomaan, ja kuolemaan. Useimmissa tapauksissa täydellinen toipuminen hepatitis B-viruksen aiheuttamasta infektiosta on odotettavissa. Kuitenkin monissa Afrikan ja Aasian maissa hepatitis 2 /-. r* r1 - yo//.υ B-viruksen aiheuttama infektio on endeemistä. Hyvin moni yksilö näiden maiden väestöstä on hepatitis B-viruksen krooninen kantaja, jolloin vaarana on, että he voivat mahdollisesti levittää tautia edelleen.

Rokottaminen on ainoa tunnettu suojakeino hepatitis B-vi-rusta vastaan. Viime aikoina monet yritykset (esimerkiksi Merck, Sharp & Dohme, USA sekä Pasteur Institute, Ranska) ovat tuoneet markkinoille plasmasta saadun rokotteen hepatitis B-virusta vastaan. Tämä rokote sisältää antigeeninä hepatitis B-viruksen proteiineja, jotka sijaitsevat tavallisesti viruspartikkelin kotelon pinnalla. Tällaista antigeeniä kutsutaan yleisesti hepatitis B-viruksen pinnan antigeeniksi (HBsAg) ja tätä antigeeniä koodaavaa virusgeeniä kutsutaan HBsAG-geeniksi, Edellä mainitut rokotteet sisältävät pinnan antigeeniä, joka on eristetty hepatitis B-viruksen infektoimien ihmisten plasmasta. Vaikka itse pinnan antigeeni ei olekaan patogeeninen niin kuitenkin se kiihottaa ihmisessä hepatitis B-viruspartikkeleita vastaan vaikuttavien vasta-aineiden tuotantoa.

Hepatitis B-viruksen pinnan antigeenin ainoa kaupallisesti saatavana oleva lähde on hepatitis B-viruksen infektoimien ihmisten veri. Pinnan antigeenin eristäminen ja puhdistaminen ihmisseerumista on vaivalloista ja aikaa vievää ja näin ollen se on suhteellisen kallista. Tämän lisäksi, niin kauan kun ihmisseerumi on pinnan antigeenin ainoa kaupallisesti saatavilla oleva lähde, rokotteisiin käytettävissä olevan pinnan antigeenin määrä pysyy rajoitettuna.

Ajatellen suuressa mitassa toteutettavia rokotuksia, erityisesti niillä alueilla, joilla hepatitis B-virus on endeeminen, olisi erittäin tärkeätä, että käytettävissä olisi hepatitis B-viruksen pinnan antigeenin halpa ja käytännöllisesti katsoen ehtymätön lähde, johtuen siitä, että on olemassa vaara kontaminoitua patogeenisillä aineilla, kun pinnan antigeeniä eristetään ihmisseerumista, niin on toivottavaa, ettei 3 95726 ihmisseerumia käytetä pinnan antigeenin lähteenä. Tällä hetkellä ei myöskään tunneta ihmisten ja simpanssien lisäksi mitään sellaista biologista järjestelmää, jossa hepatitis B-virus voisi kasvaa ja missä se voitaisiin saada lisääntymään.

Molekyylibiologian viimeaikainen kehittyminen on tehnyt mahdolliseksi sen, että järjestys hepatitis B-viruksen täydellisessä genomissa voidaan kloonata (Siddiqui, A. et ai., Proc. Natl. Aca. Sei., USA, Voi. 76, s. 4664, 1979; Sninsky, J.J. et ai., Nature, Voi. 279, s. 346, 1979; sekä Charnay, P. et ai. Nucl. Acids Res., Voi. 7, s. 335, 1979). Tämän lisäksi hepatitis B-viruksen eri virusprote-iineja koodaavat alueet on tunnistettu (katso esimerkiksi eurooppalaiset patenttihakemukset, joiden julkaisunumerot ovat 13828, 20251 ja 38765 sekä Galibert et ai., Nature,

Voi. 281, sivut 646-650, 1979; Pasek et ai., Nature,

Voi. 282, sivut 575-579, 1979; sekä Valenzuela et ai.,

Nature, Voi. 280, sivut 815-819, 1979).

Tämän kehityksen mukaisesti lukuisia isäntäjärjestelmiä on testattu virusgenomin sen osan, joka koodaa hepatitis B-viruksen pinnan antigeeniproteiineja, ilmentämiseksi.

Monissa yhteyksissä on osoitettu,että tiettyjen eukarioottis-ten tuotteiden ollessa kyseessä voivat bakteerit toimia halpana tuotantojärjestelmänä. Kuitenkin kohdataan monia vaikeuksia kun eukarioottisia tuotteita syntetoidaan bakteereissa. Esimerkiksi; 1) eukarioottinen rakenteellinen geeni ei ehkä kopioidu tehokkaasti bakteereissa, koska kodonien käyttö bakteereissa eroaa kodonien käytöstä eukariooteissa; 2) eukarioottinen geenituote voi olla toksinen isäntänä toimineelle bakteerisolulle; 3) eukarioottisen geenituotteen rakenne ja toiminta voi riippua tietyistä luennan jälkeisistä prosesseista, kuten 4 95726 glykosylaatiosta tai disulfidisidosten erityisestä kytkeytymisestä, joista kumpaakaan ei saada aikaan bakteeri-isännässä; 4) geenituote erittyy ainoastaan harvoin isäntänä toimineesta bakteerisolusta; 5) eukarioottiset promoottorit eivät tavallisesti toimi bakteereissa ja ne on korvattava bakteerista saadulla promoottorilla, ja tällainen korvaaminen voi johtaa eukari-oottisen geenituotteen muuntumiseeen, esimerkiksi tuotteen N-päätteen osa on peräisin bakteerista ja tämä osa käsittää ensimmäisenä aminohapponaan N-formyylimetioniinin, jota ei esiinny eukariooteissa, ja joka saattaa toimia uutena immunogeenisena determinanttina nisäkkään immuunijärjestelmälle; ja 6) puhdistamisvaiheen aikana bakteerin soluseinämistä peräisin olevia komponentteja voi puhdistua geenituotteen mukana ja ne voivat aiheuttaa vakavia allergisia reaktioita tai ne voivat johtaa geenituotetta vastaanottavassa nisäkkäässä anafylaktiseen shokkiin.

Bakteereissa tuotettuun hepatitis B-viruksen pinnan antigeeniin on liittynyt vaikeuksia. Ensinnäkin, tuotannon taso bakteereissa on hyvin alhainen ja tämän lisäksi puhdis- taminen on aloitettava bakteerilysaatista, koska tuote ei erity bakteerisolujen ulkopuolelle. Toisen ongelman aiheuttaa se, ettei bakteereissa esiinny tiettyjä luennan jälkeisiä prosesseja, esimerkiksi pinnan antigeenin glykosy-laatiota, mikä vaikuttaa immuunireaktion spesifisyyden tasoon. Kaikista näistä syistä johtuen on toivottavaa, ettei bakteereita käytetä isäntinä proteiinin tuotannossa.

Hiivasolut, jotka on transformoitu hepatitis B-viruksen pinnan antigeeniä koodaavan ketjun sisältävällä, asianmukaisella yhdistelmävektorilla, syntetoivat mainittua pinnan antigeeniä, jota kerääntyy huomattavia määriä hiivaviljel-mään. Tälläkin isäntäjärjestelmällä on eräitä huomattavia haittoja, kuten 1) pinnan antigeeni ei erity hiivasoluista 11 5 95726 ja se on eristettävä näiden solujen solulysaatista, ja 2) hiivasoluissa muodostuneet pinnan antigeenin monomeerit eivät muodosta kovalenttisesti liittyneitä dimeerejä, kuten nisäkässoluista erittynyt pinnan antigeeni.

Alalla on yritetty monta kertaa saada aikaan sellaisia ni-säkässolulinjoja, jotka tuottavat pinnan antigeeniä. Nämä solulinjat ovat olleet peräisin ihmisen hepatosellulaari-sista (maksasolujen) karsinoomista (Alexander, J.J. et al·.,

Afr. Med. J., Voi. 50, s. 2124, 1976) seka soluista, jotka on transfektoitu kloonatulla hepatitis B-viruksen DNA:11a. Lisäksi apinan munuaissoluja on infektoitu simian-virukseen 40 (SV40) pohjautuvilla yhdistelmä-DNA-vektoreilla, jotka käsittävät 40 % hepatitis B-viruksen genomista (Laub, O. et ai., J. of Virol., Voi. 48, s. 271, 1983). Samoin yhteistransfektointiin perustuvia menetelmiä on käytetty pinnan antigeeniä ilmentävien solulinjojen valikointiin (Standring, D.N. et ai., J. of Virol., Voi. 50, s. 563, 1984). Dihydrofolaattireduktaasi (DHFR)- geeniä on käytetty suuria määriä antigeeniä tuottavien nisäkässolu-linjojen aikaansaamiseksi (Michel et ai., Proc. Natl.

Aca. Sei., Voi. 81, s. 7708, 1984). Samoin eukarioottisia virusvektoreita, joissa valikoitavissa olevana merkitsi-. menä käytetään transformoitua fenotyyppiä (Hsiung, N.

et ai., Molec. and Applied Genetics, Voi. 2, s. 497, 1984) , on käytetty pinnan antigeenin geenin siirtämiseen nisäkäs-solujen sisään. Näissä tapauksissa onkogeenisiä DNA-ketju ja sisältäviä DNA-muodosteita, tai onkogeenisistä viruksista saatuja DNA-ketjuja, käytettiin pinnan antigeeniä tuottavien solulinjojen valikointiin. Onkogeenisen ketjun käyttö valikoinnin merkitsimenä aiheuttaa jälleen uusia turvallisuusongelmia, mikäli näiden solujen pinnan antigeeniä käytetään rokotuksissa.

Monissa julkaisuissa tarkastellaan hepatitis B-viruksen koodaavan ketjun syntetoimien polypeptidien ilmentymistä.

6 95726

Eurooppalaisessa patenttihakemuksessa no. 013 828-A1 todetaan, että nukleotidiketjut, jotka koodaavat 163 aminohappojäännöksen muodostamaa pätkää (PreSrää koo-daava alue) ja jotka sijaitsevat HBV-genomissa välittömästi ennen S-proteiinia koodaavaa aluetta, voidaan myös sisällyttää niihin kappaleisiin, joita käytetään käyttökelpoisten yhdistelmä-DNA-molekyylien tuottamiseen, sellaisten polypeptidien, joilla on hepatitis B-viruksen pinnan antigeenin antigeenisyyttä, tuottamiseksi. Lisäksi esitetään, että geenikappaleita, jotka käsittävät sekä HBsAg-proteiiniin liittyvän esiasteen ketjun että siihen liittyvän rakenteellisen geenin, voidaan leikata käyttämällä yhtä tai useampaa lukuisista restriktioendonukleaaseista ennen kloonaavan vektorin muodostamista tai sen aikana. Edelleen esitetään, että HBsAg-proteiinia koodaavaa rakenteellista geeniä edeltävä, 163 kodonin suuruinen esiaste tulisi leikata S-proteiinia koodaavan ketjun sisältävästä kloonaavasta kul-jettimesta, ennen kuin vektoria käytetään transformoi-miseen.

Eurooppalaisessa patenttihakemuksessa no. 072 318-82 kuvataan menetelmä HBsAgrn valmistamiseksi kasvattamalla sellaisella vektorilla transformoituja hiivasoluja, joka vektori käsittää hiivan replikonin, hiivan promoottorin sekä S-proteiinia koodaavan DNA-osan ja josta vektorista puuttuu erityisesti HBsAg-proteiinia koodaavaa rakenteellista geeniä edeltävä, 163 kodonin suuruinen esiaste. Samoin kuvataan HBsAg-antigeenin käsittävä rokote, sekä menetelmä HBsAg-antigeenin vasta-aineen saamiseksi puhdistamalla vasta-aine HBsAg-antigeeniä vastaan immunoitujen eläinten seerumista. Samoin kuvataan 14 - 18 nm:n antigeenipartik-keli, joka kykenee muodostamaan immuunikompleksin HBsAg:n vasta-aineen kanssa.

Il 7 95726

Julkaisussa Feitelson et ai., Virology, Voi. 130, sivut 75-90, 1983, todetaan, että monia pinnan antigeeniin liittyviä polypeptidejä voidaan koodata osittain PreS-proteiinia koodaavan ketjun puitteissa, esimerkiksi 24 000, 28 000, 32 000, 43 000 ja 50 000 daltonin poly-peptidit.

Julkaisussa Laub et ai., J. Virol., Voi. 48, no 1, sivut 271-180, 1983, kuvataan simian-virukseen perustuva . varhaisen korvausvektorin muodostaminen, joka vektori käsittää HBsAg-antigeeniä koodaavan rakenteellisen geenin sekä välittömästi tätä rakenteellista geeniä edeltävän, 163 kodonin suuruisen esiasteketjun sekä tämän koodaavan ketjun ilmentäminen SV40-viruksella transformoiduissa CV-1-soluissa (COS-soluissa), jotka on transformoitu tällaisella vektorilla. Laub et ai. esittävät samoin, että HBsAg-antigeeniä ilmentyy enemmän sellaisissa COS-soluissa, jotka on transformoitu ainoastaan S-proteiinia koodaavan ketjun sisältävällä vektorilla kuin niissä COS-soluissa, joiden transformointiin käytetty vektori sisältää 163 kodonin suuruisen esiasteen välittömästi HBsAg-antigeeniä koodaavan rakenteellisen geenin edellä.

JP-patentcihakemuksessa no. J5-8194-897-A (Takeda I), kuvataan HBV DNA (adw-alatyyppi), joka koodaa koko PreS-S -proteiinin polvpeptidiä sekä tämän rwa*n sisältävä vektori, ja tällä DNA :11a transformoitu isäntä. JP-patenttihakemuksessa no. J5-9080-615-A (Takeda II), kuvataan HBV DNA (adw-alatyyppi), joka koodaa koko PreS-S -proteiinin polvpeptidiä , sekä tällä DNA:11a tuotettu polypeptidi ja sen käyttö rokotteena. JP-patenttihakemuksessa no. J5-9074-985-A (Takeda III) kuvataan DNA-kappale, joka sisältää yhden tai useamman, koko adw-tyypin PreS-S -proteiinia koodaavan ketjun, S-proteiinia 8 95726 koodaavan ketjun tai hepatitis B-viruksen ytimen antigeeniä (HBcAg) koodaavan ketjun, tällaista DNA:ta sisältävän vektorin, sekä tällä DNA:11a transformoidut isäntäsolut.

Takeda III -julkaisussa todetaan, että PreS-S -proteiinin koodaavan ketjun koodaamaa 43 000 daltonin polypeptidiä "voidaan käyttää rokotteena HBV-infektioiden ehkäisemiseksi". Takeda III -julkaisussa kuvataan PreS-S -proteiinia koodaavan ketjun kloonaaminen E. coli -bakteeriin sekä tämän ketjun tuottaman polypeptidin tunnistaminen.

Gerlich esitti eurooppalaisen kliinisen mikrobiologian seuran "European Association of Clinical Microbiology" järjestämässä tilaisuudessa, Bolognassa, lokakuun 18. päivänä 1983, pitämässään esitelmässä, että HBV:n neljä mahdollista geeniä on päätelty kloonatun HBV-DNA:n DNA-ketjun perusteella; että HBV-viruksen pinnan proteiinien geeni (S-gee-ni) koostuu yhdestä keskeytymättömästä koodaavasta ketjusta, joka luetaan vähintään kolmeksi polypeptidiksi; että pääasiallisen proteiinin, P24, ja sen glykosyloituneen muodon, GP27, ketju alkaa S-geenin kolmannen säilyneen, luentaan liittyvän käynnistyssignaalin kohdalta; että vähäisemmät pinnan proteiinit, GP33 tai GP36, alkavat toisen käynnistyssignaalin kohdalta; että ainoastaan HBV:n P41-polypeptidi todennäköisesti käyttää S-geenin täysi-pituista koodaavaa ketjua; että P41 sisältää HBV:n pääasiallisen antigeenisen determinantin; ja että se on läsnä ainoastaan täydellisissä viruspartikkeleissa, muttei ylimääräisen pinta-antigeenin 20 nm:n partikkeleissa, joista nykyiset hepatitis B-rokotteet ovat peräisin.

Gerlich ei puutu esityksessään erityisesti P41-polypeptidin PreS^-alueeseen eikä siihen, että tämä PreS^-alue sisältää erityisesti antigeenisen determinantin, joka voisi olla käyttökelpoinen HBV-rokotteessa.

Julkaisussa Stibbe et ai., Develop. Biol. Standard, Voi.

’ 54, sivut 33-43, 1983, joka esitettiin Ateenassa pidetyssä 9 95726 virusperäistä hepatitista käsittelevässä, toisessa WHO/IABS-symposiumissa: Standardization in Immunoprophylaxis of Infections by Hepatitis Viruses, Ateena, Kreikka, 1982, todetaan, että HBV:n infektoimien ihmisten seerumista eristetyn HBsAg-antigeenin 20 nm:n partikkelit sisältävät vähintään kolme vähäisempää proteiinia, GP33, GP36 ja P41, mikä on varmistettu elektroforeettisesti SDS-geelillä. Stibbe et ai. päättelevät, että GP33 ja GP36 eivät todennäköisesti ole HBV-rokotteen olennaisia komponentteja. Stibbe et ai. eivät puutu erityisesti P41-proteiinin PreS^-alueeseen tai siihen, että tämä alue sisältää erityisesti antigeenisen determinantin, joka voisi olla käyttökelpoinen HBV-rokotteessa.

Julkaisussa Stibbe et ai., J. Virol., Voi. 46, no. 2, sivut 626-628, 1983, esitetään, että HBsAg-antigeenin koodaavasta alueesta peräisin olevia vähäisiä glykoproteiineja, joista käytetään lyhenteitä GP33 ja GP36, koodaa PreS2-S-proteiinin koodaava ketju. PreS2-alue on osa PreS-koodaavaa aluetta hepatitis B-viruksen genomissa, ja se koodaa ensimmäistä 55 aminohappoa välittömästi ennen S-proteiinia.

Julkaisussa Neurath et ai., Science, 224, sivut 392-394, 1984, esitetään, että polypeptidi, jonka järjestys on identtinen PreS2~alueen aminopäätteessä olevien 26 aminohapon kanssa, toimii erittäin tehokkaana immunogeeninä, ja julkaisussa ehdotetaan, että tämän immunogeenin vaikutuksesta muodostuneita vasta-aineita voidaan käyttää diagnostisissa kokeissa.

Julkaisussa Heerman et ai., J. Virol., Voi. 52, no. 2, sivut 396-402, 1984, kuvataan sekä S-proteiinia koodaavan ketjun että PreS-proteiinia koodaavan ketjun sisältävä, 389 aminohappoa koodaava koko ketju, joka koodaa luonnosta saaduissa HBV-partikkeleissa sekä viruksen pinnan antigeeni-rihmoissa esiintyvää polypeptidiä P39, sen glykosyloituneen 95726 muodon G?42 ohella, sekä muita HSV-viruksen pinnan antigeeniin liittyviä polypeptidejä P24, GP27, GP33 ja GP36. Heerman et ai. esittävät samoin, että P39/P42-proteiinin ainutlaatuinen osa eli sen PreS^-alue, sitoi monoklonaa-lisia vasta-aineita, jotka oli indusoitu HBV-partikkeleil-la immunoimalla. He esittävät, että tämä PreS^-alue on todennäköisesti erittäin immunogeeninen. PreS^-alue on PreS-proteiinia koodaavan alueen se osa, joka sijaitsee välittömästi ennen PreS2-a.lue tta, ja se käsittää aminohappoja 1-108 (tai 1-122, viruksen alatyypistä riippuen) koodaavat ketjut, jotka aminohapot muodostavat välittömästi PreS2~proteiinia koodaavaa ketjua edeltävän pätkän. Heerman et ai. toteavat samoin, että PreS-alueen ketjut saattavat olla mielenkiintoisia etsittäessä HBV-virusta vastaan vaikuttavana, vaihtoehtoisena rokotteena toimivia, immunogee-nisia ja suojaavia poly- tai oligopeptidejä.

Julkaisussa Michel et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA,

Voi. 81, sivut 7708-7712, 1984, esitetään ihmisseerumin polyalbumiinin reseptoreita kantavan HBsAg-antigeenin synteesi kiinanhamsterin munasarjasoluissa (CHO-soluissa), jotka on transfektoitu PreS2~S-proteiinia koodaavan ketjun käsittävällä plasmidilla.

Julkaisussa Cattaneo et ai., Nature, Voi. 305, sivut 335-338, 1985, esitetään, että HBV-genomin S-geeni käynnistää luennan PreS-alueen alussa (eli 489 nukleotidiä tai 163 kodonia ylävirran puolella S-geenistä), ja mRNA muokkau-tuu/polyadenyloituu eräässä kohdassa tämän ydingeenin sisällä.

Julkaisussa Persing et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA,

Voi. 82, sivut 3440-3444, 1985, esitetään, että PreS2“S-proteiinia koodaavalla ketjulla transformoidut hiiren L-solut tuottavat kolmea, HBsAg-antigeeniin liittyvää poly-peptidiä, joiden molekyylipainot ovat 24 000, 27 000 ja 35 000 daltonia, ja jotka kaikki ovat järjestäytyneet moni- 11 11 95726 mutkaisiksi immunoreaktiiviksi HBsAg-partikkeleiksi, joiden halkaisija on 22 nm, ja jotka sitoutuvat polymeroituun ihmisseerumin albumiiniin (HSA; human serum albumin); kun taas PreS2~alueen 3"-pään läheisyydessä kehyssiirtymämutaa-tion käsittävällä, PreS2~S-proteiinia koodaavalla ketjulla transformoidut hiiren L-solut tuottavat pelkästään 24 000 ja 27 000 daitonin polypeptidejä, jotka ovat järjestäytyneet halkaisijaltaan 22 nm:n suuruisiksi, immunoreaktii-visiksi HBsAg-partikkeleiksi, jotka eivät kykene sitoutumaan ihmisseerumin albumiiniin. Persing et ai. päättelevät, että PreS2-S-proteiinia koodaava ketju koodaa 35 000 daitonin polypeptidiä; PreS2~proteiinia koodaava osa saa aikaan HBsAg-antigeenin kyvyn sitoutua ihmisseerumin albumiiniin, mutta sitä ei tarvita HBsAg-partikkeleiden muodostumiseen ja erittymiseen; ja että HBsAg-antigeenin hallitsevaa po-pypeptidiä (eli 24 000 daitonin polypeptidiä) ei saada pääasiallisesti PreS2~S-proteiinia koodaavan ketjun koodaamia, suurempia esiasteita (eli 27 000 ja 35 000 daitonin polypeptidejä) pilkkomalla.

Julkaisussa Milich et ai., Science, Voi. 228, sivut 1195-1199, 1985, esitetään, että rokotteilla, jotka sisältävät sekä PreS2-että HBsAg-aminohappoja käsittäviä HBsAg-partik-keleita, jotka HBsAg-partikkelit olivat erittyneet PreS2-S-proteiinia koodaavan ketjun sisältävällä plasmidilla trans-fektoiduista kiinanhamsterin munasarjasoluista (CHO-soluis-ta), voidaan välttää epäreaktiivisuus pelkkää HBsAg:ta sisältäville rokotteille, koska HBsAgm aiheuttama immuno-geeninen reaktio ei riipu PreS2:n aiheuttamasta immunogee-nisestä reaktiosta ja että PreS2-S-proteiinin koodaavan ketjun koodaaman 33 000 daitonin suuruisen polypeptidin aminopäätteessä olevat 26 aminohappojäännöstä muodostavat vasta-aineiden hallitseman sitoutumiskohdan PreS^-alueessa.

Julkaisussa Neurath et ai., Nature, Voi. 315, sivut 154-156, 1985 esitetään, että PreS2-alue koodaa HBV-kotelon pinnan 12 95726 proteiinia, jonka immunologisia alueita (domain) erityisesti maksasolut tunnistavat; PreS2~S-proteiinia koodaava ketju koodaa HBV-partikkeleissa läsnäolevaa proteiinia; PreS2~proteiinia koodaavaa geeniä vastaavat synteettiset peptidit ovat erittäin immunogeenisiä ja julkaisussa päätellään, että HBV-rokotteiden tulisi sisältää PreS2~pro-teiinia.

Valenzuela julkaisi toukokuun 15. päivänä 1985 Bostonissa pidetyssä Bio-Expo-5 -kongressissa koko PreS2-proteiinia koodaavan ketjun ilmentämisen hiivassa ja hän esitti, että tällaiset hiivasolut todellakin syntetoivat sekä HBsAg-että PreS2~peptidiä sisältäviä partikkeleita, jotka ovat elektronimikroskopian ja laskeumaominaisuuksiensa perusteella hyvin samankaltaisia kuin pelkästään HBsAg:tä sisältävät partikkelit, ja ettei PreS2~alue häiritse kykyä muodostaa 22 nanometrin HBsAg-partikkeleita. Valenzuela esittää samoin, että on esitetty hypoteesi, että HBV joutuu maksaan sitomalla polyalbumiinia polyalbumiinin reseptoriinsa, joka polyalbumiini puolestaan sitoutuu maksassa olevaan polyalbumiinin reseptoriin, jolloin virus sisäistyy. PreS2~alue koodaa HBV-viruksen polyalbumiinin reseptoria. Valenzuela päättelee, että PreS2:ta sisältävä proteiini saa aikaan vasta-aineita, jotka sen lisäksi, että ne inaktivoivat HBV-virusta normaalilla mekanismilla, saattavat vaikuttaa siihen mekanismiin, jonka avulla virus tunkeutuu maksasoluihin. Katso myös julkaisua Valenzuela et ai., Biotechnology, Voi. 3. sivut 317-320, 1985.

Julkaisussa Valenzuela et ai., Biotechnology, Voi. 3, sivut 323-327, 1985, esitetään PreS2~proteiinin koodaavan alueen koodaaman, HBsAg-antigeeniin liittyvän polyalbumiinin reseptorin käyttö moniarvoisten rokotteiden valmistamiseksi. Valenzuela valmisti hybridipartikkelin HBsAg-an-tigeenistä ja ja Herpes simplex 1-viruksen glykoproteiinis-ta D (HSV1gD) ilmentämällä koko HSV1gD-PreS2~S-proteiinia koodaavan ketjun hiivassa.

I! 95726 1 3

Eurooppalaisessa patenttihakemuksessa no. 0 154 902-A2 kuvataan hepatitis B -rokote, jonka sisältämä peptidi käsittää vähintään kuudesta, peräkkäisestä, hepatitis-B-viruksen kotelossa PreS-geenin koodaamaan alueeseen kuuluvasta aminohaposta muodostuvan aminohappoketjun.

Tämä rokote ei sisällä aminohappoketjuja, jotka vastaavat hepatitis B -viruksen luonnossa esiintyviä kotelo-proteiineja, eikä fysiologisesti hyväksyttävää laimen-ninta. Peptidi voi olla vapaana tai se on voitu kytkeä kantajaan.

Julkaisussa Kent et ai., Pept. Chem., Voi. 22, sivut 167-70, 1984, esitetään , että kemiallisesti svntetoitu peptidi, joka käsittää N-päätteen 26 aminohappoa PreS2~slueesta, on erittäin hyvä antigeeni, ja että se on synteettisen rokotteen eräs mahdollisuus.

Julkaisussa Lo et ai., Biochem. Biophys. Res. Conun. ,

Voi. 129, no 3, sivut 797-803, 1985, esitetään HBV-vi-ruksen eri alatyyppien (adw, adr, ayw ja ayw) tapauksessa täysipituisesta HBV DNA:sta restriktioendonukleaaseilla saadun kartan tunnusomaiset piirteet, mukaan lukien koko PreS-alueesta restriktioendonukleaaseilla saadun kartan tunnusomaiset piirteet. Lo et ai. julkaisevat samoin täysipituisen HBV DNA:n kloonaamisen ja ilmentämisen E. coli-bakteerissa käyttäen ilmentämisvektoria pUC8 ja he toteavat, että heidän aikomuksenaan on käyttää tällaista HBV-geenin tuotetta, joka on ilmennetty joko prokari-oottisissa tai eukarioottisissa soluissa, diagnostisena aineena sekä rokotelähteenä.

Julkaisussa Wong et ai., J. Virology, Voi. 55, no 1, sivut 223-231, 1985, esitetään PreS-proteiinin koko avoimen lukukehyksen koodaaman kahden HBV-polypeptidin eli 42 ja 46 kilodaltonin glykosyloidun polypeptidin tunnistaminen, jotka polypeptidit sisältävät determinant- 14 95726 teja sekä HBsAg- että PreS -alueesta. Wong et ai. esittävät samoin kolminkertaisen fuusioproteiinin ilmentämisen, joka fuusioproteiini sisältää 108 N-päätteen aminohappoja 27-133 vastaavaa aminohappoa PreS-alueen 174 aminohaposta (adv^-alatyyppi) sekä β-galaktosidaasin ja kloramfenikoli-asetylitransferaasin ketjut. Tämä peptidi sisältää 15 aminohappoa PreS2~alueesta ja 93 aminohappoa PreS^-alueesta. Wong et ai. esittävät samoin, että (a) tämän kolminkertaisina fuusioproteiinin vaikutuksesta muodostunut polyklonaalinen antiseerumi kykeni tunnistamaan 42 ja 46 kilodaltonin polypeptidit osittain puhdistettujen viruspartikkeleiden preparaateista, sekä (b) glykosyloituneet 42 ja 46 kilodaltonin polypeptidit tuntuvat vastaavan edellä mainitussa Heermanin et ai. julkaisussa kuvattuja 39 ja 42 kilodaltonin glykosyloi-mattomia polypeptidejä.

Julkaisussa Offensperger et ai., Proc. Natl. Acad. Sei.

USA, Voi. 82, sivut 7540-7544, 1985, esitetään PreS2~ peptidin ja β-galaktosidaasin välistä fuusioproteiinia koodaavan kloonatun DNA-ketjun ilmentäminen E. coli-soluissa.

Lukuisissa kirjallisuusviitteissä tarkastellaan plasmideja, jotka sisältävät hiiren metallotioneiinigeenin promoottorin .

Sekä US-patenttihakemuksessa no. 452 783 että julkaisussa Pavlakis et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Voi. 80, sivu 397, 1983, esitetään naudan papillomavirukseen perustuva yhdistelmäplasmidi, joka sisältää ihmisen kasvuhormonin (hGH) geenin sekä metallotioneiinigeenin (MMT) promoottorin.

: Eurooppalaisessa patenttihakemuksessa no EP 0 105 141A2 esitetään yhdistelmäplasmidit, jotka sisältävät S-prote- 1 is 95726 iinia koodaavan ketjun ja joko naudan papillomavirus-tyypin 1 DNA:n tai Maloney-hiiren sarkoomaviruksen DNA:n.

Hofschneiderin et ai. julkaisemissa plasmideissa käytetään mieluiten luonnollista, S-proteiinia koodaavaan ketjuun liittyvää promoottoria, mutta Hofschneider-viitteessä mainitaan myöskin (esimerkkiä kuitenkaan esittämättä), että "/eräänä7 muuna esimerkkinä edullisesta luonnollisesta eukarioottisesta ilmentämissignaalista voidaan mainita metallotioneiinisignaali hiirisoluista".

Eurooppalaisessa patenttihakemuksessa no. 0 096 492A2 esitetään koko metallotioneiinigeenin ketjun, promoottorialue mukaan lukien, sisältävien plasmidien käyttö MMT-geenin suhteen alavirran puolella sijaitsevien geenien voimakkaan ilmentymisen aikaansaamiseksi isäntinä toimivissa, tällaisella plasmidilla transformoiduissa nisäkäs-soluissa .

