KR930012107B1 - 한국형 c형 간염 바이러스의 특이 항원인 khcv 403 단백질의 정제방법 - Google Patents

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Description

한국형 C형 간염 바이러스의 특이 항원인 KHCV 403 단백질의 정제방법

제1도는 본 발명에 따른 정제과정중 각 단계에서 얻어지는 조생성물을 SDS-폴리아크릴 아마이드젤 전기영동한 결과를 나타낸 것이며,

제2도는 본 발명에 따른 정제과정중 각 단계에서 얻어지는 조생성물을 SDS-폴리아크릴 아마이드 젤 전기영동하고, 이를 한국형 C형 간염 환자의 혈청에서 분리한 면역글로불린 G(IG G)를 이용하여 웨스턴-블롯팅한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 유전자 재조합 효모에서 생성된 한국형 C형 간염 바이러스의 특이 항원인 KHCV 403 단백질을 정제하는 방법에 관한 것이다.

일반적으로 바이러스성 간염은 A형, B형 간염 바이러스, 델타 바이러스(HDV), 사이토매갈로 바이러스(CMV) 및 엡스틴바 바이러스(EBV)에 의해 발병되는 것으로 알려져 왔으며, 1980년대에 그 유전자들이 규명됨으로써 진단시약들과 백신들이 개발되어 이러한 질병의 진단과 예방에 큰 진전이 있었다.

그러나 상기한 간염과는 다른 비 A 비 B형 간염(NANBH) 혹은 C형 간염이라고 불리우는 간염 환자들이 수혈 후 발병한 간염 환자의 80 내지 90%를 차지하는 것으로 밝혀졌다. [Alter, H. J., , 838-841(1975)]. 또한, 딘스타그의 보고에 의하면, C형 간염 환자의 반수 정도가 만성 간염으로 발전하고 그중 약 20% 정도가 간경화증(cirrhosis)에 이어 간암으로까지 진전되었으며, 이 점이 C형 간염의 가장 큰 문제점이 지적되었다.[Dienstag, J. L. and Alter, H. J., 6, 67-81(1986)].

사람의 C형 간염 바이러스가 침팬지에게 감염될 수 있다는 사실이 밝혀진 후[Alter, H. J. 459-463(1978); Tabor, E. 463-466(1978)], 브래들리(Bradley)등은 C형 간염 환자의 혈장을 침팬지에 감염시켜 이로부터 간염에 감염된 혈청을 대량확보하여 바이러스의 분리 및 회수 방법을 확립하였고[Bradley, D. W. 773- 779(1985)], 츄(Choo)등이 상기한 방법을 이용하여 C형 간염 바이러스를 다량 확보한 뒤 바이러스의 전 핵산을 추출하여 부분적인 cDNA를 클로닝하고, 그 유전자의 크기는 약 10,000개의 염기로 이루어져 추정하였다.[359-362(1989)].

쿠오(Kuo)등은 부분적인 유전자의 절편을 대장균에 클로닝한 후 발현시켜 재조합 바이러스 단백질을 만들었으며, 부분적인 2개의 비구조 유전자(NS 3/NS 4)로 부터 발현시킨 재조합 바이러스 항원인 C-100이 C형 간염 환자의 혈청과 반응함을 증명하였고, 특히 수혈성 간염 환자의 70% 이상이 C-100에 대한 항체를 보유하고 있음을 밝혔다.(Kuo., G. 362-364(1989).

그런데, 최근에 C형 간염 환자의 혈청이 RNA 분석에 있어서는 양성으로 나타나 실제로 C형 간염 환자이지만 C-100을 항원으로 사용한 진단에서는 음성으로 나타날 가능성이 있다는 것이 보고되었다.[Kaneko, s,976(1990); Muraiso, K, 511-159(1990)].

또한 C-100를 사용한 전단에서는 음성으로 나타난 상당수의 C형 간염 환자의 혈청이 5'-말단에 위치한 구조 유전자중의 하나인 코아(Core) 단백질를 항원으로 사용한 분석에서의 양성으로 나타난다는 사실이 발표된 바 있다.[Muraiso, K 511-516(1990)].

