JP3219409B2

JP3219409B2 - Ｃ型肝炎アッセイ

Info

Publication number: JP3219409B2
Application number: JP50618393A
Authority: JP
Inventors: レスニーウスキイ，リチヤード・アール; リユーング，タツト・ケイ
Original assignee: アボツト・ラボラトリーズ
Priority date: 1991-09-16
Filing date: 1992-09-16
Publication date: 2001-10-15
Anticipated expiration: 2016-10-15
Also published as: AU2679492A; ES2145746T5; EP0642666B1; DE69230917T2; EP0642666A1; DE69230917T3; EP0642666A4; TW222686B; JPH06510861A; DE69230917D1; WO1993006247A1; ATE191792T1; CA2119013A1; EP0642666B2; ES2145746T3

Description

【発明の詳細な説明】発明の背景本発明は一般に、Ｃ型肝炎ウィルス抗原と免疫学的に
反応する抗体の試験サンプル中における存在及び／又は
量を同定するためのアッセイ、特にＣ型肝炎ウィルス抗
原のエピトープを少なくとも１つ有するポリペプチドと
抗体との複合体を検出するためのアッセイに関する。

急性ウィルス性肝炎は、明確に定義された患者の症状
の組合せ（例えば黄疸、肝性圧痛、並びにアラニンアミ
ノトランスフェラーゼ及びアスパルテートアミノトラン
スフェラーゼの血清レベルでの上昇）によって臨床学的
に診断される。原因である特定の型のウィルスを診断す
るには一般に、他の血清学的イムノアッセイが実施され
ている。歴史的には、臨床的に肝炎の症状を示すが、Ａ
型肝炎、Ｂ型肝炎、エプスタインバー又はサイトメガロ
ウィルスに感染していない患者は、除外法によって非Ａ
非Ｂ型肝炎（NANBH）に感染していると臨床学的に診断
された。この疾患から慢性肝臓障害に至ることもあり得
る。

免疫学的に特徴のある良く知られた肝炎誘発ウィルス
（例えばＡ型肝炎ウィルス（HAV）、Ｂ型肝炎ウィルス
（HBV）及びＤ型肝炎ウィルス（HDV））は各々、別科の
ウィルスに属し、独自のウィルス構成、タンパク質構造
及び複製機構を有する。

NANBHウィルスを、既知の肝炎ウィルスのいずれかと
のゲノム類似性によって同定しようとしたが失敗した。
このことは、NANBHが独自の構成及び構造を有すること
を示唆している。Fowler等、J.Med.Virol.12:205−213
（1983）及びWeiner等、J.Med.Virol.21:239−247（198
7）。

NANBHに関連する抗原の正確な同定が困難であること
が特に、NANBHに特異的な抗体を検出するアッセイの開
発の障害になっていた。例えば、J.Wands等の米国特許
第4,870,076号、Wands等のProc.Nat'l.Acad.Sci.83:660
8−6612（1986）、Ohori等のJ.Med.Virol.12:161−178
（1983）、Bradley等のProc.Nat'l.Acad.Sci.84:6277−
6281（1987）、T.Akatsuka等のJ.Med.Virol.20:43−56
（1986）、B.Seto等の米国特許出願第07/234,641号（U.
S.Department of Commerce National Technical I
nformation Service,Springfield,Virginia No.89138
168より入手可）、1988年11月30日公開のK.Takahashi等
のヨーロッパ特許出願第０ 293 274号、及びR.Seelig
等のPCT出願PCT/EP88/00123号を参照されたい。

近年、他の肝炎誘発ウィルスが、M.Houghton等によっ
てＣ型肝炎ウィルス（HCV）として明確に同定された
（ヨーロッパ特許出願公開第０ 318 216号、1989年５
月31日）。このウィルスを記載した関連文献としては、
G.Kuo等のScience 244:359−361（1989）及びQ.Choo等
のScience 244:362−364（1989）が挙げられる。M.Hou
ghton等は、NANBHに感染した患者の持つ抗体と免疫学的
に反応する抗原をコードするHCV由来のcDNA配列を単離
したと報告し、これによりHCVがNANBHを引起こす原因ウ
ィルスであることが確定した。

HCVに関連するcDNA配列は、慢性HCV感染チンパンジー
の血清をプールして得られたRNAから作製したcDNAライ
ブラリーから単離した。cDNAライブラリーは、平均約20
0塩基対からなるcDNA配列を含んでいた。cDNAライブラ
リーをスクリーニングして、NANBH既往歴のある患者の
血清中の抗体と結合できるコードされたエピトープをク
ローン中に発現した。

前記ヨーロッパ特許出願の中で、M.Houghton等は更
に、幾つかのスーパーオキシドジスムターゼ融合ポリペ
プチド（SOD）の製造、及びHCVスクリーニングアッセイ
を開発する上でのこれらSOD融合ポリペプチドの使用を
記述した。ヨーロッパ特許出願に記載された最も複雑な
SOD融合ポリペプチドはC100−３と称され、アミノ末端
にヒトSODのアミノ酸154個、制限部位EcoR Iを含む合成
DNAアダプターの発現に由来するアミノ酸残基５個、ク
ローン化されたHCV cDNAフラグメントの発現に由来す
るアミノ酸363個、及びMS2クローニングベクターのヌク
レオチド配列由来のカルボキシ末端アミノ酸５個を含む
と記載されている。このポリペプチドをコードするDNA
配列は、プラスミドを用いて酵母細胞に形質転換され
た。形質転換した細胞を培養し、発現した分子量54,000
のポリペプチドを分別抽出法によっておよそ80％の純度
まで精製した。

SOD−NANB_5-1-1及びSOD−NANBH₈₁と称される他のSOD
融合ポリペプチドは、組換えバクテリア内で発現され
た。大腸菌融合ポリペプチドは、分別抽出法、また陰イ
オン及び陽イオン交換カラムを用いるクロマトグラフィ
ーにより精製された。この精製法により、純度約80％の
SOD−NANB_5-1-1、及び純度約50％のNANBH₃₈が製造でき
た。

M.Houghton等によって記述された組換えSOD融合ポリ
ペプチドは、マイクロタイターウェル又はポリスチレン
ビーズにコーティングされて、血清サンプルのアッセイ
に用いられた。簡潔に言えば、コーティングしたマイク
ロタイターウェルは、希釈サンプルと共にインキュベー
トした。インキュベーション後、マイクロタイターウェ
ルを洗浄し、放射性標識したヒツジ抗ヒト抗体又はマウ
ス抗ヒトIgG−HRP（西洋ワサビペルオキシダーゼ）結合
体を用いて発色／現像した。これらのアッセイは、後急
性期及び慢性期双方のHCV感染を検出するために用いら
れた。前述の調製方法のために、アッセイでは、サンプ
ルに酵母菌又は大腸菌抽出物を添加して、血清サンプル
中に存在する任意の酵母菌又は大腸菌抗体との望ましく
ない免疫学的反応を防ぐことが特に必要であった。

Ortho Diagnostics Systems Inc.は、HCV抗原に対
する抗体を検出する酵素免疫アッセイを開発した。Orth
oアッセイ法は、組換え酵母/C型肝炎ウィルスSOD融合ポ
リペプチドC100−３でコーティングしたマイクロウェル
中で行なわれる三段階の血清／血漿検査である。

第１段階では、検体を直接テストウェル中で希釈し
て、一定時間インキュベートする。検体中にHCV抗原に
対する抗体が存在する場合、マイクロウェルの表面に抗
原−抗体複合体が形成される。抗体が存在しない場合
は、複合体は形成されず、結合しない血清又は血漿タン
パク質は洗浄段階で除去される。

第２段階では、抗ヒトIgGマウスモノクローナル抗体
西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体をマイクロウェルに
加える。結合体は、抗原−抗体複合体の抗体部分に特異
的に結合する。抗原−抗体複合体が存在しなければ、結
合しなかった結合体も洗浄段階で除去される。

第３段階では、ｏ−フェニレンジアミン2HCl（OPD）
と過酸化水素とからなる酵素検出系がテストウェルに添
加される。結着した結合体が存在すれば、OPDは酸化さ
れて、着色した最終生成物が得られる。着色した最終生
成物の形成後、希硫酸をマイクロウェルに添加して、色
素形成検出反応を停止させる。