PCT-patenttihakemuksessa no WO 83/01783 sekä julkaisussa Palmiter et ai., Cell, Voi. 29, sivu 701, 1982, esitetään plasmidi, joka käsittää hiiren MT-1-geenin promoottorin, joka promoottori on sulautettu yhteen rakenteellisen geenin kanssa (mieluiten tymidiinikinaasin geeniin herpes simplex-viruksesta) sekä näiden plasmidien mikroinjektoiminen hiiri-sikiöihin ja siinä todetaan, että tuloksena olevan yhteen-sulautetun polypeptidituotteen geneettistä . ilmentymistä näistä sikiöistä muodostuneiden täysikasvuisten hiirien erikoistuneissa soluissa voidaan tämän jälkeen säädellä antamalla hiirelle raskasmetallien ioneja. Palmiter et ai. julkaisevat samoin plasmidit, jotka sisältävät rotan kasvuhormoniin yhteensulautetun hiiren MT-1-promoottorin, näiden plasmidien mikroinjektoimisen hiirisikiöihin sekä tuloksena olevan yhteensulautetun polypeptidituotteen geneettisen ilmentymisen säätelyn raskasmetalleja anta-- maila.

95726 16 Tässä keksinnössä hyödynnetään yhdistelmä-DNA-tekniikalla valmistettua partikkelia, joka käsittää vähintään yhden, koko PreS^PreSj-proteiinin koodaavan alueen koodaaman proteiinin.

Tässä keksinnössä käytetään samoin yhdistelmä-DNA-vektoria, joka käsittää PreS,-PreS2-proteiinia koodaavan alueen sekä hiiren metallotioneiini (MMT) -promoottorin. On suotavaa, että tämä vektori käsittää lisäksi kopioitumisen päättymis-kohdan sekä valikoinnin merkits imen.

Tässä keksinnössä käytetään samoin isäntänä toimivaa trans-fektoitua eukarioottista solua, joka on transfektoitu PreS,-PreS2-proteiinia koodaavan alueen ja MMT-promoottorin käsittävällä yhdistelmä-DNA-vektorilla. On suositeltavaa, että tähän vektoriin sisältyy lisäksi kopioitumisen päättymiskoh-ta sekä valikoinnin merkitsin. Nisäkässolu on paras isäntä. Esitetään lisäksi menetelmä tällaisen transfektoidun, isäntänä toimivan solun valmistamiseksi, joka menetelmä käsittää eukarioottisen solun transfektoimisen tämän keksinnön mukaisella yhdistelmä-DNA-vektorilla.

Esitetään samoin menetelmä vähintään yhden, koko PreS,-PreS2-proteiinin koodaavan alueen koodaaman proteiinin käsittävien partikkeleiden valmistamiseksi, joka menetelmä käsittää (a) tämän keksinnön mukaisten, transfektoitujen, isäntänä toimivien eukarioottisten solujen viljelemisen sellaisissa vilje-lyalustassa vallitsevissa olosuhteissa, että tämä isäntä kykenee ilmentämään tällaista proteiinia; ja (b) näiden partikkeleiden eristämisen. Transfektoitu isäntä kykenee mieluiten erittämään näiksi partikkeleiksi kasaantuneet proteiinit kasvualustaan. Tämä menetelmä käsittää mielellään lisäksi raskasmetallien ionien tai steroidihormonien lisäämisen tällaiseen viljelyalustaan, mikä edistää proteiinien ilmentymistä.

Tämä keksintö kohdistuu menetelmään PreS^PreSj-proteiinin koodaavan alueen koodaamia proteiineja vastaan vaikuttavien 17 95726 vasta-aineiden läsnäolon toteamiseksi nisäkkään veriseerumista saadussa näytteessä, tämän menetelmän käsittäessä vaiheet, joissa: a) näyte saatetaan kosketuksiin tämän keksinnön mukaisilla, merkitsemättömillä partikkeleilla pinnoitetun kiinteän substraatin kanssa; b) mainittua kosketuksiin saatettua näytettä inkuboidaan ja se pestään; c) mainittu kosketuksiin saatettu näyte saatetaan kosketuksiin tämän keksinnön mukaisten, merkittyjen partikkeleiden kanssa, jolloin saadaan merkitty, kosketuksiin saatettu näyte; d) mainittua merkittyä, kosketuksiin saatettua näytettä inkuboidaan ja se pestään; ja e) merkittyjen partikkeleiden määrä merkityssä, kosketuksiin saatetussa näytteessä määritetään.

Tämä keksintö kohdistuu samoin menetelmään PreS^PreSj-S-proteiinin koodaavan alueen koodaamien proteiinien läsnäolon toteamiseksi nisäkkään veriseerumista saadussa näytteessä, tämän menetelmän käsittäessä vaiheet, joissa: a) valmistetaan seos, joka sisältää tämän keksinnön mukaisten partikkeleiden käsittämän immunogeenin tuottamaa vasta-ainetta; b) näyte saatetaan kosketuksiin tämän seoksen ensimmäisen osan sekä merkityn immunogeenin kanssa, tätä ensimmäistä osaa inkuboidaan ja se pestään; c) antigeeniä sisältämätön vertailunäyte saatetaan kosketuksiin tämän seoksen toisen osan sekä merkityn immunogeenin kanssa, tätä toista osaa inkuboidaan ja se pestään; d) edellisten vaiheiden b) ja c) seoksiin lisätään sama määrä proteiinia A käsittävää stafylokokkia, molempia seoksia inkuboidaan ja neste erotetaan kiintoaineesta; ja e) merkityn immunogeenin määrä kummassakin, edellä esitetyssä vaiheessa d) tuloksena olevassa seoksessa määritetään.

Tämä keksintö kohdistuu samoin käyttövalmiiden diagnostisten aineiden pakkaukseen ("kitti") PreS,-PreS2-S-proteiinin koo- . 95726 18 daavan alueen koodaamia proteiineja vastaan vaikuttavien vasta-aineiden läsnäolon ilmaisemiseksi nisäkkään veriseerumista saadusta näytteestä tämän kitin käsittäessä: a) merkitsemättömiä proteiineja, jotka käsittävät tämän keksinnön mukaisen, kiinteään kantajaan kiinnitetyn partikkelin; ja b) ihmisen IgG:tä tai IgM:ää, esimerkiksi, vastaan vaikuttavia, merkittyjä vasta-aineita.

Tämä keksintö kohdistuu samoin diagnostiseen kittiin PreS,-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen koodaamien proteiinien läsnäolon ilmaisemiseksi nisäkkään veriseerumista saadusta näytteestä tämän kitin käsittäessä: a) tämän keksinnön mukaisten partikkeleiden tuottamia, kiinteään kantajaan kiinnitettyjä vasta-aineita; ja b) tämän keksinnön mukaisten partikkeleiden tuottamia, merkittyjä vasta-aineita.

Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa .

Tässä keksinnössä käytetään yhteistransfektoitua eukarioot-tista isantäsolua, joka on transfektoitu sekä tässä esitetyllä yhdistelmä-DNA-vektorilla että toisella yhdistelmä-DNA-vektorilla, joka käsittää PreS2-S-proteiinia koodaavan alueen tai pelkästään S-proteiinia koodaavan alueen sekä MMT-promoottorin. Tämä toinen yhdistelmävektori käsittää mielellään lisäksi kopioitumisen päättymiskohdan sekä valinnaisesti valikoinnin merkitsimen. Valinnaisesti tämä yhteistransf ektoitu isäntä on transfektoitu sekä tämän keksinnön mukaisella yhdistelmä-DNAvektorilla, toisella yhdistelmä-DNA-vektorilla että kolmannella yhdistelmä-DNA-vektorilla, joka käsittää MMT-promoottorin sekä valikoinnin merkitsimen. Tämä kolmas yhdistelmävektori käsittää mielellään lisäksi kopioitumisen päättymiskohdan.

Kuva l esittää plasmidin pBPV342-l2 osittaista restriktioen-donukleaaseilla saatua karttaa. Kuvassa 1 esitetään myös plasmidista pML2 peräisin olevan DNA:n, naudan papillooma- 19 95726 viruksen (BPV) DNA:n, MMT-promoottorin ja kopioinnin päätty-misalueen sv-PAS-t sijainti plasmidissa pBPV342-12. Kuva 1 esittää samoin plasmidin pBPV342-12 pilkkomista restriktio-endonukleaasilla BamHI.

Kuva 2 esittää hepatitis B -viruksen täydellisen, lineaarisessa muodossa olevan genomin sisältävän plasmidin pAOl osittaista, restriktioendonukleaaseilla saatua karttaa.

Samoin, kuva 2 havainnollistaa plasmidin pAOl pilkkomista restriktioendonukleaasilla EcoRI, entsyymillä EcoRI saadun lineaarisen HBV-tuotteen ligatoimista T4 DNA -ligaasilla konkatameerien muodostamiseksi ja saadun konkatameerituot-teen pilkkomista restriktioendonukleaasilla Bglll spesifisen DNAkappaleen aikaansaamiseksi, joka DNA-kappale sisältää PreS,-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueeseen liittyvän vahingoittumattoman koodaavan DNA-ketjun.

Kuva 3 esittää plasmidin pDMl osittaista, restriktioendonukleaaseilla saatua karttaa ja se havainnollistaa samoin sen muodostamista ligatoimalla plasmidin pMMT-neo käsittävä, entsyymillä BamHI saatu DNA-kappale entsyymillä Balll saatuun. hepatitis B -viruksen genomiseen kappaleeseen, joka koodaa PreSj-PreS2-S-proteiinin koodaavaa ketjua.

Kuvat 4A ja 4B esittävät plasmidin pDM2 osittaista, restriktioendonukleaaseilla saatua karttaa, ja niissä havainnollistetaan sen muodostamista ligatoimalla restriktioendonukleaasilla BamHI saatu kappale ja restriktioendonukleaaseilla BamHI ja Bglll saatu kappale, molemmat plasmidista pDMl.

Kuva 5 esittää plasmidin pDM3 osittaista, restriktioendonukleaaseilla saatua karttaa ja siinä havainnollistetaan sen muodostamista plasmideista pDMl ja PMMT-neo.

Kuva 6 on graafinen esitys, joka havainnollistaa tämän keksinnön mukaisten partikkeleiden eluoitumista BioRad-kolon-nista A5m.

20 95726

Kuva 7 on graafinen esitys tämän keksinnön mukaisten partik-keleiden tyypillisestä isopyknisestä CsCl-sentrifugoinnista, lähtien noin 30 fraktiosta, jotka ovat peräisin BioRad-ko-lonnista A5m saadusta ensimmäisestä piikistä.

Kuvat 8A, 8B ja 8C ovat käyriä, jotka havainnollistavat se-ropositiivista muuntumista, jonka tämän keksinnön mukaisten puhdistettujen partikkeleiden erilaiset laimennokset indusoivat hiirissä.

Kuvat 9A ja 9B esittävät plasmidin pENDO-1 osittaista, rest-riktioendonukleaaseilla saatua karttaa ja niissä havainnollistetaan sen monivaiheista muodostamista.

Kuva 10 esittää plasmidin pENDO-2 osittaista, restriktioen-donukleaaseilla saatua karttaa ja siinä havainnollistetaan sen muodostamista ligatoimalla plasmideista pENDOl ja pDM2 restriktioendonukleaaseilla saatuja DNA-kappaleita.

Kuva 11 esittää plasmidin pENDO-O osittaista, restriktioendonukleaaseilla saatua karttaa ja siinä havainnollistetaan sen muodostamista.

Käsitteellä "PreS,-PreS2-S-proteiinin koodaava alue" tarkoitetaan HBV-viruksen DNA-genomin sitä aluetta, joka koodaa PreS,-PreS2-S-polypeptidinä tunnettua koko polypeptidiä ja joka alue käsittää kaikki kodonit ensimmäisen metioniinin kodonista alkaen ja päättyen lopulliseen päättämiskodoniin (TAA), joka ei määritä minkään aminohapon liittämistä vaan joka saa aikaan luennan päättymisen, tai tällaisen koodaavan alueen mitä tahansa toiminnallista johdannaista. Tämän alueen koodaamia proteiineja ovat esimerkiksi PreS,-PreS2-S-po-lypeptidi (389 aminohappojäännöstä HBV-alatyypissä adw esimerkiksi) , PreS2-S-polypeptidi (281 aminohappojäännöstä HBV-alatyypissä adw, esimerkiksi) sekä S-polypeptidi (226 aminohappo jäännöstä HBV-alatyypissä adw, esimerkiksi). Edullisimmat PreSi-PreS2-S-proteiinia koodaavat alueet ovat peräisin seuraavista alatyypeistä: adr, ayw, adyw ja adw. Käsit- 11 95726 21 teellä "toiminnallinen johdannainen" tarkoitetaan PreS,-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen mitä tahansa sellaista johdannaista, jonka koodaamat polypeptidit partikkeliksi kasautuneena toimivat immunogeenisen aktiivisuuden suhteen olennaisesti samalla tavalla kuin luonnollisen PreSj-PreS^S-proteiinin koodaavan alueen koodaamista polypeptideistä kasautumalla muodostuva partikkeli. Näitä johdannaisia ovat PreSj-PreSj-S-proteiinin koodaavan alueen osittaiset ketjut, sekä tällaisesta koodaavasta alueesta muuntamalla saadut johdannaiset. Tekniikat tällaisen koodaavan alueen muuntamiseksi ovat alalla tunnettuja ja niitä ovat esimerkiksi käsittely kemiallisella tai biologisella mutageenilla, sä-teilyttäminen tai suora geneettinen manipulointi, kuten nukleiinihappojen istuttaminen, hävittäminen tai korvaaminen entsyymejä tai muita yhdistelmä-DNA-tekniikan ja molekyylibiologian menetelmiä käyttäen.

Käsitteellä "PreS2-S-proteiinin koodaava ketju" tarkoitetaan HBV-viruksen DNA-genomin sitä aluetta, joka koodaa PreS2-S-polypeptidinä tunnettua koko polypeptidiä ja joka alue käsittää kaikki kodonit ensimmäisen metioniinin kodonista alkaen ja päättyen lopulliseen päättämiskodoniin (TAA), joka ei määritä minkään aminohapon liittämistä, kuten edellä esitetään, tai tällaisen koodaavan alueen mitä tahansa toiminnallista johdannaista. Tämän alueen koodaamia proteiineja ovat esimerkiksi PreS2-S-polypeptidi (218 aminohappojäännös -tä HBV-alatyypissä adw) ja S-polypeptidi (226 aminohappo-jäännöstä HBV-alatyypissä adw, esimerkiksi). Edullisimmat PreS2-S-proteiinin koodaavat alueet ovat peräisin seuraavista alatyypeistä: adr, ayw, adyw ja adw. Käsitteellä "toiminnallinen johdannainen" tarkoitetaan PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen mitä tahansa sellaista johdannaista, jonka koodaamat polypeptidit partikkeliksi kasautuneena toimivat immunogeenisen aktiivisuuden suhteen olennaisesti samalla tavalla kuin luonnollisen Pres2-S-proteiinin koodaavan alueen korjaamista polypeptideistä kasautumalla muodostuva partikkeli. Tällaisia johdannaisia ovat esimerkiksi PreS2-S-pro-teiinia koodaavan alueen osittaiset ketjut sekä tällaisesta 22 9 5 7 2 6 koodaavasta alueesta muuntamalla saadut johdannaiset. Tekniikat, joita voidaan käyttää tällaisen koodaavan alueen muuntamiseen, ovat tunnettuja alalla ja eräitä näistä on kuvattu edellä.

Käsitteellä "S-proteiinin koodaava ketju" tarkoitetaan HBV-viruksen DNA-genomin sitä aluetta, joka koodaa S-polypepti-dinä tunnettua koko polypeptidiä ja joka alue käsittää kaikki kodonit ensimmäisen metioniinin kodonista alkaen ja päättyen lopulliseen päättämiskodoniin (TAA), joka ei määritä minkään aminohapon liittämistä, kuten edellä esitetään, tai tällaisen koodaavan alueen mitä tahansa toiminnallista johdannaista. Tämän alueen koodaamia proteiineja ovat esimerkiksi S-peptidi (226 aminohappojäännöstä HBV-alatyypissä adw, esimerkiksi). Edullisimmat S-proteiinin koodaavat alueet ovat peräisin seuraavista HBV-alatyypeistä: adr, ayw, adyw ja adw. Käsitteellä "toiminnallinen johdannainen" tarkoitetaan S-proteiinin koodaavan alueen mitä tahansa sellaista johdannaista, jonka koodaamat polypeptidit partikkeliksi kasautuneena toimivat immunogeenisen aktiivisuuden suhteen olennaisesti samalla tavalla kuin luonnollisen S-proteiinin koodaavan alueen koodaamista polypeptideistä kasautumalla muodostuva partikkeli. Näitä johdannaisia ovat esimerkiksi S-proteiinin koodaavan alueen osittaiset ketjut sekä tällaisesta koodaavasta alueesta muuntamalla saadut johdannaiset. Tekniikat, joita voidaan käyttää tällaisen koodaavan alueen muuntamiseen, ovat tunnettuja alalla ja eräitä niistä on kuvattu edellä.

Käsitteellä promoottorin tarkoitetaan DNA-molekyylissä geenin suhteen ylävirran puolella sijaitsevaa DNA-ketjua, joka ohjaa isäntäsolun asianmukaisen RNA-polymeraasikompleksin kiinnittymistä DNA-molekyyliin tiettyyn kohtaan tässä DNA-molekyylissä siten, että RNA-polymeraasikompleksi sijoittuu oikealla tavalla geenin kopioitumisen aloittamiseksi tietystä pisteestä DNA-molekyylissä, mikä johtaa yhden DNA-juos-teen RNA-kopion synteesiin.

Il 95726 23 Käsitteellä "kopioituminen" tarkoitetaan isäntäsolun biosyn-teesimekanismin, RNA-polymeraasikompleksit mukaan lukien, suorittamaa prosessia, jossa, yhtä kahdesta toisiaan täydentävästä DNA-juosteesta mallina käyttäen, ribonukleotidit polymeroituvat peräkkäin suunnassa 5' - 3' (suunnassa 3' -5' mallina toimivan DNA-juosteen suhteen), jolloin saadaan tämän yhden DNA-juosteen täsmällinen kopio, joka kuitenkin sisältää ribonukleotidejä deoksiribonukleotidien asemasta.

Käsitteellä "kopioitumisen päättävä ketju" tarkoitetaan DNA-molekyylin sitä aluetta, josta käytetään merkintää t, joka alue antaa kopiointiprosessiin osallistuvalle RNA-polymeraa-sikompleksille signaalin tämän kopioimisprosessin päättämiseksi, jolloin saatua RNA-molekyyliä voidaan jatkokäsitellä asianmukaisesti, mikä käsittää esimerkiksi polyadenylaation ja kuljettamisen niiden RNA-molekyylien tapauksessa, joita RNA-molekyylejä on tarkoitus käyttää lähetti-RNA-molekyylei-nä isäntäsolun sytoplasmassa.

Käsitteellä "polyadenylaatio" tarkoitetaan prosessia, jossa isäntäsolun biosynteesikoneisto tunnistaa RNA-molekyylistä erityisen ketjun, tavallisesti 5'-AATAAA-3', jota nimitetään polyadenylaation signaaliksi, PAS, ja se ohjaa malliin perustumattoman polyriboadenylaattiryhmän liittämistä mainitun molekyylin 3'-päähän, noin 15 - 20 nukleotidiä signaalista alavirtaan (3'-pään suunnassa) tämän liittämisen tapahtuessa erityisesti entsyymillä poly-A-polymeraasi.

Käsitteellä "valikoinnin merkitsin" tarkoitetaan geenideter-minanttia, joka solussa ilmentyessään saa soluun aikaan tiettyjä ominaisuuksia, joiden avulla tällainen solu on tunnistettavissa tai valikoitavissa muista soluista, jotka eivät sisällä tai ilmennä mainittua geenideterminanttia.

Edullisia valikoinnin merkitsimiä ovat esimerkiksi lääkeaineen vastustuskykyyn perustuvat merkitsimet. Käsitteellä "lääkeaineen vastustuskykyyn perustuva merkitsin" tarkoitetaan valikoinnin merkitsimien erityistä luokkaa, joka solun 95726 24 ilmentäessä tällaista merkitsintä saa aikaan sen, että solu kykenee vastustamaan sellaisen lääkeaineen tai antibiootin tappavia vaikutuksia, jotka lääkeaineet tai antibiootit tavallisesti salpaavat solun kasvun tai tappavat solun, mikäli se ei käsitä tai ilmennä mainittua lääkeaineen vastustuskykyyn perustuvaa merkitsintä.

Edullisia lääkeaineen vastustuskykyyn perustuvia merkitsimiä ovat esimerkiksi neomysiinin vastustuskyvyn aikaansaavan geenin, neo, koodaava ketju; Eco-gpt-geenin (Mulligan, R.C. ja Berg. P., Science, Voi. 209, sivu 1422, 1980) koodaava ketju: dihydrofolaattireduktaasi(DHFR)-geenin koodaava ketju (Ringold, G. et ai., J. of Molec. and Appld. Genet., Voi.

1, sivu 165, 1981).

Käsitteellä "partikkelit, jotka käsittävät vähintään yhden, koko PreS,-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen koodaaman proteiinin" tarkoitetaan hepatitis B -partikkelia, joka ei sisällä lainkaan nukleiinihappoa ja joka on muodostunut kasautumalla koko PreS]-, PreS2- ja S-alueella transfektoidun eu-karioottisen solun viljelmän hajotteeseen (lysaatti) tai hajotteesta, tällaisen partikkelin sisältäessä pääasiallisesti S-polypeptidistä (dimeeri) muodostuneita alayksiköitä, jotka ovat myös muodostuneet pienemmistä määristä koko PreS,-PreS2-S--polypeptidiä, valinnaisesti, PreS2-S-polypeptidiä.

Tässä keksinnössä käytetään yhdistelmä-DNA-vektoria, joka käsittää PreS,-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen sekä MMT-promoottorin. MMT-promoottori voidaan sisällyttää DNA-vektoriin joko DNA-ketjun luonnollisen promoottorin lisäksi (hepatitis B -viruksen promoottorin) tai hepatitis B -viruksen promoottorin tilalle. MMT-vektori sijoitetaan DNA-vek-torissa mieluiten välittömästi ylävirran puolelle PreS,-PreS2-S-proteiinin koodaavasta alueesta. Tällainen vektori käsittää mielellään samoin kopioitumisen päättämisketjun sekä valikoinnin merkitsimen. Tällainen valikoinnin merkitsin on mieluiten lääkeaineen vastustuskykyyn perustuva merkitsin, kuten neomysiinigeeni. Tällainen kopioitumisen 95726 25 päättämisket ju on mielellään SV40-viruksen päättämiskohta (sv-PAS-t) tai mieluummin DEF-alue (mg-PAS-t) hiiren glo-biinigeenistä. SV40-päättämisketju on alalla hyvin tunnettu ja se kuvataan monissa julkaisuissa, kuten Mulligan ja Berg, Science, Voi. 209, sivu 1422, 1980. Hiiren globiinigeenin DEF-alue kuvataan julkaisussa Falck-Pederson et ai., Cell,

Voi. 40, sivu 897, 1985. Tällainen vektori voidaan muodostaa tavanomaisilla yhdistelmä-DNA-tekniikoilla ja muilla molekyylibiologian menetelmillä. Edullisimmassa tapauksessa, mg-PAS-t-aluetta käyttäen, tämä vektori ei sisällä lainkaan virus-DNA:n kappaleita ja se ei ole onkogeeninen eli se ei transformoi (tee syöpää aiheuttavaksi) yhtäkään isän-täsolua, johon se on istutettu. Kun tällainen vektori transfektoidaan isäntään, mikäli se ei sisällä autonomista replikaatioketjua (replikonia), joka kykenee toimimaan tällä vektorilla transfektoidussa isännässä, niin se yhtenäistyy isäntäkromosomiin ja replikoituu passiivisesti isäntägenomin kanssa.

Tässä keksinnössä käytetyllä yhdistelmä-DNA-vektorilla tulisi mielellään olla seuraavat tunnusomaiset piirteet: 1) PreS,-PreS2-S-proteiinin koodaava alue; 2) MMT-promoottori, joka sijaitsee välittömästi ylävirran puolella PreSj-PreSj-S-proteiinin koodaavasta alueesta; 3) tämän vektorin tulisi kyetä replikoituinaan bakteereissa tai muussa prokarioottisessa isännässä, johon se on transformoitu, kasvamiseksi, monistumiseksi sekä yhdistelmävekto-rin suurten määrien tuottamiseksi. Täten tällaisen vektorin tulisi käsittää bakteeriperäisen tai muun prokarioottisen replikonin eli DNA-kappaleen, joka sisältää ne kaikki toiminnot, joita tarvitaan autonomiseen replikoitumiseen sekä vektorin ylläpitämiseen kromosomien ulkopuolella isäntänä toimivassa prokarioottisessa solussa, kuten isäntänä toimivassa bakteerisolussa, joka on transformoitu tällä vektorilla. Tällaiset replikonit ovat alalla hyvin tunnettuja; 4) vektorireplikonin tulisi olla pieni (eli pienempi kuin 6-8 kiloemäsparia), jotta sen helppo geneettinen ja molekyylibiologinen manipuloiminen olisi mahdollista; 95726 26 5) vektorin tulisi käsittää valikoinnin merkitsin, mielellään lääkeaineen, kuten ampisilliinin, vastustuskykyyn perustuva merkitsin tällä vektorilla transformoiduissa isäntänä toimivissa bakteerisoluissa käyttöä varten; 6) vektorin tulisi käsittää toinenkin valikoinnin merkitsin, mielellään lääkeaineen, kuten neomysiinin, vastustuskykyyn perustuva merkitsin, tällä vektorilla transfektoiduissa eu-karioottisissa isäntäsoluissa sellaisenaan käytettäväksi; 7) vektorin tulisi sisältää sopivia endonukleaasien restrik-tiokohtia kloonaamista varten; 8) vektorin tulisi sisältää kopioitumisen päättämisketju ja polyadenylaation ketju.

Vektori ei mieluiten käsitä autonomista replikaatioketjua (replikonia), joka kykenee toimimaan tällä vektorilla trans-fektoidussa, eukarioottisessa isäntäsolussa. Pääasiallinen syy siihen, että eukarioottisissa isäntäsoluissa käytetään replikoitumatonta vektorijärjestelmää, on se, että kaikki ne vektorijärjestelmät, jotka kykenevät autonomiseen ja kromosomien ulkopuoliseen replikoitumiseen isäntänä toimivassa, eukarioottisessa, tällaisella vektorilla transfektoidussa nisäkässolussa, käsittävät onkogeenisistä viruksista saatuja repiikoneja. On toivottavaa, että farmaseuttisesti mielenkiintoisia polypeptidejä, kuten esimerkiksi PreS]-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen koodaamia proteiineja, koodaavi-en DNA-ketjujen ilmentämiseen käytetään vektoreita, joiden käsittämä DNA ei ole peräisin onkogeenisistä viruksista.

Tässä keksinnössä käytetty vektori käsittää MMT-promootto-rin. MMT-promoottori ei ole virusperäinen, ja se on voimakas kopioitumisen promoottori. MMT-promoottorin koodaava ketju esitetään julkaisussa Pavlakis ja Hamer, Proc. Natl. Acad.

Sei., Voi. 11, sivu 397, 1983. MMT-promoottoria voidaan säätää raskasmetallien ioneilla, kuten sinkin ja kadmiumin ioneilla, sekä steroidihormoneilla kuten deksametasonilla.

Tällainen säätely on hyvin tunnettua (katso esimerkiksi julkaisu Yagle ja Palmiter, Molecular and Cellular Biol., Voi.

5, sivu 291, 1985} .

27 9572.6

Esitetään myös transfektoitu eukarioottinen isäntäsolu, joka on transformoitu tämän keksinnön mukaisella yhdistelmä-DNA-vektorilla. Tämä isäntä on mielellään nisäkässolu, mieluiten kiinanhamsterin munasarjan (CHO) solulinja, vero-solu-linja, L-solulinja tai hiirestä tai rotasta saatu fibroblas-tinen solulinja. Tällainen isäntä voidaan valmistaa trans-fektoimalla eukarioottinen solu tämän keksinnön mukaisella yhdistelmä-DNA-vektorilla käyttäen tavanomaisia tekniikoita, kuten esimerkiksi menetelmää, joka esitetään julkaisussa Graham ja van der Eb, Virology, Voi. 52, sivu 456, 1973, tai Wigler, M. Cell, Voi. 141, sivu 725, 1978.

Esitetään samoin menetelmä PreSj-PreSj-S-proteiinin koodaavan alueen koodaamia proteiineja käsittävän partikkelin valmistamiseksi, jossa partikkelissa vähintään yksi näistä proteiineista vastaa koko PreS,-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen koodaamaa polypeptidiä, tämän menetelmän käsittäessä vaiheet, joissa: a) tämän keksinnön mukaista transfektoitua isäntää viljellään sellaisissa viljelyalustassa vallitsevassa olosuhteissa, että tällainen isäntä kykenee ilmentämään näitä proteiineja, ja b) tällainen partikkeli eristetään.

Tällainen yhteistransfektoitu isäntä kykenee mieluiten erittämään tällaisiksi partikkeleiksi kasautuneet proteiinit alustaan. Kasvatusalustaan lisätään mielellään raskasmetallien ioneja tai steroidihormoneja, kuten deksametasonia, | MMT-promoottorin indusoimiseksi, mikä täten edistää tällai sen koodaavan alue en ilmentymistä. Raskasmetallien ioneina käytetään mieluiten kadmiumin tai sinkin ioneja. Raskasmetallien ionien tai steroidihormonin optimaalinen pitoisuus alustassa voidaan määrittää tavanomaisin tekniikoin.

Mikäli transfektoitu isäntäsolu erittää partikkelit suoraan viljelyalustaan, niin tällöin nämä partikkelit voidaan eristää transfektoidun isännän viljelyalustasta proteiinien eristämiseen tavanomaisesti käytetyillä tekniikoilla. Mikäli transfektoitu isäntäsolu ei eritä näitä partikkeleita, niin tällöin ne saadaan tämän isännän viljelmän hajotteesta viljelmän hajottamiseksi tavanomaisesti käytetyillä teknii- . 95726 28 koilla. Nämä. partikkelit saadaan glykolysoituneina, ja ne muodostavat PreS,-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen koodaamista proteiineista, käsittäen vähintään yhden koko PreS,-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen koodaaman proteiinin.

Esitetään myös rokote, joka käsittää immunologisesti suojaa-van määrän tämän keksinnön mukaisia partikkeleita. Käsitteellä "immunologisesti suojaava määrä" tarkoitetaan tämän keksinnön mukaisten partikkeleiden sitä määrää (mielellään 1-20 μg), joka tarvitaan vasta-aineiden indusoimiseksi ja niiden tason pitämiseksi isännässä riittävänä neutraloimaan infektoiva aine sekä estämään mainitun infektoivan aineen lisääntyminen ja siitä johtuva sairastuminen.

Esitetty partikkeli ei sisällä lainkaan virusperäisiä DNA-komponentteja ja näin ollen sillä ei ole tavallisesti luonnollisista lähteistä peräisin oleviin rokotteisiin liittyviä epätoivottuja sivuvaikutuksia, kuten tahaton infektoiminen viruksella, allergiset reaktiot, kuumeet ja muut vastaavat. Rokotetta, joka käsittää immunologisesti suojaavan määrän esillä olevia partikkeleita, voidaan käyttää parantamaan HBV:n aiheuttamaa immuunireaktiota ja sillä voidaan välttää reagoimattomuus sellaisille hepatitis B -virusta vastaan vaikuttaville rokotteille, jotka eivät sisällä koko PreS^ PreS2-S-proteiinin koodaavan ketjun koodaamia proteiineja.