한편, 일본의 연구팀은 C형 간염으로 진단된 일본인의 혈청으로부터 부분 cDNA를 클로닝하였고[Takeuchi, K.4626(1990)], 그 염기서열이 침팬지형의 C형 간염 바이러스의 염기서열과 약 85% 정도의 유사성이 있고, 아미노산 서열에 있어서는 약 90% 정도의 유사성이 있음을 밝혔다[Kubo, Y.,10367-10372(1989); Kato. N. B. 219-223(1989); Kaneko, S.976(1990)참조].

본 출원인은 상기의 사실을 바탕으로 C형 간염 증세로 진단된 한국인 환자의 혈액으로 부터 C형 간염 바이러스 입자를 분리하여 그 염기서열이 미국형과는 20 내지 30% 다른 고유한 한국형 C형 간염 바이러스의 존재를 규명하여 대한민국 특허출원 제91-9510호로 특허 출원한 바 있고, 이에 따라 진단시약 및 백신 개발에 요구되는 한국형 C형 간염 바이러스에 대한 유전자를 효모, 박테리아 및 동물세포 등에서 발현시킬 수 있게 되었다.

특히, 본 출원이에 의해 규명된 것들중 하나인 KHCV 403 cDNA(본 출원인의 선출원 제91-9510호 참조)를 발현시키는데 있어, 발현체로서 효모를 사용하고 KHCV 403 cDNA 앞에 유비퀴틴과 유전자를 접합시키게 되면, 이후의 발현과정을 거쳐 생산되는 KHCV 403 단백질은 초기에 유비퀴틴 융합된 상태로 생성되거나 유비퀴틴이 즉시 유비퀴티네이즈에 의해 떨어져 나가게 되어, N-말단의 메틴오닌에 제거된 형태의 KHCV 403 단백질을 직접 얻을 수 있으므로 따로 메티오닌을 제거하는 공정을 필요로 하지 않으며, 이러한 발현 시스템을 1991년 8월 6일자 대한민국 특허출원 제91-13602호로 출원하였다.

본 발명자들은 상기 효모에서 발현된 KHCV 403 항원을 정제하는데 있어서 기존의 단백질 정제방법을 사용해 본 결과, 원심분리 방법, 컬럼 크로마토그래피 방법 등은 불용성 상태로 발현된 단백질을 정제하는데 적용하기에는 어려움이 많고, 또 종래의 C형 간염 바이러스 단백질을 정제하는데 사용하던 방법으로서 SDS를 함유한 완충액을 이용한 용출법이나 6M 우레아 존재하의 용출 및 컬럼 크로마토그래피를 이용한 방법 등은 절차가 복잡하고 완제품의 순도가 약 80% 정도로 낮다는 문제점이 있었다(국제특허 출원공개 제WO 89/04669호 참조).

이에 본 발명에서는 상기 문제점을 해결하고자, 연구 노력한 결과 유전자 재조합 효모 세포로부터 세포파괴와 가용성 단백질의 제거, 우레아를 사용한 침전 단백질의 용해, 이온교환 크로마토그래피 및 FPLC(Fast Protein, Peptide and Polynucleotide Chromatography)의 단계를 거쳐, 고순도의 한국형 C형 간염 바이러스의 특이 항원인 KHCV 403 단백질을 대량 정제할 수 있는 방법을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 한국형 HCV 항체에 대한 특이도가 기존의 미국형 또는 일본형 HCV의 항원보다 더 높은 KHCV 403 특이 항원을 고순도로 대량 정제할 수 있는 정제방법을 제공하는데 있다.

즉, 본 발명은 유전자 재조합 효모로부터 단백질을 정제하는데 있어서, (가) 한국형 C형 간염 바이러스의 KHCV 403 cDNA와 유비퀴틴 유전자가 발현되어 있는 효모세포를 파괴한 후 용해된 상태의 물질을 제거하고; (나) 상기 단계(가)에서 얻어진 세포 침전물을 8M 우레아로 용해시켜 침전된 물질을 제거하고; (다) 상기 단계(나)에서 얻어진 단백질 용액을 이온교환 크로마토그래피하고; (라) 상기 단계(다)에서 수집한 단백질 분획을 FPLC하는 것을 특징으로 하는 KHCV 403 항원 단백질의 정제방법을 제공하는 것이다.

