FI95726B - Diagnostic processes and determination series which use hepatitis B virus surface antigens which have been prepared by recombinant DNA technology - Google Patents
Diagnostic processes and determination series which use hepatitis B virus surface antigens which have been prepared by recombinant DNA technology Download PDFInfo
- Publication number
- FI95726B FI95726B FI914267A FI914267A FI95726B FI 95726 B FI95726 B FI 95726B FI 914267 A FI914267 A FI 914267A FI 914267 A FI914267 A FI 914267A FI 95726 B FI95726 B FI 95726B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- protein
- pres2
- dna
- hepatitis
- particles
- Prior art date
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
- 95726- 95726
Diagnostiset menetelmät ja määrityssarjat, joissa käytetään yhdistelmä-DNA-tekniikalla muodostettua hepatitis B -viruksen pinta-antigeenia Tämä keksintö kohdistuu bakteeriperäisiin plasmideihin, jotka käsittävät PreS2-PreS2-S-proteiinia koodaavan alueen, mutta joista puuttuvat hepatitis B -viruksen ytimen antigeeniä koodaavat ketjut ja joita plasmideja käytetään eukarioottis-ten solulinjojen transfektioon PreS!-PreS2-S-proteiinia koodaavan alueen koodaamia polypeptidejä sisältävien partikke-leiden tuottamiseksi.This invention relates to plasmids of bacterial origin comprising the PreS2-PreS2-S protein coding region but lacking the hepatitis B virus core antigen coding chains, and the assays to the hepatitis B virus surface antigen. which plasmids are used to transfect eukaryotic cell lines to produce particles containing polypeptides encoded by the PreS1-PreS2-S protein coding region.
Viime aikoina geenitekniikassa tehdyt kehitysaskeleet tekevät mahdolliseksi sen, että lukuisia peptidejä ja proteiineja voidaan ilmentää bakteeri-, hiiva- sekä nisäkässoluissa yhä suurempina määrinä. Vaikka monia proteiineja ja peptidejä onkin ilmennetty bakteereissa huomattavia määriä, niin kuitenkin erityisenä toiveena on ihmislääketieteessä käytettävien proteiinien ja polypeptidien ilmentäminen suurina määrinä nisäkässoluissa, jolloin voidaan välttää ne haitat, jotka johtuvat bakteerisoluista peräisin olevista, mahdollisesti kontaminoivista tuotteista tai jotka liittyvät bakteerisoluissa ilmentämiseen.Recent advances in genetic engineering make it possible for numerous peptides and proteins to be expressed in increasing amounts in bacterial, yeast, and mammalian cells. Although many proteins and peptides have been expressed in significant amounts in bacteria, there is a particular desire to express high levels of proteins and polypeptides used in human medicine in mammalian cells to avoid the disadvantages of bacterial cell-derived, potentially contaminating products.
Erityisen mielenkiinnon kohteena on hepatitis B-viruksen pinnan antigeeniproteiinien ilmentäminen suurina määrinä nisäkässoluissa. Näiden proteiinien ilmentymistaso nisäkäs-soluissa ei toistaiseksi ole ollut niin korkea, että näiden polypeptidien taloudellinen tuotanto olisi ollut mahdollista .Of particular interest is the expression of hepatitis B virus surface antigen proteins in high amounts in mammalian cells. The level of expression of these proteins in mammalian cells has so far not been so high that economic production of these polypeptides would have been possible.
Hepatitis B-virus siirtyy ihmisestä toiseen ja aiheuttaa kroonisen ja heikentävän infektion, joka johtaa maksan vakavaan vaurioitumiseen, pääasiassa karsinoomaan, ja kuolemaan. Useimmissa tapauksissa täydellinen toipuminen hepatitis B-viruksen aiheuttamasta infektiosta on odotettavissa. Kuitenkin monissa Afrikan ja Aasian maissa hepatitis 2 /-. r* r1 - yo//.υ B-viruksen aiheuttama infektio on endeemistä. Hyvin moni yksilö näiden maiden väestöstä on hepatitis B-viruksen krooninen kantaja, jolloin vaarana on, että he voivat mahdollisesti levittää tautia edelleen.The hepatitis B virus is transmitted from person to person and causes a chronic and debilitating infection that results in severe damage to the liver, mainly carcinoma, and death. In most cases, complete recovery from hepatitis B virus infection is expected. However, in many African and Asian countries hepatitis 2 / -. r * r1 - yo // .υ The infection caused by the B virus is endemic. A very large number of individuals in the population of these countries are chronic carriers of the hepatitis B virus, with the risk that they may potentially spread the disease further.
Rokottaminen on ainoa tunnettu suojakeino hepatitis B-vi-rusta vastaan. Viime aikoina monet yritykset (esimerkiksi Merck, Sharp & Dohme, USA sekä Pasteur Institute, Ranska) ovat tuoneet markkinoille plasmasta saadun rokotteen hepatitis B-virusta vastaan. Tämä rokote sisältää antigeeninä hepatitis B-viruksen proteiineja, jotka sijaitsevat tavallisesti viruspartikkelin kotelon pinnalla. Tällaista antigeeniä kutsutaan yleisesti hepatitis B-viruksen pinnan antigeeniksi (HBsAg) ja tätä antigeeniä koodaavaa virusgeeniä kutsutaan HBsAG-geeniksi, Edellä mainitut rokotteet sisältävät pinnan antigeeniä, joka on eristetty hepatitis B-viruksen infektoimien ihmisten plasmasta. Vaikka itse pinnan antigeeni ei olekaan patogeeninen niin kuitenkin se kiihottaa ihmisessä hepatitis B-viruspartikkeleita vastaan vaikuttavien vasta-aineiden tuotantoa.Vaccination is the only known means of protection against hepatitis B virus. Recently, many companies (e.g., Merck, Sharp & Dohme, USA, and Pasteur Institute, France) have introduced a plasma-derived vaccine against the hepatitis B virus. This vaccine contains hepatitis B virus proteins as an antigen, which are usually located on the surface of the viral particle housing. Such an antigen is commonly referred to as hepatitis B virus surface antigen (HBsAg) and the viral gene encoding this antigen is called HBsAG gene. The above vaccines contain a surface antigen isolated from human plasma infected with hepatitis B virus. Although the surface antigen itself is not pathogenic, it nevertheless stimulates the production of antibodies against hepatitis B virus particles in humans.
Hepatitis B-viruksen pinnan antigeenin ainoa kaupallisesti saatavana oleva lähde on hepatitis B-viruksen infektoimien ihmisten veri. Pinnan antigeenin eristäminen ja puhdistaminen ihmisseerumista on vaivalloista ja aikaa vievää ja näin ollen se on suhteellisen kallista. Tämän lisäksi, niin kauan kun ihmisseerumi on pinnan antigeenin ainoa kaupallisesti saatavilla oleva lähde, rokotteisiin käytettävissä olevan pinnan antigeenin määrä pysyy rajoitettuna.The only commercially available source of hepatitis B virus surface antigen is the blood of people infected with hepatitis B virus. Isolation and purification of surface antigen from human serum is cumbersome and time consuming and therefore relatively expensive. In addition, as long as human serum is the only commercially available source of surface antigen, the amount of surface antigen available for vaccines remains limited.
Ajatellen suuressa mitassa toteutettavia rokotuksia, erityisesti niillä alueilla, joilla hepatitis B-virus on endeeminen, olisi erittäin tärkeätä, että käytettävissä olisi hepatitis B-viruksen pinnan antigeenin halpa ja käytännöllisesti katsoen ehtymätön lähde, johtuen siitä, että on olemassa vaara kontaminoitua patogeenisillä aineilla, kun pinnan antigeeniä eristetään ihmisseerumista, niin on toivottavaa, ettei 3 95726 ihmisseerumia käytetä pinnan antigeenin lähteenä. Tällä hetkellä ei myöskään tunneta ihmisten ja simpanssien lisäksi mitään sellaista biologista järjestelmää, jossa hepatitis B-virus voisi kasvaa ja missä se voitaisiin saada lisääntymään.Considering large-scale vaccinations, especially in areas where hepatitis B virus is endemic, it would be very important to have a cheap and virtually inexhaustible source of hepatitis B virus surface antigen, due to the risk of contamination with pathogenic agents when surface antigen is isolated from human serum, it is desirable that 3,95726 human sera not be used as a source of surface antigen. At present, there is also no known biological system other than humans and chimpanzees in which the hepatitis B virus could grow and be propagated.
Molekyylibiologian viimeaikainen kehittyminen on tehnyt mahdolliseksi sen, että järjestys hepatitis B-viruksen täydellisessä genomissa voidaan kloonata (Siddiqui, A. et ai., Proc. Natl. Aca. Sei., USA, Voi. 76, s. 4664, 1979; Sninsky, J.J. et ai., Nature, Voi. 279, s. 346, 1979; sekä Charnay, P. et ai. Nucl. Acids Res., Voi. 7, s. 335, 1979). Tämän lisäksi hepatitis B-viruksen eri virusprote-iineja koodaavat alueet on tunnistettu (katso esimerkiksi eurooppalaiset patenttihakemukset, joiden julkaisunumerot ovat 13828, 20251 ja 38765 sekä Galibert et ai., Nature,Recent advances in molecular biology have made it possible to clone the sequence in the complete genome of the hepatitis B virus (Siddiqui, A. et al., Proc. Natl. Aca. Sci., USA, Vol. 76, p. 4664, 1979; Sninsky, JJ et al., Nature, Vol. 279, p. 346, 1979; and Charnay, P. et al., Nucl. Acids Res., Vol. 7, p. 335, 1979). In addition, regions encoding different viral proteins of the hepatitis B virus have been identified (see, for example, European Patent Applications Nos. 13828, 20251 and 38765 and Galibert et al., Nature,
Voi. 281, sivut 646-650, 1979; Pasek et ai., Nature,Butter. 281, pages 646-650, 1979; Pasek et al., Nature,
Voi. 282, sivut 575-579, 1979; sekä Valenzuela et ai.,Butter. 282, pages 575-579, 1979; and Valenzuela et al.,
Nature, Voi. 280, sivut 815-819, 1979).Nature, Vol. 280, pages 815-819, 1979).
Tämän kehityksen mukaisesti lukuisia isäntäjärjestelmiä on testattu virusgenomin sen osan, joka koodaa hepatitis B-viruksen pinnan antigeeniproteiineja, ilmentämiseksi.In line with this development, numerous host systems have been tested to express the portion of the viral genome that encodes hepatitis B virus surface antigen proteins.
Monissa yhteyksissä on osoitettu,että tiettyjen eukarioottis-ten tuotteiden ollessa kyseessä voivat bakteerit toimia halpana tuotantojärjestelmänä. Kuitenkin kohdataan monia vaikeuksia kun eukarioottisia tuotteita syntetoidaan bakteereissa. Esimerkiksi; 1) eukarioottinen rakenteellinen geeni ei ehkä kopioidu tehokkaasti bakteereissa, koska kodonien käyttö bakteereissa eroaa kodonien käytöstä eukariooteissa; 2) eukarioottinen geenituote voi olla toksinen isäntänä toimineelle bakteerisolulle; 3) eukarioottisen geenituotteen rakenne ja toiminta voi riippua tietyistä luennan jälkeisistä prosesseista, kuten 4 95726 glykosylaatiosta tai disulfidisidosten erityisestä kytkeytymisestä, joista kumpaakaan ei saada aikaan bakteeri-isännässä; 4) geenituote erittyy ainoastaan harvoin isäntänä toimineesta bakteerisolusta; 5) eukarioottiset promoottorit eivät tavallisesti toimi bakteereissa ja ne on korvattava bakteerista saadulla promoottorilla, ja tällainen korvaaminen voi johtaa eukari-oottisen geenituotteen muuntumiseeen, esimerkiksi tuotteen N-päätteen osa on peräisin bakteerista ja tämä osa käsittää ensimmäisenä aminohapponaan N-formyylimetioniinin, jota ei esiinny eukariooteissa, ja joka saattaa toimia uutena immunogeenisena determinanttina nisäkkään immuunijärjestelmälle; ja 6) puhdistamisvaiheen aikana bakteerin soluseinämistä peräisin olevia komponentteja voi puhdistua geenituotteen mukana ja ne voivat aiheuttaa vakavia allergisia reaktioita tai ne voivat johtaa geenituotetta vastaanottavassa nisäkkäässä anafylaktiseen shokkiin.It has been shown on many occasions that in the case of certain eukaryotic products, bacteria can act as a cheap production system. However, many difficulties are encountered when eukaryotic products are synthesized in bacteria. For example; 1) the eukaryotic structural gene may not be efficiently replicated in bacteria because the use of codons in bacteria differs from the use of codons in eukaryotes; 2) the eukaryotic gene product may be toxic to the host bacterial cell; 3) the structure and function of a eukaryotic gene product may depend on certain post-reading processes, such as 4 95726 glycosylation or specific coupling of disulfide bonds, neither of which is achieved in a bacterial host; 4) the gene product is rarely secreted from the host bacterial cell; 5) eukaryotic promoters do not normally function in bacteria and must be replaced by a bacterial-derived promoter, and such replacement may result in modification of the eukaryotic gene product, e.g., the N-terminal portion of the product is derived from the bacterium and comprises N-formylmethionine as its first amino acid. , and which may serve as a novel immunogenic determinant for the mammalian immune system; and 6) during the purification step, components derived from the cell walls of the bacterium may be cleared with the gene product and may cause severe allergic reactions or may lead to anaphylactic shock in the mammal receiving the gene product.
Bakteereissa tuotettuun hepatitis B-viruksen pinnan antigeeniin on liittynyt vaikeuksia. Ensinnäkin, tuotannon taso bakteereissa on hyvin alhainen ja tämän lisäksi puhdis- taminen on aloitettava bakteerilysaatista, koska tuote ei erity bakteerisolujen ulkopuolelle. Toisen ongelman aiheuttaa se, ettei bakteereissa esiinny tiettyjä luennan jälkeisiä prosesseja, esimerkiksi pinnan antigeenin glykosy-laatiota, mikä vaikuttaa immuunireaktion spesifisyyden tasoon. Kaikista näistä syistä johtuen on toivottavaa, ettei bakteereita käytetä isäntinä proteiinin tuotannossa.Hepatitis B virus surface antigen produced in bacteria has been associated with difficulties. Firstly, the level of production in the bacteria is very low and in addition to this the purification has to start from the bacterial lysate, because the product is not secreted outside the bacterial cells. Another problem is the absence of certain post-reading processes in the bacteria, for example glycosylation of the surface antigen, which affects the level of specificity of the immune response. For all of these reasons, it is desirable that bacteria not be used as hosts in protein production.
Hiivasolut, jotka on transformoitu hepatitis B-viruksen pinnan antigeeniä koodaavan ketjun sisältävällä, asianmukaisella yhdistelmävektorilla, syntetoivat mainittua pinnan antigeeniä, jota kerääntyy huomattavia määriä hiivaviljel-mään. Tälläkin isäntäjärjestelmällä on eräitä huomattavia haittoja, kuten 1) pinnan antigeeni ei erity hiivasoluista 11 5 95726 ja se on eristettävä näiden solujen solulysaatista, ja 2) hiivasoluissa muodostuneet pinnan antigeenin monomeerit eivät muodosta kovalenttisesti liittyneitä dimeerejä, kuten nisäkässoluista erittynyt pinnan antigeeni.Yeast cells transformed with an appropriate recombinant vector containing a chain encoding a hepatitis B virus surface antigen synthesize said surface antigen, which accumulates in significant amounts in yeast culture. This host system also has some significant disadvantages, such as 1) the surface antigen is not secreted from yeast cells and must be isolated from the cell lysate of these cells, and 2) the surface antigen monomers formed in the yeast cells do not form covalently linked dimers such as mammalian antigen secreted cells.
Alalla on yritetty monta kertaa saada aikaan sellaisia ni-säkässolulinjoja, jotka tuottavat pinnan antigeeniä. Nämä solulinjat ovat olleet peräisin ihmisen hepatosellulaari-sista (maksasolujen) karsinoomista (Alexander, J.J. et al·.,Many attempts have been made in the art to provide mammalian cell lines that produce surface antigen. These cell lines have been derived from human hepatocellular (liver cell) carcinomas (Alexander, J.J. et al.,
Afr. Med. J., Voi. 50, s. 2124, 1976) seka soluista, jotka on transfektoitu kloonatulla hepatitis B-viruksen DNA:11a. Lisäksi apinan munuaissoluja on infektoitu simian-virukseen 40 (SV40) pohjautuvilla yhdistelmä-DNA-vektoreilla, jotka käsittävät 40 % hepatitis B-viruksen genomista (Laub, O. et ai., J. of Virol., Voi. 48, s. 271, 1983). Samoin yhteistransfektointiin perustuvia menetelmiä on käytetty pinnan antigeeniä ilmentävien solulinjojen valikointiin (Standring, D.N. et ai., J. of Virol., Voi. 50, s. 563, 1984). Dihydrofolaattireduktaasi (DHFR)- geeniä on käytetty suuria määriä antigeeniä tuottavien nisäkässolu-linjojen aikaansaamiseksi (Michel et ai., Proc. Natl.Afr. Med. J., Vol. 50, p. 2124, 1976) as well as from cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA. In addition, monkey kidney cells have been infected with recombinant DNA vectors based on simian virus 40 (SV40) comprising 40% of the hepatitis B virus genome (Laub, O. et al., J. of Virol., Vol. 48, p. 271 , 1983). Similarly, methods based on co-transfection have been used to select cell lines expressing surface antigen (Standring, D.N. et al., J. of Virol., Vol. 50, p. 563, 1984). The dihydrofolate reductase (DHFR) gene has been used to generate large amounts of antigen-producing mammalian cell lines (Michel et al., Proc. Natl.
Aca. Sei., Voi. 81, s. 7708, 1984). Samoin eukarioottisia virusvektoreita, joissa valikoitavissa olevana merkitsi-. menä käytetään transformoitua fenotyyppiä (Hsiung, N.Aca. Sci., Vol. 81, p. 7708, 1984). Likewise, eukaryotic viral vectors with selectable labeling. a transformed phenotype is used (Hsiung, N.
et ai., Molec. and Applied Genetics, Voi. 2, s. 497, 1984) , on käytetty pinnan antigeenin geenin siirtämiseen nisäkäs-solujen sisään. Näissä tapauksissa onkogeenisiä DNA-ketju ja sisältäviä DNA-muodosteita, tai onkogeenisistä viruksista saatuja DNA-ketjuja, käytettiin pinnan antigeeniä tuottavien solulinjojen valikointiin. Onkogeenisen ketjun käyttö valikoinnin merkitsimenä aiheuttaa jälleen uusia turvallisuusongelmia, mikäli näiden solujen pinnan antigeeniä käytetään rokotuksissa.et al., Molec. and Applied Genetics, Vol. 2, p. 497, 1984) has been used to transfer the surface antigen gene into mammalian cells. In these cases, oncogenic DNA strand and containing DNA constructs, or DNA strands derived from oncogenic viruses, were used to select surface antigen-producing cell lines. The use of an oncogenic chain as a marker of selection again poses new safety concerns if the surface antigen of these cells is used in vaccinations.
Monissa julkaisuissa tarkastellaan hepatitis B-viruksen koodaavan ketjun syntetoimien polypeptidien ilmentymistä.Many publications look at the expression of polypeptides synthesized by the hepatitis B virus coding chain.
6 957266 95726
Eurooppalaisessa patenttihakemuksessa no. 013 828-A1 todetaan, että nukleotidiketjut, jotka koodaavat 163 aminohappojäännöksen muodostamaa pätkää (PreSrää koo-daava alue) ja jotka sijaitsevat HBV-genomissa välittömästi ennen S-proteiinia koodaavaa aluetta, voidaan myös sisällyttää niihin kappaleisiin, joita käytetään käyttökelpoisten yhdistelmä-DNA-molekyylien tuottamiseen, sellaisten polypeptidien, joilla on hepatitis B-viruksen pinnan antigeenin antigeenisyyttä, tuottamiseksi. Lisäksi esitetään, että geenikappaleita, jotka käsittävät sekä HBsAg-proteiiniin liittyvän esiasteen ketjun että siihen liittyvän rakenteellisen geenin, voidaan leikata käyttämällä yhtä tai useampaa lukuisista restriktioendonukleaaseista ennen kloonaavan vektorin muodostamista tai sen aikana. Edelleen esitetään, että HBsAg-proteiinia koodaavaa rakenteellista geeniä edeltävä, 163 kodonin suuruinen esiaste tulisi leikata S-proteiinia koodaavan ketjun sisältävästä kloonaavasta kul-jettimesta, ennen kuin vektoria käytetään transformoi-miseen.European patent application no. 013 828-A1 states that nucleotide strands encoding a fragment of 163 amino acid residues (PreSr coding region) located in the HBV genome immediately before the S-protein coding region may also be included in those fragments used for the use of useful recombinant DNA molecules. to produce polypeptides having hepatitis B virus surface antigen antigenicity. It is further disclosed that gene fragments comprising both the HBsAg-associated precursor chain and the associated structural gene can be excised using one or more of a number of restriction endonucleases before or during the construction of the cloning vector. It is further suggested that the 163 codon precursor preceding the structural gene encoding the HBsAg protein should be excised from the cloning vehicle containing the S protein coding chain before the vector is used for transformation.
Eurooppalaisessa patenttihakemuksessa no. 072 318-82 kuvataan menetelmä HBsAgrn valmistamiseksi kasvattamalla sellaisella vektorilla transformoituja hiivasoluja, joka vektori käsittää hiivan replikonin, hiivan promoottorin sekä S-proteiinia koodaavan DNA-osan ja josta vektorista puuttuu erityisesti HBsAg-proteiinia koodaavaa rakenteellista geeniä edeltävä, 163 kodonin suuruinen esiaste. Samoin kuvataan HBsAg-antigeenin käsittävä rokote, sekä menetelmä HBsAg-antigeenin vasta-aineen saamiseksi puhdistamalla vasta-aine HBsAg-antigeeniä vastaan immunoitujen eläinten seerumista. Samoin kuvataan 14 - 18 nm:n antigeenipartik-keli, joka kykenee muodostamaan immuunikompleksin HBsAg:n vasta-aineen kanssa.European patent application no. 072 318-82 describes a method for producing HBsAgr by culturing yeast cells transformed with a vector comprising a yeast replicon, a yeast promoter, and a DNA portion encoding an S protein, and in particular a 163 codon precursor preceding a structural gene encoding an HBsAg protein. Also described is a vaccine comprising HBsAg antigen, and a method for obtaining an antibody to HBsAg antigen by purifying the antibody from the serum of animals immunized against HBsAg antigen. Also described is an antigen particle of 14 to 18 nm capable of forming an immune complex with an antibody to HBsAg.
Il 7 95726Il 7 95726
Julkaisussa Feitelson et ai., Virology, Voi. 130, sivut 75-90, 1983, todetaan, että monia pinnan antigeeniin liittyviä polypeptidejä voidaan koodata osittain PreS-proteiinia koodaavan ketjun puitteissa, esimerkiksi 24 000, 28 000, 32 000, 43 000 ja 50 000 daltonin poly-peptidit.In Feitelson et al., Virology, Vol. 130, pages 75-90, 1983, states that many surface antigen-related polypeptides can be partially encoded within the PreS protein coding chain, for example, 24,000, 28,000, 32,000, 43,000, and 50,000 dalton polypeptides.
Julkaisussa Laub et ai., J. Virol., Voi. 48, no 1, sivut 271-180, 1983, kuvataan simian-virukseen perustuva . varhaisen korvausvektorin muodostaminen, joka vektori käsittää HBsAg-antigeeniä koodaavan rakenteellisen geenin sekä välittömästi tätä rakenteellista geeniä edeltävän, 163 kodonin suuruisen esiasteketjun sekä tämän koodaavan ketjun ilmentäminen SV40-viruksella transformoiduissa CV-1-soluissa (COS-soluissa), jotka on transformoitu tällaisella vektorilla. Laub et ai. esittävät samoin, että HBsAg-antigeeniä ilmentyy enemmän sellaisissa COS-soluissa, jotka on transformoitu ainoastaan S-proteiinia koodaavan ketjun sisältävällä vektorilla kuin niissä COS-soluissa, joiden transformointiin käytetty vektori sisältää 163 kodonin suuruisen esiasteen välittömästi HBsAg-antigeeniä koodaavan rakenteellisen geenin edellä.In Laub et al., J. Virol., Vol. 48, No. 1, pages 271-180, 1983, is described as being based on simian virus. generation of an early replacement vector comprising a structural gene encoding an HBsAg antigen and a precursor chain of 163 codons immediately preceding that structural gene and expression of this coding chain in SV40-transformed CV-1 cells (COS cells) transformed with such a vector. Laub et al. also show that HBsAg antigen is expressed more in COS cells transformed with a vector containing only the S protein coding chain than in COS cells whose transformation vector contains a 163 codon precursor immediately upstream of the structural gene encoding HBsAg antigen.
JP-patentcihakemuksessa no. J5-8194-897-A (Takeda I), kuvataan HBV DNA (adw-alatyyppi), joka koodaa koko PreS-S -proteiinin polvpeptidiä sekä tämän rwa*n sisältävä vektori, ja tällä DNA :11a transformoitu isäntä. JP-patenttihakemuksessa no. J5-9080-615-A (Takeda II), kuvataan HBV DNA (adw-alatyyppi), joka koodaa koko PreS-S -proteiinin polvpeptidiä , sekä tällä DNA:11a tuotettu polypeptidi ja sen käyttö rokotteena. JP-patenttihakemuksessa no. J5-9074-985-A (Takeda III) kuvataan DNA-kappale, joka sisältää yhden tai useamman, koko adw-tyypin PreS-S -proteiinia koodaavan ketjun, S-proteiinia 8 95726 koodaavan ketjun tai hepatitis B-viruksen ytimen antigeeniä (HBcAg) koodaavan ketjun, tällaista DNA:ta sisältävän vektorin, sekä tällä DNA:11a transformoidut isäntäsolut.JP patent application no. J5-8194-897-A (Takeda I) describes HBV DNA (adw subtype) encoding the entire PreS-S protein polypeptide and a vector containing this rwa *, and a host transformed with this DNA. In JP patent application no. J5-9080-615-A (Takeda II) describes HBV DNA (adw subtype) encoding the entire PreS-S protein polypeptide, as well as the polypeptide produced by this DNA and its use as a vaccine. In JP patent application no. J5-9074-985-A (Takeda III) describes a DNA fragment containing one or more chains encoding the entire adw-type PreS-S protein, a chain encoding S protein 8 95726, or a hepatitis B virus core antigen (HBcAg ), a vector containing such DNA, and host cells transformed with this DNA.
Takeda III -julkaisussa todetaan, että PreS-S -proteiinin koodaavan ketjun koodaamaa 43 000 daltonin polypeptidiä "voidaan käyttää rokotteena HBV-infektioiden ehkäisemiseksi". Takeda III -julkaisussa kuvataan PreS-S -proteiinia koodaavan ketjun kloonaaminen E. coli -bakteeriin sekä tämän ketjun tuottaman polypeptidin tunnistaminen.Takeda III states that the 43,000 dalton polypeptide encoded by the PreS-S protein coding chain "can be used as a vaccine to prevent HBV infections". Takeda III describes the cloning of a chain encoding a PreS-S protein into E. coli and the identification of a polypeptide produced by this chain.
Gerlich esitti eurooppalaisen kliinisen mikrobiologian seuran "European Association of Clinical Microbiology" järjestämässä tilaisuudessa, Bolognassa, lokakuun 18. päivänä 1983, pitämässään esitelmässä, että HBV:n neljä mahdollista geeniä on päätelty kloonatun HBV-DNA:n DNA-ketjun perusteella; että HBV-viruksen pinnan proteiinien geeni (S-gee-ni) koostuu yhdestä keskeytymättömästä koodaavasta ketjusta, joka luetaan vähintään kolmeksi polypeptidiksi; että pääasiallisen proteiinin, P24, ja sen glykosyloituneen muodon, GP27, ketju alkaa S-geenin kolmannen säilyneen, luentaan liittyvän käynnistyssignaalin kohdalta; että vähäisemmät pinnan proteiinit, GP33 tai GP36, alkavat toisen käynnistyssignaalin kohdalta; että ainoastaan HBV:n P41-polypeptidi todennäköisesti käyttää S-geenin täysi-pituista koodaavaa ketjua; että P41 sisältää HBV:n pääasiallisen antigeenisen determinantin; ja että se on läsnä ainoastaan täydellisissä viruspartikkeleissa, muttei ylimääräisen pinta-antigeenin 20 nm:n partikkeleissa, joista nykyiset hepatitis B-rokotteet ovat peräisin.At a presentation given by the European Association of Clinical Microbiology in Bologna on 18 October 1983, Gerlich stated that four possible genes for HBV had been inferred from the DNA strand of cloned HBV DNA; that the HBV virus surface protein gene (S gene) consists of a single uninterrupted coding chain that is counted as at least three polypeptides; that the chain of the major protein, P24, and its glycosylated form, GP27, begins at the third conserved reading-related initiation signal of the S gene; that the smaller surface proteins, GP33 or GP36, start at the second trigger signal; that only the HBV P41 polypeptide is likely to use the full-length coding chain of the S gene; that P41 contains the major antigenic determinant of HBV; and that it is present only in complete viral particles, but not in the 20 nm particles of excess surface antigen from which current hepatitis B vaccines are derived.
Gerlich ei puutu esityksessään erityisesti P41-polypeptidin PreS^-alueeseen eikä siihen, että tämä PreS^-alue sisältää erityisesti antigeenisen determinantin, joka voisi olla käyttökelpoinen HBV-rokotteessa.Gerlich does not specifically address the PreS1 region of the P41 polypeptide or the fact that this PreS1 region specifically contains an antigenic determinant that could be useful in an HBV vaccine.
Julkaisussa Stibbe et ai., Develop. Biol. Standard, Voi.In Stibbe et al., Develop. Biol. Standard, Vol.
’ 54, sivut 33-43, 1983, joka esitettiin Ateenassa pidetyssä 9 95726 virusperäistä hepatitista käsittelevässä, toisessa WHO/IABS-symposiumissa: Standardization in Immunoprophylaxis of Infections by Hepatitis Viruses, Ateena, Kreikka, 1982, todetaan, että HBV:n infektoimien ihmisten seerumista eristetyn HBsAg-antigeenin 20 nm:n partikkelit sisältävät vähintään kolme vähäisempää proteiinia, GP33, GP36 ja P41, mikä on varmistettu elektroforeettisesti SDS-geelillä. Stibbe et ai. päättelevät, että GP33 ja GP36 eivät todennäköisesti ole HBV-rokotteen olennaisia komponentteja. Stibbe et ai. eivät puutu erityisesti P41-proteiinin PreS^-alueeseen tai siihen, että tämä alue sisältää erityisesti antigeenisen determinantin, joka voisi olla käyttökelpoinen HBV-rokotteessa.'54, pages 33-43, 1983, presented at the Second WHO / IABS Symposium on 9 95726 Viral Hepatitis in Athens: Standardization in Immunoprophylaxis of Infections by Hepatitis Viruses, Athens, Greece, 1982, states that HBV-infected people the 20 nm particles of serum HBsAg antigen contain at least three minor proteins, GP33, GP36, and P41, as confirmed by electrophoresis on an SDS gel. Stibbe et al. conclude that GP33 and GP36 are unlikely to be essential components of the HBV vaccine. Stibbe et al. do not specifically interfere with the PreS1 region of the P41 protein or that this region specifically contains an antigenic determinant that could be useful in an HBV vaccine.
Julkaisussa Stibbe et ai., J. Virol., Voi. 46, no. 2, sivut 626-628, 1983, esitetään, että HBsAg-antigeenin koodaavasta alueesta peräisin olevia vähäisiä glykoproteiineja, joista käytetään lyhenteitä GP33 ja GP36, koodaa PreS2-S-proteiinin koodaava ketju. PreS2-alue on osa PreS-koodaavaa aluetta hepatitis B-viruksen genomissa, ja se koodaa ensimmäistä 55 aminohappoa välittömästi ennen S-proteiinia.In Stibbe et al., J. Virol., Vol. 46, no. 2, pages 626-628, 1983, discloses that minor glycoproteins derived from the coding region of the HBsAg antigen, abbreviated GP33 and GP36, are encoded by the PreS2-S protein coding chain. The PreS2 region is part of the PreS coding region in the hepatitis B virus genome and encodes the first 55 amino acids immediately before the S protein.
Julkaisussa Neurath et ai., Science, 224, sivut 392-394, 1984, esitetään, että polypeptidi, jonka järjestys on identtinen PreS2~alueen aminopäätteessä olevien 26 aminohapon kanssa, toimii erittäin tehokkaana immunogeeninä, ja julkaisussa ehdotetaan, että tämän immunogeenin vaikutuksesta muodostuneita vasta-aineita voidaan käyttää diagnostisissa kokeissa.Neurath et al., Science, 224, pp. 392-394, 1984, discloses that a polypeptide having an sequence identical to the 26 amino acids at the amino terminus of the PreS2 region acts as a highly potent immunogen, and suggests that antibodies formed by this immunogen substances can be used in diagnostic tests.
Julkaisussa Heerman et ai., J. Virol., Voi. 52, no. 2, sivut 396-402, 1984, kuvataan sekä S-proteiinia koodaavan ketjun että PreS-proteiinia koodaavan ketjun sisältävä, 389 aminohappoa koodaava koko ketju, joka koodaa luonnosta saaduissa HBV-partikkeleissa sekä viruksen pinnan antigeeni-rihmoissa esiintyvää polypeptidiä P39, sen glykosyloituneen 95726 muodon G?42 ohella, sekä muita HSV-viruksen pinnan antigeeniin liittyviä polypeptidejä P24, GP27, GP33 ja GP36. Heerman et ai. esittävät samoin, että P39/P42-proteiinin ainutlaatuinen osa eli sen PreS^-alue, sitoi monoklonaa-lisia vasta-aineita, jotka oli indusoitu HBV-partikkeleil-la immunoimalla. He esittävät, että tämä PreS^-alue on todennäköisesti erittäin immunogeeninen. PreS^-alue on PreS-proteiinia koodaavan alueen se osa, joka sijaitsee välittömästi ennen PreS2-a.lue tta, ja se käsittää aminohappoja 1-108 (tai 1-122, viruksen alatyypistä riippuen) koodaavat ketjut, jotka aminohapot muodostavat välittömästi PreS2~proteiinia koodaavaa ketjua edeltävän pätkän. Heerman et ai. toteavat samoin, että PreS-alueen ketjut saattavat olla mielenkiintoisia etsittäessä HBV-virusta vastaan vaikuttavana, vaihtoehtoisena rokotteena toimivia, immunogee-nisia ja suojaavia poly- tai oligopeptidejä.In Heerman et al., J. Virol., Vol. 52, no. 2, pages 396-402, 1984, describes the entire 389 amino acid coding chain containing both the S protein coding chain and the PreS protein coding chain, encoding polypeptide P39 present in naturally occurring HBV particles and viral surface antigen strands, its glycosylated 95 in addition to Form G? 42, as well as other HSV surface antigen-related polypeptides P24, GP27, GP33 and GP36. Heerman et al. also show that a unique part of the P39 / P42 protein, i.e. its PreS1 region, bound monoclonal antibodies induced by immunization with HBV particles. They suggest that this PreS 2 region is likely to be highly immunogenic. The PreS2 region is the portion of the PreS protein coding region immediately preceding the PreS2 domain and comprises chains encoding amino acids 1-108 (or 1-122, depending on the virus subtype) that amino acids immediately form in PreS2 ~. a fragment preceding the chain encoding the protein. Heerman et al. also note that the chains of the PreS region may be of interest in the search for immunogenic and protective poly- or oligopeptides that act as an alternative vaccine against HBV.
Julkaisussa Michel et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA,In Michel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S,
Voi. 81, sivut 7708-7712, 1984, esitetään ihmisseerumin polyalbumiinin reseptoreita kantavan HBsAg-antigeenin synteesi kiinanhamsterin munasarjasoluissa (CHO-soluissa), jotka on transfektoitu PreS2~S-proteiinia koodaavan ketjun käsittävällä plasmidilla.Butter. 81, pages 7708-7712, 1984, discloses the synthesis of HBsAg antigen carrying human serum polyalbumin receptors in Chinese hamster ovary (CHO) cells transfected with a plasmid comprising the chain encoding the PreS2-S protein.
Julkaisussa Cattaneo et ai., Nature, Voi. 305, sivut 335-338, 1985, esitetään, että HBV-genomin S-geeni käynnistää luennan PreS-alueen alussa (eli 489 nukleotidiä tai 163 kodonia ylävirran puolella S-geenistä), ja mRNA muokkau-tuu/polyadenyloituu eräässä kohdassa tämän ydingeenin sisällä.In Cattaneo et al., Nature, Vol. 305, pages 335-338, 1985, discloses that the S gene of the HBV genome initiates reading at the beginning of the PreS region (i.e., 489 nucleotides or 163 codons upstream of the S gene), and that the mRNA is modified / polyadenylated at a site within this core gene. .
Julkaisussa Persing et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA,In Persing et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S,
Voi. 82, sivut 3440-3444, 1985, esitetään, että PreS2“S-proteiinia koodaavalla ketjulla transformoidut hiiren L-solut tuottavat kolmea, HBsAg-antigeeniin liittyvää poly-peptidiä, joiden molekyylipainot ovat 24 000, 27 000 ja 35 000 daltonia, ja jotka kaikki ovat järjestäytyneet moni- 11 11 95726 mutkaisiksi immunoreaktiiviksi HBsAg-partikkeleiksi, joiden halkaisija on 22 nm, ja jotka sitoutuvat polymeroituun ihmisseerumin albumiiniin (HSA; human serum albumin); kun taas PreS2~alueen 3"-pään läheisyydessä kehyssiirtymämutaa-tion käsittävällä, PreS2~S-proteiinia koodaavalla ketjulla transformoidut hiiren L-solut tuottavat pelkästään 24 000 ja 27 000 daitonin polypeptidejä, jotka ovat järjestäytyneet halkaisijaltaan 22 nm:n suuruisiksi, immunoreaktii-visiksi HBsAg-partikkeleiksi, jotka eivät kykene sitoutumaan ihmisseerumin albumiiniin. Persing et ai. päättelevät, että PreS2-S-proteiinia koodaava ketju koodaa 35 000 daitonin polypeptidiä; PreS2~proteiinia koodaava osa saa aikaan HBsAg-antigeenin kyvyn sitoutua ihmisseerumin albumiiniin, mutta sitä ei tarvita HBsAg-partikkeleiden muodostumiseen ja erittymiseen; ja että HBsAg-antigeenin hallitsevaa po-pypeptidiä (eli 24 000 daitonin polypeptidiä) ei saada pääasiallisesti PreS2~S-proteiinia koodaavan ketjun koodaamia, suurempia esiasteita (eli 27 000 ja 35 000 daitonin polypeptidejä) pilkkomalla.Butter. 82, pages 3440-3444, 1985, discloses that mouse L cells transformed with the chain encoding the PreS2 “S protein produce three HBsAg antigen-related polypeptides with molecular weights of 24,000, 27,000, and 35,000 daltons, and which all are organized into multifilament immunoreactive HBsAg particles 22 nm in diameter that bind to polymerized human serum albumin (HSA; human serum albumin); whereas, in the vicinity of the 3 "end of the PreS2 region, mouse L cells transformed with a chain encoding a PreS2-S protein encoding a framework transition mutation produce only 24,000 and 27,000 daiton polypeptides organized into 22 nm diameter immunoreactions. Persing et al conclude that the PreS2-S protein coding chain encodes a 35,000 daiton polypeptide, the PreS2 protein coding moiety conferring the ability of the HBsAg antigen to bind to human serum albumin, but does not require it. For the formation and secretion of HBsAg particles, and that the HBsAg antigen-dominant polypeptide (i.e., a 24,000 daiton polypeptide) is not obtained by cleavage of larger precursors (i.e., 27,000 and 35,000 daiton polypeptides) encoded primarily by the PreS2-S protein coding chain.
Julkaisussa Milich et ai., Science, Voi. 228, sivut 1195-1199, 1985, esitetään, että rokotteilla, jotka sisältävät sekä PreS2-että HBsAg-aminohappoja käsittäviä HBsAg-partik-keleita, jotka HBsAg-partikkelit olivat erittyneet PreS2-S-proteiinia koodaavan ketjun sisältävällä plasmidilla trans-fektoiduista kiinanhamsterin munasarjasoluista (CHO-soluis-ta), voidaan välttää epäreaktiivisuus pelkkää HBsAg:ta sisältäville rokotteille, koska HBsAgm aiheuttama immuno-geeninen reaktio ei riipu PreS2:n aiheuttamasta immunogee-nisestä reaktiosta ja että PreS2-S-proteiinin koodaavan ketjun koodaaman 33 000 daitonin suuruisen polypeptidin aminopäätteessä olevat 26 aminohappojäännöstä muodostavat vasta-aineiden hallitseman sitoutumiskohdan PreS^-alueessa.In Milich et al., Science, Vol. 228, pages 1195-1199, 1985, discloses that vaccines containing HBsAg particles comprising both PreS2 and HBsAg amino acids, which HBsAg particles were secreted from a Chinese hamster ovary transfected with a plasmid containing a chain encoding the PreS2-S protein, (CHO cells), inactivity to HBsAg-only vaccines can be avoided because the immunogenic response induced by HBsAgm is independent of the immunogenic response elicited by PreS2 and that the 33,000 daiton polypeptide encoded by the PreS2-S protein coding chain the 26 amino acid residues at the amino terminus form an antibody-bound binding site in the PreS1 region.
Julkaisussa Neurath et ai., Nature, Voi. 315, sivut 154-156, 1985 esitetään, että PreS2-alue koodaa HBV-kotelon pinnan 12 95726 proteiinia, jonka immunologisia alueita (domain) erityisesti maksasolut tunnistavat; PreS2~S-proteiinia koodaava ketju koodaa HBV-partikkeleissa läsnäolevaa proteiinia; PreS2~proteiinia koodaavaa geeniä vastaavat synteettiset peptidit ovat erittäin immunogeenisiä ja julkaisussa päätellään, että HBV-rokotteiden tulisi sisältää PreS2~pro-teiinia.In Neurath et al., Nature, Vol. 315, pages 154-156, 1985, discloses that the PreS2 region encodes a HBV envelope surface 12,957,726 protein, the immunological regions of which are specifically recognized by liver cells; The chain encoding the PreS2-S protein encodes a protein present in HBV particles; The synthetic peptides corresponding to the gene encoding the PreS2 protein are highly immunogenic and the publication concludes that HBV vaccines should contain the PreS2 protein.
Valenzuela julkaisi toukokuun 15. päivänä 1985 Bostonissa pidetyssä Bio-Expo-5 -kongressissa koko PreS2-proteiinia koodaavan ketjun ilmentämisen hiivassa ja hän esitti, että tällaiset hiivasolut todellakin syntetoivat sekä HBsAg-että PreS2~peptidiä sisältäviä partikkeleita, jotka ovat elektronimikroskopian ja laskeumaominaisuuksiensa perusteella hyvin samankaltaisia kuin pelkästään HBsAg:tä sisältävät partikkelit, ja ettei PreS2~alue häiritse kykyä muodostaa 22 nanometrin HBsAg-partikkeleita. Valenzuela esittää samoin, että on esitetty hypoteesi, että HBV joutuu maksaan sitomalla polyalbumiinia polyalbumiinin reseptoriinsa, joka polyalbumiini puolestaan sitoutuu maksassa olevaan polyalbumiinin reseptoriin, jolloin virus sisäistyy. PreS2~alue koodaa HBV-viruksen polyalbumiinin reseptoria. Valenzuela päättelee, että PreS2:ta sisältävä proteiini saa aikaan vasta-aineita, jotka sen lisäksi, että ne inaktivoivat HBV-virusta normaalilla mekanismilla, saattavat vaikuttaa siihen mekanismiin, jonka avulla virus tunkeutuu maksasoluihin. Katso myös julkaisua Valenzuela et ai., Biotechnology, Voi. 3. sivut 317-320, 1985.At the Bio-Expo-5 Congress in Boston on May 15, 1985, Valenzuela published the expression of the entire PreS2 protein coding chain in yeast, and he argued that such yeast cells indeed synthesize particles containing both HBsAg and PreS2 peptide, which are well found by electron microscopy and deposition. similar to HBsAg-only particles, and the PreS2 region does not interfere with the ability to form 22-nanometer HBsAg particles. Valenzuela also argues that it has been hypothesized that HBV enters the liver by binding polyalbumin to its polyalbumin receptor, which in turn binds to the polyalbumin receptor in the liver, thereby internalizing the virus. The PreS2 region encodes the HBV polyalbumin receptor. Valenzuela concludes that the PreS2-containing protein produces antibodies that, in addition to inactivating the HBV virus by a normal mechanism, may affect the mechanism by which the virus invades liver cells. See also Valenzuela et al., Biotechnology, Vol. 3. pp. 317-320, 1985.
Julkaisussa Valenzuela et ai., Biotechnology, Voi. 3, sivut 323-327, 1985, esitetään PreS2~proteiinin koodaavan alueen koodaaman, HBsAg-antigeeniin liittyvän polyalbumiinin reseptorin käyttö moniarvoisten rokotteiden valmistamiseksi. Valenzuela valmisti hybridipartikkelin HBsAg-an-tigeenistä ja ja Herpes simplex 1-viruksen glykoproteiinis-ta D (HSV1gD) ilmentämällä koko HSV1gD-PreS2~S-proteiinia koodaavan ketjun hiivassa.In Valenzuela et al., Biotechnology, Vol. 3, pages 323-327, 1985, discloses the use of the HBsAg antigen-associated polyalbumin receptor encoded by the PreS2 protein coding region for the preparation of polyvalent vaccines. Valenzuela prepared a hybrid particle from the HBsAg antigen and and from Herpes simplex 1 virus glycoprotein D (HSV1gD) by expressing the entire HSV1gD-PreS2-S protein coding chain in yeast.
I! 95726 1 3I! 95726 1 3
Eurooppalaisessa patenttihakemuksessa no. 0 154 902-A2 kuvataan hepatitis B -rokote, jonka sisältämä peptidi käsittää vähintään kuudesta, peräkkäisestä, hepatitis-B-viruksen kotelossa PreS-geenin koodaamaan alueeseen kuuluvasta aminohaposta muodostuvan aminohappoketjun.European patent application no. 0 154 902-A2 describes a hepatitis B vaccine comprising a peptide comprising an amino acid chain of at least six contiguous amino acids belonging to the region encoded by the PreS gene in the housing of the hepatitis B virus.
Tämä rokote ei sisällä aminohappoketjuja, jotka vastaavat hepatitis B -viruksen luonnossa esiintyviä kotelo-proteiineja, eikä fysiologisesti hyväksyttävää laimen-ninta. Peptidi voi olla vapaana tai se on voitu kytkeä kantajaan.This vaccine does not contain amino acid chains corresponding to the naturally occurring envelope proteins of the hepatitis B virus, nor a physiologically acceptable diluent. The peptide may be free or may be coupled to a carrier.
Julkaisussa Kent et ai., Pept. Chem., Voi. 22, sivut 167-70, 1984, esitetään , että kemiallisesti svntetoitu peptidi, joka käsittää N-päätteen 26 aminohappoa PreS2~slueesta, on erittäin hyvä antigeeni, ja että se on synteettisen rokotteen eräs mahdollisuus.In Kent et al., Pept. Chem., Vol. 22, pages 167-70, 1984, discloses that a chemically synthesized peptide comprising 26 amino acids of the N-terminus from the PreS2 region is a very good antigen and that it is a possibility for a synthetic vaccine.
Julkaisussa Lo et ai., Biochem. Biophys. Res. Conun. ,In Lo et al., Biochem. Biophys. Res. CONUN. ,
Voi. 129, no 3, sivut 797-803, 1985, esitetään HBV-vi-ruksen eri alatyyppien (adw, adr, ayw ja ayw) tapauksessa täysipituisesta HBV DNA:sta restriktioendonukleaaseilla saadun kartan tunnusomaiset piirteet, mukaan lukien koko PreS-alueesta restriktioendonukleaaseilla saadun kartan tunnusomaiset piirteet. Lo et ai. julkaisevat samoin täysipituisen HBV DNA:n kloonaamisen ja ilmentämisen E. coli-bakteerissa käyttäen ilmentämisvektoria pUC8 ja he toteavat, että heidän aikomuksenaan on käyttää tällaista HBV-geenin tuotetta, joka on ilmennetty joko prokari-oottisissa tai eukarioottisissa soluissa, diagnostisena aineena sekä rokotelähteenä.Butter. 129, No. 3, pages 797-803, 1985, for the different subtypes of HBV virus (adw, adr, ayw and ayw), show the characteristics of a map obtained from full-length HBV DNA with restriction endonucleases, including a map obtained from the entire PreS region with restriction endonucleases. characteristic features. Lo et al. also disclose the cloning and expression of full-length HBV DNA in E. coli using the expression vector pUC8 and state that they intend to use such an HBV gene product expressed in either prokaryotic or eukaryotic cells as a diagnostic agent and vaccine source.