最終生成物の着色の程度は、マイクロウェルリーダー
で測定する。このアッセイを使用して、患者の血清及び
血漿をスクリーニングしてもよい。

HCVが汚染された血液及び血液製剤によって伝染し得
ることは確定している。輸血を受けた患者が輸血後肝炎
にかかる率は10％に達する。この内約90％が、HCVと診
断される感染症の結果である。血液及び血液製剤による
HCV感染を防ぐには、HCVキャリア並びに汚染された血液
及び血液製剤を識別するための、信頼性が高く、感受性
及び特異性のある診断及び予後のツールが必要である。
従って、サンプル中のHCV抗体の存在を正確に検出す
る、信頼性が高く有効な試薬や方法を用いるHCVアッセ
イが必要である。

発明の要約本発明は、HCV抗原のエピトープを少なくとも１つ含
むポリペプチドをサンプルと接触させることにより、試
験サンプル中においてHCV抗原に対する抗体の存在を検
出する改良アッセイを提供する。ポリペプチドは、p380
−JH1、ｐ−380.LG、p380−Ｊ及びp408からなる群の中
から選択される。

本発明のアッセイ方式の一つは、HCV抗原と免疫学的
に反応する抗体の存在を明確に同定するための確認アッ
セイ（confirmatory assay）である。簡潔に言えば、液
体サンプルを使用して、第１及び第２のアリコートを作
成する。次いで、抗体とポリペプチドとの複合体を形成
するのに適した条件下で、HCV抗原のエピトープを少な
くとも１つ含む、HCV cDNA配列を含むクローンによっ
て発現されるタンパク質中に含まれると推定される連続
アミノ酸配列の複製である少なくとも２種のポリペプチ
ドをアリコートと接触させる。最後に、抗体−抗原複合
体を検出する。第１のアリコート及び第２のアリコート
は、p380−JH1、ｐ−380.LG、p380−Ｊ及びp408Jからな
る群の中から選択される少なくとも１種のポリペプチド
と接触させる。但し、第１のアリコートで使用するポリ
ペプチドは第２のアリコートには使用しないものとす
る。

別のアッセイ方式は、抗体とポリペプチドとの複合体
を形成するのに適した条件下で、p380JH1、p380J、p38
0.LG及びp408Jからなる群の中から選択され、HCV抗原の
エピトープを少なくとも１つ含む少なくとも１種のポリ
ペプチドを結合した固相をサンプルと接触させ、抗体−
ポリペプチド複合体を検出することからなる、液体サン
プル中においてHCV抗原と免疫学的に反応する抗体の存
在を同定するアッセイである。

別のアッセイ方式は、抗体とポリペプチドとの複合体
を形成するのに適した条件下で、p380JH1、p380J、p38
0.LG及びp408Jからなる群の中から選択され、HCV抗原の
エピトープを少なくとも１つ含むポリペプチドをサンプ
ルと接触させ、抗体−ポリペプチド複合体を慢性HCV感
染の指標として検出することからなる、液体サンプル中
においてHCV抗原と免疫学的に反応する抗体の存在を同
定するアッセイである。

別のアッセイ方式は、抗体と少なくとも１種のポリペ
プチドとの複合体を形成するのに適した条件下で、p380
JH1、p380J、p380.LG及びp408Jからなる群の中から選択
され、各々がHCV抗原の明瞭なエピトープを含む少なく
とも２種のポリペプチドを同時にサンプルと接触させ、
複合体を発色剤と反応させて抗体−ポリペプチド複合体
を検出することによって、HCV抗原と免疫学的に反応す
る抗体の存在を同定するイムノドットアッセイである。

別のアッセイの方式は、陽性結果が誤認でないことを
確認するために、サンプルを用い第１及び第２の免疫学
的に同一のアリコートを作成した液体サンプル中におい
てHCV抗原と免疫学的に反応する抗体の存在を同定する
競合アッセイである。第１のアリコートは、抗体と結合
した検出可能な抗体−ポリペプチド複合体を形成するの
に適した条件下で、HCV抗原のエピトープを少なくとも
１つ含む結合ポリペプチド（p380JH1、p380J、p380.LG
及びp408Jからなる群の中から選択）を含む固相担体と
接触させ、第２のアリコートは、最初にp380JH1、p380
J、p380.LG及びp408Jからなる群の中から選択される未
結合ポリペプチドと接触させ、次いでp380JH1、p380J、
p380.LG及びp408Jからなる群の中から選択される結合ポ
リペプチドを含む固相担体と接触させる。

全てのアッセイでは、固相担体に吸着したポリペプチ
ドに接触させる前に、サンプル、特に血清又は血漿を希
釈しておくことが好ましい。しかしながら、試験サンプ
ルを検査するときには、希釈していないか又は濃厚なサ
ンプルが好まれ得る。サンプルは、全血、血清、血漿、
脳脊髄液、尿、及びリンパ球又は細胞の培養液上清のよ
うな種々の生物学適サンプルから得ることができる。固
相担体の材料としては、セルロース材料（例えば紙及び
ニトロセルロース）、天然及び合成のポリマー材料（例
えばポリアクリルアミド、ポリスチレン）、綿、シリコ
ンチップ、多孔質ゲル（例えばシリカゲル、アガロー
ス、デキストラン及びゼラチン）、装填材料を形成し得
る粒子（例えばイオン捕捉アッセイで使用される粒
子）、並びに無機材料（例えば不活性アルミナ、硫酸マ
グネシウム及びガラス）が含まれ得る。好適な固相担体
材料は、良く知られた種々の物理的形状（例えばマイク
ロタイターウェル、試験管、ビーズ、ストリップ、膜及
び極微粒子）でアッセイに使用でき、磁性であっても、
非磁性であってもよい。イムノドット以外のアッセイで
は、ポリスチレンビーズを固相担体として用いることが
好ましい。イムノドットブロットアッセイでは、ニトロ
セルロースを固相担体として用いることが好ましい。

本発明のアッセイで抗体−抗原複合体を検出するため
の適切な方法及び試薬は、市販されているか又は関連技
術として知られている。代表的な方法は、酵素、放射性
同位体、蛍光試験、発光試験又は化学発光試薬のような
検出試薬を使用し得る。これらの試験は、既知の手順に
従ってハプテン標識抗ハプテン検出系の作成に使用で
き、例えば、ビオチン標識抗ビオチン系を使用して、抗
体−抗原複合体を検出してもよい。

本発明は更に、固相担体に結合したHCV抗原のエピト
ープを少なくとも１つ含むポリペプチド、必須のサンプ
ル調製試薬、洗浄剤、検出試薬、及びシグナル生成試薬
を含むアッセイキットも包括している。

目下好適な実施態様において本発明を説明する以下の
詳細な説明を考慮すれば、本発明のその他の態様及び利
点は当業者には一目瞭然であろう。

図面の簡単な説明図1a及び1bはHCVゲノムを示す。

図２は、HCV接種チンパンジーにおける抗体の存在を
同定するための、抗原性ポリペプチドの使用を示す。

図3a及び3bは、組合わせアッセイ方式を使用した場合
の感受性の向上を示す。

図４は、イムノドットアッセイ用のテストカートリッ
ジを示す。

図５は抗NS5 S/N抗体の量（白四角間の実線として示
す）及び抗HCV 2.0 S/CO抗体の量（黒四角間の実線と
して示す）を処理（presentation）後の日数に対してプ
ロットした血清転換（servoconversion）のグラフを示
す。

発明の詳細な説明本発明は、試験サンプル中においてHCV抗原に対する
抗体を検出するためのアッセイに関する。好ましい方式
では、ヒト血清又は血漿をサンプル希釈後で希釈し、HC
V抗原性エピトープを含むポリペプチドでコーティング
したポリスチレンビーズと共にインキュベートする。サ
ンプル中に抗体が存在する場合、それらは抗原性ポリペ
プチドと共に複合体を形成して、ポリスチレンビーズに
結合される。複合体形成後、結合しない物質及び試薬は
ビーズと洗浄により除去され、ビーズ−抗原抗体複合体
を、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した、ヒト抗体
に対するヤギ抗体を含んだ溶液と反応させる。次いで、
このペルオキシダーゼ酵素は、既にビーズに固定された
抗原−抗体複合体に結合する。最終反応では、西洋ワサ
ビペルオキシダーゼはｏ−フェニレンジアミン及び過酸
化水素と接触して、黄橙色に発色する。色の濃さは、ビ
ーズに固定した抗原と最初に結合する抗体の量に比例す
る。