이와 같은 본 발명의 정제방법을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명에 따른 정제과정에 앞서, 먼저 대한민국 특허출원 제91-9510호의 제9도에 개시되어 있는 바와 같은 한국형 C형 간염 바이러스와 KHCV 403 cDNA와 유비퀴틴(Bachmair, A. and Varshavsky, A.91-96(1988)의 유전자를 포함하는 재조합 효모를 본 출원인의 1991년 8월 6일자 대한민국 특허출원 제91-13602호에 따라 제조하여 준비한 후, 이를 적당한 배지에서 배양하여 상기 KHCV 403 cDNA와 유비퀴틴 유전자를 발현시켜서 KHCV UV 403 단백질을 생산한다. 이때 KHCV UB 403 융합 단백질을 효모 세포내에서 유비퀴틴이 유비퀴티네이즈에 의해 KHCV 403 단백질로부터 떨어져 나가 KHCV 403 단백질로 전환되게 된다.

그런 다음, 배양액을 원심분리하여 효모세포를 침전시킨 후 이 세포를 완충액(50mM 트리스 5mM EDTA, 10mM β-머캅토에탄올, 1mM 페닐메틸설포닐플루오라이드, 1μg/m1 펩스타딘, pH 8.5)에 현탁시키고 직경 0.4mm의 유리구슬을 50%(v/v)의 비율로 첨가하여 균질분쇄기로 세포막을 파괴시켜 효모 균질액을 얻는다.

이때 상기에서 얻어진 효모세포 균질액의 일부를 램리의 방법[Laemmli,680(1970)]에 따라 소듐도데실설페이트(SDS : Sodium Dodecyl Sulfate)의 존재하에 폴리아크릴아미드 젤에서 전기영동하고, 분리된 단백질을 타우빈(Towbin)등의 방법[4350-4354(1979)]에 따라 니트로셀룰로스필터로 옮긴 후, 이 필터를 C형 감염에 감염된 한국인 환자의 혈청으로부터 분리한 면역글불린을 이용하여 웨스텐-블롯팅(Western blotting)하여서 KHCV 403 항원 단백질의 존재를 확인한다. 그 결과, 재조합 효모에서 발현시킨 분자량 17,000달톤 정도의 KHCV 403 단백질이 C형 간염에 간염된 사람의 혈청과 면역학적으로 특이하게 반응하여 C형 간염 바이러스의 특이 항원이라는 것을 확인할 수 있다.

그런 다음, 상기에서 수득한 효모 균질액을 원심분리기로 원심분리하에 용해된 상태의 단백질을 제거하고 불용성 침전물을 얻는다.

이어서, 이 침전물을 8M 우레아를 함유하는 완충액으로 용해시킨 후 원심분리기를 거쳐 불용성 물질을 제거하고 상등액만을 얻는다. 이 상등액을 약 2M 우레아를 함유한 완충액으로 투석하여 우레아 농도를 낮춘 후 이를 원심분리하여 침전물을 제거하고 순도가 증가된 KHCV 403 단백질 용액을 얻는다.

이렇게 얻어진 단백질 용액, 즉 상기에서 얻어진 상등액을 동일 완충액으로 평형시킨 DEAE(diethylaminoethyl)-세파로스 컬럼에 통과시켜 크로마토그래피하고, 염화나트륨을 함유하는 완충액으로 용출시켜 분리되는 용액을 수집한다.

이어서, 상기에서 수집한 단백질용액을 우레아를 함유하지 않는 완충액으로 투석시켜서 우레아를 제거한 다음, 동일 완충액으로 평형시킨 DEAE-세파로스 컬럼에 통과시켜 재 크로마토그래피하고, 염화나트륨 농도구배를 준 완충액으로 용출시킨다. 각 분획들을 소듐도데실설페이트-폴리아크릴 아마이드 젤 전기영동(SDS-PAGE)으로 확인한 후 KHCV 403 단백질을 포함하는 특정 분획만을 별도로 수집한다.