Julkaisussa Wong et ai., J. Virology, Voi. 55, no 1, sivut 223-231, 1985, esitetään PreS-proteiinin koko avoimen lukukehyksen koodaaman kahden HBV-polypeptidin eli 42 ja 46 kilodaltonin glykosyloidun polypeptidin tunnistaminen, jotka polypeptidit sisältävät determinant- 14 95726 teja sekä HBsAg- että PreS -alueesta. Wong et ai. esittävät samoin kolminkertaisen fuusioproteiinin ilmentämisen, joka fuusioproteiini sisältää 108 N-päätteen aminohappoja 27-133 vastaavaa aminohappoa PreS-alueen 174 aminohaposta (adv^-alatyyppi) sekä β-galaktosidaasin ja kloramfenikoli-asetylitransferaasin ketjut. Tämä peptidi sisältää 15 aminohappoa PreS2~alueesta ja 93 aminohappoa PreS^-alueesta. Wong et ai. esittävät samoin, että (a) tämän kolminkertaisina fuusioproteiinin vaikutuksesta muodostunut polyklonaalinen antiseerumi kykeni tunnistamaan 42 ja 46 kilodaltonin polypeptidit osittain puhdistettujen viruspartikkeleiden preparaateista, sekä (b) glykosyloituneet 42 ja 46 kilodaltonin polypeptidit tuntuvat vastaavan edellä mainitussa Heermanin et ai. julkaisussa kuvattuja 39 ja 42 kilodaltonin glykosyloi-mattomia polypeptidejä.In Wong et al., J. Virology, Vol. 55, No. 1, pages 223-231, 1985, discloses the identification of two HBV polypeptides encoded by the entire open reading frame of the PreS protein, i.e., 42 and 46 kilodaltons of glycosylated polypeptides, which polypeptides contain 14,957,726 determinants from both the HBsAg and PreS regions. Wong et al. also show the expression of a triple fusion protein containing 108 amino acids corresponding to amino acids 27-133 of the N-terminus of the 174 amino acids of the PreS region (adv ^ subtype) and the β-galactosidase and chloramphenicol acetyltransferase chains. This peptide contains 15 amino acids from the PreS2 region and 93 amino acids from the PreS2 region. Wong et al. also show that (a) the polyclonal antiserum formed by this triple fusion protein was able to recognize 42 and 46 kilodalton polypeptides from preparations of partially purified viral particles, and (b) the glycosylated 42 and 46 kilodalton polypeptides appear to correspond to the aforementioned Heerman et al. the 39 and 42 kilodalton non-glycosylated polypeptides described in the publication.
Julkaisussa Offensperger et ai., Proc. Natl. Acad. Sei.In Offensperger et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, Voi. 82, sivut 7540-7544, 1985, esitetään PreS2~ peptidin ja β-galaktosidaasin välistä fuusioproteiinia koodaavan kloonatun DNA-ketjun ilmentäminen E. coli-soluissa.USA, Vol. 82, pages 7540-7544, 1985, discloses the expression of a cloned DNA strand encoding a fusion protein between a PreS2 peptide and a β-galactosidase in E. coli cells.
Lukuisissa kirjallisuusviitteissä tarkastellaan plasmideja, jotka sisältävät hiiren metallotioneiinigeenin promoottorin .Numerous literature references consider plasmids containing the promoter of the mouse metallothionein gene.
Sekä US-patenttihakemuksessa no. 452 783 että julkaisussa Pavlakis et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Voi. 80, sivu 397, 1983, esitetään naudan papillomavirukseen perustuva yhdistelmäplasmidi, joka sisältää ihmisen kasvuhormonin (hGH) geenin sekä metallotioneiinigeenin (MMT) promoottorin.As well as in U.S. Patent Application no. 452,783 that Pavlakis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 80, page 397, 1983, discloses a recombinant plasmid based on bovine papillomavirus containing the human growth hormone (hGH) gene and the metallothionein gene (MMT) promoter.
: Eurooppalaisessa patenttihakemuksessa no EP 0 105 141A2 esitetään yhdistelmäplasmidit, jotka sisältävät S-prote- 1 is 95726 iinia koodaavan ketjun ja joko naudan papillomavirus-tyypin 1 DNA:n tai Maloney-hiiren sarkoomaviruksen DNA:n.: European Patent Application No. EP 0 105 141A2 discloses recombinant plasmids comprising a chain encoding S-protein 95726 and both bovine papillomavirus type 1 DNA or Maloney mouse sarcoma virus DNA.
Hofschneiderin et ai. julkaisemissa plasmideissa käytetään mieluiten luonnollista, S-proteiinia koodaavaan ketjuun liittyvää promoottoria, mutta Hofschneider-viitteessä mainitaan myöskin (esimerkkiä kuitenkaan esittämättä), että "/eräänä7 muuna esimerkkinä edullisesta luonnollisesta eukarioottisesta ilmentämissignaalista voidaan mainita metallotioneiinisignaali hiirisoluista".Hofschneiderin et al. plasmids preferably use a natural promoter linked to the S-protein coding chain, but the Hofschneider reference also states (without giving an example) that "/ as another example of a preferred natural eukaryotic expression signal, a metallothionein signal from a mouse cell" may be mentioned.
Eurooppalaisessa patenttihakemuksessa no. 0 096 492A2 esitetään koko metallotioneiinigeenin ketjun, promoottorialue mukaan lukien, sisältävien plasmidien käyttö MMT-geenin suhteen alavirran puolella sijaitsevien geenien voimakkaan ilmentymisen aikaansaamiseksi isäntinä toimivissa, tällaisella plasmidilla transformoiduissa nisäkäs-soluissa .European patent application no. 0 096 492A2 discloses the use of plasmids containing the entire metallothionein gene chain, including the promoter region, to induce strong expression of genes downstream of the MMT gene in host mammalian cells transformed with such a plasmid.
PCT-patenttihakemuksessa no WO 83/01783 sekä julkaisussa Palmiter et ai., Cell, Voi. 29, sivu 701, 1982, esitetään plasmidi, joka käsittää hiiren MT-1-geenin promoottorin, joka promoottori on sulautettu yhteen rakenteellisen geenin kanssa (mieluiten tymidiinikinaasin geeniin herpes simplex-viruksesta) sekä näiden plasmidien mikroinjektoiminen hiiri-sikiöihin ja siinä todetaan, että tuloksena olevan yhteen-sulautetun polypeptidituotteen geneettistä . ilmentymistä näistä sikiöistä muodostuneiden täysikasvuisten hiirien erikoistuneissa soluissa voidaan tämän jälkeen säädellä antamalla hiirelle raskasmetallien ioneja. Palmiter et ai. julkaisevat samoin plasmidit, jotka sisältävät rotan kasvuhormoniin yhteensulautetun hiiren MT-1-promoottorin, näiden plasmidien mikroinjektoimisen hiirisikiöihin sekä tuloksena olevan yhteensulautetun polypeptidituotteen geneettisen ilmentymisen säätelyn raskasmetalleja anta-- maila.PCT Patent Application No. WO 83/01783 and Palmiter et al., Cell, Vol. 29, page 701, 1982, discloses a plasmid comprising a promoter of the murine MT-1 gene fused to a structural gene (preferably a thymidine kinase gene from herpes simplex virus) and microinjection of these plasmids into mouse fetuses and states that the result genetic of the fusion polypeptide product. expression in specialized cells of adult mice formed from these fetuses can then be regulated by administering heavy metal ions to the mouse. Palmiter et al. likewise disclose plasmids containing the murine MT-1 promoter fused to rat growth hormone, microinjection of these plasmids into mouse fetuses, and heavy metals for regulating the genetic expression of the resulting fused polypeptide product.
95726 16 Tässä keksinnössä hyödynnetään yhdistelmä-DNA-tekniikalla valmistettua partikkelia, joka käsittää vähintään yhden, koko PreS^PreSj-proteiinin koodaavan alueen koodaaman proteiinin.95726 16 The present invention utilizes a recombinant particle comprising at least one protein encoded by the entire PreS1 PreSj coding region.
Tässä keksinnössä käytetään samoin yhdistelmä-DNA-vektoria, joka käsittää PreS,-PreS2-proteiinia koodaavan alueen sekä hiiren metallotioneiini (MMT) -promoottorin. On suotavaa, että tämä vektori käsittää lisäksi kopioitumisen päättymis-kohdan sekä valikoinnin merkits imen.The present invention also uses a recombinant DNA vector comprising the PreS, PreS2 protein coding region and the mouse metallothionein (MMT) promoter. It is desirable that this vector further comprises a copy termination site and a selection marker.
Tässä keksinnössä käytetään samoin isäntänä toimivaa trans-fektoitua eukarioottista solua, joka on transfektoitu PreS,-PreS2-proteiinia koodaavan alueen ja MMT-promoottorin käsittävällä yhdistelmä-DNA-vektorilla. On suositeltavaa, että tähän vektoriin sisältyy lisäksi kopioitumisen päättymiskoh-ta sekä valikoinnin merkitsin. Nisäkässolu on paras isäntä. Esitetään lisäksi menetelmä tällaisen transfektoidun, isäntänä toimivan solun valmistamiseksi, joka menetelmä käsittää eukarioottisen solun transfektoimisen tämän keksinnön mukaisella yhdistelmä-DNA-vektorilla.The present invention also uses a host-transfected eukaryotic cell transfected with a recombinant DNA vector comprising the PreS, PreS2 protein coding region and the MMT promoter. It is recommended that this vector further include a copy termination site and a selection marker. The mammalian cell is the best host. Also provided is a method of producing such a transfected host cell, the method comprising transfecting a eukaryotic cell with a recombinant DNA vector of the present invention.
Esitetään samoin menetelmä vähintään yhden, koko PreS,-PreS2-proteiinin koodaavan alueen koodaaman proteiinin käsittävien partikkeleiden valmistamiseksi, joka menetelmä käsittää (a) tämän keksinnön mukaisten, transfektoitujen, isäntänä toimivien eukarioottisten solujen viljelemisen sellaisissa vilje-lyalustassa vallitsevissa olosuhteissa, että tämä isäntä kykenee ilmentämään tällaista proteiinia; ja (b) näiden partikkeleiden eristämisen. Transfektoitu isäntä kykenee mieluiten erittämään näiksi partikkeleiksi kasaantuneet proteiinit kasvualustaan. Tämä menetelmä käsittää mielellään lisäksi raskasmetallien ionien tai steroidihormonien lisäämisen tällaiseen viljelyalustaan, mikä edistää proteiinien ilmentymistä.Also provided is a method of making particles comprising at least one protein encoded by the entire PreS1-PreS2 coding region, the method comprising (a) culturing the transfected host eukaryotic cells of this invention under conditions such as that of the host. such a protein; and (b) isolating these particles. Preferably, the transfected host is capable of secreting proteins accumulated into these particles into the medium. This method preferably further comprises adding heavy metal ions or steroid hormones to such a culture medium, which promotes the expression of proteins.
Tämä keksintö kohdistuu menetelmään PreS^PreSj-proteiinin koodaavan alueen koodaamia proteiineja vastaan vaikuttavien 17 95726 vasta-aineiden läsnäolon toteamiseksi nisäkkään veriseerumista saadussa näytteessä, tämän menetelmän käsittäessä vaiheet, joissa: a) näyte saatetaan kosketuksiin tämän keksinnön mukaisilla, merkitsemättömillä partikkeleilla pinnoitetun kiinteän substraatin kanssa; b) mainittua kosketuksiin saatettua näytettä inkuboidaan ja se pestään; c) mainittu kosketuksiin saatettu näyte saatetaan kosketuksiin tämän keksinnön mukaisten, merkittyjen partikkeleiden kanssa, jolloin saadaan merkitty, kosketuksiin saatettu näyte; d) mainittua merkittyä, kosketuksiin saatettua näytettä inkuboidaan ja se pestään; ja e) merkittyjen partikkeleiden määrä merkityssä, kosketuksiin saatetussa näytteessä määritetään.This invention relates to a method for detecting the presence of 17,957,26 antibodies to proteins encoded by the PreS1 PreSj protein coding region in a sample obtained from mammalian blood serum, the method comprising the steps of: a) contacting the sample with an unlabeled particle coated solid of the invention; (b) incubating and washing said contacted sample; c) contacting said contacted sample with the labeled particles of this invention to obtain a labeled, contacted sample; d) incubating and washing said labeled, contacted sample; and e) determining the number of labeled particles in the labeled, contacted sample.
Tämä keksintö kohdistuu samoin menetelmään PreS^PreSj-S-proteiinin koodaavan alueen koodaamien proteiinien läsnäolon toteamiseksi nisäkkään veriseerumista saadussa näytteessä, tämän menetelmän käsittäessä vaiheet, joissa: a) valmistetaan seos, joka sisältää tämän keksinnön mukaisten partikkeleiden käsittämän immunogeenin tuottamaa vasta-ainetta; b) näyte saatetaan kosketuksiin tämän seoksen ensimmäisen osan sekä merkityn immunogeenin kanssa, tätä ensimmäistä osaa inkuboidaan ja se pestään; c) antigeeniä sisältämätön vertailunäyte saatetaan kosketuksiin tämän seoksen toisen osan sekä merkityn immunogeenin kanssa, tätä toista osaa inkuboidaan ja se pestään; d) edellisten vaiheiden b) ja c) seoksiin lisätään sama määrä proteiinia A käsittävää stafylokokkia, molempia seoksia inkuboidaan ja neste erotetaan kiintoaineesta; ja e) merkityn immunogeenin määrä kummassakin, edellä esitetyssä vaiheessa d) tuloksena olevassa seoksessa määritetään.The present invention also relates to a method for detecting the presence of proteins encoded by the PreS1-PreSj-S coding region in a sample obtained from mammalian blood serum, the method comprising the steps of: a) preparing a composition comprising an antibody produced by an immunogen comprising the particles of the invention; (b) contacting the sample with the first portion of this mixture and the labeled immunogen, incubating the first portion and washing; (c) contacting the antigen-free reference sample with the second portion of this mixture and the labeled immunogen, incubating the second portion and washing; d) adding the same amount of staphylococcus comprising protein A to the mixtures of steps b) and c) above, incubating both mixtures and separating the liquid from the solid; and e) determining the amount of labeled immunogen in each of the resulting mixtures in step d) above.
Tämä keksintö kohdistuu samoin käyttövalmiiden diagnostisten aineiden pakkaukseen ("kitti") PreS,-PreS2-S-proteiinin koo- . 95726 18 daavan alueen koodaamia proteiineja vastaan vaikuttavien vasta-aineiden läsnäolon ilmaisemiseksi nisäkkään veriseerumista saadusta näytteestä tämän kitin käsittäessä: a) merkitsemättömiä proteiineja, jotka käsittävät tämän keksinnön mukaisen, kiinteään kantajaan kiinnitetyn partikkelin; ja b) ihmisen IgG:tä tai IgM:ää, esimerkiksi, vastaan vaikuttavia, merkittyjä vasta-aineita.The present invention is also directed to the packaging ("putty") of ready-to-use diagnostic agents for the PreS, PreS2-S protein. 95726 for detecting the presence of antibodies to proteins encoded by the 18-region region from a sample obtained from mammalian blood serum, the kit comprising: a) unlabeled proteins comprising a particle of the present invention attached to a solid support; and b) labeled antibodies against human IgG or IgM, for example.
Tämä keksintö kohdistuu samoin diagnostiseen kittiin PreS,-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen koodaamien proteiinien läsnäolon ilmaisemiseksi nisäkkään veriseerumista saadusta näytteestä tämän kitin käsittäessä: a) tämän keksinnön mukaisten partikkeleiden tuottamia, kiinteään kantajaan kiinnitettyjä vasta-aineita; ja b) tämän keksinnön mukaisten partikkeleiden tuottamia, merkittyjä vasta-aineita.The present invention is also directed to a diagnostic kit for detecting the presence of proteins encoded by the coding region of the PreS, PreS2-S protein from a sample obtained from mammalian blood serum, said kit comprising: a) antibodies supported by the particles of this invention attached to a solid support; and b) labeled antibodies produced by the particles of this invention.
Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa .The essential features of the invention are set out in the appended claims.
Tässä keksinnössä käytetään yhteistransfektoitua eukarioot-tista isantäsolua, joka on transfektoitu sekä tässä esitetyllä yhdistelmä-DNA-vektorilla että toisella yhdistelmä-DNA-vektorilla, joka käsittää PreS2-S-proteiinia koodaavan alueen tai pelkästään S-proteiinia koodaavan alueen sekä MMT-promoottorin. Tämä toinen yhdistelmävektori käsittää mielellään lisäksi kopioitumisen päättymiskohdan sekä valinnaisesti valikoinnin merkitsimen. Valinnaisesti tämä yhteistransf ektoitu isäntä on transfektoitu sekä tämän keksinnön mukaisella yhdistelmä-DNAvektorilla, toisella yhdistelmä-DNA-vektorilla että kolmannella yhdistelmä-DNA-vektorilla, joka käsittää MMT-promoottorin sekä valikoinnin merkitsimen. Tämä kolmas yhdistelmävektori käsittää mielellään lisäksi kopioitumisen päättymiskohdan.The present invention uses a co-transfected eukaryotic host cell transfected with both the recombinant DNA vector disclosed herein and another recombinant DNA vector comprising the PreS2-S protein coding region or the S protein-only coding region and the MMT promoter. This second recombinant vector preferably further comprises a copy end point and optionally a selection marker. Optionally, this co-transfected host is transfected with both a recombinant DNA vector of the present invention, a second recombinant DNA vector, and a third recombinant DNA vector comprising an MMT promoter and a selection marker. This third recombinant vector preferably further comprises an end point for copying.
Kuva l esittää plasmidin pBPV342-l2 osittaista restriktioen-donukleaaseilla saatua karttaa. Kuvassa 1 esitetään myös plasmidista pML2 peräisin olevan DNA:n, naudan papillooma- 19 95726 viruksen (BPV) DNA:n, MMT-promoottorin ja kopioinnin päätty-misalueen sv-PAS-t sijainti plasmidissa pBPV342-12. Kuva 1 esittää samoin plasmidin pBPV342-12 pilkkomista restriktio-endonukleaasilla BamHI.Figure 1 shows a partial map of plasmid pBPV342-12 obtained with restriction endonucleases. Figure 1 also shows the location of plasmid pML2-derived DNA, bovine papilloma virus (BPV) DNA, MMT promoter, and copy termination region sv-PAS-t in plasmid pBPV342-12. Figure 1 also shows the digestion of plasmid pBPV342-12 with the restriction endonuclease BamHI.
Kuva 2 esittää hepatitis B -viruksen täydellisen, lineaarisessa muodossa olevan genomin sisältävän plasmidin pAOl osittaista, restriktioendonukleaaseilla saatua karttaa.Figure 2 shows a partial map of restriction endonucleases of plasmid pAO1 containing the complete linear genome of hepatitis B virus.
Samoin, kuva 2 havainnollistaa plasmidin pAOl pilkkomista restriktioendonukleaasilla EcoRI, entsyymillä EcoRI saadun lineaarisen HBV-tuotteen ligatoimista T4 DNA -ligaasilla konkatameerien muodostamiseksi ja saadun konkatameerituot-teen pilkkomista restriktioendonukleaasilla Bglll spesifisen DNAkappaleen aikaansaamiseksi, joka DNA-kappale sisältää PreS,-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueeseen liittyvän vahingoittumattoman koodaavan DNA-ketjun.Similarly, Figure 2 illustrates the cleavage of plasmid pAO1 with the restriction endonuclease EcoRI, the ligation of a linear HBV product obtained with the enzyme EcoRI with T4 DNA ligase to form concatamers, and the cleavage of the resulting concatamer product -product-S an intact coding DNA strand associated with the coding region.
Kuva 3 esittää plasmidin pDMl osittaista, restriktioendonukleaaseilla saatua karttaa ja se havainnollistaa samoin sen muodostamista ligatoimalla plasmidin pMMT-neo käsittävä, entsyymillä BamHI saatu DNA-kappale entsyymillä Balll saatuun. hepatitis B -viruksen genomiseen kappaleeseen, joka koodaa PreSj-PreS2-S-proteiinin koodaavaa ketjua.Figure 3 shows a partial map of plasmid pDM1 obtained by restriction endonucleases and likewise illustrates its construction by ligating a BamHI-derived DNA fragment comprising plasmid pMMT-neo to Ball1-derived. hepatitis B virus genomic fragment encoding the PreSj-PreS2-S protein coding chain.
Kuvat 4A ja 4B esittävät plasmidin pDM2 osittaista, restriktioendonukleaaseilla saatua karttaa, ja niissä havainnollistetaan sen muodostamista ligatoimalla restriktioendonukleaasilla BamHI saatu kappale ja restriktioendonukleaaseilla BamHI ja Bglll saatu kappale, molemmat plasmidista pDMl.Figures 4A and 4B show a partial map of plasmid pDM2 obtained with restriction endonucleases and illustrate its construction by ligating a fragment obtained with restriction endonuclease BamHI and a fragment obtained with restriction endonucleases BamHI and BglII, both from plasmid pDM1.
Kuva 5 esittää plasmidin pDM3 osittaista, restriktioendonukleaaseilla saatua karttaa ja siinä havainnollistetaan sen muodostamista plasmideista pDMl ja PMMT-neo.Figure 5 shows a partial map of plasmid pDM3 obtained by restriction endonucleases and illustrates the plasmids pDM1 and PMMT-neo formed by it.
Kuva 6 on graafinen esitys, joka havainnollistaa tämän keksinnön mukaisten partikkeleiden eluoitumista BioRad-kolon-nista A5m.Figure 6 is a graph illustrating the elution of particles of this invention from a BioRad column A5m.
20 9572620 95726
Kuva 7 on graafinen esitys tämän keksinnön mukaisten partik-keleiden tyypillisestä isopyknisestä CsCl-sentrifugoinnista, lähtien noin 30 fraktiosta, jotka ovat peräisin BioRad-ko-lonnista A5m saadusta ensimmäisestä piikistä.Figure 7 is a graphical representation of typical isopycnic CsCl centrifugation of the particles of this invention, starting with about 30 fractions from the first peak obtained from the BioRad column A5m.
Kuvat 8A, 8B ja 8C ovat käyriä, jotka havainnollistavat se-ropositiivista muuntumista, jonka tämän keksinnön mukaisten puhdistettujen partikkeleiden erilaiset laimennokset indusoivat hiirissä.Figures 8A, 8B and 8C are curves illustrating the seropositive conversion induced by different dilutions of the purified particles of this invention in mice.
Kuvat 9A ja 9B esittävät plasmidin pENDO-1 osittaista, rest-riktioendonukleaaseilla saatua karttaa ja niissä havainnollistetaan sen monivaiheista muodostamista.Figures 9A and 9B show a partial map of plasmid pENDO-1 obtained by restriction endonucleases and illustrate its multistep construction.
Kuva 10 esittää plasmidin pENDO-2 osittaista, restriktioen-donukleaaseilla saatua karttaa ja siinä havainnollistetaan sen muodostamista ligatoimalla plasmideista pENDOl ja pDM2 restriktioendonukleaaseilla saatuja DNA-kappaleita.Figure 10 shows a partial map of plasmid pENDO-2 obtained with restriction endonucleases and illustrates its generation by ligating DNA fragments obtained from plasmids pENDO1 and pDM2 with restriction endonucleases.
Kuva 11 esittää plasmidin pENDO-O osittaista, restriktioendonukleaaseilla saatua karttaa ja siinä havainnollistetaan sen muodostamista.Figure 11 shows a partial map of plasmid pENDO-O obtained by restriction endonucleases and illustrates its construction.
Käsitteellä "PreS,-PreS2-S-proteiinin koodaava alue" tarkoitetaan HBV-viruksen DNA-genomin sitä aluetta, joka koodaa PreS,-PreS2-S-polypeptidinä tunnettua koko polypeptidiä ja joka alue käsittää kaikki kodonit ensimmäisen metioniinin kodonista alkaen ja päättyen lopulliseen päättämiskodoniin (TAA), joka ei määritä minkään aminohapon liittämistä vaan joka saa aikaan luennan päättymisen, tai tällaisen koodaavan alueen mitä tahansa toiminnallista johdannaista. Tämän alueen koodaamia proteiineja ovat esimerkiksi PreS,-PreS2-S-po-lypeptidi (389 aminohappojäännöstä HBV-alatyypissä adw esimerkiksi) , PreS2-S-polypeptidi (281 aminohappojäännöstä HBV-alatyypissä adw, esimerkiksi) sekä S-polypeptidi (226 aminohappo jäännöstä HBV-alatyypissä adw, esimerkiksi). Edullisimmat PreSi-PreS2-S-proteiinia koodaavat alueet ovat peräisin seuraavista alatyypeistä: adr, ayw, adyw ja adw. Käsit- 11 95726 21 teellä "toiminnallinen johdannainen" tarkoitetaan PreS,-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen mitä tahansa sellaista johdannaista, jonka koodaamat polypeptidit partikkeliksi kasautuneena toimivat immunogeenisen aktiivisuuden suhteen olennaisesti samalla tavalla kuin luonnollisen PreSj-PreS^S-proteiinin koodaavan alueen koodaamista polypeptideistä kasautumalla muodostuva partikkeli. Näitä johdannaisia ovat PreSj-PreSj-S-proteiinin koodaavan alueen osittaiset ketjut, sekä tällaisesta koodaavasta alueesta muuntamalla saadut johdannaiset. Tekniikat tällaisen koodaavan alueen muuntamiseksi ovat alalla tunnettuja ja niitä ovat esimerkiksi käsittely kemiallisella tai biologisella mutageenilla, sä-teilyttäminen tai suora geneettinen manipulointi, kuten nukleiinihappojen istuttaminen, hävittäminen tai korvaaminen entsyymejä tai muita yhdistelmä-DNA-tekniikan ja molekyylibiologian menetelmiä käyttäen.The term "PreS, PreS2-S protein coding region" refers to that region of the HBV virus DNA genome that encodes the entire polypeptide known as the PreS, PreS2-S polypeptide, and that region comprises all codons from the first methionine codon to the final termination codon. (TAA), which does not determine the incorporation of any amino acid but which results in the termination of the reading, or any functional derivative of such a coding region. Proteins encoded by this region include, for example, PreS, -PreS2-S polypeptide (389 amino acid residues in HBV subtype adw for example), PreS2-S polypeptide (281 amino acid residues in HBV subtype adw, for example), and S polypeptide (226 amino acid residues in HBV subtype adw, for example). The most preferred regions encoding the PreSi-PreS2-S protein are from the following subtypes: adr, ayw, adyw, and adw. The term "functional derivative" refers to any derivative of the coding region of the PreS1-PreS2-S protein whose encoded polypeptides, when assembled into particles, function in substantially the same manner as the coding region of the native PreS1-PreS2-S protein. a particle formed by aggregation of polypeptides. These derivatives include partial chains of the coding region of the PreSj-PreSj-S protein, as well as derivatives obtained by modification from such a coding region. Techniques for modifying such a coding region are known in the art and include, for example, chemical or biological mutagenic treatment, irradiation, or direct genetic manipulation, such as insertion, deletion, or replacement of nucleic acids using enzymes or other methods of recombinant DNA technology and molecular biology.
Käsitteellä "PreS2-S-proteiinin koodaava ketju" tarkoitetaan HBV-viruksen DNA-genomin sitä aluetta, joka koodaa PreS2-S-polypeptidinä tunnettua koko polypeptidiä ja joka alue käsittää kaikki kodonit ensimmäisen metioniinin kodonista alkaen ja päättyen lopulliseen päättämiskodoniin (TAA), joka ei määritä minkään aminohapon liittämistä, kuten edellä esitetään, tai tällaisen koodaavan alueen mitä tahansa toiminnallista johdannaista. Tämän alueen koodaamia proteiineja ovat esimerkiksi PreS2-S-polypeptidi (218 aminohappojäännös -tä HBV-alatyypissä adw) ja S-polypeptidi (226 aminohappo-jäännöstä HBV-alatyypissä adw, esimerkiksi). Edullisimmat PreS2-S-proteiinin koodaavat alueet ovat peräisin seuraavista alatyypeistä: adr, ayw, adyw ja adw. Käsitteellä "toiminnallinen johdannainen" tarkoitetaan PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen mitä tahansa sellaista johdannaista, jonka koodaamat polypeptidit partikkeliksi kasautuneena toimivat immunogeenisen aktiivisuuden suhteen olennaisesti samalla tavalla kuin luonnollisen Pres2-S-proteiinin koodaavan alueen korjaamista polypeptideistä kasautumalla muodostuva partikkeli. Tällaisia johdannaisia ovat esimerkiksi PreS2-S-pro-teiinia koodaavan alueen osittaiset ketjut sekä tällaisesta 22 9 5 7 2 6 koodaavasta alueesta muuntamalla saadut johdannaiset. Tekniikat, joita voidaan käyttää tällaisen koodaavan alueen muuntamiseen, ovat tunnettuja alalla ja eräitä näistä on kuvattu edellä.The term "PreS2-S protein coding chain" refers to that region of the HBV virus DNA genome that encodes the entire polypeptide known as the PreS2-S polypeptide and that region comprises all codons from the first methionine codon to the final termination codon (TAA) that does not determine the incorporation of any amino acid, as described above, or any functional derivative of such a coding region. Proteins encoded by this region include, for example, the PreS2-S polypeptide (218 amino acid residues in the HBV subtype adw) and the S polypeptide (226 amino acid residues in the HBV subtype adw, for example). The most preferred coding regions for the PreS2-S protein are from the following subtypes: adr, ayw, adyw, and adw. The term "functional derivative" refers to any derivative of the PreS2-S protein coding region whose polypeptides, when assembled into particles, function in substantially the same manner as a particle formed by aggregation of polypeptides repaired by the native Pres2-S protein coding region. Such derivatives include, for example, partial chains of the PreS2-S protein coding region and derivatives obtained from such a 22 9 5 7 2 6 coding region by modification. Techniques that can be used to transform such a coding region are known in the art and some of these have been described above.
Käsitteellä "S-proteiinin koodaava ketju" tarkoitetaan HBV-viruksen DNA-genomin sitä aluetta, joka koodaa S-polypepti-dinä tunnettua koko polypeptidiä ja joka alue käsittää kaikki kodonit ensimmäisen metioniinin kodonista alkaen ja päättyen lopulliseen päättämiskodoniin (TAA), joka ei määritä minkään aminohapon liittämistä, kuten edellä esitetään, tai tällaisen koodaavan alueen mitä tahansa toiminnallista johdannaista. Tämän alueen koodaamia proteiineja ovat esimerkiksi S-peptidi (226 aminohappojäännöstä HBV-alatyypissä adw, esimerkiksi). Edullisimmat S-proteiinin koodaavat alueet ovat peräisin seuraavista HBV-alatyypeistä: adr, ayw, adyw ja adw. Käsitteellä "toiminnallinen johdannainen" tarkoitetaan S-proteiinin koodaavan alueen mitä tahansa sellaista johdannaista, jonka koodaamat polypeptidit partikkeliksi kasautuneena toimivat immunogeenisen aktiivisuuden suhteen olennaisesti samalla tavalla kuin luonnollisen S-proteiinin koodaavan alueen koodaamista polypeptideistä kasautumalla muodostuva partikkeli. Näitä johdannaisia ovat esimerkiksi S-proteiinin koodaavan alueen osittaiset ketjut sekä tällaisesta koodaavasta alueesta muuntamalla saadut johdannaiset. Tekniikat, joita voidaan käyttää tällaisen koodaavan alueen muuntamiseen, ovat tunnettuja alalla ja eräitä niistä on kuvattu edellä.The term "S-protein coding chain" refers to that region of the HBV virus DNA genome that encodes the entire polypeptide known as the S-polypeptide and that includes all codons from the first methionine codon to the final termination codon (TAA), which does not specify any amino acid insertion as described above, or any functional derivative of such a coding region. Proteins encoded by this region include, for example, the S-peptide (226 amino acid residues in the HBV subtype adw, for example). The most preferred S protein coding regions are from the following HBV subtypes: adr, ayw, adyw, and adw. The term "functional derivative" refers to any derivative of the S protein coding region that, when assembled into a particle, encodes the polypeptides in substantially the same manner as a particle formed by the accumulation of polypeptides encoded by the native S protein coding region. These derivatives include, for example, partial chains of the S protein coding region, as well as derivatives obtained by modification of such a coding region. Techniques that can be used to transform such a coding region are known in the art and some of them have been described above.
Käsitteellä promoottorin tarkoitetaan DNA-molekyylissä geenin suhteen ylävirran puolella sijaitsevaa DNA-ketjua, joka ohjaa isäntäsolun asianmukaisen RNA-polymeraasikompleksin kiinnittymistä DNA-molekyyliin tiettyyn kohtaan tässä DNA-molekyylissä siten, että RNA-polymeraasikompleksi sijoittuu oikealla tavalla geenin kopioitumisen aloittamiseksi tietystä pisteestä DNA-molekyylissä, mikä johtaa yhden DNA-juos-teen RNA-kopion synteesiin.The term promoter refers to a DNA strand upstream of a gene in a DNA molecule that directs the attachment of the appropriate host cell RNA polymerase complex to a specific site on the DNA molecule so that the RNA polymerase complex is correctly positioned in the DNA to initiate transcription of the gene. resulting in the synthesis of a single DNA strand RNA copy.
Il 95726 23 Käsitteellä "kopioituminen" tarkoitetaan isäntäsolun biosyn-teesimekanismin, RNA-polymeraasikompleksit mukaan lukien, suorittamaa prosessia, jossa, yhtä kahdesta toisiaan täydentävästä DNA-juosteesta mallina käyttäen, ribonukleotidit polymeroituvat peräkkäin suunnassa 5' - 3' (suunnassa 3' -5' mallina toimivan DNA-juosteen suhteen), jolloin saadaan tämän yhden DNA-juosteen täsmällinen kopio, joka kuitenkin sisältää ribonukleotidejä deoksiribonukleotidien asemasta.Il 95726 23 The term "transcription" refers to a process performed by a host cell biosynthesis mechanism, including RNA polymerase complexes, in which, using one of two complementary strands of DNA as a template, ribonucleotides polymerize sequentially in the 5 'to 3' direction (3 'to 5'). with respect to the template DNA strand) to give an exact copy of this single strand of DNA, which, however, contains ribonucleotides instead of deoxyribonucleotides.
Käsitteellä "kopioitumisen päättävä ketju" tarkoitetaan DNA-molekyylin sitä aluetta, josta käytetään merkintää t, joka alue antaa kopiointiprosessiin osallistuvalle RNA-polymeraa-sikompleksille signaalin tämän kopioimisprosessin päättämiseksi, jolloin saatua RNA-molekyyliä voidaan jatkokäsitellä asianmukaisesti, mikä käsittää esimerkiksi polyadenylaation ja kuljettamisen niiden RNA-molekyylien tapauksessa, joita RNA-molekyylejä on tarkoitus käyttää lähetti-RNA-molekyylei-nä isäntäsolun sytoplasmassa.The term "transcription termination chain" refers to the region of a DNA molecule denoted by t that signals the RNA polymerase complex involved in the transcription process to terminate this transcription process, whereby the resulting RNA molecule can be further processed appropriately, including, for example, polyadenylation and RNA transport. in the case of molecules which RNA molecules are to be used as messenger RNA molecules in the cytoplasm of the host cell.
Käsitteellä "polyadenylaatio" tarkoitetaan prosessia, jossa isäntäsolun biosynteesikoneisto tunnistaa RNA-molekyylistä erityisen ketjun, tavallisesti 5'-AATAAA-3', jota nimitetään polyadenylaation signaaliksi, PAS, ja se ohjaa malliin perustumattoman polyriboadenylaattiryhmän liittämistä mainitun molekyylin 3'-päähän, noin 15 - 20 nukleotidiä signaalista alavirtaan (3'-pään suunnassa) tämän liittämisen tapahtuessa erityisesti entsyymillä poly-A-polymeraasi.The term "polyadenylation" refers to the process by which a host cell biosynthesis machinery recognizes a specific chain from an RNA molecule, usually 5'-AATAAA-3 ', termed a polyadenylation signal, PAS, and directs the insertion of a non-model polyriboadenylate group at the 3' end of said molecule. 20 nucleotides downstream (3'-direction) of the signal, this coupling taking place in particular by the enzyme poly-A polymerase.
Käsitteellä "valikoinnin merkitsin" tarkoitetaan geenideter-minanttia, joka solussa ilmentyessään saa soluun aikaan tiettyjä ominaisuuksia, joiden avulla tällainen solu on tunnistettavissa tai valikoitavissa muista soluista, jotka eivät sisällä tai ilmennä mainittua geenideterminanttia.The term "selection marker" refers to a gene determinant which, when expressed in a cell, confers on the cell certain properties that allow such a cell to be identified or selected from other cells that do not contain or express said gene determinant.
Edullisia valikoinnin merkitsimiä ovat esimerkiksi lääkeaineen vastustuskykyyn perustuvat merkitsimet. Käsitteellä "lääkeaineen vastustuskykyyn perustuva merkitsin" tarkoitetaan valikoinnin merkitsimien erityistä luokkaa, joka solun 95726 24 ilmentäessä tällaista merkitsintä saa aikaan sen, että solu kykenee vastustamaan sellaisen lääkeaineen tai antibiootin tappavia vaikutuksia, jotka lääkeaineet tai antibiootit tavallisesti salpaavat solun kasvun tai tappavat solun, mikäli se ei käsitä tai ilmennä mainittua lääkeaineen vastustuskykyyn perustuvaa merkitsintä.Preferred selection markers are, for example, markers based on drug resistance. The term "drug resistance marker" refers to a particular class of selectable markers that, when expressed by cell 95726 24, provide the ability of a cell to resist the lethal effects of a drug or antibiotic that does not normally inhibit or kill cell growth. comprise or express said drug resistance labeling.
Edullisia lääkeaineen vastustuskykyyn perustuvia merkitsimiä ovat esimerkiksi neomysiinin vastustuskyvyn aikaansaavan geenin, neo, koodaava ketju; Eco-gpt-geenin (Mulligan, R.C. ja Berg. P., Science, Voi. 209, sivu 1422, 1980) koodaava ketju: dihydrofolaattireduktaasi(DHFR)-geenin koodaava ketju (Ringold, G. et ai., J. of Molec. and Appld. Genet., Voi.Preferred markers based on drug resistance include, for example, the coding chain of the neomycin resistance gene, neo; Chain encoding the Eco-gpt gene (Mulligan, RC and Berg. P., Science, Vol. 209, page 1422, 1980): the chain encoding the dihydrofolate reductase (DHFR) gene (Ringold, G. et al., J. of Molec ., and Appld. Genet., Vol.
1, sivu 165, 1981).1, page 165, 1981).
Käsitteellä "partikkelit, jotka käsittävät vähintään yhden, koko PreS,-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen koodaaman proteiinin" tarkoitetaan hepatitis B -partikkelia, joka ei sisällä lainkaan nukleiinihappoa ja joka on muodostunut kasautumalla koko PreS]-, PreS2- ja S-alueella transfektoidun eu-karioottisen solun viljelmän hajotteeseen (lysaatti) tai hajotteesta, tällaisen partikkelin sisältäessä pääasiallisesti S-polypeptidistä (dimeeri) muodostuneita alayksiköitä, jotka ovat myös muodostuneet pienemmistä määristä koko PreS,-PreS2-S--polypeptidiä, valinnaisesti, PreS2-S-polypeptidiä.The term "particles comprising at least one protein encoded by the entire PreS, PreS2-S coding region" refers to a hepatitis B particle that contains no nucleic acid at all and is formed by aggregation throughout the PreS2, PreS2 and S regions. to a lysate (lysate) of a culture of a transfected eukaryotic cell, such a particle containing subunits composed mainly of S polypeptide (dimer), which are also formed of smaller amounts of whole PreS, PreS2-S polypeptide, optionally, PreS2-S polypeptide .
Tässä keksinnössä käytetään yhdistelmä-DNA-vektoria, joka käsittää PreS,-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen sekä MMT-promoottorin. MMT-promoottori voidaan sisällyttää DNA-vektoriin joko DNA-ketjun luonnollisen promoottorin lisäksi (hepatitis B -viruksen promoottorin) tai hepatitis B -viruksen promoottorin tilalle. MMT-vektori sijoitetaan DNA-vek-torissa mieluiten välittömästi ylävirran puolelle PreS,-PreS2-S-proteiinin koodaavasta alueesta. Tällainen vektori käsittää mielellään samoin kopioitumisen päättämisketjun sekä valikoinnin merkitsimen. Tällainen valikoinnin merkitsin on mieluiten lääkeaineen vastustuskykyyn perustuva merkitsin, kuten neomysiinigeeni. Tällainen kopioitumisen 95726 25 päättämisket ju on mielellään SV40-viruksen päättämiskohta (sv-PAS-t) tai mieluummin DEF-alue (mg-PAS-t) hiiren glo-biinigeenistä. SV40-päättämisketju on alalla hyvin tunnettu ja se kuvataan monissa julkaisuissa, kuten Mulligan ja Berg, Science, Voi. 209, sivu 1422, 1980. Hiiren globiinigeenin DEF-alue kuvataan julkaisussa Falck-Pederson et ai., Cell,The present invention uses a recombinant DNA vector comprising the coding region of the PreS, PreS2-S protein and the MMT promoter. The MMT promoter can be included in the DNA vector in addition to either the natural promoter of the DNA strand (hepatitis B virus promoter) or the hepatitis B virus promoter. The MMT vector is preferably placed in the DNA vector immediately upstream of the coding region of the PreS, PreS2-S protein. Such a vector preferably also comprises a copy termination chain and a selection marker. Such a selection marker is preferably a marker based on drug resistance, such as the neomycin gene. Such a 95726 copy termination terminus is preferably the SV40 virus termination site (sv-PAS-t) or more preferably the DEF region (mg-PAS-t) of the murine globin gene. The SV40 termination chain is well known in the art and is described in many publications, such as Mulligan and Berg, Science, Vol. 209, page 1422, 1980. The DEF region of the mouse globin gene is described in Falck-Pederson et al., Cell,
Voi. 40, sivu 897, 1985. Tällainen vektori voidaan muodostaa tavanomaisilla yhdistelmä-DNA-tekniikoilla ja muilla molekyylibiologian menetelmillä. Edullisimmassa tapauksessa, mg-PAS-t-aluetta käyttäen, tämä vektori ei sisällä lainkaan virus-DNA:n kappaleita ja se ei ole onkogeeninen eli se ei transformoi (tee syöpää aiheuttavaksi) yhtäkään isän-täsolua, johon se on istutettu. Kun tällainen vektori transfektoidaan isäntään, mikäli se ei sisällä autonomista replikaatioketjua (replikonia), joka kykenee toimimaan tällä vektorilla transfektoidussa isännässä, niin se yhtenäistyy isäntäkromosomiin ja replikoituu passiivisesti isäntägenomin kanssa.Butter. 40, page 897, 1985. Such a vector can be generated by conventional recombinant DNA techniques and other methods of molecular biology. Most preferably, using the mg-PAS-t region, this vector contains no fragments of viral DNA at all and is not oncogenic, i.e., it does not transform (make carcinogenic) any host cell into which it has been implanted. When such a vector is transfected into a host, if it does not contain an autonomous replication chain (replicon) capable of functioning in the host transfected with this vector, it integrates into the host chromosome and replicates passively with the host genome.
Tässä keksinnössä käytetyllä yhdistelmä-DNA-vektorilla tulisi mielellään olla seuraavat tunnusomaiset piirteet: 1) PreS,-PreS2-S-proteiinin koodaava alue; 2) MMT-promoottori, joka sijaitsee välittömästi ylävirran puolella PreSj-PreSj-S-proteiinin koodaavasta alueesta; 3) tämän vektorin tulisi kyetä replikoituinaan bakteereissa tai muussa prokarioottisessa isännässä, johon se on transformoitu, kasvamiseksi, monistumiseksi sekä yhdistelmävekto-rin suurten määrien tuottamiseksi. Täten tällaisen vektorin tulisi käsittää bakteeriperäisen tai muun prokarioottisen replikonin eli DNA-kappaleen, joka sisältää ne kaikki toiminnot, joita tarvitaan autonomiseen replikoitumiseen sekä vektorin ylläpitämiseen kromosomien ulkopuolella isäntänä toimivassa prokarioottisessa solussa, kuten isäntänä toimivassa bakteerisolussa, joka on transformoitu tällä vektorilla. Tällaiset replikonit ovat alalla hyvin tunnettuja; 4) vektorireplikonin tulisi olla pieni (eli pienempi kuin 6-8 kiloemäsparia), jotta sen helppo geneettinen ja molekyylibiologinen manipuloiminen olisi mahdollista; 95726 26 5) vektorin tulisi käsittää valikoinnin merkitsin, mielellään lääkeaineen, kuten ampisilliinin, vastustuskykyyn perustuva merkitsin tällä vektorilla transformoiduissa isäntänä toimivissa bakteerisoluissa käyttöä varten; 6) vektorin tulisi käsittää toinenkin valikoinnin merkitsin, mielellään lääkeaineen, kuten neomysiinin, vastustuskykyyn perustuva merkitsin, tällä vektorilla transfektoiduissa eu-karioottisissa isäntäsoluissa sellaisenaan käytettäväksi; 7) vektorin tulisi sisältää sopivia endonukleaasien restrik-tiokohtia kloonaamista varten; 8) vektorin tulisi sisältää kopioitumisen päättämisketju ja polyadenylaation ketju.The recombinant DNA vector used in the present invention should preferably have the following characteristics: 1) the coding region of the PreS, PreS2-S protein; 2) an MMT promoter located immediately upstream of the PreSj-PreSj-S protein coding region; 3) this vector should be capable of growing, amplifying, and producing large amounts of the recombinant vector when replicated in bacteria or another prokaryotic host into which it has been transformed. Thus, such a vector should comprise a bacterial or other prokaryotic replicon, i.e., a DNA fragment that contains all the functions required for autonomous replication and maintenance of the vector outside the chromosomes in a host prokaryotic cell, such as a host bacterial cell transformed with the vector. Such replicons are well known in the art; 4) the vector replicon should be small (i.e., less than 6-8 kilobase pairs) to allow for easy genetic and molecular biological manipulation; 95726 26 5) the vector should comprise a selection marker, preferably a marker based on the resistance of a drug such as ampicillin, for use in host bacterial cells transformed with this vector; 6) the vector should comprise another marker of choice, preferably a marker based on the resistance of a drug such as neomycin, for use as such in eukaryotic host cells transfected with this vector; 7) the vector should contain appropriate endonuclease restriction sites for cloning; 8) the vector should contain a transcription termination chain and a polyadenylation chain.
Vektori ei mieluiten käsitä autonomista replikaatioketjua (replikonia), joka kykenee toimimaan tällä vektorilla trans-fektoidussa, eukarioottisessa isäntäsolussa. Pääasiallinen syy siihen, että eukarioottisissa isäntäsoluissa käytetään replikoitumatonta vektorijärjestelmää, on se, että kaikki ne vektorijärjestelmät, jotka kykenevät autonomiseen ja kromosomien ulkopuoliseen replikoitumiseen isäntänä toimivassa, eukarioottisessa, tällaisella vektorilla transfektoidussa nisäkässolussa, käsittävät onkogeenisistä viruksista saatuja repiikoneja. On toivottavaa, että farmaseuttisesti mielenkiintoisia polypeptidejä, kuten esimerkiksi PreS]-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen koodaamia proteiineja, koodaavi-en DNA-ketjujen ilmentämiseen käytetään vektoreita, joiden käsittämä DNA ei ole peräisin onkogeenisistä viruksista.Preferably, the vector does not comprise an autonomous replication chain (replicon) capable of operating in a eukaryotic host cell transfected with this vector. The main reason for using a non-replicating vector system in eukaryotic host cells is that all vector systems capable of autonomous and extrachromosomal replication in a host eukaryotic mammalian cell transfected with such a vector comprise. It is desirable that vectors whose DNA is not derived from oncogenic viruses be used to express DNA strands encoding pharmaceutically interesting polypeptides, such as those encoded by the coding region of the PreS1-PreS2-S protein.
Tässä keksinnössä käytetty vektori käsittää MMT-promootto-rin. MMT-promoottori ei ole virusperäinen, ja se on voimakas kopioitumisen promoottori. MMT-promoottorin koodaava ketju esitetään julkaisussa Pavlakis ja Hamer, Proc. Natl. Acad.The vector used in the present invention comprises the MMT promoter. The MMT promoter is not viral and is a potent replication promoter. The coding chain for the MMT promoter is disclosed in Pavlakis and Hamer, Proc. Natl. Acad.
Sei., Voi. 11, sivu 397, 1983. MMT-promoottoria voidaan säätää raskasmetallien ioneilla, kuten sinkin ja kadmiumin ioneilla, sekä steroidihormoneilla kuten deksametasonilla.Sci., Vol. 11, page 397, 1983. The MMT promoter can be regulated by heavy metal ions such as zinc and cadmium ions, and steroid hormones such as dexamethasone.
Tällainen säätely on hyvin tunnettua (katso esimerkiksi julkaisu Yagle ja Palmiter, Molecular and Cellular Biol., Voi.Such regulation is well known (see, e.g., Yagle and Palmiter, Molecular and Cellular Biol., Vol.
5, sivu 291, 1985} .5, page 291, 1985}.
27 9572.627 9572.6
Esitetään myös transfektoitu eukarioottinen isäntäsolu, joka on transformoitu tämän keksinnön mukaisella yhdistelmä-DNA-vektorilla. Tämä isäntä on mielellään nisäkässolu, mieluiten kiinanhamsterin munasarjan (CHO) solulinja, vero-solu-linja, L-solulinja tai hiirestä tai rotasta saatu fibroblas-tinen solulinja. Tällainen isäntä voidaan valmistaa trans-fektoimalla eukarioottinen solu tämän keksinnön mukaisella yhdistelmä-DNA-vektorilla käyttäen tavanomaisia tekniikoita, kuten esimerkiksi menetelmää, joka esitetään julkaisussa Graham ja van der Eb, Virology, Voi. 52, sivu 456, 1973, tai Wigler, M. Cell, Voi. 141, sivu 725, 1978.Also disclosed is a transfected eukaryotic host cell transformed with a recombinant DNA vector of this invention. This host is preferably a mammalian cell, preferably a Chinese hamster ovary (CHO) cell line, a tax cell line, an L cell line, or a fibroblast cell line derived from a mouse or rat. Such a host can be prepared by transfecting a eukaryotic cell with a recombinant DNA vector of this invention using conventional techniques, such as the method described in Graham and van der Eb, Virology, Vol. 52, page 456, 1973, or Wigler, M. Cell, Vol. 141, page 725, 1978.