HCV抗原性エピトープを有する好ましいポリペプチド
は、免疫学的に反応性のある他の既知物質と類似のアミ
ノ酸配列を有し且つ免疫学的に何らかの反応性を持つと
同定された部分から選択した。ポリペプチドの免疫学的
反応性は、HCVゲノムのcDNAフラグメントで形質転換さ
せた大腸菌クローンの細胞抽出物と、HCV感染血清とを
反応させて最初に同定した。クローンは、取込まれたcD
NAによってコードされるポリペプチドを発現すると推定
された。このポリペプチドはHCV抗原に対する抗体を含
んでいることが分かっている血清と免疫学的に反応し
た。しかしながら、所与のアミノ酸配列の分析からは、
免疫学的反応性を予知する上での大まかな手掛かりしか
得られない。所与のアミノ酸配列を作成し、アッセイ中
でその疑わしい配列をテストする以外には、免疫学的活
性を確定する一定不変の予想法は無い。表１に示す如
く、免疫学的反応性を提供すると予想される数種のペプ
チドが、実際のアッセイで使用すると反応しないことが
判明した。

492nmでの吸光度が陰性対照の吸光度値の４倍以上で
あれば（S/N≧4.0）、サンプル値は陽性であるとみなさ
れる。

A00642 NANB（HCV）肝炎回復患者からのヒト血漿サン
プル。患者はNANBであると臨床学的に診断され、HBV及
びHAVマーカーに対しては陰性であった。

＃491 Ｃ−100に基づくスクリーニングアッセイで陽性
のヒト血漿ドナー。既知の臨床病歴はなし。

＃423 Ｃ−100−３に基づくスクリーニングアッセイで
陽性のヒト血漿ドナー。既知の臨床病歴はなし。

HCV抗原のエピトープを１つ以上有するポリペプチド
を使用して行ったHCV抗原に対する抗体の存在の検出を
図２に示す。組換えC100−３ポリペプチドを使用するア
ッセイ、及びp1689ポリペプチドを使用する他のアッセ
イで、チンパンジーMelilotのHCV感染の過程をフォロー
した。いずれのアッセイも接種前は陰性の結果が出た。
またいずれのアッセイもこの動物がHCVに感染してから
約100日後に抗体の存在を検出した。

免疫学的に反応することが判明した本発明のポリペプ
チドを調製するために合成法及び組換え法の両方を使用
する方法は幾つか知られている。好ましくは、自動化合
成機を用いてポリペプチドを製造することができる。p1
684の合成を以下に示す。

p1684の合成： G.Barany及びR.B.MerrifieldがThe Peptides（E.Gro
ss and R.Meinhoeffer,eds.）2,1−284（1980）Acade
mic Press.New York,NYに記載の一般的な手順に従っ
て、完全に保護されたペプチドを段階的固相合成（カル
ボキシル末端残基で始める）によってフェニルアセトア
ミドメチル（PAM）上で組み立てた。オキシメチルフェ
ニルアセトアミドメチル（OMPA）リンケージでＣ末端ア
ミノ酸バリン（Cal）を固相担体にはカップリングさせ
て、トリフルオロ酢酸（TFA）での長い処理に対して改
善された安定性を示すPAM樹脂を得た。BOC−Val−OCH₂
−PAM−樹脂（0.78mmol/g,0.13g）をApplied Biosyste
ms Peptide Synthesizerモデル430Aの反応容器に移し
た。Applied Biosystemsの小規模高速サイクルプロト
コルを用いて、Ｎ末端に向けてカルボキシル末端から始
まる全てのその後のアミノ酸を段階的にカップリングさ
せた。保護されたアミノ酸を、アスパラギン、グルタミ
ン、アルギニン及びヒスチジンの予備生成した対称無水
物に関する化学技術を用いてカップリングし、Ｎ−Ｎ′
−ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）/1−ヒドロ
キシベンゾトリアゾール（HOBT）に関する化学技術を用
いて２度カップリングした。第１のカップリングでは、
予備生成した対称無水物をジメチルホルムアミド（DM
F）に溶解したものを用いて、保護されたアミノ酸をカ
ップリングした。個々のアミノ酸の対称無水物を塩化メ
チレン中で生成し、次いで溶媒をDMFに変えて、ペプチ
ド合成機の反応容器に移した。対称無水物の第２のカッ
プリングもDMFで実施した。使用した全てのアミノ酸の
Ｎ−アミノ基をｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−BO
C）リンケージで保護した。種々のアミノ酸の側鎖官能
基は以下の基で保護された： Arg−Tos （トシル） Lys−2Clz （２−クロロベンジルオキシカルボニル） Thr,Ser−Bzl （ベンジル） Tyr−2BrZ （２−ブロモベンジルオキシカルボニル） Cys−4MeBzl （４−メチルベンジル） Asp,Glu−0Bzl （０−ベンジル） His−DNP ジニトロフェニル完全に保護されたペプチド−樹脂（0.2g）を５分間塩
化メチレン（CH₂Cl₂）中で膨潤させた。ペプチド−樹脂
を手動操作の反応容器に移し、５％チオフェノールのDM
Fで２度、それぞれ20分間処理し、次いでCH₂Cl₂で６
度、それぞれ１分間洗浄し、次いで合成機の反応容器に
移した。次に、製造業者のプロトコルに従って60％TFA/
CH₂Cl₂を用いてｔ−BOC保護基を除去し、次いで部分的
に脱保護したペプチド−樹脂を真空下、室温で一晩乾燥
した。

部分的に脱保護したペプチド−樹脂を硫化ジメチル
（DMS［1ml］、ｐ−クレゾール［1ml］、ｐ−チオクレ
ゾール［0.2g］及びHF［10ml］）によって０℃で１時間
処理して、樹脂担体からペプチドを開裂させた。HF/DMF
及び他の揮発物を０℃で真空蒸留した。開裂させたペプ
チドと樹脂とを15mlのジエチルエーテルアリコートで３
度洗浄し、それぞれ40％酢酸水溶液と15％酢酸水溶液と
からなるアリコート10mlで３度洗浄して、開裂したペプ
チドを抽出した。水性抽出物を合わせ、ジエチルエーテ
ルアリコート15mlで３度洗浄し、次いで凍結乾燥して、
粗ペプチドを得た。

C₄,4.6×30mmカラム（Brownlee,Applied Biosystem
s,Inc.,Foster City,California）を用い、1ml/分の流
速で、0.1％水性TFA（Ａ）及び100％アセトニトリル
（Ｂ）を溶媒系とする逆相高速液体クロマトグラフィー
で粗ペプチドの純度を分析した。このペプチド分析で使
用した好ましい溶媒勾配は最初、Ｂ溶媒を30％にした。
カラムを30％Ｂで１分間保持し、次いで線形勾配を用い
て20分で55％Ｂまで上昇させ、そこで１分間保持した。
最後に、カラム濃度を２分間で30％Ｂに下げた。溶離剤
中でのペプチドの存在を、225nm及び280nmで同時に監視
した。精製ペプチドの組成を酸加水分解で決定した。酸
除去後に、Beckmar6300アミノ酸分析機で水解物を分析
した。

精製ポリペプチドの量を増したければ、C₄,10×100mm
のカラム（Brownlee,Applied Biosystems,Inc.,Foster
City,California）を用い、前述したのと同じ0.1％水
性TFA（Ａ）及び100％アセトニトリル（Ｂ）を溶媒系を
使用して、同様に半製（semi−preparative）逆相高速
液体クロマトグラフィーを実施した。半製検査の好まし
い溶媒勾配は最初、3ml/分で２分間27％Ｂとし、次いで
線形勾配を用いて20分で50％Ｂに増した。濃度を50％Ｂ
で１分間保持し、次いで１分以内に27％Ｂに下げた。

本明細書に記載する他のペプチドを、前述した合成と
同様の方法で固相担体上に組み立てた。アミノ酸：トリ
オトファン及びメチオニンが存在する場合、これらは側
鎖を保護せずに使用した。通常鎖組み立て中にメチオニ
ンを組み込んだ後に、エタンジチオール（0.1％v/v）を
TFAに加えて、その後ｔ−BOC基を全て除去した。しかし
ながらDNPによって保護されたヒスチジンが配列中に存
在する場合は、エタンジチオールをTFAに加えなかっ
た。代わりに、インドール（１％v/v）を使用した。更
には、トリプトファンを組み込んだ後に、インドール
（１％v/v）をTFA溶液に加えた。

