JP3665371B2 - Ｃ型肝炎ウイルス感染又はグループ判定のためのエピトープキメラ抗原ペプチド、その製法、及びそれを使用する感染又はグループ判定法 - Google Patents
Ｃ型肝炎ウイルス感染又はグループ判定のためのエピトープキメラ抗原ペプチド、その製法、及びそれを使用する感染又はグループ判定法 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス感染判定又はグループ判定に使用するためのエピトープキメラ抗原ペプチド、その製法、及びそれを使用する感染又はグループ判定法に係る。
【０００２】
【従来の技術】
非Ａ非Ｂ型肝炎は伝染性の肝炎でありウイルスを媒体として伝播すると考えられている。非Ａ非Ｂ型肝炎の伝播経路はいまだ明らかになっていない部分が多いが、輸血、血液製剤により引き起こされる非Ａ非Ｂ型肝炎は、Ｂ型肝炎のスクリーニング体制が確立された今日、輸血後肝炎として医療上の大きな問題点となっている。
【０００３】
１９８９年非Ａ非Ｂ型肝炎に関連したウイルス遺伝子の一部がクローニングされ、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）と命名された。ほぼ同時期に本出願人を含む多くの研究グループによりＨＣＶ遺伝子が数多く単離され、その構造上の特徴が明らかとなった（Science 244: 359-362(1989)及びScience 244: 362-344(1989)）。
【０００４】
推定されるＨＣＶ遺伝子は約９４００塩基からなる＋鎖のＲＮＡをゲノムとして持ち、約３０００アミノ酸からなる一つながりのポリペプチドをコードしていると考えられている。予想されるアミノ酸配列はフラビウイルスあるいはペスチウイルスと相同性を持ち、これらのウイルスに近縁のウイルスであろうと考えられている。これらのウイルス構造との比較から、ＨＣＶゲノムによってコードされるポリペプチドは、１本のポリペプチドとして細胞内において合成された後に、アミノ末端から構造蛋白質であるコア、エンベロープ（Ｅ１）、ＮＳ１またはＥ２（ＮＳ１／Ｅ２）と、非構造蛋白質であるＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５に切断され、それぞれの機能を果たすと考えられている。
【０００５】
これらの非構造蛋白質のうちＮＳ３、ＮＳ４のアミノ酸配列を比較することによりＨＣＶは少なくとも２種類のグループ（グループＩ、グループII）に分類可能であることが明らかとなった[Tsukiyama-Kohara et al. Virus Genes (1991) 5: 243-254] 。ひとつはカイロン社により分離されたＨＣＶと核酸、アミノ酸レベルでの相同性の高いグループＩと、核酸、アミノ酸レベルでの相同性の低いグループIIとに分類される（本出願人による特開平５−８４０８５号公報）。
【０００６】
グループＩ ＨＣＶとグループII ＨＣＶとの違いについては未だ明らかになっていない部分が多いが、金井［Kanai et al., Lancet (1992) 339: 1543 ］や吉岡［Yoshioka et al., Hepatology (1992) 16: 293-299］等はグループII感染患者の方がグループＩ感染患者よりもインターフェロン治療が効果的であることを報告している。このことはグループ判別を効率良く行なうことにより、インターフェロン治療がより効果的に行なえるようになることを示唆している。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者等は、詳細な検討により、ＮＳ４領域のグループＩとII間のアミノ酸配列が最も異なる領域（1676から1760まで）の配列を持つペプチドは、グループＩ由来の配列を持つものはグループＩ ＨＣＶに感染した患者血清中の抗体と反応し、グループII由来の配列を持つものはグループII ＨＣＶに感染した患者血清中の抗体と反応すること、さらにこれらの配列を持つペプチドを組み合わせ、患者血清との反応性を調べることにより、患者が何れのグループに属するＨＣＶに感染しているのかを判別することが可能となることを明らかにしてきた（特願平５−１９４１８５号）。
【０００８】
しかしながら、多くの血清を検索するなかで、グループ判別が困難な患者血清が、低い比率ではあるが存在することが今回初めて明らかになった。
【０００９】
したがって、本発明は、これらの判別困難であった血清でもグループ判別可能になるエピトープキメラ抗原ペプチド及びその製造方法を提供することを目的とする。
【００１０】
本発明はまた、このようなエピトープキメラ抗原ペプチドをＨＣＶ感染又はグループ判定に使用することを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ゲノムＲＮＡ又はそのｃＤＮＡによってコードされるグループＩ ＨＣＶ関連抗原上の異なる２つ以上のエピトープをペプチド性つなぎ目を介して接合して成る、グループＩ ＨＣＶ感染を特異的に判別するためのエピトープキメラ抗原ペプチドを提供する。
【００１２】
本発明はまた、ＨＣＶゲノムＲＮＡ又はそのｃＤＮＡによってコードされるグループII ＨＣＶ関連抗原上の異なる２つ以上のエピトープをペプチド性つなぎ目を介して接合して成る、グループII ＨＣＶ感染を特異的に判別するためのエピトープキメラ抗原ペプチドを提供する。
【００１３】
グループＩ ＨＣＶ及びグループII ＨＣＶには、遺伝子構造が互いに異なる領域が存在することが、本発明者らの研究によって判明してきている（特願平５−１９４１８５号）。例えば、ＮＳ４領域中アミノ酸番号1676〜1764のアミノ酸配列は、ＨＣＶのグループＩとグループIIとで大きく相違し、両者の識別を可能にする。このようにＨＣＶグループＩとIIの識別を可能にする領域は、ＮＳ４領域以外にも存在し、例えばコア領域にも存在することが今回判明した。ＨＣＶグループＩ及びグループIIについては、前述のとおり、カイロン社により分離されたＨＣＶ株（Ｃ5-1-1 ：国際公開番号ＷＯ89／04669 号）との核酸、アミノ酸レベルでの相同性の比較によって決定され、相同性のより高い（通常80％以上）ＨＣＶ株をグループＩ、相同性のより低い（通常80％未満）ＨＣＶ株をグループIIと称している。グループII ＨＣＶ株の中にはカイロン社のグループＩ ＨＣＶ株との相同性が約50％と極めて低いものも存在する。したがって、ＨＣＶゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列上には、ＮＳ４領域及びコア領域以外にもＨＣＶグループＩとグループIIを識別可能にする他の領域も存在するものと推定される。
【００１４】
本発明のＨＣＶ関連抗原上のエピトープには、ＮＳ４及びコア領域上のエピトープの他に、これら領域以外のＨＣＶグループＩ及びIIを区別する他の領域のエピトープも包含される。本発明においては、そのようなエピトープがＨＣＶのＮＳ４領域又はコア領域上に存在することが好ましい。エピトープの具体例は、下記の説明から明らかであろう。
【００１５】
コア領域のペプチドを用いたグループ判別
上述したように、ＨＣＶにはグループＩとIIの異なる種類が存在しており、グループＩとIIはアミノ酸配列に部分的な相違を有している。両者の配列をＨＣＶ遺伝子全体にわたって比較することにより、ＮＳ４以外にもグループ特異的に配列が異なる領域がコア領域のアミノ酸番号61から80にあたる領域に存在することが今回判明した。この領域についてグループＩとIIを比較した結果を下記に示す。
【００１６】
【表１】
上記の領域に於てグループ内でアミノ酸配列は保存されているのに対し、グループ間でアミノ酸配列が異なっている。この領域の配列が抗原性を持ち、グループ判別の抗原として用いることが可能か否かを明らかにするため、それぞれのアミノ酸配列を持つペプチドを作製し、患者血清との反応性を調べた（下記実施例１参照）。
【００１７】
その結果、血清との反応性はＮＳ４領域を用いた場合の反応性と比較すると反応する血清数が少ないことから、グループ判別のための主要なエピトープを提供しているとは考えられないが、ＨＣＶグループ特異的に反応していることは、ＰＣＲ法及びＮＳ４領域を用いた判別結果との比較により明らかとなった。さらに詳細に検討すると、ＮＳ４領域には反応せず、この領域にのみグループ特異的に反応する患者血清が、グループＩの血清に於て少数ながら存在することが明らかになった。
【００１８】
コア領域上のグループＩ又はグループII ＨＣＶ特異的抗原のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号９又は１０に示す。
【００１９】
上記の結果、コア領域の配列を持つペプチドを用いた判別方法は、ＮＳ４領域を用いたものと比較すると、その検出率に於て大きく劣るものの、少数の患者血清に於て検出可能となることから、ＮＳ４領域を用いた判別方法を相補することが期待出来ることを示唆している。
【００２０】
ＮＳ４領域ペプチドのエピトープ解析
ＮＳ４領域のうちグループＩ ＨＣＶに於ては、グループＩ ＨＣＶのポリプロテイン1676から1760に相当するアミノ酸配列を持つC14-1-2 抗原、グループIIＨＣＶに於ては、グループII ＨＣＶのポリプロテイン1680から1764に相当するアミノ酸配列を持つC14-2-2 抗原を、抗原として用いることによりグループ判別が可能である（本出願人による特願平５−１９４１８５号）。
【００２１】
患者血清中に存在する抗体は、これらのグループ特異的抗原へ単独に、もしくは両者に結合する。グループＩに対応するC14-1-2 抗原に単独に結合した場合には、患者はグループＩ ＨＣＶに感染しており、グループIIに対応するC14-2-2 抗原に単独に結合した場合には、患者はグループII ＨＣＶに感染していることが明白に判定可能である。
【００２２】
一方両者に反応する抗体が検出された場合でも、その反応性が異なっていることから、判別可能である。すなわちグループＩに感染している場合にはC14-1-2 抗原と強く反応し、これは希釈した血清が各抗原と反応して生じる、ELISA 反応の基質反応産物の与える吸光度を比較することにより判定することができる。しかしながらこのような血清に於ては、血清中に存在するＨＣＶに対する抗体が、グループＩ及びII抗原両者に、反応の強さは異なるものの非特異的に反応する場合もあり、このような反応を出来るだけ抑えることが望ましい。
【００２３】
上記反応を生じせしめる領域を見いだすために、C14-1-2 抗原、C14-2-2 抗原と抗体との反応特異性を調べた。実施例２に具体的な方法を記載したが、C14-1-2 抗原と患者血清中の抗体との反応は、ペプチド１−Ｗ、１−Ｘ、１−Ｙを反応に加えることにより阻害され、さらに１−Ｗで阻害が認められたものについては、１−Ｗの配列を分断化した配列を持つ１−Ｗa を加えると反応の阻害が認められた。