Esitetään samoin menetelmä PreSj-PreSj-S-proteiinin koodaavan alueen koodaamia proteiineja käsittävän partikkelin valmistamiseksi, jossa partikkelissa vähintään yksi näistä proteiineista vastaa koko PreS,-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen koodaamaa polypeptidiä, tämän menetelmän käsittäessä vaiheet, joissa: a) tämän keksinnön mukaista transfektoitua isäntää viljellään sellaisissa viljelyalustassa vallitsevassa olosuhteissa, että tällainen isäntä kykenee ilmentämään näitä proteiineja, ja b) tällainen partikkeli eristetään.Also provided is a method of making a particle comprising proteins encoded by the PreSj-PreSj-S protein coding region, wherein at least one of these proteins corresponds to the entire PreS1-PreS2-S protein coding region polypeptide, the method comprising the steps of: a) and the b transfected host is cultured under conditions prevailing in the culture medium such that such a host is capable of expressing these proteins, and b) such a particle is isolated.
Tällainen yhteistransfektoitu isäntä kykenee mieluiten erittämään tällaisiksi partikkeleiksi kasautuneet proteiinit alustaan. Kasvatusalustaan lisätään mielellään raskasmetallien ioneja tai steroidihormoneja, kuten deksametasonia, | MMT-promoottorin indusoimiseksi, mikä täten edistää tällai sen koodaavan alue en ilmentymistä. Raskasmetallien ioneina käytetään mieluiten kadmiumin tai sinkin ioneja. Raskasmetallien ionien tai steroidihormonin optimaalinen pitoisuus alustassa voidaan määrittää tavanomaisin tekniikoin.Such a co-transfected host is preferably capable of secreting proteins accumulated into such particles into the medium. Heavy metal ions or steroid hormones such as dexamethasone are preferably added to the medium, | To induce the MMT promoter, thus thus promoting the expression of its coding region. The ions of heavy metals used are preferably cadmium or zinc. The optimal concentration of heavy metal ions or steroid hormone in the medium can be determined by conventional techniques.
Mikäli transfektoitu isäntäsolu erittää partikkelit suoraan viljelyalustaan, niin tällöin nämä partikkelit voidaan eristää transfektoidun isännän viljelyalustasta proteiinien eristämiseen tavanomaisesti käytetyillä tekniikoilla. Mikäli transfektoitu isäntäsolu ei eritä näitä partikkeleita, niin tällöin ne saadaan tämän isännän viljelmän hajotteesta viljelmän hajottamiseksi tavanomaisesti käytetyillä teknii- . 95726 28 koilla. Nämä. partikkelit saadaan glykolysoituneina, ja ne muodostavat PreS,-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen koodaamista proteiineista, käsittäen vähintään yhden koko PreS,-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen koodaaman proteiinin.If the transfected host cell secretes the particles directly into the culture medium, then these particles can be isolated from the culture medium of the transfected host by techniques conventionally used to isolate proteins. If these particles are not secreted by the transfected host cell, then they are obtained from the culture digest of this host by techniques commonly used to lyse the culture. 95726 28 koilla. These. the particles are obtained glycosylated and form a protein encoded by the PreS, -PreS2-S protein coding region, comprising at least one protein encoded by the entire PreS, -PreS2-S protein coding region.
Esitetään myös rokote, joka käsittää immunologisesti suojaa-van määrän tämän keksinnön mukaisia partikkeleita. Käsitteellä "immunologisesti suojaava määrä" tarkoitetaan tämän keksinnön mukaisten partikkeleiden sitä määrää (mielellään 1-20 μg), joka tarvitaan vasta-aineiden indusoimiseksi ja niiden tason pitämiseksi isännässä riittävänä neutraloimaan infektoiva aine sekä estämään mainitun infektoivan aineen lisääntyminen ja siitä johtuva sairastuminen.Also provided is a vaccine comprising an immunologically protective amount of the particles of this invention. The term "immunologically protective amount" refers to the amount of particles of this invention (preferably 1-20 μg) required to induce antibodies and maintain their level in the host sufficient to neutralize the infectious agent and prevent the growth of said infectious agent and consequent disease.
Esitetty partikkeli ei sisällä lainkaan virusperäisiä DNA-komponentteja ja näin ollen sillä ei ole tavallisesti luonnollisista lähteistä peräisin oleviin rokotteisiin liittyviä epätoivottuja sivuvaikutuksia, kuten tahaton infektoiminen viruksella, allergiset reaktiot, kuumeet ja muut vastaavat. Rokotetta, joka käsittää immunologisesti suojaavan määrän esillä olevia partikkeleita, voidaan käyttää parantamaan HBV:n aiheuttamaa immuunireaktiota ja sillä voidaan välttää reagoimattomuus sellaisille hepatitis B -virusta vastaan vaikuttaville rokotteille, jotka eivät sisällä koko PreS^ PreS2-S-proteiinin koodaavan ketjun koodaamia proteiineja.The disclosed particle contains no viral DNA components at all and thus does not usually have the undesirable side effects associated with vaccines from natural sources, such as unintentional infection with a virus, allergic reactions, fever and the like. A vaccine comprising an immunologically protective amount of the present particles can be used to enhance the immune response elicited by HBV and to avoid unresponsiveness to hepatitis B virus vaccines that do not contain the proteins encoded by the entire PreS2 PreS2-S protein coding chain.
Rokote voidaan valmistaa sekoittamalla immunologisesti suojaava määrä tämän keksinnön mukaisia partikkeleita sopivaan puskuriin kuten fosfaatilla puskuroituun suolaliuokseen.The vaccine may be prepared by mixing an immunologically protective amount of the particles of this invention in a suitable buffer such as phosphate buffered saline.
Tämä rokote voi lisäksi käsittää apuainetta, kuten alumiinihydroksidia tai muuta vastaavaa.This vaccine may further comprise an excipient such as aluminum hydroxide or the like.
Vaihtoehtoisesti esitettyjen partikkeleiden käsittämät poly-peptidit voidaan irrottaa mainituista partikkeleista ja liittää uudestaan lipidivesikkeliin. Hepatitis B -virusta vastaan vaikuttava rokote voidaan valmistaa käyttäen tämän keksinnön mukaisia polypeptidejä käsittäviä mainittuja lipi-divesikkeleitä. Asianmukaisena pitoisuutena olevia lipidi- 29 9 5 7 2 6 vesikkeleitä voidaan käyttää rokotteena apuainetta, kuten alumiinihydroksidia, käyttäen tai käyttämättä.Alternatively, the polypeptides comprised by the disclosed particles may be detached from said particles and reattached to the lipid vesicle. A vaccine against hepatitis B virus can be prepared using said Lipi dihydrogen-containing polypeptides of this invention. Lipid vesicles in the appropriate concentration can be used as a vaccine with or without an excipient such as aluminum hydroxide.
Rokotteen partikkeleita voidaan käyttää yhdessä fysiologisesti hyväksyttävän laimentimen (väliaine), kuten fosfaatilla puskuroidun suolaliuoksen, kanssa.Vaccine particles can be used in combination with a physiologically acceptable diluent (medium) such as phosphate buffered saline.
Rokotetta, joka käsittää immunologisesti suojaavan määrän esitettyjä partikkeleita, voidaan valmistaa ja käyttää yleisesti samalla tavalla, joka julkaistaan US-patenttijulkai-sussa no. 4 118 479, jonka koko sisältö liitetään oheen tällä viittauksella.A vaccine comprising an immunologically protective amount of the disclosed particles can be prepared and used in a generally similar manner to that disclosed in U.S. Pat. 4,118,479, the entire contents of which are incorporated herein by reference.
Rokotetta voidaan antaa ihon alaisesti, ihon sisäisesti tai lihaksen sisäisesti injektoimalla. Edullisin antoreitti riippuu erityisestä rokotteesta, mutta kuitenkin uskotaan, että lihaksen sisään injektoiminen on yleensä sopivinta. Antokertojen tiheys vaihtelee rokotteesta riippuen.The vaccine can be given by subcutaneous, intradermal or intramuscular injection. The most preferred route of administration depends on the particular vaccine, however, intramuscular injection is generally believed to be most appropriate. The frequency of administrations varies depending on the vaccine.
Tämä keksintö kohdistuu menetelmään PreS,-PreS2S-proteiinin koodaavan alueen koodaamia proteiineja vastaan vaikuttavien vasta-aineiden läsnäolon ilmaisemiseksi nisäkkään veriseerumista otetusta näytteestä, tämän menetelmän käsittäessä vaiheet, joissa: a) näyte saatetaan kosketuksiin tämän keksinnön mukaisilla ’ merkitsemättömillä partikkeleilla pinnoitetun kiinteän kan tajan kanssa; b) mainittua kosketuksiin saatettua näytettä inkuboidaan ja se pestään; c) mainittu kosketuksiin saatettu näyte saatetaan kosketuksiin tämän keksinnön mukaisten merkittyjen partikkeleiden ) kanssa, jolloin saadaan merkitty, kosketuksiin saatettu näy te ; d) mainittua merkittyä, kosketuksiin saatettua näytettä inkuboidaan ja se pestään; ja e) merkittyjen partikkeleiden määrä merkityssä, kosketuksiin saatetussa näytteessä määritetään.This invention relates to a method for detecting the presence of antibodies against proteins encoded by the PreS1-PreS2S protein coding region in a sample taken from a mammalian blood serum, the method comprising the steps of: a) contacting the sample with a solid label coated with the unlabeled particles of this invention; (b) incubating and washing said contacted sample; c) contacting said contacted sample with the labeled particles of this invention to obtain a labeled, contacted sample; d) incubating and washing said labeled, contacted sample; and e) determining the number of labeled particles in the labeled, contacted sample.
30 9 5 7 2 6 Tämä keksintö kohdistuu samoin menetelmään PreSj-PreSj-S-pro-teiinin koodaavan alueen koodaamien proteiinien läsnäolon ilmaisemiseksi nisäkkään veriseerumista saadusta näytteestä, tämän menetelmän käsittäessä vaiheet, joissa; a) valmistetaan seos, joka sisältää tämän keksinnön mukaisten partikkeleiden käsittämän immunogeenin tuottamaa vasta-ainetta; b) näyte saatetaan kosketuksiin tämän seoksen ensimmäisen osan sekä merkityn immunogeenin kanssa, tätä ensimmäistä osaa inkuboidaan ja se pestään; c) antigeeniä sisältämätön vertailunäyte saatetaan kosketuksiin tämän seoksen toisen osan sekä merkityn immunogeenin kanssa, tätä toista osaa inkuboidaan ja se pestään; d) edellisten vaiheiden b) ja c) seoksiin lisätään sama määrä proteiinia A käsittävää stafylokokkia, molempia seoksia inkuboidaan ja neste erotetaan kiintoaineesta; ja e) merkityn immunogeenin määrä kummassakin, edellä esitetyssä vaiheessa d) tuloksena olevassa seoksessa määritetään.The present invention also relates to a method for detecting the presence of proteins encoded by the coding region of the PreSj-PreSj-S protein in a sample obtained from mammalian blood serum, the method comprising the steps of; a) preparing a mixture comprising an antibody produced by an immunogen comprising the particles of this invention; (b) contacting the sample with the first portion of this mixture and the labeled immunogen, incubating the first portion and washing; (c) contacting the antigen-free reference sample with the second portion of this mixture and the labeled immunogen, incubating the second portion and washing; d) adding the same amount of staphylococcus comprising protein A to the mixtures of steps b) and c) above, incubating both mixtures and separating the liquid from the solid; and e) determining the amount of labeled immunogen in each of the resulting mixtures in step d) above.
Tämä keksintö kohdistuu samoin diagnostiseen kittiin PreS,-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen koodaamia proteiineja vastaan vaikuttavien vasta-aineiden läsnäolon ilmaisemiseksi nisäkkään veriseerumista saadusta näytteestä, tämän kitin käsittäessä: a) merkitsemättömiä proteiineja, jotka käsittävät tämän keksinnön mukaisen, kiinteään kantajaan kiinnitetyn partikkelin; ja b) ihmisen IgG:tä tai IgM:ää, esimerkiksi, vastaan vaikuttavia, merkittyjä vasta-aineita.The present invention is also directed to a diagnostic kit for detecting the presence of antibodies to proteins encoded by the coding region of the PreS, PreS2-S protein from a sample obtained from mammalian blood serum, the kit comprising: a) unlabeled proteins comprising a particle of the invention attached to a solid support; and b) labeled antibodies against human IgG or IgM, for example.
Tämä keksintö kohdistuu samoin diagnostiseen kittiin PreS,-! PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen koodaamien proteiinien läsnäolon ilmaisemiseksi nisäkkään veriseerumista saadusta näytteestä, tämän kitin käsittäessä: a) tämän keksinnön mukaisten partikkeleiden tuottamia, kiinteään kantajaan kiinnitettyjä vasta-aineita; ja b) tämän keksinnön mukaisten partikkeleiden tuottamia, merkittyjä vasta-aineita.The present invention is also directed to the diagnostic kit PreS, -! To detect the presence of proteins encoded by the coding region of the PreS2-S protein from a sample obtained from mammalian blood serum, this kit comprises: a) antibodies produced by the particles of this invention attached to a solid support; and b) labeled antibodies produced by the particles of this invention.
31 95726 Tämä keksintö käsittää samoin diagnostiset kokeet hepatitis B -viruksen pinnan antigeenien ja näiden antigeenien vaikutuksesta muodostuneiden vasta-aineiden ilmaisemiseksi suoraan. Radioimmunokoetta (RIA) tai entsyymiin kytketyn im-munosorbentin koetta (ELISA) käytetään PreS,-PreS2-S-proteiinin koodaavien alueiden koodaamia proteiineja sisältävien HBV-antigeenien ilmaisemiseksi HBV-viruksella infektoituneiden eläinten, kuten ihmisten, seerumista. Eräs diagnostinen koe käsittää seuraavat vaiheet: 1. kiinteä substraatti, jonka pinnalla on sitoutumiskohtia, kuten polystyreenihelmien muodostama substraatti, pinnoitetaan sellaisten partikkeleiden vaikutuksesta muodostuneilla vasta-aineilla, jotka partikkelit sisältävät PreS,-PreS2-S-proteiinia sisältävien polypeptidien aminohappoketjuja vastaavia aminohappoketjuja; 2. tämän jälkeen pinnoitetut helmet pestään esimerkiksi Tris-puskuroidulla suolaliuoksella ylimääräisten vasta-aineiden poistamiseksi; 3. sitten helmet saatetaan kosketuksiin proteiinia sisältävän liuoksen, kuten esimerkiksi naudan seerumin albumiinia (BSA) tai gelatiinia sisältävän liuoksen, kanssa helmien pinnalla olevien proteiinin sitoutumiskohtien kyllästämiseksi (epäspesifisen sitoutumisen vähentämiseksi). Tällaisen proteiinia sisältävän liuoksen sopivana pitoisuutena voidaan käyttää esimerkiksi arvoja 1-50 mg/ml; 4. sitten helmet pestään ylimääräisen BSA:n tai gelatiinin poistamiseksi; 5. tämän jälkeen helmiä inkuboidaan sellaisten seerumi- r näytteiden kanssa, joiden näytteiden epäillään sisältävän HBV-viruksia tai HBV-viruksen pinnan antigeenejä (vertailuna käytetään normaalia seerumia); 6. tämän jälkeen helmet pestään liuoksena, esimerkiksi Tris-puskuroidulla suolaliuoksella ja ne sekoitetaan HBV-viruksen pinnan antigeenejä vastaan vaikuttavaan, radioaktiivisesti merkittyyn vasta-aineeseen, kuten esimerkiksi 125I-merkittyyn vasta-aineeseen; 7. tämän jälkeen helmiä inkuboidaan; ja 8. helmet pestään ja lasketaan gammalaskurilla.31 95726 The present invention likewise comprises diagnostic experiments for the direct detection of hepatitis B virus surface antigens and antibodies formed by the action of these antigens. A radioimmunoassay (RIA) or an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is used to detect HBV antigens containing proteins encoded by the coding regions of the PreS, PreS2-S protein from the serum of HBV-infected animals, such as humans. One diagnostic assay comprises the steps of: 1. coating a solid substrate having binding sites, such as a substrate formed by polystyrene beads, with antibodies formed by particles comprising amino acids corresponding to the amino acid chains of polypeptides comprising PreS, PreS2-S protein; 2. the coated beads are then washed with, for example, Tris-buffered saline to remove excess antibodies; 3. the beads are then contacted with a protein-containing solution, such as a solution containing bovine serum albumin (BSA) or gelatin, to saturate the protein binding sites on the surface of the beads (to reduce non-specific binding). For example, values of 1-50 mg / ml may be used as a suitable concentration of such a protein-containing solution; 4. the beads are then washed to remove excess BSA or gelatin; 5. the beads are then incubated with serum samples suspected of containing HBV viruses or HBV surface antigens (normal serum is used as a reference); 6. the beads are then washed as a solution, for example with Tris-buffered saline, and mixed with a radiolabeled antibody against HBV surface antigens, such as a 125 I-labeled antibody; 7. the beads are then incubated; and 8. the beads are washed and counted in a gamma counter.
32 95726 Tässä esitettyjä PreS,-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen koodaamia partikkeleita voidaan käyttää diagnostisena välineenä HBV-viruksen pinnan antigeeniproteiinissa olevia PreS^PreS^S-alueita vastaan vaikuttavien vasta-aineiden ilmaisemiseksi tietystä näytteestä. PreS,-PreS2-S-polypepti-diä sisältäviä partikkeleita absorboidaan kiinteään substraattiin, jonka pinnalla on sitoutumiskohtia, esimerkiksi polystyreenihelmien pinnalle. Tämän jälkeen substraatti saatetaan kosketuksiin erään aineen, esimerkiksi gelatiinin, BSA:N tai maitojauheen kanssa substraatin pinnalla olevien epäspesifisten sitoutumiskohtien kyllästämiseksi. Tämän jälkeen substraatti pestään puskuroidulla liuoksena ja sitten puskuri poistetaan. Substraattiin lisätään eläimen seerumilla laimennettu näyte, esimerkiksi ihmisseerumin näyte. Tuloksena saatua massaa inkuboidaan ja se pestään. Tämän jälkeen massaan lisätään ihmisen IgGrtä tai IgM:ää vastaan vaikuttavia, radioaktiivisesta merkittyjä, esimerkiksi jo-dattuja (125I) vasta-aineita. Tuloksena olevaa massaa inkuboidaan, ja sitten se pestään ja lasketaan, esimerkiksi gamma-laskurilla. Mikäli laskurilla saatu tulos on suurempi kuin vertailuna toimineesta normaalista seerumista gammalaskuril-la saatu tulos, niin tällöin näyte sisältää HBV-viruksen PreS,-PreS2-S-koodaavia alueita vastaan vaikuttavia vasta-aineita.The particles encoded by the PreS1-PreS2-S protein coding region disclosed herein can be used as a diagnostic tool to detect antibodies against the PreS1-PreS2S regions in the HBV surface antigen protein from a particular sample. Particles containing the PreS, -PreS2-S polypeptide are absorbed on a solid substrate having binding sites on the surface, for example on the surface of polystyrene beads. The substrate is then contacted with a substance, such as gelatin, BSA, or milk powder, to saturate the non-specific binding sites on the surface of the substrate. The substrate is then washed as a buffered solution and then the buffer is removed. A sample diluted with animal serum, for example a sample of human serum, is added to the substrate. The resulting mass is incubated and washed. Radiolabeled, e.g., iodinated (125I) antibodies against human IgG or IgM are then added to the pulp. The resulting mass is incubated and then washed and counted, for example with a gamma counter. If the result obtained with the counter is greater than the result obtained with the gamma counter from the normal serum used as a control, then the sample contains antibodies against the PreS, PreS2-S coding regions of the HBV virus.
. Oletetaan, että edellä esitettyä toimenpidesarjaa HBV-viruk sen PreS[-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen koodaamia proteiineja vastaan vaikuttavien vasta-aineiden ilmaisemiseksi voidaan käytttää diagnostisena välineenä, jolla voidaan ilmaista hepatitis B -viruksen aiheuttama infektio.. It is contemplated that the above sequence of procedures for detecting antibodies against proteins encoded by the coding region of the HBV virus PreS [-PreS2-S protein can be used as a diagnostic tool to detect hepatitis B virus infection.
Diagnostiseen kokeeseen käytettävä reagenssikitti HBV-geno-missa olevien PreS]-PreS2-S-proteiinin koodaavien alueiden koodaamien antigeenien toteamiseksi testattavasta näytteestä voi käsittää seuraavat komponentit: 1. tämän keksinnön mukaisissa HBV-viruksen pinnan anti-geenipartikkeleissa olevia PreSj-PreS2-S-alueita vastaavia 95726 33 aminohappoketjuja käsittävää partikkelia vastaan vaikuttavilla vasta-aineilla pinnoitettu kiinteä substraatti; 2. proteiinia sisältävä liuos tämän kiinteän substraatin pinnalla olevien proteiinin sitoutumiskohtien kyllästämiseksi; ja 3. tietty määrä radioaktiivisesti merkittyä vasta-ainetta, esimerkiksi HBV-viruksen pinnan antigeenipolypeptidejä vastaan vaikuttavaa vasta-ainetta,A reagent kit for a diagnostic assay to detect antigens encoded by the coding regions of the PreS] -PreS2-S protein in the HBV genome may comprise the following components: 1. PreSj-PreS2-S regions in the HBV surface antigen particles of this invention; a solid substrate coated with antibodies against a particle comprising the corresponding 95726 33 amino acid chains; 2. a protein-containing solution for impregnating protein binding sites on the surface of this solid substrate; and 3. a certain amount of a radiolabeled antibody, for example an antibody against HBV surface antigen polypeptides,
Toinen diagnostiseen kokeeseen käytettävä reagenssikitti hepatitis B -viruksen genomissa olevan PreSj-PreSj-S-proteiinin koodaavan alueen koodaamia proteiineja vastaan vaikuttavien vasta-aineiden toteamiseksi testattavasta näytteestä käsittää seuraavat komponentit: 1. kiinteä substraatti, jonka pinnalle on adsorboitu tämän keksinnön mukaisiin HBV-viruksen pinnan antigeeniproteiinei-hin liittyviä PreSj-PreSj-S-proteiinin koodaavia alueita vastaavia aminohappoketjuja sisältäviä partikkeleita, ja tämä substraatti käsitellään proteiinia sisältävällä liuoksena tämän kiinteän substraatin pinnalla olevien epäspesifisten proteiinin sitoutumiskohtien kyllästämiseksi; ja 2. tietty määrä ihmisen IgG:tä tai IgM:ää vastaan vaikuttavia, radioaktiivisesta merkittyjä vasta-aineita.Another reagent kit for a diagnostic test for detecting antibodies against proteins encoded by the PreSj-PreSj-S protein coding region in the hepatitis B virus genome comprises the following components: 1. A solid substrate adsorbed on the surface of the HBV virus surface of the present invention. particles containing amino acid chains corresponding to the coding regions of the PreSj-PreSj-S protein associated with the antigenic protein, and this substrate is treated as a protein-containing solution to saturate non-specific protein binding sites on the surface of this solid substrate; and 2. a certain amount of radiolabeled antibodies against human IgG or IgM.
Edellä kuvatuissa reagenssikiteissä käytettävät, radioaktiivisesti merkityt vasta-aineet voidaan pakata liuoksen muotoon tai lyofilisoituun muotoon, joka voidaan palauttaa alkuperäiseen muotoonsa. Tämän lisäksi entsyymiin kytketyillä tai fluoresoivasti merkityillä vasta-aineilla voidaan korvata kuvatut radioaktiivisesta merkityt vasta-aineet.The radiolabeled antibodies used in the reagent crystals described above can be packaged in the form of a solution or in a lyophilized form that can be restored to its original form. In addition, enzyme-linked or fluorescently labeled antibodies can be substituted for the radiolabeled antibodies described.
i Edellä kuvattua reagenssikittiä ja toimenpidesarjaa hepati tis B -viruksen PreS,-PreS2-S-koodaavaa aluetta vastaavia po-lypeptidejä vastaan vaikuttavien vasta-aineiden toteamiseksi voidaan käyttää hyväksi eräissä sovellutuksissa, kuten määritettäessä HBV-infektio potilaasta ottamalla potilaasta seerumia ja käyttämällä edellä kuvattua koetta tai edellä kuvattua reagenssikittiä; ja ennustettaessa mahdollisuus 34 9 5 7 2 6 parantua HBV-infektiosta ottamalla seerumia infektoidusta potilaasta ja käyttämällä kuvattuja toimenpiteitä vasta-aineen ilmaisemiseksi.The reagent kit and kit described above for the detection of antibodies against polypeptides corresponding to the hepatisis B virus PreS, PreS2-S coding region can be used in some applications, such as determining HBV infection in a patient by taking serum from the patient and using the assay described above. or the reagent kit described above; and predicting the possibility of 34 9 5 7 2 6 recovery from HBV infection by taking serum from an infected patient and using the procedures described to detect the antibody.
Koetoimenpiteitä ja reagenssikittejä vasta-aineen ilmaisemiseksi voidaan käyttää eri HBV-rokotteiden kvalitatiiviseen vertailuun siten, että rokotetuista potilaista otetaan seerumia, jonka jälkeen käytetään edellä kuvattuja koetoimenpiteitä tai kittejä vasta-aineiden ilmaisemiseksi. Yleisesti, kaikki tunnetut immunologiset kokeet, joissa käytetään tätä antigeeniä reagenssina, voidaan suorittaa käyttäen tämän keksinnön mukaisia, PreS,-, PreS2- tai S-proteiinia sisältäviä partikkeleita. Yleisesti, kaikki tunnetut immunologiset kokeet, joissa käytetään vasta-ainetta sisältävää seerumia tai reagensseja, voidaan toteuttaa käyttäen vasta-aineseeru-mia, joka on tuotettu käyttämällä tämän keksinnön mukaisilla yhdistelmä-DNA-tekniikoilla tuotettua peptidiä. Näihin immunologisiin kokeisiin kuuluvat kaikki ne kokeet, jotka Lan-gone ja Van Vunakis esittävät teoksessa Methods of Enzymolo-gy, Academic Press. Voi. 70, 73 ja 74. Ne kokeet, jotka esitetään seuraavissa US-patenttijulkaisuissa: 4 459 359, 4 343 896, 4 331 761, 4 292 403, 4 228 2401, 4 157 280, 4 152 411, 4 169 012, 4 016 043, 3 839 153, 3 654 090 ja Re 31 006 sekä teoksen Methods of Enzymology volyymeissa 70, 73 ja 74, liitetään oheen tällä viittauksena.Experimental procedures and reagent kits for antibody detection can be used for qualitative comparison of different HBV vaccines by taking serum from vaccinated patients, followed by the experimental procedures or kits described above for detecting antibodies. In general, all known immunological experiments using this antigen as a reagent can be performed using PreS, PreS2, or S protein-containing particles of this invention. In general, all known immunological experiments using antibody-containing serum or reagents can be performed using antibody serum produced using a peptide produced by the recombinant DNA techniques of this invention. These immunological experiments include all experiments presented by Lan-gone and Van Vunakis in Methods of Enzymology, Academic Press. Butter. 70, 73 and 74. The experiments disclosed in the following U.S. Patents: 4,459,359, 4,343,896, 4,331,761, 4,292,403, 4,228,2401, 4,157,280, 4,152,411, 4,169,012, 4,016 043, 3,839,153, 3,654,090 and Re 31,006 and Methods of Enzymology in volumes 70, 73 and 74 are incorporated herein by reference.
ii
Esitetään samoin yhteistransfektoitu eukarioottinen isän-täsolu, joka on transfektoitu sekä esitetyllä yhdistelmävek-torilla että toisella yhdistelmä-DNA-vektorilla, joka käsittää PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen, tai pelkästään S-proteiinin koodaavan alueen, sekä MMT-promoottorin. Tämä ! toinen yhdistelmävektori käsittää mielellään lisäksi kopioi- tumisen päättyrniskohdan ja valinnaisesti valikoinnin merkit-simen. Valinnaisesti, tämä yhteistransfektoitu isäntä on transfektoitu sekä esitetyllä yhdistelmä-DNA-vektorilla, toisella yhdistelmä-DNA-vektorilla että kolmannella yhdistelmä-DNA-vektorilla, joka käsittää MMT-promoottorin ja valikoinnin merkitsimen. Tämä kolmas yhdistelmävektori käsit 35 95726 tää mielellään lisäksi kopioitumisen päättymiskohdan. Toinen ja valinnainen kolmas yhdistelmä-DNA-vektori sisältävät mielellään myös replikonin, joka mahdollistaa kasvun ja monistumisen prokarioottisessa isäntäsolussa. kuten bakteerin muodostamassa isäntäsolussa, kun tällainen isäntä transformoidaan mainitulla toisella tai valinnaisella kolmannella yhdistelmä-DNA-vektorilla.Also provided is a co-transfected eukaryotic host cell transfected with both the recombinant vector shown and another recombinant DNA vector comprising the PreS2-S protein coding region, or the S protein coding region alone, and the MMT promoter. This! the second recombinant vector preferably further comprises a copy endpoint and optionally a selection marker. Optionally, this co-transfected host is transfected with both the recombinant DNA vector shown, the second recombinant DNA vector, and a third recombinant DNA vector comprising an MMT promoter and a selection marker. This third recombinant vector preferably comprises a copy end point. The second and optional third recombinant DNA vector preferably also contain a replicon that allows for growth and replication in the prokaryotic host cell. as in a bacterial host cell, when such a host is transformed with said second or optional third recombinant DNA vector.
Näiden yhteistransfektoitujen isäntäsolujen valmistamismene-telmä käsittää eukarioottisen solun transfektoimisen sekä esitetyllä yhdistelmä-DNA-vektorilla, edellä kuvatulla toisella yhdistelmä-DNA-vektorilla, että valinnaisesti kolmannella edellä kuvatulla yhdistelmä-DNA-vektorilla. Toinen ja valinnainen kolmas edellä kuvattu yhdistelmä-DNA-vektori voidaan muodostaa tavanomaisilla tekniikoilla. Mikäli valinnaista kolmatta vektoria ei käytetä, niin toinen yhdistelmä -DNA- vektori käsittää mielellään lisäksi valikoinnin merkitsimen, kuten lääkeaineen vastustuskykyyn perustuvan merkitsimen. Mikäli toinen ja/tai valinnainen kolmas yhdis-telmä-DNA-vektori käsittää kopioitumisen päättymiskohdan, niin tämä kohta on mielellään mg-PAS-t-päättymiskohta.A method of making these co-transfected host cells comprises transfecting a eukaryotic cell with both the recombinant DNA vector shown, the second recombinant DNA vector described above, and optionally the third recombinant DNA vector described above. The second and optional third recombinant DNA vector described above can be generated by conventional techniques. If an optional third vector is not used, the second combination DNA vector will preferably further comprise a selectable marker, such as a drug resistance marker. If the second and / or optional third recombinant DNA vector comprises a transcription termination site, then this site is preferably a mg-PAS-t termination site.
Edellä kuvatussa toisessa yhdistelmä-DNA-vektorissa MMT-pro-moottori sijaitsee mielellään tässä vektorissa välittömästi ylävirran puolella PreS2-S-proteiinin koodaavasta alueesta.In the second recombinant DNA vector described above, the MMT promoter is preferably located in this vector immediately upstream of the coding region of the PreS2-S protein.
Edellä kuvatussa valinnaisessa kolmannessa yhdistelmä-DNA-vektorissa MMT-promoottori sijaitsee mielellään tässä vektorissa välittömästi ylävirran puolella valikoinnin merkitsi -mestä. On suotavaa, ettei edellä kuvattu toinen yhdistelmä-vektori eikä valinnainen kolmas yhdistelmävektori sisällä lainkaan virus-DNA-kappaleita, jotka eivät ole peräisin HBV-viruksesta, ja että nämä yhdistelmävektorit eivät ole onko-geenisiä. Näin ollen, kun nämä edulliset vektorit transfek-toidaan isäntään, ne yhdentyvät isännän kromosomiin ja rep-likoituvat passiivisesti yhdessä isäntägenomin kanssa.In the optional third recombinant DNA vector described above, the MMT promoter is preferably located in this vector immediately upstream of the selection marker. It is desirable that neither the second recombinant vector described above nor the optional third recombinant vector contain any viral DNA fragments that are not derived from HBV, and that these recombinant vectors are not oncogenic. Thus, when these preferred vectors are transfected into a host, they integrate into the host chromosome and passively replicate together with the host genome.
Esitetty vektori, edellä kuvattu toinen yhdistelmä-DNA-vek-tori sekä valinnaisesti kolmas edellä kuvattu yhdistelmä-DNA-vektori transfektoidaan yhdessä eukarioottiseen isäntään 36 . 95726 pareittaisina yhdistelminä, tai kaikki kolme vektoria yhdessä, tavanomaisia menetelmiä käyttäen. Vaihtoehtoisesti, vektori, toinen yhdistelmä-DNA-vektori ja valinnaisesti kolmas yhdistelmä-DNA-vektori transfektoidaan eukarioottiseen isäntään eri vaiheissa. Vektori transfektoidaan ensin eukarioottiseen isäntään tämän keksinnön mukaisella menetelmällä, jolloin saadaan tämän keksinnön mukainen transfektoitu isäntä. Tämän jälkeen tämä transfektoitu isäntä transfektoidaan toisella edellä kuvatulla yhdistelmä-DNA-vektorilla ja valinnaisesti kolmannella edellä kuvatulla yhdistelmä-DNA-vektorilla, tavanomaisia menetelmiä käyttäen, jolloin saadaan tämän keksinnön mukainen yhteistransfektoitu isäntä.The disclosed vector, the second recombinant DNA vector described above, and optionally the third recombinant DNA vector described above are co-transfected into a eukaryotic host 36. 95726 in paired combinations, or all three vectors together, using conventional methods. Alternatively, the vector, the second recombinant DNA vector, and optionally the third recombinant DNA vector are transfected into the eukaryotic host at various stages. The vector is first transfected into a eukaryotic host by the method of the present invention to obtain a transfected host of the present invention. This transfected host is then transfected with the second recombinant DNA vector described above and optionally with the third recombinant DNA vector described above, using conventional methods, to give the co-transfected host of this invention.
Esitetty vektori, toinen yhdistelmä-DNA-vektori ja valinnainen kolmas yhdistelmä-DNA-vektori käsittävät kukin valikoinnin merkitsimen, jotka poikkeavat toisistaan, jolloin uuden transfektoidun isännän tunnistaminen kussakin peräkkäisessä, lopulliseen, tämän keksinnön mukaiseen transfektoituun isäntään johtavassa transfektointivaiheessa on mahdollista.The disclosed vector, the second recombinant DNA vector, and the optional third recombinant DNA vector each comprise a selection marker that differs from each other, allowing the identification of a new transfected host in each successive transfection step leading to a final transfected host of this invention.
Tällaiset sekundääriset transfektointivaiheet toteutetaan moninkertaisesti transfektoidun isäntäsolun käsittämän PreS,-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen geenikopioiden lukumäärän suurentamiseksi. On edullista, ettei toinen yhdistelmävektori eikä valinnainen kolmas yhdistelmävektori käsitä repli-konia, joka kykenee toimimaan eukarioottisessa solussa.Such secondary transfection steps are performed to increase the number of gene copies of the coding region of the PreS1-PreS2-S protein contained in the multiple transfected host cell. It is preferred that neither the second recombinant vector nor the optional third recombinant vector comprises a replicon capable of functioning in a eukaryotic cell.
Tässä esitetään samoin menetelmä yhteistransfektoidun isännän tuottaman partikkelin valmistamiseksi, joka partikkeli käsittää vähintään yhden, koko PreS,-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen koodaaman proteiinin, tämän menetelmän käsittäessä: a) yhteistransfektoidun eukarioottisen isäntäsolun viljelemisen sellaisissa viljelyalustassa, vallitsevissa olosuhteissa, että tämä isäntä kykenee ilmentämään näitä proteiineja; ja b) tämän partikkelin eristämisen. Tällainen yhteistransfektoitu isäntä kykenee mielellään erittämään nämä tällaiseksi partikkeliksi kasautuneet proteiinit alustaan. Tämä menetelmä käsittää mielellään lisäksi raskasmetallien ionien tai steroidihormonien lisäämisen tällaiseen 37 95726 viljelyalustaan, mikä edistää yhteistransformoitujen vektoreiden sisältämän PreS,-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen ilmentymistä. Mieluiten käytetään raskasmetallien ioneja, erityisesti sinkin tai kadmiumin ioneja. Raskasmetallien ionien tai steroidihormonien optimaalinen pitoisuus alustassa voidaan määrittää tavanomaisin menetelmin. Mikäli yhteis-transfektoitu isäntä erittää nämä partikkelit suoraan viljelyalustaan, niin tällöin nämä partikkelit voidaan eristää tämän keksinnön mukaisen yhteistransformoidun isännän vilje-lyalustasta tekniikoilla, joita käytetään tavanomaisesti proteiinien eristämiseen. Mikäli yhteistransfektoitu isäntä ei eritä näitä partikkeleita viljelyalustaan, niin tällöin ne saadaan tämän yhteistransfektoidun isännän viljelmän ha-jotteesta tavanomaisilla viljelmän hajotustekniikoilla.Also disclosed herein is a method of producing a particle produced by a co-transfected host comprising at least one protein encoded by the entire PreS, PreS2-S coding region, the method comprising: a) culturing a co-transfected eukaryotic host cell in a culture medium; to express these proteins; and b) isolating the particle. Such a co-transfected host is preferably able to secrete these proteins accumulated as such particles into the medium. Preferably, this method further comprises adding heavy metal ions or steroid hormones to such a culture medium, which promotes the expression of the coding region of the PreS1-PreS2-S protein contained in the co-transformed vectors. Preferably, heavy metal ions are used, especially zinc or cadmium ions. The optimal concentration of heavy metal ions or steroid hormones in the medium can be determined by conventional methods. If the co-transfected host secretes these particles directly into the culture medium, then these particles can be isolated from the culture medium of the co-transformed host of this invention by techniques conventionally used to isolate proteins. If the co-transfected host does not secrete these particles into the culture medium, then they are obtained from the disintegration of the culture of this co-transfected host by conventional culture digestion techniques.
Nämä partikkelit eristetään glykosyloituneessa muodossa, ja ne muodostuvat PreS,-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen, PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen sekä S-proteiinin koodaavan alueen koodaamista proteiineista.These particles are isolated in glycosylated form and consist of proteins encoded by PreS, the PreS2-S protein coding region, the PreS2-S protein coding region, and the S protein coding region.
Tässä hakemuksessa esitetään samoin rokote, joka käsittää immunologisesti suojaavan määrän (mielellään 1-20 ^g) tässä esitetyn yhteistransfektoidun isännän tuottamia partikkeleita.This application also provides a vaccine comprising an immunologically protective amount (preferably 1-20 μg) of particles produced by a co-transfected host disclosed herein.
Yhteistransfektoidun isännän tuottama partikkeli ei sisällä . lainkaan virusperäisiä DNA-komponentteja, ja näin ollen sii hen ei liity luonnollisista lähteistä peräisin olevilla rokotteilla tavallisesti esiintyviä epätoivottuja sivuvaikutuksia, kuten tahatonta infektoitumista viruksella, allergisia reaktioita, kuumeita ja muita vastaavia. Esitettyä rokotetta, joka käsittää immunologisesti suojaavan määrän yh-teistransfektoidun isännän tuottamia partikkeleita, voidaan käyttää parantamaan HBV-virukseen kohdistuvaa immuunireaktiota, ja sillä voidaan välttää reagoimattomuus sellaisille hepatitis B -virusta vastaan vaikuttaville rokotteille, jotka eivät käsitä vähintään yhtä, koko PreS,-PreS2-S-proteiinin koodaavan ketjun koodaamaa proteiinia.The particle produced by the co-transfected host does not contain. no viral DNA components at all, and thus is not associated with the undesirable side effects normally associated with vaccines from natural sources, such as unintentional infection with a virus, allergic reactions, fever, and the like. The disclosed vaccine comprising an immunologically protective amount of particles produced by a co-transfected host can be used to enhance the immune response to HBV and to avoid unresponsiveness to hepatitis B virus vaccines that do not comprise at least one, whole PreS, -PreS A protein encoded by the chain encoding the S protein.
38 9 5 7 2 638 9 5 7 2 6
Rokote voidaan valmistaa lisäämällä immunologisesti suojaava määrä yhteistransfektoidun isännän tuottamia partikkeleita sopivaan puskuriin, kuten esimerkiksi fosfaatilla puskuroituun suolaliuokseen. Rokote voi lisäksi käsittää apuainetta, kuten alumiinihydroksidia ja muita vastaavia.The vaccine can be prepared by adding an immunologically protective amount of particles produced by the co-transfected host to a suitable buffer, such as phosphate buffered saline. The vaccine may further comprise an excipient such as aluminum hydroxide and the like.
Vaihtoehtoisesti, esitetyn yhteistransfektoidun isännän tuottamien partikkeleiden sisältämät polypeptidit voidaan irrottaa mainituista partikkeleista ja ne voidaan liittää uudestaan lipidivesikkeliin. Hepatitis B -virusta vastaan vaikuttava rokote voidaan valmistaa käyttämällä näitä lipi-divesikkeleitä, jotka käsittävät tämän keksinnön mukaisista partikkeleista saatuja polypeptidejä. Lipidivesikkeleitä käsittävä rokote voi lisäksi käsittää apuainetta, kuten alumiinihydroksidia .Alternatively, the polypeptides contained in the particles produced by the disclosed co-transfected host may be cleaved from said particles and reattached to the lipid vesicle. A vaccine against hepatitis B virus can be prepared using these Lipi dihydrogens comprising polypeptides derived from the particles of this invention. The vaccine comprising lipid vesicles may further comprise an excipient such as aluminum hydroxide.
Esitetyn rokotteen muodostavia yhteistransfektoidun isännän tuottamia partikkeleita voidaan käyttää yhdessä fysiologisesti hyväksyttävän laimentimen (väliaineen), kuten fosfaatilla puskuroidun suolaliuoksen, kanssa.The particles produced by the co-transfected host constituting the disclosed vaccine may be used in conjunction with a physiologically acceptable diluent (medium) such as phosphate buffered saline.
Rokote, joka käsittää immunologisesti suojaavan määrän esitettyjä partikkeleita, voidaan valmistaa ja sitä voidaan käyttää sillä samalla yleisellä tavalla, joka kuvataan US-patenttijulkaisussa no. 4 118 479.A vaccine comprising an immunologically protective amount of the disclosed particles can be prepared and used in the same general manner as described in U.S. Pat. 4,118,479.
Rokotetta voidaan antaa ihonalaisella, ihonsisäisellä tai lihaksensisäisellä injektiolla. Vaikka edullinen antotapa riippuukin kyseisestä rokotteesta, niin kuitenkin oletetaan, että lihaksen sisäinen injektio on yleisesti sopivin. Anto-kertojen tiheys riippuu rokotteesta.The vaccine can be given by subcutaneous, intradermal or intramuscular injection. Although the preferred route of administration depends on the particular vaccine, it is believed that intramuscular injection is generally most suitable. The frequency of administration depends on the vaccine.
Tämä keksintö kohdistuu menetelmään PreSj-PreS^S-proteiinin koodaavan alueen koodaamia proteiineja vastaan vaikuttavien vasta-aineiden läsnäolon ilmaisemiseksi nisäkkään veriseerumista saadusta näytteestä, tämän menetelmän käsittäessä vaiheet, joissa: 39 95726 a) näyte saatetaan kosketuksiin tämän keksinnön mukaisen yh-teistransfektoidun isännän tuottamalla merkitsemättömillä partikkeleilla pinnoitetun kiinteän substraatin kanssa; b) mainittua kosketuksiin saatettua näytettä inkuboidaan ja se pestään; c) mainittu kosketuksiin saatettu näyte saatetaan kosketuksiin tämän keksinnön mukaisten merkittyjen partikkeleiden kanssa, jolloin saadaan merkitty, kosketuksiin saatettu näyte; d) mainittua merkittyä ja kosketuksiin saatettua näytettä inkuboidaan ja se pestään; ja e) merkityn partikkelin määrä merkityssä, kosketuksiin saatetussa näytteessä määritetään.This invention relates to a method for detecting the presence of antibodies against proteins encoded by the PreSj-PreS ^ S protein coding region in a sample obtained from a mammalian blood serum, the method comprising the steps of: a) contacting the sample with a co-transfected host of the present invention; with a particle-coated solid substrate; (b) incubating and washing said contacted sample; c) contacting said contacted sample with the labeled particles of this invention to obtain a labeled, contacted sample; (d) incubating and washing said labeled and contacted sample; and e) determining the amount of labeled particle in the labeled, contacted sample.
Tämä keksintö kohdistuu samoin menetelmään PreS,-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen koodaamien proteiinien läsnäolon ilmaisemiseksi nisäkkään veriseerumista saadusta näytteestä, tämän menetelmän käsittäessä vaiheet, joissa: a) valmistetaan vasta-ainetta sisältävä seos, joka vasta-aine on tuotettu tämän keksinnön mukaisten partikkeleiden käsittämällä immunogeenillä; b) näyte saatetaan kosketuksiin tämän seoksen ensimmäisen osan sekä merkityn immunogeenin kanssa, ja tätä ensimmäistä osaa inkuboidaan ja se pestään; c) antigeeniä sisältämätön vertailunäyte saatetaan kosketuksiin tämän seoksen toisen osan sekä merkityn immunogeenin kanssa, tätä toista osaa inkuboidaan ja se pestään; d) edellisten vaiheiden b) ja c) seoksiin lisätään sama määrä proteiinia A käsittävää stafylokokkia, molempia seoksia inkuboidaan ja neste erotetaan kiintoaineesta; ja e) merkityn immunogeenin määrä kummassakin, edellä esitetyssä vai- heessa d) tuloksena olevassa seoksessa määritetään.The present invention also relates to a method for detecting the presence of proteins encoded by the coding region of the PreS, -PreS2-S protein in a sample obtained from mammalian blood serum, the method comprising the steps of: a) preparing an antibody-containing mixture produced by the particles of the invention; comprising an immunogen; (b) contacting the sample with the first portion of this mixture and the labeled immunogen, and incubating and washing this first portion; (c) contacting the antigen-free reference sample with the second portion of this mixture and the labeled immunogen, incubating the second portion and washing; d) adding the same amount of staphylococcus comprising protein A to the mixtures of steps b) and c) above, incubating both mixtures and separating the liquid from the solid; and e) determining the amount of labeled immunogen in each of the resulting mixtures in step d) above.
Tämä keksintö kohdistuu samoin diagnostiseen kittiin PreSi-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen koodaamia proteiineja vastaan vaikuttavien vasta-aineiden läsnäolon ilmaisemiseksi nisäkkään veriseerumista saadusta näytteestä, tämän kitin käsittäessä: 40 95726 a) merkitsemättömiä proteiineja, jotka muodostavat tämän keksinnön mukaisen, kiinteään kantajaan kiinnitetyn partikkelin; ja b) ihmisen IgG:tä tai IgM:ää, esimerkiksi, vastaan vaikuttavia, merkittyjä vasta-aineita.The present invention is also directed to a diagnostic kit for detecting the presence of antibodies to proteins encoded by the PreSi-PreS2-S coding region from a sample obtained from a mammalian blood serum, the kit comprising: a) unlabeled proteins forming a solid support of the invention; ; and b) labeled antibodies against human IgG or IgM, for example.
Tämä keksintö kohdistuu samoin diagnostiseen kittiin PreSj-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen koodaamien proteiinien läsnäolon ilmaisemiseksi nisäkkään veriseerumista saadusta näytteestä, tämän kitin käsittäessä: a) tämän keksinnön mukaisten partikkeleiden tuottamia, kiinteään kantajaan kiinnitettyjä vasta-aineita; sekä b) tämän keksinnön mukaisten partikkeleiden tuottamia, merkittyjä vasta-aineita.The present invention is also directed to a diagnostic kit for detecting the presence of proteins encoded by the coding region of the PreS1-PreS2-S protein in a sample obtained from mammalian blood serum, the kit comprising: a) antibodies supported by the particles of this invention attached to a solid support; and b) labeled antibodies produced by the particles of this invention.
Tässä hakemuksessa esitetään yhdistelmä-DNA-konkatameeri, joka käsittää: a) plasmidivektorin, joka sisältää PreS,-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen ja vähintään yhden muun plasmidivektorin, joka käsittää yhden seuraavista koodaavis-ta alueista: PreSj-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen tai PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen tai S-proteiinin koodaavan alueen; sekä b) MMT-promoottorin. Tällainen konkatameeri käsittää mielellään lisäksi valikoinnin merkitsimen ja kopioitumisen päättymiskohdan.This application provides a recombinant DNA concatamer comprising: a) a plasmid vector comprising the PreS1-PreS2-S protein coding region and at least one other plasmid vector comprising one of the following coding regions: PreSj-PreS2-S protein a coding region or a PreS2-S protein coding region or an S protein coding region; and b) the MMT promoter. Such a concatamer preferably further comprises a selection marker and a copy termination site.
Esitetään samoin menetelmä transfektoidun isännän tuottaman partikkelin valmistamiseksi, joka partikkeli käsittää vähintään yhden, koko PreS,-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen koodaaman proteiinin, menetelmän käsittäessä: a) transfektoidun eukarioottisen isäntäsolun, joka käsittää esitetyn konkatameerin, viljelemisen sellaisissa kasvatusalustassa vallitsevassa olosuhteissa, että tämä isäntä kykenee ilmentämään näitä proteiineja; sekä b) mainitun partikkelin eristämisen. Tämä yhteistransfektoitu isäntä kykenee erittämään nämä partikkeleiksi kasautuneet proteiinit alustaan. Tämä menetelmä käsittää mielellään lisäksi raskasmetallien ionien tai steroidihormonien lisäämisen tällaiseen viljelyalustaan, mikä edistää transfektoitujen vektoreiden sisältämän PreS,- li 4i 55726Also provided is a method of producing a particle produced by a transfected host comprising at least one protein encoded by the entire PreS, PreS2-S coding region, comprising: a) culturing a transfected eukaryotic host cell comprising the disclosed concatamer in a culture medium in such a culture; this host is capable of expressing these proteins; and b) isolating said particle. This co-transfected host is capable of secreting these particles accumulated into particles into the medium. This method preferably further comprises adding heavy metal ions or steroid hormones to such a culture medium, which promotes the PreS, li 4i 55726 content of the transfected vectors.
PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen ilmentymistä. Mieluiten käytetään raskasmetallien ioneja, erityisesti sinkin ja kadmiumin ioneja. Raskasmetallien ionien tai steroidihormonien optimaalinen pitoisuus alustassa voidaan määrittää tavanomaisilla tekniikoilla. Mikäli konkatameerillä transfektoi-tu isäntä erittää nämä partikkelit suoraan viljelyalustaan, niin nämä partikkelit voidaan tällöin eristää transfektoidun isännän viljelyalustasta tekniikoilla, joita käytetään tavallisesti proteiinien eristämiseen. Mikäli transfektoitu isäntä ei eritä näitä partikkeleita viljelyalustaan, niin tällöin ne saadaan tämän transfektoidun isännän viljelmän hajotteesta tekniikoilla, joita tavanomaisesti käytetään viljelmien hajottamiseen. Nämä partikkelit eristetään gly-kosyloituneessa muodossa, ja ne muodostuvat PreSj-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen, PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen ja S-proteiinin koodaavan alueen koodaamista proteiineista.Expression of the coding region of the PreS2-S protein. Preferably, heavy metal ions are used, especially zinc and cadmium ions. The optimal concentration of heavy metal ions or steroid hormones in the medium can be determined by conventional techniques. If the concatamer-transfected host secretes these particles directly into the culture medium, then these particles can be isolated from the culture medium of the transfected host by techniques commonly used to isolate proteins. If the transfected host does not secrete these particles into the culture medium, then they are obtained from the culture lysate of this transfected host by techniques conventionally used to lyse the cultures. These particles are isolated in Gly-cosylated form and consist of proteins encoded by the PreSj-PreS2-S protein coding region, the PreS2-S protein coding region, and the S protein coding region.
Esitetyllä konkatameerillä transfektoidun isännän tuottama partikkeli ei sisällä lainkaan virusperäisiä DNA-komponentteja, joten siihen ei liity luonnollisista lähteistä peräisin olevilla rokotteilla tavallisesti esiintyviä epätoivottuja sivuvaikutuksia, kuten tahatonta infektoitumista viruksella, allergisia reaktioita, kuumeita ja muita vastaavia. Rokotetta, joka käsittää immunologisesti suojaavan määrän konkatameerillä transfektoidun isännän tuottamia partikkeleita, voidaan käyttää parantamaan HBV-virukseen kohdistuvaa immuunireaktiota ja sillä voidaan välttää reagoimattomuus sellaisille hepatitis B -virusta vastaan vaikuttaville rokotteille, jotka eivät käsitä vähintään yhtä koko PreS,-PreS2-S-proteiinin koodaavan ketjun koodaamaa proteiinia.The particle produced by the host transfected with the disclosed concatamer does not contain any viral DNA components, so it is not associated with the undesirable side effects commonly encountered with vaccines from natural sources, such as inadvertent infection with the virus, allergic reactions, fever, and the like. A vaccine comprising an immunologically protective amount of particles produced by a concatamer-transfected host can be used to enhance the immune response to HBV and to avoid unresponsiveness to hepatitis B virus vaccines that do not comprise at least one whole of the PreS, PreS2-S protein. protein encoded by the chain.
42 9 5 7 2 642 9 5 7 2 6
Rokote voidaan valmistaa lisäämällä immunologisesti suojaava määrä tämän keksinnön mukaisella konkatameerillä transfek-toidun isännän tuottamia partikkeleita sopivaan puskuriin, kuten fosfaatilla puskuroituun suolaliuokseen. Rokote voi lisäksi käsittää apuainetta, kuten alumiinihydroksidia tai muuta vastaavaa.A vaccine can be prepared by adding an immunologically protective amount of particles produced by a host transfected with a concatamer of this invention to a suitable buffer, such as phosphate buffered saline. The vaccine may further comprise an excipient such as aluminum hydroxide or the like.
Vaihtoehtoisesti, konkatameerillä transfektoidun isännän tuottamien partikkeleiden käsittämät polypeptidit voidaan irrottaa mainituista partikkeleista ja liittää uudestaan lipidivesikkeliin. Hepatitis B -virusta vastaan vaikuttava rokote voidaan valmistaa käyttämällä näitä lipidivesikkelei-tä, jotka käsittävät esitettyjen partikkeleiden sisältämiä polypeptidejä. Lipidivesikkeleitä käsittävä rokote voi lisäksi käsittää apuainetta, kuten alumiinihydroksidia.Alternatively, polypeptides comprised of particles produced by a concatamer-transfected host may be cleaved from said particles and reattached to the lipid vesicle. A vaccine against hepatitis B virus can be prepared using these lipid vesicles comprising the polypeptides contained in the disclosed particles. The vaccine comprising lipid vesicles may further comprise an excipient such as aluminum hydroxide.
Rokotteen muodostavia, konkatameerillä transfektoidun isännän tuottamia partikkeleita voidaan käyttää yhdessä fysiologisesti hyväksyttävän laimentimen (väliaineen), esimerkiksi fosfaatilla puskuroidun suolaliuoksen, kanssa.The vaccine-forming particles produced by the concatamer-transfected host can be used in conjunction with a physiologically acceptable diluent (medium), for example, phosphate-buffered saline.
Rokote, joka käsittää immunologisesti suojaavan määrän esitettyjä partikkeleita, voidaan valmistaa ja sitä voidaan käyttää sillä samalla yleisellä tavalla, joka kuvataan US-patenttijulkaisussa no. 4 118 497.A vaccine comprising an immunologically protective amount of the disclosed particles can be prepared and used in the same general manner as described in U.S. Pat. 4,118,497.
Il 43 95726 Tätä rokotetta voidaan antaa ihonalaisella, ihonsisäisellä tai lihaksensisäisellä injektiolla. Vaikka edullinen antotapa riippuukin kyseessä olevasta rokotteesta, niin kuitenkin oletetaan, että lihaksensisäinen injektio on yleisesti sopivin. Antokertojen tiheys riippuu rokotteesta.Il 43 95726 This vaccine can be given by subcutaneous, intradermal or intramuscular injection. Although the preferred route of administration depends on the vaccine in question, intramuscular injection is generally considered to be the most appropriate. The frequency of administration depends on the vaccine.
Tämä keksintö kohdistuu samoin menetelmään PreS^-PreS2~S-proteiinin koodaavan alueen koodaamia proteiineja vastaan vaikuttavien vasta-aineiden läsnäolon ilmaisemiseksi nisäkkään veriseerumista saadusta näytteestä, tämän menetelmän käsittäessä vaiheet, joissa: a) näyte saatetaan kosketuksiin tämän keksinnön mukaisella konkatameerillä transfektoidun isännän tuottamilla, merkitsemättömillä partikkeleilla pinnoitetun kiinteän substraatin kanssa; b) mainittua kosketuksiin saatettua näytettä inkuboidaan ja se pestään; c) mainittu kosketuksiin saatettu näyte saatetaan kosketuksiin tämän keksinnön mukaisten merkittyjen partikke-leiden kanssa, jolloin saadaan merkitty, kosketuksiin saatettu näyte; d) mainittua merkittyä, kosketuksiin saatettua näytettä inkuboidaan ja se pestään; ja ·· e) merkityn partikkelin määrä merkityssä, kosketuksiin saatetussa näytteessä määritetään.The present invention is also directed to a method for detecting the presence of antibodies to proteins encoded by the coding region of the PreS1-PreS2-S protein from a sample obtained from a mammalian blood serum, the method comprising the steps of: a) contacting the sample with a concatamer-transfected host of the invention; with a particle-coated solid substrate; (b) incubating and washing said contacted sample; c) contacting said contacted sample with the labeled particles of this invention to obtain a labeled, contacted sample; d) incubating and washing said labeled, contacted sample; and ·· (e) the amount of labeled particle in the labeled, contacted sample is determined.
Tämä keksintö kohdistuu samoin menetelmään PreS^-PreS2~S-proteiinin koodaavan alueen koodaamien proteiinien läsnäolon ilmaisemiseksi nisäkkään veriseerumista saadusta näytteestä, tämän menetelmän käsittäessä vaiheet, joissa: a) valmistetaan vasta-ainetta sisältävä seos, joka vasta-aine on tuotettu tämän keksinnön mukaisten partikkeleiden käsittämällä immunogeenillä; b) näyte saatetaan kosketuksiin tämän seoksen ensimmäisen osan sekä merkityn immunogeenin kanssa ja tätä ensimmäistä osaa inkuboidaan ja se pestään; 44 95726 c) antigeeniä sisältämätön vertailunäyte saatetaan kosketuksiin tämän seoksen toisen osan sekä merkityn immunogeenin kanssa, ja tätä toista osaa inkuboidaan ja se pestään; d) edellisten vaiheiden b) ja c) seoksiin lisätään sama määrä proteiinia A käsittävää stafylokokkia, molempia seoksia inkuboidaan ja neste erotetaan kiintoaineesta; ja e) merkityn immunogeenin määrä kummassakin, edellä esitetyssä vaiheessa d) tuloksena olevassa seoksessa määritetään .The present invention also relates to a method for detecting the presence of proteins encoded by the coding region of the PreS1-PreS2-S protein in a sample obtained from mammalian blood serum, the method comprising the steps of: a) preparing an antibody-containing mixture produced by the particles of the invention; comprising an immunogen; (b) contacting the sample with the first portion of this mixture and the labeled immunogen and incubating and washing this first portion; 44 95726 (c) the antigen-free control sample is contacted with a second portion of this mixture and the labeled immunogen, and this second portion is incubated and washed; d) adding the same amount of staphylococcus comprising protein A to the mixtures of steps b) and c) above, incubating both mixtures and separating the liquid from the solid; and e) determining the amount of labeled immunogen in each of the resulting mixtures in step d) above.
Tämä keksintö kohdistuu samoin diagnostiseen kittiin PreS^-PreS2~S-proteiinin koodaavan alueen koodaamia proteiineja vastaan vaikuttavien vasta-aineiden läsnäolon ilmaisemiseksi nisäkkään veriseerumista saadusta näytteestä, tämän kitin käsittäessä; a) merkitsemättömiä proteiineja, jotka muodostavat tämän keksinnön mukaisen, kiinteään kantajaan kiinnitetyn partikkelin; ja b) ihmisen IgG:tä tai IgM:ää, esimerkiksi, vastaan vaikuttavia, merkittyjä vasta-aineita.The present invention is also directed to a diagnostic kit for detecting the presence of antibodies against proteins encoded by the coding region of the PreS1-PreS2-S protein from a sample obtained from a mammalian blood serum, the kit comprising; a) unlabeled proteins that form a particle attached to a solid support of this invention; and b) labeled antibodies against human IgG or IgM, for example.
Tämä keksintö kohdistuu samoin diagnostiseen kittiin PreS^-PreS2~S-proteiinin koodaavan alueen koodaamien proteiinien läsnäolon ilmaisemiseksi nisäkkään veriseerumista saadusta näytteestä, tämän kitin käsittäessä: a) tämän keksinnön mukaisten partikkelien indusoimia, kiinteään kantajaan kiinnitettyjä vasta-aineita; sekä b) tämän keksinnön mukaisten partikkeleiden tuottamia, merkittyjä vasta-aineita.The present invention is also directed to a diagnostic kit for detecting the presence of proteins encoded by the coding region of the PreS1-PreS2-S protein from a sample obtained from mammalian blood serum, the kit comprising: a) antibodies induced by the particles of this invention attached to a solid support; and b) labeled antibodies produced by the particles of this invention.
Ensimmäinen edullinen suoritusmuotoThe first preferred embodiment
Ensimmäisessä edullisessa suoritusmuodossa yksi tämän keksinnön mukainen vektori käsittää vektorimuodosteen, joka sisältää geeniketjut yhdistelmäplasmideista pBPV342-12 (Law et ai., Molecular and Cellular Biol., Voi. 3, sivu 2110, 45 95726 1983) sekä pAOI (Cummings, I.W. et ai., Proc. Natl. Aca.In a first preferred embodiment, one vector of the present invention comprises a vector construct containing gene chains from the recombinant plasmids pBPV342-12 (Law et al., Molecular and Cellular Biol., Vol. 3, page 2110, 45 95726 1983) and pAOI (Cummings, IW et al. , Proc. Natl. Aca.
Sei. USA, Voi. 77, sivu 1842, 1980). Eräitä näistä plasmi-deista peräisin olevia geneettisiä elementtejä on yhdistetty tämän keksinnön mukaisen vektorin, josta käytetään lyhennettä pDMI, aikaansaamiseksi (katso kuva 3). Plasmidi pDM1, jonka sisältämä geenisegmentti käsittää PreS1~PreS2~ S-proteiinin koodaavan alueen mainittuun proteiinin koodaa-vaan alueeseen liittyvän luonnollisen promoottorijärjestelmän säätelyn alaisena, neomysiinin vastustuskyvyn geenin, MMT-promoottorin ja SV40-viruksen PAS-t-toiminnon, viedään tämän jälkeen transfektoimalla mihin tahansa yhteen lukuisista eukarioottisista soluista, kuten nisäkässoluista, tämän keksinnön mukaisten partikkeleiden ilmentämiseksi suurina määrinä ja mielellään niiden erittämiseksi.Sci. USA, Vol. 77, page 1842, 1980). Some genetic elements derived from these plasmids have been combined to provide a vector of the present invention, abbreviated pDMI (see Figure 3). Plasmid pDM1, the gene segment of which comprises the coding region of the PreS1-PreS2-S protein under the control of a natural promoter system associated with said protein coding region, transfection of the neomycin resistance gene, the MMT promoter and the SV40 virus PAS-t function to any one of a plurality of eukaryotic cells, such as mammalian cells, for expressing and preferably secreting the particles of this invention in large amounts.
Plasmidi pBPV342-12 (katso kuva 1) sisältää geeniketjut, jotka käsittävät MMT-promoottorin, neomysiinin vastustuskyvyn geenin, SV40-viruksen PAS-t-toiminnon ja naudan pa-pillomaviruksen (BPV) genomin. Plasmidin pDM1 muodostamisen aikana plasmidi pBPV342-12 pilkotaan entsyymillä BamHI, jonka seurauksena plasmidi katkeaa kahdeksi DNA-kappaleeksi.Plasmid pBPV342-12 (see Figure 1) contains gene chains comprising the MMT promoter, the neomycin resistance gene, the SV40 virus PAS-t function, and the bovine papillomavirus (BPV) genome. During the construction of plasmid pDM1, plasmid pBPV342-12 is cleaved by the enzyme BamHI, resulting in the cleavage of the plasmid into two pieces of DNA.
Nämä kappaleet_erotetaan, jonka jälkeen 7,95 kiloemäsparin (kb) kappale, joka käsittää koko BPV-genomin, heitetään * pois. BPV DNA:n eliminointi on erittäin edullista, sillä siten vältetään BPV DNA:n tai BPV-proteiinien sisältyminen tämän keksinnön mukaiseen partikkeliin, jota on tarkoitus käyttää rokotevalmisteessa. Jäljellä oleva BamHI-kappale (6,65 kb) plasmidista pBPV342-12, joka kappale sisältää MMT-promoottorin, neomysiinin vastustuskyvyn geenin ja SV40-viruksen PAS-t-alueen geeniketjut, ligatoidaan tämän jälkeen tavanomaisia tekniikoita käyttäen plasmidista pAOI saatuun DNA-ketjuun, joka kuitenkin sisältää vahingoittumattoman PreS^-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen (tarkasteltu jäljempänä; katso myös kuvaa 2).These fragments are separated, after which a 7.95 kilobase pair (kb) fragment comprising the entire BPV genome is discarded *. Elimination of BPV DNA is highly advantageous, as it avoids the inclusion of BPV DNA or BPV proteins in the particle of this invention to be used in the vaccine preparation. The remaining BamHI fragment (6.65 kb) from plasmid pBPV342-12, which contains the MMT promoter, neomycin resistance gene and SV40 virus PAS-t region gene chains, is then ligated to the DNA strand from plasmid pAOI using standard techniques. however, which contains the coding region of the intact PreS1-PreS2-S protein (discussed below; see also Figure 2).
46 9572646 95726
Plasmidi pAOI (katso kuva 2), joka sisältää koko hepatitis B-viruksen genomin, pilkotaan entsyymillä EcoRI, jolloin saadaan 3,2 kiloemäsparin kappale. Tämä 3,2 kiloemäsparin kappale ligatoidaan itseensä peräkkäisten toisintojen muodostamiseksi, jotka toisinnot käsittävät sekä hepatitis B-viruksen ytimen että pinnan antigeenejä koodaavia geeni-ketjuja sisältävän, pitkän konkatameerisen DNA-rakenteen.Plasmid pAOI (see Figure 2), which contains the entire hepatitis B virus genome, is digested with EcoRI to give a 3.2 kilobase pair fragment. This 3.2 kilobase pair fragment is ligated to itself to form successive replicas comprising both a hepatitis B virus core and a long concatameric DNA construct containing gene chains encoding surface antigens.
Tämä menetelmä hepatitis B-viruksen geeniketjujen tällaiseksi manipuloimiseksi, joka on välttämätöntä plasmidiin pAOI toteutetun molekulaarisen kloonaamisen aiheuttaman permutaation välttämiseksi sekä toiminnallisen järjestäytymisen palauttamiseksi PreS^-PreS2_S-proteiinin koodaavan alueen suhteen, esitetään julkaisussa Cummings et ai.,This method for such manipulation of hepatitis B virus gene chains, which is necessary to avoid permutation caused by molecular cloning of plasmid pAOI and to restore functional organization with respect to the coding region of the PreS1-PreS2_S protein, is described in Cummings et al.,
Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Voi. 77, sivu 1842, 1980. Tämän jälkeen toteutetaan pilkkominen entsyymillä Bglll, jolloin HBV-viruksen ytimen antigeenin geenisegmentti saadaan eliminoiduksi, ja tällöin jäljelle jää DNA-kappale (2,78 kb), joka käsittää hepatitis B-virusgenomista PreS^-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen sekä tämän alueen luonnollisen promoottorijärjestelmän (ρ^β)· Tämän jälkeen lineaarinen, plasmidista pBPV342-12 saatu BamHI-kappale (katso kuva 1) ja plasmidista pAOI saatu * Bglll-kappale (katso kuva 2) ligatoidaan yhdistelmäplasmi- din pDM1 (katso kuva 3) aikaansaamiseksi, joka yhdistelmä-plasmidi käsittää PreS^-PreS2~S-proteiinin koodaavan alueen luonnollisen promoottorin .(Put)) .Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 77, page 1842, 1980. This is followed by digestion with the enzyme BglII to eliminate the HBV virus core antigen gene segment, leaving a DNA fragment (2.78 kb) comprising the hepatitis B virus genome PreS1-PreS2-S The coding region of the protein and the natural promoter system of this region (ρ ^ β) · The linear BamHI fragment from plasmid pBPV342-12 (see Figure 1) and the * BglII fragment from plasmid pAOI (see Figure 2) are then ligated into the recombinant plasmid pDM1. (see Figure 3), which recombinant plasmid comprises the natural promoter of the coding region of the PreS1-PreS2-S protein (Put).
noWell
Toinen edullinen suoritusmuoto Tämän keksinnön toisessa edullisessa suoritusmuodossa plas-midissa pDM1 oleva luonnollinen promoottori irrotetaan pilkkomalla entsyymeillä Bglll ja BamHI siten, että MMT-premoottori sijoittuu suoraan ennen PreS^-S-proteiinin koodaavaa aluetta, jolloin MMT-promoottori säätelee mainitun koodaavan alueen kopioitumista. Entsyymeillä BamHI ja Bglll pilkkomisen jälkeen saadaan kolme erillistä DNA- 47 95726 kappaletta (katso kuvat 4A ja 4B): 1) 5,1 kiloemäsparin kappale, joka sisältää polyadeny-laatiokohdan ja MMT-promoottorin; 2) 3,0 kiloemäsparin kappale, joka sisältää neomysiinin vastustuskyvyn geenin ja luonnollisen promoottorin; ja 3) 1,4 kiloemäsparin kappale, joka sisältää PreS2~S-proteiinin koodaavan alueen.Another Preferred Embodiment In another preferred embodiment of the present invention, the native promoter in plasmid pDM1 is cleaved by digestion with BglII and BamHI so that the MMT premotor is located immediately before the coding region of the PreS1-S protein, wherein the MMT promoter regulates said coding region. After digestion with BamHI and BglII, three separate DNA fragments (47,957,726) are obtained (see Figures 4A and 4B): 1) a 5.1 kilobase pair fragment containing a polyadenylation site and an MMT promoter; 2) a 3.0 kilobase pair fragment containing the neomycin resistance gene and a natural promoter; and 3) a 1.4 kilobase pair fragment containing the PreS2-S protein coding region.
Puhdistamisen jälkeen 5,1 ja 1,4 kiloemäsparin kappaleet ligatoidaan tavanomaisilla tekniikoilla, jolloin saadaan yhdistelmäplasmideja (6,46 kb), jotka sisältävät PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen, nyt kuitenkin MMT-promoottorin säätelyn alaisuudessa. Koska näiden kahden ligatoidun kappaleen suhteelliset suuntautumiset ovat satunnaisia, ja koska syntyy kaksi erilaista plasmidityyppiä, joista ainoastaan toinen on suuntautunut oikealla tavalla kopi-ointivaiheen luentaa ajatellen, alkaen MMT-promoottorista ja jatkuen pinnan antigeenien geeniketjuihin, niin oikea toiminnallinen plasmidi pDM2 varmistetaan pilkkomalla puhdistetut, kyseeseen tulevat plasmidit entsyymeillä EcoRI ja Xbal. Oikealla tavalla suuntautuneesta plasmi-dista saadaan tällä tavalla pilkkoen 2,1 kiloemäsparin ja 4,4 kiloemäsparin suuruinen kappale.After purification, the 5.1 and 1.4 kilobase pairs are ligated by conventional techniques to give recombinant plasmids (6.46 kb) containing the PreS2-S protein coding region, but now under the control of the MMT promoter. Because the relative orientations of the two ligated bodies are random, and because two different types of plasmids are generated, only one of which is correctly oriented for copy-reading, starting from the MMT promoter and continuing to the surface antigen gene chains, the correct functional plasmid pDM2 is cleaved. future plasmids with the enzymes EcoRI and XbaI. In this way, a 2.1 kilobase pair and a 4.4 kilobase pair fragment is obtained from the correctly oriented plasmid.
Plasmidin pDM2 sisältävä bakteerikanta HB101 talletettiin kantakokoelmaan Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen, Göttingen, tunnusnumerolla DSM 3285, huhtikuun 4. päivänä 1985. Lisäksi talletettiin muita mikro-organismeja, mm. mikro-organismi pMMT-neoplasmidi, joka sisältää PreS^-PreS2~S-proteiinia koodaavan DNA-ketjun, talletuslaitokseen American Type Culture Collection (ATCC), Rockville,The bacterial strain HB101 containing plasmid pDM2 was deposited in the strain collection Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen, Göttingen, under accession number DSM 3285, on 4 April 1985. In addition, other microorganisms were deposited, e.g. the microorganism pMMT neoplasmid containing a DNA strand encoding the PreS1-PreS2 ~ S protein, deposited with the American Type Culture Collection (ATCC), Rockville,
Maryland 11.4.1986 seuraavilla talletusnumeroilla: pBR322.G2 — φφ 67073 POLINK 23456 — φφ 67072 . pBlg/2.8 — φφ. 67075 pMMT-neoplasmidi — ΦΦ- 67074 .Maryland 11 April 1986 with the following deposit numbers: pBR322.G2 - φφ 67073 POLINK 23456 - φφ 67072. pBlg / 2.8 - φφ. 67075 pMMT neoplasmid - ΦΦ- 67074.
48 9572648 95726
Kolmas edullinen suoritusmuotoThird preferred embodiment
Kolmannessa edullisessa suoritusmuodossa MMT-promoottori jatkostetaan PreS^-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen sisältävään HBV-geenisegmenttiin siten, että luonnollinen promoottorijärjestelmä eliminoituu ja että mainittu koo-daava ketju saadaan MMT-promoottorin suoran säätelyn alaisuuteen (katso kuva 9).In a third preferred embodiment, the MMT promoter is extended to an HBV gene segment containing the PreS1-PreS2-S protein coding region such that the native promoter system is eliminated and said coding chain is placed under the direct control of the MMT promoter (see Figure 9).
Neljäs edullinen suoritusmuotoFourth preferred embodiment
Neljännessä edullisessa suoritusmuodossa plasmidista pBR322.G2 saadulla hiiren globiinigeenin mg-PAS-t-segmentillä, joka toimii polyadenylaation päättymissignaalina (PAS-t), korvataan SV4 0-viruksesta saatu PAS-t-alue. mg-PAS- t-segmen-tillä korvaamisella saadaan aikaan DNA-siirtovektoreita, jotka eivät käsitä lainkaan muista kuin HPV-viruksesta peräisin olevia genomisia osia (katso kuvat 9, 10 ja 11).In a fourth preferred embodiment, the mg-PAS-t segment of the mouse globin gene from plasmid pBR322.G2, which serves as a polyadenylation termination signal (PAS-t), replaces the PAS-t region derived from SV40 virus. Replacement of the mg-PAS segment provides DNA transfer vectors that do not comprise genomic portions other than those derived from the HPV virus (see Figures 9, 10, and 11).
Viides edullinen suoritusmuotoA fifth preferred embodiment
Viides edullinen suoritusmuoto on menetelmä plasmidi-DNA:n sekakonkatameerien valmistamiseksi, geenikopioiden lukumäärän suurentamiseksi ligatoimalla PreS^-PreS2~S-, PreS2-S-tai S-proteiinin koodaavaa aluetta koodaavia geenimuodos-teita sisältäviä plasmideja suuria määriä plasmideihin, ‘ jotka sisältävät lääkeaineen vastustuskykyyn perustuvan merkitsimen, ja jotka tämän jälkeen transfektoidaan solu-linjoihin.A fifth preferred embodiment is a method for preparing mixed concatamers of plasmid DNA, increasing the number of gene copies by ligating plasmids containing gene constructs encoding the PreS1-PreS2-S, PreS2-S or S protein coding region with large amounts of antibodies to the plasmids containing and which are then transfected into cell lines.
Seuraavissa esimerkeissä kuvataan yksityiskohtaisemmin tämän keksinnön mukaisten yhdistelmä-DNA-vektoreiden, isäntien ja partikkeleiden valmistamista sekä sisällyttämistä nisäkkään solulinjaan. Seuraavien esimerkkien tarkoituksena on pelkästään havainnollistaa keksintöä, ja ne eivät pyri rajoittamaan sitä millään tavalla.The following examples describe in more detail the preparation and incorporation of the recombinant DNA vectors, hosts, and particles of this invention into a mammalian cell line. The following examples are intended to illustrate the invention only and are not intended to limit it in any way.
Il 49 95726Il 49 95726
EsimerkiteXAMPLES
Materiaalit ja menetelmät A. Nisäkässolulinjojen alkuperä ja kuvaus 1. L-solutMaterials and Methods A. Origin and Description of Mammalian Cell Lines 1. L cells
Tutkijat K.K. Sanford, W.R. Earle ja G.D. Likely (J. Nat.Researchers K.K. Sanford, W.R. Earle and G.D. Likely (J. Nat.
Cancer Inst., Voi. 9, sivu 229, 1948) saivat aikaan NCTC-kloonin 929 maaliskuussa 1948 lähtökannasta L, jonka tutkija W.R. Earle (J. Nat. Cancer Inst., Voi. 4, sivu 165, 1943) oli muodostanut 1940. Lähtökanta L saatiin 100 vuorokauden ikäisen uroshiiren C3H/An normaalista ihonalaisesta areolaari- ja adipoosi- (rasva-) kudoksesta, ja klooni 929 saatiin lähtökannan 95. aliviljelmän sukupolvesta (kapil-laaritekniikalla yhden ainoan solun eristämiseksi).Cancer Inst., Vol. 9, page 229, 1948) produced NCTC clone 929 in March 1948 from starting strain L, which was studied by the researcher W.R. Earle (J. Nat. Cancer Inst., Vol. 4, page 165, 1943) had formed 1940. Starting strain L was obtained from normal subcutaneous areolar and adipose (adipose) tissue of a 100-day-old male C3H / An, and clone 929 was obtained. from the 95th subculture generation of the starting strain (by Kapil lary technique to isolate a single cell).
Tutkijat D.R. Dubbs ja S. Kit (S. Kit et ai., Exp. Cell Res., Voi. 31, sivut 297-312, 1963; sekä D.R. Dubbs & S. Kit, Exp. Cells Res., Voi 33, sivu 19, 1964) eristivät hiiren L-solujen alilinjan LM(TK-), joka on puutteellinen tymidiinikinaasin suhteen. Se ei kykene kasvamaan alustassa, joka sisältää HAT:ia. Tässä solulinjassa ei ole havaittu HAT-vastustuskyvyn spontaania palautumista, ja vaikuttaa erittäin todennäköiseltä, että siinä on tapahtu-; nut tämän geenin käsittämä häviämä.Researchers D.R. Dubbs and S. Kit (S. Kit et al., Exp. Cell Res., Vol. 31, pp. 297-312, 1963; and DR Dubbs & S. Kit, Exp. Cells Res., Vol. 33, p. 19, 1964) isolated the mouse L cell subline LM (TK-), which is deficient in thymidine kinase. It is unable to grow in a medium containing HAT. No spontaneous recovery of HAT resistance has been observed in this cell line, and it seems highly probable that it has occurred; loss of this gene.
Perättäisten aliviljelmien lukumäärä lähtökudoksesta laskien: 648; klooni, 553.Number of consecutive subcultures from the source tissue: 648; clone, 553.
Pakastusalusta: Viljelyalusta, 90 % DNSO 10 %; antibioot teja sisältämätön.Freezer: Culture medium, 90% DNSO 10%; antibiotic-free.
Elinkyky: 81-96 % (kykenemättömyys ottaa väriä vastaan).Viability: 81-96% (inability to absorb color).
Viljelyalusta: DMEM + 10 % FBS (Dulbeccon ja Vogtin muunnettu Eagle-alusta + 10 % FBS).Culture medium: DMEM + 10% FBS (modified Eagle medium from Dulbecco and Vogt + 10% FBS).
Sulaneiden solujen kasvuominaisuudet: Siirrosteella, joka ; 5 käsittää 6-8 x 10 solua 5 millilitrassa edellä mainittua viljelyalustaa yhtä T-25 -pulloa kohden, saadaan aikaan 50 95726 500-kertainen lisääntyminen 7 vuorokaudessa 37 °C:n lämpötilassa, edellyttäen, että alusta uusitaan kahdesti viikossa ja että pH asetetaan arvoon 7,3 hiilidioksidin (5 tai 10 %) ja ilman kostutetulla seoksella. Aliviljelmät valmistetaan raaputtamalla tai ravistelemalla. Solut kasvavat myös hyvin muissa alustoissa (Waymouth, Eagle, NCTC 135, jne), joita on täydennetty 10-30 % hevosen seerumia.Growth properties of molten cells: Inoculum, which; 5 comprises 6-8 x 10 cells per 5 ml of the above culture medium per T-25 flask, a 50-fold increase of 50 95726 is obtained in 7 days at 37 ° C, provided that the medium is renewed twice a week and the pH is adjusted to 7.3 with a moistened mixture of carbon dioxide (5 or 10%) and air. Subcultures are made by scraping or shaking. Cells also grow well in other media (Waymouth, Eagle, NCTC 135, etc.) supplemented with 10-30% horse serum.
Maljauksen tehokkuus: 70 %.Plating efficiency: 70%.
Morfologia: Fibroblastien kaltainen.Morphology: Fibroblast-like.
Kariologia: Kromosomien esiintymistiheyden jakautuminen 100 solua: 2n = 40.Cariology: Chromosome frequency distribution per 100 cells: 2n = 40.
Solut:_2 2 1 4 2 9 4 1 2 16 17 4 13 2Cells: _2 2 1 4 2 9 4 1 2 16 17 4 13 2
Kromosomit: 56-58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69Chromosomes: 56-58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69
Solut;_2 2 11_6Solut; _2 2 11_6
Kromosomit: 70 71-76-82-125-241Chromosomes: 70 71-76-82-125-241
Sekundäärisen rajoitteen (konstriktio) käsittävä pitkä metasentrinen kromosomi todettiin 77/100 solussa.A long metacentric chromosome with secondary restriction (constriction) was detected in 77/100 cells.
Steriilisyys: Mykoplasma-, bakteeri- ja fungikokeet olivat negatiiviset.Sterility: Mycoplasma, bacterial and fungi tests were negative.
Laji: Varmistettu hiirestä saaduksi agglutinaation ja hemagciutinaation sekakokein.Species: Confirmed from a mouse by mixed agglutination and haemagglutination experiments.
Virusalttius: Altis pseudorabiesvirukselle ja vesikulaari- selle .stomatitisvirukselle (intialainen kanta) . Kun soluja viljodiin edellä esitetyssä viljelyalustassa, niin Herpes simplex B-virus ja vaccinia tuottivat sytopaattisia vaikutuksia vain ensimmäisessä vaiheessa. Alttius tietyille viruksille voi vaihdella käytetyn viljelyalustan mukaan.Viral susceptibility: Susceptible to pseudorabies virus and vesicular .stomatitis virus (Indian strain). When cells were cultured in the above culture medium, Herpes simplex B virus and vaccinia produced cytopathic effects only in the first stage. Susceptibility to certain viruses may vary depending on the culture medium used.
Ei altis polioviruksen tyypille 1, Coxsackie-viruksen tyypille B-5 eikä polyomavirukselle.Not susceptible to poliovirus type 1, Coxsackie virus type B-5 or polyomavirus.
Tuumorigeenisyys: Siirroste, joka käsitti 1 x 10** solua hiirtä kohden, injektoitiin ihonalaisesti karvattomiin hiiriin. Säteilyttämättömissä hiirissä muodostui 0/25 li - 95726 51 tuumoria. Röntgensäteillä käsitellyissä hiirissä (425 r, koko kehoon) muodostui 11/18 tuumoria (sarkoomia) injektio-kohtaan .Tumor Geneticity: An inoculum comprising 1 x 10 ** cells per mouse was injected subcutaneously into nude mice. Non-irradiated mice developed 0/25 li to 95726 51 tumors. X-ray treated mice (425 r, whole body) developed 11/18 tumors (sarcoma) at the injection site.
Käänteistranskriptaasi: positiivinen.Reverse transcriptase: positive.
Myöntäjä, valmistaja ja tunnusomaisten piirteiden selvittäjä: American Type Culture Collection, Rockville,Issuer, manufacturer and characterizer: American Type Culture Collection, Rockville,
Maryland.Maryland.
2. Vero-solut2. Vero cells
Vero-solulinjan valmistus aloitettiin normaalin, täysikasvuisen afrikkalaisen marakatin munuaisesta maaliskuun 27. päivänä 1962, ja valmistajina olivat Y. Yasumuar ja Y. Kawakita Chiba-yliopistosta, Chiba, Japani (Nippon,Production of the Vero cell line began on the kidney of a normal, adult African maracam on March 27, 1962, and was manufactured by Y. Yasumuar and Y. Kawakita of Chiba University, Chiba, Japan (Nippon,
Rinsho, Voi. 21, sivu 1209, 1963).Rinsho, Oh. 21, page 1209, 1963).
Perättäisten aliviljelmien lukumäärä lähtökudoksesta laskien: 121.Number of consecutive subcultures, starting from the source tissue:.
Pakastusalusta: Olennainen vähimmäisalusta (Eagle), joka käsittää ei-olennaisia aminohappoja ja Earle-BSS, 85 %; sikiöasteisen naudan seerumia, 5 % dimetyylisulfoksidia (DMSO), 10 %; antibiootteja sisältämätön.Freezer: Essential Minimum Medium (Eagle) comprising non-essential amino acids and Earle-BSS, 85%; fetal bovine serum, 5% dimethyl sulfoxide (DMSO), 10%; antibiotic-free.
Elinkyky: Suurin piirtein 97 % (kykenemättömyys ottaa ; vastaan väriä).Viability: Approximately 97% (inability to absorb; accept color).
Viljelyalusta: DMEM, 5 % FBS.Culture medium: DMEM, 5% FBS.
Sulaneiden solujen kasvuominaisuudet: Siirrosteella, joka käsittää 3x10^ elävää solua 3 millilitrassa edellä mainittua viljelyalustaa yhtä T-25 -pulloa kohden, saadaan aikaan 30-kertainen lisääntyminen 7 vuorokaudessa 37 °C:n lämpötilassa, edellyttäen, että alusta uusitaan kolmasti viikossa ja että pH asetetaan arvoon 7,4 hiilidioksidin (5 tai 10 %) ja ilman kostutetulla seoksella. Aliviljel-mät valmistetaan trypsinisoimalla.Growth properties of thawed cells: Inoculum comprising 3x10 4 viable cells per 3 ml of the above medium per T-25 flask provides a 30-fold increase in 7 days at 37 ° C, provided that the medium is renewed three times a week and that the pH is set at 7.4 with a moistened mixture of carbon dioxide (5 or 10%) and air. Subcultures are prepared by trypsinization.
Maljauksen tehokkuus: Suurin piirtein 24 % edellä mai nitussa viljelyalustassa.Plating efficiency: Approximately 24% in the above medium.
52 9572652 95726
Morfologia: Epiteelisten fibroblastien kaltainen.Morphology: Similar to epithelial fibroblasts.
Kariologia: Kromosomien esiintymistiheyden jakautuminen 50 solua: 2n = 60.Cariology: Chromosome frequency distribution 50 cells: 2n = 60.
Solut:_212 2345721 17 22Cells: _212 2345721 17 22
Kromosomit: 47-49 59 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60Chromosomes: 47-49 59 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60
Steriilisyys: Mykoplasma-, bakteeri- ja fungikokeet olivat negatiiviset.Sterility: Mycoplasma, bacterial and fungi tests were negative.
Laji: Varmistettu apinasta saaduksi immunofluoresenssi- kokeella.Species: Confirmed in a monkey by immunofluorescence assay.
Virusalttius: Altis polioviruksen tyypille 3, Getah, NNdumu, Pixuna, Ross River, Semliki, Paramaribo, Kokobera, Modoc, Murutucu, Germiston, Guaroa, Pongola ja Tacaribe Arboviruksille. Ei altis Stratford, Apeu, Caraparu, Madrid, Nepuyo ja Ossa Arboviruksille.Viral susceptibility: Prone to poliovirus type 3, Getah, NNdumu, Pixuna, Ross River, Semliki, Paramaribo, Kokobera, Modoc, Murutucu, Germiston, Guaroa, Pongola and Tacaribe Arboviruses. Not susceptible to Stratford, Apeu, Caraparu, Madrid, Nepuyo and Ossa Arboviruses.
Käänteistranskriptaasi: ei todettavissa.Reverse transcriptase: not detectable.
Myöntäjä, valmistaja ja tunnusomaisten piirteiden selvittäjä: American Type Culture Collection, Rockville,Issuer, manufacturer and characterizer: American Type Culture Collection, Rockville,
Maryland.Maryland.
3. CHO-KI-solut CHO-KI-solut saatiin alikloonina lähtö-CHO-solulinjasta, jonka valmistuksen tutkija T.T. Puck aloitti täysikasvuisen kiinanhamsterin munasarjasta otetusta kudosnäytteestä, vuonna 1957 (J. Exp. Med., Voi. 108, sivu 945, 1958). CHO-KI-solut tarvitsevat proliinia, ja niiden modaalinen kromosomiluku on 20 (Proc. Nat. Acad. Sei., Voi. 60, sivu 1275, 1968). Näistä soluista puuttuu ilmeisesti se aktiivinen geenimuoto, joka tarvitaan proliinin synteesiin, ja salpautuminen biosynteettisessä ketjussa tapahtuu vaiheessa, jossa glutaamihappo muunnetaan glutaamiseksi gamma-semialdehydiksi. Proliinin omavaraisuuden palautumistoden-näköisyys on 10 6 (Genetics, Voi. 55, sivu 513, 1967) .3. CHO-KI Cells CHO-KI cells were obtained as a subclone from a parent CHO cell line prepared by T.T. Puck began with an adult Chinese hamster ovary tissue sample, in 1957 (J. Exp. Med., Vol. 108, page 945, 1958). CHO-KI cells require proline and have a modal chromosome number of 20 (Proc. Nat. Acad. Sci., Vol. 60, page 1275, 1968). These cells apparently lack the active gene form required for proline synthesis, and blockade in the biosynthetic chain occurs at the stage where glutamic acid is converted to glutamate for gamma-semialdehyde. The probability of recovery of proline self-sufficiency is 10 6 (Genetics, Vol. 55, page 513, 1967).
Perättäisten aliviljelmien lukumäärä lähtökudoksesta laskien: suurin piirtein 400; 7 kantakokoelmassa ATCC.Number of consecutive subcultures from the source tissue: approximately 400; 7 in the ATCC strain collection.
Il 53 95726Il 53 95726
Pakastusalusta: Viljelyalusta, 92 %; glyseroli, 8 %; antibiootteja sisältämätön.Freezer: Culture medium, 92%; glycerol, 8%; antibiotic-free.
Elinkyky: Suurin piirtein 90 % (kykenemättömyys ottaa väriä vastaan).Viability: Approximately 90% (inability to absorb color).
Viljelyalusta: F-12 -alusta (Ham) 90 %; sikiöasteisen naudan seerumi, 10 %; antibiootteja sisältämätön.Culture medium: F-12 medium (Ham) 90%; fetal bovine serum, 10%; antibiotic-free.
Sulaneiden solujen kasvuominaisuudet: Siirroste, joka käsittää 105 elävää solua 1 millilitrassa edellä mainittua viljelyalustaa 37 °C:n lämpötilassa lisääntyy 15-20 kertaiseksi 7 vuorokaudessa.Growth properties of thawed cells: The inoculum comprising 105 living cells in 1 ml of the above-mentioned culture medium at 37 ° C increases 15-20-fold in 7 days.
Maljauksen tehokkuus: suurin piirtein 90 % edellä maini tussa viljelyalustassa.Plating efficiency: approximately 90% in the above medium.
Morfologia: epiteelin kaltainen.Morphology: epithelial.
Kariologia: kromosomien esiintymistiheyden jakautuminen 50 solua: 2n = 22.Cariology: chromosome frequency distribution 50 cells: 2n = 22.
Solut:_2 2 35 3 4 1 1 1 1Cells: _2 2 35 3 4 1 1 1 1
Kromosomit: 18 19 20 21 22-24-32-39-42Chromosomes: 18 19 20 21 22-24-32-39-42
Steriilisyys: mykoplasma-, bakteeri- ja fungikokeet olivat negatiiviset.Sterility: Mycoplasma, bacterial and fungi tests were negative.
Laji: varmistettu kiinanhamsterista saaduksi sytoksisella : vasta-aineella, värin vastaanottamattomuuden kokeella ja isoentsyymianalyysillä.Species: confirmed from Chinese hamster by cytotoxic: antibody, dye intolerance test and isoenzyme analysis.
Virusalttius: altis vesikulaariselle stomatitisvirukselle (intialainen kanta) sekä Getah-arbovirukselle. Ei altis polioviruksen tyypille 2, Modoc- ja Button William-arbovi-ruksille.Viral susceptibility: susceptible to vesicular stomatitis virus (Indian strain) and Getah arbovirus. Not susceptible to poliovirus type 2, Modoc and Button William arbovi.
Käänteistranskriptaasi: ei todettu.Reverse transcriptase: not detected.
Erityisiä ominaisuuksia: viitesolut tarvitsevat proliinia kasvaakseen.Special properties: reference cells need proline to grow.
Myöntäjä: T.T. Puck, Eleanor Roosevelt Institute forIssued by: T.T. Puck, Eleanor Roosevelt Institute for
Cancer Research, University of Colorado Medical Center,Cancer Research, University of Colorado Medical Center,
Denver, Colorado.Denver, Colorado.
54 95726 4. NIH/3T3-solut NIH/3T3, joka on jatkuva solulinja erittäin kosketusinhi-boiduista soluista, saatiin NIH-sveitsinhiiren sikiövil-jelmistä samalla tavalla kuin alkuperäinen satunnaissii-tetty 3T3 (ATCC CCL 92) sekä sukusiitetty BALB/c3T3 (ATCC CCL 163). Aikaansaadulla NIH/3T3-linjalla toteutettiin enemmän kuin 5 peräkkäistä alikloonausvaihetta sellaisen alikloonin kehittämiseksi, jonka alikloonin morfologiset ominaisuudet sopivat parhaiten transformaatiokokeisiin. Tämän alikloonin varhaisimmat saatavat vaiheet (passage) ovat suurin piirtein 120 vaiheen päässä ensimmäisestä sikiöviljelmästä. NIH/3T3 on erittäin herkkä sarkoomavi-ruksen fokuksen muodostumiselle ja leukemiaviruksen lisääntymiselle, ja se on osoittautunut erittäin käyttökelpoiseksi DNA:n transfektiotutkimuksissa. J. Virol., Voi. 4, sivut 549-553, 1969; Cell, Voi. 16, sivut 63-75 sekä 347-356, 1979.54 95726 4. NIH / 3T3 Cells NIH / 3T3, a continuous cell line from highly contact inhibited cells, was obtained from fetal cultures of NIH Swiss mice in the same manner as the original randomly transplanted 3T3 (ATCC CCL 92) and the seeded BALB / c3T3 (ATCC CCL 92). CCL 163). More than 5 consecutive subcloning steps were performed on the resulting NIH / 3T3 line to develop the subclone whose morphological properties are best suited for transformation experiments. The earliest available passages of this subclone are approximately 120 steps away from the first fetal culture. NIH / 3T3 is highly sensitive to sarcoma virus focus formation and leukemia virus proliferation and has been shown to be very useful in DNA transfection studies. J. Virol., Vol. 4, pages 549-553, 1969; Cell, Vol. 16, pages 63-75 and 347-356, 1979.
B. Alustat, puskurit ja liuokset 1. Nisäkässolujen viljelmiin a. Dulbeccon muunnettu Eagle-alusta, joka sisältää runsaasti glukoosia (DMEM).B. Media, Buffers, and Solutions 1. For mammalian cell cultures a. Dulbecco's modified glucose-rich Eagle's medium (DMEM).