樹脂からのHFの開裂及びペプチドの精製を本質的には
以下で説明するように実施した。

前述した方法で合成したペプチドの抗原性／免疫原性
を評価した。アミノ末端で始まり、カルボキシ末端で終
わる免疫学的に反応性のペプチドのアミノ酸配列の概要
を表２及び表８に示す。

表２に示すポリペプチドは、当業者に公知の種々の側
鎖保護方法を用いて、段階的に又はフラグメントカップ
リングプロトコルで調製しても良い。ポリペプチドを酵
素方法を用いて調製しても良い。

更には、本発明を実施する上で有用なポリペプチドを
組換え技術を用いて調製しても良い。簡潔に言えば、所
望のポリペプチドをコードするDNA配列を所望の完全配
列のフラグメントから組み立てることが好ましい。フラ
グメントは一般に、良く知られている自動化された方法
及び装置を用いて作成する。完全な配列を作成した後に
発現ベクター内に所望の配列を組込み、宿主細胞内で形
質転換させる。次いで、DNA配列が宿主細胞によって発
現されて、所望のポリペプチドが得られる。これを宿主
細胞又は宿主細胞が培養されている培地から採取する。
大抵の場合、作成されたDNA配列は、宿主細胞内で最も
よく発現されることが知られているコドンを用いて組み
立てられる。組換え技術を用いてより小さいペプチドを
調製しなければならないときには、鎖状につながった所
望のポリペプチドの幾つかのコピーをコードする単一の
DNA配列を作成することが有利であり得る。次いで長鎖
を単離し、鎖を開裂させて、より短い所望の配列にす
る。

p1684のアミノ酸配列を逆翻訳すると、大腸菌での高
い発現レベルを容易にするために最適化された（フラグ
メントの組み立て合成と相容れないものではない）表３
に示すコドンが得られる。個々のオリゴヌクレオチドは
製造業者が推奨する方法及び試薬を用いてApplied Bio
system 380A DNA合成機で合成される。これらの精製
オリゴヌクレオチドをアニールし、連結させてDNA配列
全体を組み立て、BamH I Sa IIで消化し、連結によっ
てpUC18を得る。得られたプラスミドを大腸菌JM103細胞
に形質転換することが好適である。表３は更にp1及びp1
223を発現するための好ましいコドンを示す。

クローンがDNA配列を発現することを確定するため
に、クローンを250mlのErylenmeyerフラスコ内にて、50
mlのLria Brothを用いて37℃で成長させる。培養物のO
D600が0.3−0.5に達すると、IPGTを加えて最終濃度を1m
Mにし、発現を誘発する。サンプル（1.5ml）を１時間の
間隔で除去し、細胞をペレット化し、２×SDS/PAGE装填
緩衝液に再度懸濁させて、OD600を10.0にする。調製し
たサンプルのアリコート（15μｌ）を15％SDS/PAGEゲル
上に装填し、発現したポリペプチドを分離し、次いでイ
ムノプロットのために電気泳動でニトロセルロースに移
動させる。移動したタンパク質を含むニトロセルロース
シートをブロッキング溶液と共に１時間インキュベート
し、５％大腸菌JM103溶解物を含むTBSで希釈したHCV患
者血清と共に４℃で一晩インキュベートする。ニトロセ
ルロースシートをTBSで３度洗浄し、次いで10％ウシ胎
児血清を含むTBSで希釈したHRPO標識ヤギ抗ヒトIgGと共
にインキュベートする。ニトロセルロースをTBSで３度
洗浄し、2mg/mlの４−クロロ−１ナプトールと、0.02％
過酸化水素と、17％メタノールとを含むTBSで発色現像
する。HCV患者の血清では免疫反応の強いバンドが形成
され、このことは、合成ポリペプチドが免疫学的に反応
性の形態で大腸菌に発現されることを示している。

前述したポリペプチドを用いる好ましいアッセイ方式
を以下の実施例で説明する。しかしながら、当業者に公
知の他のアッセイ方式を使用してもよい。これらのアッ
セイには、イオン捕捉アッセイ、極微粒子アッセイ、及
び少なくとも１種のポリペプチドを固相にくっ付けて、
試験用血清と接触させ、抗原−抗体複合体について固相
表面を走査する走査型トンネリング（tunneling）顕微
鏡検査の使用が含まれる。

実施例１では確認アッセイを説明する。実施例２では
組合わせアッセイを説明する。実施例３では合成ポリペ
プチドをベースとするアッセイを説明する。実施例４で
はイムノドットアッセイを説明する。実施例５では競合
アッセイを説明する。実施例６では、ペプチド380−43
6、447−483、643−683及び2302−2352を使用するEIAア
ッセイを説明する。実施例７ではペプチドp380.LGを使
用するEIAを説明する。実施例８では、ペプチド2302（N
S−５）を使用するEIAを、抗原NS3（CKS−33C,NS4（Ｃ
−100）又はCORE（CKS−CORE））を使用するEIAと比較
して説明する。実施例９では適用するPEPSCANプロトコ
ルを説明する。実施例10では、４つの異なるHCV単離物
の配列をベースとする合成ペプチドの調製を説明する。
実施例11では、実施例10のペプチドを使用しての慢性患
者及び血漿ドナーに関する研究から得られたデータを説
明する。これらの実施例は例示的であって、本発明の範
囲を制限するものではない。

実施例実施例1.確認アッセイ確認アッセイは、異なる源から調製して、単離するこ
とが好ましい、HCV抗原性エピトープを含む少なくとも
２種のポリペプチドを使用する。一方のポリペプチドは
血清又は血漿サンプルのスクリーニングに使用する。他
方のポリペプチドは、スクリーニング手順によってHCV
抗体を含むとして最初に同定されたサンプル中にHCV抗
体が存在することを確認するために使用する。

本発明の好ましい確認アッセイでは、スクリーニング
手段で組換えC100−３ポリペプチドを使用する。C100−
３組換えポリペプチドは、1689−1806アミノ酸配列によ
って規定される免疫優性領域及び多数のエピトープを含
むと考えられる。ヨーロッパ特許出願公開第０ 318 2
16号に記載の如く、C100−３ポリペプチドを組換え酵母
細胞中に発現して、細胞抽出物から単離する。殆どがC1
00−３の複製であるアミノ酸配列を含む他の組換えポリ
ペプチドを使用しても良い。

確認アッセイで使用する他のペプチドは、p1、p35、p
99、p1192、p1223、p1684、p1689、p1694、p1866及びp1
899からなる群の中から選択される合成ペプチドであ
る。好ましいペプチドはP1684又はp1866である。前述し
た手順に従ってこれらのペプチドを調製した。確認アッ
セイでは、C100−３と、合成ペプチドのp1684、p1694又
はp1866とを別々にポリスチレンビーズ上にコーティン
グした。所望とあれば、ポリスチレンビーズ上にコーテ
ィングした合成ペプチドを組合せて使用しても良い。

ポリスチレンビーズをまず、蒸留水及びプロパノール
で洗浄し、次いで約0.4〜0.5M NaClと約0.0022％トリ
トンＸ−100とを含み、pHを約6.5〜10.0に調整した適切
な0.1M緩衝溶液で0.1〜20.0μg/mlに希釈した粗又は精
製HCV合成ペプチドと共にインキュベートする。以下の
緩衝液：トリス、NaH₂PO₄・H₂O、硼酸及びクエン酸塩緩
衝液が好ましく、各ペプチドについて最適化されてい
る。合成ペプチドのための好ましい緩衝液、pH及びコー
ティング濃度を表４に示す。pHが規定範囲よりも低くな
っても高くなってもうまくコーティングできる。ビーズ
を抗原溶液中にて38〜42℃で約２時間インキュベート
し、リン酸緩衝液（PBS）で洗浄し、0.1％トリトンＸ−
100のPBS中に38〜42℃で60分間浸軟させる。次いでビー
ズをPBSで２度洗浄し、５％（w/v）ウシ血清アルブミン
（BSA）のPBS溶液を用いて60分間でオーバーコーティン
グし、PBSで３度洗浄する。最後に、ビーズを５％（w/
v）スクロースのPBSでオーバーコーティングし、窒素下
又は空気中で乾燥する。

