KR100305192B1 - 유전자재조합대장균으로부터한국형씨(c)형간염바이러스의특이항원인케이에이치씨브이유비엔에스51.2(khcvubns51.2)단백질의정제방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 유전자 재조합 대장균에 의해 생산된 한국형 C형 간염 바이러스(KHCV)의 특이항원인 KHCV UB NS5 1.2 단백질의 정제에 있어서, 재조합 대장균 세포의 파괴, 가용성 단백질의 제거, 트리톤 X-100을 이용한 불용성 침전물의 세척, 우레아를 이용한 침전 단백질의 용해, DEAE 세파로스 이온교환 크로마토그래피, S-300 겔 투과 크로마토그래피, 우레아의 제거 및 EPLC-페닐 수퍼로즈 크로마토그래피를 거쳐 고순도의 UB NS5 1.2 단백질을 대량으로 얻을 수 있는 정제방법에 관한 것이다.

Description

유전자 재조합 대장균으로부터 한국형 C형 간염 바이러스의 특이항원인 KHCV UB NS5 1.2 단백질의 정제방법

제1도는 본 발명에 따라 유전자 재조합 대장균으로 부터 KHCV UB NS5 1.2 단백질을 정제하는 과정의 개요를 도시한 것이고,

제2도는 본 발명에 따른 정제 과정 중 각 단계에서 얻어지는 조생성물들 및 최종 정제된 KHCV UB NS5 1.2 단백질을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동한 결과를 나타낸 것이며,

제3도는 KHCV UB NS5 1.2 단백질이 발현된 대장균 세포의 총 균질액과 본 발명에 따른 정제과정 중 각 단계에서 얻어지는 조생성물들 및 최종 정제된 KHCV UB NS5 1.2 단백질을 한국형 C형 간염 환자의 혈청을 사용하여 웨스턴 블롯팅한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 유전자 재조합 대장균에 의해 생산된 한국형 C형 간염 바이러스(KHCV)의 특이항원인 KHCV UB NS5 1.2 단백질의 정제방법에 관한 것이다.

바이러스성 간염은 간염 바이러스의 감염에 의해 발생되는 간 질환으로서 지금까지는 A형 간염 바이러스(HAV), B형 간염 바이러스(HBV), 델타 간염 바이러스(HDV), 사이토 메갈로 바이러스(CMV) 및 엡스틴 바 바이러스(EBV) 등이 그의 주된 발병체로서 단리 및 확인되었다. 그러나 최근에는 상기한 바이러스들에 의한 감염외의 요소로 인해 발생된 간염 환자들이 있음이 보고되었다.

비 A 비 B 형 간염(이하 NANBH)으로 명명된 이 간염은 물 및 식품을 통하여 전염되는 것과 혈액을 통하여 전염되는 것으로 분류되며 수혈로 인해 발병되는 간염의 90%가 NANBH로 알려져 있다(Alter, H.J. et al., Lancet 2, 838-841(1975)). 더 나아가 헌혈자의 1-6%가 NANBH 바이러스 보균자로 간주되며 감염 환자의 약 40-5O%가 만성 간염으로 발전하고 또 그중 약 20% 정도가 간 경변 및 간암으로까지 진전되므로(Dienstag, J.L. 및 Alter, H.J., Semin. Liver Dis. 6, 67-81(1986)) 특히 위험한 간염으로 간주된다. 따라서 NANBH 바이러스 및 그에 의해 감염된 혈액 또는 혈액생성물을 진단하고 확인하기 위해서는 보다 민감하고 특이적인 방법이 필요하게 되었다.

그러나 바이러스 항원 및 항체를 검출하기 위해 기존에 사용되어 온 아가-겔 확산법, 카운터 면역 전기영동법, 면역 형광 현미경 검사법, 면역 전자 현미경 사진법, 방사선 면역 측정법 및 효소-결합 면역 흡착 측정법 등은 NANBH에 대한 진단방법으로 사용하기에는 그 특이성과 재생가능성이 불충분한데, 그 이유는 비특이적인 단백질 상호작용과 자기면역반응 및 NANBH 이외의 질병에 따른 류마티스성 인자 유사물질 등이 같이 검출되기 때문이다.