【００２４】
一方C14-2-2 抗原と患者血清中の抗体との反応は、ペプチド２−Ｗ、２−Ｘ、２−Ｙを反応に加えることにより阻害され、さらに２−Ｗで阻害が認められたものについては、２−Ｗの配列を分断化した配列を持つ２−Ｗa を加えると反応の阻害が認められた。
【００２５】
これらの結果からC14-1-2 抗原上の患者血清の認識配列（エピトープ）は１−Ｗa （配列番号３）、１−Ｘ（配列番号４）、１−Ｙ（配列番号５）にあり、C14-2-2 抗原上の患者血清の認識配列（エピトープ）は２−Ｗa （配列番号６）、２−Ｘ（配列番号７）、２−Ｙ（配列番号８）にあることが判明した。
【００２６】
エピトープキメラ抗原の設計
グループＩ ＨＣＶ感染判別抗原としては、C14-1-2 抗原が適しており、患者血清中の抗体は１−Ｗa 、１−Ｘ、１−Ｙペプチドをエピトープとして認識し結合している。一方患者血清のうち少数はC14-1-2 に対する抗体を持っていないが、コア領域に対する抗体を持っている。グループ判別抗原としてはこれらの抗体の何れとも反応するものが望ましい。しかしながら、コア領域とＮＳ４領域はＨＣＶ遺伝子上で大きく離れていることから、ＨＣＶ遺伝子からこれらの配列のみを一つながりのものとして取り出すことは困難である。
【００２７】
そこで本発明者等は、ＨＣＶのグループ判別を可能にする領域上に存在する互いに異なる２つ以上のエピトープを組み合わせた人工的に構築したエピトープキメラ抗原、例えばC14-1-2 抗原のグルーピング抗原として最適な性質と、それを相補するコア抗原の性質とを兼ね備えたキメラ抗原を構築することにより、ＨＣＶグループ判別だけでなくＨＣＶ感染判定の確度を高め得ることを見出した。
【００２８】
本発明によって可能となったエピトープキメラ抗原は、明らかになったエピトープをただ単純に結合させることによって作製できるものではない。すなわち、単純にエピトープ配列を組み合わせた場合には、エピトープの接合によって生じる配列が、新たなエピトープとなり、非特異反応を生じさせる可能性が生じる。またペプチドが短鎖の場合には立体構造が取れないために、正常な立体構造が形成された場合にはエピトープとして機能する配列が、エピトープとして機能しないことがある。そのため、ペプチドの鎖長を長くすることにより、短鎖ペプチドでは見いだせなかったこのような配列がエピトープとして機能し、目的とする機能以外の働きをする可能性がある。
【００２９】
本発明は、このような問題点を解決する方法をも示すものである。
【００３０】
エピトープキメラ抗原は以下の手順に従うことにより効率的に設計することができる。始めにエピトープペプチドの性質を調べることが重要である。即ちエピトープはそれに結合する抗体の結合部位（パラトープ）と水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、疎水結合等により非共有的に結合する。結合が成立するためにはエピトープ上のこれらの力が作用する部位と、パラトープ上の作用する部位とが一定の空間配置を取ることが必要である。すなわちエピトープとして機能する配列からなるペプチドが、エピトープとして機能するためには、パラトープに結合できる立体構造を取ることが必要である。一方ペプチドの高次構造は、ペプチドの長さが変わるペプチドにアミノ酸が付加されることにより変化することが予想されることから、エピトープキメラ抗原において、エピトープペプチドを単に付加した場合には抗原性を失う可能性が生じる。そのためエピトープキメラ抗原を設計する際にはこのような構造変化を生じさせない工夫をする必要がある。そのため組み合わせるエピトープペプチドの本来の構造を知る必要がある。
【００３１】
エピトープペプチドの構造を知るためには、結晶構造のエックス線回析、核磁気共鳴（NMR ）分析により構造が分析できているものであれば、それを用いればよいが、一般にはこのような例は少ないことから、アミノ酸配列からその２次構造予測を行なう方法、例えばChouとFasman等によって開発された計算式[Chou P.Y. & Fasman G. D. (1974) Biochemistry 13: 211-222; Chou P.Y. & Fasman G. D. (1974) Biochemistry 13: 222-245; Chou P.Y. & Fasman G. D. (1978) Ann. Rev. Biochem. 47: 251-276]やRobson等によって開発された計算式[Robson B. & Suzuki E. (1976) J. Mol. Biol. 107: 327-356; Garnier, J., Osguthorpe D. J. & Robson B. (1978) J. Mol. Biol. 120: 97-120] などを利用し解析を行なう。さらにHoppとWoods [Hopp T. P. & Woods K.R. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 3824-3828] やKyteとDoolittle [Kyte J. & Doolittle R.F. (1982) J. Mol. Biol. 157: 105-132]等によって開発された計算式に従い、蛋白質の疎水−親水プロットを行ないエピトープペプチドが示す性質に関する情報を得ておくことが好ましい。さらにJameson とWolf[Jameson B.A. & Wolf H.(1988) Comput. Applic. in Biosciences 4: 181-186]によって提唱されている計算式に従い，目的とするペプチドの抗原性に関する予測した性質も知っておくことは好ましいことである。さらにJanin 等やEmini 等によって提唱されている表面部位の予測法[Janin J., Wodak S., Levitt M. & Maigret B. (1978) J. Mol. Biol. 125: 357-386; Emini E., Hughes J.V., Perlow D.S., & Boger J. (1965) J. Biol. 55:836-839] 、Karplus 等によって提唱されている蛋白質の可塑性予測法[Karplus P.A. & Schulz G.E. (1985) Naturwiss. 72: 212-213]で得られる情報も抗原性を予想する際に役立つ。
【００３２】
ここで上記の各種解析を行なう際に重要なことは、エピトープ解析を行なった条件でのエピトープペプチドの情報を得ておくことである。例えば実施例に示したものでは、C14 抗原という約100 アミノ酸からなる配列と抗体とを反応させる際に、短鎖ペプチドを加えることによる結合阻害によりエピトープ解析を行なったが、この場合にはエピトープは長い配列の中で機能しているものであるから、上記の解析はこの長い配列を元に行なう。
【００３３】
エピトープキメラ抗原に於ては、これらの予測法によって得られるエピトープペプチドの予測構造が変化しないように、キメラ抗原ペプチドを設計する必要がある。
【００３４】
さらにエピトープキメラ抗原に於ては、エピトープペプチドのつなぎ目が新たなエピトープを提供しないように設計されねばならない。この予測は以下の方法によって成し得る。
【００３５】
一つはつなぎ目によって生じるペプチド配列を用いて遺伝子情報、蛋白構造情報バンクを検索し、一致する配列が無いことを確認する。もしくは一致する配列があったとしても抗原性が無いことが確認できれば良い。
【００３６】
本発明においては、つなぎ目のペプチド配列が抗原性をもたないか又は抗原性が低いと予測される配列を持つようにアミノ酸を付加、もしくは欠失させることにより設計する。付加すべきアミノ酸としては、例えばイソロイシン、ロイシン、バリン等の疎水的な性質を持つアミノ酸が好ましく、疎水性アミノ酸を付加することによってペプチド性つなぎ目の疎水性が増しエピトープとして機能する可能性を低くすることができる。すなわちエピトープキメラペプチドにおいてエピトープとして機能させるには、分子表面にエピトープが露出していることが肝要であり、疎水的な性質を付加することにより、分子表面に露出させる可能性を低くすることができる。
【００３７】
すなわち、本発明のエピトープキメラ抗原ペプチドにおいては、ペプチド性つなぎ目は抗原性をもたないか又は低抗原性であることを特徴とする。
【００３８】
上記の方法に従い最適な感染ＨＣＶグループ判別抗原として配列番号１に示す配列からなるペプチドGR1EPV5 、配列番号２に示す配列からなるペプチドGR1EPV4 を設計した。
【００３９】
エピトープキメラ抗原の作製
本発明のエピトープキメラ抗原は、化学合成法により、又は遺伝子工学的手法を用いて作製することができる。
【００４０】
化学合成法の場合、該方法は、ＨＣＶゲノムＲＮＡ又はそのｃＤＮＡによってコードされるグループＩ又はグループII ＨＣＶ関連抗原上の異なる２つ以上のエピトープの各々を従来のペプチド合成法を用いて合成する段階、ペプチド性つなぎ目を別個に合成する段階、エピトープとエピトープの間をペプチド性つなぎ目を介して結合する段階を包含する。ペプチド合成法は周知の技術であり、例えば日本生化学会編、生化学実験講座１「タンパク質の化学IV−化学修飾とペプチド合成」（1981年）東京化学同人に記載される種々の手法が使用され得る。長鎖ペプチドの場合には、通常、固相法が用いられる。またアミノ酸の保護及び脱保護の技術もペプチド合成において一般的に使用される。
【００４１】
遺伝子工学的手法の場合、該方法は、エピトープキメラ抗原ペプチドをコードするＤＮＡ断片を作製する段階、該ＤＮＡ断片をベクターに組み込んで複製可能な発現ベクターを構築する段階、該発現ベクターを宿主細胞に導入し、ペプチドを発現する形質転換体を得る段階、さらに該形質転換体を培養し発現産物を発現させて発現したペプチドを回収する段階を含む。この製造方法も本発明の一部である。
【００４２】
例えば配列番号１及び２に示すアミノ酸配列を有するキメラペプチドをコードするＤＮＡ断片は実施例３に示すように作製することが可能である。さらに実施例４に示すように形質転換体を取得し、形質転換体を培養し、該ペプチドを分離、回収することが可能である。
【００４３】
