JPH0873497A - C型肝炎ウイルス感染又はグループ判定のためのエピトープキメラ抗原ペプチド、その製法、及びそれを使用する感染又はグループ判定法 - Google Patents

C型肝炎ウイルス感染又はグループ判定のためのエピトープキメラ抗原ペプチド、その製法、及びそれを使用する感染又はグループ判定法

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JPH0873497A
JPH0873497A JP6232073A JP23207394A JPH0873497A JP H0873497 A JPH0873497 A JP H0873497A JP 6232073 A JP6232073 A JP 6232073A JP 23207394 A JP23207394 A JP 23207394A JP H0873497 A JPH0873497 A JP H0873497A
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Abstract

(57)【要約】 【構成】 C型肝炎ウイルス(HCV)ゲノムRNA又
はそのcDNAによってコードされるグループI又はII
HCV関連抗原上の異なる2つ以上のエピトープをペ
プチド性つなぎ目を介して接合して成る、それぞれグル
ープI又はIIHCV感染を特異的に判別するためのエピ
トープキメラ抗原ペプチド、その製法、及びそれを用い
るHCVグループ判定又はHCV判定方法。 【効果】 従来グループ判別が困難であった血清等の検
体であっても、本発明のエピトープキメラ抗原によって
その判別が可能となり、HCVのグルーピング判別、H
CV感染判定に精度良く使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、C型肝炎ウイルス感染
判定又はグループ判定に使用するためのエピトープキメ
ラ抗原ペプチド、その製法、及びそれを使用する感染又
はグループ判定法に係る。
【0002】
【従来の技術】非A非B型肝炎は伝染性の肝炎でありウ
イルスを媒体として伝播すると考えられている。非A非
B型肝炎の伝播経路はいまだ明らかになっていない部分
が多いが、輸血、血液製剤により引き起こされる非A非
B型肝炎は、B型肝炎のスクリーニング体制が確立され
た今日、輸血後肝炎として医療上の大きな問題点となっ
ている。
【0003】1989年非A非B型肝炎に関連したウイ
ルス遺伝子の一部がクローニングされ、C型肝炎ウイル
ス(HCV)と命名された。ほぼ同時期に本出願人を含
む多くの研究グループによりHCV遺伝子が数多く単離
され、その構造上の特徴が明らかとなった(Science 24
4: 359-362(1989)及びScience 244: 362-344(1989))。
【0004】推定されるHCV遺伝子は約9400塩基
からなる+鎖のRNAをゲノムとして持ち、約3000
アミノ酸からなる一つながりのポリペプチドをコードし
ていると考えられている。予想されるアミノ酸配列はフ
ラビウイルスあるいはペスチウイルスと相同性を持ち、
これらのウイルスに近縁のウイルスであろうと考えられ
ている。これらのウイルス構造との比較から、HCVゲ
ノムによってコードされるポリペプチドは、1本のポリ
ペプチドとして細胞内において合成された後に、アミノ
末端から構造蛋白質であるコア、エンベロープ(E
1)、NS1またはE2(NS1/E2)と、非構造蛋
白質であるNS2、NS3、NS4、NS5に切断さ
れ、それぞれの機能を果たすと考えられている。
【0005】これらの非構造蛋白質のうちNS3、NS
4のアミノ酸配列を比較することによりHCVは少なく
とも2種類のグループ(グループI、グループII)に分
類可能であることが明らかとなった[Tsukiyama-Kohara
et al. Virus Genes (1991)5: 243-254] 。ひとつはカ
イロン社により分離されたHCVと核酸、アミノ酸レベ
ルでの相同性の高いグループIと、核酸、アミノ酸レベ
ルでの相同性の低いグループIIとに分類される(本出願
人による特開平5−84085号公報)。
【0006】グループI HCVとグループII HCV
との違いについては未だ明らかになっていない部分が多
いが、金井[Kanai et al., Lancet (1992) 339: 1543