*. Tässä käytetään kuivaa jauhemaista GIBCO-alustaa, ja siihen lisätään täydennykseksi: 26 mMNaHC03 2 mM L-glutamiini (Gibco) 1 mM Na-pyruvaatti (Gibco) 60 ug/ml gentamysiiniä tai 100 yksikköä/ml penisilliiniä + 100 yksikköä/ml 1 streptomysiiniä.*. Here, dry powdered GIBCO medium is used and supplemented with: 26 mM NaHCO 3 2 mM L-glutamine (Gibco) 1 mM Na-pyruvate (Gibco) 60 ug / ml gentamicin or 100 units / ml penicillin + 100 units / ml 1 streptomycin.
b. Hamin F12 Tässä käytetään kuivaa jauhemaista GIBCO-alustaa, johon lisätään täydennykseksi: 14 mM Na HCO3 : 60 yg/ml gentamysiiniä 55 95726 c. Solujen pakastamisalusta 90 % (tilavuus/tilavuus) FBS-DMEM 10 % (tilavuus/tilavuus) dimetyylisulfoksidia Pakastusalusta valmistetaan juuri ennen käyttöä. Kaikki alustat steriloidaan suodattamalla 0,45 ja 0,2 mikronin suodattimien läpi (Gilman). Alustojen steriilisyys varmistetaan inkuboimalla antibioottia sisältämättömästä alustasta otettua näytettä 37 °C:n lämpötilassa 1 viikko. Staattisessa viljelmässä käytettävään alustaan lisätään täydennykseksi 10 % FBS. Sikiöasteisen naudan seerumi (FBS) inaktivoidaan lämmöllä 56 °C:n lämpötilassa 30 minuuttia. Steriiliä alustaa säilytetään 40 °C:n lämpötilassa ennen käyttöä.b. Ham F12 A dry powdered GIBCO medium is used here supplemented with: 14 mM Na HCO3: 60 ug / ml gentamicin 55 95726 c. Cell freezer 90% (v / v) FBS-DMEM 10% (v / v) dimethyl sulfoxide The freezer is prepared just before use. All media are sterilized by filtration through 0.45 and 0.2 micron filters (Gilman). The sterility of the media is confirmed by incubating a sample of the antibiotic-free medium at 37 ° C for 1 week. 10% FBS is added to the medium used for static culture. Fetal bovine serum (FBS) is heat inactivated at 56 ° C for 30 minutes. The sterile medium is stored at 40 ° C before use.
d. Trypsiiniliuos 0,5 g/1 trypsiiniä 0,2 g/1 EDTA (tetranatrium) Hankin tasapainotetussa suolaliuoksessad. Trypsin solution 0.5 g / l trypsin 0.2 g / l EDTA (tetrasodium) in equilibrated saline
Koska EDTA todettiin toksiseksi Vero-soluille, niin näiden solujen kanssa käytetään EDTA:ta sisältämätöntä trypsiini-liuosta.Because EDTA was found to be toxic to Vero cells, a trypsin-free EDTA solution is used with these cells.
e. PBS (fosfaatilla puskuroitu suolaliuos), GIBCOe. PBS (phosphate buffered saline), GIBCO
183 mM NaCl 8,6 mM Na2HP04 2,2 mM KH2P04183 mM NaCl 8.6 mM Na 2 HPO 4 2.2 mM KH 2 PO 4
f. TN Ef. TN E
160 mM NaCl 10 mM Tris, pH 7,5160 mM NaCl 10 mM Tris, pH 7.5
1 mM EDTA1 mM EDTA
2. Molekyylibiologisiin tarkoituksiin a. liuokset SDS-PAGE -toimenpiteisiin2. For molecular biological purposes a. Solutions for SDS-PAGE procedures
Akryyliamidi (varasto): 30 % (paino/paino) akryyliamidia (BioRad) 0,8 % (paino/paino) N’,N-metyleeni-bisakryyliamidia (BioRad) 56 95726 4 x puskuri erottavaa geeliä varten 1,5 M Tris-Cl, pH 8,8 0,4 (paino/tilavuus) natriumdodekyylisulfaatti (SDS) (Serva) 4 x puskuri väligeeliä vartenAcrylamide (stock): 30% (w / w) acrylamide (BioRad) 0.8% (w / w) N ', N-methylene bisacrylamide (BioRad) 56 95726 4 x buffer for separating gel 1.5 M Tris- Cl, pH 8.8 0.4 (w / v) sodium dodecyl sulfate (SDS) (Serva) 4 x buffer for intermediate gel
0,5 M Tris-Cl, pH 6,8 0,4 (paino/tilavuus) SDS0.5 M Tris-Cl, pH 6.8 0.4 (w / v) SDS
3 x näytepuskuri 22,3 % (tilavuus/tilavuus) glyserolia 0,03 % (paino/tilavuus) bromifenolisinistä3 x sample buffer 22.3% (v / v) glycerol 0.03% (w / v) bromophenol blue
6,7 (paino/tilavuus) SDS6.7 (w / v) SDS
10 x elektrodipuskuri10 x electrode buffer
0,25 M Tris, pH 8,2 1,90 M glysiini 1 % (paino/tilavuus) SDS0.25 M Tris, pH 8.2 1.90 M glycine 1% (w / v) SDS
b. Liuokset hopeavärjäyksen toimenpiteisiinb. Solutions for silver staining procedures
Liuos I 50 % (tilavuus/tilavuus) metanolia 10 % (tilavuus/tilavuus) etikkahappoaSolution I 50% (v / v) methanol 10% (v / v) acetic acid
Liuos II 10 % (tilavuus/tilavuus) metanolia 5 % (tilavuus/tilavuus) etikkahappoaSolution II 10% (v / v) methanol 5% (v / v) acetic acid
Liuos III 10 % glutaraldehydiäSolution III 10% glutaraldehyde
Liuos IV 20 % AgNO^ vedessä (varastoliuos)Solution IV 20% AgNO 2 in water (stock solution)
Liuos V 3 % (paino/tilavuus) Na2CC>2 0,1 % (tilavuus/tilavuus) formaldehydiä c. Liuokset luentaan avoimen fosfodiesterisillan ("nick") kohdalta 10 x reaktiopuskuriSolution V 3% (w / v) Na 2 CO 2> 0.1% (v / v) formaldehyde c. Solutions are read at the open phosphodiester bridge ("nick") 10 x reaction buffer
500 mM Tris-Cl, pH 7,2 100 mM MgS04 1 mM DTT500 mM Tris-Cl, pH 7.2 100 mM MgSO 4 1 mM DTT
li 57 95726li 57 95726
Nukleotidiseos:Nukleotidiseos:
100 mM dGTP 100 mM dATP 100 mM dTTP100 mM dGTP 100 mM dATP 100 mM dTTP
10 mM Tris-puskurissa, pH 7,5 d. Hybridisaatiossa käytettävät liuokset 20 x SSC: 3 M NaCl 0,3 M Na2_sitraatti 50 x Denhardtin liuos 1 % (paino/paino) Ficoll 400 (PL-Pharmacia) 1 % (paino/paino) polyvinyylipyrrolidoni (Sigma)In 10 mM Tris buffer, pH 7.5 d. Hybridization solutions 20 x SSC: 3 M NaCl 0.3 M Na 2 citrate 50 x Denhardt's solution 1% (w / w) Ficoll 400 (PL-Pharmacia) 1% (w / w) polyvinylpyrrolidone (Sigma)
1 % (paino/paino) BSA1% (w / w) BSA
oo
Steriloidaan suodattamalla ja säilytetään -20 C:n lämpötilassaSterilize by filtration and store at -20 ° C
EsihybridisaatioseosEsihybridisaatioseos
50 % (tilavuus/tilavuus) formamidia 5 x Denhardtin liuos 5 x SSC50% (v / v) formamide 5 x Denhardt's solution 5 x SSC
50 mM Na-fosfaatti pH 7,0 250 ug/ml denaturoitua lohen sperman DNA:ta50 mM Na phosphate pH 7.0 250 ug / ml denatured salmon sperm DNA
Hybridisaatioseos:The hybridization:
50 % formamidia 5 x SSC50% formamide 5 x SSC
20 mM Na-fosfaatti, pH 7,0 1 x Denhardtin liuos 100 yg/ml denaturoidun lohen sperman DNA:ta e. Puskurit restriktioentsyymejä varten20 mM Na phosphate, pH 7.0 1 x Denhardt's solution 100 ug / ml denatured salmon sperm DNA e. Buffers for restriction enzymes
Joko valmistajien esittämät puskurit, tai: Vähän suolaa Keskimääräisesti suolaa Runsaasti suolaa sisältävä puskuri sisältävä puskuri sisältävä puskuriEither the buffers provided by the manufacturers, or: Low salt Medium salt High salt buffer Buffer
Sma I Bglll BamHISma I Bglll BamHI
Hpal PstI PvuIHpal PstI PvuI
Xbal EcoRI SaliXbal EcoRI Sali
Spel BstEII (60 °C) 58 95726Mp BstEII (60 ° C) 58 95726
Restriktiopuskurit: Vähän suolaa Keskimääräisesti Paljon suolaa suolaaRestriction buffers: Low salt Average High salt salt
Tris, pH 7,4 10 mM 6,6mM 6,6 mMTris, pH 7.4 10 mM 6.6 mM 6.6 mM
MgCl2 10 6,6 6,6 suolaa 20 (KC1) 60 (NaCl) 150 (NaCl) β-merkaptoetanoli 10 6,6 6,6 f. Alustat 1. L-alusta: 10 g Baktotryptonia 5 g hiivauutetta 10 g NaCl 1 litra vettä 2. L-alustaa sisältävät agarmaljat: L-alustaa, joka sisältää 15 g/1 Difco- agaria 3. L-alusta-amp-agarmalj at: L-alustasta tehty agar, joka sisältää 20-50 ug/ml ampisilliiniä C. EntsyymitMgCl 2 10 6.6 6.6 salt 20 (KCl) 60 (NaCl) 150 (NaCl) β-mercaptoethanol 10 6.6 6.6 f. Substrates 1. L medium: 10 g Bactotrypton 5 g yeast extract 10 g NaCl 1 liters of water 2. L-medium agar plates: L-medium containing 15 g / l Difco agar 3. L-medium amp agar plates: L-medium agar containing 20-50 ug / ml ampicillin C Enzymes
Seuraavia entsyymejä käytetään: 1. Deoksiribonukleaasi I (Worthington) ‘ 2. DNA-polymeraasi I ("Klenow-kappale") (Boehringer Mannheim) 3. T4-DNA-ligaasi (Boehringer Mannheim) 4. Restriktioentsyymit:The following enzymes are used: 1. Deoxyribonuclease I (Worthington) ‘2. DNA polymerase I (‘ Klenow fragment ’) (Boehringer Mannheim) 3. T4 DNA ligase (Boehringer Mannheim) 4. Restriction enzymes:
EcoRI, Xbal, BamHI,. Bglll, BstEII, Spel,EcoRI, Xbal, BamHI ,. Bglll, BstEII, Spel,
Sali, Hpal, Smal, PvuI, PstI (BoehringerSali, Hpal, Smal, PvuI, PstI (Boehringer
Mannheim, BRL, New England BioLabs) 5. Lysozyme (SIGMA) 6. Pronaasi 11 59 95726 D. Analyyttiset ja kvantitatiiviset toimenpiteet 1. Värin sitomiskoeMannheim, BRL, New England BioLabs) 5. Lysozyme (SIGMA) 6. Pronase 11 59 95726 D. Analytical and Quantitative Measures 1. Color Binding Assay
Kokonaisproteiinipitoisuus tämän keksinnön mukaisten, puhdistettujen partikkeleiden preparaateissa määritetään BioRad-yhtiÖn proteiinikokeen kittiä käyttäen. Tässä menetelmässä käytetään Bradford-koetta, jossa Coomassie-sinisen sitoutuminen proteiiniin mitataan spektrofotometrisesti. Standardina käytetään ovalbumiinia.The total protein content in the preparations of the purified particles of this invention is determined using a BioRad protein assay kit. This method uses the Bradford assay, in which the binding of Coomassie blue to a protein is measured spectrophotometrically. Ovalbumin is used as standard.
2. Radioimmuunikoe (RIA) 1 25 "Kerrosteena" (sandwich) toteutettavassa NML RIA I radio-immuunikokeessa hepatitis B-viruksen pinnan antigeeniä vastaan vaikuttavalla hiiren vasta-aineella (anti-HBs) pinnoitettuja helmiä inkuboidaan seerumin tai plasman sekä asianmukaisten vertailunäytteiden kanssa. PreS^-PreS2~S-proteii-nin koodaavan alueen koodaamia polypeptidejä sisältävät partikkelit sitoutuvat kiinteän faasin vasta-aineeseen. Sitoutumattoman materiaalin pois imemisen ja helmien pese- 1 25 misen jälkeen ihmisen I-anti-HBs:n annetaan reagoida helmien pinnalla olevan, vasta-aineen ja antigeenin välisen kompleksin kanssa. Tämän jälkeen helmet pestään si-125 toutumattoman . I-anti-HBs:n poistamiseksi.2. Radioimmunoassay (RIA) 1 25 In the "sandwich" NML RIA I radioimmunoassay, beads coated with a mouse antibody (anti-HBs) against hepatitis B virus surface antigen are incubated with serum or plasma and appropriate controls. Particles containing polypeptides encoded by the coding region of the PreS1-PreS2-S protein bind to a solid phase antibody. After uptake of unbound material and washing of the beads, human anti-HBs is reacted with a complex of antibody-antigen on the surface of the beads. The beads are then washed with si-125 unbound. To remove I-anti-HBs.
Helmiin jäävä radioaktiivisuus lasketaan gamma-tuikelasku-rilla. Reaktiivisena pidetään niitä näytteitä, joista saatujen sykäysten lukumäärä minuutissa (cpm) on suurempi tai yhtä suuri kuin se erotusarvo (cut off), joka saadaan kertomalla tietyllä tekijällä negatiivisen vertailun keskimääräinen sykäysten määrä (NCx) .The radioactivity remaining in the beads is counted on a gamma scintillation counter. Samples are considered reactive if the number of beats per minute (cpm) obtained is greater than or equal to the cut-off value obtained by multiplying the average number of beats (NCx) of the negative control by a certain factor.
3. Immuunisaostaminen3. Immunoprecipitation
Solut kasvatetaan 100 % yhteen T75-pullossa. Tämän jälkeen viljelyalustaksi vaihdetaan 5 ml metioniinia sisältämätöntä . -3 5 - alustaa, joka sisältää 400 yCi L-/ S/-metioniinia ja 400 -35 - ” . yCi L-^ S/-kysteiiniä (NEN), ja inkubointia jatketaan koko yön. Alusta väkevöidään 10-kertaiseksi fraktiosaosta- . 95726 60 maila polyetyleeniglykolia käyttäen. Väkevöityä proteiinia (noin 10^ cpm) inkuboidaan ennen immunointia saadun, marsun seerumin 10 μ-litran kanssa tai marsun anti-HBsAg-see-rumin 1 ja 10 mikrolitran kanssa 50 mikrolitrassa TEN-liu-osta (10 mM Tris, pH 7,4 1 mM EDTA, 130 mM NaCl), joka käsitti 0,5 % Tween 20 -tuotetta, 1 tunnin ajan 37 °C:n lämpötilassa. Immunoglobuliinia sidotaan 20 mikrolitraan proteiinin A ja Sepharose C1-4B-geenin (Pharmacia) seosta 1 tunnin ajan 37 °C:n lämpötilassa, pestään kerran liuoksella TEN-Tween 20 ja liuoksella, joka käsittää 500 mM LiCl, ja jälleen liuoksella TEN-Tween 20. Näytteet käsitellään elektroforeettisesti jäljempänä kuvattua SDS-PAGE-järjestelmää käyttäen. Geelejä kiinnitetään 60 minuuttia liuoksessa, joka käsittää 10 % trikloorietikkahappoa, 10 % jääetikkaa ja 30 % metanolia, ja inkuboidaan Enlightning-liuoksessa (NEN) 30 minuuttia. Geelit kuivataan ja auto-radiografoidaan KODAK XAR-5-filmille.Cells are grown 100% together in a T75 flask. The culture medium is then changed to 5 ml of methionine-free medium. -3 5 - medium containing 400 yCi L- / S / -methionine and 400 -35 - ”. γCi L-^ S / -cysteine (NEN), and incubation is continued overnight. The medium is concentrated to 10-fold fraction fraction. 95726 60 clubs using polyethylene glycol. The concentrated protein (approximately 10 cpm) is incubated with 10 μl of guinea pig serum or 1 and 10 microliters of guinea pig anti-HBsAg serum obtained before immunization in 50 microliters of TEN-Liu (10 mM Tris, pH 7.4). 1 mM EDTA, 130 mM NaCl) comprising 0.5% Tween 20 for 1 hour at 37 ° C. Immunoglobulin is bound to 20 microliters of a mixture of protein A and Sepharose C1-4B gene (Pharmacia) for 1 hour at 37 ° C, washed once with TEN-Tween 20 and a solution comprising 500 mM LiCl, and again with TEN-Tween 20 Samples are electrophoresed using the SDS-PAGE system described below. The gels are fixed for 60 minutes in a solution comprising 10% trichloroacetic acid, 10% glacial acetic acid and 30% methanol and incubated in Enlightning solution (NEN) for 30 minutes. The gels are dried and auto-radiographed on KODAK XAR-5 Film.
4. SDS-polyakryyliamidigeelillä toteutettu elektroforeesi (PAGE) Näytteen ja geelin esikäsitteleminen: PAGE-analyysiä varten tämän keksinnön mukaisten puhdistettujen partikkelinäyttei-den pitoisuus asetetaan arvoon 10 yg/ml. Kustakin näytteestä otetaan 10 yl, joka sekoitetaan 10 mikrolitraan 1 M DDT 10 % SDS-liuoksessa ja 10 mikrolitraan näytepuskuria. Tätä seosta keitetään 5, 10 tai 15 minuuttia juuri ennen sen laittamista geelille 20 nanometrin partikkeleiden rikkomiseksi ja monomeeristen molekyylien aikaansaamiseksi. Sen jälkeen, kun seokseen on lisätty 10 yl siirtopuskuria (loading buffer), se käsitellään elektroforeettisesti 0,75 mm paksuisessa geeliliuskassa (12 x 18 x 0,1 cm), joka käsitti 12,5 % polyakryyliamidia ja 0,4 % bisakryyli-amidia käyttäen Laemmlin (1970) puskurijärjestelmää sekä arvoja 15 mA ja 100 V 6 tunnin ajan. Proteiinivyöhykkeet tehdään näkyviksi hopealla värjäämällä (katso seuraava, hopealla värjäämistä käsittelevä kappale).4. SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis (PAGE) Sample and Gel Pretreatment: For PAGE analysis, the concentration of the purified particle samples of this invention is set at 10 μg / ml. 10 ul of each sample is taken and mixed with 10 microliters of 1 M DDT in 10% SDS and 10 microliters of sample buffer. This mixture is boiled for 5, 10 or 15 minutes just before being applied to the gel to break up 20 nanometer particles and produce monomeric molecules. After the addition of 10 ul of loading buffer, the mixture is electrophoretically treated on a 0.75 mm thick gel strip (12 x 18 x 0.1 cm) comprising 12.5% polyacrylamide and 0.4% bisacrylamide. using the Laemmli (1970) buffer system with values of 15 mA and 100 V for 6 h. Protein bands are visualized by silver staining (see the next section on silver staining).
KK
61 95726 5. Hopealla värjääminen PAGE-geeli värjätään hopealla Merrilin et ai. (1981) mukaisesti. Proteiini kiinnitetään geeliin liuoksella, joka käsittää 50 % metanolia ja 10 % etikkahappoa, 30 minuuttia. Geeliä pestään 30 minuuttia liuoksella, joka käsittää 10 % metanolia ja 5 % etikkahappoa. Sen jälkeen kun geeliä on inkuboitu 10 % glutaraldehydissä 30 minuuttia, sitä pestään ionittomassa vedessä yön yli. Sen jälkeen kun geeliä on inkuboitu 0,1 % AgNC^-liuoksessa 30 minuuttia, sitä pestään lyhyesti vedessä. Värjätty geeli kehitetään 100 millilitrassa 3 % Na2CC>2-liuosta ja 30 mikrolitrassa formaldehydiä ja kiinnitetään 1 % etikkahapolla. Geeli suljetaan muovipussin sisään ja valokuvataan.61 95726 5. Silver Staining PAGE gel is stained with silver according to Merrilin et al. (1981). The protein is attached to the gel with a solution comprising 50% methanol and 10% acetic acid for 30 minutes. The gel is washed for 30 minutes with a solution comprising 10% methanol and 5% acetic acid. After incubation in 10% glutaraldehyde for 30 minutes, the gel is washed in deionized water overnight. After incubation in 0.1% AgNCl 2 solution for 30 minutes, the gel is washed briefly in water. The stained gel is developed in 100 ml of 3% Na 2 CO 2 solution and 30 microliters of formaldehyde and fixed with 1% acetic acid. The gel is sealed inside a plastic bag and photographed.
E. Geneettinen manipuloiminen 1. Yhdistelmä-DNA-toimenpiteet a. Puhdistetun DNA:n pilkkominen restriktioendonukleaa-seillaE. Genetic Manipulation 1. Recombinant DNA Procedures a. Cleavage of Purified DNA by Restriction Endonucleases
Toteutetaan kunkin endonukleaasin kohdalla valmistajan ohjeiden mukaisesti.Carry out for each endonuclease according to the manufacturer's instructions.
b. Plasmidi-DNA:n eristäminen 1.1 litra plasmidin sisältäviä soluja kasvatetaan L-alus-• tässä optiseen tiheyteen ODgQ00,5, jonka jälkeen viljelmän annetaan laajentua 12-20 tuntia siten, että läsnä on 200 yg/ml kloram fenikolia.b. Isolation of Plasmid DNA 1.1 liters of plasmid-containing cells are grown in L-medium to an optical density of ODgQ00.5, after which the culture is allowed to expand for 12-20 hours in the presence of 200 ug / ml chloramphenicol.
2. Viljelmä sentrifugoidaan Sorval-sentrifugilla RC5b, nopeudella 8000 rpm 20 minuuttia.2. The culture is centrifuged in a Sorval centrifuge RC5b at 8000 rpm for 20 minutes.
3. Solut suspendoidaan uudestaan 18 millilitraan kylmää liuosta, joka käsittää 25 % sakkaroosia, 50 mM Tris, pH 8,0.3. Resuspend cells in 18 ml of cold solution containing 25% sucrose, 50 mM Tris, pH 8.0.
4. Suspensio siirretään 250 millitran Erlenmeyeriin. Pidetään jäissä.4. Transfer the suspension to a 250 ml Erlenmeyer. Keep on ice.
5. Suspensioon lisätään 6 ml 5 mg/ml lysotsyymiä liuoksessa, joka käsittää 250 mM Tris, pH 8,0, ja annetaan seisoa 10-15 minuuttia.5. Add 6 ml of 5 mg / ml lysozyme in a solution of 250 mM Tris, pH 8.0 to the suspension and allow to stand for 10-15 minutes.
62 95726 6. Seokseen lisätään 6 ml 250 mM EDTA-liuosta, pH 8,0 ja sekoitetaan varoen; seosta inkuboidaan 15 minuuttia jäissä.62 95726 6. Add 6 ml of 250 mM EDTA solution, pH 8.0 to the mixture and mix gently; the mixture is incubated for 15 minutes on ice.
7. Seokseen lisätään 30 ml detergenttiseosta; 0,01 % Triton X-100 60 mM EDTA, pH 8,0 50 mM Tris, pH 8,0.7. Add 30 ml of detergent mixture to the mixture; 0.01% Triton X-100 60 mM EDTA, pH 8.0 50 mM Tris, pH 8.0.
8. Seosta inkuboidaan 30 minuuttia jäissä.8. Incubate the mixture for 30 minutes on ice.
9. Se sentrifugoidaan nopeudella 25 000 rpm, 4 °C:n lämpötilassa, 90 minuuttia SW28-roottorissa.9. It is centrifuged at 25,000 rpm, 4 ° C, for 90 minutes in a SW28 rotor.
10. Supernatanttiin lisätään pronaasia pitoisuudeksi 250 yg/ml, ja inkuboidaan 30 minuuttia 37 °C:n lämpötilassa.10. Pronase is added to the supernatant at a concentration of 250 μg / ml, and incubated for 30 minutes at 37 ° C.
11. Supernatantti uutetaan kertaalleen fenolilla, käyttäen 1/2 tilavuudesta fenolia, joka on tasapainotettu TE-liuok-sella (10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA).11. Extract the supernatant once with phenol, using 1/2 volume of phenol equilibrated with TE solution (10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA).
12. Vesikerros poistetaan; natriumasetaattia lisätään pitoisuudeksi 300 mM; 2 tilavuutta kylmää 100 % etanolia lisätään; sekoitetaan huolellisesti. Pidetään -20 °C:n lämpötilassa yön yli.12. The aqueous layer is removed; sodium acetate is added to a concentration of 300 mM; 2 volumes of cold 100% ethanol are added; mix thoroughly. Store at -20 ° C overnight.
13. Seos sentrifugoidaan ja suspendoidaan 6 millilitraan TE-10 -liuosta (10 mM Tris, 10 mM EDTA, pH 8,0).13. The mixture is centrifuged and suspended in 6 ml of TE-10 solution (10 mM Tris, 10 mM EDTA, pH 8.0).
14. Suspensioon lisätään 9,4 g CsCl:ia ja 0,65 ml etidium-' bromidia, jonka pitoisuus on 6 mg/ml; tilavuudeksi saate- . taan 10 ml lisäämällä steriiliä, kahdesti tislattua vettä.14. 9.4 g of CsCl and 0.65 ml of ethidium bromide at a concentration of 6 mg / ml are added to the suspension; the volume of the broadcast. 10 ml by adding sterile, doubly distilled water.
15. Liuoksella täytetään Beckman-yhtiön lämmön avulla suljettavat gradienttiputket; niitä sentrifugoidaan nopeudella 48 000 rpm 40 tuntia Ti70.1-Beckman-roottorissa.15. The solution is filled into Beckman heat-sealable gradient tubes; they are centrifuged at 48,000 rpm for 40 hours in a Ti70.1-Beckman rotor.
16. Plasmidivyöhykkeet tehdään näkyviksi UV-säteillä ja plasmidi-DNA poistetaan ruiskun ja numeron 18 neulan avulla putken seinämän läpi työntämällä.16. Plasmid zones are visualized by UV rays and plasmid DNA is removed by pushing through the wall of the tube using a syringe and a No. 18 needle.
17. Etidiumbromidi poistetaan plasmidifraktiosta uuttamalla kolmasti peräkkäin yhtä suurilla tilavuuksilla isobutanolia.17. Ethidium bromide is removed from the plasmid fraction by extraction three times in succession with equal volumes of isobutanol.
18. DNA dialysoidaan yhtä 2 litran suuruista liuoserää vastaan, tämän liuoksen käsittäessä 10 mM Tris, pH 7,4, 1 mM EDTA, pH 7,5, 5 mM NaCl, 2 tuntia tai enemmän 4 °C;n lämpötilassa.18. The DNA is dialyzed against one batch of 2 liters of solution comprising 10 mM Tris, pH 7.4, 1 mM EDTA, pH 7.5, 5 mM NaCl for 2 hours or more at 4 ° C.
li «3 SS726 19. DNA uutetaan kertaalleen fenolilla käyttäen 1/3 tilavuutta fenolia, joka on tasapainotettu edellä kuvatulla TE-liuoksella.li «3 SS726 19. DNA is extracted once with phenol using 1/3 volume of phenol equilibrated with the TE solution described above.
20. DNA:han lisätään NaAc-yhdistettä pitoisuudeksi 300 mM, ja 2 tilavuutta 100 % etanolia; saostetaan -20 °C:n lämpötilassa yön yli, tai -70 °C:n lämpötilassa 30 minuuttia.20. NaAc is added to the DNA to a concentration of 300 mM, and 2 volumes of 100% ethanol; precipitated at -20 ° C overnight, or at -70 ° C for 30 minutes.
c. Luenta avoimen fosfodiesterisillan kohdalta ("nick")c. Reading at the open phosphodiester bridge ("nick")
Luenta avoimen fosfodiesterisillan kohdalta suoritetaan Rigby et ai. mukaisesti (J. Mol. Biol. Voi. 113, sivut 237-251, 1977). Reaktioseos DNA:n 32P-merkitsemiseksi sisältää tavallisesti 0,5 yg esimerkiksi plasmidin EcoRI-Xbal-kappaletta kokonaistilavuudessa 30 yl, käsittäen edelleen 50 mM Tris, pH 7,8, 5 mM MgCl2, 10 mM merkaptoetano-lia, 0,1 mM dATP, 0,1 mM dGTP, 0,1 mM dTTP, 50 yCi 32P-dCTP, 10 yksikköä DNA-polymeraasia I, 3 yl pitoisuudeltaan 1 mg/ml olevan DNaasin 2 x 10 3 -kertaista laimennosta, ja seosta inkuboidaan 90 minuuttia 15 °C:n lämpötilassa, jolloin saadaan yhteensä 3 x 106 - 12 x 10^ cpm, eli 1 x 10^ - 5 x 107 cpm/yg DNA.The reading for the open phosphodiester bridge is performed by Rigby et al. (J. Mol. Biol. Vol. 113, pp. 237-251, 1977). The reaction mixture for 32 P-labeling of DNA usually contains, for example, 0.5 μg of the EcoRI-XbaI fragment of the plasmid in a total volume of 30 μl, further comprising 50 mM Tris, pH 7.8, 5 mM MgCl 2, 10 mM mercaptoethanol, 0.1 mM dATP , 0.1 mM dGTP, 0.1 mM dTTP, 50 μCi 32 P-dCTP, 10 units of DNA polymerase I, 3 μl of a 2 x 10 3-fold dilution of 1 mg / ml DNase, and the mixture is incubated for 90 minutes at 15 ° At C to give a total of 3 x 10 6 to 12 x 10 8 cpm, i.e. 1 x 10 6 to 5 x 10 7 cpm / μg DNA.
d. Kykenevien bakteerisolujen transformaatiod. Transformation of capable bacterial cells
Tiheästä, yön aikana muodostuneesta viljelmästä otetaan • 1 ml bakteerisolujen suspensiota, joka siirrostetaan 100 millilitraan kasvualustaa (L-alusta). Soluja kasvatetaan 37 °C:n lämpötilassa optiseen tiheyteen OD^q = 0,7, johon päästään 2 tunnissa voimakkaasti ravistellen 500 millilit-ran Erlenmeyer-pulloissa. Kasvu pysäytetään jäähdyttämällä viljelmää jäissä 10 minuuttia. Tästä viljelmästä otetaan 3 ml, josta eksponentiaalisessa kasvuvaiheessa olevat bakteerisolut otetaan talteen sentrifugoimalla nopeudella 3000 rpm 5 minuuttia. Solut suspendoidaan uudestaan 1,5 milli-litraan liuosta, joka käsittää 50 mM CaCl2~yhdistettä 10 mM Tris-puskurissa, pH 8,0, ja niitä inkuboidaan jälleen jäissä 15 minuuttia. Solut otetaan jälleen talteen sentrifugoimalla nopeudella 3000 rpm 5 minuuttia, ja ne suspen- 64 55726 doidaan uudestaan 200 mikrolitraan liuosta, joka käsittää 50 mM CaCl2-yhdistettä 10 mM Tris-puskurissa, pH 8,0 ja pidetään 4 °C:n lämpötilassa yön yli.From a dense overnight culture, take 1 ml of a suspension of bacterial cells inoculated into 100 ml of medium (L medium). The cells are grown at 37 ° C to an optical density OD ^ q = 0.7, which is reached in 2 hours with vigorous shaking in 500 ml Erlenmeyer flasks. Growth is stopped by cooling the culture on ice for 10 minutes. 3 ml of this culture is taken, from which the bacterial cells in the exponential growth stage are recovered by centrifugation at 3000 rpm for 5 minutes. The cells are resuspended in 1.5 milliliters of a solution comprising 50 mM CaCl 2 in 10 mM Tris buffer, pH 8.0, and incubated again on ice for 15 minutes. The cells are again harvested by centrifugation at 3000 rpm for 5 minutes and resuspended in 200 microliters of a solution comprising 50 mM CaCl 2 in 10 mM Tris buffer, pH 8.0, and maintained at 4 ° C overnight. .
Tämän jälkeen ligaatioseoksen kokonaistilavuus saatettiin 70 mikrolitraksi liuoksella, joka käsittää 10 mM Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA, ja se lisättiin 200 mikrolitraan bakteerisolujen suspensiota DNA:n siirtämiseksi soluihin.The total volume of the ligation mixture was then made to 70 microliters with a solution comprising 10 mM Tris, pH 7.5, 1 mM EDTA, and added to 200 microliters of bacterial cell suspension to transfer DNA to the cells.
Seosta inkuboitiin jäissä 30 minuuttia, jonka jälkeen siihen lisättiin 1 ml L-alustaa, ja seosta inkuboitiin 42 °C:n lämpötilassa 2 minuuttia ja 37 °C;n lämpötilassa 40 minuuttia. Inkuboinnin jälkeen solut levitettiin agarmaljoille, jotka sisälsivät 50 yl ampisilliinia/ml agaria, siten, että maljalle levitettävän solususpension tilavuus oli 50-300 ui. Agarmaljoja inkuboitiin 37 °C:n lämpötilassa yön yli. Tämän inkubointijakson jälkeen maljoille oli muodostunut yksittäisiä, erillisiä bakteeripesäkkeitä.The mixture was incubated on ice for 30 minutes, after which 1 ml of L medium was added, and the mixture was incubated at 42 ° C for 2 minutes and at 37 ° C for 40 minutes. After incubation, the cells were plated on agar plates containing 50 μl ampicillin / ml agar so that the volume of cell suspension applied to the plate was 50-300 μl. The agar plates were incubated at 37 ° C overnight. After this incubation period, single, distinct bacterial colonies had formed on the plates.
e. Southernin täpläanalyysie. Southern blot analysis
Jotta saataisiin selville tämän keksinnön mukaisten vektoreiden järjestäytyminen isäntäsolun genomissa, kromosomaa-linen DNA tämän keksinnön mukaisia partikkeleita tuottavista solulinjoista eristetään ja pilkotaan sopivilla restriktio-entsyymeillä, ja analysoidaan Southernin menetelmällä (J.In order to determine the organization of the vectors of this invention in the genome of the host cell, chromosomal DNA from cell lines producing the particles of this invention is isolated and digested with appropriate restriction enzymes, and analyzed by the Southern method (J.
Mol. Biol., Voi. 98, sivut 503-517, 1975) käyttäen 3^P-mer-kittyä DNA-koetinta. Sen jälkeen, kun kromosomaalinen DNA (20 yg) on pilkottu restriktioentsyymeillä EcoRI ja Xbal, niin tuloksena olevat kappaleet erotetaan elektroforeetti-sesti 0,7 % agaroosigeelillä. Tämän jälkeen DNA denaturoidaan käsittelemällä sitä 366 nanometrin UV-säteillä 10 minuuttia, ja inkuboimalla 45 minuuttia liuoksessa, joka käsittää 0,5 N NaOH ja 1 M NaCl. Geelit neutraloidaan inkuboimalla 60 minuuttia liuoksessa 0,5 M Tris, 1,5 M NaCl, pH 7,5. DNA siirretään nitroselluloosaa olevalle suodatti-melle kastelemalla sitä 20 tuntia liuoksella, joka käsittää 3 M NaCl, 0,3 M Na-sitraattia (20 x SSC), geelin läpi 11 65 95726 laittamalla nitroselluloosasuodattimen päälle pino kuivia paperipyyhkeitä. Nitroselluloosasuodatinta pidetään 2 tuntia vakuumiuunissa 80 °C:n lämpötilassa.Mol. Biol., Vol. 98, pages 503-517, 1975) using a 3β-labeled DNA probe. After digestion of chromosomal DNA (20 μg) with the restriction enzymes EcoRI and XbaI, the resulting fragments are separated electrophoretically on a 0.7% agarose gel. The DNA is then denatured by treatment with 366 nanometers of UV rays for 10 minutes, and incubation for 45 minutes in a solution comprising 0.5 N NaOH and 1 M NaCl. The gels are neutralized by incubation for 60 minutes in a solution of 0.5 M Tris, 1.5 M NaCl, pH 7.5. The DNA is transferred to a nitrocellulose filter by wetting it for 20 hours with a solution of 3 M NaCl, 0.3 M Na citrate (20 x SSC) through a gel 11 65 95726 by placing a stack of dry paper towels on top of the nitrocellulose filter. The nitrocellulose filter is kept for 2 hours in a vacuum oven at 80 ° C.
Radioaktiivinen DNA-koetin plasmidin pDMI (4,3 kb) EcoRI-Xbal -kappaleesta valmistetaan nick-luennalla.A radioactive DNA probe from the EcoRI-XbaI fragment of plasmid pDMI (4.3 kb) is prepared by nick reading.
DNA-koettimen kanssa hybridisaatiota varten nitroselluloosa-suodatin suljetaan muovipussiin, joka sisältää 10 ml esi-hybridisaat-ioseosta: 50 % formamidia, 5 x £SC, 50 mM natrium-fosfaattia, pH 7,0, 5 x Denhardtin liuos, 250 yg/ml denaturoitua lohen sperman DNA:ta. Suodatinta inkuboidaan tässä seoksessa 4 tuntia 45 °C:n lämpötilassa, jonka jälkeen esi-hybridisaatioseos korvataan hybridisaatioseoksella: 50 % formamidia, 5 x SSC, 20 mM Na-fosfaattia, pH 7,0, 1 x Denhardtin liuos, 100 yg/ml denaturoitua lohen sperman DNA:ta 5 x 103 cpm/ml "^P-koetinta. Sen jälkeen, kun suodatinta on inkuboitu hvbridisaatioseoksessa 18 tuntia 45 °C:n lämpötilassa, sitä pestään kolmasti kulloinkin 5 minuuttia 50 °C:n lämpötilassa liuoksella 0,1 x SSC, 0,1 % SDS.For hybridization with the DNA probe, the nitrocellulose filter is sealed in a plastic bag containing 10 ml of pre-hybridization mixture: 50% formamide, 5 x £ SC, 50 mM sodium phosphate, pH 7.0, 5 x Denhardt's solution, 250 μg / ml of denatured salmon sperm DNA. The filter is incubated in this mixture for 4 hours at 45 ° C, after which the pre-hybridization mixture is replaced by the hybridization mixture: 50% formamide, 5 x SSC, 20 mM Na phosphate, pH 7.0, 1 x Denhardt's solution, 100 μg / ml denatured salmon sperm DNA 5 x 103 cpm / ml "^ P probe. After incubation of the filter in the hybridization mixture for 18 hours at 45 ° C, it is washed three times for 5 minutes at 50 ° C with a solution of 0.1 x SSC, 0.1% SDS.
Suodatinta kuivataan 60 0C":n lämpötilassa 10 minuuttia, ja sillä valotetaan kahta röntgensädefilmiä (XAR-5, KODAK) kahden voimistavan varjostimen välissä, ja pidetään -80 °C:n lämpötilassa. Ensimmäinen röntgensädefilmi kehitetään -3 vuorokautta kestäneen valottamisen jälkeen; toinen filmi 7 vuorokautta kestäneen valottamisen jälkeen. Merkityn DNA-koettimen hvbridisoituminen yhteen solun DNA:sta saatuun restriktiokappaleeseen, joka on peräisin tämän keksinnön mukaisia partikkeleita tuottavista transfektanteista , osoittaa, että solun DNA sisältää todellakin tämän keksinnön mukaisen yhtenäistyneen vektorin. Koska Southernin rtäpläanalyysin perusteella solu-DNA:n restriktioprofiili on sama kuin alkuperäisessä plasmidimuodosteessa, niin voidaan todeta, ettei plasmidi-DNA:n huomattavaa uudestaan-järjestäytvmistä tapahtunut sen yhtenäistyessä isäntäsolun ÖNA:hän.The filter is dried at 60 ° C for 10 minutes and exposed to two X-ray films (XAR-5, KODAK) between the two intensifying shaders, and kept at -80 ° C. The first X-ray film is developed after -3 days of exposure; the second film After 7 days of exposure, hybridization of the labeled DNA probe to a single restriction fragment derived from cellular DNA derived from transfectants producing the particles of this invention indicates that the cellular DNA does indeed contain a homogenized vector of this invention. n has the same restriction profile as the original plasmid construct, it can be seen that no significant rearrangement of the plasmid DNA occurred as it fused to the host cell ÖNA.
66 95726 2. Nisäkkään solulinjojen transfektio ja tämän keksinnön mukaisia partikkeleita tuottavien kloonien tunnistaminen66 95726 2. Transfection of mammalian cell lines and identification of clones producing particles of this invention
Solut transfektoidaan käyttäen Wiglerin et ai. esittämää (Cell, Voi. 14, sivu 725, 1978), kalsiumfosfaatilla saos-tamiseen perustuvaa menetelmää. Tämän jälkeen solut ositetaan suhteessa 1:6 uusiin viljelymaljoille, ja ne solut, joihin on siirtynyt lääkeaineen vastustuskykyyn perustuvan merkitsimen geeni (neo), valikoidaan kasvattamalla G418-pitoisessa alustassa. Sen jälkeen kun solut ovat kasvaneet 10 vuorokautta selektiivisellä alustalla, lääkeaineelle vastustuskykyiset pesäkkeet kloonataan mikrotiitterile-vyille. Sen jälkeen, kun solut ovat kasvaneet yhteen, tämän keksinnön mukaisten partikkeleiden ilmentyneet määrät varmistetaan RIA-tekniikalla.Cells are transfected using the method of Wigler et al. (Cell, Vol. 14, page 725, 1978), a method based on calcium phosphate precipitation. The cells are then partitioned 1: 6 into new culture dishes, and those cells to which the drug resistance marker marker (neo) has been transferred are selected by growth in G418-containing medium. After the cells have grown for 10 days on selective medium, drug-resistant colonies are cloned into microtiter plates. After the cells have grown together, the expressed amounts of the particles of this invention are confirmed by RIA.
Kudosviljelymaljoille (halkaisija 100 mm) siirrostetaan 5x10^ solua ja niitä inkuboidaan yön yli 37 °C:n lämpötilassa. Neljä tuntia ennen transfektoimista viljelyalusta korvataan uudella alustalla. Transfektoitava DNA suspen-doidaan 1 millilitraan liuosta, joka sisältää 250 mM CaCl2/ 140 mM NaCl, 25 mM Hepes, pH 7,1, sekä 0,75 mM NaHPO^ . Tämä kalsiumfosfaatin ja DNA:n välinen saostuma lisätään viljelmän soluihin. Viljelmää inkuboidaan yön yli, jonka jälkeen soluviljelmään lisätään uutta alustaa ja soluja inkuboidaan edelleen kaksi vuorokautta.Tissue culture dishes (diameter 100 mm) are inoculated with 5x10 4 cells and incubated overnight at 37 ° C. Four hours before transfection, the culture medium is replaced with new medium. The DNA to be transfected is suspended in 1 ml of a solution containing 250 mM CaCl 2/140 mM NaCl, 25 mM Hepes, pH 7.1, and 0.75 mM NaHPO 4. This precipitate between calcium phosphate and DNA is added to the culture cells. The culture is incubated overnight, after which new medium is added to the cell culture and the cells are further incubated for two days.
F. Toimenpiteet, joilla saadaan nisäkässolujen staattinen soluviljelmäF. Procedures for obtaining static cell culture of mammalian cells
Ampullillinen soluja, joita on pidetty -196 °C:n lämpötilassa * nestemäisessä typessä, sulatetaan nopeasti laittamalla ampulli 5 minuutiksi vesihauteeseen, jonka lämpötila on 37 °C. Yksi ml tätä juuri sulatettua solususpensiota laimennetaan lisäämällä siihen hitaasti 10 ml asianmukaista viljelyalustaa. Tämän jälkeen solut otetaan talteen sentri-fugoimalla, suspendoidaan uudestaan 10 millilitraan vilje-lyalustaa. Tämän jälkeen solut otetaan talteen sentrifu- 67 95726 goimalla ja ne suspendoidaan uudestaan 10 millilitraan viljelyalustaa, siirretään T25-viljelypulloihin ja niitä kasvatetaan inkubaattorissa 37 °C:n lämpötilassa siten, että läsnä on 5 % C02:ta. Näissä olosuhteissa L-solujen ja CHO-solujen kaksinkertaistumiseen tarvittava aika on suurin piirtein 15-20 tuntia ja Vero-solujen tapauksessa 30-40 tuntia. L-solut ja CHO-solut saadaan pysymään hengissä ja kasvamaan myös sen jälkeen, kun ne ovat kasvaneet 100-prosenttisesti yhteen, kun taas Vero-solut siirretään, kun ne ovat kasvaneet 100-prosenttisesti yhteen.The ampoule of cells kept at -196 ° C * in liquid nitrogen is rapidly thawed by placing the ampoule in a water bath at 37 ° C for 5 minutes. One ml of this freshly thawed cell suspension is diluted by slowly adding 10 ml of the appropriate culture medium. The cells are then harvested by centrifugation, resuspended in 10 ml of culture medium. The cells are then harvested by centrifugation and resuspended in 10 ml of culture medium, transferred to T25 culture flasks and grown in an incubator at 37 ° C in the presence of 5% CO 2. Under these conditions, the time required for doubling of L cells and CHO cells is approximately 15-20 hours and in the case of Vero cells 30-40 hours. L cells and CHO cells are allowed to survive and grow even after they have grown 100% together, while Vero cells are transplanted after they have grown 100% together.
G. Toimenpiteet nisäkässolujen kasvattamiseksi ACUSYST-P-laitteessa ja tämän keksinnön mukaisten partikkeleiden ottaminen talteen 1. Siirrosten kasvatus ja esikäsittelyG. Procedures for Growing Mammalian Cells in an ACUSYST-P Device and Recovering Particles of This Invention 1. Inoculum Growth and Pretreatment
Soluja pidetään T75- tai T150-pulloissa, jotka sisältävät 2 DMEM-10 % FBS. Pyöritettävissä pulloissa (850 cm ) inku- boidaan 10-15 x 10® solua, jotka on saatu T-pulloista.Cells are maintained in T75 or T150 flasks containing 2 DMEM-10% FBS. In rotatable flasks (850 cm), 10-15 x 10® cells obtained from T-flasks are incubated.
Kun soluja on kasvatettu 3-5 vuorokautta, yhteensä noin o 10 solua otetaan talteen kuudesta pyöritettävästä pullosta ja ne siirrostetaan kuuteen onttokuituhylsyyn (HFC) ACUSYST-P-laitteessa, jonka valmistaja on yhtiö Endotronics, Inc., Minneapolis, Minnesota, USA.After culturing the cells for 3-5 days, a total of about 10 cells are harvested from six rotatable flasks and inoculated into six hollow fiber cores (HFCs) in an ACUSYST-P manufactured by Endotronics, Inc., Minneapolis, Minnesota, USA.
2. ACUSYST-P-viljelmä ja tämän keksinnön mukaisten partikkeleiden ottaminen talteen2. ACUSYST-P culture and recovery of particles of this invention
Siirrostamisen jälkeen HFC-hylsyt laitetaan ACUSYST-P-vil jely järjestelmään ja hylsyjen läpi kulkevan alustan virtausnopeus asetetaan arvoon 50 ml/tunti ja se pidetään tässä arvossa. Alustasta määritetään päivittäin pH, p02, glukoosi ja laktaatti. Kasvatuksen kestettyä 2-3 viikkoa, 600 millilitran nestetilavuus otetaan kahdesti viikossa kunkin ACUSYST-P-laitteessa olevan onttokuituhylsyn kapillaarin ulkopuolisesta tilasta. Tämän keksinnön mukaisten partikkeleiden muodostuminen todetaan radioimmunokokeella (RIA). Koska pakastaminen tuhoaa RIA-kokeella määritettä- 68 95726 vän aktiivisuuden, niin talteen otettuja näytteitä säilytetään 4 °C:n lämpötilassa ennen puhdistamista. Proteaasi-aktiivisuutta ei todeta lainkaan näissä olosuhteissa Azo-coll-substraatin proteolyysillä (SIGMA) määritettynä.After inoculation, the HFC cores are placed in an ACUSYST-P culture system and the flow rate of the medium passing through the cores is set at and maintained at 50 ml / hour. The pH, pO 2, glucose and lactate are determined daily from the medium. After 2-3 weeks of growth, a volume of 600 milliliters of fluid is taken twice a week from outside the capillary space of each hollow fiber sleeve in the ACUSYST-P. The formation of the particles of this invention is detected by radioimmunoassay (RIA). Since freezing destroys the activity determined by the RIA assay, the collected samples are stored at 4 ° C before purification. No protease activity was observed under these conditions as determined by proteolysis of the Azo-coll substrate (SIGMA).
3. Toimenpiteet laadun tarkkailemiseksi a. Kokeet bakteereiden ja fungien läsnäolon toteamiseksi3. Quality control measures a. Tests for the presence of bacteria and fungi
Solujoukosta, joka sisältää noin 5x10^ solua/ml ja jotka on suspendoitu siihen soluviljelyalustaan, josta ne otettiin talteen, määritetään bakteereiden ja fungien läsnä olo. Yksi ml soluja vedetään tryptikaasi-soija-agaria (BBL) sisältäville maljoille, ja toinen 1 ml siirrostetaan tioglykolaattialustaan (DIFCO) aerobisten sekä anaerobisten bakteereiden läsnäolon toteamiseksi. Fungikontaminaatio ilmaistaan vetämällä 1 ml soluja Sabouraud-agaria (DIFCO) sisältäville maljoille. Nämä kokeet toteutettiin säännöllisesti, jolloin voitiin varmistua kasvualustan steriiliydestä sekä siitä, etteivät soluviljelmät olleet kontaminoituneet bakteereilla tai fungeilla.The presence of bacteria and fungi is determined from a set of cells containing about 5x10 6 cells / ml suspended in the cell culture medium from which they were harvested. One ml of cells is plated on plates containing trypticase-soy agar (BBL), and another 1 ml is inoculated into thioglycollate medium (DIFCO) to detect the presence of aerobic as well as anaerobic bacteria. Fung contamination is expressed by drawing 1 ml of cells on plates containing Sabouraud agar (DIFCO). These experiments were performed regularly to ensure the sterility of the medium and that the cell cultures were not contaminated with bacteria or fungi.
b. Kokeet mykoplasman läsnäolon toteamiseksib. Tests for the presence of mycoplasma
Fluoresenssivärjäys. Mykoplasma-DNA:n läsnäolo solun sytoplasmassa määritetään värjäysmenetelmällä käyttäen fluoro-kromia, Hoechst 33258. Tämä DNA:n värjäävä väri fluoresoi ultraviolettivalossa, ja se toimii mykoplasmojen läsnäolon osoittavan, erittäin nopean ja herkän kokeen perustana.Fluorescent staining. The presence of mycoplasma DNA in the cell cytoplasm is determined by a staining method using fluorochrome, Hoechst 33258. This DNA staining dye fluoresces under ultraviolet light and serves as the basis for a very rapid and sensitive experiment indicating the presence of mycoplasmas.
Tässä menetelmässä käytetään testattavien solujen peite-lasiviljelmiä, joita käytetään kun solut ovat kasvaneet 50-70 -prosenttisesti yhteen. Kiinnittämisen ja värjäämisen jälkeen peitinlaseja tarkastellaan fluoresenssimikroskoo-pilla. Sytoplasminen fluoresenssi osoittaa mykoplasman läsnäolon.This method uses cover glass cultures of the cells to be tested, which are used when the cells have grown 50-70% together. After attachment and staining, coverslips are examined by fluorescence microscopy. Cytoplasmic fluorescence indicates the presence of mycoplasma.
Hoechst 33258 bisbentsamidi-fluorokromin varastoliuos *. valmistetaan liuottamalla 5 mg fluorokromia 100 millilit- raan PBS-liuosta magneettisekoittajaa käyttäen. Se steri- I) 69 95726 loidaan suodattamalla 0,22 mikronin kalvon läpi, säilytetään pimeässä, 4 °C:n lämpötilassa, ja laimennetaan tuhat-kertäisesti PBS-liuoksella ennen käyttöä. Peitinlasiviljel-mien, jotka ovat kasvaneet yhteen 50-70 -prosenttisesti, alusta erotetaan soluista imulla, ja kiinnitetään 4 °C:n lämpötilassa vaihtamalla kahdesti seos, joka käsittää etanolia ja etikkahappoa suhteessa 3:1. Peitinlasit pestään kerran ionittomalla vedellä ja inkuboidaan 30 minuuttia 37 °C:n lämpötilassa laimennetun, fluorokromina toimivan bisbentsamidin (Hoechst 33258) kanssa, jonka jälkeen peitinlasit huuhdellaan ionittomalla vedellä. Peitinlasit laitetaan solupuoli alaspäin mikroskooppilasille käyttäen upotinnesteenä glyserolia (22,2 ml 2 % sitruunahappoa; 1 ml H20; 27,8 ml 2,8 % Na2HP04; 50 ml glyserolia, pH 5,5) .Hoechst 33258 bisbenzamide fluorochrome stock solution *. is prepared by dissolving 5 mg of fluorochrome in 100 ml of PBS using a magnetic stirrer. It is sterilized by filtration through a 0.22 micron membrane, stored in the dark at 4 ° C, and diluted 1,000-fold with PBS before use. For coverslip cultures grown 50-70%, the medium is separated from the cells by suction and fixed at 4 ° C by changing twice the mixture of ethanol and acetic acid in a ratio of 3: 1. The coverslips are washed once with deionized water and incubated for 30 minutes at 37 ° C with dilute fluorochrome bisbenzamide (Hoechst 33258), after which the coverslips are rinsed with deionized water. The coverslips are placed cell side down on a microscope slide using glycerol (22.2 ml of 2% citric acid; 1 ml of H 2 O; 27.8 ml of 2.8% Na 2 HPO 4; 50 ml of glycerol, pH 5.5) as an immersion liquid.