遺伝子工学的な手法に於て発現に用いる発現ベクターとしては、実施例に示した大腸菌を宿主とし、大腸菌トリプトファンオペロンの制御化に発現させるベクター以外にも、大腸菌を宿主としては、大腸菌トリプトファンオペロン以外にもＴａｃプロモーター、Ｔｒｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰｈｏＡプロモーター、λプロモーター等を利用したベクターを用いることが可能である。また大腸菌以外にも酵母を宿主とし、解糖系遺伝子、たとえばグリセロアルデヒド−３−燐酸デヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼＩ、II、ピルビン酸キナーゼ、ホスホグリセリンキナーゼ、トリオースイソメラーゼ等の酵母で慣用に用いられているプロモーターを利用した発現ベクターを用いて発現させることも可能である。さらに昆虫細胞を宿主としバキュロウイルスをベクターとした発現系、哺乳類細胞例えばＣＨＯ細胞や、ＣＯＳ細胞 ＨｅＬａ細胞等を宿主とし、慣用的に用いられる組み込み型発現ベクターやワクチニアウイルスをベクターとした発現系、アデノウイルスや慣用的に用いられるウイルスをベクターとした発現系を利用しても発現可能である。
【００４４】
さらに遺伝子工学的手法を用いる場合には、キメラ抗原ペプチドを他のペプチドとの融合蛋白質として発現させることも慣用的に用いられる手段である。
【００４５】
上記の方法に基づくならば、グループＩ又はグループ II と同様に、グループIII （Okamoto et al, J. Gen. Virol. 72:2697-2704(1991)）に属するＨＣＶゲノムから、グループIII を特異的に区別するエピトープ領域を取り出してエピトープキメラ抗原ペプチドを作製することが可能であり、これを用いることによりグループIII に感染している患者血清のグループ判別を行なうことができる。
【００４６】
遺伝子工学的に発現させ回収したグルーピングに好適なキメラ抗原ペプチドを用いてＨＣＶ感染患者の血清中のグループＩ特異的な抗体を検出すると、実施例５に示すごとく、それ以前に用いていた抗原のみでは検出不可能であった患者血清のグループ判定を行なうことが可能となった。
【００４７】
したがって、本発明はさらに、エピトープキメラ抗原ペプチドと、ＨＣＶに感染したと推定される試料中のグループＩ又はグループII特異的な抗体との免疫学的反応を行なった後、生成する抗原−抗体複合体の濃度又は存在を測定することを含む、ＨＣＶグループ判定方法を提供する。
【００４８】
本発明はまた、エピトープキメラ抗原ペプチドと、ＨＣＶに感染したと推定される試料中のＨＣＶ関連抗体との免疫学的反応を行なった後、生成する抗原−抗体複合体の濃度又は存在を測定することを含む、ＨＣＶ感染判定方法を提供する。
【００４９】
抗原−抗体複合体の濃度又は存在は、エンザイムイムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、イムノドットブロッティング等の公知の一般的方法を用いて測定することができる。上記判定の精度は、それぞれのグループ抗原に対する抗体価を測定することによりさらに向上する。また田中ら(T.Tanaka ら，Hepatology 19:1347〜1353，1994) により提唱されている判別方法を用いることもできる。
【００５０】
以下実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００５１】
【実施例】
実施例１ コア領域ペプチドを用いたグループ判別
配列番号９及び１０の配列を持つペプチドをアプライドバイオシステム社のペプチド合成機（Ｍｏｄｅｌ：４３０Ａ）を用いて合成し、逆相クロマトグラフィーにより目的のペプチドを精製した。精製したペプチドが目的の配列であることはアミノ酸シークエンサーの分析により確認した。
【００５２】
このペプチドを2.5 μg/mlの濃度となるように8M尿素を含む0.1Mの燐酸緩衝液（pH7.5 ）に希釈した。希釈した抗原をヌンク社のマルチモジュールプレートにウェルあたり 100μｌのせ、室温に2 時間静置した。抗原希釈液を除いた後、ウェルあたり 100μｌのブロッキング液［0.5 ％カゼイン、0.15M NaCl、2.5mM EDTA、0.1M燐酸緩衝液（pH7.0 ）］を加え室温に2 時間静置し抗原をプレートに固定した。
【００５３】
各ウェルに検体希釈液［0.5 ％カゼイン、0.5M NaCl 、2.5mM EDTA、0.1M燐酸緩衝液（pH7.0 ）］によって11倍に希釈した非Ａ非Ｂ型慢性肝炎患者血清 100μｌを加え４５分静置した。ウェルを0.1% Tween20を含むPBS で洗浄した後、 100μｌのホースラディッシュパーオキシダーゼによって標識された抗ヒトIgG 抗体を加え、45分静置した。ウェルを0.1% Tween20を含むPBS で洗浄した後、常法に従い、発色法により酵素活性を計測した。その結果を表２にまとめて示す。また比較のため、Ｃ１４−１−２及びＣ１４−２−２抗原を用いてグループ判別した結果と、ＰＣＲ法によりグループ判別した結果を表中に示した。
【００５４】
【表２】
表から明らかなように、ほとんどの検体に於てはＣ１４−１−２及びＣ１４−２−２抗原を用いることによりグループ判別が可能であったが、検体番号１６のように配列番号９のペプチドを用いることにより始めて血清学的にグループ判別が可能になるものが存在することが判明した。
【００５５】
実施例２ Ｃ１４−１−２抗原のエピトープ解析
精製したＣ１４−１−２ペプチドを2.5 μg/mlの濃度となるように８Ｍ尿素を含む０．１Ｍの燐酸緩衝液（pH7.5 ）に希釈した。希釈した抗原をヌンク社のマルチモジュールプレートにウェルあたり 200μｌのせ、室温に2 時間静置した。抗原希釈液を除いた後、ウェルあたり 200μｌのブロッキング液［0.5 ％カゼイン、0.15M NaCl、2.5mM EDTA、0.1M燐酸緩衝液（pH7.0 ）］を加え室温に2 時間静置した。このように抗原をプレートに固定した。検体２０μl と化学合成したペプチド（0.1 ｍｇ／ｍｌ）２０μl を等量混和し、室温１時間静置した。これに検体希釈液を 200μl 加えた後にペプチドを固定したプレートに加えた。３０℃１時間反応させた後、洗浄を行ない、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトIgG （マウスモノクローナル抗体）を加え３０℃１時間反応させた。洗浄した後、ｏ−フェニレンジアミン溶液を加え、３０℃１時間反応させた後１Ｍ硫酸溶液を加えることにより反応を停止させ、比色計で 492ｎｍの発色を測定した。
【００５６】
結果を表３に示す。表３に示した検体は全てＨＣＶグループＩに属すことはｔｒｐＥ・Ｃ１４−１−２（特願平５−１９４１８５号）との反応性より明らかであり、グループＩの配列を持つペプチドを加えることによりｔｒｐＥ・Ｃ１４−１−２との反応が阻害されていることが明らかである。これらの結果からＣ１４−１−２抗原に於て患者血清中の抗体は阻害のかかったペプチドにエピトープが存在していることが明らかになった。
【００５７】
【表３】
実施例３ エピトープキメラ抗原ペプチドをコードする遺伝子の作製
［ＨＣＶグループ判定に適したエピトープキメラ抗原遺伝子の構築］
以下のＤＮＡをＤＮＡ合成機（ＡＢＩ：Ｍｏｄｅｌ３９４Ａ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ：Ｍｏｄｅｌ８７００）を用いて合成した。
【００５８】
ＥＰ１：ＧＣＧＡＡＴＴＣＧＣＣＴＣＡＣＡＣＣＴＣＣＣＴＴＡＣＡＴＣ；
ＥＰ２Ｒ：ＧＧＧＴＡＣＣＴＡＣＣＡＣＧＧＧＡＧＣＡＧＣＡＧＣＴＣ；
ＣＯＲＥ−Ｆ：ＡＧＧＴＡＣＣＣＣＴＡＡＡＧＣＴＣＧＴＣＧＴＣＣＧＧＡＡＧＧＴＣＧＴＧＣＴ；
ＣＯＲＥ−Ｒ：ＴＣＣＣＨＨＨＴＴＧＡＧＣＣＣＡＡＧＣＡＣＧＡＣＣＴＴＣＣＧＧＡＣＧ；
Ｖ４ＸＹＺ：ＡＧＡＣＣＣＧＧＧＴＡＣＣＡＣＧＧＧＡＧＣＡＧＣＡＧＣ；
ＥＰ５：ＡＣＣＣＧＧＧＡＧＴＧＴＧＧＴＣＡＴＴＧＴＧＧＧＴＡＧＧ；および
ＥＰ６：ＧＡＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＣＡＡＴＣＧＡＡＣＴＣＣＣＧＧＴＡＧＡＧＧＡＣＴＴＣ。
【００５９】
ＥＰ１とＥＰ２Ｒ及びＶ４ＸＹＺはグループＩのＨＣＶ ｃＤＮＡからペプチドＸ、Ｙ、Ｚ領域をコードする配列を取り出すためのプライマーである。ＥＰ５とＥＰ６はグループＩのＨＣＶ ｃＤＮＡからペプチドＶ、Ｗａ領域をコードする配列を取り出すためのプライマーである。
【００６０】
これらのプライマーを用いてＰＣＲ法により配列を取り出した。反応は１ｎｇのＨＣＶ ｃＤＮＡ（Ｃ６−７９）（本出願人らによる特願平５−１９３１０４号）、100 ｐｍｏｌプライマー（ＥＰ１とＥＰ２ＲまたはＥＰ１とＶ４ＸＹＺまたはＥＰ５とＥＰ６）を加え、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ2 、0.01％ゼラチン、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、２．５Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅとなるよう 100μｌの反応液を調製し、ミネラルオイルを重層して９４℃、３０秒、５５℃、１分、７２℃、２分の条件で２５サイクル反応を行なわせた。またＣＯＲＥ−ＦとＣＯＲＥ−Ｒをそれぞれ２μｇ加え、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ2 、0.01％ゼラチン、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、２．５Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅとなるよう 100μｌの反応液を調製し、ミネラルオイルを重層して９４℃、３０秒、５０℃、１分、７２℃、２分の条件で１５サイクル反応を行なわせた。反応液の一部をアガロース電気泳動し、ＥＰ１とＥＰ２Ｒの組み合わせでは約 140ｂｐの、ＥＰ１とＶ４ＸＹＺの組み合わせでは約 150ｂｐの、ＣＯＲＥ−ＦとＣＯＲＥ−Ｒの組み合せでは約５０ｂｐの断片、ＥＰ５とＥＰ６の組み合せでは約 100ｂｐの断片を分離した。分離したＤＮＡ断片をアガロース切片からＭｅｒｍａｉｄ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ１０１社）を用いメーカーの推奨する方法に従いＴＥ溶液中に回収した。回収したＤＮＡ断片を２５ｎｇのｐＧＥＭ−Ｔベクターと共に２０μｌの反応液［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 ，１ｍＭ ＡＴＰ，１０ｍＭ ＤＴＴ，Ｔ４ ＤＮＡリガ−ゼ］中で１６℃、１時間反応させた。反応液の一部を用い大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ社）をＨａｎａｈａｎの方法[ DNA cloning: A practical approach (ed. D. M. Glover), vol. 1, p109-, IRC press, (1885)] に従って形質転換した。アンピシリン耐性のコロニーを選択し、形質転換体のDNA をミニプレパレーション法により調製し、制限酵素で切断することにより両断片が環状化しているプラスミドを持つ形質転換体を選択した。