그런 다음, 상기에서 수집한 단백질 용액을 염화나트륨을 함유하는 완충액으로 투석시킨 후, 동일 완충액으로 평형시킨 FPLC-페닐 컬럼에 통과시켜 크로마토그래피하고, 염화 나트륨 농도구배를 준 완충액으로 용출시킨다. 각 분획들을 SDS-PAGE로 확인한 후 고순도의 KHCV 403 단백질을 포함하는 분획을 수집함으로써, 유전자 재조합 효모 세포로 부터 고순도의 한국형 C형 간염 바이러스의 특이 항원인 KHCV 403항원을 대량으로 추출 정제할 수가 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의거하여 상세히 설명하면 다음과 같다. 하기의 실시예들은 본 발명을 예시한 것으로서 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다

[실시예 1]

유전자 재조합 효모 세포의 배양

한국형 C형 간염 바이러스의 특이 항원인 KHCV 403 cDNA와 유비퀴틴 유전자를 포함하는 벡터(pYLBC-A/G-UB-KHCV 403, 본 출원인은 1991년 8월 16일자 대한민국 특허출원 제91-13602호 참조)에 의해 형질전환된 효모 세포(Saccharomyces cerevisiaeDC04-UB-KHCV 403, pYLBC-A/G-UG-KHCV 403, ATCC 74079, 1991년 7월 1일자로 미합중국 종균협회(ATCC)에 기탁, 본 출원인의 1991년 8월 6일자 대한민국 특허출원 제91-13602호 참조)를 4% 포도당이 첨가된 루이신 결핍 배지(0.67% 아미노산이 없는 효모 질소기질, 5% 글루코스, 루이신 결핍된 아미노산 혼합물 0.25g)에서 배양한 다음, 2%의 포도당을 함유하는 100ml YEPD 배지(2% 펩틴, 1% 효모추출물, 2% 글루코스)로 옮겨 30℃에서 약 6시간동안 진탕배양하여서 발효를 위한 종자균을 얻었다.

14ℓ 용량의 발효조(Bench Top Fermentor : NBS사, U. S. A)에 10ℓ의 YEPD(2% 포도당) 배지를 채우고 상기 종균 배양액을 접종한 다음, 250rpm의 진탕속도 및 30℃의 온도조건에서 약 48시간동안 진탕배양하였다. 배양액을 원심분리기(Beckman J-6B, Rotro H.S 4.2)를 사용하여 2500rpm의 속도로 20분간 원심분리하여 재조합 효모 세포 침전물을 얻었다.

[실시예 2]

효모세포의 파괴

상기 실시예 1에서 얻어진 재조합 효모 세포침전물을 500ml의 완충액(50mM 트리스 6mM EDTA, 10mM β-머캅토 에탄올, 1mM 페닐메틸설포닐플루오라이드, 1μg/ml 펩스타틴, pH 8.5)에 현탁시킨 다음, 직경 0.4mm의 유리구슬을 총 부피의 50%(v/v)까지 첨가하고 균질분쇄기로 4℃의 온도에서 5분간 분쇄하여서 세포막을 파괴시켰다. 파괴된 세포액을 여과막(Whatman, 3MM, U. S. A)을 이용하여 진공 여과시켜서 유리구슬을 제거하고효모 균질액을 얻었다.

[실시예 3]

특이 항원 단백질의 확인

상기 실시예 2에서 얻어진 효모 균질액중 소량을 15% SDS-폴리아크릴 아마이드 젤에서 전기영동하고, 여기서 유비퀴틴이 세포내에서 단리되고 KHCV 403 단백질은 약 17,000달톤(dalton) 정도의 크기로 생성됨을 확인하였다.

그런 다음, 젤상으로 부터 분리된 단백질을 니트로셀룰로스 필터로 전달(blot)시킨 다음, 이 필터를 0.2% 트윈-20이 함유된 인산염수완충액(PBS : 10mM 인산 0.15M NaCl, pH 7.0)에 넣고 상온에서 2시간동안 약하게 흔들어 주어 단백질에 하기 면역 글로불린 G가 비특이적으로 결합되는 것을 차단(blocking)하였다. 이어서, 0.5% 젤라틴과 0.05% 트윈 20을 함유하는 PBS에 한국인 C형 간염 환자의 혈청으로 부터 분리한 면역글로불린 G(8.2mg/ml)를 1/200(v/v)로 희석시켜 첨가하고 상온에서 1시간 동안 약하게 흔들면서 반응시킨 다음, 0.2% 트윈-20을 함유한 PBS로 5분씩 4회 세척하였다. 이 필터에 0.5% 젤라틴과 0.05% 트윈-20을 함유하는 PBS로 양고추냉이 퍼옥시다제(horseradish peroxid ase)로 표지된 항-사람 면역글로불린 G(Bio-Rad La., Goat Anti-Human IgG-HRP)을 1/200(v/v)로 희석시켜 첨가한 다음, 상온에서 1시간동안 약하게 흔들면서 반응시켰다. 이 필터를 0.2% 트윈 20을 함유하는 PBS로 5분씩 4회 세척하고, 50mM 트리스 완충액(pH 7.0)으로 2회 세척한 다음, 400μg/ml 4-클로로-1-나프톨과 0.03% 과산화수소수가 함유된 50mM 트리스완충액(pH 7.0)을 첨가하여 발색시켰다. 제2 도에서 보이는 바와 같이 총 효모균질액 중에서 KHCV 403 단백질만이 C형 간염 환자의 혈청과 면역학적으로 반응하여 가시적 밴드로 나타났다. 이 웨스턴-블롯팅의 결과를 통해, 생성된 KHCV 403 단백질이 C형 간염 바이러스의 특이 항원임을 확인하였다.