따라서 NANBH의 전파의 방지 및 진단 그리고 백신과 면역치료제 등의 개 발에 필수적으로 요구되는 NANBH 바이러스에 대한 동정 및 분리를 위한 각종 시도가 오랫동안 계속되어 왔다. 최근에 미국의 카이론사(chiron)는 NANBH 환자의 혈장을 침팬지에 감염시켜 간염 혈청을 대량 확보함으로써 NANBH 바이러스의 분리 및 회수가 가능함을 보고한 바 있고(Bradley, D.W. et al., Gastroenterology 88, 773-779 (1985)), 츄(Choo)등은 상기한 대량의 침팬지 혈청을 이용하여 NANBH 바이러스(이하 C형 간염 바이러스(Hepatitis C Virus), HCV)를 확보한 뒤 바이러스의 전 핵산을 추출하여 부분적인 cDNA를 클로닝한 결과 이 바이러스가 양성 가닥 리보헥산(positive-stranded RNA) 바이러스로서 약 10,000 개의 염기로 이루어 져 있음을 밝혔으며 (Science 244, 359-362 (1989)), 부분적인 2개의 비구조 유전자절편(NS3/NS4)을 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD) 유전자와 융합시켜 재조합 효모에서 융합단백질인 SOD-C100-3을 발현시켜 상기 단백질이 C형 간염 환자의 혈청과 반응함을 증명하였고, 특히 수혈성 간염 환자의 70% 이상이 C100-3에 대한 항체를 보유하고 있음을 밝혔다(Kuo, G., et al. Science 244, 362-464 (1989)).

이어, 카이론사의 호튼등은 1988년 6월 1일 출원된 국제특허(PCT 출원 제PCT/US88/04125호)에서 상기의 침팬지로부터 분리 및 동정된 HCV 유전자로부터 코딩되는 항원들이 백신 및 HCV 항체 진단시약 제조에 유용함을 기술하였다.

이를 이용하여 미국의 오르토 사(Ortho diagnostic systems. Inc.)가 1990년에 개발한 HCV 항체 감정용 면역효소 진단시약이 C형 간염 진단에 널리 이용되게 되었다. 그러나 SOD-C100-3을 이용한 이 진단방법은 C100-3에 대한 항체가 C형 간염 바이러스 감염 후 4-6개월이 지난 후에 생성되므로 초기의 급성 C형 간염 환자를 정확히 진단하지 못하며 더우기 자가 면역성 만성 간염 환자나 C형 간염 이외의 간염 환자의 경우에서도 높은 빈도의 양성 반응이 나타나는 단점이 있음이 보고되었다(McFarlane, I.G., et al., Lancet 335, 754-757 (1990); Gray, J.J., et al., Lancet 335, 609-610 (1990)).

최근에는 C형 간염 바이러스의 5′말단에 위치한 핵(core) 구조 유전자로부터 발현시킨 핵 단백질을 이용함으로써, C100-3을 이용한 항체진단 방법보다 더 개선되고 조기진단이 가능한 진단방법이 개발되었다(Muraiso, K., et. al., Biochem. Biophy. Res. Comm. 172, 511-516 (1990); Hosein, B., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 3647-3651 (1991)). 특히 상기 핵 항원을 사용한 진단방법은 C100-3을 이용한 진단방법보다 약 6 내지 8주 일찍 항체를 진단할 수 있음이 보고되었다(Harada, S., et al., J. Virol 65 3015 (1991)). 따라서 많은 회사들이 핵 항원을 포함한 제2세대 진단시약을 개발하게 되었고 미국의 애보트사(Abbott Lab.)는 상기의 핵 항원을 첨가하여 기존의 C100-3항원을 사용한 제1세대 진단방법보다 더 민감하고 특이도가 높은 개선된 진단방법을 개발하여 보고한 바 있다(Lesniewski, R.R., et al., EP725354 (1990)).