【００６１】
ＥＰ１とＥＰ２Ｒとを用いて生じた断片のクローニングされているプラスミドＤＮＡをＫｐｎＩとＥｃｏＲＩで切断し、電気泳動を行なうことにより約１４０ｂｐの断片を分離し、Ｍｅｒｍａｉｄ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ１０１社）を用いメーカーの推奨する方法に従いＴＥ溶液中に回収した。またＣＯＲＥ−ＦとＣＯＲＥ−Ｒの組み合わせで生じた断片のクローニングされているプラスミドＤＮＡをＫｐｎＩとＳｍａＩで切断し、電気泳動を行なうことにより約６０ｂｐの断片を分離し、Ｍｅｒｍａｉｄ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ１０１社）を用いメーカーの推奨する方法に従いＴＥ溶液中に回収した。回収した断片とＥｃｏＲＩとＳｍａＩで切断したｐＴ７Ｔ３１９Ｕ（ファルマシア社）とＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結反応させ、反応液の一部を用い、大腸菌ＳＵＲＥ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ社）を形質転換した。アンピシリン耐性のコロニーを選択し、形質転換体のＤＮＡをミニプレパレーション法により調製し、制限酵素で切断することにより両断片が結合環状化しているプラスミドを持つ形質転換体を選択した。得られたプラスミドをＳｍａＩとＢａｍＨＩで切断し、ＥＰ５とＥＰ６で生じた断片のクローニングされているプラスミドＤＮＡをＢａｍＨＩとＳｍａＩで切断し、電気泳動を行なうことにより 100ｂｐの断片を分離し、Ｍｅｒｍａｉｄ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ１０１社）を用い回収した断片と、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結反応させた。反応液の一部を用い、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ社）を形質転換した。アンピシリン耐性のコロニーを選択し、形質転換体のDNA をミニプレパレーション法により調製し、制限酵素で切断することにより両断片が結合環状化しているプラスミドを持つ形質転換体を選択した。このようにしてＧＲ１ＥＰＶ５遺伝子断片を持つプラスミドを構築した。
【００６２】
構築したプラスミド1 μg をEcoRI 、BamHI で切断した（50mM Tris-HCl [pH7.5], 7mM MgCl2 , 100mM NaCl, 10 units EcoRI, 10 units BamHI／反応液量10μl で37℃１時間反応）後、この反応液をアガロース電気泳動にかけ約 250bpの断片を分離した。分離した断片をＭｅｒｍａｉｄ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ１０１社）を用い回収した。一方ｐＴｒｐＴｒｐＥ 1μg をEcoRI 、BamHI で切断した（50mM Tris-HCl [pH7.5], 7mM MgCl2 , 100mM NaCl, 10 units EcoRI, 10 units BamHI／反応液量10μl で37℃１時間反応）後、この反応液をアガロースにかけ約3Kbpの断片を分離した。分離した断片をガラスパウダー法により回収した。回収した両断片をＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結反応させた。反応液の一部を用い、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ社）を形質転換した。アンピシリン耐性のコロニーを選択し、形質転換体のDNA をミニプレパレーション法により調製し、制限酵素で切断することにより両断片が結合環状化しているプラスミドを持つ形質転換体を選択した。このようにしてＧＲ１ＥＰＶ５遺伝子発現プラスミド、ｐＴｒｐＧＲ１ＥＰＶ５を構築した。このプラスミドを大腸菌に移入後、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センターに平成６年７月７日付で寄託し、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４４２２を得た。
【００６３】
ＥＰ１とＶ４ＸＹＺの組み合わせで生じた断片の挿入されているプラスミドをＥｃｏＲＩとＳｍａＩで切断し生じる約 150ｂｐの断片を、電気泳動により分離し、Ｍｅｒｍａｉｄ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ１０１社）を用いメーカーの推奨する方法に従いＴＥ溶液中に回収した。回収した断片とＥｃｏＲＩとＳｍａＩで切断したｐＴｒｐＧＲ１ＥＰＶ５とＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結反応させ、反応液の一部を用い、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ社）を形質転換した。その結果ＧＲ１ＥＰＶ４遺伝子発現プラスミド、ｐＴｒｐＧＲ１ＥＰＶ４を構築した。このプラスミドを大腸菌に移入後、同センターに平成６年７月７日付で寄託し、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４４２１を得た。
【００６４】
実施例４ エピトープキメラ抗原の発現と精製
ｐＴｒｐＧＲ１ＥＰＶ４またはｐＴｒｐＧＲ１ＥＰＶ５で形質転換された大腸菌を 100μg/mlアンピシリンを含むＬＢ培地で３７℃一夜培養した。これを１％濃度で 100μg/mlアンピシリンを含むＭ９−ＣＡに接種し３７℃一夜培養した。培養終了後遠心により菌体を集め、50mlのLysis 液［50mM Tris-HCl (pH8.5), 30mM NaCl, 5mM EDTA ］に再懸濁し、1ml のリゾチーム液（10mg/ml Lysozyme）を加え、37℃において１時間処理した。この懸濁液を超音波処理（150W、90秒で２回）にかけることにより細胞を破壊した。15000rpmで、４℃において30分間遠心し不溶性分画を回収した。不溶性分画を50mlのＮＰ４０を１％含むＡ溶液［50mM Tris-HCl (pH8.5) ］に再懸濁しホモジナイズ（1500rpm で５ストローク）した。懸濁液を15000rpmで、４℃において30分間遠心し不溶性分画を回収した。不溶性分画を50mlの2M尿素を含むＡ溶液に再懸濁しホモジナイズ（1500rpm で５ストローク）した。懸濁液を15000rpmで、４℃において30分間遠心し不溶性分画を回収した。不溶性分画を50mlの６M 尿素を含むＡ溶液に再懸濁しホモジナイズ（1500rpm で５ストローク）した。懸濁液を15000rpmで、４℃において30分間遠心し可溶性分画を回収した。
【００６５】
６Ｍ尿素を含む溶液で可溶化した抗原溶液から、ＳセファーロースＨＰカラム（ファルマシア社）を用いたイオン交換法とＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ｐｇ（ファルマシア社）を用いたゲル濾過法によりエピトープキメラ抗原ペプチドＧＲ１ＥＰＶ４（配列番号２のアミノ酸配列を含む）及びＧＲ１ＥＰＶ５（配列番号１のアミノ酸配列を含む）を精製した。
【００６６】
実施例５ エピトープキメラ抗原ペプチドと患者血清との反応
エピトープキメラ抗原ペプチドを2.5 μg/mlの濃度となるように8M尿素を含む0.1Mの燐酸緩衝液（pH7.5 ）に希釈した。希釈した抗原をヌンク社のマルチモジュールプレートにウェルあたり 100μｌのせ、室温で2 時間静置した。抗原希釈液を除いた後、ウェルあたり 100μｌのブロッキング液［0.5 ％カゼイン、0.15M NaCl、2.5mM EDTA、0.1M燐酸緩衝液（pH7.0 ）］を加え室温で2 時間静置し抗原をプレートに固定した。
【００６７】
各ウェルに検体希釈液［0.5 ％カゼイン、0.5M NaCl 、2.5mM EDTA、0.1M燐酸緩衝液（pH7.0 ）］によって11倍に希釈した非Ａ非Ｂ型慢性肝炎患者血清 100μｌを加え４５分静置した。ウェルを0.1% Tween20を含むPBS で洗浄した後、 100μｌのホースラディッシュパーオキシダーゼによって標識された抗ヒトIgG 抗体を加え、45分静置した。ウェルを0.1% Tween20を含むPBS で洗浄した後、常法に従い、発色法により酵素活性を計測した。その結果を表４にまとめて示す。また比較のため、Ｃ１４−１−２及びＣ１４−２−２抗原を用いてグループ判別した結果と、ＰＣＲ法によりグループ判別した結果を表中に示した。
【００６８】
【表４】
Ｃ１４−１−２と同じエピトープを持つＧＲ１ＥＰＶ４抗原ペプチドは、ほとんどＣ１４−１−２と同じ反応性を示した。しかしながらグループII ＨＣＶ感染患者血清でＣ１４−１−２に比較的強い反応を示した血清２２、２５について反応が弱くなっており、余分なエピトープを除くことにより判別が容易になっていることは明らかである。
【００６９】
コア領域のグループ判別エピトープを含むＧＲ１ＥＰＶ５抗原では、ＧＲ１ＥＰＶ４同様血清２２、２５での判別が容易になっているのに加え、さらに血清番号７、１６において反応性が向上しており、この抗原を用いることにより、感染しているＨＣＶのグループ判別が容易になったことは明らかである。
【００７０】
【発明の効果】
従来グループ判別が困難であった血清等の検体であっても、本発明のエピトープキメラ抗原によってその判別が可能となり、ＨＣＶのグルーピング判別だけでなくＨＣＶ感染判定にも精度良く使用することができる。本発明に従えば、抗原抗体反応を利用した方法に於て常に問題となる抗原抗体間の非特異反応の軽減、抗原抗体間の特異反応の反応性向上を図ることができ、抗原抗体反応を利用した免疫学的診断方法に適用するためのペプチド抗原の機能向上を達成できる。
【００７１】
【配列表】
【産業上の利用分野】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス感染判定又はグループ判定に使用するためのエピトープキメラ抗原ペプチド、その製法、及びそれを使用する感染又はグループ判定法に係る。
【０００２】
【従来の技術】
非Ａ非Ｂ型肝炎は伝染性の肝炎でありウイルスを媒体として伝播すると考えられている。非Ａ非Ｂ型肝炎の伝播経路はいまだ明らかになっていない部分が多いが、輸血、血液製剤により引き起こされる非Ａ非Ｂ型肝炎は、Ｂ型肝炎のスクリーニング体制が確立された今日、輸血後肝炎として医療上の大きな問題点となっている。