ペプチドをそれぞれ別個にポリスチレンビーズ上にコ
ーティングして、抗体捕捉方式で使用する。400μｌの
サンプル希釈液及びペプチドでコーティングしたビーズ
と共に、10μｌのサンプルを反応トレーのウェルに加え
る。サンプル希釈液は、約10％（v/v）以下のウシ血清
及び約20％（v/v）以下のヤギ血清の20mMトリスリン酸
塩緩衝液からなり、これには0.20％（v/v）以下のトリ
トンＸ−100と、３％（w/v）以下のBSAとが含まれてい
る。組換え酵母C100−３ポリペプチドを使用するときに
は、試験サンプル中に存在し得る酵母抗原に対する抗体
を、サンプル希釈液に加える酵母抽出物（通常約200μg
/ml）と反応させる。サンプル希釈液に酵母抽出物を加
えて、偽陽性結果を防止する。最終材料を滅菌濾過し、
プラスチック瓶に詰め、0.1％アジ化ナトリウムで保存
する。

40℃で１時間インキュベートした後にビーズを洗浄
し、反応トレーのウェルに結合体200μｌを加える。

好ましい結合体はヤギ抗ヒトIgG西洋ワサビペルオキ
シダーゼ結合体である。結合体濃縮液は、Kirkegaard
and Perry Laboratories,Inc.Gaithersburg,Maryland
から購入し、力価を測定して、処理濃度を決定する。次
いで、濃縮液を処理濃度の20倍の濃度になるまで希釈液
で希釈する。結合体希釈液は、10％（v/v）ウシ血清
と、10％（v/v）ヤギ血清と、0.15％トリトンＸ−100と
の20mMトリス緩衝液（pH7.5）中に0.01％ゲンタマイシ
ンスルフェートと、ピンク色素と、保存料としての抗菌
剤とを加えたものからなる。結合体を滅菌濾過して、プ
ラスチック瓶に詰める。

結合体と共に40℃で１時間インキュベートした後に、
ビーズを洗浄し、OPD基質に室温で30分間暴露し、1N H
₂SO₄を加えて反応停止させる。492nmで吸光度を読取
る。

ポリペプチドC100−３を用いたスクリーニングアッセ
イで繰り返し反応性があることが判明したサンプルを、
p1684又はp1689でコーティングしたビーズを用いて２組
で検査する。反応性のある検体は確認されたサンプルと
みなされる。p1684とp1689とも反応しないサンプルは、
p1694及びp1866ビーズを用いて２組で検査する。これら
のペプチドの一方と又は両方と反応するサンプルは確認
されたとみなされる。これらのペプチドのいずれとも反
応しない検体は確認されないとみなされる。

許容し得る特異性を維持するために、アッセイのカッ
トオフ（cutoff）は、正常母集団平均の吸光度値よりも
少なくとも５〜15標準偏差高くなければならない。これ
らの基準にそって、推定されるほとんどの“真の陰性”
を“真の陽性”検体から明確に区別するアッセイ用カッ
トオフを選択してもよい。一般的なカットオフ値は、陰
性対照の平均吸光度値の約2.1〜８倍として計算しても
良い。

確認アッセイの性能 1.静脈薬使用者サンプル NIHから資金提供を受けた研究に登録された静脈薬使
用者の母集団からサンプルを採取した。母集団は、個
体、即ちイリノイ州メイウッドのEdward Hines Jr.Ve
teran's Administration Hospitalの患者からConnie
Pachucki医師及び感染病医員のメンバーが２年かけて
選択した承認静脈薬使用者からなっていた。

表５に示すように、各々一人のドナーから得た総計29
6検体を、組換え酵母C100−３ポリペプチドを用いてス
クリーニングした。最初に検査した296検体中合計271検
体（91.6％）が陽性であり、再検査では271検体中269検
体（99.3％）が繰り返し陽性であった。

確認検査によれば、繰り返し陽性であった269検体中2
63検体（97.8％）がp1689と反応し、５検体がp1689とは
反応せず、１検体は確認ポリペプチドを用いる検査を行
わなかった。p1689と反応しなかった５検体中４検体がp
1866とのみ反応し、p1689と反応しなかった１検体はp16
94とのみ反応した。

繰り返し反応性のあった全ての検体がHCV合成ペプチ
ドを用いるアッセイで反応性ありと確認された。

2.チンパンジーサンプル確認アッセイを使用して、６匹のチンパンジーの92サ
ンプルを評価した。最初全てが組換えC100−３と反応し
た。（これらの検体の性質が稀なものであり、また他の
HCV抗原を用いる血清学的研究に使用するために、チン
パンジー血清は２度繰り返して検査しなかった）。p168
9を使用すると、92検体中83検体（90.2％）が反応性あ
りと確認された。p1694及びp1866を用いて繰り返し検査
すると、最初に反応性ありと確認された割合が96.7％
（92検体中89検体）に向上した。

3.Chiron Corporation非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス向上（p
roficiency）パネル＃２ HCV C100−３に対する抗体を含む検体（12検体）を
包含する純粋及び希釈ヒト血漿からなる向上パネルをCh
iron Corporationの科学者から入手した。このパネル
は、他のアッセイでの反応性が低いものから高いものま
でを包括する検体、非反応性であると推定される“真の
陰性”検体、及び希釈すると結果が低レベルになるか又
は陰性になる反応性検体からなる。

Chiron Corporation非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス向上パ
ネル＃２で確認アッセイを行った結果は、事前のスクリ
ーニングアッセイで反応性を示した９検体中９検体（10
0％）がp1689によって確認されることを示している。全
ての陰性検体は非反応性であった。

4.NANBパネルIIでの確認検査感染性HCV血清と、陰性血清と、他の疾病対照とから
なる、Dr.H.Alter,NIH,Bethesda,MDの血統の明らかな
（highly pedigreed）既往歴の高いヒト血清のパネルを
検査した。総計44検体がパネルに存在した。

表６に示すように、C100−３を用いるアッセイで反応
性を示した全ての検体（16/16、100％）がp1689によっ
て確認された。更には、全ての血統の明らかな陰性又は
“他の疾病”対照はペプチドアッセイで反応性を示さな
かったので、非特異的反応性はなかった。

示すデータはHCV抗原に対する抗体の検出での確認ア
ッセイの有効性を証明している。このアッセイはHCV抗
原に対する抗体の検出の感受性及び特異性を示す。

データは更に、合成ペプチドを用いる確認方式の有用
性を証明している。合成ペプチドは、イムノアッセイで
使用する独立した抗原源として機能する。危険性の高い
又は血統の明らかな陽性HCVパネルで繰り返し反応性を
示す検体の平均99％を確認できるということはこの方式
が有用であることを証明している。

実施例2.組合せアッセイ組合せアッセイは同一ビーズ上にコーティングされた
１種以上のポリペプチド抗原を使用する。複数のポリペ
プチドを含むビーズを調製するには、実施例１で記述し
たポリスチレンビーズを適切な緩衝溶液中で同時にポリ
ペプチドに接触させる。ビーズをポリペプチドと接触さ
せた後に、更に前述したように処理する。

C100−３及びp1694を含むポリスチレンビーズの場
合、アッセイの感受性は増す。図3aに示すグラフのよう
に、実施例１の検出手順を使用するときに、コーティン
グ溶液にそれぞれ約0.3、0.95及び３μｇのp1694を加え
ると、シグナルがかなり増す。図3bのグラフのデータか
らは、陰性ヒト血漿から発生する（非特異的結合に伴い
得るような）シグナルの対応的な上昇がないことが分か
る。

実施例3.合成ポリペプチドをベースとするアッセイ HCV抗原のエピトープを含む合成ポリペプチドを使用
して、SOD融合ポリペプチドC100−３を用いるHCV免疫ア
ッセイよりも特異的であり得る、感受性の増した免疫ア
ッセイを行う。ポリスチレンビーズ上でより短いアミノ
酸配列を使用すると、感受性が増す。

合成ポリペプチドを用いるアッセイでは、組換えC100
−３ポリペプチドの場合と比べて感受性が増すことを系
列希釈研究で実証した。系列希釈研究では、組換えC100
−３スクリーニングアッセイを用いてHCV抗原に対する
抗体を有すると同定された15サンプルを使用した。第１
のアッセイでは組換えC100−３ポリペプチドを、第２の
アッセイではp1689ポリペプチドを用いて各陽性サンプ
ルをアッセイした。次いで、S/CO値が１未満になるまで
サンプルを２倍に希釈した。12サンプルではp1689ポリ
ペプチドが全ての希釈度で感受性を増し（S/CO値がより
大きくなり）、２サンプルではp1689ポリペプチドと組
換え酵母C100−３ポリペプチドとがほとんど同等であっ
た。１サンプルではp1689ポリペプチドが全ての希釈度
で陽性サンプルに対して陰性反応を示す。