또한 미국의 UBI 사(United Biomed. Inc.)는 서로 다른 10 종의 HCV 항원 결정기(epitope)를 가진 15 내지 65 개의 아미노산으로 구성된 인공 합성 폴리펩티드를 사용한 개선된 진단방법을 개발하여 보고하였다(Wang, C. Y., EP 442394 (199l)). 또한 미국의 오르토사에서는 기존의 제1세대 진단 시약에 포함되어 있는 SOD-C100-3 외에도 핵 항원 단백질인 C22-3과 비구조 3 유전자 및 비구조 4 유전자의 단백질 산물인 C33C와 C200을 첨가한 제2세대 진단방법을 개발함으로써 HCV 항체에 대한 민감도를 더욱 개선했다고 보고한 바 있으며 (McHutchi-son, J. G., et al., Hepatology 15, 19-25 (1992)), 감염된지 15 내지 20 주 정도 경과한 환자의 혈청에서도 HCV 항체를 검출할 수 있다는 보고도 있었다(Alter, H. J., Annals of Internal Medicine 115, 644-649 (1991)). 즉, 단일항원을 사용하는 경우보다는 서로 다른 항원 결정기를 갖는 항원들을 복합 사용함으로써 더욱 민감하고 특이한 C형 간염 진단방법을 개발할 수 있다는 것을 보여 주었다.

본 발명자들은 한국형 C형 간염 환자의 혈청으로부터 HCV 입자를 분리하고 그 유전자 구조를 규명하여 기존의 미국형 및 일본형 HCV와는 상이한 고유한 한국형 HCV가 존재함을 규명한 바 있으며 또한 핵 유전자로부터 KHCV UB Core 14, 비구조 3 유전자로부터 KHCV UB897 단백질, 비구조 5 유전자로부터 KHCV 403 단백질 및 외피 유전자로부터 KHCV 외피 1, KHCV 외피 2N, KHCV 외피 2C 단백질들을 재조합 효모 및 대장균으로부터 발현시키고(선행 한국 특허 출원 제91-10942호, 제91-10943호, 제91-25505호, 제92-10039호 참조), 이들 단백질들의 면역 특이성을 확인한 다음 고순도로 대량 분리 정제하는 방법을 개발하였다(선행 한국 특허 출원 제91-13594호, 제91-13595호, 제91-13597호, 제91-25506 호, 제92-10039호 참조).

또한 이들 HCV 특이 항원들을 사용하여 기존의 공지된 효소면역 측정법(ELISA imMunoassay, EIA) 원리에 따라 환자의 혈청으로부터 C형 간염 바이러스에 대한 항체를 검정하는 개선된 진단방법을 개발하여 보고한 바 있다(선행 한국 특허 출원 제91-13601호 참조).

그러나 상기한 HCV 항원들은 C형 간염의 진단에는 유용하나 그 치료를 위해 만성 간염과 급성 간염 환자의 경과를 정확히 구분하기 위한 목적에 있어서는 만족스럽지 못하였다.

따라서 간염 초기에 나타나는 HCV 항체를 좀 더 빨리 인식할 수 있는 진단방법과 바이러스 RNA 및 바이러스 항원을 인식할 수 있는 진단방법의 개발이 절실히 필요하다.

다른 한편으로, 순수분리된 HCV의 특이항원들을 이용하여 이들 항원들에 대한 단일 클론성항체 또는 다중 클론성 항체를 제조할 수 있으며 이 항체들을 C형 간염 환자의 혈청에서 HCV 항원을 검출하는데 사용함으로써 좀더 민감한 조기 진단에 크게 공헌할 수 있고, 특히 이 항체들 중 중화 항원 결정기(neutralizing epitope)에 대한 특이성을 가지고 있는 항체들은 수동면역 치료법에 대해서도 크게 유용하다. 또한 단일 클론성 항체는 항 이디오타입 항체를 증가시키는데 사용될 수 있는데 이는 HCV 항원의 면역원성 영역을 밝히는 것 뿐만아니라 C형 간염의 치료 및 진단에도 유용하게 사용할 수 있다는 것이 공지되어 있다.