【０００３】
１９８９年非Ａ非Ｂ型肝炎に関連したウイルス遺伝子の一部がクローニングされ、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）と命名された。ほぼ同時期に本出願人を含む多くの研究グループによりＨＣＶ遺伝子が数多く単離され、その構造上の特徴が明らかとなった（Science 244: 359-362(1989)及びScience 244: 362-344(1989)）。
【０００４】
推定されるＨＣＶ遺伝子は約９４００塩基からなる＋鎖のＲＮＡをゲノムとして持ち、約３０００アミノ酸からなる一つながりのポリペプチドをコードしていると考えられている。予想されるアミノ酸配列はフラビウイルスあるいはペスチウイルスと相同性を持ち、これらのウイルスに近縁のウイルスであろうと考えられている。これらのウイルス構造との比較から、ＨＣＶゲノムによってコードされるポリペプチドは、１本のポリペプチドとして細胞内において合成された後に、アミノ末端から構造蛋白質であるコア、エンベロープ（Ｅ１）、ＮＳ１またはＥ２（ＮＳ１／Ｅ２）と、非構造蛋白質であるＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５に切断され、それぞれの機能を果たすと考えられている。
【０００５】
これらの非構造蛋白質のうちＮＳ３、ＮＳ４のアミノ酸配列を比較することによりＨＣＶは少なくとも２種類のグループ（グループＩ、グループII）に分類可能であることが明らかとなった[Tsukiyama-Kohara et al. Virus Genes (1991) 5: 243-254] 。ひとつはカイロン社により分離されたＨＣＶと核酸、アミノ酸レベルでの相同性の高いグループＩと、核酸、アミノ酸レベルでの相同性の低いグループIIとに分類される（本出願人による特開平５−８４０８５号公報）。
【０００６】
グループＩ ＨＣＶとグループII ＨＣＶとの違いについては未だ明らかになっていない部分が多いが、金井［Kanai et al., Lancet (1992) 339: 1543 ］や吉岡［Yoshioka et al., Hepatology (1992) 16: 293-299］等はグループII感染患者の方がグループＩ感染患者よりもインターフェロン治療が効果的であることを報告している。このことはグループ判別を効率良く行なうことにより、インターフェロン治療がより効果的に行なえるようになることを示唆している。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者等は、詳細な検討により、ＮＳ４領域のグループＩとII間のアミノ酸配列が最も異なる領域（1676から1760まで）の配列を持つペプチドは、グループＩ由来の配列を持つものはグループＩ ＨＣＶに感染した患者血清中の抗体と反応し、グループII由来の配列を持つものはグループII ＨＣＶに感染した患者血清中の抗体と反応すること、さらにこれらの配列を持つペプチドを組み合わせ、患者血清との反応性を調べることにより、患者が何れのグループに属するＨＣＶに感染しているのかを判別することが可能となることを明らかにしてきた（特願平５−１９４１８５号）。
【０００８】
しかしながら、多くの血清を検索するなかで、グループ判別が困難な患者血清が、低い比率ではあるが存在することが今回初めて明らかになった。
【０００９】
したがって、本発明は、これらの判別困難であった血清でもグループ判別可能になるエピトープキメラ抗原ペプチド及びその製造方法を提供することを目的とする。
【００１０】
本発明はまた、このようなエピトープキメラ抗原ペプチドをＨＣＶ感染又はグループ判定に使用することを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ゲノムＲＮＡ又はそのｃＤＮＡによってコードされるグループＩ ＨＣＶ関連抗原上の異なる２つ以上のエピトープをペプチド性つなぎ目を介して接合して成る、グループＩ ＨＣＶ感染を特異的に判別するためのエピトープキメラ抗原ペプチドを提供する。
【００１２】
本発明はまた、ＨＣＶゲノムＲＮＡ又はそのｃＤＮＡによってコードされるグループII ＨＣＶ関連抗原上の異なる２つ以上のエピトープをペプチド性つなぎ目を介して接合して成る、グループII ＨＣＶ感染を特異的に判別するためのエピトープキメラ抗原ペプチドを提供する。
【００１３】
グループＩ ＨＣＶ及びグループII ＨＣＶには、遺伝子構造が互いに異なる領域が存在することが、本発明者らの研究によって判明してきている（特願平５−１９４１８５号）。例えば、ＮＳ４領域中アミノ酸番号1676〜1764のアミノ酸配列は、ＨＣＶのグループＩとグループIIとで大きく相違し、両者の識別を可能にする。このようにＨＣＶグループＩとIIの識別を可能にする領域は、ＮＳ４領域以外にも存在し、例えばコア領域にも存在することが今回判明した。ＨＣＶグループＩ及びグループIIについては、前述のとおり、カイロン社により分離されたＨＣＶ株（Ｃ5-1-1 ：国際公開番号ＷＯ89／04669 号）との核酸、アミノ酸レベルでの相同性の比較によって決定され、相同性のより高い（通常80％以上）ＨＣＶ株をグループＩ、相同性のより低い（通常80％未満）ＨＣＶ株をグループIIと称している。グループII ＨＣＶ株の中にはカイロン社のグループＩ ＨＣＶ株との相同性が約50％と極めて低いものも存在する。したがって、ＨＣＶゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列上には、ＮＳ４領域及びコア領域以外にもＨＣＶグループＩとグループIIを識別可能にする他の領域も存在するものと推定される。
【００１４】
本発明のＨＣＶ関連抗原上のエピトープには、ＮＳ４及びコア領域上のエピトープの他に、これら領域以外のＨＣＶグループＩ及びIIを区別する他の領域のエピトープも包含される。本発明においては、そのようなエピトープがＨＣＶのＮＳ４領域又はコア領域上に存在することが好ましい。エピトープの具体例は、下記の説明から明らかであろう。
【００１５】
コア領域のペプチドを用いたグループ判別
上述したように、ＨＣＶにはグループＩとIIの異なる種類が存在しており、グループＩとIIはアミノ酸配列に部分的な相違を有している。両者の配列をＨＣＶ遺伝子全体にわたって比較することにより、ＮＳ４以外にもグループ特異的に配列が異なる領域がコア領域のアミノ酸番号61から80にあたる領域に存在することが今回判明した。この領域についてグループＩとIIを比較した結果を下記に示す。
【００１６】
【表１】
【００１７】
その結果、血清との反応性はＮＳ４領域を用いた場合の反応性と比較すると反応する血清数が少ないことから、グループ判別のための主要なエピトープを提供しているとは考えられないが、ＨＣＶグループ特異的に反応していることは、ＰＣＲ法及びＮＳ４領域を用いた判別結果との比較により明らかとなった。さらに詳細に検討すると、ＮＳ４領域には反応せず、この領域にのみグループ特異的に反応する患者血清が、グループＩの血清に於て少数ながら存在することが明らかになった。
【００１８】
コア領域上のグループＩ又はグループII ＨＣＶ特異的抗原のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号９又は１０に示す。
【００１９】
上記の結果、コア領域の配列を持つペプチドを用いた判別方法は、ＮＳ４領域を用いたものと比較すると、その検出率に於て大きく劣るものの、少数の患者血清に於て検出可能となることから、ＮＳ４領域を用いた判別方法を相補することが期待出来ることを示唆している。
【００２０】
ＮＳ４領域ペプチドのエピトープ解析
ＮＳ４領域のうちグループＩ ＨＣＶに於ては、グループＩ ＨＣＶのポリプロテイン1676から1760に相当するアミノ酸配列を持つC14-1-2 抗原、グループIIＨＣＶに於ては、グループII ＨＣＶのポリプロテイン1680から1764に相当するアミノ酸配列を持つC14-2-2 抗原を、抗原として用いることによりグループ判別が可能である（本出願人による特願平５−１９４１８５号）。
【００２１】
患者血清中に存在する抗体は、これらのグループ特異的抗原へ単独に、もしくは両者に結合する。グループＩに対応するC14-1-2 抗原に単独に結合した場合には、患者はグループＩ ＨＣＶに感染しており、グループIIに対応するC14-2-2 抗原に単独に結合した場合には、患者はグループII ＨＣＶに感染していることが明白に判定可能である。
【００２２】
一方両者に反応する抗体が検出された場合でも、その反応性が異なっていることから、判別可能である。すなわちグループＩに感染している場合にはC14-1-2 抗原と強く反応し、これは希釈した血清が各抗原と反応して生じる、ELISA 反応の基質反応産物の与える吸光度を比較することにより判定することができる。しかしながらこのような血清に於ては、血清中に存在するＨＣＶに対する抗体が、グループＩ及びII抗原両者に、反応の強さは異なるものの非特異的に反応する場合もあり、このような反応を出来るだけ抑えることが望ましい。
【００２３】
上記反応を生じせしめる領域を見いだすために、C14-1-2 抗原、C14-2-2 抗原と抗体との反応特異性を調べた。実施例２に具体的な方法を記載したが、C14-1-2 抗原と患者血清中の抗体との反応は、ペプチド１−Ｗ、１−Ｘ、１−Ｙを反応に加えることにより阻害され、さらに１−Ｗで阻害が認められたものについては、１−Ｗの配列を分断化した配列を持つ１−Ｗa を加えると反応の阻害が認められた。
【００２４】
一方C14-2-2 抗原と患者血清中の抗体との反応は、ペプチド２−Ｗ、２−Ｘ、２−Ｙを反応に加えることにより阻害され、さらに２−Ｗで阻害が認められたものについては、２−Ｗの配列を分断化した配列を持つ２−Ｗa を加えると反応の阻害が認められた。
【００２５】
これらの結果からC14-1-2 抗原上の患者血清の認識配列（エピトープ）は１−Ｗa （配列番号３）、１−Ｘ（配列番号４）、１−Ｙ（配列番号５）にあり、C14-2-2 抗原上の患者血清の認識配列（エピトープ）は２−Ｗa （配列番号６）、２−Ｘ（配列番号７）、２−Ｙ（配列番号８）にあることが判明した。
【００２６】
エピトープキメラ抗原の設計
グループＩ ＨＣＶ感染判別抗原としては、C14-1-2 抗原が適しており、患者血清中の抗体は１−Ｗa 、１−Ｘ、１−Ｙペプチドをエピトープとして認識し結合している。一方患者血清のうち少数はC14-1-2 に対する抗体を持っていないが、コア領域に対する抗体を持っている。グループ判別抗原としてはこれらの抗体の何れとも反応するものが望ましい。しかしながら、コア領域とＮＳ４領域はＨＣＶ遺伝子上で大きく離れていることから、ＨＣＶ遺伝子からこれらの配列のみを一つながりのものとして取り出すことは困難である。