急性HCV感染の回復症例を示す３匹のチンパンジー
と、慢性HCV感染を示す３匹のチンパンジーとの連続採
血からのサンプルに関する他の研究で、免疫反応に相違
があることが判明した。この差は感染の型及びアッセイ
で使用するポリペプチドによるものと考えられる。この
研究では、HCVを接種した６匹のチンパンジーの連続採
血からの血清をアッセイした。アッセイプロトコルは実
施例１に記述したプロトコルと同様であったが、以下の
点が異なる。

西洋ワサビペルオキシダーゼにカップリングされたヒ
トIgG,IgM及びIgAに対する親和性精製ヤギ抗体を0.2μg
/ml抗IgG、0.5μg/ml抗IgM及び0.2μg/ml抗IgAの処理濃
度で使用して、抗体IgG,IgM及びIgAを検出した（Kirkeg
aard ＆ Perry Laboratories,Inc.,Gaithersburg,Ma
ryland）。各アッセイの血清希釈度は、IgGで1:41、IgM
で1:101、IgAで1:41であった。

この研究で使用したポリペプチドはC100−２、p169
4、p1689及びp1866である。

簡潔に言えば、ポリペプチドを含むビーズを希釈血清
と共に40℃で１時間インキュベートし、次いでビーズを
洗浄し、適切なヤギ抗体と共に40℃で１時間インキュベ
ートした。ビーズを再度洗浄し、ビーズをOPDと共に室
温で30分間インキュベートすることによってアッセイを
発色現像した。発色現像を1N硫酸で終了し、結果を492n
mで読取った。

全てのチンパンジーは、７〜17の接種後ウェル（WP
I）内でC100−３、p1684及びp1866によって検出される
抗体を産生した。各チンパンジー内では、C100−３、p1
684及びp1866と反応するIgG抗体がほぼ同時に出現し
た。p1694及びp1866に対する反応はこの期間内に変動
し、このことは、これら２種のペプチドに対する抗体が
HCV感染後に検出不能であるか又はかなり遅れて検出さ
れることを示している。これらのデータは、検査した５
種のペプチドの中で、C100−３、p1684又はp1689に対す
る抗体がHCV感染を最も早く示す、最も一貫した血清学
的指標であることを示唆している。

IgM抗体は、検査した６匹のチンパンジーのうち３匹
だけで検出された。３匹の動物の各々のC100−３、p168
4、p1689及びp1694に対する反応を７〜10のWPIで検出し
たが、p1866に対するIgM抗体は２匹のチンパンジーで検
出されず、残りの１匹は遅れて検出した。全てのIgM反
応は短命で、そのレベルは２週間から22週間以内に陽性
以下に下がった（S/Nは3.0未満）。

急性疾病から回復した３匹のチンパンジーでIgM抗体
が確認されたが、慢性感染の３匹のチンパンジーでIgM
抗体が検出されなかったことは予想外である。予備実験
の結果によれば、好ましいIgM結合によって偽陰性IgM結
果が出ることはありそうもない。５種のペプチドを用い
てこれら６匹のチンパンジーで観察されたパターンが真
実であれば、抗体アッセイは重要なHCV予後情報を提供
する。

６匹のチンパンジーのうち２匹だけで陽性IgA反応（S
/Nは3.0以上）が検出され、反応が２段階であるか又はI
gG又はIgM反応よりもかなり遅いことが証明された。こ
れら２匹のチンパンジーは慢性疾患であったが、３匹の
回復したチンパンジーの血清は30〜40WPIでのみ利用可
能なので、IgA抗体の重要性に関する結論を出すことは
できない。

ポリペプチドは、HCV抗原に対する抗体をアッセイす
るために使用すると、HCV感染の進行をフォローするの
に有用であり、またポリペプチドは、HCV感染の臨床学
的進行中に産生する種々の抗体に対して予期しない感受
性を示すことが結果から分かる。

実施例4.イムノドットアッセイイムノドットアッセイ系は、ニトロセルロース固相担
体上のアレーに置かれた精製合成ポリペプチドのパネル
を使用する。調製した固相担体をサンプルと接触させ、
HCV抗原に対する特異抗体を捕捉する。捕捉した抗体を
結合体特異反応によって検出する。1988年８月２日付け
米国特許出願第07/227.408号に記載の機器内で反射率光
学素子アセンブリを用いて結合体特異反応を定量するこ
とが好ましい。関連する米国特許出願第07/227,272号、
米国特許出願第07/227,586号及び米国特許出願第07/22
7,590号は更に、イムノドットアッセイを実施するのに
有用な特定の方法及び装置を開示している。簡潔に言え
ば、前記イムノドットアッセイを実施するために自動化
プロセスで使用され得るニトロセルロースをベースとす
るテストカートリッジを図４に示す。各ポリペプチドは
テストカートリッジ上の特異反応区域内に含まれる。全
ての抗原性ポリペプチドをニトロセルロース上に配した
後に、ニトロセルロース上の過剰結合部位を阻止する。
次いで、サンプルが適切な抗体を含んでいれば、各反応
区域内の抗原性ポリペプチドが反応するようにテストカ
ートリッジを試験サンプルと接触させる。反応後、テス
トカートリッジを洗浄し、良く知られた適切な試薬を用
いて任意の抗原抗体反応を同定する。

前述の特許出願に記載の如く、プロセス全体を自動化
することが可能である。先に引用したイムノドットアッ
セイを実施するための方法及び装置に関するこれらの出
願明細書は、参照によって本明細書の一部を構成するも
のとする。

好ましいイムノドットアッセイでは、合成ポリペプチ
ドp1223、p1684、p1689、p1866を緩衝水溶液（ポリペプ
チド希釈剤:0.03％トリトンＸ−100及び0.1％アジ化ナ
トリウムの50mMヘペス緩衝液、pH7.6）中で希釈し、各
反応区域で約40ngを、予め組み立てたニトロセルロース
テストカートリッジに適用した。カートリッジを室温で
一晩乾燥した後に、ニトロセルロース相の非特異的結合
能力を阻止した。ブロッキング溶液は１％ブタゼラチン
と、0.1％カゼイン酵素水解物と、５％トウィーン−20
と、0.1％アジ化ナトリウムと、0.5M塩化ナトリウム
と、20mMトリスpH7.5とからなっている。

テストカートリッジをサンプル00642、423（表１参
照）及びALT27と共にインキュベートした。サンプルALT
27は、アラニンアミノトランスフェラーゼのレベルが高
い有志ドナーから入手した。サンプルをインキュベート
した後に、ビオチン結合ヤギ抗ヒト免疫グロブリン特異
抗体、アルカリ性ホスファターゼ結合ウサギ抗ビオチン
特異抗体及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル
ホスフェートで続けてインキュベートして、反応部位で
着色産物を得た。

検出可能な反応は、アレー上の抗原部位に肉眼で識別
できる物質が生成されることによって規定される。機器
で定量すると、バックグラウンド上方で（above backgr
ound）約0.0150以上の反射率密度値（Dr）が得られる。
被試験ポリペプチドのいずれも、組換えC100−３ポリペ
プチドを用いてHCV抗原に対する抗体に対して予め陰性
であることが証明された陰性対照血清との検出可能な反
応を引出さなかった。

調製した試験細胞をサンプル00642（陰性血清が1:100
で希釈）又はサンプル423（陰性血清が1:40で希釈）と
共にインキュベートすると、合成ポリペプチドp1684、p
1689、p1694、p1866の各々との反応が生起した。ポリペ
プチドp1684、p1689、p1694及びp1866の他に、ポリペプ
チドp1223がALT27の多い検体とかなり反応した。全ての
検体でp1689との反応性が最も高かった。抗原希釈を微
妙に変えると、ポリペプチドp1684とサンプル00642との
反応性が高まった（改変したポリペプチド希釈剤は0.5M
塩化ナトリウムと、0.0022％トリトンＸ−100と、0.1M
トリス/HCl、pH8.5とからなっていた）。

陰性反応又は陰性反応を示すポリペプチドp1223、p16
84、p1689、p1694及びp1866を含むテストカートリッジ
の正味（net）反射率（Dr）を表７に示す。