이러한 사실에 의거하여, 본 발명자들은 한국형 C형 간염환자의 진단에 있어서, 기존의 미국형 및 일본형 HCV에 의해 코딩되는 단백질을 사용하는 것보다 감지도 및 특이도가 더 높은 한국형 HCV에 대한 진단시약 및 백신을 개발하고자 노력하던 중, 한국형 HCV의 전체 유전자중 비구조 5 유전자에서 상기한 KHCV 403 부분을 포함하는 아미노말단 1,200 염기쌍 부분이 한국형 C형 간염 환자의 혈청과 면역학적 특이성을 가지고 반응하며 또한 상기한 KHCV 403보다 더 높은 민감도를 보인다는 것을 확인하고 이를 유전공학적인 방법으로 재조합 대장균에서 발현시키는데 성공하고 이를 보고한 바 있다(동일자로 출원하는 한국 특허출원 제93-26611호 참조).

재조합 대장균에서 발현된 KHCV UB NS5 1.2 단백질을 정제하는데 있어서, 기존의 단백질 정제방법에 사용되어 왔던 원심분리 방법과 컬럼 크로마토그래피 등은 불용해 상태로 발현된 KHCV UB NS5 1.2 단백질의 정제에는 적용하기 어렵고, 또 종래의 HCV 단백질의 정제에 사용되어 왔던 SDS 를 함유한 완충액을 이용한 용출, 우레아 존재하의 용출과 컬럼 크로마토그래피 등의 방법은 절차가 복잡하고 완제품의 순도가 낮다는 문제점이 있으며(국제 특허 출원 공개번호 WO 89/84669), 특히 성질이 전혀 다른 여타 HCV 항원의 정제에 사용되어 왔던 정제방법을 그대로 적용하는 것으로는 KHCV UB NS5 1.2 단백질을 정제하는 것이 불가능하였다.

이에 본 발명자들은 재조합 대장균에서 유비퀴틴(ubi-quitin, 이하 UB)과의 융합단백질로서 발현된 KHCV UB NS5 1.2 단백질을 효과적으로 정제하는 방법을 개발하고자 연구를 계속한 결과 재조합 대장균 세포의 파괴, 가용성 단백질의 제거, 트리톤 X-100을 이용한 불용성 침전물의 세척, 우레아를 이용한 침전 단백질의 용해, DEAE 세파로스 이온교환 크로마토그래피, S-300 겔 투과 크로마토그래피, 우레아의 제거 및 FPLC-페닐 수퍼로즈 크로마토그래피를 거쳐 고순도의 UB NS5 1.2 단백질을 대량으로 얻을 수 있는 정제방법을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 한국형 HCV 항체에 대한 특이도와 민감도가 기존의 미국형 및 일본형 HCV의 항원보다 더 높은 UB NS5 1.2 특이 항원을 고순도로 대량 정제할 수 있는 정제 방법을 제공함으로써 타 제품들에 비해 더 민감하고 조기 진단이 가능한 C형 간염 진단시약의 개발과 한국형 HCV에 대한 특이도가 더 높은 백신의 개발에 기여하는 것이다.

즉, 본 발명은 유전자 재조합 대장균으로 부터 KHCV UB NS5 1.2 단백질을 정제하는데 있어서, 가) KHCV NS5 1.2 유전자 및 유비퀴틴 유전자의 융합유전자(KHCV UB NS5 1.2 유전자)를 함유하는 재조합 대장균 세포를 파괴한 후 원심분리하여 불용성 침전물을 얻고; 나) 상기 가)의 불용성 침전물을 트리톤 X-100을 함유한 완충액에 현탁시킨 후 원심분리하여 불용성 침전물을 얻고; 다) 상기 나)의 불용성 침전물을 우레아를 함유한 완충액에 현탁시킨 후 원심분리하여 상등액을 취하고; 라) 상기 다)의 상등액을 DEAE-세파로스 이온교환 크로마토그래피로 분리시켜 KHCV UB NS5 1.2 단백질을 포함하는 분획을 수집하고; 마) 상기 라)에서 수집한 단백질 용액을 S-300 겔 투과 크로마토그래피로 분리시켜 KHCV UB NS5 1.2 단백질을 포함하는 분획을 수집하고; 바) 상기 마)에서 수집한 단백질 용액을 투석시켜 우레아를 제거하고 FPLC-페닐 수퍼로즈 크로마토그래피하여 KHCV UB NS5 1.2 단백질을 정제함을 포함하는 KHCV UB NS5 1.2 단백질의 정제 방법을 제공하는 것이다.