【００２７】
そこで本発明者等は、ＨＣＶのグループ判別を可能にする領域上に存在する互いに異なる２つ以上のエピトープを組み合わせた人工的に構築したエピトープキメラ抗原、例えばC14-1-2 抗原のグルーピング抗原として最適な性質と、それを相補するコア抗原の性質とを兼ね備えたキメラ抗原を構築することにより、ＨＣＶグループ判別だけでなくＨＣＶ感染判定の確度を高め得ることを見出した。
【００２８】
本発明によって可能となったエピトープキメラ抗原は、明らかになったエピトープをただ単純に結合させることによって作製できるものではない。すなわち、単純にエピトープ配列を組み合わせた場合には、エピトープの接合によって生じる配列が、新たなエピトープとなり、非特異反応を生じさせる可能性が生じる。またペプチドが短鎖の場合には立体構造が取れないために、正常な立体構造が形成された場合にはエピトープとして機能する配列が、エピトープとして機能しないことがある。そのため、ペプチドの鎖長を長くすることにより、短鎖ペプチドでは見いだせなかったこのような配列がエピトープとして機能し、目的とする機能以外の働きをする可能性がある。
【００２９】
本発明は、このような問題点を解決する方法をも示すものである。
【００３０】
エピトープキメラ抗原は以下の手順に従うことにより効率的に設計することができる。始めにエピトープペプチドの性質を調べることが重要である。即ちエピトープはそれに結合する抗体の結合部位（パラトープ）と水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、疎水結合等により非共有的に結合する。結合が成立するためにはエピトープ上のこれらの力が作用する部位と、パラトープ上の作用する部位とが一定の空間配置を取ることが必要である。すなわちエピトープとして機能する配列からなるペプチドが、エピトープとして機能するためには、パラトープに結合できる立体構造を取ることが必要である。一方ペプチドの高次構造は、ペプチドの長さが変わるペプチドにアミノ酸が付加されることにより変化することが予想されることから、エピトープキメラ抗原において、エピトープペプチドを単に付加した場合には抗原性を失う可能性が生じる。そのためエピトープキメラ抗原を設計する際にはこのような構造変化を生じさせない工夫をする必要がある。そのため組み合わせるエピトープペプチドの本来の構造を知る必要がある。
【００３１】
エピトープペプチドの構造を知るためには、結晶構造のエックス線回析、核磁気共鳴（NMR ）分析により構造が分析できているものであれば、それを用いればよいが、一般にはこのような例は少ないことから、アミノ酸配列からその２次構造予測を行なう方法、例えばChouとFasman等によって開発された計算式[Chou P.Y. & Fasman G. D. (1974) Biochemistry 13: 211-222; Chou P.Y. & Fasman G. D. (1974) Biochemistry 13: 222-245; Chou P.Y. & Fasman G. D. (1978) Ann. Rev. Biochem. 47: 251-276]やRobson等によって開発された計算式[Robson B. & Suzuki E. (1976) J. Mol. Biol. 107: 327-356; Garnier, J., Osguthorpe D. J. & Robson B. (1978) J. Mol. Biol. 120: 97-120] などを利用し解析を行なう。さらにHoppとWoods [Hopp T. P. & Woods K.R. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 3824-3828] やKyteとDoolittle [Kyte J. & Doolittle R.F. (1982) J. Mol. Biol. 157: 105-132]等によって開発された計算式に従い、蛋白質の疎水−親水プロットを行ないエピトープペプチドが示す性質に関する情報を得ておくことが好ましい。さらにJameson とWolf[Jameson B.A. & Wolf H.(1988) Comput. Applic. in Biosciences 4: 181-186]によって提唱されている計算式に従い，目的とするペプチドの抗原性に関する予測した性質も知っておくことは好ましいことである。さらにJanin 等やEmini 等によって提唱されている表面部位の予測法[Janin J., Wodak S., Levitt M. & Maigret B. (1978) J. Mol. Biol. 125: 357-386; Emini E., Hughes J.V., Perlow D.S., & Boger J. (1965) J. Biol. 55:836-839] 、Karplus 等によって提唱されている蛋白質の可塑性予測法[Karplus P.A. & Schulz G.E. (1985) Naturwiss. 72: 212-213]で得られる情報も抗原性を予想する際に役立つ。
【００３２】
ここで上記の各種解析を行なう際に重要なことは、エピトープ解析を行なった条件でのエピトープペプチドの情報を得ておくことである。例えば実施例に示したものでは、C14 抗原という約100 アミノ酸からなる配列と抗体とを反応させる際に、短鎖ペプチドを加えることによる結合阻害によりエピトープ解析を行なったが、この場合にはエピトープは長い配列の中で機能しているものであるから、上記の解析はこの長い配列を元に行なう。
【００３３】
エピトープキメラ抗原に於ては、これらの予測法によって得られるエピトープペプチドの予測構造が変化しないように、キメラ抗原ペプチドを設計する必要がある。
【００３４】
さらにエピトープキメラ抗原に於ては、エピトープペプチドのつなぎ目が新たなエピトープを提供しないように設計されねばならない。この予測は以下の方法によって成し得る。
【００３５】
一つはつなぎ目によって生じるペプチド配列を用いて遺伝子情報、蛋白構造情報バンクを検索し、一致する配列が無いことを確認する。もしくは一致する配列があったとしても抗原性が無いことが確認できれば良い。
【００３６】
本発明においては、つなぎ目のペプチド配列が抗原性をもたないか又は抗原性が低いと予測される配列を持つようにアミノ酸を付加、もしくは欠失させることにより設計する。付加すべきアミノ酸としては、例えばイソロイシン、ロイシン、バリン等の疎水的な性質を持つアミノ酸が好ましく、疎水性アミノ酸を付加することによってペプチド性つなぎ目の疎水性が増しエピトープとして機能する可能性を低くすることができる。すなわちエピトープキメラペプチドにおいてエピトープとして機能させるには、分子表面にエピトープが露出していることが肝要であり、疎水的な性質を付加することにより、分子表面に露出させる可能性を低くすることができる。
【００３７】
すなわち、本発明のエピトープキメラ抗原ペプチドにおいては、ペプチド性つなぎ目は抗原性をもたないか又は低抗原性であることを特徴とする。
【００３８】
上記の方法に従い最適な感染ＨＣＶグループ判別抗原として配列番号１に示す配列からなるペプチドGR1EPV5 、配列番号２に示す配列からなるペプチドGR1EPV4 を設計した。
【００３９】
エピトープキメラ抗原の作製
本発明のエピトープキメラ抗原は、化学合成法により、又は遺伝子工学的手法を用いて作製することができる。
【００４０】
化学合成法の場合、該方法は、ＨＣＶゲノムＲＮＡ又はそのｃＤＮＡによってコードされるグループＩ又はグループII ＨＣＶ関連抗原上の異なる２つ以上のエピトープの各々を従来のペプチド合成法を用いて合成する段階、ペプチド性つなぎ目を別個に合成する段階、エピトープとエピトープの間をペプチド性つなぎ目を介して結合する段階を包含する。ペプチド合成法は周知の技術であり、例えば日本生化学会編、生化学実験講座１「タンパク質の化学IV−化学修飾とペプチド合成」（1981年）東京化学同人に記載される種々の手法が使用され得る。長鎖ペプチドの場合には、通常、固相法が用いられる。またアミノ酸の保護及び脱保護の技術もペプチド合成において一般的に使用される。
【００４１】
遺伝子工学的手法の場合、該方法は、エピトープキメラ抗原ペプチドをコードするＤＮＡ断片を作製する段階、該ＤＮＡ断片をベクターに組み込んで複製可能な発現ベクターを構築する段階、該発現ベクターを宿主細胞に導入し、ペプチドを発現する形質転換体を得る段階、さらに該形質転換体を培養し発現産物を発現させて発現したペプチドを回収する段階を含む。この製造方法も本発明の一部である。
【００４２】
例えば配列番号１及び２に示すアミノ酸配列を有するキメラペプチドをコードするＤＮＡ断片は実施例３に示すように作製することが可能である。さらに実施例４に示すように形質転換体を取得し、形質転換体を培養し、該ペプチドを分離、回収することが可能である。
【００４３】
遺伝子工学的な手法に於て発現に用いる発現ベクターとしては、実施例に示した大腸菌を宿主とし、大腸菌トリプトファンオペロンの制御化に発現させるベクター以外にも、大腸菌を宿主としては、大腸菌トリプトファンオペロン以外にもＴａｃプロモーター、Ｔｒｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰｈｏＡプロモーター、λプロモーター等を利用したベクターを用いることが可能である。また大腸菌以外にも酵母を宿主とし、解糖系遺伝子、たとえばグリセロアルデヒド−３−燐酸デヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼＩ、II、ピルビン酸キナーゼ、ホスホグリセリンキナーゼ、トリオースイソメラーゼ等の酵母で慣用に用いられているプロモーターを利用した発現ベクターを用いて発現させることも可能である。さらに昆虫細胞を宿主としバキュロウイルスをベクターとした発現系、哺乳類細胞例えばＣＨＯ細胞や、ＣＯＳ細胞 ＨｅＬａ細胞等を宿主とし、慣用的に用いられる組み込み型発現ベクターやワクチニアウイルスをベクターとした発現系、アデノウイルスや慣用的に用いられるウイルスをベクターとした発現系を利用しても発現可能である。
【００４４】
さらに遺伝子工学的手法を用いる場合には、キメラ抗原ペプチドを他のペプチドとの融合蛋白質として発現させることも慣用的に用いられる手段である。
【００４５】
上記の方法に基づくならば、グループＩ又はグループ II と同様に、グループIII （Okamoto et al, J. Gen. Virol. 72:2697-2704(1991)）に属するＨＣＶゲノムから、グループIII を特異的に区別するエピトープ領域を取り出してエピトープキメラ抗原ペプチドを作製することが可能であり、これを用いることによりグループIII に感染している患者血清のグループ判別を行なうことができる。