[실시예 4]

용해된 단백질의 제거

상기 실시예 2에서 얻어진 효모균질액을 11,000rpm에서 원심분리 (Beckman J2-21, Rotor JA 14 이용)하여 상등액을 제거하고 KHCV 403 단백질을 포함하는 불용성 침전물을 얻었다.

[실시예 5]

8M 우레아를 사용한 침전물의 용해와 우레아 분별분획

상기 실시예 4에서 얻어진 침전물을 8M 우레아가 함유된 완충액(50mM 트리스 5mM EDTA, 10mM β-머캅토에탄올, 1mM 페닐메틸 설포닐플루오라이드, 1μg/ml 펩스타딘, pH 8.5) 750ml에 용해시킨 다음, 원심분리하여 용해되지 않은 침전물을 제거하고 상등액만을 취하였다. 이 상등액을 2M 우레아가 포함된 완충액(10mM 트리스 2mM EDTA, 5mM β-머캅토에탄올, pH 9.0)으로 투석시킨뒤, 원심분리하여 침전물을 제거하고 KHCV 403 단백질이 함유된 상등액만을 얻었다.

[실시예 6]

1차 DEAE-이온 교환 크로마토크래피

상기 실시예 5에서 얻어진 상등액을 2M 우레아가 함유된 완충액(10mM 트리스 2mM EDTA, 5mM β-머캅토에탄올, pH 9.0)으로 평형시킨 DEAE-세파로즈 컬럼(Pharmacia, FF, 5cm×15cm, U.S.A)에 통과시킨 후, 결합된 단백질에 0.2M 염화나트륨을 함유하는 동일 완충액(10mM 트리스 2mM EDTA, 5mM β-머캅토에탄올, pH 9.0) 750ml를 가하여 분리되는 단백질 분획을 수집하였다.

[실시예 7]

2차 DEAE 이온 교환 크로마토그래피

상기 실시예 6에서 수집된 단백질분획을 완충액(10mM 트리스 2mM EDTA, 5mM β-머캅토에탄올, pH 9.0)으로 투석시켜 우레아를 제거한 다음 동일 완충액으로 평형시킨 DEAE-세파로즈 컬럼에 통과시켰다. 0.1M 염화나트륨을 함유하는 완충액(10mM 트리스 2Mm EDTA, 4mM β-머캅토에탄올, pH 9.0)을 가하여 분리되는 단백질을 제거한 다음, 염화나트륨을 0.1M 내지 0.2M 농도 구배로 갖는 완충액(10mM 트리스 2mM DETA, 5mM β-머캅토 에탄올, pH 9.0) 500ml를 가하여 분리되는 단백질 분획들을 얻었다. 이 분획들을 SDS-PAGE한 다음 고순도의 KHCV 403 단백질을 포함하는 특정분획을 수집하였다.

[실시예 8]

FPLC-페닐 크로마토그래피

상기 실시예 7에서 수집한 단백질 용액을 1.5M 염화나트륨을 함유하는 완충액(50mM 트리스 2mM EDTA, 5mM β-머캅토 에탄올, pH 7.4)으로 투석시킨 다음, 동일 완충액으로 평형시킨 FPLC-페닐 세파로스 컬럼(Pharmacia, HR 10/10, 1cm×8cm, U.S.A)에 통과시키고 염화나트륨을 0 내지 1.5M의 농도구배로 갖는 완충액(50mM 트리스 2mM EDTA, 5mM β-머캅토에탄올, pH 7.4) 160ml을 가하여 분리되는 분획을 얻었다. 이들 분획들을 SDS-PAGE하여 순도를 확인하고, 이로부터 고순도의 KHCV 403 단백질을 포함하는 특정분획을 별도로 수집하여 95% 이상의 순도를 가진 KHCV 403 단백질을 얻었다.