]や吉岡[Yoshioka et al., Hepatology (1992) 16:
293-299]等はグループII感染患者の方がグループI感
染患者よりもインターフェロン治療が効果的であること
を報告している。このことはグループ判別を効率良く行
なうことにより、インターフェロン治療がより効果的に
行なえるようになることを示唆している。
【0007】
【発明が解決しようとする課題】本発明者等は、詳細な
検討により、NS4領域のグループIとII間のアミノ酸
配列が最も異なる領域(1676から1760まで)の配列を持
つペプチドは、グループI由来の配列を持つものはグル
ープI HCVに感染した患者血清中の抗体と反応し、
グループII由来の配列を持つものはグループII HCV
に感染した患者血清中の抗体と反応すること、さらにこ
れらの配列を持つペプチドを組み合わせ、患者血清との
反応性を調べることにより、患者が何れのグループに属
するHCVに感染しているのかを判別することが可能と
なることを明らかにしてきた(特願平5−194185
号)。
【0008】しかしながら、多くの血清を検索するなか
で、グループ判別が困難な患者血清が、低い比率ではあ
るが存在することが今回初めて明らかになった。
【0009】したがって、本発明は、これらの判別困難
であった血清でもグループ判別可能になるエピトープキ
メラ抗原ペプチド及びその製造方法を提供することを目
的とする。
【0010】本発明はまた、このようなエピトープキメ
ラ抗原ペプチドをHCV感染又はグループ判定に使用す
ることを目的とする。
【0011】
【課題を解決するための手段】本発明は、C型肝炎ウイ
ルス(HCV)ゲノムRNA又はそのcDNAによって
コードされるグループI HCV関連抗原上の異なる2
つ以上のエピトープをペプチド性つなぎ目を介して接合
して成る、グループI HCV感染を特異的に判別する
ためのエピトープキメラ抗原ペプチドを提供する。
【0012】本発明はまた、HCVゲノムRNA又はそ
のcDNAによってコードされるグループII HCV関
連抗原上の異なる2つ以上のエピトープをペプチド性つ
なぎ目を介して接合して成る、グループII HCV感染
を特異的に判別するためのエピトープキメラ抗原ペプチ
ドを提供する。
【0013】グループI HCV及びグループII HC
Vには、遺伝子構造が互いに異なる領域が存在すること
が、本発明者らの研究によって判明してきている(特願
平5−194185号)。例えば、NS4領域中アミノ
酸番号1676〜1764のアミノ酸配列は、HCVのグループ
IとグループIIとで大きく相違し、両者の識別を可能に
する。このようにHCVグループIとIIの識別を可能に
する領域は、NS4領域以外にも存在し、例えばコア領
域にも存在することが今回判明した。HCVグループI
及びグループIIについては、前述のとおり、カイロン社
により分離されたHCV株(C5-1-1 :国際公開番号W
O89/04669 号)との核酸、アミノ酸レベルでの相同性
の比較によって決定され、相同性のより高い(通常80%
以上)HCV株をグループI、相同性のより低い(通常
80%未満)HCV株をグループIIと称している。グルー
プII HCV株の中にはカイロン社のグループI HC
V株との相同性が約50%と極めて低いものも存在する。
したがって、HCVゲノムDNAのヌクレオチド配列上
には、NS4領域及びコア領域以外にもHCVグループ
IとグループIIを識別可能にする他の領域も存在するも
のと推定される。
【0014】本発明のHCV関連抗原上のエピトープに
は、NS4及びコア領域上のエピトープの他に、これら
領域以外のHCVグループI及びIIを区別する他の領域
のエピトープも包含される。本発明においては、そのよ
うなエピトープがHCVのNS4領域又はコア領域上に
存在することが好ましい。エピトープの具体例は、下記
の説明から明らかであろう。
【0015】コア領域のペプチドを用いたグループ判別 上述したように、HCVにはグループIとIIの異なる種
類が存在しており、グループIとIIはアミノ酸配列に部
分的な相違を有している。両者の配列をHCV遺伝子全
体にわたって比較することにより、NS4以外にもグル
ープ特異的に配列が異なる領域がコア領域のアミノ酸番
号61から80にあたる領域に存在することが今回判明し
た。この領域についてグループIとIIを比較した結果を
下記に示す。
【0016】
【表1】 上記の領域に於てグループ内でアミノ酸配列は保存され