이와같은 본 발명의 정제방법을 상세히 설명하면 다음과 같다. 정제과정에 앞서, UB NS5 1.2 단백질이 생산된 대장균 세포, 예를 들면 한국형 C형 간염 바이러스의 KHCV NS5 1.2 유전자와 유비퀴틴(UB)의 유전자를 포함하는 벡터(ptrpH-UB-NS5-1.2)로 형질전환된 재조합 대장균 세포(Escherichia coli, W3110)를 본 출원인이 동일자로 출원하는 한국 특허출원 제93-26611호에 따라 제조하여 준비하고, 이를 20㎍/㎖의 암피실린이 함유된 루리아(Luria) 배지에서 선별 배양한 다음 2% 카사미노산과 10㎍/㎖의 트립토판이 함유된 M9 배지로 옮기고 4시간 정도 배양한 뒤 인돌 아크릴 산(indole acrylic acid, IAA)을 최종농도 50㎍/㎖가 되게 첨가하여 UB NS5 1.2 융합 단백질이 발현되게 한 다음 4시간 정도 더 배양하고 원심 분리하여 대장균 세포를 수득하였다.

상기의 대장균 세포를 완충액에 현탁시킨 뒤 라이소자임(lysozyme)을 최종농도 0.2㎍/㎖가 되게 첨가하고 상온에서 약 30분 정도 반응시킨 다음 얼음위에서 초음파 처리로 세포를 분쇄시켜 세포 균질액을 얻는다.

이때 상기에서 얻어진 세포 균질액의 일부를 램리의 방법(Laemmli, Nature 227, 680 (1970))에 따라 SDS(sodium dodecyl sulfate)의 존재하에 폴리아크릴아미드 젤에서 전기영동하고, 분리된 단백질을 타우빈(Towbin) 등의 방법(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 76, 4350-4354 (1979))에 따라 임모빌론(immo-bilon) P 필터로 옮긴후, 이 필터를 한국형 C형 간염 환자의 혈청으로 부터 분리한 면역 글로불린을 이용하여 웨스턴-블롯팅(Western blotting)하여 UB NS5 1.2 항원 단백질의 존재를 확인한다. 그 결과, 재조합 대장균에서 발현된 분자량 68,000 달톤 정도의 단백질이 C형 간염 환자의 혈청과 면역학적으로 특이하게 반응하여 HCV의 특이항원임을 확인할 수 있다.

상기에서 수득한 세포균질액을 원심분리하여 용해된 상태의 단백질을 제거 하고 불용성 침전물을 얻는다. 이 침전물을 트리톤 X-100, 바람직하게는 1%의 트리톤 X-100을 함유한 완충액에 현탁시키고 교반한 다음 원심분리하여 가용성 단백질을 제거하고 불용성 침전물을 얻는다. 상기의 침전물을 우레아를 함유한 완충액, 바람직하게는 8M 우레아를 함유한 완충액에 용해시킨 후 원심분리하여 상등액만을 취한 다음 이를 동일 완충액으로 평형시킨 DEAE 세파로즈 이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 통과시킨다. 결합된 단백질을 0-0.3M 선형 농도구배의 염화나트륨을 가하여 용출시키고 KHCV U8 NS5 1.2 단백질을 포함하는 특정분획들만을 수집한 후 이를 YM1O 한외여과막 농축기를 이용하여 농축한다. 그 다음, S-300 겔 투과 크로마토그래피에 의해 단백질을 분자량 크기에 따라 분리시키고 KHCV UB NS5 1.2를 포함하는 분획을 모은 후 이 용액을 투석시켜 우레아를 제거한 다음 염화나트륨을 최종농도 1.5M이 되게 첨가한다. 이를 FPLC-페닐-수퍼로즈 컬럼에 통과시킨 다음 1.5M-0M 선형농도 구배의 염화나트륨을 가하여 흡착되어 있던 단백질을 용출시키고 KHCV UB NS5 1.2 단백질을 포함하는 특정 분획들만을 별도로 수집함으로써 한국형 HCV의 특이항원인 KHCV UB NS5 1.2 단백질을 대량으로 추출 정제할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의거하여 상세히 설명하면 다음과 같다. 하기의 실시예들은 본 발명을 예시한 것으로서 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

[실시예]