実施例5.競合アッセイ抗原性HCVエピトープを含む合成ポリペプチドは競合
アッセイにおいて有用である。中和アッセイを行うに
は、C100−３領域にあるエピトープを表わすペプチド
（例えばp1694、p1684又はp1689）が34であり、最終濃
度が0.5−50μg/mlななるように検体希釈剤と混合す
る。検体又は希釈検体10μｌを反応ウェルに加え、ペプ
チドを含む検体希釈剤400μｌを加えて、所望とあれば
混合物を約15分から２時間プレインキュベートしてもよ
い。次いでHCVのC100−３抗原でコーティングしたビー
ズを反応ウェルに加えて、40℃で１時間インキュベート
する。洗浄後、結合体希釈剤中のペルオキシダーゼ標識
ヤギ抗ヒトIgG 200μｌを添加して、40℃で１時間イン
キュベートする。洗浄後、OPD基質を加えて、室温で30
分間インキュベートする。1Nの硫酸を添加して反応を停
止させ、吸光度を492nmで読み取る。

C100−３抗原に対する抗体を含んだサンプルは、溶液
中にあるこれら抗体に対するペプチドの競合的結合によ
ってシグナルの低下を起こす。競合結合率％は、合成ペ
プチドの存在下でのサンプルの吸光度値と、合成ペプチ
ドなしでアッセイしたサンプルの吸光度値とを同一希釈
度で比較して計算してもよい。

実施例6.EIAアッセイ実施例１に記載の方法に従って、ビーズをペプチド38
0−436と、447−483、643−686又は2302−2353とでコー
ティングした。但し、ペプチド380−436及び447−483は
同一の固相担体上で同時にコーティングした。いずれの
配列もHCVの推定上のエンベロープ領域に由来するもの
である。この型のアッセイでは一方のペプチドだけが活
性を示した。本明細書に記載の各ビーズ配置を用いてEI
Aを実施した。EIA法を実施例１に記載の如く実施し、カ
ットオフは陰性対照値の４倍に設定した。慢性NANBHと
診断された患者の血清検体で行ったこれらのアッセイで
得られたデータを表９に示す。

実施例7.P380.LG及びp380を使用するEIA ビーズを実施例１に従ってp380.LG又はp380でコーテ
ィングした。実施例１の手順に基づくEIAを用いて、サ
ンプルをアッセイした。表10に示すデータで分かるよう
に、p380.LGペプチドは、p380に対して陰性の検体中で
抗体を検出した。HCV配列は領域380−436a.a.で変異性
が大きい。従って恐らく、これらのエンベロープ領域ペ
プチド配列の一方とヒト検体との反応性に基づくHCV
“血清型”間の分化（differentiation）が可能であろ
う。表10のデータは、p380.LGが、p380に対して陰性の
慢性HCV感染患者を検出できることを示唆している。

実施例8.p2302を使用するEIA 実施例１の方法に従って、ビーズをp2302又は組換えH
CV抗原でコーティングした。組換え抗原でコーティング
したビーズは、HCVゲノムのNS3（CKS−33C）、NS4（Ｃ
−100）及びCore（CKS−CORE）領域由来の抗原を含んで
いた。HCV2.0の抗原ではなく、p2302への血清転換を示
した患者サンプルを図５に示す。従って、このペプチド
はHCV感染患者を検出する能力を向上させる。

実施例9.PEPSCANプロトコル a.a.600−720由来のHCVゲノムのNS1領域をPEPSCAN分
析でマッピングした。この分析は、免疫原性領域を同定
するためのタンパク質配列に及ぶ一連の重複ペプチドの
血清学的分析である。製造業者の指示（Cambridge Res
earch Bioscience,Valley Stream,NY）に従って、ポ
リプロピレン上で合計106個の重複するヘキサマーペプ
チドを合成した。これらのペプチドを用いて、HCVに対
して血清反応陽性の個体の血清から精製したIgGのFabダ
イマーを検査した。（製造業者が記載する指示に従って
実施した）EIAの反応性に基づいて、表11に示すように
４つのペプチド配列を選択した。

カルボキシ末端残基を初めとして、これらのペプチド
の各々を段階的固相合成で合成した。HCVのＣ−100タン
パク質に対する抗体に対して血清反応陽性のパネルで、
抗体とNSペプチドとの反応性を以下に記載するようにマ
イクロタイターEIAで検査した。

EIAプロトコル 10μg/mlのペプチドを含む0.02M重炭酸塩緩衝液（pH
9.5）100μｌで、マイクロタイタープレートのウェルを
室温で12〜16時間かけてコーティングした。リン酸緩衝
溶液（PBS）に0.01％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）と
0.05％トウィーン−20（登録商標）（カルフォルニア州
リッチモンドのBioRad Loboratoriesより入手可）とを
加えたもので洗浄した後に、遊離した部位を１％BSAの
重炭酸塩緩衝液（pH9.5）でオーバーコーティングし
た。プレートを４℃で貯蔵し、次いで最後に洗浄した。

HCV Ｃ−100に対する抗体に対して血清反応陽性の個
体由来の血清を、20mMリン酸ナトリウム（pH7.4）と、
0.15M NaClと、20％正常ヤギ血清と、10％ウシ胎児血
清と、5mM EDTAと、10mM EGTAと、50mMトリスと、0.2
％トウィーン−20と、保存料としてのアジ化ナトリウム
（pH6.8）とからなる緩衝液100μｌで系列希釈した。希
釈した血清を、マイクロタイターウェルのペプチドと37
℃で３時間又は室温で一晩反応させた。プレートを洗浄
し、適切に希釈したヤギ抗マウス（HH）西洋ワサビペル
オキシダーゼ（HRPO）結合抗体（Jackson.Immunochemic
als,West Grove,PA）100μｌを加えた。プレートを37
℃で２時間インキュベートした。最後に洗浄した後に、
Ｏ−フェニレンジアミン2HCl（OPD）着色試薬100μｌを
加えた。暗所にて室温で20〜25分間反応させ、1N H₂SO
₄ 100μｌを加えて反応を停止させた。反応混合物の吸
光度を492nmで記録した。HCV感染について陰性であるこ
とが予め確認された陰性対照を含め、各プレートは３組
にした。希釈度が1:2000のサンプルの吸光度が同一希釈
度の陰性対照の吸光度の３倍ならば、サンプルは反応性
を示すとみなした。これらのサンプルと各ペプチドとの
反応性を表12に示す。

表12の記号の意味は以下の通りである：＋＝A492が陰性対照の３倍を示すサンプル＋＋＝1:5000希釈度まで力価が測定されたサンプル＋＋＋＝1:10,000希釈度まで力価が測定されたサンプル
と強い反応性を示す＊全てのサンプルは、EIA及びウェスタンブロット分析
によってＣ型肝炎ウィルスに対する抗体の存在を示し
た。

実施例10.E2/NS1の５′末端の合成ペプチド HCVのE2/NS1推定構造領域の５′末端は、世界中で研
究されている多数のウィルス単離物の中では核酸含量及
びアミノ酸含量に関して超可変性であることが判明し
た。この領域は宿主免疫監視機構を破壊（defeat）する
ためにウィルス機構に含まれていると考えられるが、証
明はされていない。この領域が体液免疫選択的圧力下で
突然変異しなければならないならば、ウィルスの遺伝子
型変異に対する特異抗体反応がHCV感染患者で検出でき
ねばならない。我々は、この超可変領域内に多数のエピ
トープが存在することを実証し、かくして、フラビウィ
ルス及びペスチウィルスでは、このE2/NS1領域が宿主の
免疫系及び抗原の異なる変異体に対する以後の選択的圧
力にさらされるという仮定を裏付けた。