C. Kokeet virusten läsnäolon toteamiseksi 1) Kokeet soluviljelmissä.C. Tests for the presence of viruses 1) Tests in cell cultures.
Testisoluja tarkastellaan normaalin morfologian suhteen vähintään 14 vuorokauden pituisen inkubointijakson aikana, testattavan solulinjan suspensiolla siirrostamisen jälkeen.The test cells are examined for normal morphology during an incubation period of at least 14 days, after inoculation with the suspension of the test cell line.
Tämän lisäksi 3.-5. vuorokautena ja jälleen 12. vuorokauden jälkeen, vähintään 4 % siirrostetuista testiviljelmistä pestään, ja siitä määritetään hemadsorptio käyttäen lampaan ja ihmisen punasoluja. Tulokset luetaan sen jälkeen kun viljelmiä on inkuboitu 30 minuuttia 3-4 °C:n lämpötilassa, ja jälleen 30 minuutin kuluttua 34-37 °C:n lämpötilassa. Kokeista, joilla voidaan määrittää viruksella infektoituneiden, erytrosyyttejä absorboivien solujen läsnäolo, saadut tulokset osoittivat viruskontaminaation puuttumisen.In addition to this, 3-5. day and again after day 12, at least 4% of the inoculated test cultures are washed and assayed for hemadsorption using sheep and human erythrocytes. The results are read after incubating the cultures for 30 minutes at 3-4 ° C, and again after 30 minutes at 34-37 ° C. The results of experiments to determine the presence of virus-infected erythrocyte-absorbing cells showed the absence of viral contamination.
2) Kokeet eläimissä.2) Experiments on animals.
Testattavat solut suspendoidaan liuokseen, joka käsittää 140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8,1 mM Na2HP04, pH 7,2, pitoisuudeksi 10^/ml, ja niitä siirrostetaan eri eläinryhmiin. Yhdessä ryhmässä, vähintään 10 eläintä vähintään kahdesta imevien hiirten pesueesta saa siirrostetta. Soluja siir- 70 95726 rostetaan kuhunkin eläimeen 0,1 ml vatsaontelon sisäisesti ja 0,01 ml aivojen sisäisesti. Hiiriä tarkkaillaan päivittäin, vähintään 14 vuorokauden ajan. Jokaiselle hiirelle, joka kuolee kokeen 24 ensimmäisen tunnin jälkeen tai joka tapetaan sairastumisen vuoksi, tehdään ruumiinavaus ja siitä etsitään jälkiä virusinfektiosta. Tämä tutkimus käsittää lisätestaamisen, joka toteutetaan alisiirrostamalla sopivia kudossuspensioita aivojen sisäisesti ja vatsaontelon sisäisesti vähintään viidestä imevästä hiirestä muodostuvaan lisäryhmään, jota tarkkaillaan 14 vuorokautta. Tämän lisäksi tehdään sokeakoe yhdistetystä, emulgoidusta kudoksesta (ihoa ja elimiä (viscus) lukuunottamatta), joka on saatu alkuperäisen 24 vuorokauden pituisen kokeen jälkeen eloon jääneistä hiiristä.The test cells are suspended in a solution comprising 140 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8.1 mM Na 2 HPO 4, pH 7.2 to a concentration of 10 μl / ml and inoculated into different groups of animals. In one group, at least 10 animals from at least two washes of sucking mice receive inoculum. Cells are transplanted into each animal 0.1 ml intraperitoneally and 0.01 ml intracerebrally. Mice are observed daily for at least 14 days. Any mouse that dies after the first 24 hours of the experiment or is killed due to disease will have an autopsy and look for traces of viral infection. This study involves further testing performed by subculturing appropriate tissue suspensions intracerebrally and intraperitoneally into an additional group of at least five sucking mice, which is monitored for 14 days. In addition, a blank test is performed on pooled, emulsified tissue (excluding skin and organs (viscus)) obtained from mice that survived the initial 24-day test.
Toisessa ryhmässä myös 10 täysikasvuista hiirtä saa siir-rostetta. Kuhunkin eläimeen siirrostetaan 0,5 ml soluja vatsaontelon sisäisesti ja 0,03 ml soluja aivojen sisäisesti. Eläimiä tarkkaillaan neljä viikkoa, ja jokainen eläin, joka sairastuu, tai jossa esiintyy poikkeavuutta tavallisuudesta, tutkitaan sairastumisen syyn selvittämiseksi. Kontaminoivien virusten läsnäolon osoittavista, eläimissä toteutetuista kokeista saadut tulokset eivät ilmaisseet viruskontaminaatiota.In the second group, 10 adult mice also receive inoculum. Each animal is inoculated with 0.5 ml of cells intraperitoneally and 0.03 ml of cells intracerebral. The animals are observed for four weeks, and any animal that becomes ill or has an abnormality is examined to determine the cause of the disease. Results from animal experiments showing the presence of contaminating viruses did not indicate viral contamination.
d. Koe tuumorigeenisyyden selvittämiseksi.d. Test for tumorigenicity.
Sopivassa tuumorigeenisyyden ilmaisevassa kokeessa, jossa käytetään karvattomia hiiriä (nu/nu), 20 eläimeen siirrostetaan 24 tunnin sisällä syntymisestä 0,1 ml voimakasta seerumia. Tämä injektio annetaan joko lihaksen sisään tai ihonalaisesti ja se toistetaan 2., 7. ja 14. elinpäivänä.In a suitable tumorigenicity test using nude mice (nu / nu), 20 animals are inoculated within 24 hours of birth with 0.1 ml of strong serum. This injection is given either intramuscularly or subcutaneously and is repeated on days 2, 7 and 14 of life.
Yksi miljoona vertailuna käytettyä tuumorisolua tuottaa säännöllisesti asteittain kasvavia tuumoreita ja etäispesäkkeitä. Yksi miljoona elävää solua tutkittavasta solu-linjasta siirrostetaan ihon alaisesti mihin tahansa sellaiseen kohtaan, jossa kehittyvät tuumorit voivat puhjetaOne million reference tumor cells produce regularly growing tumors and metastases. One million living cells from the cell line under study are inoculated subcutaneously at any site where developing tumors can erupt
IIII
71 95726 (raajat ovat sopivia). Eläimiä tarkkaillaan 21 vuorokautta sen toteamiseksi, muodostuuko injektiokohtaan solmuketta, ja mittauksia suoritetaan ajoittain asteittaisen kasvun toteamiseksi. 21 vuorokauden pituisen havainnointijakson päätyttyä kaikki eläimet tapetaan ja niistä etsitään jälkiä tuumorin muodostumisesta injektiokohtaan sekä muihin elimiin, kuten imurauhasiin, keuhkoihin, munuaisiin ja maksaan. Kaikki tuumorin kaltaiset muutokset ja kaikki siirrostamiskohdat tutkitaan histopatologisesti. Tämän lisäksi, koska eräät solulinjat voivat muodostaa etäispesäkkeitä paikallisen tuumorikasvun kuitenkin puuttuessa, niin kaikkien eläinten keuhkot ja alueelliset imusolmukkeet tutkitaan histologisesti.71 95726 (limbs are suitable). Animals are observed for 21 days to determine if nodules form at the injection site, and measurements are made periodically to detect gradual growth. At the end of the 21-day observation period, all animals are sacrificed and traces of tumor formation at the injection site and other organs such as the lymph nodes, lungs, kidneys, and liver are searched. All tumor-like changes and all inoculation sites are examined histopathologically. In addition, because some cell lines can form metastases in the absence of local tumor growth, however, the lungs and regional lymph nodes of all animals are examined histologically.
Tämän kokeen tavoitteita ajatellen asteittain kasvava tuumori määritellään kosketeltavaksi solmukkeeksi, jonka koko suurenee 21 vuorokauden pituisen havaintojakson aikana, ja jossa voidaan todeta eläviä ja mitoottisesti aktiivisia siirrostesoluja histologisesti tutkittaessa. Asteittain kasvavana tuumorina ei pidetä sitä, että läsnä on mikros-kooppisesti eläviä soluja liittyneenä muuttumattomaan tai regressiiviseen solmukkeeseen.For the purposes of this experiment, a progressively growing tumor is defined as a tactile node that increases in size over a 21-day observation period and in which live and mitotically active inoculum cells can be detected by histological examination. The presence of microscopically living cells associated with an unchanged or regressive node is not considered a progressive tumor.
H. Tämän keksinnön mukaisten partikkeleiden puhdistaminen I. Fraktiosaostaminen polyetyleeniglykolilla (PEG)H. Purification of the Particles of This Invention I. Fractionation with Polyethylene Glycol (PEG)
Alusta otetaan talteen kapillaarien ulkopuolisesta tilasta, ACUSYST-P-viljelyjärjestelmästä, ja yhdistetään 3000 milli-litran tilavuuksiksi. Kuhunkin tilavuuteen lisätään 180 g PEG 8000-tuotetta (SIGMA), joka liuotetaan sekoittamalla huoneen lämpötilassa 20 minuuttia, ja sekoittamista jatketaan edelleen 3 tuntia 4 °C:n lämpötilassa. Saostuma otetaan talteen sentrifugoimalla 500 millilitran suuruisissa pulloissa GS 3-roottorissa nopeudella 4500 rpm (3000 x g) 30 minuuttia 10 °C:n lämpötilassa. Supernatant-ti otetaan talteen ja siihen lisätään jälleen 180 g PEG 8000 -tuotetta, joka liuotetaan huoneen lämpötilassa edellä 72 95726 kuvatusti. Liuosta sekotetaan 4 °C:n lämpötilassa edelleen 3 tuntia. Tämän liuoksen saostuma otetaan talteen edellä kuvatusti, paitsi että sentrifugointi toteutetaan nopeudella 9000 rpm (15 000 x g) 60 minuuttia. Kasauma suspen-doidaan uudestaan fosfaatilla puskuroituun suolaliuokseen (PBS).The medium is recovered from the space outside the capillaries, the ACUSYST-P culture system, and combined into 3,000 milliliter volumes. To each volume is added 180 g of PEG 8000 product (SIGMA), which is dissolved by stirring at room temperature for 20 minutes, and stirring is continued for 3 hours at 4 ° C. The precipitate is collected by centrifugation in 500 ml flasks on a GS 3 rotor at 4500 rpm (3000 x g) for 30 minutes at 10 ° C. The supernatant is collected and 180 g of PEG 8000 are again added, which is dissolved at room temperature as described above 72 95726. The solution is stirred at 4 ° C for a further 3 hours. The precipitate of this solution is collected as described above, except that centrifugation is performed at 9,000 rpm (15,000 x g) for 60 minutes. The pellet is resuspended in phosphate buffered saline (PBS).
2. Geelisuodatukseen perustuva kromatografia Materiaali, joka saatiin PEG-saostamalla, ja joka on liuotettu uudestaan PBS-liuokseen, käsitellään kromatogra-fisesti geelillä suodattamalla käyttäen BioRad-yhtiön A-5m-hartsia 4 °C:n lämpötilassa. Kolonnin ulottuvuudet ovat 25 x 1000 mm, ja petin tilavuus on 480 ml. Jaettaessa materiaali tyypillisellä tavalla fraktioihin 1000 ug tämän keksinnön mukaisia PEG-saostettuja partikkeleita 10-15 millilitran tilavuudessa laitetaan kolonniin ja elu-oidaan PBS- tai TNE-liuoksella, virtausnopeuden ollessa 6 pisaraa minuutissa (18 ml/h) ja eluaatista kerätään 3 millilitran fraktioita. Kuvassa 6 esitetään A-5m-ko-lonnista eluoituneen, RIA-ilmaistavan materiaalin profiili. Yhtenäinen viiva osoittaa kunkin fraktion absorbanssin aallonpituudella 280 nm, ja pisteet osoittavat RIA-tulok-sien perusteella lasketun materiaalimäärän.2. Gel Filtration Chromatography The material obtained by PEG precipitation and redissolved in PBS is chromatographed by gel filtration using BioRad's A-5m resin at 4 ° C. The dimensions of the column are 25 x 1000 mm and the volume of the bed is 480 ml. When the material is typically divided into fractions, 1000 ug of PEG-precipitated particles of this invention in a volume of 10-15 ml are applied to the column and eluted with PBS or TNE solution at a flow rate of 6 drops per minute (18 ml / h) and 3 ml fractions are collected from the eluate. Figure 6 shows the profile of RIA-detectable material eluted from the A-5m column. The solid line indicates the absorbance of each fraction at 280 nm, and the dots indicate the amount of material calculated from the RIA results.
3. Isopykninen sentrifugointi CsCl-yhdisteessä 30 fraktiota, jotka kattavat geelisuodatuksena toteutetusta pylväskromatografiästä saadun ensimmäisen piikin, ja jotka sisältävät tämän keksinnön mukaiset, osittain puhdistetut partikkelit, yhdistetään (suurin piirtein 100 ml). Tämän 3 liuoksen tiheys asetetaan arvoon 1,30 g/cm CsCl-yhdis-teellä, jonka jälkeen liuos siirretään nitroselluloosa-putkiin, jotka sopivat SW 27/28-roottoriin (Beckman).3. Isopycnic Centrifugation in CsCl 30 fractions covering the first peak from gel permeation column chromatography and containing the partially purified particles of this invention are pooled (approximately 100 mL). The density of this solution 3 is set at 1.30 g / cm with CsCl, after which the solution is transferred to nitrocellulose tubes suitable for a SW 27/28 rotor (Beckman).
Gradientit saadaan aikaan laittamalla pohjalle 4 ml CsCl-liuosta, jonka tiheys on 1,35 g/cm"*, ja pinnalle 4 ml CsCl-liuosta, jonka tiheys on 1,25 g/cm , sekä 4 ml CsCl-liuosta, jonka tiheys on 1,20 g/cm^. Gradientteja sentrifu- il 73 95726 goidaan nopeudella 28 000 rpm 50 tuntia 10 °C:n lämpötilassa, jaetaan fraktioihin, ja puhdistuneet partikkelit otetaan talteen tiheydeltään 1,20 g/cm^ olevasta kerroksesta, gradientin pinnalta (kuva 7). Puhdistuneet partikkelit erottuvat hyvin kontaminoivan proteiinin pienestä määrästä, joka muodostaa vyöhykkeen grandientin keskelle. Liuoksesta poistetaan suola dialysoimalla, ensin vettä vastaan, sitten 3 suolaliuoksen erää vastaan, 24 tunnin pituisen ajanjakson aikana.Gradients are obtained by applying 4 ml of a solution of Cs35 solution with a density of 1,35 g / cm * to the bottom and 4 ml of a solution of CsCl solution with a density of 1.25 g / cm and 4 ml of CsCl solution with a density of The gradients are centrifuged at 28,000 rpm for 50 hours at 10 ° C, divided into fractions, and the purified particles are recovered from a layer having a density of 1.20 g / cm 2, from the surface of the gradient. (Figure 7) The purified particles are well separated from the small amount of contaminating protein that forms a zone in the center of the grandient, and the solution is desalted by dialysis, first against water, then against 3 portions of saline over a period of 24 hours.
Ylimääräisenä laaduntarkkailutoimenpiteenä osa tästä gradientin avulla puhdistetusta materiaalista sentrifugoidaan uudestaan lineaarista CsCl-gradienttia käyttäen. Odotusten mukaisesti saadaan yksi ainoa puhdistettujen partikkeleiden piikki tiheyteen 1,2 g/cm^.As an additional quality control measure, a portion of this gradient-purified material is recentrifuged using a linear CsCl gradient. As expected, a single peak of purified particles with a density of 1.2 g / cm 2 is obtained.
1. Tämän keksinnön mukaisten puhdistettujen partikkeleiden apuaineen valmistaminen ja stabiilisuuskoe Tämän keksinnön mukaisessa rokotteessa käytettävän apuaineen valmistamiseksi steriilissä suolaliuoksessa toivottuna pitoisuutena olevaan antigeeniin lisätään 1/10 000 tilavuutta Thimerosolia ja 1/10 tilavuutta suodattamalla steriloitua 0,2 M AIK(SO)2:12 I^O-liuosta, pH asetetaan arvoon 5,0 steriilillä 1 N NaOH-liuoksella, ja suspensiota sekoitetaan huoneen lämpötilassa 3 tuntia. Alunalla saostettu antigeeni otetaan talteen sentrifugoimalla 10 minuuttia nopeudella 200 rpm, suspendoidaan uudestaan steriiliin normaaliin suolaliuokseen, joka sisältää 1:10 000 Thimerosolia, ja jaetaan osiin steriileissä olosuhteissa.1. Preparation of the excipient of the purified particles of this invention and stability test To prepare the excipient for use in the vaccine of this invention in sterile saline to the desired concentration of antigen, 1/10,000 volume of Thimerosol and 1/10 volume of sterilized 0.2 M AIK (SO) 2:12 L O solution, the pH is adjusted to 5.0 with sterile 1 N NaOH solution, and the suspension is stirred at room temperature for 3 hours. The alum-precipitated antigen is recovered by centrifugation at 200 rpm for 10 minutes, resuspended in sterile normal saline containing 1: 10,000 Thimerosol, and aliquoted under sterile conditions.
Tämän keksinnön mukaisten, alunaan absorboituneiden partikkeleiden stabiilisuuden määrittämiseksi antigeeni otettiin talteen tekemällä aluna uudestaan liukoiseksi 3 % natrium-sitraattiin, mitä seurasivat peräkkäiset dialyysit 3 % natriumsitraattia ja PBS-liuosta vastaan. Tämän jälkeen 74 95726 keksinnön mukaisten partikkeleiden määrä määritetään yhdensuuntaisella (parallel-line) radioimmuunikokeella puhdistetun HBsAg-standardin laimennoksia vastaan, näiden laimennosten käsittäessä PBS-50 % juuri syntyneen vasikan seerumia .To determine the stability of the alum absorbed particles of this invention, the antigen was recovered by redissolving the alum in 3% sodium citrate followed by sequential dialysis against 3% sodium citrate and PBS. The number of 74,95726 particles of the invention is then determined by a parallel-line radioimmunoassay against dilutions of purified HBsAg standard, these dilutions comprising PBS-50% freshly born calf serum.
Taulukko 1table 1
Stabiilisuuskokeen parametrit Näytteet: kaksi näytettä sellaisenaan ja kaksi alunaan absorboituna Näytteen pitoisuus: 5 yg/ml Säilytysastia: lasiampulliStability test parameters Samples: two samples as such and two absorbed in alum Sample concentration: 5 ug / ml Container: glass ampoule
Säilytyslämpötila: 2-8 °CStorage temperature: 2-8 ° C
Kokeet: (a) kvalitatiivinen: SDS-PAGEExperiments: (a) qualitative: SDS-PAGE
(b) kvantitatiivinen: radioimmunokoe(b) quantitative: radioimmunoassay
Esimerkki 1Example 1
PreS^-PreS2~S -proteiinin koodaavan alueen koodaamia poly-peptidejä käsittävien partikkeleiden ilmentäminen A. Yhdistelmäplasmidin pMMT-neo valmistaminenExpression of Particles Containing Polypeptides Encoded by the Coding Region of the PreS1-PreS2 ~ S Protein A. Preparation of the Recombinant Plasmid pMMT-neo
Plasmidi pBPV342-12 pilkottiin restriktioendonukleaasilla BamHI (katso kuva 1 sekä kappaletta Materiaalit ja menetelmät) . Tällöin saatiin kaksi DNA-molekyyliä: yksi molekyyli (7,95 kb) käsittää naudan papillomaviruksen (BPV) koko ge-nomin; toinen molekyyli (6,65 kb) sisältää osan bakteeri-pi asmidista pML2 (pBR322, josta on hävitetty "mvrkkyketju"), hiiren metallotioneiinipromoottorin (pMMT), neomvsiinin vastustuskyvyn geenin (neo) sekä SV40 PAS-t-alueen (katso kuva 1) . Kun tämä kappale ligatoidaan itseensä (tehdään rengasmaiseksi), niin tällöin saadaan plasmidi pMMT-neo (katso myös kuva 5).Plasmid pBPV342-12 was digested with restriction endonuclease BamHI (see Figure 1 and Materials and Methods). Two DNA molecules were obtained: one molecule (7.95 kb) comprises the entire genome of bovine papillomavirus (BPV); the second molecule (6.65 kb) contains part of the bacterial pi plasmid pML2 (pBR322 depleted of the "chain"), the mouse metallothionein promoter (pMMT), the neomvinin resistance gene (neo), and the SV40 PAS-t region (see Figure 1) . When this fragment is ligated to itself (made annular), the plasmid pMMT-neo is obtained (see also Figure 5).
Reaktio toteutettiin reaktiopuskurissa (katso Materiaalit ja menetelmät), jonka kokonaistilavuus on 400 yl, ja lopullinen pitoisuus 0,2 yg/yl pBPV342-12; sekä 80 yksikköä entsyymiä BamHI, ja reaktio toteutettiin 37 °C:n lämpö-The reaction was performed in reaction buffer (see Materials and Methods) with a total volume of 400 μl and a final concentration of 0.2 μg / μl pBPV342-12; and 80 units of BamHI, and the reaction was performed at 37 ° C.
IIII
75 95726 tilassa 4 tuntia. Pilkkoutumisen täydellisyys varmistettiin elektroforeettisesti agaroosigeelillä käyttäen 0,7 % agaroosigeeliä (katso materiaalit ja menetelmät). Reaktio pysäytettiin lisäämällä 40 yl 8 M LiCl-liuosta ja DNA saos-tettiin 1 millilitralla etanolia -80 °C:n lämpötilassa 30 minuuttia. Saostettu DNA suspendoitiin uudestaan 100 mikro-litraan 10 mM Tris-puskuria, pH 7,8.75 95726 mode for 4 hours. The completeness of the digestion was confirmed electrophoretically on an agarose gel using a 0.7% agarose gel (see Materials and Methods). The reaction was stopped by the addition of 40 μl of 8 M LiCl solution and the DNA was precipitated with 1 ml of ethanol at -80 ° C for 30 minutes. The precipitated DNA was resuspended in 100 microliters of 10 mM Tris buffer, pH 7.8.
B. Koko PreS^-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen sekä kopioitumisen luonnollisen promoottorin sisältävän kappaleen eristäminen HBV-genomin adw-alatyypin valmistus ja kloonaaminen kuvataan julkaisussa Cummings, I.W. et ai., Proc. Natl. Aca.B. Isolation of the entire PreS1-PreS2-S protein coding region and the copy-containing natural promoter fragment The preparation and cloning of the adw subtype of the HBV genome is described in Cummings, I.W. et al., Proc. Natl. Aca.
Sei. USA, Voi. 77, sivu 1842, 1980. Rengasmainen HBV-genomi tehdään lineaariseksi ainoasta EcoRI-kohdasta bakteriofagiin lambda kloonaamista varten sekä bakteeriplasmidin alikloo-naamista varten, jolloin saadaan plasmidi pA01 (katso kuva 2). Koska EcoRI-restriktiokohta sijaitsee PreS1-PreS2~S-proteiinin koodaavassa alueessa, niin tämä alue katkeaa lineaarisessa EcoRI-muodossa. Vahingoittumattoman PreS.|-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen aikaansaamiseksi plas-midin pA01 3,2_kiloemäsparin suuruinen EcoRI-istute eristettiin ja erotettiin plasmidi-DNA:sta pilkkomalla 100 mikrogrammaa plasmidia pA01 reaktiopuskurissa, jota oli yhteensä 400 yl (katso materiaalit ja menetelmät), ja joka sisälsi 200 yksikköä EcoRI-entsyymiä, 4 tuntia 37 °C:n lämpötilassa. 3,2 kiloemäsparin suuruinen DNA-istute eristettiin plasmidi-DNA:sta preparatiivisella elektroforeesilla 0,7 % agaroosigeeliä käyttäen (katso Materiaalit ja menetelmät). DNA eluoitiin sähköisesti agaroosigeeliltä ioninvaihtosuodattimelle DE 81 Whatman, josta DNA poistetaan runsaasti suolaa sisältävään liuokseen. DNA puhdistettiin uuttamalla kerran fenolin ja kloroformin seoksella ja saostamalla kahdesti etanolilla. Tämän jälkeen puhdistettu lineaarinen 3,2 kb EcoRI-kappale, joka koodaa täydellistä HBV-genomia, ligatoitiin itseensä käyttäen 76 9 5 7 2 6 korkeata DNA-pitoisuutta, joka suosii konkatameerien muodostumista: 30 yg EcoRI-kappaleen DNA:ta ligatoitiin reak-tiopuskurissa, jonka kokonaistilavuus oli 50 ui» ja joka sisälsi 1,8 yksikköä T4 DNA-ligaasia ja 2 mM ATP:tä, 15 °C:n lämpötilassa 1 tunnin ajan, ja 4 °C lämpötilassa yön yli; tämän jälkeen DNA puhdistettiin uuttamalla kahdesti fenolin ja kloroformin seoksella, uuttamalla kertaalleen kloroformilla, jonka jälkeen kahteen kertaan saostaminen etanolilla. DNA-kasauma suspendoitiin uudestaan 20 mikro-litraan 10 mM Tris-puskuria, pH 7,8, ja pilkottiin restrik-tioentsyymillä Bglll reaktiopuskurissa (katso Materiaalit ja menetelmät), jonka kokonaistilavuus oli 50 yl, ja joka sisälsi 50 yksikköä entsyymiä Bglll, 37 °C:n lämpötilassa 4 tuntia.Sci. USA, Vol. 77, page 1842, 1980. The annular HBV genome is made linear from a single EcoRI site to bacteriophage for cloning into lambda and subcloning of the bacterial plasmid to give plasmid pA01 (see Figure 2). Because the EcoRI restriction site is located in the coding region of the PreS1-PreS2 ~ S protein, this region is cleaved in the linear EcoRI form. To obtain the intact PreS. | -PreS2-S protein coding region, a 3.2 kilobase pair EcoRI insert of plasmid pA01 was isolated and separated from plasmid DNA by digesting 100 micrograms of plasmid pA01 in a total of 400 ul of reaction buffer (see Materials and Methods). , and containing 200 units of EcoRI, for 4 hours at 37 ° C. A 3.2 kilobase pair DNA insert was isolated from plasmid DNA by preparative electrophoresis using a 0.7% agarose gel (see Materials and Methods). DNA was electrically eluted from an agarose gel onto a DE 81 Whatman ion exchange filter, from which the DNA is removed to a high salt solution. The DNA was purified by extraction once with a mixture of phenol and chloroform and precipitation twice with ethanol. The purified linear 3.2 kb EcoRI fragment encoding the complete HBV genome was then ligated to itself using a high concentration of 76 9 5 7 2 6 DNA that favors the formation of concatamers: 30 μg of EcoRI fragment DNA was ligated in reaction buffer. , with a total volume of 50 μl »and containing 1.8 units of T4 DNA ligase and 2 mM ATP, at 15 ° C for 1 hour, and at 4 ° C overnight; the DNA was then purified by extraction twice with a mixture of phenol and chloroform, extraction once with chloroform, followed by precipitation twice with ethanol. The DNA pellet was resuspended in 20 microliters of 10 mM Tris buffer, pH 7.8, and digested with restriction enzyme BglII in reaction buffer (see Materials and Methods) with a total volume of 50 μl and containing 50 units of BglII, 37 °. At C for 4 hours.
Tässä reaktiossa muodostuneet DNA-kappaleet erotettiin elektroforeettisesti käyttäen 1,5 % agaroosigeeliä. Agaroo-sigeeliltä eristettiin 2,78 kiloemäsparin suuruinen Bglll-kappale, joka sisältää vahingoittumattoman PreS^-PreS2~S-proteiinin koodaavan alueen, sekä sen luonnollisen promoottori järjestelmän , jota tarvitaan pinnan antigeenipolypep-tidien ilmentämiseksi, ja tämä kappale puhdistettiin edellä esitetysti (katso kuva 2) .The DNA fragments formed in this reaction were separated electrophoretically using a 1.5% agarose gel. A 2.78 kilobase pair BglII fragment containing the intact PreS1-PreS2 ~ S protein coding region and its natural promoter system required for expression of surface antigen polypeptides was isolated from an agarose gel and purified as described above (see figure). 2).
C. PreS^-PreS2~S-proteiinin koodaavan alueen sisältävän kappaleen istuttaminen pMMT-neo-plasmidiin: plasmidin pDM1 muodostaminenC. Insertion of a fragment containing the coding region of the PreS1-PreS2 ~ S protein into the pMMT neo plasmid: construction of plasmid pDM1
Edellä osassa A kuvatusti valmistetusta DNA-liuoksesta otettiin 1 yl, ja se sekoitettiin 5 mikrolitraan edellä osassa B kuvattua, 2,78 kiloemäsparin suuruista Bglll-kappaletta (0,25 yg/yl).1 ul of the DNA solution prepared as described in Part A above was taken and mixed with 5 microliters of 2.78 kilobase pair BglII (0.25 ug / ul) as described in Part B above.
Seos alistettiin ligaatioreaktioon yhteensä 10 mikrolit-rassa reaktiopuskuria, joka sisältää 0,9 yksikköä T4 DNA-ligaasia, 15 °C:n lämpötilassa 1 tunnin ajan, ja 4 °C:n lämpötilassa yön yli.The mixture was subjected to a ligation reaction in a total of 10 microliters of reaction buffer containing 0.9 units of T4 DNA ligase at 15 ° C for 1 hour and at 4 ° C overnight.
77 9572677 95726
Bakteerisoluja, mieluiten HB101-soluja käsiteltiin siten, että ne kykenivät ottamaan vastaan DNA:ta transformaatio-reaktiossa, joka toteutetaan osassa Materiaalit ja menetelmät kuvatun menetelmän mukaisesti. Ligaatioseos käsitti 10 mM Tris, pH 7,5 1 mM EDTA, kokonaistilavuuden ollessa 70 yl, ja se lisättiin 200 mikrolitraan kykeneväksi tehtyjen bakteerisolujen suspensiota DNA:n siirtämiseksi soluihin .Bacterial cells, preferably HB101 cells, were treated to be able to receive DNA in a transformation reaction carried out according to the method described in Materials and Methods. The ligation mixture comprised 10 mM Tris, pH 7.5 1 mM EDTA, with a total volume of 70 μl, and was added to 200 microliters of a suspension of bacterial cells capable of transferring DNA into the cells.
Seosta inkuboitiin jäissä 30 minuuttia, sitten siihen lisättiin 1 ml L-alustaa, ja seosta inkuboitiin 42 °C:n lämpötilassa 2 minuuttia ja 37 °C:n lämpötilassa 40 minuuttia. Inkuboinnin jälkeen solut levitettiin LB-agarmaljoille, jotka sisälsivät 50 yg ampisilliinia/ml siten, että kullekin maljalle saatiin 50-300 yl solususpensiota. Agarmaljoja inkuboitiin 37 °C:n lämpötilassa yön yli. Tämän inkubointi-jakson jälkeen yksittäiset eristetyt bakteeripesäkkeet seulottiin toivotun, 2,78 kiloemäsparin suuruisen, Bglll-entsyymillä saadun DNA-kappaleen muodostaman istutteen sisältävän bakteeriplasmidin pMMT-neo läsnäolon suhteen (katso kuva 3).The mixture was incubated on ice for 30 minutes, then 1 ml of L-medium was added thereto, and the mixture was incubated at 42 ° C for 2 minutes and at 37 ° C for 40 minutes. After incubation, cells were plated on LB agar plates containing 50 μg ampicillin / ml to give 50-300 μl of cell suspension per plate. The agar plates were incubated at 37 ° C overnight. After this incubation period, individual isolated colonies were screened for the presence of the desired bacterial plasmid pMMT-neo containing a 2.78 kilobase pair BglII-derived insert (see Figure 3).
Seulonta toteutetaan mieluiten pesäkehybridisaatioon perustuvalla menetelmällä. Tätä tarkoitusta varten yksittäiset pesäkkeet nostettiin hammastikulla, ja ne siirrettiin ampisilliinia sisältävälle LB-agarmaljalle ristikon muotoon, joka mahdollistaa kloonien tunnistamisen. Maljaa inkuboitiin yli yön 37 °C:n lämpötilassa.Screening is preferably performed by a method based on colony hybridization. For this purpose, individual colonies were raised with a toothpick and transferred to an ampicillin-containing LB agar plate in the shape of a lattice that allows clones to be identified. The plate was incubated overnight at 37 ° C.
Pesäkkeet siirrettiin nitroselluloosasuodattimelle laittamalla suodatin agarpinnan päälle, ja pitämällä sitä agarin pinnalla niin kauan, kunnes se oli märkä. Suodatin poistettiin varovaisesti agarin pinnalta, jonka jälkeen toteutettiin peräkkäinen siirtäminen Whatman 3M-paperin kolmeen kerrokseen, joista kukin oli kasteltu liuoksella, joka käsitti joko 0,5 M NaOH, tai 1 M Tris, pH 7,0, 1,5 M NaCl/ 0,5 M Tris, pH 7,4, tai 2 x SSC. Suodattimet laitettiin vs 95726 pesäkepuoli ylöspäin kasteltujen papereiden päälle solujen hajottamisen ja tämän jälkeen toteutettavien neutralointi-ja kiinnitystoimenpiteiden ajaksi.The colonies were transferred to a nitrocellulose filter by placing the filter on the agar surface and keeping it on the agar surface until it was wet. The filter was carefully removed from the agar surface, followed by sequential transfer to three layers of Whatman 3M paper, each soaked in a solution comprising either 0.5 M NaOH or 1 M Tris, pH 7.0, 1.5 M NaCl / O , 5 M Tris, pH 7.4, or 2 x SSC. Filters were placed vs 95726 colony side up on wetted papers for cell lysis and subsequent neutralization and fixation procedures.
Sen jälkeen, kun suodattimet oli kuivattu ilmassa, niitä kuumennettiin vakuumissa 80 °C:n lämpötilassa. Tämän jälkeen nitroselluloosasuodattimilla toteutettiin DNA-hybridi-saatio käyttäen edellä osassa B kuvatulla tavalla valmistetun PreS^-PreS2~S-proteiinin koodaavan alueen sisältävästä, 2,78 kiloemäsparin suuruisesta Bglll-kappaleesta saatua, radioaktiivisesti merkittyä DNA-koetinta sekä luentaa avoimen fosfodiesterisillan (nick) kohdalta (katso Materiaalit ja menetelmät).After air drying, the filters were heated in vacuo at 80 ° C. The nitrocellulose filters were then subjected to DNA hybridization using a radiolabeled DNA probe obtained from a 2.78 kilobase BglII fragment containing the coding region of the PreS1-PreS2 ~ S protein prepared as described in Part B above and reading an open phosphodiester bridge. (see Materials and Methods).
Nitroselluloosasuodatinta inkuboitiin esihybridisaatioseok- sessa, joka sisältää 50 % formamidia, 20 mM natriumfosfaatti- puskuria, pH 6,6; 1 x Denhardt:in liuosta; 100 yg/ml denatu- 7 3 2 roitua lohen sperman DNA:ta sekä 1x10 cpm P-merkittyä DNA:ta, joka oli sulatettu 0,2 N NaOH-liuokseen, 68 °C:n lämpötilassa 10 minuuttia.The nitrocellulose filter was incubated in a prehybridization mixture containing 50% formamide, 20 mM sodium phosphate buffer, pH 6.6; 1 x Denhardt's solution; 100 μg / ml denatured salmon sperm DNA and 1x10 cpm P-labeled DNA thawed in 0.2 N NaOH at 68 ° C for 10 minutes.
Tätä suodatinta inkuboitiin tässä seoksessa 16 tuntia 45 °C:n lämpötilassa. Tämän jälkeen suodatinta pestiin kahdesti liuoksessa, joka käsitti 2 x SSC, 0,1 % SDS, kummallakin kerralla huoneen lämpötilassa 5 minuutin ajan, ja kahdesti liuoksessa, joka käsitti 0,1 x SSC, 0,1 % SDS, 15 minuuttia, kummallakin kerralla .50 °C:n lämpötilassa. Suodatti-milla valotettiin kahden varjostimen välissä röntgensä-defilmiä (mieluiten 3M) -80 °C:n lämpötilassa kahden vuorokauden ajan.This filter was incubated in this mixture for 16 hours at 45 ° C. The filter was then washed twice in a solution comprising 2 x SSC, 0.1% SDS, each time at room temperature for 5 minutes, and twice in a solution comprising 0.1 x SSC, 0.1% SDS, for 15 minutes, each time .50 ° C. The filters were exposed to X-ray film (preferably 3M) between the two shades at -80 ° C for two days.
Kloonatun 2,78 kiloemäsparin suuruisen Bglll-kappaleen käsittävän yhdistelmäplasmidin sisältävät pesäkkeet nähtiin mustina pisteinä. 50 pesäkkeestä tunnistettiin neljä, ja näiden pesäkkeiden plasmidi-DNA eristettiin minipreparaat-teina menetelmällä, joka esitetään julkaisussa Birnboim ja Doly, Nucl. Acids Res., Voi. 7, sivu 1513, 1979, ja se n 79 95726 analysoitiin pilkkomalla kaksinkertaisesti restriktio-endonukleaaseilla Bglll ja Xbal. Analyysit vahvistivat edellä kuvatun, odotetun rakenteen (katso kuva 3).Colonies containing a recombinant plasmid containing a cloned 2.78 kilobase pair BglII fragment were seen as black dots. Four of the 50 colonies were identified, and plasmid DNA from these colonies was isolated as minipreps by the method described in Birnboim and Doly, Nucl. Acids Res., Vol. 7, page 1513, 1979, and its n 79 95726 was analyzed by double digestion with restriction endonucleases BglII and XbaI. The analyzes confirmed the expected structure described above (see Figure 3).
D. PreS^-PreS2~S-proteiinin koodaavien alueiden luonnollisen promoottorin korvaaminen metallotioneiinipromootto-rilla: plasmidin pDM2 muodostaminenD. Replacement of the natural promoter of the coding regions of the PreS1-PreS2 ~ S protein with the metallothionein promoter: construction of plasmid pDM2
Edellä kuvattu plasmidi pDM1 pilkottiin täydellisesti restrik-tioentsyymeillä Bglll ja BamHI reaktiopuskurissa, jonka kokonaistilavuus oli 100 yl, ja joka sisälsi 20 yg plasmidi-DNA:ta ja ensin 50 yksikköä entsyymiä Bglll, reaktiopuskurin käsittäessä 6,7 mM Tris, pH 7,8; 6,7 mM MgCl2/‘ 6,7 mMPlasmid pDM1 described above was completely digested with restriction enzymes BglII and BamHI in a reaction volume of 100 ul containing 20 ug of plasmid DNA and first 50 units of enzyme BglII, the reaction buffer comprising 6.7 mM Tris, pH 7.8; 6.7 mM MgCl 2 / 6.7 mM
8-merkaptoetanolia, 37 °C;n lämpötilassa 4 tunnin ajan; tämän jälkeen suolapitoisuus nostettiin arvoon 150 mM NaCl, ja pilkkominen suoritettiin loppuun lisäämällä 40 yksikköä entsyymiä BamHI, ja seosta inkuboitiin 37 °C:n lämpötilassa yön yli. Tällöin saatiin kolme kappaletta, suurimman kappaleen ollessa kooltaan 5,1 kb, seuraavan kappaleen 2,97 kb, ja pienimmän kappaleen ollessa kooltaan 1,4 kb. Nämä kappaleet erotettiin preparatiivisella elektroforeesilla käyttäen 0,7 % agaroosigeeliä, josta kappaleet (5,1 kb ja 1,4 kb) eristettiin elektroforeettisesti käyttäen ioninvaihtosuodatinta Whatman DE 81.8-mercaptoethanol, at 37 ° C for 4 hours; the salt concentration was then raised to 150 mM NaCl, and digestion was completed by the addition of 40 units of BamHI, and the mixture was incubated at 37 ° C overnight. Three pieces were obtained, the largest piece being 5.1 kb, the next piece being 2.97 kb, and the smallest piece being 1.4 kb. These fragments were separated by preparative electrophoresis using a 0.7% agarose gel, from which the fragments (5.1 kb and 1.4 kb) were isolated electrophoretically using an Whatman DE 81 ion exchange filter.
DNA poistettiin tältä suodattimelta inkuboimalla sitä runsaasti suolaa sisältävässä puskurissa 4 tuntia 4 °C:n lämpötilassa, ja DNA puhdistettiin uuttamalla fenolin ja kloroformin seoksella ja saostamalla kahdesti etanolilla. DNA suspendoitiin uudestaan 20 mikrolitraan 10 mM Tris-puskuria, pH 7,8. Yhdestä mikrolitrasta määritettiin puhtaus ja siitä arvioitiin DNA-määrä elektroforeettisesti agaroosigee-liä käyttäen.DNA was removed from this filter by incubation in high salt buffer for 4 hours at 4 ° C, and the DNA was purified by extraction with a mixture of phenol and chloroform and precipitation twice with ethanol. The DNA was resuspended in 20 microliters of 10 mM Tris buffer, pH 7.8. Purity was determined for one microliter and the amount of DNA was evaluated electrophoretically using an agarose gel.
Suuri (5,1 kb) kappale, joka sisälsi metallotioneiinipro-moottorin Bglll-päässä, ligatoitiin PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen sisältävään pieneen kappaleeseen (1,4 kb), so 95726 joka ei kuitenkaan sisältänyt tämän geenin luonnollista promoottoria tai PreS^-osaa. Suuri kappale sisälsi samoin luonnollisen päättämis-polyadenylaatiosignaalin (hb-PAS-t), joka on välttämätön hepatitis B-viruksen PreS2~S-pro-teiinin koodaavan alueen ilmentämiseksi (katso myös kuva 4) .A large (5.1 kb) fragment containing a metallothionein promoter at the BglII end was ligated to a small fragment (1.4 kb) containing the coding region of the PreS2-S protein, i.e. 95726, which did not, however, contain the natural promoter of this gene or the PreS2-S protein. parts. The large body also contained the natural termination polyadenylation signal (hb-PASs) necessary to express the coding region of the hepatitis B virus PreS2-S protein (see also Figure 4).
Roska suuri kappale sisältää myös bakteeriplasmidin, niin on mahdollista, että tämä kappale ligatoituu itseensä automaattisesti ilman, että pienikokoinen BamHI-kappale sisältyy ligaatio-tuotteeseen. Tästä syystä suuren kappaleen preparaatista, jota oli yhteensä 20 y1, otettiin 10 yl, ja se käsiteltiin alkalisella fosfataasilla lisäämällä tätä entsyymiä 28 yksikköä ja inkuboimalla 37 °C:n lämpötilassa 20 minuuttia. Reaktio pysäytettiin lisäämällä 1 yl 50 mM EGTA, ja inkuboimalla 68 °C:n lämpötilassa 10 minuuttia. DNA puhdistettiin saostamalla kahdesti etanolilla 0,8 M LiCl-liuoksessa.The large fragment of debris also contains a bacterial plasmid, so it is possible that this fragment will automatically ligate to itself without the compact BamHI fragment being included in the ligation product. Therefore, a large aliquot of the preparation totaling 20 μl was taken from 10 μl and treated with alkaline phosphatase by adding 28 units of this enzyme and incubating at 37 ° C for 20 minutes. The reaction was stopped by the addition of 1 μl of 50 mM EGTA, and incubated at 68 ° C for 10 minutes. DNA was purified by precipitation twice with ethanol in 0.8 M LiCl solution.
DNA-kasauma suspendoitiin uudestaan 10 mikrolitraan 10 mM Tris-puskuria, pH 7,8, ja tästä puskurista otettiin 5 yl vertailunäytteeksi, josta määritettiin ligatoiturainen itseensä, ja toinen 5 mikrolitraa sekoitettiin 5 mikrolitraan elektroeluoitua pientä (1,4 kb) BamHI-kappaletta.The DNA pellet was resuspended in 10 microliters of 10 mM Tris buffer, pH 7.8, and 5 ul of this buffer was taken as a control to determine the ligated self, and another 5 microliters was mixed with 5 microliters of electroeluted small (1.4 kb) BamHI.
Kummankin näytteen ligatoiminen toteutettiin 20 mikrolitran kokonaistilavuudessa, kuten edellä esitettiin. Transfor-mointi HB101-bakteereihin toteutettiin edellä kuvatusti.Ligation of both samples was performed in a total volume of 20 microliters as described above. Transformation into HB101 bacteria was performed as described above.
Kaksitoista erillistä pesäkettä otettiin ja niitä kasvatettiin 2 millilitran viljelmissä, ja plasmidi-DNA eristettiin tutkijoiden Birnboim ja Doly, mainittu edellä, mukaisesti. Plasmidi-DNA:sta määritettiin pienikokoisen BamHI-kappaleen liittyminen ja suuntautuminen pilkkomalla kaksinkertaisesti restriktioentsyymeillä EcoRI ja Xbal.Twelve separate colonies were taken and grown in 2 ml cultures, and plasmid DNA was isolated according to Birnboim and Doly, cited above. Plasmid DNA was assayed for the incorporation and orientation of a small BamHI fragment by double digestion with the restriction enzymes EcoRI and XbaI.
Näistä 12 plasmidi-DNA:sta kahdessa tämä pieni (1,4 kb) BamHI-kappale on saatu istutetuksi samalla tavalla suuntautuneena kuin metallotioneiinipromoottori.In two of these 12 plasmid DNAs, this small (1.4 kb) BamHI fragment has been inserted in the same orientation as the metallothionein promoter.
li ei 95726 Nämä plasmidi-DNA:t kasvatetaan massaviljelmässä, ja esi-käsitellään eukarioottisiin soluihin siirtämistä varten, joka siirtäminen toteutetaan yhteistransfektiolla.li no 95726 These plasmid DNAs are grown in mass culture and pretreated for transfer into eukaryotic cells by co-transfection.
Vaihtoehtoisesti, metallotioneiinipromoottorin käsittävästä plasmidista pMMT-neo saadulla EcoRI/Bglll-kappaleella (1,9 kb) korvataan plasmidissa pD?11 PreS2~S-proteiinin koo-daavan alueen edessä sijaitseva lyhyt (32 emäsparin) EcoRI-BamHI-kappale, jolloin saadaan plasmidi pDM3, kuten kuvassa 5 esitetään.Alternatively, the EcoRI / BglII fragment (1.9 kb) obtained from the plasmid comprising the metallothionein promoter pMMT-neo (1.9 kb) replaces the short (32 bp) EcoRI-BamHI fragment in front of the coding region of the pD? 11 PreS2-S protein to give plasmid pDM3, as shown in Figure 5.
E. Kohdissa C ja D saatujen yhdistelmä-DNA-vektoreiden vieminen nisäkässoluihin ja tämän keksinnön mukaisia partikkeleita tuottavien solulinjojen muodostaminenE. Introduction of Recombinant DNA Vectors Obtained in C and D into Mammalian Cells and Generation of Particle-Producing Cell Lines of the Invention
Yhdistelmäplasmidit pDM1 ja pDM2 transfektoitiin yhdessä hiiren L-soluihin, vero-soluihin (afrikkalainen marakatti), CHO-soluihin ja hiiren 3T3-fibroblasteihin käyttäen tavanomaisia transfektointimenetelmiä (Graham ja van der Eb, Virology, Voi. 52, sivu 456, 1973, edellä) (katso Materiaalit ja menetelmät). Solut, jotka ottavat vastaan plasmidi-DNA: ta ja joissa plasmidi-DNA säilyy, ovat vastustuskykyisiä lääkeaineelle G418, ja ne säilyvät hengissä tätä lääkeainetta sisältävällä selektiivisellä alustalla. Ne solut, jotka eivät ota vastaan DNA:ta, eivät pysy hengissä selektiivisellä alustalla. Nämä solut todetaan erillisinä klooneina viljelymaljän pinnalla. Solut otettiin talteen kloo-naussylinterillä ja niitä kasvatettiin massaviljelmää varten tavanomaiseen tapaan käyttäen tavallista ravintoalustaa, kuten Dulbeccon muunnettua Eagle-alustaa, johon on lisätty täydennykseksi 10 % vasikan seerumia ja 500 yg lääkeainetta G418/ml (katso Materiaalit ja menetelmät). Viidestä saadusta kloonista muodostettiin solulinja, joista käytettiin nimityksiä ENDO-I, -II, -III, -IV ja -v,ja niistä valmistettiin pakastetut varastolinjat (katso Materiaalit ja *. menetelmät). Näiden solulinjojen tuotantonopeus staatti sessa viljelmässä määritettiin radioimmuunikokeella (RIA? 82 95726 katso Materiaalit ja menetelmät) ja sitä verrattiin tunnettujen solulinjojen tuotantonopeuteen. Tämän keksinnön mukaiset solulinjat tuottavat keskimäärin 500 - 1000 ng tämän keksinnön mukaista partikkelia millilitraan viljely-alustaa vuorokaudessa.The recombinant plasmids pDM1 and pDM2 were co-transfected into mouse L cells, vero cells (African maracella), CHO cells, and mouse 3T3 fibroblasts using standard transfection methods (Graham and van der Eb, Virology, Vol. 52, page 456, 1973, supra). (see Materials and Methods). Cells that receive plasmid DNA and retain plasmid DNA are resistant to G418 and survive on a selective medium containing this drug. Those cells that do not accept DNA do not survive on a selective medium. These cells are detected as separate clones on the surface of the culture dish. Cells were harvested on a cloning cylinder and grown for mass culture in a conventional manner using a standard medium such as Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 10% calf serum and 500 ug G418 / ml (see Materials and Methods). From the five clones obtained, a cell line designated ENDO-I, -II, -III, -IV and -v was generated and prepared into frozen storage lines (see Materials and * Methods). The production rate of these cell lines in static culture was determined by radioimmunoassay (RIA? 82 95726 see Materials and Methods) and compared to the production rate of known cell lines. The cell lines of this invention produce an average of 500 to 1000 ng of particles of this invention per milliliter of culture medium per day.