【００４６】
遺伝子工学的に発現させ回収したグルーピングに好適なキメラ抗原ペプチドを用いてＨＣＶ感染患者の血清中のグループＩ特異的な抗体を検出すると、実施例５に示すごとく、それ以前に用いていた抗原のみでは検出不可能であった患者血清のグループ判定を行なうことが可能となった。
【００４７】
したがって、本発明はさらに、エピトープキメラ抗原ペプチドと、ＨＣＶに感染したと推定される試料中のグループＩ又はグループII特異的な抗体との免疫学的反応を行なった後、生成する抗原−抗体複合体の濃度又は存在を測定することを含む、ＨＣＶグループ判定方法を提供する。
【００４８】
本発明はまた、エピトープキメラ抗原ペプチドと、ＨＣＶに感染したと推定される試料中のＨＣＶ関連抗体との免疫学的反応を行なった後、生成する抗原−抗体複合体の濃度又は存在を測定することを含む、ＨＣＶ感染判定方法を提供する。
【００４９】
抗原−抗体複合体の濃度又は存在は、エンザイムイムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、イムノドットブロッティング等の公知の一般的方法を用いて測定することができる。上記判定の精度は、それぞれのグループ抗原に対する抗体価を測定することによりさらに向上する。また田中ら(T.Tanaka ら，Hepatology 19:1347〜1353，1994) により提唱されている判別方法を用いることもできる。
【００５０】
以下実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００５１】
【実施例】
実施例１ コア領域ペプチドを用いたグループ判別
配列番号９及び１０の配列を持つペプチドをアプライドバイオシステム社のペプチド合成機（Ｍｏｄｅｌ：４３０Ａ）を用いて合成し、逆相クロマトグラフィーにより目的のペプチドを精製した。精製したペプチドが目的の配列であることはアミノ酸シークエンサーの分析により確認した。
【００５２】
このペプチドを2.5 μg/mlの濃度となるように8M尿素を含む0.1Mの燐酸緩衝液（pH7.5 ）に希釈した。希釈した抗原をヌンク社のマルチモジュールプレートにウェルあたり 100μｌのせ、室温に2 時間静置した。抗原希釈液を除いた後、ウェルあたり 100μｌのブロッキング液［0.5 ％カゼイン、0.15M NaCl、2.5mM EDTA、0.1M燐酸緩衝液（pH7.0 ）］を加え室温に2 時間静置し抗原をプレートに固定した。
【００５３】
各ウェルに検体希釈液［0.5 ％カゼイン、0.5M NaCl 、2.5mM EDTA、0.1M燐酸緩衝液（pH7.0 ）］によって11倍に希釈した非Ａ非Ｂ型慢性肝炎患者血清 100μｌを加え４５分静置した。ウェルを0.1% Tween20を含むPBS で洗浄した後、 100μｌのホースラディッシュパーオキシダーゼによって標識された抗ヒトIgG 抗体を加え、45分静置した。ウェルを0.1% Tween20を含むPBS で洗浄した後、常法に従い、発色法により酵素活性を計測した。その結果を表２にまとめて示す。また比較のため、Ｃ１４−１−２及びＣ１４−２−２抗原を用いてグループ判別した結果と、ＰＣＲ法によりグループ判別した結果を表中に示した。
【００５４】
【表２】
【００５５】
実施例２ Ｃ１４−１−２抗原のエピトープ解析
精製したＣ１４−１−２ペプチドを2.5 μg/mlの濃度となるように８Ｍ尿素を含む０．１Ｍの燐酸緩衝液（pH7.5 ）に希釈した。希釈した抗原をヌンク社のマルチモジュールプレートにウェルあたり 200μｌのせ、室温に2 時間静置した。抗原希釈液を除いた後、ウェルあたり 200μｌのブロッキング液［0.5 ％カゼイン、0.15M NaCl、2.5mM EDTA、0.1M燐酸緩衝液（pH7.0 ）］を加え室温に2 時間静置した。このように抗原をプレートに固定した。検体２０μl と化学合成したペプチド（0.1 ｍｇ／ｍｌ）２０μl を等量混和し、室温１時間静置した。これに検体希釈液を 200μl 加えた後にペプチドを固定したプレートに加えた。３０℃１時間反応させた後、洗浄を行ない、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトIgG （マウスモノクローナル抗体）を加え３０℃１時間反応させた。洗浄した後、ｏ−フェニレンジアミン溶液を加え、３０℃１時間反応させた後１Ｍ硫酸溶液を加えることにより反応を停止させ、比色計で 492ｎｍの発色を測定した。
【００５６】
結果を表３に示す。表３に示した検体は全てＨＣＶグループＩに属すことはｔｒｐＥ・Ｃ１４−１−２（特願平５−１９４１８５号）との反応性より明らかであり、グループＩの配列を持つペプチドを加えることによりｔｒｐＥ・Ｃ１４−１−２との反応が阻害されていることが明らかである。これらの結果からＣ１４−１−２抗原に於て患者血清中の抗体は阻害のかかったペプチドにエピトープが存在していることが明らかになった。
【００５７】
【表３】
［ＨＣＶグループ判定に適したエピトープキメラ抗原遺伝子の構築］
以下のＤＮＡをＤＮＡ合成機（ＡＢＩ：Ｍｏｄｅｌ３９４Ａ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ：Ｍｏｄｅｌ８７００）を用いて合成した。
【００５８】
ＥＰ１：ＧＣＧＡＡＴＴＣＧＣＣＴＣＡＣＡＣＣＴＣＣＣＴＴＡＣＡＴＣ；
ＥＰ２Ｒ：ＧＧＧＴＡＣＣＴＡＣＣＡＣＧＧＧＡＧＣＡＧＣＡＧＣＴＣ；
ＣＯＲＥ−Ｆ：ＡＧＧＴＡＣＣＣＣＴＡＡＡＧＣＴＣＧＴＣＧＴＣＣＧＧＡＡＧＧＴＣＧＴＧＣＴ；
ＣＯＲＥ−Ｒ：ＴＣＣＣＨＨＨＴＴＧＡＧＣＣＣＡＡＧＣＡＣＧＡＣＣＴＴＣＣＧＧＡＣＧ；
Ｖ４ＸＹＺ：ＡＧＡＣＣＣＧＧＧＴＡＣＣＡＣＧＧＧＡＧＣＡＧＣＡＧＣ；
ＥＰ５：ＡＣＣＣＧＧＧＡＧＴＧＴＧＧＴＣＡＴＴＧＴＧＧＧＴＡＧＧ；および
ＥＰ６：ＧＡＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＣＡＡＴＣＧＡＡＣＴＣＣＣＧＧＴＡＧＡＧＧＡＣＴＴＣ。
【００５９】
ＥＰ１とＥＰ２Ｒ及びＶ４ＸＹＺはグループＩのＨＣＶ ｃＤＮＡからペプチドＸ、Ｙ、Ｚ領域をコードする配列を取り出すためのプライマーである。ＥＰ５とＥＰ６はグループＩのＨＣＶ ｃＤＮＡからペプチドＶ、Ｗａ領域をコードする配列を取り出すためのプライマーである。
【００６０】
これらのプライマーを用いてＰＣＲ法により配列を取り出した。反応は１ｎｇのＨＣＶ ｃＤＮＡ（Ｃ６−７９）（本出願人らによる特願平５−１９３１０４号）、100 ｐｍｏｌプライマー（ＥＰ１とＥＰ２ＲまたはＥＰ１とＶ４ＸＹＺまたはＥＰ５とＥＰ６）を加え、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ2 、0.01％ゼラチン、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、２．５Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅとなるよう 100μｌの反応液を調製し、ミネラルオイルを重層して９４℃、３０秒、５５℃、１分、７２℃、２分の条件で２５サイクル反応を行なわせた。またＣＯＲＥ−ＦとＣＯＲＥ−Ｒをそれぞれ２μｇ加え、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ2 、0.01％ゼラチン、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、２．５Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅとなるよう 100μｌの反応液を調製し、ミネラルオイルを重層して９４℃、３０秒、５０℃、１分、７２℃、２分の条件で１５サイクル反応を行なわせた。反応液の一部をアガロース電気泳動し、ＥＰ１とＥＰ２Ｒの組み合わせでは約 140ｂｐの、ＥＰ１とＶ４ＸＹＺの組み合わせでは約 150ｂｐの、ＣＯＲＥ−ＦとＣＯＲＥ−Ｒの組み合せでは約５０ｂｐの断片、ＥＰ５とＥＰ６の組み合せでは約 100ｂｐの断片を分離した。分離したＤＮＡ断片をアガロース切片からＭｅｒｍａｉｄ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ１０１社）を用いメーカーの推奨する方法に従いＴＥ溶液中に回収した。回収したＤＮＡ断片を２５ｎｇのｐＧＥＭ−Ｔベクターと共に２０μｌの反応液［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 ，１ｍＭ ＡＴＰ，１０ｍＭ ＤＴＴ，Ｔ４ ＤＮＡリガ−ゼ］中で１６℃、１時間反応させた。反応液の一部を用い大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ社）をＨａｎａｈａｎの方法[ DNA cloning: A practical approach (ed. D. M. Glover), vol. 1, p109-, IRC press, (1885)] に従って形質転換した。アンピシリン耐性のコロニーを選択し、形質転換体のDNA をミニプレパレーション法により調製し、制限酵素で切断することにより両断片が環状化しているプラスミドを持つ形質転換体を選択した。
【００６１】
ＥＰ１とＥＰ２Ｒとを用いて生じた断片のクローニングされているプラスミドＤＮＡをＫｐｎＩとＥｃｏＲＩで切断し、電気泳動を行なうことにより約１４０ｂｐの断片を分離し、Ｍｅｒｍａｉｄ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ１０１社）を用いメーカーの推奨する方法に従いＴＥ溶液中に回収した。またＣＯＲＥ−ＦとＣＯＲＥ−Ｒの組み合わせで生じた断片のクローニングされているプラスミドＤＮＡをＫｐｎＩとＳｍａＩで切断し、電気泳動を行なうことにより約６０ｂｐの断片を分離し、Ｍｅｒｍａｉｄ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ１０１社）を用いメーカーの推奨する方法に従いＴＥ溶液中に回収した。回収した断片とＥｃｏＲＩとＳｍａＩで切断したｐＴ７Ｔ３１９Ｕ（ファルマシア社）とＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結反応させ、反応液の一部を用い、大腸菌ＳＵＲＥ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ社）を形質転換した。アンピシリン耐性のコロニーを選択し、形質転換体のＤＮＡをミニプレパレーション法により調製し、制限酵素で切断することにより両断片が結合環状化しているプラスミドを持つ形質転換体を選択した。得られたプラスミドをＳｍａＩとＢａｍＨＩで切断し、ＥＰ５とＥＰ６で生じた断片のクローニングされているプラスミドＤＮＡをＢａｍＨＩとＳｍａＩで切断し、電気泳動を行なうことにより 100ｂｐの断片を分離し、Ｍｅｒｍａｉｄ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ１０１社）を用い回収した断片と、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結反応させた。反応液の一部を用い、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ社）を形質転換した。アンピシリン耐性のコロニーを選択し、形質転換体のDNA をミニプレパレーション法により調製し、制限酵素で切断することにより両断片が結合環状化しているプラスミドを持つ形質転換体を選択した。このようにしてＧＲ１ＥＰＶ５遺伝子断片を持つプラスミドを構築した。