[KHCV UB NS5 1.2 단백질의 정제]

[단계 1. 재조합 대장균 세포의 배양]

C형 간염 바이러스의 특이항원인 KHCV NS5 1.2 단백질 유전자를 함유하는 재조합 대장균 세포(동일자로 출원하는 한국 특허 출원 제93-26611호 참조)를 20㎍/㎖의 암피실린이 함유된 10㎖의 액체 루리아(Luria) 배지(1 리터당 박토 트립톤 10g, 효모추출물 5g, 염화나트륨 10g)에서 37℃로 12시간 동안 진탕 배양한 다음, 2% 카사미노산과 10㎍/㎖의 트립토판이 함유된 1리터의 M9 배지(40mM K₂HPO₄, 22mM KH₂PO₄, 0.1mM CaC1₂, 10㎍/㎖ Vit B₁)로 옮겨 37℃에서 4시간 동안 진탕배양한 후 인돌 아크릴산(indole acrylic acid: IAA)을 최종농도 50㎍/㎖가 되게 첨가하였다. IAA를 첨가한 지 약 4시간 후에 세포 배양액의 흡광도가 650nm에서 1.4 정도가 되었을때 세포배양액을 원심분리기(Beckman J-6B, Rotor JS 4.2)에서 3,500rpm의 속도로 원심분리하여 세포침전물을 얻고 이를 다음단계의 단백질 정제 과정에 사용하였다.

[단계 2: 특이항원 발현의 확인]

단계 2의 세포 균질액 중 일부를 SDS의 존재하에서 15% 폴리아크릴아미드 겔에서 전기 영동하였고, 여기에서 UB NS5 1.2 단백질이 약 68,000 달톤(dalton) 정도의 크기로 발현되었음을 확인하였다(제2도 참고).

그 후, 겔상에서 분리된 단백질을 임모빌론 p 필터(MILLIPORE,PORE, Cat. #. IPUH 00010, pore size 0.45㎛)로 전달(blot)시켰다. 이 필터를 0.5% 트윈 20이 함유된 PBS(10mM 인산, pH 7.0, 0.15M 염화나트륨)에 넣고 상온에서 2시간 동안 약하게 흔들면서 폐쇄(blocking)시켰다. 이후 0.5% 젤라틴과 0.05% 트윈 20을 함유한 PBS에 한국형 C형 간염환자의 혈청을 1:20으로 희석시켜 첨가하고 상온에서 1시간 동안 약하게 흔들면서 반응시킨 다음, 필터를 0.05% 트윈 20을 함유한 PBS로 5분씩 4회 세척하였다. 이 필터에 0.5% 젤라틴과 0.05% 트윈 20을 함유한 PBS에 양고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase)로 표지된 항-사람 면역글로불린 G(Bio-Rad Lab., anti-human IgG-HRP)를 1:500으로 희석시켜 첨가하고 상온에서 1시간 동안 진탕하면서 반응시키고, 0.05% 트윈 20을 함유한 PBS로 5분씩 4회 세척한 다음 50mM 트리스 완충액(pH 7.0)으로 2회 세척하였다. 400㎍/㎖의 4-클로로-1-나프톨과 0.03% 과산화수소가 함유된 50mM 트리스 완충액을 가하여 필터를 발색시켰다. 제3도에서 볼 수 있는 바와 같이, 총 세포균질액 중에서 UB NS5 1.2 단백질만이 C형 간염 환자의 혈청과 면역학적으로 반응하여 가시적 밴드로 나타났다. 이 웨스턴-블롯팅의 결과를 통해, 발현된 UB NS5 1.2 단백질이 HCV 특이항원임을 확인하였다.

[단계 3: 대장균 세포 파괴 및 가용성 단백질의 제거]

UB NS5 1.2 단백질이 발현된 세포침전물을 40㎖의 완충액 1(20mM 트리스, pH 9.0, 1mM EDTA, 10mM 베타 머캅토 에탄올, 1mM 페닐 메틸 설포닐 플루오라이드, 1㎍/㎖ 펩스타틴 A)에 현탁시킨 후, 리소자임 용액을 최 종농도 0.2㎎/㎖가 되게 가한 뒤 상온에서 30분 동안 배양하고, 이후 얼음위에서 초음파 분쇄기(HEAT SYSTEMS-ULTRASONICS, INC., W225 USA)로 80%의 출력과 50%의 효율 사이클(duty-cycle)에서 약 15분간 초음파를 처리하여 세포를 파괴시켜 박테리아 균질액을 얻었다. 상기 세포 균질액을 원심분리기(Beckman J2-21, Rotor JA 20)로 15,000rPm에서 25분간 원심분리하여 가용성 단백질을 제거하고 불용성 침전물을 얻었다.