Rokote voidaan valmistaa sekoittamalla immunologisesti suojaava määrä tämän keksinnön mukaisia partikkeleita sopivaan puskuriin kuten fosfaatilla puskuroituun suolaliuokseen.

Tämä rokote voi lisäksi käsittää apuainetta, kuten alumiinihydroksidia tai muuta vastaavaa.

Vaihtoehtoisesti esitettyjen partikkeleiden käsittämät poly-peptidit voidaan irrottaa mainituista partikkeleista ja liittää uudestaan lipidivesikkeliin. Hepatitis B -virusta vastaan vaikuttava rokote voidaan valmistaa käyttäen tämän keksinnön mukaisia polypeptidejä käsittäviä mainittuja lipi-divesikkeleitä. Asianmukaisena pitoisuutena olevia lipidi- 29 9 5 7 2 6 vesikkeleitä voidaan käyttää rokotteena apuainetta, kuten alumiinihydroksidia, käyttäen tai käyttämättä.

Rokotteen partikkeleita voidaan käyttää yhdessä fysiologisesti hyväksyttävän laimentimen (väliaine), kuten fosfaatilla puskuroidun suolaliuoksen, kanssa.

Rokotetta, joka käsittää immunologisesti suojaavan määrän esitettyjä partikkeleita, voidaan valmistaa ja käyttää yleisesti samalla tavalla, joka julkaistaan US-patenttijulkai-sussa no. 4 118 479, jonka koko sisältö liitetään oheen tällä viittauksella.

Rokotetta voidaan antaa ihon alaisesti, ihon sisäisesti tai lihaksen sisäisesti injektoimalla. Edullisin antoreitti riippuu erityisestä rokotteesta, mutta kuitenkin uskotaan, että lihaksen sisään injektoiminen on yleensä sopivinta. Antokertojen tiheys vaihtelee rokotteesta riippuen.

Tämä keksintö kohdistuu menetelmään PreS,-PreS2S-proteiinin koodaavan alueen koodaamia proteiineja vastaan vaikuttavien vasta-aineiden läsnäolon ilmaisemiseksi nisäkkään veriseerumista otetusta näytteestä, tämän menetelmän käsittäessä vaiheet, joissa: a) näyte saatetaan kosketuksiin tämän keksinnön mukaisilla ’ merkitsemättömillä partikkeleilla pinnoitetun kiinteän kan tajan kanssa; b) mainittua kosketuksiin saatettua näytettä inkuboidaan ja se pestään; c) mainittu kosketuksiin saatettu näyte saatetaan kosketuksiin tämän keksinnön mukaisten merkittyjen partikkeleiden ) kanssa, jolloin saadaan merkitty, kosketuksiin saatettu näy te ; d) mainittua merkittyä, kosketuksiin saatettua näytettä inkuboidaan ja se pestään; ja e) merkittyjen partikkeleiden määrä merkityssä, kosketuksiin saatetussa näytteessä määritetään.

30 9 5 7 2 6 Tämä keksintö kohdistuu samoin menetelmään PreSj-PreSj-S-pro-teiinin koodaavan alueen koodaamien proteiinien läsnäolon ilmaisemiseksi nisäkkään veriseerumista saadusta näytteestä, tämän menetelmän käsittäessä vaiheet, joissa; a) valmistetaan seos, joka sisältää tämän keksinnön mukaisten partikkeleiden käsittämän immunogeenin tuottamaa vasta-ainetta; b) näyte saatetaan kosketuksiin tämän seoksen ensimmäisen osan sekä merkityn immunogeenin kanssa, tätä ensimmäistä osaa inkuboidaan ja se pestään; c) antigeeniä sisältämätön vertailunäyte saatetaan kosketuksiin tämän seoksen toisen osan sekä merkityn immunogeenin kanssa, tätä toista osaa inkuboidaan ja se pestään; d) edellisten vaiheiden b) ja c) seoksiin lisätään sama määrä proteiinia A käsittävää stafylokokkia, molempia seoksia inkuboidaan ja neste erotetaan kiintoaineesta; ja e) merkityn immunogeenin määrä kummassakin, edellä esitetyssä vaiheessa d) tuloksena olevassa seoksessa määritetään.

Tämä keksintö kohdistuu samoin diagnostiseen kittiin PreS,-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen koodaamia proteiineja vastaan vaikuttavien vasta-aineiden läsnäolon ilmaisemiseksi nisäkkään veriseerumista saadusta näytteestä, tämän kitin käsittäessä: a) merkitsemättömiä proteiineja, jotka käsittävät tämän keksinnön mukaisen, kiinteään kantajaan kiinnitetyn partikkelin; ja b) ihmisen IgG:tä tai IgM:ää, esimerkiksi, vastaan vaikuttavia, merkittyjä vasta-aineita.

Tämä keksintö kohdistuu samoin diagnostiseen kittiin PreS,-! PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen koodaamien proteiinien läsnäolon ilmaisemiseksi nisäkkään veriseerumista saadusta näytteestä, tämän kitin käsittäessä: a) tämän keksinnön mukaisten partikkeleiden tuottamia, kiinteään kantajaan kiinnitettyjä vasta-aineita; ja b) tämän keksinnön mukaisten partikkeleiden tuottamia, merkittyjä vasta-aineita.

31 95726 Tämä keksintö käsittää samoin diagnostiset kokeet hepatitis B -viruksen pinnan antigeenien ja näiden antigeenien vaikutuksesta muodostuneiden vasta-aineiden ilmaisemiseksi suoraan. Radioimmunokoetta (RIA) tai entsyymiin kytketyn im-munosorbentin koetta (ELISA) käytetään PreS,-PreS2-S-proteiinin koodaavien alueiden koodaamia proteiineja sisältävien HBV-antigeenien ilmaisemiseksi HBV-viruksella infektoituneiden eläinten, kuten ihmisten, seerumista. Eräs diagnostinen koe käsittää seuraavat vaiheet: 1. kiinteä substraatti, jonka pinnalla on sitoutumiskohtia, kuten polystyreenihelmien muodostama substraatti, pinnoitetaan sellaisten partikkeleiden vaikutuksesta muodostuneilla vasta-aineilla, jotka partikkelit sisältävät PreS,-PreS2-S-proteiinia sisältävien polypeptidien aminohappoketjuja vastaavia aminohappoketjuja; 2. tämän jälkeen pinnoitetut helmet pestään esimerkiksi Tris-puskuroidulla suolaliuoksella ylimääräisten vasta-aineiden poistamiseksi; 3. sitten helmet saatetaan kosketuksiin proteiinia sisältävän liuoksen, kuten esimerkiksi naudan seerumin albumiinia (BSA) tai gelatiinia sisältävän liuoksen, kanssa helmien pinnalla olevien proteiinin sitoutumiskohtien kyllästämiseksi (epäspesifisen sitoutumisen vähentämiseksi). Tällaisen proteiinia sisältävän liuoksen sopivana pitoisuutena voidaan käyttää esimerkiksi arvoja 1-50 mg/ml; 4. sitten helmet pestään ylimääräisen BSA:n tai gelatiinin poistamiseksi; 5. tämän jälkeen helmiä inkuboidaan sellaisten seerumi- r näytteiden kanssa, joiden näytteiden epäillään sisältävän HBV-viruksia tai HBV-viruksen pinnan antigeenejä (vertailuna käytetään normaalia seerumia); 6. tämän jälkeen helmet pestään liuoksena, esimerkiksi Tris-puskuroidulla suolaliuoksella ja ne sekoitetaan HBV-viruksen pinnan antigeenejä vastaan vaikuttavaan, radioaktiivisesti merkittyyn vasta-aineeseen, kuten esimerkiksi 125I-merkittyyn vasta-aineeseen; 7. tämän jälkeen helmiä inkuboidaan; ja 8. helmet pestään ja lasketaan gammalaskurilla.

32 95726 Tässä esitettyjä PreS,-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen koodaamia partikkeleita voidaan käyttää diagnostisena välineenä HBV-viruksen pinnan antigeeniproteiinissa olevia PreS^PreS^S-alueita vastaan vaikuttavien vasta-aineiden ilmaisemiseksi tietystä näytteestä. PreS,-PreS2-S-polypepti-diä sisältäviä partikkeleita absorboidaan kiinteään substraattiin, jonka pinnalla on sitoutumiskohtia, esimerkiksi polystyreenihelmien pinnalle. Tämän jälkeen substraatti saatetaan kosketuksiin erään aineen, esimerkiksi gelatiinin, BSA:N tai maitojauheen kanssa substraatin pinnalla olevien epäspesifisten sitoutumiskohtien kyllästämiseksi. Tämän jälkeen substraatti pestään puskuroidulla liuoksena ja sitten puskuri poistetaan. Substraattiin lisätään eläimen seerumilla laimennettu näyte, esimerkiksi ihmisseerumin näyte. Tuloksena saatua massaa inkuboidaan ja se pestään. Tämän jälkeen massaan lisätään ihmisen IgGrtä tai IgM:ää vastaan vaikuttavia, radioaktiivisesta merkittyjä, esimerkiksi jo-dattuja (125I) vasta-aineita. Tuloksena olevaa massaa inkuboidaan, ja sitten se pestään ja lasketaan, esimerkiksi gamma-laskurilla. Mikäli laskurilla saatu tulos on suurempi kuin vertailuna toimineesta normaalista seerumista gammalaskuril-la saatu tulos, niin tällöin näyte sisältää HBV-viruksen PreS,-PreS2-S-koodaavia alueita vastaan vaikuttavia vasta-aineita.

. Oletetaan, että edellä esitettyä toimenpidesarjaa HBV-viruk sen PreS[-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen koodaamia proteiineja vastaan vaikuttavien vasta-aineiden ilmaisemiseksi voidaan käytttää diagnostisena välineenä, jolla voidaan ilmaista hepatitis B -viruksen aiheuttama infektio.

Diagnostiseen kokeeseen käytettävä reagenssikitti HBV-geno-missa olevien PreS]-PreS2-S-proteiinin koodaavien alueiden koodaamien antigeenien toteamiseksi testattavasta näytteestä voi käsittää seuraavat komponentit: 1. tämän keksinnön mukaisissa HBV-viruksen pinnan anti-geenipartikkeleissa olevia PreSj-PreS2-S-alueita vastaavia 95726 33 aminohappoketjuja käsittävää partikkelia vastaan vaikuttavilla vasta-aineilla pinnoitettu kiinteä substraatti; 2. proteiinia sisältävä liuos tämän kiinteän substraatin pinnalla olevien proteiinin sitoutumiskohtien kyllästämiseksi; ja 3. tietty määrä radioaktiivisesti merkittyä vasta-ainetta, esimerkiksi HBV-viruksen pinnan antigeenipolypeptidejä vastaan vaikuttavaa vasta-ainetta,

Toinen diagnostiseen kokeeseen käytettävä reagenssikitti hepatitis B -viruksen genomissa olevan PreSj-PreSj-S-proteiinin koodaavan alueen koodaamia proteiineja vastaan vaikuttavien vasta-aineiden toteamiseksi testattavasta näytteestä käsittää seuraavat komponentit: 1. kiinteä substraatti, jonka pinnalle on adsorboitu tämän keksinnön mukaisiin HBV-viruksen pinnan antigeeniproteiinei-hin liittyviä PreSj-PreSj-S-proteiinin koodaavia alueita vastaavia aminohappoketjuja sisältäviä partikkeleita, ja tämä substraatti käsitellään proteiinia sisältävällä liuoksena tämän kiinteän substraatin pinnalla olevien epäspesifisten proteiinin sitoutumiskohtien kyllästämiseksi; ja 2. tietty määrä ihmisen IgG:tä tai IgM:ää vastaan vaikuttavia, radioaktiivisesta merkittyjä vasta-aineita.

Edellä kuvatuissa reagenssikiteissä käytettävät, radioaktiivisesti merkityt vasta-aineet voidaan pakata liuoksen muotoon tai lyofilisoituun muotoon, joka voidaan palauttaa alkuperäiseen muotoonsa. Tämän lisäksi entsyymiin kytketyillä tai fluoresoivasti merkityillä vasta-aineilla voidaan korvata kuvatut radioaktiivisesta merkityt vasta-aineet.

i Edellä kuvattua reagenssikittiä ja toimenpidesarjaa hepati tis B -viruksen PreS,-PreS2-S-koodaavaa aluetta vastaavia po-lypeptidejä vastaan vaikuttavien vasta-aineiden toteamiseksi voidaan käyttää hyväksi eräissä sovellutuksissa, kuten määritettäessä HBV-infektio potilaasta ottamalla potilaasta seerumia ja käyttämällä edellä kuvattua koetta tai edellä kuvattua reagenssikittiä; ja ennustettaessa mahdollisuus 34 9 5 7 2 6 parantua HBV-infektiosta ottamalla seerumia infektoidusta potilaasta ja käyttämällä kuvattuja toimenpiteitä vasta-aineen ilmaisemiseksi.

Koetoimenpiteitä ja reagenssikittejä vasta-aineen ilmaisemiseksi voidaan käyttää eri HBV-rokotteiden kvalitatiiviseen vertailuun siten, että rokotetuista potilaista otetaan seerumia, jonka jälkeen käytetään edellä kuvattuja koetoimenpiteitä tai kittejä vasta-aineiden ilmaisemiseksi. Yleisesti, kaikki tunnetut immunologiset kokeet, joissa käytetään tätä antigeeniä reagenssina, voidaan suorittaa käyttäen tämän keksinnön mukaisia, PreS,-, PreS2- tai S-proteiinia sisältäviä partikkeleita. Yleisesti, kaikki tunnetut immunologiset kokeet, joissa käytetään vasta-ainetta sisältävää seerumia tai reagensseja, voidaan toteuttaa käyttäen vasta-aineseeru-mia, joka on tuotettu käyttämällä tämän keksinnön mukaisilla yhdistelmä-DNA-tekniikoilla tuotettua peptidiä. Näihin immunologisiin kokeisiin kuuluvat kaikki ne kokeet, jotka Lan-gone ja Van Vunakis esittävät teoksessa Methods of Enzymolo-gy, Academic Press. Voi. 70, 73 ja 74. Ne kokeet, jotka esitetään seuraavissa US-patenttijulkaisuissa: 4 459 359, 4 343 896, 4 331 761, 4 292 403, 4 228 2401, 4 157 280, 4 152 411, 4 169 012, 4 016 043, 3 839 153, 3 654 090 ja Re 31 006 sekä teoksen Methods of Enzymology volyymeissa 70, 73 ja 74, liitetään oheen tällä viittauksena.

i

Esitetään samoin yhteistransfektoitu eukarioottinen isän-täsolu, joka on transfektoitu sekä esitetyllä yhdistelmävek-torilla että toisella yhdistelmä-DNA-vektorilla, joka käsittää PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen, tai pelkästään S-proteiinin koodaavan alueen, sekä MMT-promoottorin. Tämä ! toinen yhdistelmävektori käsittää mielellään lisäksi kopioi- tumisen päättyrniskohdan ja valinnaisesti valikoinnin merkit-simen. Valinnaisesti, tämä yhteistransfektoitu isäntä on transfektoitu sekä esitetyllä yhdistelmä-DNA-vektorilla, toisella yhdistelmä-DNA-vektorilla että kolmannella yhdistelmä-DNA-vektorilla, joka käsittää MMT-promoottorin ja valikoinnin merkitsimen. Tämä kolmas yhdistelmävektori käsit 35 95726 tää mielellään lisäksi kopioitumisen päättymiskohdan. Toinen ja valinnainen kolmas yhdistelmä-DNA-vektori sisältävät mielellään myös replikonin, joka mahdollistaa kasvun ja monistumisen prokarioottisessa isäntäsolussa. kuten bakteerin muodostamassa isäntäsolussa, kun tällainen isäntä transformoidaan mainitulla toisella tai valinnaisella kolmannella yhdistelmä-DNA-vektorilla.

Näiden yhteistransfektoitujen isäntäsolujen valmistamismene-telmä käsittää eukarioottisen solun transfektoimisen sekä esitetyllä yhdistelmä-DNA-vektorilla, edellä kuvatulla toisella yhdistelmä-DNA-vektorilla, että valinnaisesti kolmannella edellä kuvatulla yhdistelmä-DNA-vektorilla. Toinen ja valinnainen kolmas edellä kuvattu yhdistelmä-DNA-vektori voidaan muodostaa tavanomaisilla tekniikoilla. Mikäli valinnaista kolmatta vektoria ei käytetä, niin toinen yhdistelmä -DNA- vektori käsittää mielellään lisäksi valikoinnin merkitsimen, kuten lääkeaineen vastustuskykyyn perustuvan merkitsimen. Mikäli toinen ja/tai valinnainen kolmas yhdis-telmä-DNA-vektori käsittää kopioitumisen päättymiskohdan, niin tämä kohta on mielellään mg-PAS-t-päättymiskohta.

Edellä kuvatussa toisessa yhdistelmä-DNA-vektorissa MMT-pro-moottori sijaitsee mielellään tässä vektorissa välittömästi ylävirran puolella PreS2-S-proteiinin koodaavasta alueesta.

Edellä kuvatussa valinnaisessa kolmannessa yhdistelmä-DNA-vektorissa MMT-promoottori sijaitsee mielellään tässä vektorissa välittömästi ylävirran puolella valikoinnin merkitsi -mestä. On suotavaa, ettei edellä kuvattu toinen yhdistelmä-vektori eikä valinnainen kolmas yhdistelmävektori sisällä lainkaan virus-DNA-kappaleita, jotka eivät ole peräisin HBV-viruksesta, ja että nämä yhdistelmävektorit eivät ole onko-geenisiä. Näin ollen, kun nämä edulliset vektorit transfek-toidaan isäntään, ne yhdentyvät isännän kromosomiin ja rep-likoituvat passiivisesti yhdessä isäntägenomin kanssa.

Esitetty vektori, edellä kuvattu toinen yhdistelmä-DNA-vek-tori sekä valinnaisesti kolmas edellä kuvattu yhdistelmä-DNA-vektori transfektoidaan yhdessä eukarioottiseen isäntään 36 . 95726 pareittaisina yhdistelminä, tai kaikki kolme vektoria yhdessä, tavanomaisia menetelmiä käyttäen. Vaihtoehtoisesti, vektori, toinen yhdistelmä-DNA-vektori ja valinnaisesti kolmas yhdistelmä-DNA-vektori transfektoidaan eukarioottiseen isäntään eri vaiheissa. Vektori transfektoidaan ensin eukarioottiseen isäntään tämän keksinnön mukaisella menetelmällä, jolloin saadaan tämän keksinnön mukainen transfektoitu isäntä. Tämän jälkeen tämä transfektoitu isäntä transfektoidaan toisella edellä kuvatulla yhdistelmä-DNA-vektorilla ja valinnaisesti kolmannella edellä kuvatulla yhdistelmä-DNA-vektorilla, tavanomaisia menetelmiä käyttäen, jolloin saadaan tämän keksinnön mukainen yhteistransfektoitu isäntä.

Esitetty vektori, toinen yhdistelmä-DNA-vektori ja valinnainen kolmas yhdistelmä-DNA-vektori käsittävät kukin valikoinnin merkitsimen, jotka poikkeavat toisistaan, jolloin uuden transfektoidun isännän tunnistaminen kussakin peräkkäisessä, lopulliseen, tämän keksinnön mukaiseen transfektoituun isäntään johtavassa transfektointivaiheessa on mahdollista.

Tällaiset sekundääriset transfektointivaiheet toteutetaan moninkertaisesti transfektoidun isäntäsolun käsittämän PreS,-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen geenikopioiden lukumäärän suurentamiseksi. On edullista, ettei toinen yhdistelmävektori eikä valinnainen kolmas yhdistelmävektori käsitä repli-konia, joka kykenee toimimaan eukarioottisessa solussa.

Tässä esitetään samoin menetelmä yhteistransfektoidun isännän tuottaman partikkelin valmistamiseksi, joka partikkeli käsittää vähintään yhden, koko PreS,-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen koodaaman proteiinin, tämän menetelmän käsittäessä: a) yhteistransfektoidun eukarioottisen isäntäsolun viljelemisen sellaisissa viljelyalustassa, vallitsevissa olosuhteissa, että tämä isäntä kykenee ilmentämään näitä proteiineja; ja b) tämän partikkelin eristämisen. Tällainen yhteistransfektoitu isäntä kykenee mielellään erittämään nämä tällaiseksi partikkeliksi kasautuneet proteiinit alustaan. Tämä menetelmä käsittää mielellään lisäksi raskasmetallien ionien tai steroidihormonien lisäämisen tällaiseen 37 95726 viljelyalustaan, mikä edistää yhteistransformoitujen vektoreiden sisältämän PreS,-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen ilmentymistä. Mieluiten käytetään raskasmetallien ioneja, erityisesti sinkin tai kadmiumin ioneja. Raskasmetallien ionien tai steroidihormonien optimaalinen pitoisuus alustassa voidaan määrittää tavanomaisin menetelmin. Mikäli yhteis-transfektoitu isäntä erittää nämä partikkelit suoraan viljelyalustaan, niin tällöin nämä partikkelit voidaan eristää tämän keksinnön mukaisen yhteistransformoidun isännän vilje-lyalustasta tekniikoilla, joita käytetään tavanomaisesti proteiinien eristämiseen. Mikäli yhteistransfektoitu isäntä ei eritä näitä partikkeleita viljelyalustaan, niin tällöin ne saadaan tämän yhteistransfektoidun isännän viljelmän ha-jotteesta tavanomaisilla viljelmän hajotustekniikoilla.

Nämä partikkelit eristetään glykosyloituneessa muodossa, ja ne muodostuvat PreS,-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen, PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen sekä S-proteiinin koodaavan alueen koodaamista proteiineista.

Tässä hakemuksessa esitetään samoin rokote, joka käsittää immunologisesti suojaavan määrän (mielellään 1-20 ^g) tässä esitetyn yhteistransfektoidun isännän tuottamia partikkeleita.

Yhteistransfektoidun isännän tuottama partikkeli ei sisällä . lainkaan virusperäisiä DNA-komponentteja, ja näin ollen sii hen ei liity luonnollisista lähteistä peräisin olevilla rokotteilla tavallisesti esiintyviä epätoivottuja sivuvaikutuksia, kuten tahatonta infektoitumista viruksella, allergisia reaktioita, kuumeita ja muita vastaavia. Esitettyä rokotetta, joka käsittää immunologisesti suojaavan määrän yh-teistransfektoidun isännän tuottamia partikkeleita, voidaan käyttää parantamaan HBV-virukseen kohdistuvaa immuunireaktiota, ja sillä voidaan välttää reagoimattomuus sellaisille hepatitis B -virusta vastaan vaikuttaville rokotteille, jotka eivät käsitä vähintään yhtä, koko PreS,-PreS2-S-proteiinin koodaavan ketjun koodaamaa proteiinia.

38 9 5 7 2 6

Rokote voidaan valmistaa lisäämällä immunologisesti suojaava määrä yhteistransfektoidun isännän tuottamia partikkeleita sopivaan puskuriin, kuten esimerkiksi fosfaatilla puskuroituun suolaliuokseen. Rokote voi lisäksi käsittää apuainetta, kuten alumiinihydroksidia ja muita vastaavia.

Vaihtoehtoisesti, esitetyn yhteistransfektoidun isännän tuottamien partikkeleiden sisältämät polypeptidit voidaan irrottaa mainituista partikkeleista ja ne voidaan liittää uudestaan lipidivesikkeliin. Hepatitis B -virusta vastaan vaikuttava rokote voidaan valmistaa käyttämällä näitä lipi-divesikkeleitä, jotka käsittävät tämän keksinnön mukaisista partikkeleista saatuja polypeptidejä. Lipidivesikkeleitä käsittävä rokote voi lisäksi käsittää apuainetta, kuten alumiinihydroksidia .

Esitetyn rokotteen muodostavia yhteistransfektoidun isännän tuottamia partikkeleita voidaan käyttää yhdessä fysiologisesti hyväksyttävän laimentimen (väliaineen), kuten fosfaatilla puskuroidun suolaliuoksen, kanssa.

Rokote, joka käsittää immunologisesti suojaavan määrän esitettyjä partikkeleita, voidaan valmistaa ja sitä voidaan käyttää sillä samalla yleisellä tavalla, joka kuvataan US-patenttijulkaisussa no. 4 118 479.

Rokotetta voidaan antaa ihonalaisella, ihonsisäisellä tai lihaksensisäisellä injektiolla. Vaikka edullinen antotapa riippuukin kyseisestä rokotteesta, niin kuitenkin oletetaan, että lihaksen sisäinen injektio on yleisesti sopivin. Anto-kertojen tiheys riippuu rokotteesta.

Tämä keksintö kohdistuu menetelmään PreSj-PreS^S-proteiinin koodaavan alueen koodaamia proteiineja vastaan vaikuttavien vasta-aineiden läsnäolon ilmaisemiseksi nisäkkään veriseerumista saadusta näytteestä, tämän menetelmän käsittäessä vaiheet, joissa: 39 95726 a) näyte saatetaan kosketuksiin tämän keksinnön mukaisen yh-teistransfektoidun isännän tuottamalla merkitsemättömillä partikkeleilla pinnoitetun kiinteän substraatin kanssa; b) mainittua kosketuksiin saatettua näytettä inkuboidaan ja se pestään; c) mainittu kosketuksiin saatettu näyte saatetaan kosketuksiin tämän keksinnön mukaisten merkittyjen partikkeleiden kanssa, jolloin saadaan merkitty, kosketuksiin saatettu näyte; d) mainittua merkittyä ja kosketuksiin saatettua näytettä inkuboidaan ja se pestään; ja e) merkityn partikkelin määrä merkityssä, kosketuksiin saatetussa näytteessä määritetään.

Tämä keksintö kohdistuu samoin menetelmään PreS,-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen koodaamien proteiinien läsnäolon ilmaisemiseksi nisäkkään veriseerumista saadusta näytteestä, tämän menetelmän käsittäessä vaiheet, joissa: a) valmistetaan vasta-ainetta sisältävä seos, joka vasta-aine on tuotettu tämän keksinnön mukaisten partikkeleiden käsittämällä immunogeenillä; b) näyte saatetaan kosketuksiin tämän seoksen ensimmäisen osan sekä merkityn immunogeenin kanssa, ja tätä ensimmäistä osaa inkuboidaan ja se pestään; c) antigeeniä sisältämätön vertailunäyte saatetaan kosketuksiin tämän seoksen toisen osan sekä merkityn immunogeenin kanssa, tätä toista osaa inkuboidaan ja se pestään; d) edellisten vaiheiden b) ja c) seoksiin lisätään sama määrä proteiinia A käsittävää stafylokokkia, molempia seoksia inkuboidaan ja neste erotetaan kiintoaineesta; ja e) merkityn immunogeenin määrä kummassakin, edellä esitetyssä vai- heessa d) tuloksena olevassa seoksessa määritetään.

Tämä keksintö kohdistuu samoin diagnostiseen kittiin PreSi-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen koodaamia proteiineja vastaan vaikuttavien vasta-aineiden läsnäolon ilmaisemiseksi nisäkkään veriseerumista saadusta näytteestä, tämän kitin käsittäessä: 40 95726 a) merkitsemättömiä proteiineja, jotka muodostavat tämän keksinnön mukaisen, kiinteään kantajaan kiinnitetyn partikkelin; ja b) ihmisen IgG:tä tai IgM:ää, esimerkiksi, vastaan vaikuttavia, merkittyjä vasta-aineita.

Tämä keksintö kohdistuu samoin diagnostiseen kittiin PreSj-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen koodaamien proteiinien läsnäolon ilmaisemiseksi nisäkkään veriseerumista saadusta näytteestä, tämän kitin käsittäessä: a) tämän keksinnön mukaisten partikkeleiden tuottamia, kiinteään kantajaan kiinnitettyjä vasta-aineita; sekä b) tämän keksinnön mukaisten partikkeleiden tuottamia, merkittyjä vasta-aineita.

Tässä hakemuksessa esitetään yhdistelmä-DNA-konkatameeri, joka käsittää: a) plasmidivektorin, joka sisältää PreS,-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen ja vähintään yhden muun plasmidivektorin, joka käsittää yhden seuraavista koodaavis-ta alueista: PreSj-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen tai PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen tai S-proteiinin koodaavan alueen; sekä b) MMT-promoottorin. Tällainen konkatameeri käsittää mielellään lisäksi valikoinnin merkitsimen ja kopioitumisen päättymiskohdan.

Esitetään samoin menetelmä transfektoidun isännän tuottaman partikkelin valmistamiseksi, joka partikkeli käsittää vähintään yhden, koko PreS,-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen koodaaman proteiinin, menetelmän käsittäessä: a) transfektoidun eukarioottisen isäntäsolun, joka käsittää esitetyn konkatameerin, viljelemisen sellaisissa kasvatusalustassa vallitsevassa olosuhteissa, että tämä isäntä kykenee ilmentämään näitä proteiineja; sekä b) mainitun partikkelin eristämisen. Tämä yhteistransfektoitu isäntä kykenee erittämään nämä partikkeleiksi kasautuneet proteiinit alustaan. Tämä menetelmä käsittää mielellään lisäksi raskasmetallien ionien tai steroidihormonien lisäämisen tällaiseen viljelyalustaan, mikä edistää transfektoitujen vektoreiden sisältämän PreS,- li 4i 55726

PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen ilmentymistä. Mieluiten käytetään raskasmetallien ioneja, erityisesti sinkin ja kadmiumin ioneja. Raskasmetallien ionien tai steroidihormonien optimaalinen pitoisuus alustassa voidaan määrittää tavanomaisilla tekniikoilla. Mikäli konkatameerillä transfektoi-tu isäntä erittää nämä partikkelit suoraan viljelyalustaan, niin nämä partikkelit voidaan tällöin eristää transfektoidun isännän viljelyalustasta tekniikoilla, joita käytetään tavallisesti proteiinien eristämiseen. Mikäli transfektoitu isäntä ei eritä näitä partikkeleita viljelyalustaan, niin tällöin ne saadaan tämän transfektoidun isännän viljelmän hajotteesta tekniikoilla, joita tavanomaisesti käytetään viljelmien hajottamiseen. Nämä partikkelit eristetään gly-kosyloituneessa muodossa, ja ne muodostuvat PreSj-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen, PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen ja S-proteiinin koodaavan alueen koodaamista proteiineista.

Esitetyllä konkatameerillä transfektoidun isännän tuottama partikkeli ei sisällä lainkaan virusperäisiä DNA-komponentteja, joten siihen ei liity luonnollisista lähteistä peräisin olevilla rokotteilla tavallisesti esiintyviä epätoivottuja sivuvaikutuksia, kuten tahatonta infektoitumista viruksella, allergisia reaktioita, kuumeita ja muita vastaavia. Rokotetta, joka käsittää immunologisesti suojaavan määrän konkatameerillä transfektoidun isännän tuottamia partikkeleita, voidaan käyttää parantamaan HBV-virukseen kohdistuvaa immuunireaktiota ja sillä voidaan välttää reagoimattomuus sellaisille hepatitis B -virusta vastaan vaikuttaville rokotteille, jotka eivät käsitä vähintään yhtä koko PreS,-PreS2-S-proteiinin koodaavan ketjun koodaamaa proteiinia.