【００６２】
構築したプラスミド1 μg をEcoRI 、BamHI で切断した（50mM Tris-HCl [pH7.5], 7mM MgCl2 , 100mM NaCl, 10 units EcoRI, 10 units BamHI／反応液量10μl で37℃１時間反応）後、この反応液をアガロース電気泳動にかけ約 250bpの断片を分離した。分離した断片をＭｅｒｍａｉｄ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ１０１社）を用い回収した。一方ｐＴｒｐＴｒｐＥ 1μg をEcoRI 、BamHI で切断した（50mM Tris-HCl [pH7.5], 7mM MgCl2 , 100mM NaCl, 10 units EcoRI, 10 units BamHI／反応液量10μl で37℃１時間反応）後、この反応液をアガロースにかけ約3Kbpの断片を分離した。分離した断片をガラスパウダー法により回収した。回収した両断片をＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結反応させた。反応液の一部を用い、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ社）を形質転換した。アンピシリン耐性のコロニーを選択し、形質転換体のDNA をミニプレパレーション法により調製し、制限酵素で切断することにより両断片が結合環状化しているプラスミドを持つ形質転換体を選択した。このようにしてＧＲ１ＥＰＶ５遺伝子発現プラスミド、ｐＴｒｐＧＲ１ＥＰＶ５を構築した。このプラスミドを大腸菌に移入後、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センターに平成６年７月７日付で寄託し、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４４２２を得た。
【００６３】
ＥＰ１とＶ４ＸＹＺの組み合わせで生じた断片の挿入されているプラスミドをＥｃｏＲＩとＳｍａＩで切断し生じる約 150ｂｐの断片を、電気泳動により分離し、Ｍｅｒｍａｉｄ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ１０１社）を用いメーカーの推奨する方法に従いＴＥ溶液中に回収した。回収した断片とＥｃｏＲＩとＳｍａＩで切断したｐＴｒｐＧＲ１ＥＰＶ５とＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結反応させ、反応液の一部を用い、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ社）を形質転換した。その結果ＧＲ１ＥＰＶ４遺伝子発現プラスミド、ｐＴｒｐＧＲ１ＥＰＶ４を構築した。このプラスミドを大腸菌に移入後、同センターに平成６年７月７日付で寄託し、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４４２１を得た。
【００６４】
実施例４ エピトープキメラ抗原の発現と精製
ｐＴｒｐＧＲ１ＥＰＶ４またはｐＴｒｐＧＲ１ＥＰＶ５で形質転換された大腸菌を 100μg/mlアンピシリンを含むＬＢ培地で３７℃一夜培養した。これを１％濃度で 100μg/mlアンピシリンを含むＭ９−ＣＡに接種し３７℃一夜培養した。培養終了後遠心により菌体を集め、50mlのLysis 液［50mM Tris-HCl (pH8.5), 30mM NaCl, 5mM EDTA ］に再懸濁し、1ml のリゾチーム液（10mg/ml Lysozyme）を加え、37℃において１時間処理した。この懸濁液を超音波処理（150W、90秒で２回）にかけることにより細胞を破壊した。15000rpmで、４℃において30分間遠心し不溶性分画を回収した。不溶性分画を50mlのＮＰ４０を１％含むＡ溶液［50mM Tris-HCl (pH8.5) ］に再懸濁しホモジナイズ（1500rpm で５ストローク）した。懸濁液を15000rpmで、４℃において30分間遠心し不溶性分画を回収した。不溶性分画を50mlの2M尿素を含むＡ溶液に再懸濁しホモジナイズ（1500rpm で５ストローク）した。懸濁液を15000rpmで、４℃において30分間遠心し不溶性分画を回収した。不溶性分画を50mlの６M 尿素を含むＡ溶液に再懸濁しホモジナイズ（1500rpm で５ストローク）した。懸濁液を15000rpmで、４℃において30分間遠心し可溶性分画を回収した。
【００６５】
６Ｍ尿素を含む溶液で可溶化した抗原溶液から、ＳセファーロースＨＰカラム（ファルマシア社）を用いたイオン交換法とＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ｐｇ（ファルマシア社）を用いたゲル濾過法によりエピトープキメラ抗原ペプチドＧＲ１ＥＰＶ４（配列番号２のアミノ酸配列を含む）及びＧＲ１ＥＰＶ５（配列番号１のアミノ酸配列を含む）を精製した。
【００６６】
実施例５ エピトープキメラ抗原ペプチドと患者血清との反応
エピトープキメラ抗原ペプチドを2.5 μg/mlの濃度となるように8M尿素を含む0.1Mの燐酸緩衝液（pH7.5 ）に希釈した。希釈した抗原をヌンク社のマルチモジュールプレートにウェルあたり 100μｌのせ、室温で2 時間静置した。抗原希釈液を除いた後、ウェルあたり 100μｌのブロッキング液［0.5 ％カゼイン、0.15M NaCl、2.5mM EDTA、0.1M燐酸緩衝液（pH7.0 ）］を加え室温で2 時間静置し抗原をプレートに固定した。
【００６７】
各ウェルに検体希釈液［0.5 ％カゼイン、0.5M NaCl 、2.5mM EDTA、0.1M燐酸緩衝液（pH7.0 ）］によって11倍に希釈した非Ａ非Ｂ型慢性肝炎患者血清 100μｌを加え４５分静置した。ウェルを0.1% Tween20を含むPBS で洗浄した後、 100μｌのホースラディッシュパーオキシダーゼによって標識された抗ヒトIgG 抗体を加え、45分静置した。ウェルを0.1% Tween20を含むPBS で洗浄した後、常法に従い、発色法により酵素活性を計測した。その結果を表４にまとめて示す。また比較のため、Ｃ１４−１−２及びＣ１４−２−２抗原を用いてグループ判別した結果と、ＰＣＲ法によりグループ判別した結果を表中に示した。
【００６８】
【表４】
【００６９】
コア領域のグループ判別エピトープを含むＧＲ１ＥＰＶ５抗原では、ＧＲ１ＥＰＶ４同様血清２２、２５での判別が容易になっているのに加え、さらに血清番号７、１６において反応性が向上しており、この抗原を用いることにより、感染しているＨＣＶのグループ判別が容易になったことは明らかである。
【００７０】
【発明の効果】
従来グループ判別が困難であった血清等の検体であっても、本発明のエピトープキメラ抗原によってその判別が可能となり、ＨＣＶのグルーピング判別だけでなくＨＣＶ感染判定にも精度良く使用することができる。本発明に従えば、抗原抗体反応を利用した方法に於て常に問題となる抗原抗体間の非特異反応の軽減、抗原抗体間の特異反応の反応性向上を図ることができ、抗原抗体反応を利用した免疫学的診断方法に適用するためのペプチド抗原の機能向上を達成できる。
【００７１】
【配列表】
Claims (7)
- Ｃ型肝炎ウイルス感染のグループ判別に用いるエピトープキメラ抗原ペプチドであって、該ペプチドは、配列番号３、４並びに５に示されるアミノ酸配列に存在するＣ型肝炎ウイルスＮＳ４抗原のエピトープを構成するアミノ酸配列がペプチドリンカーを介して連結された配列からなり、かつ該抗原上のエピトープの配置が、配列番号４、配列番号５、配列番号３に示されるアミノ酸配列に存在するエピトープの順にキメラ抗原ペプチドのＮ末端側から配置されている、エピトープキメラ抗原ペプチド。
- 配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のエピトープキメラ抗原ペプチド。
- 配列番号９に示されるアミノ酸配列に存在するＣ型肝炎ウイルスコア抗原エピトープを構成するアミノ酸配列が付加された、抗原上のエピトープの配置が配列番号４、配列番号５、配列番号９、配列番号３に示されるアミノ酸配列に存在するエピトープの順にキメラ抗原ペプチドのＮ末端側から配置されている、請求項１に記載のエピトープキメラ抗原ペプチド。
- 配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる、請求項３に記載のエピトープキメラ抗原ペプチド。
- Ｃ型肝炎ウイルス感染のグループ判別に用いるエピトープキメラ抗原ペプチドであって、該ペプチドは、配列番号６、７、８及び１０に示されるアミノ酸配列に存在するＣ型肝炎ウイルスＮＳ４抗原のエピトープを構成するアミノ酸配列がペプチドリンカーを介して連結された配列からなり、かつ該抗原上のエピトープの配置が、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号６に示されるアミノ酸配列に存在するエピトープの順にキメラ抗原ペプチドのＮ末端側から配置されているエピトープキメラ抗原ペプチド。
- 請求項１〜４の何れか一項に記載のエピトープキメラ抗原ペプチド及び請求項５に記載のエピトープキメラ抗原ペプチドと検体試料とを接触させて特異的抗体免疫反応を行わせ、生成する抗原抗体複合体の濃度又は存在を測定することを含む、Ｃ型肝炎ウイルスグループの判定法。
- 請求項１〜５の何れか一項に記載のエピトープキメラ抗原ペプチドと試料検体とを接触させて特異的免疫反応を行わせ、生成する抗原抗体複合体の濃度又は存在を測定することを含む、Ｃ型肝炎ウイルス感染の判定法。
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