F. Tämän keksinnön mukaisia partikkeleita tuottavien solu-linjojen viljeleminen Acusyst-P-laitteessaF. Culturing the particle-producing cell lines of this invention in an Acusyst-P instrument
Kuudessa pyöritettävässä pullossa DMEM + 10 % FBS-alustassa kasvatettua (katso Materiaalit ja menetelmät), yhteensä q noin 10 solua siirrostettiin kuuteen onttokuituhylsyyn Acusyst-P-viljelyjärjestelmässä (katso Materiaalit ja menetelmät) . Nestettä otettiin talteen noin 600 ml kahdesti viikossa Acusyst-P-järjestelmän kunkin onttokuituhylsyn kapillaarin ulkopuolisesta tilasta, ja säilytettiin 4 °C:n lämpötilassa ennen puhdistamista. Tämän keksinnön mukaisten partikkeleiden pitoisuus määritettiin RIA-menetelmällä (katso Materiaalit ja menetelmät).In six rotatable flasks grown in DMEM + 10% FBS medium (see Materials and Methods), a total of about 10 cells were seeded in six hollow fiber cores in an Acusyst-P culture system (see Materials and Methods). Approximately 600 ml of fluid was collected twice a week from the extrapillary space of each hollow fiber core of the Acusyst-P system, and stored at 4 ° C prior to purification. The concentration of the particles of this invention was determined by the RIA method (see Materials and Methods).
G. Tämän keksinnön mukaisten partikkeleiden puhdistaminen Acusyst-P-järjestelmässä käytetystä viljelyalustasta Näiden uusien solulinjojen tuottamat partikkelit, jotka sisältävät PreS^-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen koodaamia proteiineja, puhdistettiin polyetyleeniglykolilla (PEG) saostamalla, geelisuodattamalla ja isopyknisellä ultrasentrifugoinnilla CsCl-gradienteissä (katso jäljempänä esitetty).G. Purification of Particles of the Invention from the Culture Medium-P System The particles produced by these new cell lines containing the proteins encoded by the PreS1-PreS2-S protein coding region were purified by polyethylene glycol (PEG) precipitation, gel filtration, ultrafiltration, and isopyknation. see below).
1. Fraktiosaostaminen polyetyleeniglykolilla (PEG)1. Fraction precipitation with polyethylene glycol (PEG)
Kapillaarien ulkopuolisessa tilassa oleva alusta otettiin talteen ACUSYST-P-viljelyjärjestelmästä ja yhdistettiin 3000 millilitran suuruiseksi määriksi. Kuhunkin 3000 milli-litran määrään lisättiin 180 g tuotetta PEG 8000 (SIGMA), ja se liuotettiin sekoittamalla huoneen lämpötilassa 20 minuuttia, ja sekoittamista jatkettiin edelleen 3 tuntia li 83 9 5 7 2 6 4 °C:n lämpötilassa. Saostuma otettiin talteen sentrifu-goimalla 500 millilitran pulloissa, GS 3-roottorissa, nopeudella 4500 rpm (3000 x g) 30 minuuttia 10 °C:n lämpötilassa. Supernatantti otettiin talteen, ja siihen lisättiin jälleen 180 g tuotetta PEG 8000, ja liuotettiin huoneen lämpötilassa edellä kuvatusti. Liuosta sekoitettiin edelleen 4 °C:n lämpötilassa 3 tuntia. Saostuma otettiin talteen tästä liuoksesta edellä esitetysti, paitsi että sentrifugointi toteutettiin nopeudella 9000 rpm (15 000 x g) 60 minuuttia. Kasauma suspendoitiin uudestaan 20 milli-litraan fosfaatilla puskuroitua suolaliuosta (PBS).The medium outside the capillaries was recovered from the ACUSYST-P culture system and pooled in 3000 ml volumes. To each 3,000 milliliter volume was added 180 g of PEG 8000 (SIGMA), and it was dissolved by stirring at room temperature for 20 minutes, and stirring was continued for a further 3 hours at 83 ° C. The precipitate was collected by centrifugation in 500 ml flasks, GS 3 rotor, at 4500 rpm (3000 x g) for 30 minutes at 10 ° C. The supernatant was collected, and 180 g of PEG 8000 was added again, and dissolved at room temperature as described above. The solution was further stirred at 4 ° C for 3 hours. The precipitate was recovered from this solution as described above, except that centrifugation was performed at 9,000 rpm (15,000 x g) for 60 minutes. The pellet was resuspended in 20 milliliters of phosphate buffered saline (PBS).
2. Geelisuodatukseen perustuva kromatografia PEG-saostamisen jälkeen saatu, PBS-puskuriin uudestaan liuotettu materiaali käsiteltiin kromatografisesti geelisuo-dattamalla, käyttäen BioRad A-5m -hartsia, 4 °C:n lämpötilassa. Kolonnin ulottuvuudet olivat 25 x 1000 mm, ja petin tilavuus oli 480 ml. Jaettaessa materiaali tyypillisellä tavalla fraktioihin 1000 yg tämän keksinnön mukaisia PEG-saostettuja partikkeleita 10-15 millilitran tilavuudessa laitetaan kolonniin ja eluoidaan PBS- tai TNE-liuoksella nopeudella 6 pisaraa minuutissa (18 ml/h), ja eluaatista kerätään 3 millilitran fraktioita. Kuvassa 6 nähdään A-5m-kolonnista eluoituneiden, tämän keksinnön mukaisten partik-keleiden profiili, yhtenäinen viiva tarkoittaa kunkin fraktion absorbanssia aallonpituudella 280 nm, ja pisteillä merkitään tämän keksinnön mukaisten partikkeleiden määrää kussakin fraktiossa, RIA-määrityksen perusteella laskettuna.2. Gel Filtration Chromatography The material redissolved in PBS buffer after PEG precipitation was chromatographed by gel filtration using BioRad A-5m resin at 4 ° C. The dimensions of the column were 25 x 1000 mm and the volume of the bed was 480 ml. When the material is typically divided into 1000 μg PEG-precipitated particles of this invention in a volume of 10-15 ml, the column is applied and eluted with PBS or TNE at a rate of 6 drops per minute (18 ml / h), and 3 ml fractions are collected from the eluate. Figure 6 shows the profile of the particles of this invention eluted from the A-5m column, the solid line represents the absorbance of each fraction at 280 nm, and the dots indicate the number of particles of this invention in each fraction, calculated from the RIA assay.
3. Isopykninen sentrifugointi CsCl-liuoksessa Geelisuodatuksena toteutetussa pylväskromatografiässä tuloksena olevan ensimmäisen piikin (katso kuva 6) kattavat, noin 30 fraktiota, jotka sisältävät tämän keksinnön mukaisia, osittain puhdistettuja partikkeleita, yhdistettiin (suurin piirtein 100 ml). Tämän liuoksen tiheys saatettiin arvoon 1,30 g/cm yhdisteellä CsCl, jonka jälkeen se siir- 84 95726 rettiin nitroselluloosaputkiin, jotka sopivat SW 27- tai SW 28-roottoriin (Beckman). Gradientit saatiin aikaan laittamalla putken pohjalle 4 ml CsCl-liuosta, jonka tiheys 3 on 1,35 g/cm , ja pinnalle 4 ml CsCl-liuosta, jonka tiheys 3 on 1,25 g/cm sekä 4 ml liuosta, jonka tiheys on 1,20 3 g/cm . Gradientteja sentrifugoitiin nopeudella 28 000 rpm 50 tuntia 10 °C:n lämpötilassa, jaettiin fraktioihin ja puhdistunut antigeeni saatiin talteen tiheydeltään 1,20 g/cm olevasta kerroksesta, gradientin pinnalta. Tämän keksinnön mukaiset partikkelit erottuivat hyvin pienestä määrästä kontaminoivia proteiineja, jotka muodostivat vyöhykkeen gradientin keskelle (katso kuva 7). Liuoksesta poistettiin suolat dialysoimalla 24 tunnin ajan kolmea suolaliuoserää vastaan.3. Isopycnic Centrifugation in CsCl Solution Gel filtration column chromatography covering the first peak (see Figure 6) containing about 30 fractions containing the partially purified particles of this invention was pooled (approximately 100 ml). The density of this solution was adjusted to 1.30 g / cm 2 with CsCl, after which it was transferred to 84,95726 nitrocellulose tubes suitable for a SW 27 or SW 28 rotor (Beckman). Gradients were obtained by placing 4 ml of a 1.35 g / cm 3 CsCl solution at the bottom of the tube and 4 ml of a 1.25 g / cm 3 density CsCl solution at the bottom of the tube and 4 ml of a 1 density 1 solution. .20 3 g / cm. The gradients were centrifuged at 28,000 rpm for 50 hours at 10 ° C, divided into fractions, and the purified antigen was recovered from a layer with a density of 1.20 g / cm, from the surface of the gradient. The particles of this invention were separated from a very small amount of contaminating proteins that formed a zone in the middle of the gradient (see Figure 7). The solution was desalted by dialysis for 24 hours against three batches of saline.
Laadun varmistamiseksi osa tästä gradientin avulla puhdistetusta materiaalista sentrifugoitiin lineaarista CsCl-gra-dienttia käyttäen. Tällöin odotusten mukaisesti tämän keksinnön mukaiset partikkelit muodostivat yhden piikin tiheyteen 1,2 g/cm^.To ensure quality, a portion of this gradient-purified material was centrifuged using a linear CsCl gradient. Then, as expected, the particles of this invention formed a single peak at a density of 1.2 g / cm 2.
H. Solulinjojen tuottamien, tämän keksinnön mukaisten partikkeleiden tunnusomaiset piirteet Tämän keksinnön mukaisten partikkeleiden sisältämien polypeptidien puhtaus ja fysikaaliset ominaisuudet eri preparaateissa määritetään tavanomaisilla laboratorio-menetelmillä, kuten radioimmuunikokeella, immuunisaostuksella ja SDS-PAGE-määrityksellä (katso Materiaalit ja menetelmät).H. Characteristics of Particles of the Invention Produced by Cell Lines The purity and physical properties of the polypeptides contained in the particles of this invention in various preparations are determined by standard laboratory methods such as radioimmunoassay, immunoprecipitation, and SDS-PAGE (see Materials and Methods).
I. Puhtauden määrittäminen a. Kontaminoivien plasmaproteiinien pitoisuuden määrittäminenI. Determination of Purity a. Determination of Contaminating Plasma Protein
Eri seerumiproteiinien pitoisuudet tämän keksinnön mukaisten puhdistettujen partikkeleiden preparaateissa määritetään tavallisella RIA-tekniikalla käyttäen spesifisiä vasta- I! 85 95726 aineita naudan seerumin albumiinia, IgArta, IgG:tä, IgM:ää jne vastaan. Taulukossa 2 esitetyistä tuloksista nähdään, ettei immunoglobuliineilla kontaminoitumista voitu todeta, ja albumiinilla kontaminoituminen oli vain vähäistä.The concentrations of the various serum proteins in the preparations of the purified particles of this invention are determined by standard RIA techniques using specific antibodies. 85 95726 agents against bovine serum albumin, IgArta, IgG, IgM, etc. From the results shown in Table 2, it can be seen that no contamination with immunoglobulins could be detected and the contamination with albumin was only minor.
Taulukko 2Table 2
Kontaminoivien plasmaproteiinien määrittäminen RIA-menetelmälläDetermination of contaminating plasma proteins by RIA
Proteiini %-osuus kaikista proteiineistaProtein% of total proteins
Albumiini 0,05Albumin 0.05
IgG 0,2IgG 0.2
IgA 0,2IgA 0.2
IgM 0,2 b. Kontaminoivien isäntäsoluista peräisin olevien tai PreS^-PreS2~S-nukleiinihappojetjujen pitoisuuksien määrittäminen tämän keksinnön mukaisten partikkeleiden puhdistetuista preparaateista piste-täplä -menetelmällä Tämän keksinnön mukaisilla puhdistetuilla partikkeleilla toteutetaan piste-täplä -hybridisaatio (dot-blot) kontaminoivien PreS-j-PreS2-S -DNA-ketjujen tai isännän kromoso-maalisten DNA-ketjujen ilmaisemiseksi. Kutakin läiskää varten 100 nanogramman suuruista määrää keksinnön mukaisia puhdistettuja partikkeleita kuumennettiin 68 °C:n lämpötilassa 10 minuuttia 40 mikrolitrassa 0,25 N NaOH-liuos-ta. Positiivisena vertailuna 20 pg tämän keksinnön mukaisen yhdistelmäplasmidin pDM1 DNA:ta 40 mikrolitrassa 0,25 N • NaOH-liuosta käsitellään samalla tavalla. VälittömästiIgM 0.2 b. Determination of Concentrations of Contaminating Host Cell-derived or PreS1-PreS2-S Nucleic Acid Chains from Purified Preparations of Particles of the Invention by the Spot-Point Method The purified particles of this invention are subjected to dot-spot hybridization (dot-hybridization). -j-PreS2-S DNA strands or host chromosomal DNA strands. For each spot, an amount of 100 nanograms of the purified particles of the invention was heated at 68 ° C for 10 minutes in 40 microliters of 0.25 N NaOH solution. As a positive control, 20 pg of pDM1 DNA of the recombinant plasmid of this invention in 40 microliters of 0.25 N • NaOH solution is treated in the same manner. Direct
NaOH-liuoksessa denaturoinnin jälkeen liuos täplitetään nitroselluloosasuodattimelle. Seuraavassa esitetty suodattimien käsitteleminen ja hybridisaatiotoimenpiteet ovat analogiset Southernin täplitysmenetelmässä käytettävien 32 toimenpiteiden kanssa, paitsi että P-merkitty koetin ·* on tämän keksinnön mukaisen kromosomaalisen DNA:n ja plas- midi-DNA:n 50:50 seos, tämän plasmidi-DNA:n sisältäessä 86 95726After denaturation in NaOH solution, the solution is spotted onto a nitrocellulose filter. The following filter handling and hybridization procedures are analogous to the 32 procedures used in the Southern spotting method, except that the P-labeled probe · * is a 50:50 mixture of chromosomal DNA and plasmid DNA of this invention, this plasmid DNA including 86 95726
PreS^-PreS2-S -proteiinin koodaavan alueen. Odotusten mukaisesti hybridisoiva koetin tuottaa voimakkaan signaalin tämän keksinnön mukaisen yhdistelmäplasmidin DNA:n kanssa, mutta ainoastaan heikon taustasignaalin puhdistetun par-tikkelipreparaatin kanssa. Tämä hybridisaatiokuvio osoittaa, ettei näytteessä ole läsnä PreS1-PreS2~S-DNA:ta tai kromo-somaalista DNA:ta.The coding region of the PreS1-PreS2-S protein. As expected, the hybridizing probe produces a strong signal with the DNA of the recombinant plasmid of this invention, but only with a weak background signal with the purified particle preparation. This hybridization pattern indicates the absence of PreS1-PreS2-S DNA or chromosomal DNA in the sample.
2. Immunosaostaminen ja SDS-polyakryyliamidigeelillä toteutettu analyysi Tämän keksinnön mukaisten transfektanttien tuottamien PreS-j -PreS2~S-polypeptidien osuuksien määrittämiseksi näiden transfektanttien tuottamat proteiinit merkitään biosynteet-tisesti, immunosaostetaan ja analysoidaan SDS-PAGE-geeleil-lä (katso Materiaalit ja menetelmät). Luonnollisesta lähteestä saatua HBV-virusta vastaan vaikuttavilla vasta-aineilla viljelyalustasta immunosaostamalla eristettyjen proteiinien elektroforeettinen kuvio tehtiin näkyväksi hopealla värjäämällä. Kaksi pääasiallista proteiinia vastaa kooltaan S-proteiinin koodaavan alueen koodaamaa glykosyloimatonta ja glykosyloitunutta polypeptidiä (24 kd ja 27 kd, vastaavasti). Kaksi vähäisempää proteiinia, 33 kd ja 36 kd, vastaa kooltaan PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen koodaamaa kahta polypeptidiä. Tämä menetelmä ei ole niin herkkä, että sillä voitaisiin ilmaista PreS^-PreS2~S -polypeptidejä sisältävien polypeptidien pieniä määriä, mutta koko PreS^-PreS2~S-proteiinin koodaavan alueen koodaamien proteiinien läsnäolo voitiin ilmaista . Westernin immunotäplämenetelmällä (katso jäljempänä).2. Immunoprecipitation and SDS-Polyacrylamide Gel Analysis To determine the proportions of PreS-j-PreS2-S polypeptides produced by the transfectants of this invention, the proteins produced by these transfectants are biosynthetically labeled, immunoprecipitated, and analyzed on SDS-PAGE gels (see Materials). . The electrophoretic pattern of proteins isolated from the culture medium by immunoprecipitation with antibodies against HBV virus obtained from a natural source was visualized by silver staining. The two major proteins correspond in size to the non-glycosylated and glycosylated polypeptide encoded by the S protein coding region (24 kd and 27 kd, respectively). The two smaller proteins, 33 kd and 36 kd, correspond in size to the two polypeptides encoded by the coding region of the PreS2-S protein. This method is not so sensitive that it could detect small amounts of polypeptides containing PreS1-PreS2-S polypeptides, but the presence of proteins encoded by the entire PreS1-PreS2-S coding region could be detected. By Western immunoblotting (see below).
Heikot vyöhykkeet geelin huipulla johtuvat kasautuneesta proteiinista, ja ne ovat nähtävissä myös luonnollisista lähteistä saatujen HBV-partikkeleiden tapauksessa. Näin ollen, PreS^-PreS2-S-proteiinin koodaavalla alueella trans-fektoidut solut erittävät proteiineja, jotka eivät ainoas-,.· taan reagoi luonnollista tuotetta vastaan vaikuttavien vasta-aineiden kanssa, vaan jotka ovat myös samanlaisia „ 95726 kokonsa suhteen. Sellaisten proteiinien, jotka ovat kooltaan samanlaisia hepatitis B-viruksesta peräisin olevien, luonnollisten, glykosyloituneiden PreS-j -PreS2~S-, PreS2~S-ja S-polypeptidien kanssa, läsnäolon perusteella voidaan olettaa, että glykosylaatioreitit toimivat normaalisti näissä soluissa.The weak bands at the top of the gel are due to the accumulated protein and are also visible in the case of HBV particles obtained from natural sources. Thus, cells transfected in the coding region of the PreS1-PreS2-S protein secrete proteins that not only react with antibodies against the natural product, but are also similar in size to "95726". The presence of proteins similar in size to natural, glycosylated PreS-j-PreS2-S, PreS2-S, and S polypeptides derived from hepatitis B virus suggests that glycosylation pathways function normally in these cells.
3. Immunotäplitys (Western)3. Immunostaining (Western)
Westernin immunotäplitystoimenpiteellä varmistettiin, että kukin hopealla värjätyssä SDS-PAGE -geelijärjestelmässä esiintyvä erilainen polypeptidi reagoi spesifisen anti-HBV-vasta-aineen kanssa. SDS-PAGE -geelillä erottuneet proteiinit siirrettiin nitroselluloosasuodattimelle (Schleicher & Schull) sähkötäplityksellä (BioRad) 4 °C:n lämpötilassa,Western immunoblotting confirmed that each different polypeptide present in the silver-stained SDS-PAGE gel system reacted with a specific anti-HBV antibody. Proteins separated by SDS-PAGE gel were transferred to a nitrocellulose filter (Schleicher & Schull) by electroplating (BioRad) at 4 ° C,
100 V, 3 tunnin ajan. Siirtämisen jälkeen suodatin kyllästetään proteiineilla peroksidaasilla merkityn vasta-aineen epäspesifisen sitoutumisen välttämiseksi. Tätä varten suodatinta inkuboidaan 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa PBS-liuoksessa, joka käsittää 20 % vastasyntyneen vasikan seerumia, ja keksinnön mukaisten partikkeleiden käsittämät polypeptidit tehtiin näkyviksi peroksidaasiin konjugoiduilla HBV-spesifisillä vasta-aineilla. Suodatin laitetaan para-filmin päälle ja peitetään konjugoitujen vasta-aineiden liuoksella 3 tunniksi huoneen lämpötilassa kosteassa kammiossa. Suodatin pestään kuuteen kertaan liuoksella, joka käsittää 0,5 % Tween, 10 mM Tris ja 5 mM CaCl, jonka jälkeen se peitetään kromogeenillä, POD (o-fenyylidiamiini-dihydrokloridi) vetyperoksidissa (0,3 g/1), sitraatti-• fosfaatti-puskurissa. Pysäytysliuoksena käytetään 0,5 N100 V for 3 hours. After transfer, the filter is saturated with proteins to avoid non-specific binding of the peroxidase-labeled antibody. To this end, the filter is incubated for 1 hour at room temperature in a PBS solution comprising 20% neonatal calf serum, and the polypeptides comprised by the particles of the invention were visualized with peroxidase-conjugated HBV-specific antibodies. The filter is placed on top of the para-film and covered with a solution of conjugated antibodies for 3 hours at room temperature in a humid chamber. The filter is washed six times with a solution of 0.5% Tween, 10 mM Tris and 5 mM CaCl, then covered with chromogen, POD (o-phenyldiamine dihydrochloride) in hydrogen peroxide (0.3 g / l), citrate phosphate buffer. 0.5 N is used as the stop solution
rikkihappoa. Kaikkia kuutta virusperäistä polypeptidiä vastaavat proteiinivyöhykkeet saadaan näkyviin, eli läsnä on kaikkia PreS^-PreS2~S-proteiinin koodaavan alueen koodaamia proteiineja.sulfuric acid. The protein bands corresponding to all six viral polypeptides are displayed, i.e., all proteins encoded by the coding region of the PreS1-PreS2 ~ S protein are present.
88 95726 4. Aminohappokoostumus tämän keksinnön mukaisten partikke-leiden käsittämissä puhdistetuissa proteiineissa, joita PreS^-PreS2-S-proteiinin koodaava alue koodaa88 95726 4. Amino acid composition in purified proteins comprised of the particles of this invention encoded by the PreS1-PreS2-S protein coding region
Hapolla hydrolysoimisen jälkeen aminohappokoostumus PreS^-PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen koodaamista puhdistetuissa proteiineissa määritetään ja sitä verrataan poly-peptidikoostumukseen, joka on saatu laskemalla S-proteiinin koodaavan alueen, PreS2~S-proteiinin koodaavan alueen^nuk-leotidiketjusta. Taulukossa 3 esitetyt tulokset vastaavat hyvin DNA-ketjuista ennustettuja arvoja sekä jo julkaistuja tuloksia (Shiraishi et al·., J. Gen. Virol., Voi. 48, sivu 31, 1980). Erityisesti näiden polypeptidien tunnusomaisena piirteenä on seriinin, proliinin ja leusiinin suhteellisen suuret prosenttiset osuudet.After acid hydrolysis, the amino acid composition of the coding region of the PreS2-PreS2-S protein in the purified proteins is determined and compared to the polypeptide composition obtained by calculating the nucleotide chain of the PreS2-S protein coding region, the PreS2-S protein coding region. The results shown in Table 3 correspond well to the predicted values for DNA strands as well as already published results (Shiraishi et al., J. Gen. Virol., Vol. 48, page 31, 1980). In particular, these polypeptides are characterized by relatively high percentages of serine, proline and leucine.
Taulukko 3Table 3
Aminohappokoostumus tämän keksinnön mukaisissa puhdistetuissa partikkeleissa Jäännöksen prosenttinen osuusAmino acid composition in the purified particles of this invention Percentage of residue
OdotettuExpected
Aminohapot* Määritetty S . PreS2~S PreS^-PreS2~SAmino Acids * Determined S. PreS2 ~ S PreS ^ -PreS2 ~ S
ASN + ASP 5,5 4,2 5,2 7,3 THR 7,5 8,0 7,9 7,8 SER 12,5 11,3 12,0 10,8 GLU + GLU 7,5 4,2 4,5 5,1 PRO 12,5 10,8 10,5 12,6 GLY 8,6 6,6 7,1 8,3 ALA 5,0 2,8 4,5 5,4 VAL 4,2 5,2 5,2 4,8 CYS 3,2 6,6 5,2 3,8 MET 1,9 2,3 2,2 1,9 ILE 4,9 7,5 7,5 6,7 LEU 12,8 15,5 13,9 12,1 TYR 2,0 2,8 2,6 1,9 PHE 5,6 7,5 6,0 5,4 LYS 2,1 1,9 1,5 1,3 HIS 0,9 0,5 1,1 1,9 AEG 2,1 .2,4 3,0 ...3,0 98,8% 100,1% 99,9% 100,1% f *Tryptofaani menetetään hapolla hydrolysoitaessa 89 95726 I. Tämän keksinnön mukaisten, puhdistettujen hepatitis B-partikkeleiden tarkastelu elektronimikroskooppisestiASN + ASP 5.5 4.2 5.2 7.3 THR 7.5 8.0 7.9 7.8 SER 12.5 11.3 12.0 10.8 GLU + GLU 7.5 4.2 4.5 5.1 PRO 12.5 10.8 10.5 12.6 GLY 8.6 6.6 7.1 8.3 ALA 5.0 2.8 4.5 5.4 VAL 4.2 5 .2 5.2 4.8 CYS 3.2 6.6 5.2 3.8 MET 1.9 2.3 2.2 1.9 ILE 4.9 7.5 7.5 6.7 LEU 12, 8 15.5 13.9 12.1 TYR 2.0 2.8 2.6 1.9 PHE 5.6 7.5 6.0 5.4 LYS 2.1 1.9 1.5 1.3 HIS 0.9 0.5 1.1 1.9 AEG 2.1 .2.4 3.0 ... 3.0 98.8% 100.1% 99.9% 100.1% f * Tryptophan is lost with acid by hydrolysis 89 95726 I. Electron microscopic examination of the purified hepatitis B particles of this invention
Elektronimikroskooppisesti todettiin, että tämän keksinnön mukaiset puhdistetut partikkelit ovat pallomaisia 22 nano-metrin partikkeleita, jotka ovat samankaltaisia kuin ne partikkelit, joita tyypillisesti muodostuu hepatitis B-vi-ruksen S-proteiinin polypeptidien kasaantuessa.It was found electron microscopically that the purified particles of this invention are spherical 22 nanometer particles similar to those typically formed by the accumulation of hepatitis B virus S protein polypeptides.
J. Tämän keksinnön mukaisten puhdistettujen partikkeleiden apuaineen valmistaminen ja stabiilisuuden testaaminen Tämän keksinnön mukaisessa rokotteessa käytettävän apuaineen valmistamiseksi 1/10 000 tilavuutta Thimerosolia ja 1/10 tilavuutta suodattamalla steriloitua, 0,2 M Ai 12 H.20-liuosta lisätään steriiliin suolaliuokseen, joka sisältää antigeeniä toivottuna pitoisuutena. pH asetetaan arvoon 5,0 steriilillä 1 N NaOH-liuoksella ja suspensiota sekoitetaan huoneen lämpötilassa 3 tuntia. Alunalla saos-tettu antigeeni otetaan talteen sentrifugoimalla 10 minuuttia nopeudella 2000 rpm, jonka jälkeen se suspendoidaan uudestaan steriiliin normaaliin suolaliuokseen, joka sisältää 1:10 000 Thimerosolia, ja jaetaan osiin steriileissä olosuhteissa.J. Preparation and Stability Testing of the Purified Particle Adjuvant of the Invention To prepare an adjuvant for use in the vaccine of this invention, 1/10,000 volume of Thimerosol and 1/10 volume of a sterilized, 0.2 M Al 12 H 2 O solution filtered by filtration are added to sterile saline containing antigen at the desired concentration. The pH is adjusted to 5.0 with sterile 1 N NaOH solution and the suspension is stirred at room temperature for 3 hours. The antigen precipitated with alum is recovered by centrifugation at 2000 rpm for 10 minutes, after which it is resuspended in sterile normal saline containing 1: 10,000 Thimerosol and aliquoted under sterile conditions.
Tämän keksinnön mukaisten, alunaan absorboitujen partikkeleiden stabiilisuuden määrittämiseksi antigeeni otetaan talteen liuottamalla aluna uudestaan 3 % natriumsitraattiin, jonka jälkeen sitä dialysoidaan peräkkäin 3 % natriumsit-raattia ja PBS-liuosta vastaan. Tämän keksinnön mukaisten partikkeleiden määrä määritettiin sitten yhdensuuntaisella (parallel-line) radioimmuunikokeella puhdistetun standardin laimennoksia vastaan, jotka laimennokset oli tehty 50 % vastasyntyneen vasikan seerumia sisältävään PBS-liu-okseen. Stabiilisuuskokeissa saadut tulokset (taulukko 4) osoittavat, että puhdistetut partikkelit (joko sellaisenaan tai alunaan absorboituina) ovat stabiileja 2-8 °C:n lämpötilassa vähintään 7 kuukautta.To determine the stability of the alum absorbed particles of this invention, the antigen is recovered by redissolving the alum in 3% sodium citrate, followed by sequential dialysis against 3% sodium citrate and PBS. The number of particles of this invention was then determined by a parallel-line radioimmunoassay against dilutions of a purified standard in PBS-Liu containing 50% neonatal calf serum. The results obtained in the stability tests (Table 4) show that the purified particles (either as such or absorbed as alum) are stable at 2-8 ° C for at least 7 months.
90 9572690 95726
Taulukko 4 Stabiilisuuskokeet SDS-PAGE:Table 4 SDS-PAGE stability tests:
Tulokset vyöhykkeiden muodostumisesta Säilytys Näyte sellaisenaan Alunaan absorboitu kuukausina näyte _J_2_ _J_2_Results of zonal formation Storage Sample as such Alum absorbed in months Sample _J_2_ _J_2_
Aloitus normaali normaali normaali normaaliStart normal normal normal normal
-j M II II II-j M II II II
2 tl H 11 H2 teaspoons H 11 H
2 M II 11 II2 M II 11 II
^ tl II II II^ tl II II II
2 I» tl tl II2 I »tl tl II
g II II II IIg II II II II
-j II II II II-j II II II II
Kvantitatiivinen määritys RIA-menetelmälläQuantitative determination by RIA method
Prosenttia (%) aktiivisuudesta_ Säilytys Näyte sellaisenaan Alunaan absorboitu kuukausina näyte _ 1_2_ 1_2_Percentage (%) of activity_ Storage Sample as such Alum absorbed in months sample _ 1_2_ 1_2_
Aloitus 101 101 1 101 101 100 100 2 99 99 99 100 3 100 100 99 101 4 99 100 101 99 5 102 99 99 98 6 100 101 100 100 7 99 98 98 101 11 91 95726 K. Tämän keksinnön mukaisten partikkeleiden serokonversio ja ED5q-arvoStart 101 101 1 101 101 100 100 2 99 99 99 100 3 100 100 99 101 4 99 100 101 99 5 102 99 99 98 6 100 101 100 100 7 99 98 98 101 11 91 95726 K. Seroconversion and ED5q of the particles of this invention -value
Serokonversiokokeet suoritetaan viidellä ryhmällä, jotka muodostuvat kymmenestä täysikasvuisesta valkoisesta hiirestä (kuvat 8A, 8B ja 8C). Naaraspuolisten sveitsinhiirien Gm 1CR-kantaan injektoidaan ihonalaisesti 1 ml tämän keksinnön mukaisia partikkeleita sisältävää, apuaineena alunaa käyttävää rokotetta seuraavina laimennoksina: 1/1 (5,0 yg), 1/4 (1,3 yg) , 1/16 (0,31 yg) , 1/64 (0,16 yg) ja 1 /256 (0,078 yg). Hiirien veri otetaan talteen 28 vuorokauden kuluttua, ja vasta-ainetiitteri kvantitoidaan AUSAB-kokeella käyttäen vertailuna HBIG-standardia. Kustakin eläimestä saatu seeruminäyte laimennettiin sarjana nelinkertaisesti ja testattiin kolminkertaisesti.Seroconversion experiments are performed on five groups of ten adult white mice (Figures 8A, 8B, and 8C). The Gm 1CR strain of female Swiss mice is injected subcutaneously with 1 ml of the alum-containing vaccine containing the particles of this invention at the following dilutions: 1/1 (5.0 μg), 1/4 (1.3 μg), 1/16 (0.31 μg) yg), 1/64 (0.16 yg) and 1/256 (0.078 yg). Mice are bled after 28 days and antibody titer is quantified by the AUSAB assay using the HBIG standard as a control. A serum sample from each animal was serially diluted four-fold and tested in triplicate.
Niiden hiirien, joiden serotyyppi oli positiivinen, prosenttinen osuus väheni tämän keksinnön mukaisten partikkeleiden laimennoksen suurentuessa. Se annos, jolla 50 prosenttiin eläimistä saatiin aikaan seropositiivinen reaktio (ED^q) t on noin 0,05-0,25 yg tämän keksinnön mukaisia partikkeleita sisältävää rokotetta. Yleisesti ottaen tämän keksinnön mukaisella rokotteella saatuja serokonversion tuloksia ei voida erottaa luonnollisesta lähteestä saadulla rokotteella saaduista tuloksista.The percentage of serotype-positive mice decreased with increasing dilution of the particles of this invention. The dose at which a seropositive reaction (ED 2) is elicited in 50% of the animals is about 0.05 to 0.25 μg of the vaccine containing the particles of this invention. In general, the seroconversion results obtained with the vaccine of this invention cannot be distinguished from those obtained with a vaccine obtained from a natural source.
Esimerkki 2Example 2
PreS^-PreS2~S-proteiinin koodaavan alueen koodaamia poly-peptidejä käsittävien partikkeleiden ilmentäminen . A. Yhdistelmäplasmidin pENDO-1 valmistusExpression of particles comprising polypeptides encoded by the coding region of the PreS1-PreS2 ~ S protein. A. Preparation of recombinant plasmid pENDO-1
Yhdistelmäplasmideista pBglII2.8, pBR322.Sg2 (plasmidi, joka on valmistettu alikloonamalla plasmidin pBR322 EcoRI-kohtaan 7 kiloemäsparin suuruinen EcoRI 8G2-kappale plasmi-dista pMB9.BG2, kuvattu julkaisussa Tilghman, S.M. et ai., Proceeding Natl. Acad. Sei., Voi. 75, sivu 725, 1978, pDM2, POLINK 23456 (katso jäljempänä) sekä plasmidista pMMT-neo 92 95726 saatuja geenikappaleita käytetään vektorimuodosteiden valmistusvaiheissa pyrittäessä saamaan aikaan sellaisia yhdistelemällä saatuja ilmentämisvektoreita, joissa ei ole lainkaan muita kuin HPV-peräisiä virusgenomin osia.Of the recombinant plasmids pBglII2.8, pBR322.Sg2 (a plasmid prepared by subcloning a 7 kilobase pair EcoRI 8G2 fragment from plasmid pMB9.BG2 into the EcoRI site of plasmid pBR322, described in Tilghman, SM et al., Proceeding Natl. , Vol. 75, page 725, 1978, pDM2, POLINK 23456 (see below) and gene fragments from plasmid pMMT-neo 92 95726 are used in the steps of preparing vector constructs in order to obtain such expression vectors obtained by recombination which do not contain any viral elements other than HPV.
Kuvista 9A ja 9B nähdään, että plasmidi pBglII2.8 sisältää PreS-j-PreS2~S-proteiinin koodaavan alueen sisältävän geeni-kappaleen (1,34 kiloemäsparin suuruisen BstEII-Hpal-kappale), ja se käsittää luonnollisen voimakkaan promoottorin PreS2- S-proteiinin koodaavan alueen kopioitumista varten, mutta siitä puuttuu luonnollinen (heikko) promoottori PreS^ PreS2~S-proteiinin koodaavan alueen kopioitumista varten, sekä kopioitumisen päättävät toiminnot ja polyadenylaation signaali. Plasmidi pBglII2.8 pilkottiin entsyymeillä BstEII ja Hpal, jolloin saatiin kaksi DNA-kappaletta. Kappaleet erotettiin elektroforeettisesti 3,5 % polyakryyliamidigeelillä, jonka jälkeen toinen niistä (1,34 kb), joka sisältää PreS^-PreS2~S-proteiinin koodaavan alueen, puhdistettiin ja säilytettiin. Hpal-pää on tylppä. BstEII-pää tehtiin tylpäksi täyttämällä (tekemällä kaksijuosteiseksi) käyttäen DNA-poly-meraasia I (Klenow-kappale) ja neljää dNTP-molekyyliä, sekä tavanomaisia tekniikoita, jolloin saatiin DNA-kappale, jossa on kaksi tylppää päätä.It can be seen from Figures 9A and 9B that plasmid pBglII2.8 contains a gene fragment containing the coding region of the PreS-j-PreS2-S protein (1.34 kilobase pair BstEII-HpaI fragment) and comprises the natural strong promoter PreS2-S-. for the transcription of the protein coding region, but lacks the natural (weak) promoter for the transcription of the PreS ^ PreS2 ~ S protein coding region, as well as the transcription termination functions and the polyadenylation signal. Plasmid pBglII2.8 was digested with BstEII and HpaI to give two DNA fragments. The fragments were separated electrophoretically on a 3.5% polyacrylamide gel, after which one of them (1.34 kb) containing the coding region of the PreS1-PreS2-S protein was purified and stored. The Hpal head is blunt. The BstEII end was blunt-ended by filling (making it double-stranded) using DNA polymerase I (Klenow fragment) and four dNTPs, as well as conventional techniques to obtain a DNA fragment with two blunt ends.
Polykytkijäplasmidia POLINK 23456, jossa polykytkijäalue sisältää lukuisia restriktiokohtia (jäljempänä), käytettiin.The polylinker plasmid POLINK 23456, in which the polylinker region contains numerous restriction sites (below), was used.
Xbal Bell Hpal Clal HindlXI Kani BamHI Sohi Sacl SaliXbal Bell Hpal Clal HindlXI Kani BamHI Sohi Sacl Sali
GAATTCTAGATCTGATCAGTTAACATCCATAAGCTTGGTACCGGATCCCGGGCATGCGAGCTCGAGTCGACGAATTCTAGATCTGATCAGTTAACATCCATAAGCTTGGTACCGGATCCCGGGCATGCGAGCTCGAGTCGAC
EcoRI Belli Smal XhoIEcoRI Belli Smal XhoI
Xnval AvalXnval Aval
AvalAval
Polykytkijän sovitin (adapter) sijaitsee plasmidin pBR328 EcoRI-Sall-rajoitteisessa runkokappaleessa (3,1 kb).The polylinker adapter is located in the EcoRI-SalI-restricted backbone (3.1 kb) of plasmid pBR328.
93 95726 POLINK 23456 pilkotaan entsyymillä Hpal plasmidin tekemiseksi lineaariseksi. Tällaisessa Hpal-entsyymillä lineaariseksi tehdyssä plasmidissa on kaksi tylppää päätä. Tämän jälkeen lineaarinen plasmidi ligatoidaan tylpistä päistään PreS-j-PreS2~S-proteiinin koodaavan alueen sisältävän, plas-midista pBglII2.8 (edellä) saadun, 1,34 kiloemäsparin suuruisen DNA-kappaleen kanssa. Koska 1,34 kiloemäsparin kappale voidaan sisällyttää polykytkijäplasmidiin kummallakin mahdollisella tavalla suuntautuneena, niin oikea suuntautuminen (myötäpäivään luonnollisen kopioitumissuunnan suhteen) varmistetaan pilkkomalla entsyymillä EcoRI, mitä seuraa koon analysointi 1 % agaroosigeeleillä. Kun plasmidi, joka käsittää PreS^-PreS2~S-proteiinin koodaavan alueen oikealla tavalla suuntautuneena, pilkotaan entsyymillä EcoRI, niin tällöin saadaan kaksi 0,4 ja 4,1 kiloemäsparin suuruista kappaletta; väärä suuntautuminen johtaa kahden 1,0 ja 3,5 kiloemäsparin suuruisen kappaleen muodostumiseen. Tämän jälkeen PreS-j-PreS2~S-proteiinin koodaavan alueen sisältävä uusi plasmidi pilkotaan entsyymillä Hpal ja pilkotaan "osittain" entsyymillä BamHI. Restriktiokohtien Hpal ja BamHI välinen lyhyt (24 emäsparia) ketju erotetaan "osittaisesta" Hpal-BamHI-rungosta (5,0 kb), ja heitetään pois täydellisen pilkkomisen seurauksena reaktioseoksessa olevien kappaleiden kanssa.93 95726 POLINK 23456 is digested with the enzyme HpaI to make the plasmid linear. Such a plasmid linearized with HpaI has two blunt ends. The linear plasmid is then ligated at its blunt ends with a 1.34 kilobase pair DNA fragment containing the coding region of the PreS-j-PreS2-S protein from plasmid pBglII2.8 (above). Because the 1.34 kilobase pair fragment can be incorporated into the polylinker plasmid in either possible orientation, the correct orientation (clockwise with respect to the natural replication direction) is ensured by digestion with EcoRI, followed by size analysis on 1% agarose gels. When a plasmid comprising the coding region of the PreS1-PreS2-S protein in the correct orientation is digested with EcoRI, two 0.4 and 4.1 kilobase pairs are obtained; misalignment results in the formation of two 1.0 and 3.5 kilobase pairs. The novel plasmid containing the coding region of the PreS-j-PreS2-S protein is then digested with HpaI and "partially" digested with BamHI. The short chain (24 base pairs) between the restriction sites HpaI and BamHI is separated from the "partial" HpaI-BamHI backbone (5.0 kb), and discarded as a result of complete cleavage with the bodies in the reaction mixture.
Plasmidi pBR322.8G2 pilkotaan entsyymeillä Ball (tylppä pää) ja Bglll ("tarttuva" pää), jolloin saadaan hiiren globiinigeenistä peräisin olevan polyadenylaation päättä-misketjun mg-PAS-t sisältävä geeniketju (1,6 kb). Tämän jälkeen mg-PAS-t-ketju ligatoidaan avattuun, entsyymeillä Hpal-BamHI lineaariseksi tehtyyn plasmidiin, kuvattu edellä, suunnissa Ball-Hpal ja Bglll-BamHI ("tarttuvat" Bglll-ja BamHI-päät ovat identtiset ja näin ollen yhteen sopivat, ja ne voidaan ligatoida toisiinsa), jolloin saadaan uusi välivaiheena toimiva yhdistelmäplasmidi (6,0 kb), joka * sisältää sekä PreS^-PreS2~S-proteiinin koodaavan alueen 94 95726 että mg-PAS-t-ketjun oikealla tavalla suuntautuneina ja oikeassa järjestyksessä. Tämän jälkeen PreS^-PreS2_S-proteiinin koodaavan alueen ja mg-PAS-t-ketjun sisältävä plasmidi pilkotaan entsyymeillä Bglll ja Sali, jolloin plasmidi katkeaa kahdeksi DNA-kappaleeksi (2,95 kb ja 3,05 kb), mikä todetaan elektroforeettisesti 1 % agaroosi-geelillä. 3,05 kiloemäsparin suuruinen kappale pilkotaan entsyymillä PvuI , jolloin saadaan kaksi pienempää kappaletta (1,08 kb ja 1,98 kb), jonka jälkeen jäljellä oleva 2,95 kiloemäsparin suuruinen BglII-SalI-rajoitteinen DNA-kappale (joka ei sisällä Pvul-kohtaa), joka sisältää siihen yhteen sulautettuna PreS^-PreS2~S-proteiinin koodaavan alueen ja mg-PAS-t-ketjun, puhdistetaan ja säilytetään.Plasmid pBR322.8G2 is digested with the enzymes Ball (blunt end) and BglII ("infectious" end) to give a gene chain (1.6 kb) containing the polyadenylation termination chain from the mouse globin gene. The mg-PAS-t chain is then ligated to the opened plasmid linearized with HpaI-BamHI, described above, in the directions Ball-HpaI and BglII-BamHI (the "adhesive" BglII and BamHI ends are identical and thus compatible, and they can be ligated together) to give a new intermediate recombinant plasmid (6.0 kb) * containing both the PreS1-PreS2-S protein coding region 94 95726 and the mg-PAS-t chain in the correct orientation and order. The plasmid containing the coding region of the PreS1-PreS2_S protein and the mg-PAS-t chain is then digested with BglII and SalI, cleaving the plasmid into two pieces of DNA (2.95 kb and 3.05 kb), which is electrophoretically detected at 1%. agarose gel. The 3.05 kilobase pair fragment is digested with PvuI to give two smaller fragments (1.08 kb and 1.98 kb), followed by the remaining 2.95 kilobase pair BglII-SalI-restricted DNA fragment (which does not contain PvuI). which contains the PreS1-PreS2 ~ S protein coding region and the mg-PAS-t chain fused together are purified and stored.
Sitten plasmidi pMMT-neo, joka muodostettiin ligatoimalla osan A esimerkistä 1 saatu 6,65 kiloemäsparin kappale (katso kuva 9), pilkotaan entsyymeillä Bglll ja Sali, mikä johtaa kahteen DNA-kappaleeseen (4,23 kb ja 2,42 kb). Neo-mysiiniin perustuvan valikoinnin merkitsimen ja SV40-viruk-sen PAS-t-ketjun sisältävä, 2,42 kiloemäsparin suuruinen kappale heitetään pois. Jäljelle jäävä 4,23 kiloemäsparin kappale puhdistetaan elektroforeettisesti käyttäen 0,8 % agaroosigeeliä, jonka jälkeen se ligatoidaan edellä saatuun 2,95 kiloemäsparin suuruiseen PreS^-PreSj-S-proteii-nin koodaavan alueen ja mg-PAS-t-ketjun sisältävään, Bglll-Sall-rajoitteiseen DNA-kappaleeseen, jolloin saadaan 7,15 kiloemäsparin suuruinen yhdistelmäplasmidi, joka sisältää MMT-promoottorin, PreS^-PreS2~S-proteiinin koodaavan alueen ja polyadenylaation ja päättymisen mg-PAS-t-ketjun, tässä järjestyksessä, ja tästä plasmidista käytetään nimitystä pENDO-1. Plasmidi pENDO-1 ei sisällä muun kuin HBV-viruksen virusgenomin osia (katso kuva 9).Plasmid pMMT-neo, formed by ligating the 6.65 kilobase pair fragment from Example 1 of Part A (see Figure 9), is then digested with BglII and SalI, resulting in two DNA fragments (4.23 kb and 2.42 kb). A 2.42 kilobase pair containing the neo-mycin-based selection marker and the SV40 virus PAS-t chain is discarded. The remaining 4.23 kilobase pair fragment is purified by electrophoresis using a 0.8% agarose gel, after which it is ligated to the 2.95 kilobase pair containing BglII containing the PreS1-PreSj-S protein coding region and mg-PAS-t chain obtained above. -Sall-restricted DNA fragment to give a 7.15 kilobase pair recombinant plasmid containing the MMT promoter, the coding region of the PreS1-PreS2 ~ S protein, and the polyadenylation and termination mg-PAS-t chain, respectively, and the plasmid is called pENDO-1. Plasmid pENDO-1 does not contain parts of the non-HBV viral genome (see Figure 9).
B. Yhdistelmäplasmidin pENDO-2 valmistaminenB. Preparation of recombinant plasmid pENDO-2
Kuten kuvasta 10 nähdään, plasmidi pDM2, joka käsittää MMT-promoottorin, PreS2**S-proteiinin koodaavan alueen ja proteiinin X koodaavan alueen, pilkotaan resktriktio-As shown in Figure 10, plasmid pDM2, which comprises the MMT promoter, the PreS2 ** S protein coding region, and the protein X coding region, is digested.
IIII
95 95726 entsyymeillä Spel ja Sali. Spei-restriktiokohta sijaitsee PreS2~S-proteiinin koodaavan alueen S-proteiinin alueessa, ja se on ainut Spel-kohta plasmidissa pDM2, Sali-kohdan tavoin, joka sijaitsee myöhemmin geenissä. Näitä kahta entsyymiä käyttäen plasmidi katkaistaan kahdeksi DNA-kap-paleeksi (1,58 ja 4,88 kb), ja PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen karboksipään ja proteiinin X koodaavan alueen sisältävä 1,58 kiloemäsparin kappale heitetään pois, kun taas 4,88 kiloemäsparin kappale puhdistetaan ja säilytetään.95 95726 with the enzymes Spel and Sali. The SpeI restriction site is located in the S-protein region of the PreS2-S coding region and is the only SpeI site in plasmid pDM2, like the SalI site located later in the gene. Using these two enzymes, the plasmid is cleaved into two DNA-Kappa fragments (1.58 and 4.88 kb), and the 1.58 kilobase pair fragment containing the carboxy terminus of the PreS2-S protein coding region and the protein X coding region is discarded, while 4, The 88 kilobase pair piece is cleaned and stored.
Plasmidi pENDO-1 pilkotaan samoin entsyymeillä Spel ja Sali, jolloin plasmidi katkeaa kahdeksi DNA-kappaleeksi, jotka ovat kooltaan 1,9 ja 5,25 kb. 1,9 kiloemäsparin suuruinen kappale, joka sisältää PreS2-S-proteiinin koodaavasta alueesta S-proteiinin alueen karboksipään, sekä mg-PAS-t-alueen, puhdistetaan ja säilytetään.Plasmid pENDO-1 is similarly digested with SpeI and SalI, cleaving the plasmid into two DNA fragments of 1.9 and 5.25 kb in size. A 1.9 kilobase pair fragment containing the carboxy terminus of the S protein region from the PreS2-S protein coding region, as well as the mg-PAS-t region, is purified and stored.