42 9 5 7 2 6

Rokote voidaan valmistaa lisäämällä immunologisesti suojaava määrä tämän keksinnön mukaisella konkatameerillä transfek-toidun isännän tuottamia partikkeleita sopivaan puskuriin, kuten fosfaatilla puskuroituun suolaliuokseen. Rokote voi lisäksi käsittää apuainetta, kuten alumiinihydroksidia tai muuta vastaavaa.

Vaihtoehtoisesti, konkatameerillä transfektoidun isännän tuottamien partikkeleiden käsittämät polypeptidit voidaan irrottaa mainituista partikkeleista ja liittää uudestaan lipidivesikkeliin. Hepatitis B -virusta vastaan vaikuttava rokote voidaan valmistaa käyttämällä näitä lipidivesikkelei-tä, jotka käsittävät esitettyjen partikkeleiden sisältämiä polypeptidejä. Lipidivesikkeleitä käsittävä rokote voi lisäksi käsittää apuainetta, kuten alumiinihydroksidia.

Rokotteen muodostavia, konkatameerillä transfektoidun isännän tuottamia partikkeleita voidaan käyttää yhdessä fysiologisesti hyväksyttävän laimentimen (väliaineen), esimerkiksi fosfaatilla puskuroidun suolaliuoksen, kanssa.

Rokote, joka käsittää immunologisesti suojaavan määrän esitettyjä partikkeleita, voidaan valmistaa ja sitä voidaan käyttää sillä samalla yleisellä tavalla, joka kuvataan US-patenttijulkaisussa no. 4 118 497.

Il 43 95726 Tätä rokotetta voidaan antaa ihonalaisella, ihonsisäisellä tai lihaksensisäisellä injektiolla. Vaikka edullinen antotapa riippuukin kyseessä olevasta rokotteesta, niin kuitenkin oletetaan, että lihaksensisäinen injektio on yleisesti sopivin. Antokertojen tiheys riippuu rokotteesta.

Tämä keksintö kohdistuu samoin menetelmään PreS^-PreS2~S-proteiinin koodaavan alueen koodaamia proteiineja vastaan vaikuttavien vasta-aineiden läsnäolon ilmaisemiseksi nisäkkään veriseerumista saadusta näytteestä, tämän menetelmän käsittäessä vaiheet, joissa: a) näyte saatetaan kosketuksiin tämän keksinnön mukaisella konkatameerillä transfektoidun isännän tuottamilla, merkitsemättömillä partikkeleilla pinnoitetun kiinteän substraatin kanssa; b) mainittua kosketuksiin saatettua näytettä inkuboidaan ja se pestään; c) mainittu kosketuksiin saatettu näyte saatetaan kosketuksiin tämän keksinnön mukaisten merkittyjen partikke-leiden kanssa, jolloin saadaan merkitty, kosketuksiin saatettu näyte; d) mainittua merkittyä, kosketuksiin saatettua näytettä inkuboidaan ja se pestään; ja ·· e) merkityn partikkelin määrä merkityssä, kosketuksiin saatetussa näytteessä määritetään.

Tämä keksintö kohdistuu samoin menetelmään PreS^-PreS2~S-proteiinin koodaavan alueen koodaamien proteiinien läsnäolon ilmaisemiseksi nisäkkään veriseerumista saadusta näytteestä, tämän menetelmän käsittäessä vaiheet, joissa: a) valmistetaan vasta-ainetta sisältävä seos, joka vasta-aine on tuotettu tämän keksinnön mukaisten partikkeleiden käsittämällä immunogeenillä; b) näyte saatetaan kosketuksiin tämän seoksen ensimmäisen osan sekä merkityn immunogeenin kanssa ja tätä ensimmäistä osaa inkuboidaan ja se pestään; 44 95726 c) antigeeniä sisältämätön vertailunäyte saatetaan kosketuksiin tämän seoksen toisen osan sekä merkityn immunogeenin kanssa, ja tätä toista osaa inkuboidaan ja se pestään; d) edellisten vaiheiden b) ja c) seoksiin lisätään sama määrä proteiinia A käsittävää stafylokokkia, molempia seoksia inkuboidaan ja neste erotetaan kiintoaineesta; ja e) merkityn immunogeenin määrä kummassakin, edellä esitetyssä vaiheessa d) tuloksena olevassa seoksessa määritetään .

Tämä keksintö kohdistuu samoin diagnostiseen kittiin PreS^-PreS2~S-proteiinin koodaavan alueen koodaamia proteiineja vastaan vaikuttavien vasta-aineiden läsnäolon ilmaisemiseksi nisäkkään veriseerumista saadusta näytteestä, tämän kitin käsittäessä; a) merkitsemättömiä proteiineja, jotka muodostavat tämän keksinnön mukaisen, kiinteään kantajaan kiinnitetyn partikkelin; ja b) ihmisen IgG:tä tai IgM:ää, esimerkiksi, vastaan vaikuttavia, merkittyjä vasta-aineita.

Tämä keksintö kohdistuu samoin diagnostiseen kittiin PreS^-PreS2~S-proteiinin koodaavan alueen koodaamien proteiinien läsnäolon ilmaisemiseksi nisäkkään veriseerumista saadusta näytteestä, tämän kitin käsittäessä: a) tämän keksinnön mukaisten partikkelien indusoimia, kiinteään kantajaan kiinnitettyjä vasta-aineita; sekä b) tämän keksinnön mukaisten partikkeleiden tuottamia, merkittyjä vasta-aineita.

Ensimmäinen edullinen suoritusmuoto

Ensimmäisessä edullisessa suoritusmuodossa yksi tämän keksinnön mukainen vektori käsittää vektorimuodosteen, joka sisältää geeniketjut yhdistelmäplasmideista pBPV342-12 (Law et ai., Molecular and Cellular Biol., Voi. 3, sivu 2110, 45 95726 1983) sekä pAOI (Cummings, I.W. et ai., Proc. Natl. Aca.

Sei. USA, Voi. 77, sivu 1842, 1980). Eräitä näistä plasmi-deista peräisin olevia geneettisiä elementtejä on yhdistetty tämän keksinnön mukaisen vektorin, josta käytetään lyhennettä pDMI, aikaansaamiseksi (katso kuva 3). Plasmidi pDM1, jonka sisältämä geenisegmentti käsittää PreS1~PreS2~ S-proteiinin koodaavan alueen mainittuun proteiinin koodaa-vaan alueeseen liittyvän luonnollisen promoottorijärjestelmän säätelyn alaisena, neomysiinin vastustuskyvyn geenin, MMT-promoottorin ja SV40-viruksen PAS-t-toiminnon, viedään tämän jälkeen transfektoimalla mihin tahansa yhteen lukuisista eukarioottisista soluista, kuten nisäkässoluista, tämän keksinnön mukaisten partikkeleiden ilmentämiseksi suurina määrinä ja mielellään niiden erittämiseksi.

Plasmidi pBPV342-12 (katso kuva 1) sisältää geeniketjut, jotka käsittävät MMT-promoottorin, neomysiinin vastustuskyvyn geenin, SV40-viruksen PAS-t-toiminnon ja naudan pa-pillomaviruksen (BPV) genomin. Plasmidin pDM1 muodostamisen aikana plasmidi pBPV342-12 pilkotaan entsyymillä BamHI, jonka seurauksena plasmidi katkeaa kahdeksi DNA-kappaleeksi.

Nämä kappaleet_erotetaan, jonka jälkeen 7,95 kiloemäsparin (kb) kappale, joka käsittää koko BPV-genomin, heitetään * pois. BPV DNA:n eliminointi on erittäin edullista, sillä siten vältetään BPV DNA:n tai BPV-proteiinien sisältyminen tämän keksinnön mukaiseen partikkeliin, jota on tarkoitus käyttää rokotevalmisteessa. Jäljellä oleva BamHI-kappale (6,65 kb) plasmidista pBPV342-12, joka kappale sisältää MMT-promoottorin, neomysiinin vastustuskyvyn geenin ja SV40-viruksen PAS-t-alueen geeniketjut, ligatoidaan tämän jälkeen tavanomaisia tekniikoita käyttäen plasmidista pAOI saatuun DNA-ketjuun, joka kuitenkin sisältää vahingoittumattoman PreS^-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen (tarkasteltu jäljempänä; katso myös kuvaa 2).

46 95726

Plasmidi pAOI (katso kuva 2), joka sisältää koko hepatitis B-viruksen genomin, pilkotaan entsyymillä EcoRI, jolloin saadaan 3,2 kiloemäsparin kappale. Tämä 3,2 kiloemäsparin kappale ligatoidaan itseensä peräkkäisten toisintojen muodostamiseksi, jotka toisinnot käsittävät sekä hepatitis B-viruksen ytimen että pinnan antigeenejä koodaavia geeni-ketjuja sisältävän, pitkän konkatameerisen DNA-rakenteen.

Tämä menetelmä hepatitis B-viruksen geeniketjujen tällaiseksi manipuloimiseksi, joka on välttämätöntä plasmidiin pAOI toteutetun molekulaarisen kloonaamisen aiheuttaman permutaation välttämiseksi sekä toiminnallisen järjestäytymisen palauttamiseksi PreS^-PreS2_S-proteiinin koodaavan alueen suhteen, esitetään julkaisussa Cummings et ai.,

Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Voi. 77, sivu 1842, 1980. Tämän jälkeen toteutetaan pilkkominen entsyymillä Bglll, jolloin HBV-viruksen ytimen antigeenin geenisegmentti saadaan eliminoiduksi, ja tällöin jäljelle jää DNA-kappale (2,78 kb), joka käsittää hepatitis B-virusgenomista PreS^-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen sekä tämän alueen luonnollisen promoottorijärjestelmän (ρ^β)· Tämän jälkeen lineaarinen, plasmidista pBPV342-12 saatu BamHI-kappale (katso kuva 1) ja plasmidista pAOI saatu * Bglll-kappale (katso kuva 2) ligatoidaan yhdistelmäplasmi- din pDM1 (katso kuva 3) aikaansaamiseksi, joka yhdistelmä-plasmidi käsittää PreS^-PreS2~S-proteiinin koodaavan alueen luonnollisen promoottorin .(Put)) .

no

Toinen edullinen suoritusmuoto Tämän keksinnön toisessa edullisessa suoritusmuodossa plas-midissa pDM1 oleva luonnollinen promoottori irrotetaan pilkkomalla entsyymeillä Bglll ja BamHI siten, että MMT-premoottori sijoittuu suoraan ennen PreS^-S-proteiinin koodaavaa aluetta, jolloin MMT-promoottori säätelee mainitun koodaavan alueen kopioitumista. Entsyymeillä BamHI ja Bglll pilkkomisen jälkeen saadaan kolme erillistä DNA- 47 95726 kappaletta (katso kuvat 4A ja 4B): 1) 5,1 kiloemäsparin kappale, joka sisältää polyadeny-laatiokohdan ja MMT-promoottorin; 2) 3,0 kiloemäsparin kappale, joka sisältää neomysiinin vastustuskyvyn geenin ja luonnollisen promoottorin; ja 3) 1,4 kiloemäsparin kappale, joka sisältää PreS2~S-proteiinin koodaavan alueen.

Puhdistamisen jälkeen 5,1 ja 1,4 kiloemäsparin kappaleet ligatoidaan tavanomaisilla tekniikoilla, jolloin saadaan yhdistelmäplasmideja (6,46 kb), jotka sisältävät PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen, nyt kuitenkin MMT-promoottorin säätelyn alaisuudessa. Koska näiden kahden ligatoidun kappaleen suhteelliset suuntautumiset ovat satunnaisia, ja koska syntyy kaksi erilaista plasmidityyppiä, joista ainoastaan toinen on suuntautunut oikealla tavalla kopi-ointivaiheen luentaa ajatellen, alkaen MMT-promoottorista ja jatkuen pinnan antigeenien geeniketjuihin, niin oikea toiminnallinen plasmidi pDM2 varmistetaan pilkkomalla puhdistetut, kyseeseen tulevat plasmidit entsyymeillä EcoRI ja Xbal. Oikealla tavalla suuntautuneesta plasmi-dista saadaan tällä tavalla pilkkoen 2,1 kiloemäsparin ja 4,4 kiloemäsparin suuruinen kappale.

Plasmidin pDM2 sisältävä bakteerikanta HB101 talletettiin kantakokoelmaan Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen, Göttingen, tunnusnumerolla DSM 3285, huhtikuun 4. päivänä 1985. Lisäksi talletettiin muita mikro-organismeja, mm. mikro-organismi pMMT-neoplasmidi, joka sisältää PreS^-PreS2~S-proteiinia koodaavan DNA-ketjun, talletuslaitokseen American Type Culture Collection (ATCC), Rockville,

Maryland 11.4.1986 seuraavilla talletusnumeroilla: pBR322.G2 — φφ 67073 POLINK 23456 — φφ 67072 . pBlg/2.8 — φφ. 67075 pMMT-neoplasmidi — ΦΦ- 67074 .

48 95726

Kolmas edullinen suoritusmuoto

Kolmannessa edullisessa suoritusmuodossa MMT-promoottori jatkostetaan PreS^-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen sisältävään HBV-geenisegmenttiin siten, että luonnollinen promoottorijärjestelmä eliminoituu ja että mainittu koo-daava ketju saadaan MMT-promoottorin suoran säätelyn alaisuuteen (katso kuva 9).

Neljäs edullinen suoritusmuoto

Neljännessä edullisessa suoritusmuodossa plasmidista pBR322.G2 saadulla hiiren globiinigeenin mg-PAS-t-segmentillä, joka toimii polyadenylaation päättymissignaalina (PAS-t), korvataan SV4 0-viruksesta saatu PAS-t-alue. mg-PAS- t-segmen-tillä korvaamisella saadaan aikaan DNA-siirtovektoreita, jotka eivät käsitä lainkaan muista kuin HPV-viruksesta peräisin olevia genomisia osia (katso kuvat 9, 10 ja 11).

Viides edullinen suoritusmuoto

Viides edullinen suoritusmuoto on menetelmä plasmidi-DNA:n sekakonkatameerien valmistamiseksi, geenikopioiden lukumäärän suurentamiseksi ligatoimalla PreS^-PreS2~S-, PreS2-S-tai S-proteiinin koodaavaa aluetta koodaavia geenimuodos-teita sisältäviä plasmideja suuria määriä plasmideihin, ‘ jotka sisältävät lääkeaineen vastustuskykyyn perustuvan merkitsimen, ja jotka tämän jälkeen transfektoidaan solu-linjoihin.

Seuraavissa esimerkeissä kuvataan yksityiskohtaisemmin tämän keksinnön mukaisten yhdistelmä-DNA-vektoreiden, isäntien ja partikkeleiden valmistamista sekä sisällyttämistä nisäkkään solulinjaan. Seuraavien esimerkkien tarkoituksena on pelkästään havainnollistaa keksintöä, ja ne eivät pyri rajoittamaan sitä millään tavalla.

Il 49 95726

Esimerkit

Materiaalit ja menetelmät A. Nisäkässolulinjojen alkuperä ja kuvaus 1. L-solut

Tutkijat K.K. Sanford, W.R. Earle ja G.D. Likely (J. Nat.

Cancer Inst., Voi. 9, sivu 229, 1948) saivat aikaan NCTC-kloonin 929 maaliskuussa 1948 lähtökannasta L, jonka tutkija W.R. Earle (J. Nat. Cancer Inst., Voi. 4, sivu 165, 1943) oli muodostanut 1940. Lähtökanta L saatiin 100 vuorokauden ikäisen uroshiiren C3H/An normaalista ihonalaisesta areolaari- ja adipoosi- (rasva-) kudoksesta, ja klooni 929 saatiin lähtökannan 95. aliviljelmän sukupolvesta (kapil-laaritekniikalla yhden ainoan solun eristämiseksi).

Tutkijat D.R. Dubbs ja S. Kit (S. Kit et ai., Exp. Cell Res., Voi. 31, sivut 297-312, 1963; sekä D.R. Dubbs & S. Kit, Exp. Cells Res., Voi 33, sivu 19, 1964) eristivät hiiren L-solujen alilinjan LM(TK-), joka on puutteellinen tymidiinikinaasin suhteen. Se ei kykene kasvamaan alustassa, joka sisältää HAT:ia. Tässä solulinjassa ei ole havaittu HAT-vastustuskyvyn spontaania palautumista, ja vaikuttaa erittäin todennäköiseltä, että siinä on tapahtu-; nut tämän geenin käsittämä häviämä.

Perättäisten aliviljelmien lukumäärä lähtökudoksesta laskien: 648; klooni, 553.

Pakastusalusta: Viljelyalusta, 90 % DNSO 10 %; antibioot teja sisältämätön.

Elinkyky: 81-96 % (kykenemättömyys ottaa väriä vastaan).

Viljelyalusta: DMEM + 10 % FBS (Dulbeccon ja Vogtin muunnettu Eagle-alusta + 10 % FBS).

Sulaneiden solujen kasvuominaisuudet: Siirrosteella, joka ; 5 käsittää 6-8 x 10 solua 5 millilitrassa edellä mainittua viljelyalustaa yhtä T-25 -pulloa kohden, saadaan aikaan 50 95726 500-kertainen lisääntyminen 7 vuorokaudessa 37 °C:n lämpötilassa, edellyttäen, että alusta uusitaan kahdesti viikossa ja että pH asetetaan arvoon 7,3 hiilidioksidin (5 tai 10 %) ja ilman kostutetulla seoksella. Aliviljelmät valmistetaan raaputtamalla tai ravistelemalla. Solut kasvavat myös hyvin muissa alustoissa (Waymouth, Eagle, NCTC 135, jne), joita on täydennetty 10-30 % hevosen seerumia.

Maljauksen tehokkuus: 70 %.

Morfologia: Fibroblastien kaltainen.

Kariologia: Kromosomien esiintymistiheyden jakautuminen 100 solua: 2n = 40.

Solut:_2 2 1 4 2 9 4 1 2 16 17 4 13 2

Kromosomit: 56-58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69

Solut;_2 2 11_6

Kromosomit: 70 71-76-82-125-241

Sekundäärisen rajoitteen (konstriktio) käsittävä pitkä metasentrinen kromosomi todettiin 77/100 solussa.

Steriilisyys: Mykoplasma-, bakteeri- ja fungikokeet olivat negatiiviset.

Laji: Varmistettu hiirestä saaduksi agglutinaation ja hemagciutinaation sekakokein.

Virusalttius: Altis pseudorabiesvirukselle ja vesikulaari- selle .stomatitisvirukselle (intialainen kanta) . Kun soluja viljodiin edellä esitetyssä viljelyalustassa, niin Herpes simplex B-virus ja vaccinia tuottivat sytopaattisia vaikutuksia vain ensimmäisessä vaiheessa. Alttius tietyille viruksille voi vaihdella käytetyn viljelyalustan mukaan.

Ei altis polioviruksen tyypille 1, Coxsackie-viruksen tyypille B-5 eikä polyomavirukselle.

Tuumorigeenisyys: Siirroste, joka käsitti 1 x 10** solua hiirtä kohden, injektoitiin ihonalaisesti karvattomiin hiiriin. Säteilyttämättömissä hiirissä muodostui 0/25 li - 95726 51 tuumoria. Röntgensäteillä käsitellyissä hiirissä (425 r, koko kehoon) muodostui 11/18 tuumoria (sarkoomia) injektio-kohtaan .

Käänteistranskriptaasi: positiivinen.

Myöntäjä, valmistaja ja tunnusomaisten piirteiden selvittäjä: American Type Culture Collection, Rockville,

Maryland.

2. Vero-solut

Vero-solulinjan valmistus aloitettiin normaalin, täysikasvuisen afrikkalaisen marakatin munuaisesta maaliskuun 27. päivänä 1962, ja valmistajina olivat Y. Yasumuar ja Y. Kawakita Chiba-yliopistosta, Chiba, Japani (Nippon,

Rinsho, Voi. 21, sivu 1209, 1963).

Perättäisten aliviljelmien lukumäärä lähtökudoksesta laskien: 121.

Pakastusalusta: Olennainen vähimmäisalusta (Eagle), joka käsittää ei-olennaisia aminohappoja ja Earle-BSS, 85 %; sikiöasteisen naudan seerumia, 5 % dimetyylisulfoksidia (DMSO), 10 %; antibiootteja sisältämätön.

Elinkyky: Suurin piirtein 97 % (kykenemättömyys ottaa ; vastaan väriä).

Viljelyalusta: DMEM, 5 % FBS.

Sulaneiden solujen kasvuominaisuudet: Siirrosteella, joka käsittää 3x10^ elävää solua 3 millilitrassa edellä mainittua viljelyalustaa yhtä T-25 -pulloa kohden, saadaan aikaan 30-kertainen lisääntyminen 7 vuorokaudessa 37 °C:n lämpötilassa, edellyttäen, että alusta uusitaan kolmasti viikossa ja että pH asetetaan arvoon 7,4 hiilidioksidin (5 tai 10 %) ja ilman kostutetulla seoksella. Aliviljel-mät valmistetaan trypsinisoimalla.

Maljauksen tehokkuus: Suurin piirtein 24 % edellä mai nitussa viljelyalustassa.

52 95726

Morfologia: Epiteelisten fibroblastien kaltainen.

Kariologia: Kromosomien esiintymistiheyden jakautuminen 50 solua: 2n = 60.

Solut:_212 2345721 17 22

Kromosomit: 47-49 59 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60

Steriilisyys: Mykoplasma-, bakteeri- ja fungikokeet olivat negatiiviset.

Laji: Varmistettu apinasta saaduksi immunofluoresenssi- kokeella.

Virusalttius: Altis polioviruksen tyypille 3, Getah, NNdumu, Pixuna, Ross River, Semliki, Paramaribo, Kokobera, Modoc, Murutucu, Germiston, Guaroa, Pongola ja Tacaribe Arboviruksille. Ei altis Stratford, Apeu, Caraparu, Madrid, Nepuyo ja Ossa Arboviruksille.

Käänteistranskriptaasi: ei todettavissa.

Myöntäjä, valmistaja ja tunnusomaisten piirteiden selvittäjä: American Type Culture Collection, Rockville,

Maryland.

3. CHO-KI-solut CHO-KI-solut saatiin alikloonina lähtö-CHO-solulinjasta, jonka valmistuksen tutkija T.T. Puck aloitti täysikasvuisen kiinanhamsterin munasarjasta otetusta kudosnäytteestä, vuonna 1957 (J. Exp. Med., Voi. 108, sivu 945, 1958). CHO-KI-solut tarvitsevat proliinia, ja niiden modaalinen kromosomiluku on 20 (Proc. Nat. Acad. Sei., Voi. 60, sivu 1275, 1968). Näistä soluista puuttuu ilmeisesti se aktiivinen geenimuoto, joka tarvitaan proliinin synteesiin, ja salpautuminen biosynteettisessä ketjussa tapahtuu vaiheessa, jossa glutaamihappo muunnetaan glutaamiseksi gamma-semialdehydiksi. Proliinin omavaraisuuden palautumistoden-näköisyys on 10 6 (Genetics, Voi. 55, sivu 513, 1967) .

Perättäisten aliviljelmien lukumäärä lähtökudoksesta laskien: suurin piirtein 400; 7 kantakokoelmassa ATCC.

Il 53 95726

Pakastusalusta: Viljelyalusta, 92 %; glyseroli, 8 %; antibiootteja sisältämätön.

Elinkyky: Suurin piirtein 90 % (kykenemättömyys ottaa väriä vastaan).

Viljelyalusta: F-12 -alusta (Ham) 90 %; sikiöasteisen naudan seerumi, 10 %; antibiootteja sisältämätön.

Sulaneiden solujen kasvuominaisuudet: Siirroste, joka käsittää 105 elävää solua 1 millilitrassa edellä mainittua viljelyalustaa 37 °C:n lämpötilassa lisääntyy 15-20 kertaiseksi 7 vuorokaudessa.

Maljauksen tehokkuus: suurin piirtein 90 % edellä maini tussa viljelyalustassa.

Morfologia: epiteelin kaltainen.

Kariologia: kromosomien esiintymistiheyden jakautuminen 50 solua: 2n = 22.

Solut:_2 2 35 3 4 1 1 1 1

Kromosomit: 18 19 20 21 22-24-32-39-42

Steriilisyys: mykoplasma-, bakteeri- ja fungikokeet olivat negatiiviset.

Laji: varmistettu kiinanhamsterista saaduksi sytoksisella : vasta-aineella, värin vastaanottamattomuuden kokeella ja isoentsyymianalyysillä.

Virusalttius: altis vesikulaariselle stomatitisvirukselle (intialainen kanta) sekä Getah-arbovirukselle. Ei altis polioviruksen tyypille 2, Modoc- ja Button William-arbovi-ruksille.

Käänteistranskriptaasi: ei todettu.

Erityisiä ominaisuuksia: viitesolut tarvitsevat proliinia kasvaakseen.

Myöntäjä: T.T. Puck, Eleanor Roosevelt Institute for

Cancer Research, University of Colorado Medical Center,

Denver, Colorado.

54 95726 4. NIH/3T3-solut NIH/3T3, joka on jatkuva solulinja erittäin kosketusinhi-boiduista soluista, saatiin NIH-sveitsinhiiren sikiövil-jelmistä samalla tavalla kuin alkuperäinen satunnaissii-tetty 3T3 (ATCC CCL 92) sekä sukusiitetty BALB/c3T3 (ATCC CCL 163). Aikaansaadulla NIH/3T3-linjalla toteutettiin enemmän kuin 5 peräkkäistä alikloonausvaihetta sellaisen alikloonin kehittämiseksi, jonka alikloonin morfologiset ominaisuudet sopivat parhaiten transformaatiokokeisiin. Tämän alikloonin varhaisimmat saatavat vaiheet (passage) ovat suurin piirtein 120 vaiheen päässä ensimmäisestä sikiöviljelmästä. NIH/3T3 on erittäin herkkä sarkoomavi-ruksen fokuksen muodostumiselle ja leukemiaviruksen lisääntymiselle, ja se on osoittautunut erittäin käyttökelpoiseksi DNA:n transfektiotutkimuksissa. J. Virol., Voi. 4, sivut 549-553, 1969; Cell, Voi. 16, sivut 63-75 sekä 347-356, 1979.

B. Alustat, puskurit ja liuokset 1. Nisäkässolujen viljelmiin a. Dulbeccon muunnettu Eagle-alusta, joka sisältää runsaasti glukoosia (DMEM).

*. Tässä käytetään kuivaa jauhemaista GIBCO-alustaa, ja siihen lisätään täydennykseksi: 26 mMNaHC03 2 mM L-glutamiini (Gibco) 1 mM Na-pyruvaatti (Gibco) 60 ug/ml gentamysiiniä tai 100 yksikköä/ml penisilliiniä + 100 yksikköä/ml 1 streptomysiiniä.

b. Hamin F12 Tässä käytetään kuivaa jauhemaista GIBCO-alustaa, johon lisätään täydennykseksi: 14 mM Na HCO3 : 60 yg/ml gentamysiiniä 55 95726 c. Solujen pakastamisalusta 90 % (tilavuus/tilavuus) FBS-DMEM 10 % (tilavuus/tilavuus) dimetyylisulfoksidia Pakastusalusta valmistetaan juuri ennen käyttöä. Kaikki alustat steriloidaan suodattamalla 0,45 ja 0,2 mikronin suodattimien läpi (Gilman). Alustojen steriilisyys varmistetaan inkuboimalla antibioottia sisältämättömästä alustasta otettua näytettä 37 °C:n lämpötilassa 1 viikko. Staattisessa viljelmässä käytettävään alustaan lisätään täydennykseksi 10 % FBS. Sikiöasteisen naudan seerumi (FBS) inaktivoidaan lämmöllä 56 °C:n lämpötilassa 30 minuuttia. Steriiliä alustaa säilytetään 40 °C:n lämpötilassa ennen käyttöä.

d. Trypsiiniliuos 0,5 g/1 trypsiiniä 0,2 g/1 EDTA (tetranatrium) Hankin tasapainotetussa suolaliuoksessa

Koska EDTA todettiin toksiseksi Vero-soluille, niin näiden solujen kanssa käytetään EDTA:ta sisältämätöntä trypsiini-liuosta.

e. PBS (fosfaatilla puskuroitu suolaliuos), GIBCO

183 mM NaCl 8,6 mM Na2HP04 2,2 mM KH2P04

f. TN E

160 mM NaCl 10 mM Tris, pH 7,5

1 mM EDTA

2. Molekyylibiologisiin tarkoituksiin a. liuokset SDS-PAGE -toimenpiteisiin

Akryyliamidi (varasto): 30 % (paino/paino) akryyliamidia (BioRad) 0,8 % (paino/paino) N’,N-metyleeni-bisakryyliamidia (BioRad) 56 95726 4 x puskuri erottavaa geeliä varten 1,5 M Tris-Cl, pH 8,8 0,4 (paino/tilavuus) natriumdodekyylisulfaatti (SDS) (Serva) 4 x puskuri väligeeliä varten

0,5 M Tris-Cl, pH 6,8 0,4 (paino/tilavuus) SDS

3 x näytepuskuri 22,3 % (tilavuus/tilavuus) glyserolia 0,03 % (paino/tilavuus) bromifenolisinistä

6,7 (paino/tilavuus) SDS

10 x elektrodipuskuri

0,25 M Tris, pH 8,2 1,90 M glysiini 1 % (paino/tilavuus) SDS

b. Liuokset hopeavärjäyksen toimenpiteisiin

Liuos I 50 % (tilavuus/tilavuus) metanolia 10 % (tilavuus/tilavuus) etikkahappoa

Liuos II 10 % (tilavuus/tilavuus) metanolia 5 % (tilavuus/tilavuus) etikkahappoa

Liuos III 10 % glutaraldehydiä

Liuos IV 20 % AgNO^ vedessä (varastoliuos)

Liuos V 3 % (paino/tilavuus) Na2CC>2 0,1 % (tilavuus/tilavuus) formaldehydiä c. Liuokset luentaan avoimen fosfodiesterisillan ("nick") kohdalta 10 x reaktiopuskuri

500 mM Tris-Cl, pH 7,2 100 mM MgS04 1 mM DTT

li 57 95726

Nukleotidiseos:

100 mM dGTP 100 mM dATP 100 mM dTTP

10 mM Tris-puskurissa, pH 7,5 d. Hybridisaatiossa käytettävät liuokset 20 x SSC: 3 M NaCl 0,3 M Na2_sitraatti 50 x Denhardtin liuos 1 % (paino/paino) Ficoll 400 (PL-Pharmacia) 1 % (paino/paino) polyvinyylipyrrolidoni (Sigma)

1 % (paino/paino) BSA

o

Steriloidaan suodattamalla ja säilytetään -20 C:n lämpötilassa

Esihybridisaatioseos

50 % (tilavuus/tilavuus) formamidia 5 x Denhardtin liuos 5 x SSC

50 mM Na-fosfaatti pH 7,0 250 ug/ml denaturoitua lohen sperman DNA:ta

Hybridisaatioseos:

50 % formamidia 5 x SSC

20 mM Na-fosfaatti, pH 7,0 1 x Denhardtin liuos 100 yg/ml denaturoidun lohen sperman DNA:ta e. Puskurit restriktioentsyymejä varten

Joko valmistajien esittämät puskurit, tai: Vähän suolaa Keskimääräisesti suolaa Runsaasti suolaa sisältävä puskuri sisältävä puskuri sisältävä puskuri

Sma I Bglll BamHI

Hpal PstI PvuI

Xbal EcoRI Sali

Spel BstEII (60 °C) 58 95726

Restriktiopuskurit: Vähän suolaa Keskimääräisesti Paljon suolaa suolaa

Tris, pH 7,4 10 mM 6,6mM 6,6 mM

MgCl2 10 6,6 6,6 suolaa 20 (KC1) 60 (NaCl) 150 (NaCl) β-merkaptoetanoli 10 6,6 6,6 f. Alustat 1. L-alusta: 10 g Baktotryptonia 5 g hiivauutetta 10 g NaCl 1 litra vettä 2. L-alustaa sisältävät agarmaljat: L-alustaa, joka sisältää 15 g/1 Difco- agaria 3. L-alusta-amp-agarmalj at: L-alustasta tehty agar, joka sisältää 20-50 ug/ml ampisilliiniä C. Entsyymit

Seuraavia entsyymejä käytetään: 1. Deoksiribonukleaasi I (Worthington) ‘ 2. DNA-polymeraasi I ("Klenow-kappale") (Boehringer Mannheim) 3. T4-DNA-ligaasi (Boehringer Mannheim) 4. Restriktioentsyymit:

EcoRI, Xbal, BamHI,. Bglll, BstEII, Spel,

Sali, Hpal, Smal, PvuI, PstI (Boehringer

Mannheim, BRL, New England BioLabs) 5. Lysozyme (SIGMA) 6. Pronaasi 11 59 95726 D. Analyyttiset ja kvantitatiiviset toimenpiteet 1. Värin sitomiskoe

Kokonaisproteiinipitoisuus tämän keksinnön mukaisten, puhdistettujen partikkeleiden preparaateissa määritetään BioRad-yhtiÖn proteiinikokeen kittiä käyttäen. Tässä menetelmässä käytetään Bradford-koetta, jossa Coomassie-sinisen sitoutuminen proteiiniin mitataan spektrofotometrisesti. Standardina käytetään ovalbumiinia.