４つの異なるHCV単離物の配列に基づいて合成ペプチ
ドを調製した。ペプチドは、HCVの広い読み取り枠のア
ミノ酸380からアミノ酸436までの配列を示した。アミノ
酸408−436によってコードされるより小さいペプチドも
合成した。配列はHCV−１（Chiron原型）、HCV G83（p
380.LG）、HCV−JH−１及びHCV−Ｊから得た。ペプチド
HCV−JH−１は、K.Takeuchi等によってNucleic Acids
Research18:4626（1990）に記載されているものであ
り、ペプチドHCV−ＪはN.Kato等によってProc.Nat'l.Ac
ad.Sci.87:9524−9528（December,1990）に記載されて
いるものであった。これらのペプチドは各々同一のゲノ
ム領域によってコードされるが、57アミノ酸の長さのア
ミノ酸配列を基準に最低限25％（25〜35％の範囲）が互
いに異なっている。この領域では同一のHCV−JH−１及
びHCV−Ｊの配列に基づいてペプチド408−436を調製し
た。これらのペプチドの各々を、表４に示すコーティン
グ条件下で固相上にコーティングし、先に説明したエン
ザイムイムノアッセイ（EIA）に関する方法に基づい
て、別々のEIAの抗原ターゲットとして使用した。正常
血漿ドナーの母集団を検査して個々のEIAの特異性を実
証した。全ての分析では、陰性対照サンプルの４倍のカ
ットオフ値を使用した。米国及びイタリアの慢性HCV患
者、米国及びイタリアの急性期HCV患者、並びに米国及
び日本のHCV抗体陽性血漿ドナーからなる母集団を検査
した。

慢性患者及び血漿ドナーに関する研究データを表13に
示す。慢性HCV患者では４種の異なる合成ペプチドの各
々に対して抗体を検出した。米国の患者の中で最もよく
認識された血清型はHCV−１（43.5％）であり、HCV−Ｊ
が最も反応性が低かった（12.9％）。しかしながら、イ
タリアの患者の中では、HCV−G83が最も優性な血清型で
あり（52.0％）、HCV−１（12.0％）がこれらの患者で
最も少なかった。他のHCV抗体に対して陽性を示す米国
血漿ドナーの中で最もよく認識された型はHCV−１であ
った。反応に、HCV−１型は日本のドナーの中で最も認
識されなかった型である。HCV−G83型は日本のドナーで
最もよく認識され、米国のドナーのHCV−１とほぼ同様
の反応性を示した。

数人のHCV感染患者の急性期で、これらの血清型の少
なくとも一つへの血清転換が観察された。ある血清型に
対する抗体シグナルの損失及び第２の血清型への併発
（concurrent）血清転換が１人の患者で観察された。

米国の血漿ドナーのグループの中には、使用する４つ
全ての型のペプチドに対して検出可能な抗体を有する検
体が３つあった。このことは、380−436領域内に少なく
とも１つの保持されたエピトープが存在することを示唆
している。この領域の後半部分（a.a.408−436）内の配
列は４つのウィルス単離物の中により保持されているの
で、このペプチドは、この領域では同一のHCV−JH−１
配列及びHCV−Ｊ配列ひ基づいて調製された。これら３
つの全ての検体は更に、このようにより小さく、より保
持された領域と反応を示した。このことはこれらの境界
線内に保持されたエピトープが存在することを示してい
た。

我々のデータはこのように、HCV E2/NS1の超可変領
域内に少なくとも２つのエピトープが存在することを示
している。結論としては、この領域内で遺伝子型が変異
すると、抗原の異なるHCV変異体が生じる。世界の様々
な地域の急性期及び慢性期のHCV感染患者、並びに血漿
ドナーで単一のE2/NS1抗体反応を認めることができる。
我々の予備データは更に、HCVに対する抗体反応に関し
ては地理的な変動があり得ることを指摘している。米国
及びイタリアの慢性患者のそれぞれ58％及び68％が、４
つのHCV単離物のみに由来する配列を使用することの領
域に反応を示すことを検出したので、慢性HCVに感染し
た多数の患者はE2/NS1の超可変領域に対する抗体を有す
ることになろう。ウィルスを中和するエピトープがこの
超可変領域内に存在するならば、HCVワクチン開発の意
味は重要である。

これらのペプチドを独自のポリクローナル抗体及びモ
ノクローナル抗体の開発に使用しても良い。本発明並び
に米国特許出願第07/456,162号及び米国特許出願第07/6
10,180号（いずれの特許出願も予め参照によって本明細
書の一部を構成するものとした）のポリペプチドを、HC
Vの種々のエピトープの検出のための独自のアッセイを
開発するために組合わせて使用することができる。例え
ば、固体表面を１つ以上のペプチドでコーティングし
て、又はHCVに対する２種以上のポリペプチドを単にブ
レンドしたものからなる固相担体の混合物を使用してポ
リペプチドをこのように組み合わせることができる。こ
れらの技術は当業者には公知である。本明細書に記載の
如き本発明の特定例の用途及び変形の他の態様は当業者
には自明である。従って、本発明は以下の請求の範囲に
よってのみ限定されるものとする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者リユーング，タツト・ケイアメリカ合衆国、イリノイ・60085、ウオーキガン、グランドビル・コート・ 2825 (56)参考文献欧州特許出願公開445423（ＥＰ，Ａ２) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 33/576 C07K 7/08 G01N 33/53

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】液体サンプル中においてHCV抗原と免疫学
的に反応する抗体の存在を同定するためのアッセイであ
って、抗体とポリペプチドとの複合体を形成するのに適した条
件下で、からなる群の中から選択され、HCV抗原のエピトープを
少なくとも１つ含むポリペプチドをサンプルと接触さ
せ、抗体−ポリペプチド複合体を慢性HCV感染の指標と
して検出することからなるアッセイ。
【請求項２】ポリペプチドを固相担体に結合する請求項
１に記載のアッセイ。
【請求項３】液体サンプル中においてHCV抗原と免疫学
的に反応する抗体の存在のための組合せアッセイであっ
て、抗体とポリペプチドとの複合体を形成するのに適した条
件下で、からなる群の中から選択され、HCV抗原のエピトープを
少なくとも１つ含む少なくとも１種のポリペプチドを結
合した固相担体をサンプルと接触させ、抗体−ポリペプチド複合体を慢性HCV感染の指標として
検出することからなる組合せアッセイ。
【請求項４】固相担体がポリスチレンビーズである請求
項３に記載のアッセイ。
【請求項５】液体サンプル中においてHCV抗原と免疫学
的に反応する抗体の存在を同定するための確認アッセイ
であって、サンプルを使用して第１及び第２のアリコー
トを作成し、第１のアリコートは、抗体とポリペプチド
との複合体を形成するのに適した条件下で、からなる群の中から選択され、HCV抗原のエピトープを
少なくとも１つ含む第１のポリペプチドと接触させて、
第１の抗体−抗原複合体を検出し、第２のアリコートは、第２の抗体−抗原複合体を形成す
るのに適した条件下で、上記p380−JH1、p380J、p380.L
G及びp408Jからなる群の中から選択され、第１のポリペ
プチドとは異なる第２のポリペプチドと接触させて、第
２の抗体−抗原複合体を検出することからなる確認アッ
セイ。
【請求項６】抗原を固相担体に結合する請求項５に記載
のアッセイ。
【請求項７】前記固相担体がポリスチレンビーズである
請求項６に記載のアッセイ。
【請求項８】液体サンプル中においてHCV抗原と免疫学
的に反応する抗体の存在を同定するためのイムノドット
アッセイであって、抗体とポリペプチドとの複合体を形成するのに適した条
件下で、からなる群の中から選択され、各々がHCV抗原の明瞭な
エピトープを含み、固相担体上にコーティングされた少
なくとも２種のポリペプチドを同時にサンプルと接触さ
せ、複合体を発色剤と反応させて抗体−ポリペプチドを検出
することからなるイムノドットアッセイ。
【請求項９】液体サンプル中においてHCV抗原と免疫学
的に反応する抗体の存在を同定するための競合アッセイ
であって、サンプルを使用して第１及び第２の免疫学的
に同一のアリコートを作成し、試験サンプルの第１のアリコートは、抗体と結合して検
出可能な抗体−ポリペプチド複合体を形成するのに適し
た条件下で、HCV抗原のエピトープを少なくとも１つ含
むポリペプチドでコーティングされた固相担体と接触さ
せ、第２のアリコートは未結合ポリペプチドと接触させ、次
いでからなる群の中から選択される少なくとも１種のポリペ
プチドでコーティングされた固相担体と接触させて、結合又は未結合ポリペプチドの存在を検出することから
なる競合アッセイ。
【請求項１０】からなる群の中から選択され、HCV抗原のエピトープを
少なくとも１つ含むポリペプチドと、１つ以上のサンプル調製試薬と、１つ以上の検出／シグナル生成試薬とからなるイムノアッセイキット。
【請求項１１】ポリペプチドを固相担体上にコーティン
グする請求項10に記載のキット。