[단계 4: 불용성 침전물의 세척]

단계 3의 침전물을 1% 트리톤 X-100을 함유한 4㎖의 완충액 2(20mM 트리스, pH 9.0, 1mM EDTA, 10mM 베타-머캅토 에탄올)에 현탁시킨 후 상온에서 30분간 교반시킨 다음, 원심분리기(Beck-man J2-21, JA20)로 15,000rpm에서 25분간 원심분리하여 1% 트리톤에 용해가 가능한 단백질을 제거하고 불용성 침전 단백질을 얻었다.

[단계 5: 불용성 침전물의 용해]

단계 4의 불용성 침전물을 8M 우레아를 함유한 100㎖의 완충액 3(50mM 트리스, pH 9.0, 1mM EDTA, 10mM 베타-머캅토 에탄올)에 현탁시키고, 상온에서 1시간 동안 교반하여 용해시킨 다음 원심분리(15,000rpm)하여 용해되지 않은 침전물을 제거하고 그 상등액만을 얻었다.

[단계 6: DEAE-세파로스 이온 교환 크로마토그래피]

단계 5의 상등액을 완충액 3으로 평형시킨 DEAE-세파로스 컬럼(Pharmacia, 2.5cm x 3cm)에 분당 2㎖의 속도로 통과시키고 다시 동일 완충액을 통과시켜서 컬럼내에 유리된 상태로 남아있는 단백질들을 모두 제거하였다. 그 다음 0-0.3M 선형 농도 구배의 염화나트륨을 포함하는 300㎖의 동일 완충액을 가하여 컬럼에 흡착되어 있던 단백질들을 분당 8㎖의 속도로 용출시키고 4㎖씩의 분획들로 수집한 다음 이 분획들을 15% SDS-폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동(SDS-PAGE)하여 UB NS5 1.2 단백질을 포함하는 특정분획들 만을 별도로 수집하였다.

[단계 7. S-300 겔 투과 크로마토그래피]

단계 6에서 수집한 UB NS5 1.2 단백질을 포함하는 용액을 YM 10 한외여과막 농축기(Amicon)를 사용하여 3㎖까지 농축한 다음 이를 8M 우레아를 함유한 완충액 3으로 평형시킨 S-300 수지컬럼(Pharmacia, 1.2cm x 120cm)에 시간당 10㎖의 속도로 통과시켜 분자장의 크기에 따라 단백질을 분리하였으며 용출되는 단백질을 0.5㎖씩의 분획들로 수집한 다음 15% SDS-PAGE로 확인하여 고순도의 UB NS5 1.2 단백질을 함유하는 특정 분획들만을 별도로 수집하였다.

[단계 8. FPLC-페닐-수퍼로즈 크로마토그래피]

단계 7에서 얻은 단백질 용액을 YM10 한외여과막 농축기를 이용하여 4㎖까지 농축한 다음 인산 염 완충액(PBS, 10mM 인산, pH 7.0, 150mM 염화나트륨)으로 투석시켜서 우레아를 제거하고 염화나트륨을 최종농도 1.5M이 되게 첨가한다. 이를 1.5M 염화나트륨이 함유된 인산염 완충액으로 미리 평형시킨 FPLC-페닐-수퍼로즈 컬럼(Pharmacia, HR 5/5, 0.5cm x 5cm)에 분당 0.7㎖의 속도로 통과시키고 다시 동일 완충액을 통과시켜서 컬럼내에 유리된 상태로 남아있는 단백질을 제거한 뒤, 40㎖의 1.5M-0M 선형농도 구배의 염화나트륨을 포함한 인산완충액(10mM 인산, pH 7.0)을 가하여 흡착되어 있던 단백질을 용출시켰다. 이를 0.7㎖씩의 분획들로 수집한 다음 15% SDS-PAGE로 확인하여 고순도의 UB NS5 1.2 단백질을 포함하는 특정 분획들만을 별도로 수집함으로써 95% 이상의 순도를 가진 UB NS5 1.2 단백질을 대량으로 얻을 수 있었다(제2도 참조).