2. Radioimmuunikoe (RIA) 1 25 "Kerrosteena" (sandwich) toteutettavassa NML RIA I radio-immuunikokeessa hepatitis B-viruksen pinnan antigeeniä vastaan vaikuttavalla hiiren vasta-aineella (anti-HBs) pinnoitettuja helmiä inkuboidaan seerumin tai plasman sekä asianmukaisten vertailunäytteiden kanssa. PreS^-PreS2~S-proteii-nin koodaavan alueen koodaamia polypeptidejä sisältävät partikkelit sitoutuvat kiinteän faasin vasta-aineeseen. Sitoutumattoman materiaalin pois imemisen ja helmien pese- 1 25 misen jälkeen ihmisen I-anti-HBs:n annetaan reagoida helmien pinnalla olevan, vasta-aineen ja antigeenin välisen kompleksin kanssa. Tämän jälkeen helmet pestään si-125 toutumattoman . I-anti-HBs:n poistamiseksi.

Helmiin jäävä radioaktiivisuus lasketaan gamma-tuikelasku-rilla. Reaktiivisena pidetään niitä näytteitä, joista saatujen sykäysten lukumäärä minuutissa (cpm) on suurempi tai yhtä suuri kuin se erotusarvo (cut off), joka saadaan kertomalla tietyllä tekijällä negatiivisen vertailun keskimääräinen sykäysten määrä (NCx) .

3. Immuunisaostaminen

Solut kasvatetaan 100 % yhteen T75-pullossa. Tämän jälkeen viljelyalustaksi vaihdetaan 5 ml metioniinia sisältämätöntä . -3 5 - alustaa, joka sisältää 400 yCi L-/ S/-metioniinia ja 400 -35 - ” . yCi L-^ S/-kysteiiniä (NEN), ja inkubointia jatketaan koko yön. Alusta väkevöidään 10-kertaiseksi fraktiosaosta- . 95726 60 maila polyetyleeniglykolia käyttäen. Väkevöityä proteiinia (noin 10^ cpm) inkuboidaan ennen immunointia saadun, marsun seerumin 10 μ-litran kanssa tai marsun anti-HBsAg-see-rumin 1 ja 10 mikrolitran kanssa 50 mikrolitrassa TEN-liu-osta (10 mM Tris, pH 7,4 1 mM EDTA, 130 mM NaCl), joka käsitti 0,5 % Tween 20 -tuotetta, 1 tunnin ajan 37 °C:n lämpötilassa. Immunoglobuliinia sidotaan 20 mikrolitraan proteiinin A ja Sepharose C1-4B-geenin (Pharmacia) seosta 1 tunnin ajan 37 °C:n lämpötilassa, pestään kerran liuoksella TEN-Tween 20 ja liuoksella, joka käsittää 500 mM LiCl, ja jälleen liuoksella TEN-Tween 20. Näytteet käsitellään elektroforeettisesti jäljempänä kuvattua SDS-PAGE-järjestelmää käyttäen. Geelejä kiinnitetään 60 minuuttia liuoksessa, joka käsittää 10 % trikloorietikkahappoa, 10 % jääetikkaa ja 30 % metanolia, ja inkuboidaan Enlightning-liuoksessa (NEN) 30 minuuttia. Geelit kuivataan ja auto-radiografoidaan KODAK XAR-5-filmille.

4. SDS-polyakryyliamidigeelillä toteutettu elektroforeesi (PAGE) Näytteen ja geelin esikäsitteleminen: PAGE-analyysiä varten tämän keksinnön mukaisten puhdistettujen partikkelinäyttei-den pitoisuus asetetaan arvoon 10 yg/ml. Kustakin näytteestä otetaan 10 yl, joka sekoitetaan 10 mikrolitraan 1 M DDT 10 % SDS-liuoksessa ja 10 mikrolitraan näytepuskuria. Tätä seosta keitetään 5, 10 tai 15 minuuttia juuri ennen sen laittamista geelille 20 nanometrin partikkeleiden rikkomiseksi ja monomeeristen molekyylien aikaansaamiseksi. Sen jälkeen, kun seokseen on lisätty 10 yl siirtopuskuria (loading buffer), se käsitellään elektroforeettisesti 0,75 mm paksuisessa geeliliuskassa (12 x 18 x 0,1 cm), joka käsitti 12,5 % polyakryyliamidia ja 0,4 % bisakryyli-amidia käyttäen Laemmlin (1970) puskurijärjestelmää sekä arvoja 15 mA ja 100 V 6 tunnin ajan. Proteiinivyöhykkeet tehdään näkyviksi hopealla värjäämällä (katso seuraava, hopealla värjäämistä käsittelevä kappale).

K

61 95726 5. Hopealla värjääminen PAGE-geeli värjätään hopealla Merrilin et ai. (1981) mukaisesti. Proteiini kiinnitetään geeliin liuoksella, joka käsittää 50 % metanolia ja 10 % etikkahappoa, 30 minuuttia. Geeliä pestään 30 minuuttia liuoksella, joka käsittää 10 % metanolia ja 5 % etikkahappoa. Sen jälkeen kun geeliä on inkuboitu 10 % glutaraldehydissä 30 minuuttia, sitä pestään ionittomassa vedessä yön yli. Sen jälkeen kun geeliä on inkuboitu 0,1 % AgNC^-liuoksessa 30 minuuttia, sitä pestään lyhyesti vedessä. Värjätty geeli kehitetään 100 millilitrassa 3 % Na2CC>2-liuosta ja 30 mikrolitrassa formaldehydiä ja kiinnitetään 1 % etikkahapolla. Geeli suljetaan muovipussin sisään ja valokuvataan.

E. Geneettinen manipuloiminen 1. Yhdistelmä-DNA-toimenpiteet a. Puhdistetun DNA:n pilkkominen restriktioendonukleaa-seilla

Toteutetaan kunkin endonukleaasin kohdalla valmistajan ohjeiden mukaisesti.

b. Plasmidi-DNA:n eristäminen 1.1 litra plasmidin sisältäviä soluja kasvatetaan L-alus-• tässä optiseen tiheyteen ODgQ00,5, jonka jälkeen viljelmän annetaan laajentua 12-20 tuntia siten, että läsnä on 200 yg/ml kloram fenikolia.

2. Viljelmä sentrifugoidaan Sorval-sentrifugilla RC5b, nopeudella 8000 rpm 20 minuuttia.

3. Solut suspendoidaan uudestaan 18 millilitraan kylmää liuosta, joka käsittää 25 % sakkaroosia, 50 mM Tris, pH 8,0.

4. Suspensio siirretään 250 millitran Erlenmeyeriin. Pidetään jäissä.

5. Suspensioon lisätään 6 ml 5 mg/ml lysotsyymiä liuoksessa, joka käsittää 250 mM Tris, pH 8,0, ja annetaan seisoa 10-15 minuuttia.

62 95726 6. Seokseen lisätään 6 ml 250 mM EDTA-liuosta, pH 8,0 ja sekoitetaan varoen; seosta inkuboidaan 15 minuuttia jäissä.

7. Seokseen lisätään 30 ml detergenttiseosta; 0,01 % Triton X-100 60 mM EDTA, pH 8,0 50 mM Tris, pH 8,0.

8. Seosta inkuboidaan 30 minuuttia jäissä.

9. Se sentrifugoidaan nopeudella 25 000 rpm, 4 °C:n lämpötilassa, 90 minuuttia SW28-roottorissa.

10. Supernatanttiin lisätään pronaasia pitoisuudeksi 250 yg/ml, ja inkuboidaan 30 minuuttia 37 °C:n lämpötilassa.

11. Supernatantti uutetaan kertaalleen fenolilla, käyttäen 1/2 tilavuudesta fenolia, joka on tasapainotettu TE-liuok-sella (10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA).

12. Vesikerros poistetaan; natriumasetaattia lisätään pitoisuudeksi 300 mM; 2 tilavuutta kylmää 100 % etanolia lisätään; sekoitetaan huolellisesti. Pidetään -20 °C:n lämpötilassa yön yli.

13. Seos sentrifugoidaan ja suspendoidaan 6 millilitraan TE-10 -liuosta (10 mM Tris, 10 mM EDTA, pH 8,0).

14. Suspensioon lisätään 9,4 g CsCl:ia ja 0,65 ml etidium-' bromidia, jonka pitoisuus on 6 mg/ml; tilavuudeksi saate- . taan 10 ml lisäämällä steriiliä, kahdesti tislattua vettä.

15. Liuoksella täytetään Beckman-yhtiön lämmön avulla suljettavat gradienttiputket; niitä sentrifugoidaan nopeudella 48 000 rpm 40 tuntia Ti70.1-Beckman-roottorissa.

16. Plasmidivyöhykkeet tehdään näkyviksi UV-säteillä ja plasmidi-DNA poistetaan ruiskun ja numeron 18 neulan avulla putken seinämän läpi työntämällä.

17. Etidiumbromidi poistetaan plasmidifraktiosta uuttamalla kolmasti peräkkäin yhtä suurilla tilavuuksilla isobutanolia.

18. DNA dialysoidaan yhtä 2 litran suuruista liuoserää vastaan, tämän liuoksen käsittäessä 10 mM Tris, pH 7,4, 1 mM EDTA, pH 7,5, 5 mM NaCl, 2 tuntia tai enemmän 4 °C;n lämpötilassa.

li «3 SS726 19. DNA uutetaan kertaalleen fenolilla käyttäen 1/3 tilavuutta fenolia, joka on tasapainotettu edellä kuvatulla TE-liuoksella.

20. DNA:han lisätään NaAc-yhdistettä pitoisuudeksi 300 mM, ja 2 tilavuutta 100 % etanolia; saostetaan -20 °C:n lämpötilassa yön yli, tai -70 °C:n lämpötilassa 30 minuuttia.

c. Luenta avoimen fosfodiesterisillan kohdalta ("nick")

Luenta avoimen fosfodiesterisillan kohdalta suoritetaan Rigby et ai. mukaisesti (J. Mol. Biol. Voi. 113, sivut 237-251, 1977). Reaktioseos DNA:n 32P-merkitsemiseksi sisältää tavallisesti 0,5 yg esimerkiksi plasmidin EcoRI-Xbal-kappaletta kokonaistilavuudessa 30 yl, käsittäen edelleen 50 mM Tris, pH 7,8, 5 mM MgCl2, 10 mM merkaptoetano-lia, 0,1 mM dATP, 0,1 mM dGTP, 0,1 mM dTTP, 50 yCi 32P-dCTP, 10 yksikköä DNA-polymeraasia I, 3 yl pitoisuudeltaan 1 mg/ml olevan DNaasin 2 x 10 3 -kertaista laimennosta, ja seosta inkuboidaan 90 minuuttia 15 °C:n lämpötilassa, jolloin saadaan yhteensä 3 x 106 - 12 x 10^ cpm, eli 1 x 10^ - 5 x 107 cpm/yg DNA.

d. Kykenevien bakteerisolujen transformaatio

Tiheästä, yön aikana muodostuneesta viljelmästä otetaan • 1 ml bakteerisolujen suspensiota, joka siirrostetaan 100 millilitraan kasvualustaa (L-alusta). Soluja kasvatetaan 37 °C:n lämpötilassa optiseen tiheyteen OD^q = 0,7, johon päästään 2 tunnissa voimakkaasti ravistellen 500 millilit-ran Erlenmeyer-pulloissa. Kasvu pysäytetään jäähdyttämällä viljelmää jäissä 10 minuuttia. Tästä viljelmästä otetaan 3 ml, josta eksponentiaalisessa kasvuvaiheessa olevat bakteerisolut otetaan talteen sentrifugoimalla nopeudella 3000 rpm 5 minuuttia. Solut suspendoidaan uudestaan 1,5 milli-litraan liuosta, joka käsittää 50 mM CaCl2~yhdistettä 10 mM Tris-puskurissa, pH 8,0, ja niitä inkuboidaan jälleen jäissä 15 minuuttia. Solut otetaan jälleen talteen sentrifugoimalla nopeudella 3000 rpm 5 minuuttia, ja ne suspen- 64 55726 doidaan uudestaan 200 mikrolitraan liuosta, joka käsittää 50 mM CaCl2-yhdistettä 10 mM Tris-puskurissa, pH 8,0 ja pidetään 4 °C:n lämpötilassa yön yli.

Tämän jälkeen ligaatioseoksen kokonaistilavuus saatettiin 70 mikrolitraksi liuoksella, joka käsittää 10 mM Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA, ja se lisättiin 200 mikrolitraan bakteerisolujen suspensiota DNA:n siirtämiseksi soluihin.

Seosta inkuboitiin jäissä 30 minuuttia, jonka jälkeen siihen lisättiin 1 ml L-alustaa, ja seosta inkuboitiin 42 °C:n lämpötilassa 2 minuuttia ja 37 °C;n lämpötilassa 40 minuuttia. Inkuboinnin jälkeen solut levitettiin agarmaljoille, jotka sisälsivät 50 yl ampisilliinia/ml agaria, siten, että maljalle levitettävän solususpension tilavuus oli 50-300 ui. Agarmaljoja inkuboitiin 37 °C:n lämpötilassa yön yli. Tämän inkubointijakson jälkeen maljoille oli muodostunut yksittäisiä, erillisiä bakteeripesäkkeitä.

e. Southernin täpläanalyysi

Jotta saataisiin selville tämän keksinnön mukaisten vektoreiden järjestäytyminen isäntäsolun genomissa, kromosomaa-linen DNA tämän keksinnön mukaisia partikkeleita tuottavista solulinjoista eristetään ja pilkotaan sopivilla restriktio-entsyymeillä, ja analysoidaan Southernin menetelmällä (J.

Mol. Biol., Voi. 98, sivut 503-517, 1975) käyttäen 3^P-mer-kittyä DNA-koetinta. Sen jälkeen, kun kromosomaalinen DNA (20 yg) on pilkottu restriktioentsyymeillä EcoRI ja Xbal, niin tuloksena olevat kappaleet erotetaan elektroforeetti-sesti 0,7 % agaroosigeelillä. Tämän jälkeen DNA denaturoidaan käsittelemällä sitä 366 nanometrin UV-säteillä 10 minuuttia, ja inkuboimalla 45 minuuttia liuoksessa, joka käsittää 0,5 N NaOH ja 1 M NaCl. Geelit neutraloidaan inkuboimalla 60 minuuttia liuoksessa 0,5 M Tris, 1,5 M NaCl, pH 7,5. DNA siirretään nitroselluloosaa olevalle suodatti-melle kastelemalla sitä 20 tuntia liuoksella, joka käsittää 3 M NaCl, 0,3 M Na-sitraattia (20 x SSC), geelin läpi 11 65 95726 laittamalla nitroselluloosasuodattimen päälle pino kuivia paperipyyhkeitä. Nitroselluloosasuodatinta pidetään 2 tuntia vakuumiuunissa 80 °C:n lämpötilassa.

Radioaktiivinen DNA-koetin plasmidin pDMI (4,3 kb) EcoRI-Xbal -kappaleesta valmistetaan nick-luennalla.

DNA-koettimen kanssa hybridisaatiota varten nitroselluloosa-suodatin suljetaan muovipussiin, joka sisältää 10 ml esi-hybridisaat-ioseosta: 50 % formamidia, 5 x £SC, 50 mM natrium-fosfaattia, pH 7,0, 5 x Denhardtin liuos, 250 yg/ml denaturoitua lohen sperman DNA:ta. Suodatinta inkuboidaan tässä seoksessa 4 tuntia 45 °C:n lämpötilassa, jonka jälkeen esi-hybridisaatioseos korvataan hybridisaatioseoksella: 50 % formamidia, 5 x SSC, 20 mM Na-fosfaattia, pH 7,0, 1 x Denhardtin liuos, 100 yg/ml denaturoitua lohen sperman DNA:ta 5 x 103 cpm/ml "^P-koetinta. Sen jälkeen, kun suodatinta on inkuboitu hvbridisaatioseoksessa 18 tuntia 45 °C:n lämpötilassa, sitä pestään kolmasti kulloinkin 5 minuuttia 50 °C:n lämpötilassa liuoksella 0,1 x SSC, 0,1 % SDS.

Suodatinta kuivataan 60 0C":n lämpötilassa 10 minuuttia, ja sillä valotetaan kahta röntgensädefilmiä (XAR-5, KODAK) kahden voimistavan varjostimen välissä, ja pidetään -80 °C:n lämpötilassa. Ensimmäinen röntgensädefilmi kehitetään -3 vuorokautta kestäneen valottamisen jälkeen; toinen filmi 7 vuorokautta kestäneen valottamisen jälkeen. Merkityn DNA-koettimen hvbridisoituminen yhteen solun DNA:sta saatuun restriktiokappaleeseen, joka on peräisin tämän keksinnön mukaisia partikkeleita tuottavista transfektanteista , osoittaa, että solun DNA sisältää todellakin tämän keksinnön mukaisen yhtenäistyneen vektorin. Koska Southernin rtäpläanalyysin perusteella solu-DNA:n restriktioprofiili on sama kuin alkuperäisessä plasmidimuodosteessa, niin voidaan todeta, ettei plasmidi-DNA:n huomattavaa uudestaan-järjestäytvmistä tapahtunut sen yhtenäistyessä isäntäsolun ÖNA:hän.

66 95726 2. Nisäkkään solulinjojen transfektio ja tämän keksinnön mukaisia partikkeleita tuottavien kloonien tunnistaminen

Solut transfektoidaan käyttäen Wiglerin et ai. esittämää (Cell, Voi. 14, sivu 725, 1978), kalsiumfosfaatilla saos-tamiseen perustuvaa menetelmää. Tämän jälkeen solut ositetaan suhteessa 1:6 uusiin viljelymaljoille, ja ne solut, joihin on siirtynyt lääkeaineen vastustuskykyyn perustuvan merkitsimen geeni (neo), valikoidaan kasvattamalla G418-pitoisessa alustassa. Sen jälkeen kun solut ovat kasvaneet 10 vuorokautta selektiivisellä alustalla, lääkeaineelle vastustuskykyiset pesäkkeet kloonataan mikrotiitterile-vyille. Sen jälkeen, kun solut ovat kasvaneet yhteen, tämän keksinnön mukaisten partikkeleiden ilmentyneet määrät varmistetaan RIA-tekniikalla.

Kudosviljelymaljoille (halkaisija 100 mm) siirrostetaan 5x10^ solua ja niitä inkuboidaan yön yli 37 °C:n lämpötilassa. Neljä tuntia ennen transfektoimista viljelyalusta korvataan uudella alustalla. Transfektoitava DNA suspen-doidaan 1 millilitraan liuosta, joka sisältää 250 mM CaCl2/ 140 mM NaCl, 25 mM Hepes, pH 7,1, sekä 0,75 mM NaHPO^ . Tämä kalsiumfosfaatin ja DNA:n välinen saostuma lisätään viljelmän soluihin. Viljelmää inkuboidaan yön yli, jonka jälkeen soluviljelmään lisätään uutta alustaa ja soluja inkuboidaan edelleen kaksi vuorokautta.

F. Toimenpiteet, joilla saadaan nisäkässolujen staattinen soluviljelmä

Ampullillinen soluja, joita on pidetty -196 °C:n lämpötilassa * nestemäisessä typessä, sulatetaan nopeasti laittamalla ampulli 5 minuutiksi vesihauteeseen, jonka lämpötila on 37 °C. Yksi ml tätä juuri sulatettua solususpensiota laimennetaan lisäämällä siihen hitaasti 10 ml asianmukaista viljelyalustaa. Tämän jälkeen solut otetaan talteen sentri-fugoimalla, suspendoidaan uudestaan 10 millilitraan vilje-lyalustaa. Tämän jälkeen solut otetaan talteen sentrifu- 67 95726 goimalla ja ne suspendoidaan uudestaan 10 millilitraan viljelyalustaa, siirretään T25-viljelypulloihin ja niitä kasvatetaan inkubaattorissa 37 °C:n lämpötilassa siten, että läsnä on 5 % C02:ta. Näissä olosuhteissa L-solujen ja CHO-solujen kaksinkertaistumiseen tarvittava aika on suurin piirtein 15-20 tuntia ja Vero-solujen tapauksessa 30-40 tuntia. L-solut ja CHO-solut saadaan pysymään hengissä ja kasvamaan myös sen jälkeen, kun ne ovat kasvaneet 100-prosenttisesti yhteen, kun taas Vero-solut siirretään, kun ne ovat kasvaneet 100-prosenttisesti yhteen.

G. Toimenpiteet nisäkässolujen kasvattamiseksi ACUSYST-P-laitteessa ja tämän keksinnön mukaisten partikkeleiden ottaminen talteen 1. Siirrosten kasvatus ja esikäsittely

Soluja pidetään T75- tai T150-pulloissa, jotka sisältävät 2 DMEM-10 % FBS. Pyöritettävissä pulloissa (850 cm ) inku- boidaan 10-15 x 10® solua, jotka on saatu T-pulloista.

Kun soluja on kasvatettu 3-5 vuorokautta, yhteensä noin o 10 solua otetaan talteen kuudesta pyöritettävästä pullosta ja ne siirrostetaan kuuteen onttokuituhylsyyn (HFC) ACUSYST-P-laitteessa, jonka valmistaja on yhtiö Endotronics, Inc., Minneapolis, Minnesota, USA.

2. ACUSYST-P-viljelmä ja tämän keksinnön mukaisten partikkeleiden ottaminen talteen

Siirrostamisen jälkeen HFC-hylsyt laitetaan ACUSYST-P-vil jely järjestelmään ja hylsyjen läpi kulkevan alustan virtausnopeus asetetaan arvoon 50 ml/tunti ja se pidetään tässä arvossa. Alustasta määritetään päivittäin pH, p02, glukoosi ja laktaatti. Kasvatuksen kestettyä 2-3 viikkoa, 600 millilitran nestetilavuus otetaan kahdesti viikossa kunkin ACUSYST-P-laitteessa olevan onttokuituhylsyn kapillaarin ulkopuolisesta tilasta. Tämän keksinnön mukaisten partikkeleiden muodostuminen todetaan radioimmunokokeella (RIA). Koska pakastaminen tuhoaa RIA-kokeella määritettä- 68 95726 vän aktiivisuuden, niin talteen otettuja näytteitä säilytetään 4 °C:n lämpötilassa ennen puhdistamista. Proteaasi-aktiivisuutta ei todeta lainkaan näissä olosuhteissa Azo-coll-substraatin proteolyysillä (SIGMA) määritettynä.

3. Toimenpiteet laadun tarkkailemiseksi a. Kokeet bakteereiden ja fungien läsnäolon toteamiseksi

Solujoukosta, joka sisältää noin 5x10^ solua/ml ja jotka on suspendoitu siihen soluviljelyalustaan, josta ne otettiin talteen, määritetään bakteereiden ja fungien läsnä olo. Yksi ml soluja vedetään tryptikaasi-soija-agaria (BBL) sisältäville maljoille, ja toinen 1 ml siirrostetaan tioglykolaattialustaan (DIFCO) aerobisten sekä anaerobisten bakteereiden läsnäolon toteamiseksi. Fungikontaminaatio ilmaistaan vetämällä 1 ml soluja Sabouraud-agaria (DIFCO) sisältäville maljoille. Nämä kokeet toteutettiin säännöllisesti, jolloin voitiin varmistua kasvualustan steriiliydestä sekä siitä, etteivät soluviljelmät olleet kontaminoituneet bakteereilla tai fungeilla.

b. Kokeet mykoplasman läsnäolon toteamiseksi

Fluoresenssivärjäys. Mykoplasma-DNA:n läsnäolo solun sytoplasmassa määritetään värjäysmenetelmällä käyttäen fluoro-kromia, Hoechst 33258. Tämä DNA:n värjäävä väri fluoresoi ultraviolettivalossa, ja se toimii mykoplasmojen läsnäolon osoittavan, erittäin nopean ja herkän kokeen perustana.

Tässä menetelmässä käytetään testattavien solujen peite-lasiviljelmiä, joita käytetään kun solut ovat kasvaneet 50-70 -prosenttisesti yhteen. Kiinnittämisen ja värjäämisen jälkeen peitinlaseja tarkastellaan fluoresenssimikroskoo-pilla. Sytoplasminen fluoresenssi osoittaa mykoplasman läsnäolon.

Hoechst 33258 bisbentsamidi-fluorokromin varastoliuos *. valmistetaan liuottamalla 5 mg fluorokromia 100 millilit- raan PBS-liuosta magneettisekoittajaa käyttäen. Se steri- I) 69 95726 loidaan suodattamalla 0,22 mikronin kalvon läpi, säilytetään pimeässä, 4 °C:n lämpötilassa, ja laimennetaan tuhat-kertäisesti PBS-liuoksella ennen käyttöä. Peitinlasiviljel-mien, jotka ovat kasvaneet yhteen 50-70 -prosenttisesti, alusta erotetaan soluista imulla, ja kiinnitetään 4 °C:n lämpötilassa vaihtamalla kahdesti seos, joka käsittää etanolia ja etikkahappoa suhteessa 3:1. Peitinlasit pestään kerran ionittomalla vedellä ja inkuboidaan 30 minuuttia 37 °C:n lämpötilassa laimennetun, fluorokromina toimivan bisbentsamidin (Hoechst 33258) kanssa, jonka jälkeen peitinlasit huuhdellaan ionittomalla vedellä. Peitinlasit laitetaan solupuoli alaspäin mikroskooppilasille käyttäen upotinnesteenä glyserolia (22,2 ml 2 % sitruunahappoa; 1 ml H20; 27,8 ml 2,8 % Na2HP04; 50 ml glyserolia, pH 5,5) .

C. Kokeet virusten läsnäolon toteamiseksi 1) Kokeet soluviljelmissä.

Testisoluja tarkastellaan normaalin morfologian suhteen vähintään 14 vuorokauden pituisen inkubointijakson aikana, testattavan solulinjan suspensiolla siirrostamisen jälkeen.

Tämän lisäksi 3.-5. vuorokautena ja jälleen 12. vuorokauden jälkeen, vähintään 4 % siirrostetuista testiviljelmistä pestään, ja siitä määritetään hemadsorptio käyttäen lampaan ja ihmisen punasoluja. Tulokset luetaan sen jälkeen kun viljelmiä on inkuboitu 30 minuuttia 3-4 °C:n lämpötilassa, ja jälleen 30 minuutin kuluttua 34-37 °C:n lämpötilassa. Kokeista, joilla voidaan määrittää viruksella infektoituneiden, erytrosyyttejä absorboivien solujen läsnäolo, saadut tulokset osoittivat viruskontaminaation puuttumisen.

2) Kokeet eläimissä.

Testattavat solut suspendoidaan liuokseen, joka käsittää 140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8,1 mM Na2HP04, pH 7,2, pitoisuudeksi 10^/ml, ja niitä siirrostetaan eri eläinryhmiin. Yhdessä ryhmässä, vähintään 10 eläintä vähintään kahdesta imevien hiirten pesueesta saa siirrostetta. Soluja siir- 70 95726 rostetaan kuhunkin eläimeen 0,1 ml vatsaontelon sisäisesti ja 0,01 ml aivojen sisäisesti. Hiiriä tarkkaillaan päivittäin, vähintään 14 vuorokauden ajan. Jokaiselle hiirelle, joka kuolee kokeen 24 ensimmäisen tunnin jälkeen tai joka tapetaan sairastumisen vuoksi, tehdään ruumiinavaus ja siitä etsitään jälkiä virusinfektiosta. Tämä tutkimus käsittää lisätestaamisen, joka toteutetaan alisiirrostamalla sopivia kudossuspensioita aivojen sisäisesti ja vatsaontelon sisäisesti vähintään viidestä imevästä hiirestä muodostuvaan lisäryhmään, jota tarkkaillaan 14 vuorokautta. Tämän lisäksi tehdään sokeakoe yhdistetystä, emulgoidusta kudoksesta (ihoa ja elimiä (viscus) lukuunottamatta), joka on saatu alkuperäisen 24 vuorokauden pituisen kokeen jälkeen eloon jääneistä hiiristä.

Toisessa ryhmässä myös 10 täysikasvuista hiirtä saa siir-rostetta. Kuhunkin eläimeen siirrostetaan 0,5 ml soluja vatsaontelon sisäisesti ja 0,03 ml soluja aivojen sisäisesti. Eläimiä tarkkaillaan neljä viikkoa, ja jokainen eläin, joka sairastuu, tai jossa esiintyy poikkeavuutta tavallisuudesta, tutkitaan sairastumisen syyn selvittämiseksi. Kontaminoivien virusten läsnäolon osoittavista, eläimissä toteutetuista kokeista saadut tulokset eivät ilmaisseet viruskontaminaatiota.

d. Koe tuumorigeenisyyden selvittämiseksi.

Sopivassa tuumorigeenisyyden ilmaisevassa kokeessa, jossa käytetään karvattomia hiiriä (nu/nu), 20 eläimeen siirrostetaan 24 tunnin sisällä syntymisestä 0,1 ml voimakasta seerumia. Tämä injektio annetaan joko lihaksen sisään tai ihonalaisesti ja se toistetaan 2., 7. ja 14. elinpäivänä.

Yksi miljoona vertailuna käytettyä tuumorisolua tuottaa säännöllisesti asteittain kasvavia tuumoreita ja etäispesäkkeitä. Yksi miljoona elävää solua tutkittavasta solu-linjasta siirrostetaan ihon alaisesti mihin tahansa sellaiseen kohtaan, jossa kehittyvät tuumorit voivat puhjeta

II

71 95726 (raajat ovat sopivia). Eläimiä tarkkaillaan 21 vuorokautta sen toteamiseksi, muodostuuko injektiokohtaan solmuketta, ja mittauksia suoritetaan ajoittain asteittaisen kasvun toteamiseksi. 21 vuorokauden pituisen havainnointijakson päätyttyä kaikki eläimet tapetaan ja niistä etsitään jälkiä tuumorin muodostumisesta injektiokohtaan sekä muihin elimiin, kuten imurauhasiin, keuhkoihin, munuaisiin ja maksaan. Kaikki tuumorin kaltaiset muutokset ja kaikki siirrostamiskohdat tutkitaan histopatologisesti. Tämän lisäksi, koska eräät solulinjat voivat muodostaa etäispesäkkeitä paikallisen tuumorikasvun kuitenkin puuttuessa, niin kaikkien eläinten keuhkot ja alueelliset imusolmukkeet tutkitaan histologisesti.