Tämän jälkeen kaksi säilytettyä DNA-kappaletta (1,9 kb ja 4,88 kb) ligatoidaan uuden yhdistelmäplasmidin (6,8 kb), pENDO-2, muodostamiseksi, joka pENDO-2 sisältää MMT-pro-moottorin, PreS2-S-proteiinin koodaavan alueen ja mg-PAS-t-ketjun. Plasmidi pENDO-2 ei sisällä muun kuin HBV-virus~ genomin osia (katso kuva 10) .The two conserved DNA fragments (1.9 kb and 4.88 kb) are then ligated to form a new recombinant plasmid (6.8 kb), pENDO-2, which contains the MMT promoter, the PreS2-S protein. coding region and mg-PAS-t chain. Plasmid pENDO-2 does not contain parts of the non-HBV virus genome (see Figure 10).
C. Yhdistelmäplasmidin pENDO-O valmistaminenC. Preparation of recombinant plasmid pENDO-O
Neomysiiniin perustuva valikoinnin merkitsimen sisältämä kolmas uusi plasmidi, josta käytetään nimitystä pENDO-0 (katso kuva 11), muodostetaan pilkkomalla pMMT-neo, joka on muodostettu osan A esimerkissä 1 saadun 6,65 kiloemäsparin suuruisen kappaleen ligaatiolla (katso kuva 11), rekstriktioentsyymeillä Smal (tylppä pää) ja BamHI. Plasmidi katkeaa kahdeksi DNA-kappaleeksi (5,5 kb ja 1,15 kb). Plasmidin pMMT-neo rungosta peräisin oleva, 5,5 kiloemäsparin suuruinen, MMT-promoottorin ja neomysiiniin perustuvan valikoinnin merkitsimen sisältävä kappale säilytetään. Tämän jälkeen viimeksi mainittu kappale ligatoidaan 1,6 95726 96 kiloemäsparin suuruiseen DNA-kappaleeseen, joka sisältää BalI-BglII-rajoitteisen mg-PAS-t-ketjun, kuten plasmidin pENDO-1 muodostamisen yhteydessä esitetään. Nyt tuloksena oleva 7,2 kiloemäsparin yhdistelmäplasmidi pENDO-0 sisältää MMT-promoottorin, neomysiiniin perustuvan valikoinnin merkitsimen ja mg-PAS-t-ketjun, eikä lainkaan virusperäisiä DNA-ketjuja (katso kuva 11).The third new plasmid containing the neomycin selection marker, designated pENDO-0 (see Figure 11), is generated by digesting pMMT-neo generated by ligation of the 6.65 kilobase fragment obtained in Example 1 of Part A (see Figure 11) with the restriction enzymes SmaI. (blunt head) and BamHI. The plasmid breaks into two pieces of DNA (5.5 kb and 1.15 kb). A 5.5 kilobase pair fragment from the pMMT neo backbone of the plasmid containing the MMT promoter and the neomycin-based selection marker is retained. The latter fragment is then ligated to a 1.6 95726 96 kilobase pair DNA fragment containing the BalI-BglII-restricted mg-PAS-t chain, as shown for the construction of plasmid pENDO-1. The resulting 7.2 kilobase pair recombinant plasmid pENDO-0 contains the MMT promoter, a neomycin-based selection marker, and a mg-PAS-t chain, and no viral DNA strands at all (see Figure 11).
D. Plasmidivektoreiden pENDO-0, pENDO-1 ja pENDO-2 vieminen nisäkässoluihin yhteistransfektiollaD. Introduction of Plasmid Vectors pENDO-0, pENDO-1 and pENDO-2 into Mammalian Cells by Co-Transfection
Yhdistämällä saadut plasmidivektorit pENDO-Ο, pENDO-1 ja pENDO-2 yhteistransfektoidaan nisäkässoluihin, kuten hiiren L-soluihin, Vero-soluihin (afrikkalainen marakatti), CHO-soluihin ja hiiren 3T3-fibro blasteihin käyttäen yhteistrans-fektoimiseen tavanomaisesti soveltuvia toimenpiteitä. Lääkeaineelle G418 vastustuskykyiset transfektantit eristetään ja seulotaan tämän keksinnön mukaisten partikkeleiden tuotannon suhteen käyttäen RIA-menetelmää.The resulting plasmid vectors pENDO-Ο, pENDO-1, and pENDO-2 are co-transfected into mammalian cells such as mouse L cells, Vero cells (African maracas), CHO cells, and mouse 3T3 fibroblasts using standard co-transfection procedures. Transfectants resistant to G418 are isolated and screened for production of the particles of this invention using the RIA method.
E. Plasmidien pENDO-0, pENDO-1 ja pENDO-2 DNA:sta muodostuvien sekakonkatameerien valmistaminen ja transfektoiminen soluiinjoihinE. Preparation and transfection of mixed concatamers of DNA from plasmids pENDO-0, pENDO-1 and pENDO-2 into cell lines
Kukin plasmideista pENDO-1, pENDO-2 ja pENDO-0 sisältää ainutlaatuisen restriktiokohdan PvuI, joka sijaitsee Amp-geenissä, vastapäivään EcoRI-restriktiokohdasta (katso kuvat 9, 10 ja 11). Kukin näistä plasmideista pilkotaan erikseen entsyymillä PvuI niiden tekemiseksi lineaariseksi. Tämän jälkeen nämä plasmidit polymeroidaan sekakonkatameerien muodostamiseksi, joissa sekakonkatameereissä eri plas-mideja on läsnä eri suhteissa. Esimerkiksi, kun lineaariseksi tehtyjä plasmideja pENDO-1 ja pENDO-Ο polymeroidaan käyttäen ligaasia, kuten T4 DNA-ligaasia, niin tällöin voi muodostua sekakonkatameerejä, joissa plasmidien välinen suhde pENDO-1; pENDO-Ο on 10:1, mikäli komponentteina käytettävien, line- it 97 95726 aariseksi tehtyjä plasmideja käytetään suhteessa pENDO-1: pENDO-O 10:1. Tuloksena oleva, plasmideista pENDO-1 ja pENDO-O muodostunut sekakonkatameeri transfektoidaan eukarioottiseen soluun, kuten nisäkässoluun, ja solut valikoidaan lääkeaineen G418 vastustuskyvyn perusteella. Oletetaan, että keskimäärin jokainen lääkeaineelle G418 vastustuskykyinen (transfektoitunut) solu sisältää noin kymmenen kopiota PreS^-PreS2~S-proteiinin koodaavasta alueesta neo-geenin yhtä kopiota kohden.Each of plasmids pENDO-1, pENDO-2, and pENDO-0 contains a unique restriction site, PvuI, located in the Amp gene, counterclockwise from the EcoRI restriction site (see Figures 9, 10, and 11). Each of these plasmids is separately digested with the enzyme PvuI to make them linear. These plasmids are then polymerized to form mixed concatamers in which different plasmids are present in different ratios. For example, when the linearized plasmids pENDO-1 and pENDO-Ο are polymerized using a ligase such as T4 DNA ligase, mixed concatamers may be formed in which the ratio of plasmids pENDO-1; pENDO-Ο is 10: 1 if plasmids made as lines 97 95726 are used as components in a ratio of pENDO-1: pENDO-O 10: 1. The resulting mixed concatamer formed from plasmids pENDO-1 and pENDO-O is transfected into a eukaryotic cell, such as a mammalian cell, and the cells are selected for drug G418 resistance. It is assumed that, on average, each G418-resistant (transfected) cell contains about ten copies of the coding region of the PreS1-PreS2-S protein per copy of the neo gene.
Samoin pENDO-O -kappale polymeroidaan pENDO-2 -kappaleen kanssa ligaasilla, kuten T4 DNA-ligaasilla plasmidien suhteen pENDO-2:pENDO-0 ollessa 10:1, esimerkiksi, jolloin saadaan plasmideja pENDO-2 ja pENDO-O sisältäviä seka-konkatameerejä.Tämän jälkeen tämä konkatameeri transfektoidaan eukarioottiseen soluun, kuten nisäkässoluun. Sitten solut valikoidaan G418-vastustuskyvyn perusteella, ja G418-vastustuskykyinen (transfektoitunut) solu sisältää keskimäärin plasmidin pENDO-2 kymmenen kopiota pENDO-O:aa kohden, tässä esimerkissä.Similarly, the pENDO-O fragment is polymerized with the pENDO-2 fragment with a ligase, such as T4 DNA ligase, for plasmids pENDO-2: pENDO-0 at 10: 1, for example, to give mixed concatamers containing plasmids pENDO-2 and pENDO-O. This concatamer is then transfected into a eukaryotic cell, such as a mammalian cell. The cells are then selected for G418 resistance, and the G418-resistant (transfected) cell contains an average of ten copies of plasmid pENDO-2 per pENDO-O, in this example.
Samoin plasmidit pENDO-1, pENDO-2 ja pENDO-O polymeroidaan · ligaasilla, kuten T4 DNA-ligaasilla, sekakonkatameerin muodostamiseksi, jossa konkatameerissä suhde pENDO-1:pENDO-2: pENDO-O on esimerkiksi 10:10:1. Tuloksena oleva sekakonkatameeri transfektoidaan eukarioottiseen soluun, esimerkiksi nisäkässoluun, ja solut valikoidaan G418-vastustuskyvyn • perusteella. Vastustuskykyisten (transfektoituneiden) so lujen tulisi sisältää keskimäärin kymmenen kopiota plasmi-dista pENDO-1, kymmenen kopiota plasmidista pENDO-2 ja yhden kopion plasmidista pENDO-O.Similarly, plasmids pENDO-1, pENDO-2, and pENDO-O are polymerized with a ligase, such as T4 DNA ligase, to form a mixed concatamer in which the ratio of pENDO-1: pENDO-2: pENDO-O is, for example, 10: 10: 1. The resulting mixed concatamer is transfected into a eukaryotic cell, such as a mammalian cell, and the cells are selected for G418 resistance. Resistant (transfected) cells should contain an average of ten copies of plasmid pENDO-1, ten copies of plasmid pENDO-2 and one copy of plasmid pENDO-O.
Kunkin tuloksena olevan, lääkeaineelle vastustuskykyisen . solun tulisi tuottaa suurempina saantoina PreS^-PreS2“S-pro- teiinin koodaavan alueen koodaamia proteiineja sisältäviä partikkeleita.Each resulting drug-resistant. the cell should produce in higher yields particles containing proteins encoded by the coding region of the PreS1-PreS2 'S protein.
98 9572698 95726
Replikoitumattomien, hiiren metallotioneiinipromoottorin käsittävien vektorien käyttäminen muiden proteiinien ilmentämiseen transfektoiduissa, eukarioottisissa isäntä-soluissa .Use of non-replicating vectors comprising the mouse metallothionein promoter to express other proteins in transfected, eukaryotic host cells.
Tämä keksintö käsittää samoin yhdistelmä-DNA-tekniikalla saadut siirtovektorit, joissa käytetään mitä tahansa toiminnallista DNA-ketjua ihmisen tai rotan kasvuhormonin tuottamiseksi transfektoiduissa, eukarioottisissa isäntäsoluissa.The present invention also encompasses transfer vectors obtained by recombinant DNA technology using any functional DNA strand to produce human or rat growth hormone in transfected, eukaryotic host cells.
Käsitteellä toiminnallinen DNA-ketju tarkoitetaan mistä tahansa lähteestä suoraan tai epäsuoraan saatua erillistä DNA-aluetta, joka toimii tämän keksinnön mukaisella vektorilla transfektoidussa eukarioottisessa isäntäsolussa täydellisenä ilmentyvänä geeniyksikkönä, rakenteellisena geeninä, promoottorina tai säätelevänä alueena.The term functional DNA strand refers to a discrete DNA region obtained directly or indirectly from any source that functions as a fully expressed gene unit, structural gene, promoter, or regulatory region in a eukaryotic host cell transfected with a vector of this invention.
Täydellisellä ilmentyvällä geeniyksiköllä tarkoitetaan rakenteellista geeniä, promoottoria ja sääteleviä alueita, jotka ovat edellytyksenä sen kopioitumiseen ja luentaan.By a fully expressed gene unit is meant a structural gene, a promoter, and regulatory regions that are a prerequisite for its replication and reading.
Promoottorilla tarkoitetaan mitä tahansa rakenteellisen geenin suhteen ylävirran puolella sijaitsevaa aluetta, joka mahdollistaa RNA-polymeraasin sitoutumisen ja kopi-oitumisen tapahtumisen.By promoter is meant any region upstream of a structural gene that allows RNA polymerase to bind and copy.
Säätelevällä alueella tarkoitetaan mitä tahansa aluetta, joka säätelee rakenteellisen geenin kopioitumisnopeutta.By regulatory region is meant any region that regulates the rate of replication of a structural gene.
Rakenteellisella geenillä tarkoitetaan koodaavaa ketjua, joka toimii mallina lähetti-RNA:n synteesissä.By structural gene is meant a coding chain that serves as a template for the synthesis of messenger RNA.
Edullisia rakenteellisia geenejä ovat esimerkiksi farmaseuttisesti mielenkiintoisia polypeptidejä koodaavat ra-’ kenteelliset geenit ja näistä polypeptideistä mainittakoon virusantigeeni, insuliini, interferoni, lymfokiinit, rotan 99 95726 tai ihmisen kasvuhormonit, kudoksen plasminogeeniaktivaat-tori, alfa-l-antitrypsiini ja muut vastaavat. Edullisin on rotan tai ihmisen kasvuhormoni.Preferred structural genes include, for example, structural genes encoding pharmaceutically interesting polypeptides, such as viral antigen, insulin, interferon, lymphokines, rat 99 95726 or human growth hormones, tissue plasminogen activator, alpha-1-antitrypsin, and the like. Most preferred is rat or human growth hormone.
Tämä keksintö kohdistuu yhdistelmä-DNA-vektoriin, joka käsittää toiminnallisen DNA-ketjun ja MMT-promoottorin. MMT-promoottori voidaan sisällyttää DNA-vektoriin joko tämän DNA-ketjun luonnollisen promoottorin lisäksi tai luonnollisen promoottorin tilalle. MMT-promoottori sijaitsee mieluiten DNA-vektorissa välittömästi ylävirran puolella DNA-ketjun proteiinia koodaavasta alueesta. Tällainen vektori käsittää mielellään myös kopioitumisen päätty-misketjun ja valikoinnin merkitsimen. Tällainen merkitsin on mielellään lääkeaineen vastustuskykyyn perustuva merkitsin, kuten neomysiinigeeni. Tällainen kopioitumisen päättymisketju on mielellään SV40-päättymiskohta (sv-PAS-t) tai mieluummin hiiren globiinigeenin DEF-alue (mg-PAS-t). Tällainen vektori voidaan valmistaa tavanomaisilla yh-distelmä-DNA-tekniikoilla ja muilla molekyylibiologian menetelmillä. Edullisimmassa tapauksessa, mg-PAS-t-aluetta käyttäen vektori ei sisällä lainkaan virusperäisiä DNA-kappaleita, ja se ei ole onkogeeninen, eli se ei transformoi (tee syöpää muodostavaksi) isäntäsolua, johon se on istutettu. Kun tällainen vektori transfektoidaan isäntään, se yhtenäistyy isännän kromosomiin ja replikoituu passiivisesti isäntägenomin kanssa, mikäli vektori ei sisällä autonomista replikaatioketjua (replikonia) , joka kykenee toimimaan vektorilla transfektoidussa isännässä.This invention relates to a recombinant DNA vector comprising a functional DNA strand and an MMT promoter. The MMT promoter may be included in the DNA vector either in addition to or in place of the natural promoter of this DNA strand. The MMT promoter is preferably located in the DNA vector immediately upstream of the protein coding region of the DNA chain. Such a vector preferably also comprises a copy termination chain and a selection marker. Such a marker is preferably a marker based on drug resistance, such as the neomycin gene. Such a copy termination chain is preferably the SV40 termination site (sv-PASs) or more preferably the DEF region of the mouse globin gene (mg-PASs). Such a vector can be prepared by conventional recombinant DNA techniques and other methods of molecular biology. In the most preferred case, using the mg-PAS-t region, the vector contains no viral DNA fragments at all and is not oncogenic, i.e., it does not transform (make a cancer-forming) host cell into which it has been implanted. When such a vector is transfected into a host, it integrates into the host chromosome and replicates passively with the host genome if the vector does not contain an autonomous replication chain (replicon) capable of functioning in the host transfected with the vector.
Tämän keksinnön mukaisen yhdistelmä-DNA-vektorin tulisi mielellään käsittää seuraavat tunnusomaiset piirteet: 1) mielenkiinnon kohteena oleva DNA-ketju; 2) MMT-promoottori, joka sijaitsee välittömästi ylävirran puolella mielenkiinnon kohteena olevasta DNA-ket- • justa; 3) vektorin tulisi kyetä replikoitumaan bakteereissa tai muussa prokarioottisessa isännässä, johon se on trans 100 .The recombinant DNA vector of the present invention should preferably comprise the following characteristics: 1) the DNA strand of interest; 2) an MMT promoter located immediately upstream of the DNA strand of interest; 3) the vector should be able to replicate in bacteria or another prokaryotic host to which it is trans 100.
95726 formoitu, kasvua ja monistumista varten, yhdistelmävekto-rin suurten määrien tuottamiseksi. Täten tällaisen vektorin tulisi käsittää bakteeriperäinen tai muu prokariootti-nen replikoni, eli sellainen DNA-kappale, joka käsittää ne kaikki toiminnot, jotka ovat välttämättömiä vektorin autonomiseen replikoitumiseen ja sen säilymiseen kromosomien ulkopuolella prokarioottisessa isäntäsolussa, esimerkiksi isäntänä toimivassa bakteerisolussa, joka on transformoitu tällä vektorilla. Tällaiset replikonit ovat alalla hyvin tunnettuja.95726 formed, for growth and amplification, to produce large amounts of the recombinant vector. Thus, such a vector should comprise a bacterial or other prokaryotic replicon, i.e., a piece of DNA comprising all the functions necessary for autonomous replication of the vector and its retention outside the chromosomes in a prokaryotic host cell, for example a host bacterial cell transformed with the vector. Such replicons are well known in the art.
4) Vektorireplikonin tulisi olla pieni (eli mielellään pienempi kuin 6-8 kiloemäsparia), jotta sen geneettinen ja molekyylibiologinen manipulointi olisi helppoa.4) The vector replicon should be small (i.e., preferably less than 6-8 kilobase pairs) to facilitate its genetic and molecular biological manipulation.
5) Vektorin tulisi käsittää valikoinnin merkitsin/ mielellään lääkeaineen, kuten ampisilliinin, vastustuskykyyn perustuva valikoinnin merkitsin/ jota voidaan käyttää vektorilla transformoidussa, isäntänä toimivassa bakteeri-solussa .5) The vector should comprise a selection marker / preferably a selection marker based on the resistance of a drug such as ampicillin / which can be used in a vector-transformed host bacterial cell.
6) Vektorin tulisi käsittää myös toinen valikoinnin merkitsin, mielellään lääkeaineen, kuten neomysiinin, vastustuskykyyn perustuva merkitsin, jota voidaan käyttää tällä vektorilla transfektoidussa, isäntänä toimivassa eukarioottisessa solussa.6) The vector should also comprise another marker of choice, preferably a marker based on the resistance of a drug such as neomycin, which can be used in a host eukaryotic cell transfected with this vector.
7) Vektorin tulisi sisältää sopivia endonukleaasien restriktiokohtia kloonaamista varten.7) The vector should contain appropriate endonuclease restriction sites for cloning.
8) Vektorin tulisi sisältää kopioitumisen päättymisketju ja polyadenylaatioketju.8) The vector should contain a transcription termination chain and a polyadenylation chain.
9) Ilmentyvä geeniyksikkö ei sisällä lainkaan viruspe- . räisiä kappaleita ja se ei ole onkogeeninen.9) The expressed gene unit does not contain any viral pe. and is not oncogenic.
Edullisimmassa tapauksessa tämän keksinnön mukainen vektori ei käsitä autonomista replikaatioketjua (replikonia), joka kykenee toimimaan vektorilla transfektoidussa eukarioottisessa isäntäsolussa. Pääasiallinen syy replikoitu-mattoman vektorijärjestelmän käyttöön eukarioottisissa isäntäsoluissa on se, että kaikki ne vektorijärjestelmät, jotka kykenevät autonomiseen ja kromosomien ulkopuolella ,0, 95726 tapahtuvaan replikoitumiseen vektorilla transfektoidussa, eukarioottisessa, isäntänä toimivassa nisäkässolussa, käsittävät onkogeenisistä viruksista peräisin olevia rep-likoneja. On toivottavaa käyttää vektoreita, joiden DNA ei ole peräisin onkogeenisistä viruksista, ilmennettäessä farmaseuttisesti mielenkiintoisia polypeptidejä koodaavia DNA-ketjuja.In the most preferred case, the vector of the present invention does not comprise an autonomous replication chain (replicon) capable of functioning in a eukaryotic host cell transfected with the vector. The main reason for using a non-replicating vector system in eukaryotic host cells is that all vector systems capable of autonomous and extrachromosomal replication in a vector-transfected eukaryotic host mammalian cell transfected with the vector comprise oncogenes. It is desirable to use vectors whose DNA is not derived from oncogenic viruses to express DNA strands encoding polypeptides of pharmaceutical interest.
Tämä keksintö kohdistuu samoin transfektoituun eukarioot-tiseen isäntäsoluun, joka on transformoitu tämän keksinnön mukaisen toiminnallisen DNA-ketjun sisältävällä yhdistelmä-DNA-vektorilla. Tällainen isäntä on mielellään nisäkäs-solu, mieluiten kiinanhamsterin munasarjasta (CHO) saatu solulinja, verosolulinja, L-solulinja tai hiiren tai rotan fibroblastinen solulinja. Tällainen isäntä voidaan saada aikaan transfektoimalla eukarioottinen solu tämän keksinnön mukaisella yhdistelmä-DNA-vektorilla, tavanomaisia tekniikoita käyttäen.The present invention is also directed to a transfected eukaryotic host cell transformed with a recombinant DNA vector comprising a functional DNA strand of the present invention. Such a host is preferably a mammalian cell, preferably a cell line derived from a Chinese hamster ovary (CHO), a blood cell line, an L cell line, or a mouse or rat fibroblast cell line. Such a host can be obtained by transfecting a eukaryotic cell with a recombinant DNA vector of the present invention using conventional techniques.
Tämä keksintö kohdistuu samoin menetelmään mielenkiinnon kohteena olevan DNA-ketjun koodaamia proteiineja käsittävän partikkelin valmistamiseksi, jossa partikkelissa vähintään yksi näistä proteiineista vastaa mielenkiinnon kohteena olevan DNA-ketjun koodaamaa polypeptidiä, tämän menetelmän käsittäessä: a) tämän keksinnön mukaisen transfektoidun isännän viljelemisen sellaisissa viljelyalustassa vallitsevissa olosuhteissa, että tämä isäntä kykenee ilmentämään näitä proteiineja, ja b) tällaisen partikkelin eristämisen. Tällainen transfektoitu isäntä kykenee mieluiten erittämään nämä partikkeleiksi kasaantuneet proteiinit alustaan. Tällaiseen viljelyalustaan lisätään mielellään raskasmetallien ioneja tai steroidihormonia, kuten deksametasonia, MMT-promoottorin indusoimiseksi ja täten tällaisen koodaa-van alueen ilmentymisen edistämiseksi. Raskasmetallien ioneina käytetään mieluiten kadmiumin tai sinkin ioneja. Raskasmetallien ionien tai steroidihormonin optimaalinen pitoisuus alustassa voidaan määrittää tavanomaisilla menetelmillä .The present invention is also directed to a method of producing a particle comprising proteins encoded by a DNA strand of interest, wherein at least one of said proteins corresponds to a polypeptide encoded by the DNA strand of interest, the method comprising: a) culturing a transfected host of the invention in such a culture medium; that this host is capable of expressing these proteins, and b) isolating such a particle. Such a transfected host is preferably capable of secreting these particulate proteins into the medium. Preferably, heavy metal ions or a steroid hormone such as dexamethasone are added to such a culture medium to induce the MMT promoter and thus promote the expression of such a coding region. The ions of heavy metals used are preferably cadmium or zinc. The optimal concentration of heavy metal ions or steroid hormone in the medium can be determined by conventional methods.
102 95726 Tämä keksintö kohdistuu samoin tällä menetelmällä valmistettuihin partikkeleihin. Mikäli tämän keksinnön mukainen transfektoitu isäntäsolu erittää nämä partikkelit suoraan viljelyalastaan, niin nämä partikkelit voidaan tällöin eristää tämän keksinnön mukaisen transfektoidun isännän viljelyalustasta proteiinien puhdistamiseen tavanomaisesti käytetyillä tekniikoilla. Mikäli tämän keksinnön mukainen transfektoitu isäntäsolu ei eritä näitä partikkeleita, niin ne saadaan tämän isännän viljelmän hajotteesta viljelmän hajottamiseen tavanomaisesti käytetyillä tekniikoilla .102 95726 The present invention likewise relates to particles prepared by this method. If the transfected host cell of the present invention secretes these particles directly from its culture medium, then these particles can be isolated from the culture medium of the transfected host of the present invention by conventional techniques for protein purification. If these particles are not secreted by the transfected host cell of the present invention, they are obtained from the culture digest of this host by techniques commonly used to lyse the culture.
Esimerkki 3Example 3
Ihmisen kasvuhormonin ilmentäminenExpression of human growth hormone
Ihmisen kasvuhormonia koodaavan yhdistelmä-DNA-vektorin valmistaminen, mainitun vektorin käsittäessä metallotio-neiinipromoottorin A. Ihmisen kasvuhormonin geenin sisältävän DNA-kappa-leen eristäminen siten, ettei DNA-kappale käsitä kopioitu-misen luonnollista promoottoriaPreparation of a recombinant DNA vector encoding human growth hormone, said vector comprising a metallothionein promoter A. Isolation of a DNA fragment containing the human growth hormone gene such that the DNA fragment does not comprise the natural promoter of replication
Yhdistelmäplasmidi pBR322, jonka sisältämä 2 kiloemäsparin suuruinen EcoRI-entsyymillä saadun DNA-kappaleen muodostama istute koodittaa ihmisen kasvuhormonin geeniä (vastapäivään suuntautuneena), pilkotaan restriktioendonukleaasilla BamHI 500 mikrolitran kokonaistilavuudessa, joka sisältää 100 yg plasmidi-DNA:ta, 240 yksikköä entsyymiä BamHI, BamHI-puskurissa (runsaasti suolaa sisältävä puskuri). Tällöin saadaan kaksi kappaletta, joista toinen on noin 5,6 kb ja toinen kappale 0,8 kb. Nämä kappaleet erotetaan elektro-foreettisesti käyttäen preparatiivista 0/8 % agaroosigee-liä. Suurempi kappale, joka sisältää ihmisen kasvuhormonin rakenteellisen geenin ilman tämän geenin luonnollista promoottoria, eluoidaan sähköisesti geeliltä ja puhdistetaan uuttamalla kahdesti fenolin ja kloroformin seoksella, uuttamalla kahdesti kloroformilla ja saostamalla kahdesti 103 9 5 7 2 6 etanolilla. Kasautunut DNA suspendoidaan uudestaan 20 mik-rolitraan 10 mM Tris-puskuria, pH 8,0.The recombinant plasmid pBR322, which contains a 2 kilobase pair of EcoRI-derived DNA fragment encoding the human growth hormone gene (counterclockwise), is digested with restriction endonuclease B in buffer (high salt buffer). In this case, two pieces are obtained, one of which is about 5.6 kb and the other 0.8 kb. These fragments are separated electrophoretically using a preparative 0/8% agarose gel. The larger body, which contains the structural gene for human growth hormone without the natural promoter of this gene, is electrically eluted from the gel and purified by extraction twice with a mixture of phenol and chloroform, extraction twice with chloroform and precipitation twice with 103 9 5 7 2 6 ethanol. The accumulated DNA is resuspended in 20 microliters of 10 mM Tris buffer, pH 8.0.
B. Metallotioneiinipromoottorin ja vektorin pML2 rungon sisältävän DNA-kappaleen eristäminenB. Isolation of a DNA fragment containing the metallothionein promoter and the vector pML2 backbone
Plasmidi pMMT-neo (katso kuva 5) pilkotaan restriktioendo-nukleaaseilla Bglll ja BamHI, jolloin saadaan kaksi kappaletta, joista toinen on 4,5 kiloemäsparin suuruinen ja sisältää MMT-promoottorin ja pML2-vektorin rungon, ja toinen 2,15 kiloemäsparin suuruinen, ja se sisältää sv-PAS-t-alu-eeseen kytkeytyneen neo-geenin. Jotta itsestään ligatoitu-minen voitaisiin estää, lineaarinen DNA käsitellään alkali-sella fosfataasilla 100 mikrolitran kokonaistilavuudessa, joka sisältää 25 yg DNA-kappaletta ja 28 yksikköä alkalista fosfataasia. Seosta inkuboidaan 20 minuuttia 37 °C:n lämpötilassa, ja reaktio pysäytetään lisäämällä 10 yl 50 mM EDTA-liuosta ja kuumentamalla 10 minuuttia 68 °C:n lämpötilassa. Kappaleet erotetaan elektroforeettisesti 0,8 % agaroosigeeliä käyttäen. 4,5 kiloemäsparin kappale elu-oidaan sähköisesti geeliltä kuvatulla tavalla, ja se puhdistetaan uuttamalla kahdesti fenolin ja kloroformin seoksella, kahdesti kloroformilla ja saostamalla kahdesti etanolilla. Kasautunut DNA suspendoidaan uudestaan 20 mikro-litraan 10 mM Tris-puskuria, pH 8,0.Plasmid pMMT-neo (see Figure 5) is digested with restriction endonucleases BglII and BamHI to give two fragments, one of 4.5 kilobase pairs containing the MMT promoter and pML2 vector backbone and the other of 2.15 kilobase pairs, and it contains a neo gene linked to the sv-PAS-t region. To prevent self-ligation, the linear DNA is treated with alkaline phosphatase in a total volume of 100 microliters containing 25 ug of DNA and 28 units of alkaline phosphatase. The mixture is incubated for 20 minutes at 37 ° C, and the reaction is stopped by adding 10 μl of 50 mM EDTA solution and heating for 10 minutes at 68 ° C. The pieces are separated electrophoretically using a 0.8% agarose gel. The 4.5 kilobase pair body is electrically eluted from the gel as described and is purified by extraction twice with a mixture of phenol and chloroform, twice with chloroform and precipitation twice with ethanol. The accumulated DNA is resuspended in 20 microliters of 10 mM Tris buffer, pH 8.0.
C. Edellä kohdissa A ja B eristettyjen DNA-kappaleiden ligaatioC. Ligation of DNA fragments isolated in A and B above
Edellä kohdassa A eristettyä 5,6 kiloemäsparin suuruista kappaletta otetaan 1,5 mikrogramman suuruinen määrä ja se sekoitetaan 0,3 mikrogrammaan edellä kohdassa B eristettyä kappaletta 10 mikrolitran kokonaistilavuudessa, joka sisältää 0,9 yksikköä T4 DNA-ligaasia ja 1 x ligaatiopuskuria, sekä 100 mM ATP:tä. Seosta inkuboidaan 1 tunti 15 °C:n lämpötilassa ja yön yli 4 °C:n lämpötilassa. Tämän jälkeen ligaatioseos viedään bakteerikantaan HB101 käyttäen mene 104 95726 telmää, joka kuvataan osassa Materiaalit ja menetelmät. Transformaatioseoksesta saatuja soluja levitetään ampi-silliinia sisältäville LB-agarmaljoille, ja eristetyistä pesäkkeistä seulotaan ne, jotka sisältävät 10,1 kiloemäs-parin suuruisia, restriktioendonukleaasilla BamHI lineaariseksi tehtävissä olevia plasmideja. Suuntautuminen määritetään entsyymillä EcoRI pilkkomalla. Plasmideista, jotka sisältävät istutteen oikealla tavalla suuntautuneena, saadaan kaksi EcoRI-kappaletta, jotka ovat kooltaan 3,5 kb ja 6,6 kb. Näitä plasmideja, joista käytetään nimitystä pMMT-hGH, kasvatetaan suuressa mitassa ja ne puhdistetaan kuvatulla tavalla.An aliquot of 5.6 kilobase pairs isolated in A above is taken in an amount of 1.5 micrograms and mixed with 0.3 micrograms of the aliquot isolated in B above in a total volume of 10 microliters containing 0.9 units of T4 DNA ligase and 1x ligation buffer, and 100 mM ATP. The mixture is incubated for 1 hour at 15 ° C and overnight at 4 ° C. The ligation mixture is then introduced into the bacterial strain HB101 using the procedure described in Materials and Methods. Cells from the transformation mixture are plated on LB agar plates containing ampicillin, and isolated colonies are screened for those containing 10.1 kilobase pair plasmids that can be linearized with the restriction endonuclease BamHI. Orientation is determined by EcoRI digestion. Plasmids containing the implant in the correct orientation give two EcoRI fragments of 3.5 kb and 6.6 kb in size. These plasmids, termed pMMT-hGH, are grown on a large scale and purified as described.
D. Edellä kohdassa C saadun yhdistelmä-DNA-vektorin vieminen nisäkässoluihin ja ihmisen kasvuhormonia tuottavien so-lulinjojen muodostaminen Tämän jälkeen vektori pMMT-hGH transfektoidaan eukarioot-tisiin isäntäsoluihin (nisäkässoluihin) käyttäen yhteis-transfektoinnin tavanomaisia tekniikoita, jolloin saadaan transfektantteja, jotka syntetoivat ihmisen kasvuhormonin polypeptidiä. Tällaiset transfektantit tunnistetaan RIA-tekniikalla käyttäen ihmisen kasvuhormonia vastaan vaikuttavia vastar-aineita. Ihmisen kasvuhormonia erittävistä transfektanteista muodostetaan solusukupolvi tavanomaisia tekniikoita käyttäen.D. Introduction of the Recombinant DNA Vector Obtained in C above into Mammalian Cells and Generation of Human Growth Hormone-Producing Cell Lines The vector pMMT-hGH is then transfected into eukaryotic host cells (mammalian cells) using conventional co-transfection techniques to obtain transfectants, resulting in transfection. polypeptide. Such transfectants are identified by RIA using antibodies against human growth hormone. Human growth hormone secreting transfectants are formed into a cell generation using conventional techniques.
Esimerkki 4Example 4
Rotan kasvuhormonin ilmentäminenExpression of rat growth hormone
Rotan kasvuhormonia koodaavan yhdistelmä-DNA-vektorin valmistaminen, mainitun vektorin sisältäessä metallotioneiini-promoottorin A. Restriktioendonukleaasin Bglll kohdan muuntaminen plas-midissa pMMT-neo Xhol-kohdaksi 200 mikrogramman suuruinen määrä plasmidia pMMT-neo pilkotaan 500 yksiköllä restriktioendonukleaasia Bglll keskimää 1ϋ5 95726 räisesti suolaa sisältävässä puskurissa, reaktion kokonaistilavuuden ollessa 1000 yl. 6,65 kiloemäsparin suuruisen lineaarisen plasmidi-DNA:n päät tehdään ensin tylpiksi täyttämällä Bglll-päät DNA-polymeraasilla I (Klenow-kappale) ja käyttämällä neljää dNTP-molekyyliä kuten aikaisemmin esitetään, jonka jälkeen siihen kiinnitetään re-striktioendonukleaasin XhoI tunnistamis- ja pilkkomiskoh-dan sisältävä seuraava synteettinen DNA-kytkijäkappale (yhtiöstä PL Biochemicals, Milwaukee, Wisconsin 53205): 5'-CCTCGAGG-3' 3'-GGAGCTCC-5’ Täyttämisreaktio toteutetaan 30 mikrolitran kokonaistilavuudessa, joka sisältää 2,5 yg 6,65 kiloemäsparin suuruista kappaletta, 20 mM neljää dNTP molekyyliä, 3 yl NT-pusku-ria, 1 yl Klenow-kappaletta. Seosta inkuboidaan huoneen lämpötilassa 30 minuuttia. Reaktio pysäytetään lisäämällä 2 yl 0,25 mM EDTA-liuosta ja DNA pestään kertaalleen yhtä suurella tilavuudella fenolin ja kloroformin seosta, ja sitten yhtä suurella tilavuudella pelkkää kloroformia. Ve-sifaasin sisältämä DNA puhdistetaan edelleen saostamalla kahteen kertaan etanolilla. Saostunut DNA suspendoidaan uudestaan 10 mikrolitraan 10 mM Tris-puskuria, pH 8,0, pitoisuudeksi 50 ng/yl.Preparation of a recombinant DNA vector encoding rat growth hormone, said vector containing the metallothionein promoter A. Conversion of the restriction endonuclease BglII site in the plasmid pMMT-neo XhoI to 200 micrograms in buffer, with a total reaction volume of 1000 ul. The ends of the 6.65 kilobase pair linear plasmid DNA are first blunt-ended by filling the BglII ends with DNA polymerase I (Klenow fragment) and using four dNTPs as previously described, followed by attachment of the restriction endonuclease XhoI recognition and cleavage site. -da-containing synthetic DNA linker (from PL Biochemicals, Milwaukee, Wisconsin 53205): 5'-CCTCGAGG-3 '3'-GGAGCTCC-5' The filling reaction is performed in a total volume of 30 microliters containing 2.5 μg of 6.65 kilobase pairs. pieces, 20 mM four dNTP molecules, 3 ul NT buffer, 1 ul Klenow. The mixture is incubated at room temperature for 30 minutes. The reaction is stopped by adding 2 μl of 0.25 mM EDTA solution and the DNA is washed once with an equal volume of a mixture of phenol and chloroform, and then with an equal volume of chloroform alone. The DNA contained in the aqueous phase is further purified by precipitation twice with ethanol. The precipitated DNA is resuspended in 10 microliters of 10 mM Tris buffer, pH 8.0, to a concentration of 50 ng / μl.
Kytkijäkappale liuotetaan 50 mikrolitraan 10 mM Tris-pus-kuria, pH 8,1, pitoisuudeksi 1 pikomooli/yl. Päistään tylppä 6,65 kiloemäsparin kappale ligatoidaan kytkijä-kappaleeseen 20 mikrolitran kokonaistilavuudessa, joka sisältää 2 pikomoolia kytkijäkappaletta, 0,5 yg 6,65 kiloemäsparin kappaletta, 9 yksikköä T4 DNA-ligaasia (Boehringer Mannheim), 30 yl 2 x tylpän pään ligaatiopuskuria sekä 100 mM ATP:tä. Ligaatioreaktion annetaan edetä 15 °C:n lämpötilassa tunnin ajan ja 4 °C:n lämpötilassa yön yli.The coupling body is dissolved in 50 microliters of 10 mM Tris buffer, pH 8.1, to a concentration of 1 picomol / ul. A blunt-ended 6.65 kilobase pair is ligated to the coupling body in a total volume of 20 microliters containing 2 picomoles of coupling body, 0.5 μg of 6.65 kilobase pairs, 9 units of T4 DNA ligase (Boehringer Mannheim), 30 μl of 2 blunt-head ligation bag, and 100 mM ATP. The ligation reaction is allowed to proceed at 15 ° C for one hour and at 4 ° C overnight.
Tätä ligaatioseosta käytetään bakteerikannan HB101 trans-formoimiseen, joka kanta on tehty vastaanottavaksi (compe- 1 06 95726 tent) osassa Materiaalit ja menetelmät kuvatulla tavalla. Transformaatioseoksesta saatuja soluja levitetään ampi-silliiniä sisältäville LB-agarmaljoille. Bakteeripesäkkeet^ jotka kykenevät kasvamaan ampisilliinia sisältävillä maljoilla, otetaan talteen ja kasvatetaan 2 millilitran viljelmissä ja niistä eristetään plasmidi edellä kuvatusti.This ligation mixture is used to transform a bacterial strain HB101 that has been made receptive (compe- 1 06 95726 tent) as described in Materials and Methods. Cells obtained from the transformation mixture are plated on LB agar plates containing ampicillin. Bacterial colonies capable of growing on ampicillin-containing plates are harvested and grown in 2 ml cultures and the plasmid is isolated as described above.
Todettiin, että 12 bakteeripesäkkeestä neljä (OK 3, OK 4, OK 11 ja OK 12) käsitti plasmidin, joka oli odotetun kokoinen pelkällä entsyymillä XhoI tai sekä entsyymillä BamHI että entsyymillä EcoRI pilkkomisen jälkeen. Kloonien OK 3 ja OK 11 plasmidi-DNA:n annettiin lisääntyä HB101-kannassa plasmidin tuottamiseksi suuressa mitassa.Four of the 12 bacterial colonies (OK 3, OK 4, OK 11, and OK 12) were found to comprise a plasmid of the expected size after digestion with XhoI alone or with both BamHI and EcoRI. Plasmid DNA from clones OK 3 and OK 11 was allowed to propagate in strain HB101 to produce the plasmid on a large scale.
B. Metallotioneiinipromoottorin ja pML2-vektorin rungon sisältävän DNA-kappaleen eristäminen 100 mikrogramman suuruinen määrä sekä kloonia OK 3 että kloonia OK 11 pilkottiin restriktioendonukleaaseilla BamHI ja XhoI, jolloin saatiin kaksi kappaletta, joista toinen (5,8 kb) käsitti MMT-promoottorin Xhol-pään läheisyyteen sijoittuneena ja pML2-osan BamHI-päässä, ja toinen (0,85 kb) kappale sisälsi sv-PAS-t-ketjun. Kappaleet erotettiin elektroforeettisesti 0,8 % agaroosigeelillä. 5,8 kiloemäs-parin kappale puhdistettiin sähköisesti eluoimalla, jonka jälkeen se uutettiin kahdesti fenolin ja kloroformin seoksella, uutettiin kahdesti kloroformilla ja se saos-tettiin kahdesti etanolilla. Kasautunut DNA suspendoitiin uudestaan 50 mikrolitraan 10 mM Tris-puskuria, pH 8,0.B. Isolation of a DNA fragment containing the metallothionein promoter and the backbone of the pML2 vector 100 micrograms of both clone OK 3 and clone OK 11 were digested with restriction endonucleases BamHI and XhoI to give two fragments, one of which (5.8 kb) comprised the MMT promoter XhoI. located near the end and at the BamHI end of the pML2 portion, and the second (0.85 kb) fragment contained the sv-PAS-t chain. The pieces were separated electrophoretically on a 0.8% agarose gel. The 5.8 kilobase pair was electrically purified by elution, then extracted twice with a mixture of phenol and chloroform, extracted twice with chloroform and precipitated twice with ethanol. The accumulated DNA was resuspended in 50 microliters of 10 mM Tris buffer, pH 8.0.
C. Rotan kasvuhormonin geenin sisältävän DNA-kappaleen eristäminenC. Isolation of a DNA fragment containing the rat growth hormone gene
Plasmidi pBR322.rGH, jonka sisältämä genominen BamHI-istute koodittaa rotan kasvuhormonin geeniä (vastapäivään suuntautuneena), pilkottiin entsyymeillä BamHI ja XhoI. Rakenteellisen geenin sisältävä genominen BamHI-XhoI-kap-pale eristetään edellä kuvatusti 0,8 % preparatiiviselta agaroosigeeliltä.Plasmid pBR322.rGH, which contained the genomic BamHI implant encoding the rat growth hormone gene (counterclockwise), was digested with BamHI and XhoI. The genomic BamHI-XhoI-Kap fragment containing the structural gene is isolated from a 0.8% preparative agarose gel as described above.
1 07 95726 D. Edellä kohdissa B ja C eristettyjen kappaleiden ligaatio Nämä kappaleet ligatoidaan toisiinsa siten, että MMT-pro-moottori kytkeytyy tarttuvan Xhol-pään välityksellä suoraan rakenteelliseen geeniin tarttuvan Xhol-päänsä välityksellä, oikealla tavalla suuntautuneena.1 07 95726 D. Ligation of the bodies isolated in B and C above These bodies are ligated together so that the MMT promoter is linked directly to the structural gene via its adhesive XhoI end, in the correct orientation.
Ligaatioseosta käytetään bakteerikannan HB101 tranformoin-tiin edellä esitetysti. Ampisilliinia sisältäville LB-agar-maljoille pesäkkeitä muodostavat transformantit otetaan talteen ja niitä kasvatetaan 2 millilitran viljelmissä plasmidin pienten määrien valmistamiseksi. Plasmideja, joista saadaan kaksi odotusten mukaista kappaletta entsyymeillä BamHI ja XhoI pilkottaessa, ja joista käytetään nimitystä pMMT-rGH, kasvatetaan suuressa mitassa nisäkäs-soluihin transfektointia varten.The ligation mixture is used to transform the bacterial strain HB101 as described above. Colony-forming transformants on LB agar plates containing ampicillin are harvested and grown in 2 ml cultures to prepare small amounts of plasmid. Plasmids yielding the two expected fragments by digestion with BamHI and XhoI, termed pMMT-rGH, are grown on a large scale in mammalian cells for transfection.
E. Edellä kohdassa D saadun yhdistelmä-DNA-vektorin vieminen nisäkässoluihin ja rotan kasvuhormonia tuottavien solulinjojen muodostaminen Tämän jälkeen vektori pMMT-rGH transfektoidaan eukariootti-siin isäntäsoluihin (nisäkässoluihin) yhteistransfektoin-nissa tavanomaisesti käytettävillä tekniikoilla, jolloin saadaan transfektantteja, jotka syntetoivat rotan kasvuhormonin polypeptidiä. Tällaiset transfektantit tunnistetaan RIA-tekniikalla käyttäen rotan kasvuhormonia vastaan vaikuttavia vasta-aineita'. Rotan kasvuhormonia erittävistä transfektanteista muodostetaan solulinja tavanomaisia tekniikoita käyttäen.E. Introduction of the Recombinant DNA Vector Obtained in D above into Mammalian Cells and Generation of Rat Growth Hormone-Producing Cell Lines Such transfectants are identified by RIA using antibodies against rat growth hormone. Rat growth hormone secreting transfectants are formed into a cell line using conventional techniques.
Vaikka tämä keksintö onkin kuvattu edullisten suoritusmuoto jensa avulla, niin kuitenkin alan asiantuntijalle on selvää, että keksintöön voidaan tehdä muodollisia ja yksityiskohtaisia muutoksia kuitenkaan poikkeamatta keksinnön • hengestä ja tavoitteista.Although the present invention has been described in terms of its preferred embodiments, it will be apparent to those skilled in the art that formal and detailed changes may be made therein without departing from the spirit and scope of the invention.
Claims (8)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FI914267A FI95726C (en) | 1985-04-15 | 1991-09-10 | Diagnostic methods and kits using recombinant hepatitis B virus surface antigen |
Applications Claiming Priority (8)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP85104521 | 1985-04-15 | ||
EP85104521 | 1985-04-15 | ||
US85056786A | 1986-04-11 | 1986-04-11 | |
US85056786 | 1986-04-11 | ||
FI861559 | 1986-04-14 | ||
FI861559A FI95045C (en) | 1985-04-15 | 1986-04-14 | A method for producing a protein comprising the proteins encoded by the coding region of the PreS1-PreS2-S protein of the hepatitis B virus surface antigen, and the recombinant DNA vectors and contaminants and mammalian cells used in the method |
FI914267 | 1991-09-10 | ||
FI914267A FI95726C (en) | 1985-04-15 | 1991-09-10 | Diagnostic methods and kits using recombinant hepatitis B virus surface antigen |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
FI914267A0 FI914267A0 (en) | 1991-09-10 |
FI95726B true FI95726B (en) | 1995-11-30 |
FI95726C FI95726C (en) | 1996-03-11 |
Family
ID=27440800
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
FI914267A FI95726C (en) | 1985-04-15 | 1991-09-10 | Diagnostic methods and kits using recombinant hepatitis B virus surface antigen |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
FI (1) | FI95726C (en) |
-
1991
- 1991-09-10 FI FI914267A patent/FI95726C/en active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
FI914267A0 (en) | 1991-09-10 |
FI95726C (en) | 1996-03-11 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP0198474B1 (en) | Hepatitis B surface antigen formed by recombinant DNA techniques, vaccines, diagnostics, cell lines and methods of forming same | |
US4710463A (en) | Recombinant DNA molecules capable of expressing HBV core and surface antigens | |
JPS62502704A (en) | Protein antigens with conformation-independent and conformation-dependent determinants | |
AU652851B2 (en) | Hepatitis C virus from C-100-3 and env/core regions | |
AU594642B2 (en) | A sv40 expression vector containing hbxag as an expression marker | |
AU617292B2 (en) | T and b cell epitopes of the pre-s region of hepatitis b virus surface antigen | |
NZ204952A (en) | Hepatitis b virus vaccine | |
EP0182442A2 (en) | Recombinant DNA molecules and their method of production | |
WO1988006185A1 (en) | Retroviral expression vectors and methods for producing hbv antigens | |
FI95726B (en) | Diagnostic processes and determination series which use hepatitis B virus surface antigens which have been prepared by recombinant DNA technology | |
FI95045C (en) | A method for producing a protein comprising the proteins encoded by the coding region of the PreS1-PreS2-S protein of the hepatitis B virus surface antigen, and the recombinant DNA vectors and contaminants and mammalian cells used in the method | |
FI101966B (en) | Antigenic, synthetic polypeptide and its use in diagnostics | |
US6268122B1 (en) | Recombinant DNA molecules and their method of production | |
CA1340934C (en) | Hepatitis b surface antigen formed by recombinant dna techniques, vaccines, diagnostics, cell lines and method of forming same | |
Howard | The nature of the hepatitis B virus and its mode of replication | |
EP0542753A1 (en) | Epitopes of the pre-s region of hepatitis b virus surface antigen | |
CA1341644C (en) | Recombinant dna molecules and their method of production | |
Yang et al. | Expression and characterization of hepatitis C virus core protein fused to hepatitis B virus core antigen | |
Howard | The Nature of the Hepatitis B Virus and its Mode of Replication | |
Persing | Identification and characterization of the presurface proteins of hepatitis B virus |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
BB | Publication of examined application |