이상의 정제과정중 각 단계에서 얻어지는 조생성물들을 SDS-PAGE하여 그 결과를 제1 도에 나타내었다. 제1도에서 제1열은 표준단백질 분자량으로서 위로부터 각각 72,43,29,18,14킬로달톤을 나타내며, 제2열은 표준 세포 단백질을 나타내고, 제3 열은 상기 실시예 2에서 얻어진 재조합 효모 세포 파괴후의 전체균질액이며, 제4 열은 상기 실시예 5에서 8M 우레아에 용해시킨 후 용해된 단밸질만을 전개한 것이고, 제5 열은 상기 실시예 6에서 1차 DEAE-이온 교환 크로마토그래피한후 수집한 용액이며, 제6 열은 상기 실시예 7에서 2차 DEAE-이온 교환 크로마토그래피 한 수집한 용액이고, 제7 열은 상기 실시예 8에서 FPLC-페닐 크로마토그래피한 후 정제된 KHCV 403 단백질이다.

제1 도로부터 KHCV 403 항원이 정제되는 과정을 확인할 수 있었으며 최종적으로 FPLC-페닐 크로마토그래피한 후 KHCV 403 단백질의 순도가 95% 이상으로 매우 높음을 알 수 있었다.

또한, 정제과정중 각 단계에서 얻어지는 조생성물들을 SDS-PAGE한 상기 젤을 한국인 C형 간염 환자의 혈청으로 웨스턴 블롯팅하여 제2도에서 나타내었다. 제2도로부터 상기의 방법을 이용하여 정제한 KHCV 403 단백질이 한국형 C형 간염의 특이 항원임을 확인할 수 있었다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 유전자 재조합 효모에서 발현된 한국인 C형 간염 바이러스의 특이 항원인 KHCV 403 항원을 대량 정제할 수 있을 뿐 아니라, 한국형 C형 간염 바이러스 항체에 대한 면역학적인 특이성이 기존의 다른 C형 간염 바이러스 항원들보다 더 높은 항원을 제공함으로써 보다 더 정확하게 한국인 C형 간염 환자에 대한 진단이 가능하게 되었다.

Claims (4)

1. 유전자 재조합 효모로 부터 단백질을 정제하는데 있어서, (가) 한국형 C형 간염 바이러스의 KHCV 403 cDNA와 유비퀴틴 유전자가 발현된 효모세포를 파괴시키고 용해된 상태의 물질을 제거하고; (나)상기 (가)에서 얻어진 세포 침전물을 6 내지 8M 우레아가 함유된 완충액에 용해시켜 침전된 물질을 제거하고; (다) 상기 단계(나)에서 얻어진 단백질 용액을 음이온 교환 크로마토그래피하여 KHCV 403 단백질을 흡착한 후 0 내지 0.2M 염화나트륨 완충액으로 용출시키고; (라) 상기 단계(다)에서 얻어진 단백질 분획을 2차로 음이온 교환 크로마토그래피하여 KHCV 403 단백질을 흡착한 후 0.1 내지 0.2M 염화나트륨 완충액으로 용출시키고, (마) 상기 단계(라)에서 수집한 단백질 분획율 FPLC(Fast Protein, P-eptide and Polynucleotide Liquid Chromatography)하여 0.1 내지 1.5M 염화나트륨 완충액으로 용출시켜 고순도의 KHCV 403 단백질을 수득하는 것을 특징으로 하는, 한국형 C형 간염 바이러스의 특이 항원인 KHCV 403 단백질의 정제방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 단계(나)에서 2M 우레아가 함유된 완충액으로 투석시키는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 단계(다) 및 (라)이 이온 교환 크로마토그래피로서 DEAE(디에틸아미노에틸)-세파로즈 컬럼을 사용함을 특징으로 하는 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 단계(라)의 FPLC에서 FPLC-페닐 세파로스 컬럼을 사용하며, pH 7.4의 트리스 완충액을 사용함을 특징으로 하는 방법.