Tämän kokeen tavoitteita ajatellen asteittain kasvava tuumori määritellään kosketeltavaksi solmukkeeksi, jonka koko suurenee 21 vuorokauden pituisen havaintojakson aikana, ja jossa voidaan todeta eläviä ja mitoottisesti aktiivisia siirrostesoluja histologisesti tutkittaessa. Asteittain kasvavana tuumorina ei pidetä sitä, että läsnä on mikros-kooppisesti eläviä soluja liittyneenä muuttumattomaan tai regressiiviseen solmukkeeseen.

H. Tämän keksinnön mukaisten partikkeleiden puhdistaminen I. Fraktiosaostaminen polyetyleeniglykolilla (PEG)

Alusta otetaan talteen kapillaarien ulkopuolisesta tilasta, ACUSYST-P-viljelyjärjestelmästä, ja yhdistetään 3000 milli-litran tilavuuksiksi. Kuhunkin tilavuuteen lisätään 180 g PEG 8000-tuotetta (SIGMA), joka liuotetaan sekoittamalla huoneen lämpötilassa 20 minuuttia, ja sekoittamista jatketaan edelleen 3 tuntia 4 °C:n lämpötilassa. Saostuma otetaan talteen sentrifugoimalla 500 millilitran suuruisissa pulloissa GS 3-roottorissa nopeudella 4500 rpm (3000 x g) 30 minuuttia 10 °C:n lämpötilassa. Supernatant-ti otetaan talteen ja siihen lisätään jälleen 180 g PEG 8000 -tuotetta, joka liuotetaan huoneen lämpötilassa edellä 72 95726 kuvatusti. Liuosta sekotetaan 4 °C:n lämpötilassa edelleen 3 tuntia. Tämän liuoksen saostuma otetaan talteen edellä kuvatusti, paitsi että sentrifugointi toteutetaan nopeudella 9000 rpm (15 000 x g) 60 minuuttia. Kasauma suspen-doidaan uudestaan fosfaatilla puskuroituun suolaliuokseen (PBS).

2. Geelisuodatukseen perustuva kromatografia Materiaali, joka saatiin PEG-saostamalla, ja joka on liuotettu uudestaan PBS-liuokseen, käsitellään kromatogra-fisesti geelillä suodattamalla käyttäen BioRad-yhtiön A-5m-hartsia 4 °C:n lämpötilassa. Kolonnin ulottuvuudet ovat 25 x 1000 mm, ja petin tilavuus on 480 ml. Jaettaessa materiaali tyypillisellä tavalla fraktioihin 1000 ug tämän keksinnön mukaisia PEG-saostettuja partikkeleita 10-15 millilitran tilavuudessa laitetaan kolonniin ja elu-oidaan PBS- tai TNE-liuoksella, virtausnopeuden ollessa 6 pisaraa minuutissa (18 ml/h) ja eluaatista kerätään 3 millilitran fraktioita. Kuvassa 6 esitetään A-5m-ko-lonnista eluoituneen, RIA-ilmaistavan materiaalin profiili. Yhtenäinen viiva osoittaa kunkin fraktion absorbanssin aallonpituudella 280 nm, ja pisteet osoittavat RIA-tulok-sien perusteella lasketun materiaalimäärän.

3. Isopykninen sentrifugointi CsCl-yhdisteessä 30 fraktiota, jotka kattavat geelisuodatuksena toteutetusta pylväskromatografiästä saadun ensimmäisen piikin, ja jotka sisältävät tämän keksinnön mukaiset, osittain puhdistetut partikkelit, yhdistetään (suurin piirtein 100 ml). Tämän 3 liuoksen tiheys asetetaan arvoon 1,30 g/cm CsCl-yhdis-teellä, jonka jälkeen liuos siirretään nitroselluloosa-putkiin, jotka sopivat SW 27/28-roottoriin (Beckman).

Gradientit saadaan aikaan laittamalla pohjalle 4 ml CsCl-liuosta, jonka tiheys on 1,35 g/cm"*, ja pinnalle 4 ml CsCl-liuosta, jonka tiheys on 1,25 g/cm , sekä 4 ml CsCl-liuosta, jonka tiheys on 1,20 g/cm^. Gradientteja sentrifu- il 73 95726 goidaan nopeudella 28 000 rpm 50 tuntia 10 °C:n lämpötilassa, jaetaan fraktioihin, ja puhdistuneet partikkelit otetaan talteen tiheydeltään 1,20 g/cm^ olevasta kerroksesta, gradientin pinnalta (kuva 7). Puhdistuneet partikkelit erottuvat hyvin kontaminoivan proteiinin pienestä määrästä, joka muodostaa vyöhykkeen grandientin keskelle. Liuoksesta poistetaan suola dialysoimalla, ensin vettä vastaan, sitten 3 suolaliuoksen erää vastaan, 24 tunnin pituisen ajanjakson aikana.

Ylimääräisenä laaduntarkkailutoimenpiteenä osa tästä gradientin avulla puhdistetusta materiaalista sentrifugoidaan uudestaan lineaarista CsCl-gradienttia käyttäen. Odotusten mukaisesti saadaan yksi ainoa puhdistettujen partikkeleiden piikki tiheyteen 1,2 g/cm^.

1. Tämän keksinnön mukaisten puhdistettujen partikkeleiden apuaineen valmistaminen ja stabiilisuuskoe Tämän keksinnön mukaisessa rokotteessa käytettävän apuaineen valmistamiseksi steriilissä suolaliuoksessa toivottuna pitoisuutena olevaan antigeeniin lisätään 1/10 000 tilavuutta Thimerosolia ja 1/10 tilavuutta suodattamalla steriloitua 0,2 M AIK(SO)2:12 I^O-liuosta, pH asetetaan arvoon 5,0 steriilillä 1 N NaOH-liuoksella, ja suspensiota sekoitetaan huoneen lämpötilassa 3 tuntia. Alunalla saostettu antigeeni otetaan talteen sentrifugoimalla 10 minuuttia nopeudella 200 rpm, suspendoidaan uudestaan steriiliin normaaliin suolaliuokseen, joka sisältää 1:10 000 Thimerosolia, ja jaetaan osiin steriileissä olosuhteissa.

Tämän keksinnön mukaisten, alunaan absorboituneiden partikkeleiden stabiilisuuden määrittämiseksi antigeeni otettiin talteen tekemällä aluna uudestaan liukoiseksi 3 % natrium-sitraattiin, mitä seurasivat peräkkäiset dialyysit 3 % natriumsitraattia ja PBS-liuosta vastaan. Tämän jälkeen 74 95726 keksinnön mukaisten partikkeleiden määrä määritetään yhdensuuntaisella (parallel-line) radioimmuunikokeella puhdistetun HBsAg-standardin laimennoksia vastaan, näiden laimennosten käsittäessä PBS-50 % juuri syntyneen vasikan seerumia .

Taulukko 1

Stabiilisuuskokeen parametrit Näytteet: kaksi näytettä sellaisenaan ja kaksi alunaan absorboituna Näytteen pitoisuus: 5 yg/ml Säilytysastia: lasiampulli

Säilytyslämpötila: 2-8 °C

Kokeet: (a) kvalitatiivinen: SDS-PAGE

(b) kvantitatiivinen: radioimmunokoe

Esimerkki 1

PreS^-PreS2~S -proteiinin koodaavan alueen koodaamia poly-peptidejä käsittävien partikkeleiden ilmentäminen A. Yhdistelmäplasmidin pMMT-neo valmistaminen

Plasmidi pBPV342-12 pilkottiin restriktioendonukleaasilla BamHI (katso kuva 1 sekä kappaletta Materiaalit ja menetelmät) . Tällöin saatiin kaksi DNA-molekyyliä: yksi molekyyli (7,95 kb) käsittää naudan papillomaviruksen (BPV) koko ge-nomin; toinen molekyyli (6,65 kb) sisältää osan bakteeri-pi asmidista pML2 (pBR322, josta on hävitetty "mvrkkyketju"), hiiren metallotioneiinipromoottorin (pMMT), neomvsiinin vastustuskyvyn geenin (neo) sekä SV40 PAS-t-alueen (katso kuva 1) . Kun tämä kappale ligatoidaan itseensä (tehdään rengasmaiseksi), niin tällöin saadaan plasmidi pMMT-neo (katso myös kuva 5).

Reaktio toteutettiin reaktiopuskurissa (katso Materiaalit ja menetelmät), jonka kokonaistilavuus on 400 yl, ja lopullinen pitoisuus 0,2 yg/yl pBPV342-12; sekä 80 yksikköä entsyymiä BamHI, ja reaktio toteutettiin 37 °C:n lämpö-

II

75 95726 tilassa 4 tuntia. Pilkkoutumisen täydellisyys varmistettiin elektroforeettisesti agaroosigeelillä käyttäen 0,7 % agaroosigeeliä (katso materiaalit ja menetelmät). Reaktio pysäytettiin lisäämällä 40 yl 8 M LiCl-liuosta ja DNA saos-tettiin 1 millilitralla etanolia -80 °C:n lämpötilassa 30 minuuttia. Saostettu DNA suspendoitiin uudestaan 100 mikro-litraan 10 mM Tris-puskuria, pH 7,8.

B. Koko PreS^-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen sekä kopioitumisen luonnollisen promoottorin sisältävän kappaleen eristäminen HBV-genomin adw-alatyypin valmistus ja kloonaaminen kuvataan julkaisussa Cummings, I.W. et ai., Proc. Natl. Aca.

Sei. USA, Voi. 77, sivu 1842, 1980. Rengasmainen HBV-genomi tehdään lineaariseksi ainoasta EcoRI-kohdasta bakteriofagiin lambda kloonaamista varten sekä bakteeriplasmidin alikloo-naamista varten, jolloin saadaan plasmidi pA01 (katso kuva 2). Koska EcoRI-restriktiokohta sijaitsee PreS1-PreS2~S-proteiinin koodaavassa alueessa, niin tämä alue katkeaa lineaarisessa EcoRI-muodossa. Vahingoittumattoman PreS.|-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen aikaansaamiseksi plas-midin pA01 3,2_kiloemäsparin suuruinen EcoRI-istute eristettiin ja erotettiin plasmidi-DNA:sta pilkkomalla 100 mikrogrammaa plasmidia pA01 reaktiopuskurissa, jota oli yhteensä 400 yl (katso materiaalit ja menetelmät), ja joka sisälsi 200 yksikköä EcoRI-entsyymiä, 4 tuntia 37 °C:n lämpötilassa. 3,2 kiloemäsparin suuruinen DNA-istute eristettiin plasmidi-DNA:sta preparatiivisella elektroforeesilla 0,7 % agaroosigeeliä käyttäen (katso Materiaalit ja menetelmät). DNA eluoitiin sähköisesti agaroosigeeliltä ioninvaihtosuodattimelle DE 81 Whatman, josta DNA poistetaan runsaasti suolaa sisältävään liuokseen. DNA puhdistettiin uuttamalla kerran fenolin ja kloroformin seoksella ja saostamalla kahdesti etanolilla. Tämän jälkeen puhdistettu lineaarinen 3,2 kb EcoRI-kappale, joka koodaa täydellistä HBV-genomia, ligatoitiin itseensä käyttäen 76 9 5 7 2 6 korkeata DNA-pitoisuutta, joka suosii konkatameerien muodostumista: 30 yg EcoRI-kappaleen DNA:ta ligatoitiin reak-tiopuskurissa, jonka kokonaistilavuus oli 50 ui» ja joka sisälsi 1,8 yksikköä T4 DNA-ligaasia ja 2 mM ATP:tä, 15 °C:n lämpötilassa 1 tunnin ajan, ja 4 °C lämpötilassa yön yli; tämän jälkeen DNA puhdistettiin uuttamalla kahdesti fenolin ja kloroformin seoksella, uuttamalla kertaalleen kloroformilla, jonka jälkeen kahteen kertaan saostaminen etanolilla. DNA-kasauma suspendoitiin uudestaan 20 mikro-litraan 10 mM Tris-puskuria, pH 7,8, ja pilkottiin restrik-tioentsyymillä Bglll reaktiopuskurissa (katso Materiaalit ja menetelmät), jonka kokonaistilavuus oli 50 yl, ja joka sisälsi 50 yksikköä entsyymiä Bglll, 37 °C:n lämpötilassa 4 tuntia.

Tässä reaktiossa muodostuneet DNA-kappaleet erotettiin elektroforeettisesti käyttäen 1,5 % agaroosigeeliä. Agaroo-sigeeliltä eristettiin 2,78 kiloemäsparin suuruinen Bglll-kappale, joka sisältää vahingoittumattoman PreS^-PreS2~S-proteiinin koodaavan alueen, sekä sen luonnollisen promoottori järjestelmän , jota tarvitaan pinnan antigeenipolypep-tidien ilmentämiseksi, ja tämä kappale puhdistettiin edellä esitetysti (katso kuva 2) .

C. PreS^-PreS2~S-proteiinin koodaavan alueen sisältävän kappaleen istuttaminen pMMT-neo-plasmidiin: plasmidin pDM1 muodostaminen

Edellä osassa A kuvatusti valmistetusta DNA-liuoksesta otettiin 1 yl, ja se sekoitettiin 5 mikrolitraan edellä osassa B kuvattua, 2,78 kiloemäsparin suuruista Bglll-kappaletta (0,25 yg/yl).

Seos alistettiin ligaatioreaktioon yhteensä 10 mikrolit-rassa reaktiopuskuria, joka sisältää 0,9 yksikköä T4 DNA-ligaasia, 15 °C:n lämpötilassa 1 tunnin ajan, ja 4 °C:n lämpötilassa yön yli.

77 95726

Bakteerisoluja, mieluiten HB101-soluja käsiteltiin siten, että ne kykenivät ottamaan vastaan DNA:ta transformaatio-reaktiossa, joka toteutetaan osassa Materiaalit ja menetelmät kuvatun menetelmän mukaisesti. Ligaatioseos käsitti 10 mM Tris, pH 7,5 1 mM EDTA, kokonaistilavuuden ollessa 70 yl, ja se lisättiin 200 mikrolitraan kykeneväksi tehtyjen bakteerisolujen suspensiota DNA:n siirtämiseksi soluihin .

Seosta inkuboitiin jäissä 30 minuuttia, sitten siihen lisättiin 1 ml L-alustaa, ja seosta inkuboitiin 42 °C:n lämpötilassa 2 minuuttia ja 37 °C:n lämpötilassa 40 minuuttia. Inkuboinnin jälkeen solut levitettiin LB-agarmaljoille, jotka sisälsivät 50 yg ampisilliinia/ml siten, että kullekin maljalle saatiin 50-300 yl solususpensiota. Agarmaljoja inkuboitiin 37 °C:n lämpötilassa yön yli. Tämän inkubointi-jakson jälkeen yksittäiset eristetyt bakteeripesäkkeet seulottiin toivotun, 2,78 kiloemäsparin suuruisen, Bglll-entsyymillä saadun DNA-kappaleen muodostaman istutteen sisältävän bakteeriplasmidin pMMT-neo läsnäolon suhteen (katso kuva 3).

Seulonta toteutetaan mieluiten pesäkehybridisaatioon perustuvalla menetelmällä. Tätä tarkoitusta varten yksittäiset pesäkkeet nostettiin hammastikulla, ja ne siirrettiin ampisilliinia sisältävälle LB-agarmaljalle ristikon muotoon, joka mahdollistaa kloonien tunnistamisen. Maljaa inkuboitiin yli yön 37 °C:n lämpötilassa.

Pesäkkeet siirrettiin nitroselluloosasuodattimelle laittamalla suodatin agarpinnan päälle, ja pitämällä sitä agarin pinnalla niin kauan, kunnes se oli märkä. Suodatin poistettiin varovaisesti agarin pinnalta, jonka jälkeen toteutettiin peräkkäinen siirtäminen Whatman 3M-paperin kolmeen kerrokseen, joista kukin oli kasteltu liuoksella, joka käsitti joko 0,5 M NaOH, tai 1 M Tris, pH 7,0, 1,5 M NaCl/ 0,5 M Tris, pH 7,4, tai 2 x SSC. Suodattimet laitettiin vs 95726 pesäkepuoli ylöspäin kasteltujen papereiden päälle solujen hajottamisen ja tämän jälkeen toteutettavien neutralointi-ja kiinnitystoimenpiteiden ajaksi.

Sen jälkeen, kun suodattimet oli kuivattu ilmassa, niitä kuumennettiin vakuumissa 80 °C:n lämpötilassa. Tämän jälkeen nitroselluloosasuodattimilla toteutettiin DNA-hybridi-saatio käyttäen edellä osassa B kuvatulla tavalla valmistetun PreS^-PreS2~S-proteiinin koodaavan alueen sisältävästä, 2,78 kiloemäsparin suuruisesta Bglll-kappaleesta saatua, radioaktiivisesti merkittyä DNA-koetinta sekä luentaa avoimen fosfodiesterisillan (nick) kohdalta (katso Materiaalit ja menetelmät).

Nitroselluloosasuodatinta inkuboitiin esihybridisaatioseok- sessa, joka sisältää 50 % formamidia, 20 mM natriumfosfaatti- puskuria, pH 6,6; 1 x Denhardt:in liuosta; 100 yg/ml denatu- 7 3 2 roitua lohen sperman DNA:ta sekä 1x10 cpm P-merkittyä DNA:ta, joka oli sulatettu 0,2 N NaOH-liuokseen, 68 °C:n lämpötilassa 10 minuuttia.

Tätä suodatinta inkuboitiin tässä seoksessa 16 tuntia 45 °C:n lämpötilassa. Tämän jälkeen suodatinta pestiin kahdesti liuoksessa, joka käsitti 2 x SSC, 0,1 % SDS, kummallakin kerralla huoneen lämpötilassa 5 minuutin ajan, ja kahdesti liuoksessa, joka käsitti 0,1 x SSC, 0,1 % SDS, 15 minuuttia, kummallakin kerralla .50 °C:n lämpötilassa. Suodatti-milla valotettiin kahden varjostimen välissä röntgensä-defilmiä (mieluiten 3M) -80 °C:n lämpötilassa kahden vuorokauden ajan.

Kloonatun 2,78 kiloemäsparin suuruisen Bglll-kappaleen käsittävän yhdistelmäplasmidin sisältävät pesäkkeet nähtiin mustina pisteinä. 50 pesäkkeestä tunnistettiin neljä, ja näiden pesäkkeiden plasmidi-DNA eristettiin minipreparaat-teina menetelmällä, joka esitetään julkaisussa Birnboim ja Doly, Nucl. Acids Res., Voi. 7, sivu 1513, 1979, ja se n 79 95726 analysoitiin pilkkomalla kaksinkertaisesti restriktio-endonukleaaseilla Bglll ja Xbal. Analyysit vahvistivat edellä kuvatun, odotetun rakenteen (katso kuva 3).

D. PreS^-PreS2~S-proteiinin koodaavien alueiden luonnollisen promoottorin korvaaminen metallotioneiinipromootto-rilla: plasmidin pDM2 muodostaminen

Edellä kuvattu plasmidi pDM1 pilkottiin täydellisesti restrik-tioentsyymeillä Bglll ja BamHI reaktiopuskurissa, jonka kokonaistilavuus oli 100 yl, ja joka sisälsi 20 yg plasmidi-DNA:ta ja ensin 50 yksikköä entsyymiä Bglll, reaktiopuskurin käsittäessä 6,7 mM Tris, pH 7,8; 6,7 mM MgCl2/‘ 6,7 mM

8-merkaptoetanolia, 37 °C;n lämpötilassa 4 tunnin ajan; tämän jälkeen suolapitoisuus nostettiin arvoon 150 mM NaCl, ja pilkkominen suoritettiin loppuun lisäämällä 40 yksikköä entsyymiä BamHI, ja seosta inkuboitiin 37 °C:n lämpötilassa yön yli. Tällöin saatiin kolme kappaletta, suurimman kappaleen ollessa kooltaan 5,1 kb, seuraavan kappaleen 2,97 kb, ja pienimmän kappaleen ollessa kooltaan 1,4 kb. Nämä kappaleet erotettiin preparatiivisella elektroforeesilla käyttäen 0,7 % agaroosigeeliä, josta kappaleet (5,1 kb ja 1,4 kb) eristettiin elektroforeettisesti käyttäen ioninvaihtosuodatinta Whatman DE 81.

DNA poistettiin tältä suodattimelta inkuboimalla sitä runsaasti suolaa sisältävässä puskurissa 4 tuntia 4 °C:n lämpötilassa, ja DNA puhdistettiin uuttamalla fenolin ja kloroformin seoksella ja saostamalla kahdesti etanolilla. DNA suspendoitiin uudestaan 20 mikrolitraan 10 mM Tris-puskuria, pH 7,8. Yhdestä mikrolitrasta määritettiin puhtaus ja siitä arvioitiin DNA-määrä elektroforeettisesti agaroosigee-liä käyttäen.

Suuri (5,1 kb) kappale, joka sisälsi metallotioneiinipro-moottorin Bglll-päässä, ligatoitiin PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen sisältävään pieneen kappaleeseen (1,4 kb), so 95726 joka ei kuitenkaan sisältänyt tämän geenin luonnollista promoottoria tai PreS^-osaa. Suuri kappale sisälsi samoin luonnollisen päättämis-polyadenylaatiosignaalin (hb-PAS-t), joka on välttämätön hepatitis B-viruksen PreS2~S-pro-teiinin koodaavan alueen ilmentämiseksi (katso myös kuva 4) .

Roska suuri kappale sisältää myös bakteeriplasmidin, niin on mahdollista, että tämä kappale ligatoituu itseensä automaattisesti ilman, että pienikokoinen BamHI-kappale sisältyy ligaatio-tuotteeseen. Tästä syystä suuren kappaleen preparaatista, jota oli yhteensä 20 y1, otettiin 10 yl, ja se käsiteltiin alkalisella fosfataasilla lisäämällä tätä entsyymiä 28 yksikköä ja inkuboimalla 37 °C:n lämpötilassa 20 minuuttia. Reaktio pysäytettiin lisäämällä 1 yl 50 mM EGTA, ja inkuboimalla 68 °C:n lämpötilassa 10 minuuttia. DNA puhdistettiin saostamalla kahdesti etanolilla 0,8 M LiCl-liuoksessa.

DNA-kasauma suspendoitiin uudestaan 10 mikrolitraan 10 mM Tris-puskuria, pH 7,8, ja tästä puskurista otettiin 5 yl vertailunäytteeksi, josta määritettiin ligatoiturainen itseensä, ja toinen 5 mikrolitraa sekoitettiin 5 mikrolitraan elektroeluoitua pientä (1,4 kb) BamHI-kappaletta.

Kummankin näytteen ligatoiminen toteutettiin 20 mikrolitran kokonaistilavuudessa, kuten edellä esitettiin. Transfor-mointi HB101-bakteereihin toteutettiin edellä kuvatusti.

Kaksitoista erillistä pesäkettä otettiin ja niitä kasvatettiin 2 millilitran viljelmissä, ja plasmidi-DNA eristettiin tutkijoiden Birnboim ja Doly, mainittu edellä, mukaisesti. Plasmidi-DNA:sta määritettiin pienikokoisen BamHI-kappaleen liittyminen ja suuntautuminen pilkkomalla kaksinkertaisesti restriktioentsyymeillä EcoRI ja Xbal.

Näistä 12 plasmidi-DNA:sta kahdessa tämä pieni (1,4 kb) BamHI-kappale on saatu istutetuksi samalla tavalla suuntautuneena kuin metallotioneiinipromoottori.

li ei 95726 Nämä plasmidi-DNA:t kasvatetaan massaviljelmässä, ja esi-käsitellään eukarioottisiin soluihin siirtämistä varten, joka siirtäminen toteutetaan yhteistransfektiolla.

Vaihtoehtoisesti, metallotioneiinipromoottorin käsittävästä plasmidista pMMT-neo saadulla EcoRI/Bglll-kappaleella (1,9 kb) korvataan plasmidissa pD?11 PreS2~S-proteiinin koo-daavan alueen edessä sijaitseva lyhyt (32 emäsparin) EcoRI-BamHI-kappale, jolloin saadaan plasmidi pDM3, kuten kuvassa 5 esitetään.

E. Kohdissa C ja D saatujen yhdistelmä-DNA-vektoreiden vieminen nisäkässoluihin ja tämän keksinnön mukaisia partikkeleita tuottavien solulinjojen muodostaminen

Yhdistelmäplasmidit pDM1 ja pDM2 transfektoitiin yhdessä hiiren L-soluihin, vero-soluihin (afrikkalainen marakatti), CHO-soluihin ja hiiren 3T3-fibroblasteihin käyttäen tavanomaisia transfektointimenetelmiä (Graham ja van der Eb, Virology, Voi. 52, sivu 456, 1973, edellä) (katso Materiaalit ja menetelmät). Solut, jotka ottavat vastaan plasmidi-DNA: ta ja joissa plasmidi-DNA säilyy, ovat vastustuskykyisiä lääkeaineelle G418, ja ne säilyvät hengissä tätä lääkeainetta sisältävällä selektiivisellä alustalla. Ne solut, jotka eivät ota vastaan DNA:ta, eivät pysy hengissä selektiivisellä alustalla. Nämä solut todetaan erillisinä klooneina viljelymaljän pinnalla. Solut otettiin talteen kloo-naussylinterillä ja niitä kasvatettiin massaviljelmää varten tavanomaiseen tapaan käyttäen tavallista ravintoalustaa, kuten Dulbeccon muunnettua Eagle-alustaa, johon on lisätty täydennykseksi 10 % vasikan seerumia ja 500 yg lääkeainetta G418/ml (katso Materiaalit ja menetelmät). Viidestä saadusta kloonista muodostettiin solulinja, joista käytettiin nimityksiä ENDO-I, -II, -III, -IV ja -v,ja niistä valmistettiin pakastetut varastolinjat (katso Materiaalit ja *. menetelmät). Näiden solulinjojen tuotantonopeus staatti sessa viljelmässä määritettiin radioimmuunikokeella (RIA? 82 95726 katso Materiaalit ja menetelmät) ja sitä verrattiin tunnettujen solulinjojen tuotantonopeuteen. Tämän keksinnön mukaiset solulinjat tuottavat keskimäärin 500 - 1000 ng tämän keksinnön mukaista partikkelia millilitraan viljely-alustaa vuorokaudessa.

F. Tämän keksinnön mukaisia partikkeleita tuottavien solu-linjojen viljeleminen Acusyst-P-laitteessa

Kuudessa pyöritettävässä pullossa DMEM + 10 % FBS-alustassa kasvatettua (katso Materiaalit ja menetelmät), yhteensä q noin 10 solua siirrostettiin kuuteen onttokuituhylsyyn Acusyst-P-viljelyjärjestelmässä (katso Materiaalit ja menetelmät) . Nestettä otettiin talteen noin 600 ml kahdesti viikossa Acusyst-P-järjestelmän kunkin onttokuituhylsyn kapillaarin ulkopuolisesta tilasta, ja säilytettiin 4 °C:n lämpötilassa ennen puhdistamista. Tämän keksinnön mukaisten partikkeleiden pitoisuus määritettiin RIA-menetelmällä (katso Materiaalit ja menetelmät).

G. Tämän keksinnön mukaisten partikkeleiden puhdistaminen Acusyst-P-järjestelmässä käytetystä viljelyalustasta Näiden uusien solulinjojen tuottamat partikkelit, jotka sisältävät PreS^-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen koodaamia proteiineja, puhdistettiin polyetyleeniglykolilla (PEG) saostamalla, geelisuodattamalla ja isopyknisellä ultrasentrifugoinnilla CsCl-gradienteissä (katso jäljempänä esitetty).

1. Fraktiosaostaminen polyetyleeniglykolilla (PEG)

Kapillaarien ulkopuolisessa tilassa oleva alusta otettiin talteen ACUSYST-P-viljelyjärjestelmästä ja yhdistettiin 3000 millilitran suuruiseksi määriksi. Kuhunkin 3000 milli-litran määrään lisättiin 180 g tuotetta PEG 8000 (SIGMA), ja se liuotettiin sekoittamalla huoneen lämpötilassa 20 minuuttia, ja sekoittamista jatkettiin edelleen 3 tuntia li 83 9 5 7 2 6 4 °C:n lämpötilassa. Saostuma otettiin talteen sentrifu-goimalla 500 millilitran pulloissa, GS 3-roottorissa, nopeudella 4500 rpm (3000 x g) 30 minuuttia 10 °C:n lämpötilassa. Supernatantti otettiin talteen, ja siihen lisättiin jälleen 180 g tuotetta PEG 8000, ja liuotettiin huoneen lämpötilassa edellä kuvatusti. Liuosta sekoitettiin edelleen 4 °C:n lämpötilassa 3 tuntia. Saostuma otettiin talteen tästä liuoksesta edellä esitetysti, paitsi että sentrifugointi toteutettiin nopeudella 9000 rpm (15 000 x g) 60 minuuttia. Kasauma suspendoitiin uudestaan 20 milli-litraan fosfaatilla puskuroitua suolaliuosta (PBS).

2. Geelisuodatukseen perustuva kromatografia PEG-saostamisen jälkeen saatu, PBS-puskuriin uudestaan liuotettu materiaali käsiteltiin kromatografisesti geelisuo-dattamalla, käyttäen BioRad A-5m -hartsia, 4 °C:n lämpötilassa. Kolonnin ulottuvuudet olivat 25 x 1000 mm, ja petin tilavuus oli 480 ml. Jaettaessa materiaali tyypillisellä tavalla fraktioihin 1000 yg tämän keksinnön mukaisia PEG-saostettuja partikkeleita 10-15 millilitran tilavuudessa laitetaan kolonniin ja eluoidaan PBS- tai TNE-liuoksella nopeudella 6 pisaraa minuutissa (18 ml/h), ja eluaatista kerätään 3 millilitran fraktioita. Kuvassa 6 nähdään A-5m-kolonnista eluoituneiden, tämän keksinnön mukaisten partik-keleiden profiili, yhtenäinen viiva tarkoittaa kunkin fraktion absorbanssia aallonpituudella 280 nm, ja pisteillä merkitään tämän keksinnön mukaisten partikkeleiden määrää kussakin fraktiossa, RIA-määrityksen perusteella laskettuna.

3. Isopykninen sentrifugointi CsCl-liuoksessa Geelisuodatuksena toteutetussa pylväskromatografiässä tuloksena olevan ensimmäisen piikin (katso kuva 6) kattavat, noin 30 fraktiota, jotka sisältävät tämän keksinnön mukaisia, osittain puhdistettuja partikkeleita, yhdistettiin (suurin piirtein 100 ml). Tämän liuoksen tiheys saatettiin arvoon 1,30 g/cm yhdisteellä CsCl, jonka jälkeen se siir- 84 95726 rettiin nitroselluloosaputkiin, jotka sopivat SW 27- tai SW 28-roottoriin (Beckman). Gradientit saatiin aikaan laittamalla putken pohjalle 4 ml CsCl-liuosta, jonka tiheys 3 on 1,35 g/cm , ja pinnalle 4 ml CsCl-liuosta, jonka tiheys 3 on 1,25 g/cm sekä 4 ml liuosta, jonka tiheys on 1,20 3 g/cm . Gradientteja sentrifugoitiin nopeudella 28 000 rpm 50 tuntia 10 °C:n lämpötilassa, jaettiin fraktioihin ja puhdistunut antigeeni saatiin talteen tiheydeltään 1,20 g/cm olevasta kerroksesta, gradientin pinnalta. Tämän keksinnön mukaiset partikkelit erottuivat hyvin pienestä määrästä kontaminoivia proteiineja, jotka muodostivat vyöhykkeen gradientin keskelle (katso kuva 7). Liuoksesta poistettiin suolat dialysoimalla 24 tunnin ajan kolmea suolaliuoserää vastaan.