또한 상기의 정제과정으로 순수분리된 UB NS5 1.2 단백질을 한국형 C형 간염 환자의 혈청을 이용하여 웨스턴 블롯팅한 결과를 통해 정제된 UB NS5 1.2 단백질의 면역학적 특이성을 확인하였다(제3도 참조).

제2도 및 제3도에서, M 열은 표준 단백질 분자량, 제1열은 표준세포 단백 질, 제2열은 단계 3의 세포파괴 후 전체 균질액, 제3열은 전체 균질액을 원심분리하여 얻은 불용성 침전물, 제4열은 1% 트리톤 세척후의 불용성 침전 단백질, 제5열은 단계 5의 8M 우레아로 용해시킨 단백질, 제6열은 단계 6의 DEAE-세파로스 이온교환 크로마토그래피 후 수집한 단백질들, 제7열은 단계 7의 S-300겔 투과 크로마토그래피 후 수집한 단백질, 제8열은 단계 8의 FPLC-페닐 수퍼로즈 크로마토그래피 후 정제된 UB NS5 1.2 단백질을 각각 나타낸다.

본 발명을 통해 유전공학적인 방법으로 대량 생산된 HCV의 특이항원인 UB NS5 1.2 단백질을 효과적으로 정제할 수 있게 되었으며, 정제된 UB NS5 1.2 단백질을 이용하여 보다 정확한 C형 간염 진단방법의 개발이 가능하며 특히 UB NS5 1.2 단백질을 항원으로 사용하여 HCV 항원에 대한 특이항체 를 만들 수 있게 함으로써 HCV에 대한 백신의 개발에도 크게 기여할 수 있게 되었다.

Claims (6)

1. 가) KHCV NS5 1.2 유전자 및 유비퀴틴 유전자의 융합유전자(KHCV UB NS5 1.2 유전자)를 함유하는 재조합 대장균 세포를 파괴한 후 원심분리하여 불용성 침전뱅을 얻고; 나) 상기 가)의 불용성 침전물을 트리톤 X-100을 함유한 완충액에 현탁시킨 후 원심분리하여 불용성 침전물을 얻고; 다) 상기 나)의 불용성 침전물을 우레아를 함유한 완충액에 현탁시킨 후 원심분리시킨 후 원심분리하여 상등액을 취하고; 라) 상기 다)의 상등액을 DEAE-세파로스 이온 교환 크로마토그래피로 분리시켜 KHCV UB NS5 1.2 단백질을 포함하는 분획을 수집하고, 마) 상기 라)에서 수집한 단백질 용액을 S-300 겔 투과 크로마토그래피로 분리시켜 KHCV UB NS5 1.2 단백질을 포함하는 분획을 수집하고; 바) 상기 마)에서 수집한 단백질 용액을 투석시켜 우레아를 제거하고 FPLC-페닐 수퍼로즈 크로마토그래피하여 KHCV UB NS5 1.2 단백질을 정제함을 포함하는 KHCV UB NS5 1.2 단백질의 정제 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 나)의 완충액이 1% 트리톤 X-100, 20mM 트리스, 1mM EDTA 및 10mM 베타-머캅토에탄올을 포함하는 pH 9.0의 완충액인 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 다)의 완충액이 8M 우레아, 50mM 트리스, 1mM EDTA 및 10mM 베타-머캅토에탄올을 포함하는 pH 9.0의 완충액인 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 라)단계에서 OM-0.3M 선형농도 구배의 염화나트륨을 가하여 단백질을 용출시키는 방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 바)단계에서 단백질 용액을 10mM 인산 및 150mM 염화나트륨을 포함하는 pH 7.0의 완충액으로 투석시키는 방법.
6. 제1항에 있어서, 상기 바)단계에서 1.5M-OM 선형농도 구배의 염화나트륨을 가하여 단백질을 용출시키는 방법.