Laadun varmistamiseksi osa tästä gradientin avulla puhdistetusta materiaalista sentrifugoitiin lineaarista CsCl-gra-dienttia käyttäen. Tällöin odotusten mukaisesti tämän keksinnön mukaiset partikkelit muodostivat yhden piikin tiheyteen 1,2 g/cm^.

H. Solulinjojen tuottamien, tämän keksinnön mukaisten partikkeleiden tunnusomaiset piirteet Tämän keksinnön mukaisten partikkeleiden sisältämien polypeptidien puhtaus ja fysikaaliset ominaisuudet eri preparaateissa määritetään tavanomaisilla laboratorio-menetelmillä, kuten radioimmuunikokeella, immuunisaostuksella ja SDS-PAGE-määrityksellä (katso Materiaalit ja menetelmät).

I. Puhtauden määrittäminen a. Kontaminoivien plasmaproteiinien pitoisuuden määrittäminen

Eri seerumiproteiinien pitoisuudet tämän keksinnön mukaisten puhdistettujen partikkeleiden preparaateissa määritetään tavallisella RIA-tekniikalla käyttäen spesifisiä vasta- I! 85 95726 aineita naudan seerumin albumiinia, IgArta, IgG:tä, IgM:ää jne vastaan. Taulukossa 2 esitetyistä tuloksista nähdään, ettei immunoglobuliineilla kontaminoitumista voitu todeta, ja albumiinilla kontaminoituminen oli vain vähäistä.

Taulukko 2

Kontaminoivien plasmaproteiinien määrittäminen RIA-menetelmällä

Proteiini %-osuus kaikista proteiineista

Albumiini 0,05

IgG 0,2

IgA 0,2

IgM 0,2 b. Kontaminoivien isäntäsoluista peräisin olevien tai PreS^-PreS2~S-nukleiinihappojetjujen pitoisuuksien määrittäminen tämän keksinnön mukaisten partikkeleiden puhdistetuista preparaateista piste-täplä -menetelmällä Tämän keksinnön mukaisilla puhdistetuilla partikkeleilla toteutetaan piste-täplä -hybridisaatio (dot-blot) kontaminoivien PreS-j-PreS2-S -DNA-ketjujen tai isännän kromoso-maalisten DNA-ketjujen ilmaisemiseksi. Kutakin läiskää varten 100 nanogramman suuruista määrää keksinnön mukaisia puhdistettuja partikkeleita kuumennettiin 68 °C:n lämpötilassa 10 minuuttia 40 mikrolitrassa 0,25 N NaOH-liuos-ta. Positiivisena vertailuna 20 pg tämän keksinnön mukaisen yhdistelmäplasmidin pDM1 DNA:ta 40 mikrolitrassa 0,25 N • NaOH-liuosta käsitellään samalla tavalla. Välittömästi

NaOH-liuoksessa denaturoinnin jälkeen liuos täplitetään nitroselluloosasuodattimelle. Seuraavassa esitetty suodattimien käsitteleminen ja hybridisaatiotoimenpiteet ovat analogiset Southernin täplitysmenetelmässä käytettävien 32 toimenpiteiden kanssa, paitsi että P-merkitty koetin ·* on tämän keksinnön mukaisen kromosomaalisen DNA:n ja plas- midi-DNA:n 50:50 seos, tämän plasmidi-DNA:n sisältäessä 86 95726

PreS^-PreS2-S -proteiinin koodaavan alueen. Odotusten mukaisesti hybridisoiva koetin tuottaa voimakkaan signaalin tämän keksinnön mukaisen yhdistelmäplasmidin DNA:n kanssa, mutta ainoastaan heikon taustasignaalin puhdistetun par-tikkelipreparaatin kanssa. Tämä hybridisaatiokuvio osoittaa, ettei näytteessä ole läsnä PreS1-PreS2~S-DNA:ta tai kromo-somaalista DNA:ta.

2. Immunosaostaminen ja SDS-polyakryyliamidigeelillä toteutettu analyysi Tämän keksinnön mukaisten transfektanttien tuottamien PreS-j -PreS2~S-polypeptidien osuuksien määrittämiseksi näiden transfektanttien tuottamat proteiinit merkitään biosynteet-tisesti, immunosaostetaan ja analysoidaan SDS-PAGE-geeleil-lä (katso Materiaalit ja menetelmät). Luonnollisesta lähteestä saatua HBV-virusta vastaan vaikuttavilla vasta-aineilla viljelyalustasta immunosaostamalla eristettyjen proteiinien elektroforeettinen kuvio tehtiin näkyväksi hopealla värjäämällä. Kaksi pääasiallista proteiinia vastaa kooltaan S-proteiinin koodaavan alueen koodaamaa glykosyloimatonta ja glykosyloitunutta polypeptidiä (24 kd ja 27 kd, vastaavasti). Kaksi vähäisempää proteiinia, 33 kd ja 36 kd, vastaa kooltaan PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen koodaamaa kahta polypeptidiä. Tämä menetelmä ei ole niin herkkä, että sillä voitaisiin ilmaista PreS^-PreS2~S -polypeptidejä sisältävien polypeptidien pieniä määriä, mutta koko PreS^-PreS2~S-proteiinin koodaavan alueen koodaamien proteiinien läsnäolo voitiin ilmaista . Westernin immunotäplämenetelmällä (katso jäljempänä).

Heikot vyöhykkeet geelin huipulla johtuvat kasautuneesta proteiinista, ja ne ovat nähtävissä myös luonnollisista lähteistä saatujen HBV-partikkeleiden tapauksessa. Näin ollen, PreS^-PreS2-S-proteiinin koodaavalla alueella trans-fektoidut solut erittävät proteiineja, jotka eivät ainoas-,.· taan reagoi luonnollista tuotetta vastaan vaikuttavien vasta-aineiden kanssa, vaan jotka ovat myös samanlaisia „ 95726 kokonsa suhteen. Sellaisten proteiinien, jotka ovat kooltaan samanlaisia hepatitis B-viruksesta peräisin olevien, luonnollisten, glykosyloituneiden PreS-j -PreS2~S-, PreS2~S-ja S-polypeptidien kanssa, läsnäolon perusteella voidaan olettaa, että glykosylaatioreitit toimivat normaalisti näissä soluissa.

3. Immunotäplitys (Western)

Westernin immunotäplitystoimenpiteellä varmistettiin, että kukin hopealla värjätyssä SDS-PAGE -geelijärjestelmässä esiintyvä erilainen polypeptidi reagoi spesifisen anti-HBV-vasta-aineen kanssa. SDS-PAGE -geelillä erottuneet proteiinit siirrettiin nitroselluloosasuodattimelle (Schleicher & Schull) sähkötäplityksellä (BioRad) 4 °C:n lämpötilassa,

100 V, 3 tunnin ajan. Siirtämisen jälkeen suodatin kyllästetään proteiineilla peroksidaasilla merkityn vasta-aineen epäspesifisen sitoutumisen välttämiseksi. Tätä varten suodatinta inkuboidaan 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa PBS-liuoksessa, joka käsittää 20 % vastasyntyneen vasikan seerumia, ja keksinnön mukaisten partikkeleiden käsittämät polypeptidit tehtiin näkyviksi peroksidaasiin konjugoiduilla HBV-spesifisillä vasta-aineilla. Suodatin laitetaan para-filmin päälle ja peitetään konjugoitujen vasta-aineiden liuoksella 3 tunniksi huoneen lämpötilassa kosteassa kammiossa. Suodatin pestään kuuteen kertaan liuoksella, joka käsittää 0,5 % Tween, 10 mM Tris ja 5 mM CaCl, jonka jälkeen se peitetään kromogeenillä, POD (o-fenyylidiamiini-dihydrokloridi) vetyperoksidissa (0,3 g/1), sitraatti-• fosfaatti-puskurissa. Pysäytysliuoksena käytetään 0,5 N

rikkihappoa. Kaikkia kuutta virusperäistä polypeptidiä vastaavat proteiinivyöhykkeet saadaan näkyviin, eli läsnä on kaikkia PreS^-PreS2~S-proteiinin koodaavan alueen koodaamia proteiineja.

88 95726 4. Aminohappokoostumus tämän keksinnön mukaisten partikke-leiden käsittämissä puhdistetuissa proteiineissa, joita PreS^-PreS2-S-proteiinin koodaava alue koodaa

Hapolla hydrolysoimisen jälkeen aminohappokoostumus PreS^-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen koodaamista puhdistetuissa proteiineissa määritetään ja sitä verrataan poly-peptidikoostumukseen, joka on saatu laskemalla S-proteiinin koodaavan alueen, PreS2~S-proteiinin koodaavan alueen^nuk-leotidiketjusta. Taulukossa 3 esitetyt tulokset vastaavat hyvin DNA-ketjuista ennustettuja arvoja sekä jo julkaistuja tuloksia (Shiraishi et al·., J. Gen. Virol., Voi. 48, sivu 31, 1980). Erityisesti näiden polypeptidien tunnusomaisena piirteenä on seriinin, proliinin ja leusiinin suhteellisen suuret prosenttiset osuudet.

Taulukko 3

Aminohappokoostumus tämän keksinnön mukaisissa puhdistetuissa partikkeleissa Jäännöksen prosenttinen osuus

Odotettu

Aminohapot* Määritetty S . PreS2~S PreS^-PreS2~S

ASN + ASP 5,5 4,2 5,2 7,3 THR 7,5 8,0 7,9 7,8 SER 12,5 11,3 12,0 10,8 GLU + GLU 7,5 4,2 4,5 5,1 PRO 12,5 10,8 10,5 12,6 GLY 8,6 6,6 7,1 8,3 ALA 5,0 2,8 4,5 5,4 VAL 4,2 5,2 5,2 4,8 CYS 3,2 6,6 5,2 3,8 MET 1,9 2,3 2,2 1,9 ILE 4,9 7,5 7,5 6,7 LEU 12,8 15,5 13,9 12,1 TYR 2,0 2,8 2,6 1,9 PHE 5,6 7,5 6,0 5,4 LYS 2,1 1,9 1,5 1,3 HIS 0,9 0,5 1,1 1,9 AEG 2,1 .2,4 3,0 ...3,0 98,8% 100,1% 99,9% 100,1% f *Tryptofaani menetetään hapolla hydrolysoitaessa 89 95726 I. Tämän keksinnön mukaisten, puhdistettujen hepatitis B-partikkeleiden tarkastelu elektronimikroskooppisesti

Elektronimikroskooppisesti todettiin, että tämän keksinnön mukaiset puhdistetut partikkelit ovat pallomaisia 22 nano-metrin partikkeleita, jotka ovat samankaltaisia kuin ne partikkelit, joita tyypillisesti muodostuu hepatitis B-vi-ruksen S-proteiinin polypeptidien kasaantuessa.

J. Tämän keksinnön mukaisten puhdistettujen partikkeleiden apuaineen valmistaminen ja stabiilisuuden testaaminen Tämän keksinnön mukaisessa rokotteessa käytettävän apuaineen valmistamiseksi 1/10 000 tilavuutta Thimerosolia ja 1/10 tilavuutta suodattamalla steriloitua, 0,2 M Ai 12 H.20-liuosta lisätään steriiliin suolaliuokseen, joka sisältää antigeeniä toivottuna pitoisuutena. pH asetetaan arvoon 5,0 steriilillä 1 N NaOH-liuoksella ja suspensiota sekoitetaan huoneen lämpötilassa 3 tuntia. Alunalla saos-tettu antigeeni otetaan talteen sentrifugoimalla 10 minuuttia nopeudella 2000 rpm, jonka jälkeen se suspendoidaan uudestaan steriiliin normaaliin suolaliuokseen, joka sisältää 1:10 000 Thimerosolia, ja jaetaan osiin steriileissä olosuhteissa.

Tämän keksinnön mukaisten, alunaan absorboitujen partikkeleiden stabiilisuuden määrittämiseksi antigeeni otetaan talteen liuottamalla aluna uudestaan 3 % natriumsitraattiin, jonka jälkeen sitä dialysoidaan peräkkäin 3 % natriumsit-raattia ja PBS-liuosta vastaan. Tämän keksinnön mukaisten partikkeleiden määrä määritettiin sitten yhdensuuntaisella (parallel-line) radioimmuunikokeella puhdistetun standardin laimennoksia vastaan, jotka laimennokset oli tehty 50 % vastasyntyneen vasikan seerumia sisältävään PBS-liu-okseen. Stabiilisuuskokeissa saadut tulokset (taulukko 4) osoittavat, että puhdistetut partikkelit (joko sellaisenaan tai alunaan absorboituina) ovat stabiileja 2-8 °C:n lämpötilassa vähintään 7 kuukautta.

90 95726

Taulukko 4 Stabiilisuuskokeet SDS-PAGE:

Tulokset vyöhykkeiden muodostumisesta Säilytys Näyte sellaisenaan Alunaan absorboitu kuukausina näyte _J_2_ _J_2_

Aloitus normaali normaali normaali normaali

-j M II II II

2 tl H 11 H

2 M II 11 II

^ tl II II II

2 I» tl tl II

g II II II II

-j II II II II

Kvantitatiivinen määritys RIA-menetelmällä

Prosenttia (%) aktiivisuudesta_ Säilytys Näyte sellaisenaan Alunaan absorboitu kuukausina näyte _ 1_2_ 1_2_

Aloitus 101 101 1 101 101 100 100 2 99 99 99 100 3 100 100 99 101 4 99 100 101 99 5 102 99 99 98 6 100 101 100 100 7 99 98 98 101 11 91 95726 K. Tämän keksinnön mukaisten partikkeleiden serokonversio ja ED5q-arvo

Serokonversiokokeet suoritetaan viidellä ryhmällä, jotka muodostuvat kymmenestä täysikasvuisesta valkoisesta hiirestä (kuvat 8A, 8B ja 8C). Naaraspuolisten sveitsinhiirien Gm 1CR-kantaan injektoidaan ihonalaisesti 1 ml tämän keksinnön mukaisia partikkeleita sisältävää, apuaineena alunaa käyttävää rokotetta seuraavina laimennoksina: 1/1 (5,0 yg), 1/4 (1,3 yg) , 1/16 (0,31 yg) , 1/64 (0,16 yg) ja 1 /256 (0,078 yg). Hiirien veri otetaan talteen 28 vuorokauden kuluttua, ja vasta-ainetiitteri kvantitoidaan AUSAB-kokeella käyttäen vertailuna HBIG-standardia. Kustakin eläimestä saatu seeruminäyte laimennettiin sarjana nelinkertaisesti ja testattiin kolminkertaisesti.

Niiden hiirien, joiden serotyyppi oli positiivinen, prosenttinen osuus väheni tämän keksinnön mukaisten partikkeleiden laimennoksen suurentuessa. Se annos, jolla 50 prosenttiin eläimistä saatiin aikaan seropositiivinen reaktio (ED^q) t on noin 0,05-0,25 yg tämän keksinnön mukaisia partikkeleita sisältävää rokotetta. Yleisesti ottaen tämän keksinnön mukaisella rokotteella saatuja serokonversion tuloksia ei voida erottaa luonnollisesta lähteestä saadulla rokotteella saaduista tuloksista.

Esimerkki 2

PreS^-PreS2~S-proteiinin koodaavan alueen koodaamia poly-peptidejä käsittävien partikkeleiden ilmentäminen . A. Yhdistelmäplasmidin pENDO-1 valmistus

Yhdistelmäplasmideista pBglII2.8, pBR322.Sg2 (plasmidi, joka on valmistettu alikloonamalla plasmidin pBR322 EcoRI-kohtaan 7 kiloemäsparin suuruinen EcoRI 8G2-kappale plasmi-dista pMB9.BG2, kuvattu julkaisussa Tilghman, S.M. et ai., Proceeding Natl. Acad. Sei., Voi. 75, sivu 725, 1978, pDM2, POLINK 23456 (katso jäljempänä) sekä plasmidista pMMT-neo 92 95726 saatuja geenikappaleita käytetään vektorimuodosteiden valmistusvaiheissa pyrittäessä saamaan aikaan sellaisia yhdistelemällä saatuja ilmentämisvektoreita, joissa ei ole lainkaan muita kuin HPV-peräisiä virusgenomin osia.

Kuvista 9A ja 9B nähdään, että plasmidi pBglII2.8 sisältää PreS-j-PreS2~S-proteiinin koodaavan alueen sisältävän geeni-kappaleen (1,34 kiloemäsparin suuruisen BstEII-Hpal-kappale), ja se käsittää luonnollisen voimakkaan promoottorin PreS2- S-proteiinin koodaavan alueen kopioitumista varten, mutta siitä puuttuu luonnollinen (heikko) promoottori PreS^ PreS2~S-proteiinin koodaavan alueen kopioitumista varten, sekä kopioitumisen päättävät toiminnot ja polyadenylaation signaali. Plasmidi pBglII2.8 pilkottiin entsyymeillä BstEII ja Hpal, jolloin saatiin kaksi DNA-kappaletta. Kappaleet erotettiin elektroforeettisesti 3,5 % polyakryyliamidigeelillä, jonka jälkeen toinen niistä (1,34 kb), joka sisältää PreS^-PreS2~S-proteiinin koodaavan alueen, puhdistettiin ja säilytettiin. Hpal-pää on tylppä. BstEII-pää tehtiin tylpäksi täyttämällä (tekemällä kaksijuosteiseksi) käyttäen DNA-poly-meraasia I (Klenow-kappale) ja neljää dNTP-molekyyliä, sekä tavanomaisia tekniikoita, jolloin saatiin DNA-kappale, jossa on kaksi tylppää päätä.

Polykytkijäplasmidia POLINK 23456, jossa polykytkijäalue sisältää lukuisia restriktiokohtia (jäljempänä), käytettiin.

Xbal Bell Hpal Clal HindlXI Kani BamHI Sohi Sacl Sali

GAATTCTAGATCTGATCAGTTAACATCCATAAGCTTGGTACCGGATCCCGGGCATGCGAGCTCGAGTCGAC

EcoRI Belli Smal XhoI

Xnval Aval

Aval

Polykytkijän sovitin (adapter) sijaitsee plasmidin pBR328 EcoRI-Sall-rajoitteisessa runkokappaleessa (3,1 kb).

93 95726 POLINK 23456 pilkotaan entsyymillä Hpal plasmidin tekemiseksi lineaariseksi. Tällaisessa Hpal-entsyymillä lineaariseksi tehdyssä plasmidissa on kaksi tylppää päätä. Tämän jälkeen lineaarinen plasmidi ligatoidaan tylpistä päistään PreS-j-PreS2~S-proteiinin koodaavan alueen sisältävän, plas-midista pBglII2.8 (edellä) saadun, 1,34 kiloemäsparin suuruisen DNA-kappaleen kanssa. Koska 1,34 kiloemäsparin kappale voidaan sisällyttää polykytkijäplasmidiin kummallakin mahdollisella tavalla suuntautuneena, niin oikea suuntautuminen (myötäpäivään luonnollisen kopioitumissuunnan suhteen) varmistetaan pilkkomalla entsyymillä EcoRI, mitä seuraa koon analysointi 1 % agaroosigeeleillä. Kun plasmidi, joka käsittää PreS^-PreS2~S-proteiinin koodaavan alueen oikealla tavalla suuntautuneena, pilkotaan entsyymillä EcoRI, niin tällöin saadaan kaksi 0,4 ja 4,1 kiloemäsparin suuruista kappaletta; väärä suuntautuminen johtaa kahden 1,0 ja 3,5 kiloemäsparin suuruisen kappaleen muodostumiseen. Tämän jälkeen PreS-j-PreS2~S-proteiinin koodaavan alueen sisältävä uusi plasmidi pilkotaan entsyymillä Hpal ja pilkotaan "osittain" entsyymillä BamHI. Restriktiokohtien Hpal ja BamHI välinen lyhyt (24 emäsparia) ketju erotetaan "osittaisesta" Hpal-BamHI-rungosta (5,0 kb), ja heitetään pois täydellisen pilkkomisen seurauksena reaktioseoksessa olevien kappaleiden kanssa.

Plasmidi pBR322.8G2 pilkotaan entsyymeillä Ball (tylppä pää) ja Bglll ("tarttuva" pää), jolloin saadaan hiiren globiinigeenistä peräisin olevan polyadenylaation päättä-misketjun mg-PAS-t sisältävä geeniketju (1,6 kb). Tämän jälkeen mg-PAS-t-ketju ligatoidaan avattuun, entsyymeillä Hpal-BamHI lineaariseksi tehtyyn plasmidiin, kuvattu edellä, suunnissa Ball-Hpal ja Bglll-BamHI ("tarttuvat" Bglll-ja BamHI-päät ovat identtiset ja näin ollen yhteen sopivat, ja ne voidaan ligatoida toisiinsa), jolloin saadaan uusi välivaiheena toimiva yhdistelmäplasmidi (6,0 kb), joka * sisältää sekä PreS^-PreS2~S-proteiinin koodaavan alueen 94 95726 että mg-PAS-t-ketjun oikealla tavalla suuntautuneina ja oikeassa järjestyksessä. Tämän jälkeen PreS^-PreS2_S-proteiinin koodaavan alueen ja mg-PAS-t-ketjun sisältävä plasmidi pilkotaan entsyymeillä Bglll ja Sali, jolloin plasmidi katkeaa kahdeksi DNA-kappaleeksi (2,95 kb ja 3,05 kb), mikä todetaan elektroforeettisesti 1 % agaroosi-geelillä. 3,05 kiloemäsparin suuruinen kappale pilkotaan entsyymillä PvuI , jolloin saadaan kaksi pienempää kappaletta (1,08 kb ja 1,98 kb), jonka jälkeen jäljellä oleva 2,95 kiloemäsparin suuruinen BglII-SalI-rajoitteinen DNA-kappale (joka ei sisällä Pvul-kohtaa), joka sisältää siihen yhteen sulautettuna PreS^-PreS2~S-proteiinin koodaavan alueen ja mg-PAS-t-ketjun, puhdistetaan ja säilytetään.

Sitten plasmidi pMMT-neo, joka muodostettiin ligatoimalla osan A esimerkistä 1 saatu 6,65 kiloemäsparin kappale (katso kuva 9), pilkotaan entsyymeillä Bglll ja Sali, mikä johtaa kahteen DNA-kappaleeseen (4,23 kb ja 2,42 kb). Neo-mysiiniin perustuvan valikoinnin merkitsimen ja SV40-viruk-sen PAS-t-ketjun sisältävä, 2,42 kiloemäsparin suuruinen kappale heitetään pois. Jäljelle jäävä 4,23 kiloemäsparin kappale puhdistetaan elektroforeettisesti käyttäen 0,8 % agaroosigeeliä, jonka jälkeen se ligatoidaan edellä saatuun 2,95 kiloemäsparin suuruiseen PreS^-PreSj-S-proteii-nin koodaavan alueen ja mg-PAS-t-ketjun sisältävään, Bglll-Sall-rajoitteiseen DNA-kappaleeseen, jolloin saadaan 7,15 kiloemäsparin suuruinen yhdistelmäplasmidi, joka sisältää MMT-promoottorin, PreS^-PreS2~S-proteiinin koodaavan alueen ja polyadenylaation ja päättymisen mg-PAS-t-ketjun, tässä järjestyksessä, ja tästä plasmidista käytetään nimitystä pENDO-1. Plasmidi pENDO-1 ei sisällä muun kuin HBV-viruksen virusgenomin osia (katso kuva 9).

B. Yhdistelmäplasmidin pENDO-2 valmistaminen

Kuten kuvasta 10 nähdään, plasmidi pDM2, joka käsittää MMT-promoottorin, PreS2**S-proteiinin koodaavan alueen ja proteiinin X koodaavan alueen, pilkotaan resktriktio-

II

95 95726 entsyymeillä Spel ja Sali. Spei-restriktiokohta sijaitsee PreS2~S-proteiinin koodaavan alueen S-proteiinin alueessa, ja se on ainut Spel-kohta plasmidissa pDM2, Sali-kohdan tavoin, joka sijaitsee myöhemmin geenissä. Näitä kahta entsyymiä käyttäen plasmidi katkaistaan kahdeksi DNA-kap-paleeksi (1,58 ja 4,88 kb), ja PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen karboksipään ja proteiinin X koodaavan alueen sisältävä 1,58 kiloemäsparin kappale heitetään pois, kun taas 4,88 kiloemäsparin kappale puhdistetaan ja säilytetään.

Plasmidi pENDO-1 pilkotaan samoin entsyymeillä Spel ja Sali, jolloin plasmidi katkeaa kahdeksi DNA-kappaleeksi, jotka ovat kooltaan 1,9 ja 5,25 kb. 1,9 kiloemäsparin suuruinen kappale, joka sisältää PreS2-S-proteiinin koodaavasta alueesta S-proteiinin alueen karboksipään, sekä mg-PAS-t-alueen, puhdistetaan ja säilytetään.

Tämän jälkeen kaksi säilytettyä DNA-kappaletta (1,9 kb ja 4,88 kb) ligatoidaan uuden yhdistelmäplasmidin (6,8 kb), pENDO-2, muodostamiseksi, joka pENDO-2 sisältää MMT-pro-moottorin, PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen ja mg-PAS-t-ketjun. Plasmidi pENDO-2 ei sisällä muun kuin HBV-virus~ genomin osia (katso kuva 10) .

C. Yhdistelmäplasmidin pENDO-O valmistaminen

Neomysiiniin perustuva valikoinnin merkitsimen sisältämä kolmas uusi plasmidi, josta käytetään nimitystä pENDO-0 (katso kuva 11), muodostetaan pilkkomalla pMMT-neo, joka on muodostettu osan A esimerkissä 1 saadun 6,65 kiloemäsparin suuruisen kappaleen ligaatiolla (katso kuva 11), rekstriktioentsyymeillä Smal (tylppä pää) ja BamHI. Plasmidi katkeaa kahdeksi DNA-kappaleeksi (5,5 kb ja 1,15 kb). Plasmidin pMMT-neo rungosta peräisin oleva, 5,5 kiloemäsparin suuruinen, MMT-promoottorin ja neomysiiniin perustuvan valikoinnin merkitsimen sisältävä kappale säilytetään. Tämän jälkeen viimeksi mainittu kappale ligatoidaan 1,6 95726 96 kiloemäsparin suuruiseen DNA-kappaleeseen, joka sisältää BalI-BglII-rajoitteisen mg-PAS-t-ketjun, kuten plasmidin pENDO-1 muodostamisen yhteydessä esitetään. Nyt tuloksena oleva 7,2 kiloemäsparin yhdistelmäplasmidi pENDO-0 sisältää MMT-promoottorin, neomysiiniin perustuvan valikoinnin merkitsimen ja mg-PAS-t-ketjun, eikä lainkaan virusperäisiä DNA-ketjuja (katso kuva 11).

D. Plasmidivektoreiden pENDO-0, pENDO-1 ja pENDO-2 vieminen nisäkässoluihin yhteistransfektiolla

Yhdistämällä saadut plasmidivektorit pENDO-Ο, pENDO-1 ja pENDO-2 yhteistransfektoidaan nisäkässoluihin, kuten hiiren L-soluihin, Vero-soluihin (afrikkalainen marakatti), CHO-soluihin ja hiiren 3T3-fibro blasteihin käyttäen yhteistrans-fektoimiseen tavanomaisesti soveltuvia toimenpiteitä. Lääkeaineelle G418 vastustuskykyiset transfektantit eristetään ja seulotaan tämän keksinnön mukaisten partikkeleiden tuotannon suhteen käyttäen RIA-menetelmää.

E. Plasmidien pENDO-0, pENDO-1 ja pENDO-2 DNA:sta muodostuvien sekakonkatameerien valmistaminen ja transfektoiminen soluiinjoihin

Kukin plasmideista pENDO-1, pENDO-2 ja pENDO-0 sisältää ainutlaatuisen restriktiokohdan PvuI, joka sijaitsee Amp-geenissä, vastapäivään EcoRI-restriktiokohdasta (katso kuvat 9, 10 ja 11). Kukin näistä plasmideista pilkotaan erikseen entsyymillä PvuI niiden tekemiseksi lineaariseksi. Tämän jälkeen nämä plasmidit polymeroidaan sekakonkatameerien muodostamiseksi, joissa sekakonkatameereissä eri plas-mideja on läsnä eri suhteissa. Esimerkiksi, kun lineaariseksi tehtyjä plasmideja pENDO-1 ja pENDO-Ο polymeroidaan käyttäen ligaasia, kuten T4 DNA-ligaasia, niin tällöin voi muodostua sekakonkatameerejä, joissa plasmidien välinen suhde pENDO-1; pENDO-Ο on 10:1, mikäli komponentteina käytettävien, line- it 97 95726 aariseksi tehtyjä plasmideja käytetään suhteessa pENDO-1: pENDO-O 10:1. Tuloksena oleva, plasmideista pENDO-1 ja pENDO-O muodostunut sekakonkatameeri transfektoidaan eukarioottiseen soluun, kuten nisäkässoluun, ja solut valikoidaan lääkeaineen G418 vastustuskyvyn perusteella. Oletetaan, että keskimäärin jokainen lääkeaineelle G418 vastustuskykyinen (transfektoitunut) solu sisältää noin kymmenen kopiota PreS^-PreS2~S-proteiinin koodaavasta alueesta neo-geenin yhtä kopiota kohden.

Samoin pENDO-O -kappale polymeroidaan pENDO-2 -kappaleen kanssa ligaasilla, kuten T4 DNA-ligaasilla plasmidien suhteen pENDO-2:pENDO-0 ollessa 10:1, esimerkiksi, jolloin saadaan plasmideja pENDO-2 ja pENDO-O sisältäviä seka-konkatameerejä.Tämän jälkeen tämä konkatameeri transfektoidaan eukarioottiseen soluun, kuten nisäkässoluun. Sitten solut valikoidaan G418-vastustuskyvyn perusteella, ja G418-vastustuskykyinen (transfektoitunut) solu sisältää keskimäärin plasmidin pENDO-2 kymmenen kopiota pENDO-O:aa kohden, tässä esimerkissä.

Samoin plasmidit pENDO-1, pENDO-2 ja pENDO-O polymeroidaan · ligaasilla, kuten T4 DNA-ligaasilla, sekakonkatameerin muodostamiseksi, jossa konkatameerissä suhde pENDO-1:pENDO-2: pENDO-O on esimerkiksi 10:10:1. Tuloksena oleva sekakonkatameeri transfektoidaan eukarioottiseen soluun, esimerkiksi nisäkässoluun, ja solut valikoidaan G418-vastustuskyvyn • perusteella. Vastustuskykyisten (transfektoituneiden) so lujen tulisi sisältää keskimäärin kymmenen kopiota plasmi-dista pENDO-1, kymmenen kopiota plasmidista pENDO-2 ja yhden kopion plasmidista pENDO-O.

Kunkin tuloksena olevan, lääkeaineelle vastustuskykyisen . solun tulisi tuottaa suurempina saantoina PreS^-PreS2“S-pro- teiinin koodaavan alueen koodaamia proteiineja sisältäviä partikkeleita.

98 95726

Replikoitumattomien, hiiren metallotioneiinipromoottorin käsittävien vektorien käyttäminen muiden proteiinien ilmentämiseen transfektoiduissa, eukarioottisissa isäntä-soluissa .

Tämä keksintö käsittää samoin yhdistelmä-DNA-tekniikalla saadut siirtovektorit, joissa käytetään mitä tahansa toiminnallista DNA-ketjua ihmisen tai rotan kasvuhormonin tuottamiseksi transfektoiduissa, eukarioottisissa isäntäsoluissa.

Käsitteellä toiminnallinen DNA-ketju tarkoitetaan mistä tahansa lähteestä suoraan tai epäsuoraan saatua erillistä DNA-aluetta, joka toimii tämän keksinnön mukaisella vektorilla transfektoidussa eukarioottisessa isäntäsolussa täydellisenä ilmentyvänä geeniyksikkönä, rakenteellisena geeninä, promoottorina tai säätelevänä alueena.

Täydellisellä ilmentyvällä geeniyksiköllä tarkoitetaan rakenteellista geeniä, promoottoria ja sääteleviä alueita, jotka ovat edellytyksenä sen kopioitumiseen ja luentaan.

Promoottorilla tarkoitetaan mitä tahansa rakenteellisen geenin suhteen ylävirran puolella sijaitsevaa aluetta, joka mahdollistaa RNA-polymeraasin sitoutumisen ja kopi-oitumisen tapahtumisen.

Säätelevällä alueella tarkoitetaan mitä tahansa aluetta, joka säätelee rakenteellisen geenin kopioitumisnopeutta.

Rakenteellisella geenillä tarkoitetaan koodaavaa ketjua, joka toimii mallina lähetti-RNA:n synteesissä.

Edullisia rakenteellisia geenejä ovat esimerkiksi farmaseuttisesti mielenkiintoisia polypeptidejä koodaavat ra-’ kenteelliset geenit ja näistä polypeptideistä mainittakoon virusantigeeni, insuliini, interferoni, lymfokiinit, rotan 99 95726 tai ihmisen kasvuhormonit, kudoksen plasminogeeniaktivaat-tori, alfa-l-antitrypsiini ja muut vastaavat. Edullisin on rotan tai ihmisen kasvuhormoni.

Tämä keksintö kohdistuu yhdistelmä-DNA-vektoriin, joka käsittää toiminnallisen DNA-ketjun ja MMT-promoottorin. MMT-promoottori voidaan sisällyttää DNA-vektoriin joko tämän DNA-ketjun luonnollisen promoottorin lisäksi tai luonnollisen promoottorin tilalle. MMT-promoottori sijaitsee mieluiten DNA-vektorissa välittömästi ylävirran puolella DNA-ketjun proteiinia koodaavasta alueesta. Tällainen vektori käsittää mielellään myös kopioitumisen päätty-misketjun ja valikoinnin merkitsimen. Tällainen merkitsin on mielellään lääkeaineen vastustuskykyyn perustuva merkitsin, kuten neomysiinigeeni. Tällainen kopioitumisen päättymisketju on mielellään SV40-päättymiskohta (sv-PAS-t) tai mieluummin hiiren globiinigeenin DEF-alue (mg-PAS-t). Tällainen vektori voidaan valmistaa tavanomaisilla yh-distelmä-DNA-tekniikoilla ja muilla molekyylibiologian menetelmillä. Edullisimmassa tapauksessa, mg-PAS-t-aluetta käyttäen vektori ei sisällä lainkaan virusperäisiä DNA-kappaleita, ja se ei ole onkogeeninen, eli se ei transformoi (tee syöpää muodostavaksi) isäntäsolua, johon se on istutettu. Kun tällainen vektori transfektoidaan isäntään, se yhtenäistyy isännän kromosomiin ja replikoituu passiivisesti isäntägenomin kanssa, mikäli vektori ei sisällä autonomista replikaatioketjua (replikonia) , joka kykenee toimimaan vektorilla transfektoidussa isännässä.

Tämän keksinnön mukaisen yhdistelmä-DNA-vektorin tulisi mielellään käsittää seuraavat tunnusomaiset piirteet: 1) mielenkiinnon kohteena oleva DNA-ketju; 2) MMT-promoottori, joka sijaitsee välittömästi ylävirran puolella mielenkiinnon kohteena olevasta DNA-ket- • justa; 3) vektorin tulisi kyetä replikoitumaan bakteereissa tai muussa prokarioottisessa isännässä, johon se on trans 100 .

95726 formoitu, kasvua ja monistumista varten, yhdistelmävekto-rin suurten määrien tuottamiseksi. Täten tällaisen vektorin tulisi käsittää bakteeriperäinen tai muu prokariootti-nen replikoni, eli sellainen DNA-kappale, joka käsittää ne kaikki toiminnot, jotka ovat välttämättömiä vektorin autonomiseen replikoitumiseen ja sen säilymiseen kromosomien ulkopuolella prokarioottisessa isäntäsolussa, esimerkiksi isäntänä toimivassa bakteerisolussa, joka on transformoitu tällä vektorilla. Tällaiset replikonit ovat alalla hyvin tunnettuja.

4) Vektorireplikonin tulisi olla pieni (eli mielellään pienempi kuin 6-8 kiloemäsparia), jotta sen geneettinen ja molekyylibiologinen manipulointi olisi helppoa.

5) Vektorin tulisi käsittää valikoinnin merkitsin/ mielellään lääkeaineen, kuten ampisilliinin, vastustuskykyyn perustuva valikoinnin merkitsin/ jota voidaan käyttää vektorilla transformoidussa, isäntänä toimivassa bakteeri-solussa .

6) Vektorin tulisi käsittää myös toinen valikoinnin merkitsin, mielellään lääkeaineen, kuten neomysiinin, vastustuskykyyn perustuva merkitsin, jota voidaan käyttää tällä vektorilla transfektoidussa, isäntänä toimivassa eukarioottisessa solussa.

7) Vektorin tulisi sisältää sopivia endonukleaasien restriktiokohtia kloonaamista varten.

8) Vektorin tulisi sisältää kopioitumisen päättymisketju ja polyadenylaatioketju.

9) Ilmentyvä geeniyksikkö ei sisällä lainkaan viruspe- . räisiä kappaleita ja se ei ole onkogeeninen.

Edullisimmassa tapauksessa tämän keksinnön mukainen vektori ei käsitä autonomista replikaatioketjua (replikonia), joka kykenee toimimaan vektorilla transfektoidussa eukarioottisessa isäntäsolussa. Pääasiallinen syy replikoitu-mattoman vektorijärjestelmän käyttöön eukarioottisissa isäntäsoluissa on se, että kaikki ne vektorijärjestelmät, jotka kykenevät autonomiseen ja kromosomien ulkopuolella ,0, 95726 tapahtuvaan replikoitumiseen vektorilla transfektoidussa, eukarioottisessa, isäntänä toimivassa nisäkässolussa, käsittävät onkogeenisistä viruksista peräisin olevia rep-likoneja. On toivottavaa käyttää vektoreita, joiden DNA ei ole peräisin onkogeenisistä viruksista, ilmennettäessä farmaseuttisesti mielenkiintoisia polypeptidejä koodaavia DNA-ketjuja.

Tämä keksintö kohdistuu samoin transfektoituun eukarioot-tiseen isäntäsoluun, joka on transformoitu tämän keksinnön mukaisen toiminnallisen DNA-ketjun sisältävällä yhdistelmä-DNA-vektorilla. Tällainen isäntä on mielellään nisäkäs-solu, mieluiten kiinanhamsterin munasarjasta (CHO) saatu solulinja, verosolulinja, L-solulinja tai hiiren tai rotan fibroblastinen solulinja. Tällainen isäntä voidaan saada aikaan transfektoimalla eukarioottinen solu tämän keksinnön mukaisella yhdistelmä-DNA-vektorilla, tavanomaisia tekniikoita käyttäen.

Tämä keksintö kohdistuu samoin menetelmään mielenkiinnon kohteena olevan DNA-ketjun koodaamia proteiineja käsittävän partikkelin valmistamiseksi, jossa partikkelissa vähintään yksi näistä proteiineista vastaa mielenkiinnon kohteena olevan DNA-ketjun koodaamaa polypeptidiä, tämän menetelmän käsittäessä: a) tämän keksinnön mukaisen transfektoidun isännän viljelemisen sellaisissa viljelyalustassa vallitsevissa olosuhteissa, että tämä isäntä kykenee ilmentämään näitä proteiineja, ja b) tällaisen partikkelin eristämisen. Tällainen transfektoitu isäntä kykenee mieluiten erittämään nämä partikkeleiksi kasaantuneet proteiinit alustaan. Tällaiseen viljelyalustaan lisätään mielellään raskasmetallien ioneja tai steroidihormonia, kuten deksametasonia, MMT-promoottorin indusoimiseksi ja täten tällaisen koodaa-van alueen ilmentymisen edistämiseksi. Raskasmetallien ioneina käytetään mieluiten kadmiumin tai sinkin ioneja. Raskasmetallien ionien tai steroidihormonin optimaalinen pitoisuus alustassa voidaan määrittää tavanomaisilla menetelmillä .

102 95726 Tämä keksintö kohdistuu samoin tällä menetelmällä valmistettuihin partikkeleihin. Mikäli tämän keksinnön mukainen transfektoitu isäntäsolu erittää nämä partikkelit suoraan viljelyalastaan, niin nämä partikkelit voidaan tällöin eristää tämän keksinnön mukaisen transfektoidun isännän viljelyalustasta proteiinien puhdistamiseen tavanomaisesti käytetyillä tekniikoilla. Mikäli tämän keksinnön mukainen transfektoitu isäntäsolu ei eritä näitä partikkeleita, niin ne saadaan tämän isännän viljelmän hajotteesta viljelmän hajottamiseen tavanomaisesti käytetyillä tekniikoilla .

Esimerkki 3

Ihmisen kasvuhormonin ilmentäminen

Ihmisen kasvuhormonia koodaavan yhdistelmä-DNA-vektorin valmistaminen, mainitun vektorin käsittäessä metallotio-neiinipromoottorin A. Ihmisen kasvuhormonin geenin sisältävän DNA-kappa-leen eristäminen siten, ettei DNA-kappale käsitä kopioitu-misen luonnollista promoottoria

Yhdistelmäplasmidi pBR322, jonka sisältämä 2 kiloemäsparin suuruinen EcoRI-entsyymillä saadun DNA-kappaleen muodostama istute koodittaa ihmisen kasvuhormonin geeniä (vastapäivään suuntautuneena), pilkotaan restriktioendonukleaasilla BamHI 500 mikrolitran kokonaistilavuudessa, joka sisältää 100 yg plasmidi-DNA:ta, 240 yksikköä entsyymiä BamHI, BamHI-puskurissa (runsaasti suolaa sisältävä puskuri). Tällöin saadaan kaksi kappaletta, joista toinen on noin 5,6 kb ja toinen kappale 0,8 kb. Nämä kappaleet erotetaan elektro-foreettisesti käyttäen preparatiivista 0/8 % agaroosigee-liä. Suurempi kappale, joka sisältää ihmisen kasvuhormonin rakenteellisen geenin ilman tämän geenin luonnollista promoottoria, eluoidaan sähköisesti geeliltä ja puhdistetaan uuttamalla kahdesti fenolin ja kloroformin seoksella, uuttamalla kahdesti kloroformilla ja saostamalla kahdesti 103 9 5 7 2 6 etanolilla. Kasautunut DNA suspendoidaan uudestaan 20 mik-rolitraan 10 mM Tris-puskuria, pH 8,0.

B. Metallotioneiinipromoottorin ja vektorin pML2 rungon sisältävän DNA-kappaleen eristäminen

Plasmidi pMMT-neo (katso kuva 5) pilkotaan restriktioendo-nukleaaseilla Bglll ja BamHI, jolloin saadaan kaksi kappaletta, joista toinen on 4,5 kiloemäsparin suuruinen ja sisältää MMT-promoottorin ja pML2-vektorin rungon, ja toinen 2,15 kiloemäsparin suuruinen, ja se sisältää sv-PAS-t-alu-eeseen kytkeytyneen neo-geenin. Jotta itsestään ligatoitu-minen voitaisiin estää, lineaarinen DNA käsitellään alkali-sella fosfataasilla 100 mikrolitran kokonaistilavuudessa, joka sisältää 25 yg DNA-kappaletta ja 28 yksikköä alkalista fosfataasia. Seosta inkuboidaan 20 minuuttia 37 °C:n lämpötilassa, ja reaktio pysäytetään lisäämällä 10 yl 50 mM EDTA-liuosta ja kuumentamalla 10 minuuttia 68 °C:n lämpötilassa. Kappaleet erotetaan elektroforeettisesti 0,8 % agaroosigeeliä käyttäen. 4,5 kiloemäsparin kappale elu-oidaan sähköisesti geeliltä kuvatulla tavalla, ja se puhdistetaan uuttamalla kahdesti fenolin ja kloroformin seoksella, kahdesti kloroformilla ja saostamalla kahdesti etanolilla. Kasautunut DNA suspendoidaan uudestaan 20 mikro-litraan 10 mM Tris-puskuria, pH 8,0.

C. Edellä kohdissa A ja B eristettyjen DNA-kappaleiden ligaatio

Edellä kohdassa A eristettyä 5,6 kiloemäsparin suuruista kappaletta otetaan 1,5 mikrogramman suuruinen määrä ja se sekoitetaan 0,3 mikrogrammaan edellä kohdassa B eristettyä kappaletta 10 mikrolitran kokonaistilavuudessa, joka sisältää 0,9 yksikköä T4 DNA-ligaasia ja 1 x ligaatiopuskuria, sekä 100 mM ATP:tä. Seosta inkuboidaan 1 tunti 15 °C:n lämpötilassa ja yön yli 4 °C:n lämpötilassa. Tämän jälkeen ligaatioseos viedään bakteerikantaan HB101 käyttäen mene 104 95726 telmää, joka kuvataan osassa Materiaalit ja menetelmät. Transformaatioseoksesta saatuja soluja levitetään ampi-silliinia sisältäville LB-agarmaljoille, ja eristetyistä pesäkkeistä seulotaan ne, jotka sisältävät 10,1 kiloemäs-parin suuruisia, restriktioendonukleaasilla BamHI lineaariseksi tehtävissä olevia plasmideja. Suuntautuminen määritetään entsyymillä EcoRI pilkkomalla. Plasmideista, jotka sisältävät istutteen oikealla tavalla suuntautuneena, saadaan kaksi EcoRI-kappaletta, jotka ovat kooltaan 3,5 kb ja 6,6 kb. Näitä plasmideja, joista käytetään nimitystä pMMT-hGH, kasvatetaan suuressa mitassa ja ne puhdistetaan kuvatulla tavalla.

D. Edellä kohdassa C saadun yhdistelmä-DNA-vektorin vieminen nisäkässoluihin ja ihmisen kasvuhormonia tuottavien so-lulinjojen muodostaminen Tämän jälkeen vektori pMMT-hGH transfektoidaan eukarioot-tisiin isäntäsoluihin (nisäkässoluihin) käyttäen yhteis-transfektoinnin tavanomaisia tekniikoita, jolloin saadaan transfektantteja, jotka syntetoivat ihmisen kasvuhormonin polypeptidiä. Tällaiset transfektantit tunnistetaan RIA-tekniikalla käyttäen ihmisen kasvuhormonia vastaan vaikuttavia vastar-aineita. Ihmisen kasvuhormonia erittävistä transfektanteista muodostetaan solusukupolvi tavanomaisia tekniikoita käyttäen.

Esimerkki 4

Rotan kasvuhormonin ilmentäminen

Rotan kasvuhormonia koodaavan yhdistelmä-DNA-vektorin valmistaminen, mainitun vektorin sisältäessä metallotioneiini-promoottorin A. Restriktioendonukleaasin Bglll kohdan muuntaminen plas-midissa pMMT-neo Xhol-kohdaksi 200 mikrogramman suuruinen määrä plasmidia pMMT-neo pilkotaan 500 yksiköllä restriktioendonukleaasia Bglll keskimää 1ϋ5 95726 räisesti suolaa sisältävässä puskurissa, reaktion kokonaistilavuuden ollessa 1000 yl. 6,65 kiloemäsparin suuruisen lineaarisen plasmidi-DNA:n päät tehdään ensin tylpiksi täyttämällä Bglll-päät DNA-polymeraasilla I (Klenow-kappale) ja käyttämällä neljää dNTP-molekyyliä kuten aikaisemmin esitetään, jonka jälkeen siihen kiinnitetään re-striktioendonukleaasin XhoI tunnistamis- ja pilkkomiskoh-dan sisältävä seuraava synteettinen DNA-kytkijäkappale (yhtiöstä PL Biochemicals, Milwaukee, Wisconsin 53205): 5'-CCTCGAGG-3' 3'-GGAGCTCC-5’ Täyttämisreaktio toteutetaan 30 mikrolitran kokonaistilavuudessa, joka sisältää 2,5 yg 6,65 kiloemäsparin suuruista kappaletta, 20 mM neljää dNTP molekyyliä, 3 yl NT-pusku-ria, 1 yl Klenow-kappaletta. Seosta inkuboidaan huoneen lämpötilassa 30 minuuttia. Reaktio pysäytetään lisäämällä 2 yl 0,25 mM EDTA-liuosta ja DNA pestään kertaalleen yhtä suurella tilavuudella fenolin ja kloroformin seosta, ja sitten yhtä suurella tilavuudella pelkkää kloroformia. Ve-sifaasin sisältämä DNA puhdistetaan edelleen saostamalla kahteen kertaan etanolilla. Saostunut DNA suspendoidaan uudestaan 10 mikrolitraan 10 mM Tris-puskuria, pH 8,0, pitoisuudeksi 50 ng/yl.

Kytkijäkappale liuotetaan 50 mikrolitraan 10 mM Tris-pus-kuria, pH 8,1, pitoisuudeksi 1 pikomooli/yl. Päistään tylppä 6,65 kiloemäsparin kappale ligatoidaan kytkijä-kappaleeseen 20 mikrolitran kokonaistilavuudessa, joka sisältää 2 pikomoolia kytkijäkappaletta, 0,5 yg 6,65 kiloemäsparin kappaletta, 9 yksikköä T4 DNA-ligaasia (Boehringer Mannheim), 30 yl 2 x tylpän pään ligaatiopuskuria sekä 100 mM ATP:tä. Ligaatioreaktion annetaan edetä 15 °C:n lämpötilassa tunnin ajan ja 4 °C:n lämpötilassa yön yli.

Tätä ligaatioseosta käytetään bakteerikannan HB101 trans-formoimiseen, joka kanta on tehty vastaanottavaksi (compe- 1 06 95726 tent) osassa Materiaalit ja menetelmät kuvatulla tavalla. Transformaatioseoksesta saatuja soluja levitetään ampi-silliiniä sisältäville LB-agarmaljoille. Bakteeripesäkkeet^ jotka kykenevät kasvamaan ampisilliinia sisältävillä maljoilla, otetaan talteen ja kasvatetaan 2 millilitran viljelmissä ja niistä eristetään plasmidi edellä kuvatusti.

Todettiin, että 12 bakteeripesäkkeestä neljä (OK 3, OK 4, OK 11 ja OK 12) käsitti plasmidin, joka oli odotetun kokoinen pelkällä entsyymillä XhoI tai sekä entsyymillä BamHI että entsyymillä EcoRI pilkkomisen jälkeen. Kloonien OK 3 ja OK 11 plasmidi-DNA:n annettiin lisääntyä HB101-kannassa plasmidin tuottamiseksi suuressa mitassa.

B. Metallotioneiinipromoottorin ja pML2-vektorin rungon sisältävän DNA-kappaleen eristäminen 100 mikrogramman suuruinen määrä sekä kloonia OK 3 että kloonia OK 11 pilkottiin restriktioendonukleaaseilla BamHI ja XhoI, jolloin saatiin kaksi kappaletta, joista toinen (5,8 kb) käsitti MMT-promoottorin Xhol-pään läheisyyteen sijoittuneena ja pML2-osan BamHI-päässä, ja toinen (0,85 kb) kappale sisälsi sv-PAS-t-ketjun. Kappaleet erotettiin elektroforeettisesti 0,8 % agaroosigeelillä. 5,8 kiloemäs-parin kappale puhdistettiin sähköisesti eluoimalla, jonka jälkeen se uutettiin kahdesti fenolin ja kloroformin seoksella, uutettiin kahdesti kloroformilla ja se saos-tettiin kahdesti etanolilla. Kasautunut DNA suspendoitiin uudestaan 50 mikrolitraan 10 mM Tris-puskuria, pH 8,0.

C. Rotan kasvuhormonin geenin sisältävän DNA-kappaleen eristäminen

Plasmidi pBR322.rGH, jonka sisältämä genominen BamHI-istute koodittaa rotan kasvuhormonin geeniä (vastapäivään suuntautuneena), pilkottiin entsyymeillä BamHI ja XhoI. Rakenteellisen geenin sisältävä genominen BamHI-XhoI-kap-pale eristetään edellä kuvatusti 0,8 % preparatiiviselta agaroosigeeliltä.

1 07 95726 D. Edellä kohdissa B ja C eristettyjen kappaleiden ligaatio Nämä kappaleet ligatoidaan toisiinsa siten, että MMT-pro-moottori kytkeytyy tarttuvan Xhol-pään välityksellä suoraan rakenteelliseen geeniin tarttuvan Xhol-päänsä välityksellä, oikealla tavalla suuntautuneena.

Ligaatioseosta käytetään bakteerikannan HB101 tranformoin-tiin edellä esitetysti. Ampisilliinia sisältäville LB-agar-maljoille pesäkkeitä muodostavat transformantit otetaan talteen ja niitä kasvatetaan 2 millilitran viljelmissä plasmidin pienten määrien valmistamiseksi. Plasmideja, joista saadaan kaksi odotusten mukaista kappaletta entsyymeillä BamHI ja XhoI pilkottaessa, ja joista käytetään nimitystä pMMT-rGH, kasvatetaan suuressa mitassa nisäkäs-soluihin transfektointia varten.

E. Edellä kohdassa D saadun yhdistelmä-DNA-vektorin vieminen nisäkässoluihin ja rotan kasvuhormonia tuottavien solulinjojen muodostaminen Tämän jälkeen vektori pMMT-rGH transfektoidaan eukariootti-siin isäntäsoluihin (nisäkässoluihin) yhteistransfektoin-nissa tavanomaisesti käytettävillä tekniikoilla, jolloin saadaan transfektantteja, jotka syntetoivat rotan kasvuhormonin polypeptidiä. Tällaiset transfektantit tunnistetaan RIA-tekniikalla käyttäen rotan kasvuhormonia vastaan vaikuttavia vasta-aineita'. Rotan kasvuhormonia erittävistä transfektanteista muodostetaan solulinja tavanomaisia tekniikoita käyttäen.

Vaikka tämä keksintö onkin kuvattu edullisten suoritusmuoto jensa avulla, niin kuitenkin alan asiantuntijalle on selvää, että keksintöön voidaan tehdä muodollisia ja yksityiskohtaisia muutoksia kuitenkaan poikkeamatta keksinnön • hengestä ja tavoitteista.

Claims (8)

108 95726

1. Menetelmä hepatitis-B-virusinfektion läsnäolon määrittämiseksi, tunnettu siitä, että se käsittää kvantitatiivisten immunomääritysten suorittamisen ihmisestä otetusta näytteestä siinä olevien vasta-aineiden määrän määrittämiseksi käyttäen hepatitis-B-pinta-antigeenipartik-kelia, joka on valmistettu yhdistelmä-DNA-tekniikalla, partikkelin käsittäessä PreS,-PreS2-S-proteiinin, jota koodaa-van alueen käsittävä yhdistelmä-DNA-vektori ei sisällä muita infektiivisiä virusperäisiä DNA-segmenttejä, ja määri-tysarvon vertaamisen tunnettuun standardiin.

2. Menetelmä hepatitis-B-viruksen pinta-antigeenin PreS,-PreS2-S-proteiinin koodaavien alueiden koodaamia proteiineja vastaan vaikuttavien vasta-aineiden määrittämiseksi nisäkkään veriseerumista otetusta näytteestä, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää vaiheet: a. saatetaan näyte kosketuksiin kiinteän substraatin kanssa, joka on pinnoitettu leimaamattomilla hepatitis-B-pinta-antigeenipartikkeleilla, jotka on valmistettu yhdistelmä-DNA-tekniikalla, partikkelin käsittäessä PreS]-PreS2-S-pro-teiinin, jota koodaavan alueen käsittävä yhdistelmä-DNA-vektori ei sisällä muita infektiivisiä virusperäisiä DNA-segmenttejä; b. inkuboidaan ja pestään mainittu kosketuksiin saatettu näyte; c. saatetaan mainittu näyte kosketuksiin leimattujen hepa-titis-B-pinta-antigeenipartikkelien kanssa, jotka on valmistettu yhdistelmä-DNA-tekniikalla, partikkelin käsittäessä PreS[-PreS2-S-proteiinin, jota koodaavan alueen käsit- . tävä yhdistelmä-DNA-vektori ei sisällä muita infektiivisiä virusperäisiä DNA-segmenttejä, saaden näin aikaan leimatun näytteen; d. inkuboidaan ja pestään mainittu leimattu näyte; ja e. määritetään leimatun partikkelin määrä leimatussa näytteessä . Il ,09 95 716

3. Menetelmä hepatitis-B-viruksen pinta-antigeenin PreS,-PreS2-S-proteiinin koodaavien alueiden koodaamia proteiineja vastaan vaikuttavien vasta-aineiden määrittämiseksi nisäkkään veriseerumista otetusta näytteestä, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää vaiheet: a. tuotetaan koostumus sisältäen vasta-aineen, joka on tuotettu immunogeenillä käsittäen partikkeleita, jotka on valmistettu yhdistelmä-DNA-tekniikalla, partikkelien käsittäessä hepatitis-B-viruksen pinta-antigeenin PreS[-PreS2-S-proteiinin, jota koodaavan alueen käsittävä yhdistelmä-DNA-vektori ei sisällä muita infektiivisiä virusperäisiä DNA-segmenttejä; b. saatetaan näyte kosketuksiin koostumuksen ensimmäisen osan kanssa ja leimatun immunogeenin kanssa, inkuboidaan ja pestään ensimmäinen osa; c. saatetaan antigeenivapaa kontrolli kosketuksiin koostumuksen toisen osan ja leimatun immunogeenin kanssa, ja inkuboidaan ja pestään toinen osa; d. lisätään sama määrä proteiinia A käsittävää stafylokokkia vaiheiden b. ja c. koostumuksiin, inkuboidaan molempia koostumuksia ja erotetaan neste kiinteästä aineesta; ja e. määritetään leimatun immunogeenin määrä vaiheessa d. saadussa kummassakin koostumuksessa. . 4. Diagnostinen määrityssarja hepatitis-B-viruksen pinta-antigeenin PreS,-PreS2-S-proteiinin koodaavien alueiden koodaamia proteiineja vastaan vaikuttavien vasta-aineiden määrittämiseksi nisäkkään veriseerumista otetusta näytteestä, tunnettu siitä, että se käsittää: 1 a. leimaamattornia proteiinipartikkeleita, jotka on valmistettu yhdistelmä-DNA-tekniikalla, partikkelin käsittäessä hepatitis-B-viruksen pinta-antigeenin PreS,-PreS2-S-proteii-nin, jota koodaavan alueen käsittävä yhdistelmä-DNA-vektori ei sisällä muita infektiivisiä virusperäisiä DNA-segmenttejä, ja jotka on kiinnitetty kiinteään kantajaan; ja b. leimattuja vasta-aineita ihmisen IgG:lle tai IgM:lle. no 95726

5. Diagnostinen määrityssarja hepatitis-B-viruksen pinta-antigeenin PreS1-PreS2-S-proteiinin koodaavien alueiden koodaamien proteiinien läsnäolon osoittamiseksi nisäkkään veriseerumista otetusta näytteestä, tunnettu siitä, että se käsittää: a. vasta-aineita, jotka on tuotettu partikkeleilla, jotka on valmistettu yhdistelmä-DNA-tekniikalla, partikkelin käsittäessä hepatitis-B-viruksen pinta-antigeenin PreS^PreS^ S-proteiinin, jota koodaavan alueen käsittävä yhdistelmä-DNA-vektori ei sisällä muita infektiivisiä virusperäisiä DNA-segmenttejä; ja b. leimattuja vasta-aineita, jotka on tuotettu partikkeleilla, jotka on valmistettu yhdistelmä-DNA-tekniikalla, partikkelin käsittäessä hepatitis-B-viruksen pinta-antigeenin PreSj-PreS2-S-proteiinin, jota koodaavan alueen käsittävä yhdistelmä-DNA-vektori ei sisällä muita infektiivisiä virusperäisiä DNA-segmenttejä.

6. Menetelmä hepatitis-B-viruksen pinta-antigeenin PreS[-PreS2-S-proteiinin koodaavien alueiden koodaamia proteiineja sisältävien HBV-antigeenien ilmaisemiseksi HBV-infektoituneiden eläinten seerumista, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää vaiheet: . a. varustetaan kiinteä substraatti, jonka pinnalla on sitoutumiskohtia, vasta-aineella partikkeleita vastaan, jotka on valmistettu yhdistelmä-DNA-tekniikalla, partikkelin käsittäessä hepatitis-B-viruksen pinta-antigeenin PreS,-PreS2- S-proteiinin, jota koodaavan alueen käsittävä yhdistelmä-DNA-vektori ei sisällä muita infektiivisiä virusperäisiä i DNA-segmenttejä; b. pestään päällystetyt helmet vasta-aineylimäärän poistamiseksi ; c. saatetaan helmet kosketuksiin proteiinia sisältävän liuoksen kanssa epäspesifisen sitoutumisen vähentämiseksi; d. pestään helmet proteiinipitoisen liuosylimäärän poistamiseksi ; II 95726 e. inkuboidaan helmiä sellaisten seeeruminäytteiden kanssa, joiden epäillään sisältävän HBV:tä tai HBV-pinta-antigeene-ja; f. pestään helmet liuoksella, johon on sekoitettu leimattua vasta-ainetta; ja g. määritetään leimatun vasta-aineen määrä.

7. Menetelmä hepatitis-B-viruksen pinta-antigeeniproteii-nien PreS,-PreS2-S-alueita vastaan vaikuttavien vasta-aineiden ilmaisemiseksi tietystä näytteestä, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää vaiheet: a. adsorboidaan partikkelit, jotka on valmistettu yhdistelmä -DNA- tekniikalla, partikkelin käsittäessä hepatitis-B-vi-ruksen pinta-antigeenin PreS,-PreS2-S-proteiinin, jota koo-daavan alueen käsittävä yhdistelmä-DNA-vektori ei sisällä muita infektiivisiä virusperäisiä DNA-segmenttejä, kiin-teälle, sitoutumiskohtia sisältävälle substraatille; b. saatetaan substraatti kosketuksiin aineen kanssa, joka kyllästää epäspesifiset sitoutumiskohdat substraatin pinnalla; c. pestään substraatti puskuriliuoksella ja poistetaan puskuri ; d. lisätään näyte substraattiin; e. inkuboidaan ja pestään substraattia sisältävä näyte; f. lisätään leimatut vasta-aineet ihmisen IgG:tä tai IgM:ää vastaan substraattiin; g. inkuboidaan ja pestään substraatti; ja määritetään leimatun vasta-aineen määrä.

8. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen me-.netelmä, tunnettu siitä, että proteiini on glyko- syloitu. 112 95726