ているのに対し、グループ間でアミノ酸配列が異なって
いる。この領域の配列が抗原性を持ち、グループ判別の
抗原として用いることが可能か否かを明らかにするた
め、それぞれのアミノ酸配列を持つペプチドを作製し、
患者血清との反応性を調べた(下記実施例1参照)。
【0017】その結果、血清との反応性はNS4領域を
用いた場合の反応性と比較すると反応する血清数が少な
いことから、グループ判別のための主要なエピトープを
提供しているとは考えられないが、HCVグループ特異
的に反応していることは、PCR法及びNS4領域を用
いた判別結果との比較により明らかとなった。さらに詳
細に検討すると、NS4領域には反応せず、この領域に
のみグループ特異的に反応する患者血清が、グループI
の血清に於て少数ながら存在することが明らかになっ
た。
【0018】コア領域上のグループI又はグループII
HCV特異的抗原のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号9
又は10に示す。
【0019】上記の結果、コア領域の配列を持つペプチ
ドを用いた判別方法は、NS4領域を用いたものと比較
すると、その検出率に於て大きく劣るものの、少数の患
者血清に於て検出可能となることから、NS4領域を用
いた判別方法を相補することが期待出来ることを示唆し
ている。
【0020】NS4領域ペプチドのエピトープ解析 NS4領域のうちグループI HCVに於ては、グルー
プI HCVのポリプロテイン1676から1760に相当する
アミノ酸配列を持つC14-1-2 抗原、グループIIHCVに
於ては、グループII HCVのポリプロテイン1680から
1764に相当するアミノ酸配列を持つC14-2-2 抗原を、抗
原として用いることによりグループ判別が可能である
(本出願人による特願平5−194185号)。
【0021】患者血清中に存在する抗体は、これらのグ
ループ特異的抗原へ単独に、もしくは両者に結合する。
グループIに対応するC14-1-2 抗原に単独に結合した場
合には、患者はグループI HCVに感染しており、グ
ループIIに対応するC14-2-2抗原に単独に結合した場合
には、患者はグループII HCVに感染していることが
明白に判定可能である。
【0022】一方両者に反応する抗体が検出された場合
でも、その反応性が異なっていることから、判別可能で
ある。すなわちグループIに感染している場合にはC14-
1-2抗原と強く反応し、これは希釈した血清が各抗原と
反応して生じる、ELISA 反応の基質反応産物の与える吸
光度を比較することにより判定することができる。しか
しながらこのような血清に於ては、血清中に存在するH
CVに対する抗体が、グループI及びII抗原両者に、反
応の強さは異なるものの非特異的に反応する場合もあ
り、このような反応を出来るだけ抑えることが望まし
い。
【0023】上記反応を生じせしめる領域を見いだすた
めに、C14-1-2 抗原、C14-2-2 抗原と抗体との反応特異
性を調べた。実施例2に具体的な方法を記載したが、C1
4-1-2 抗原と患者血清中の抗体との反応は、ペプチド1
−W、1−X、1−Yを反応に加えることにより阻害さ
れ、さらに1−Wで阻害が認められたものについては、
1−Wの配列を分断化した配列を持つ1−Wa を加える
と反応の阻害が認められた。
【0024】一方C14-2-2 抗原と患者血清中の抗体との
反応は、ペプチド2−W、2−X、2−Yを反応に加え
ることにより阻害され、さらに2−Wで阻害が認められ
たものについては、2−Wの配列を分断化した配列を持
つ2−Wa を加えると反応の阻害が認められた。
【0025】これらの結果からC14-1-2 抗原上の患者血
清の認識配列(エピトープ)は1−Wa (配列番号
3)、1−X(配列番号4)、1−Y(配列番号5)に
あり、C14-2-2 抗原上の患者血清の認識配列(エピトー
プ)は2−Wa (配列番号6)、2−X(配列番号
7)、2−Y(配列番号8)にあることが判明した。
【0026】エピトープキメラ抗原の設計 グループI HCV感染判別抗原としては、C14-1-2 抗
原が適しており、患者血清中の抗体は1−Wa 、1−
X、1−Yペプチドをエピトープとして認識し結合して
いる。一方患者血清のうち少数はC14-1-2 に対する抗体
を持っていないが、コア領域に対する抗体を持ってい
る。グループ判別抗原としてはこれらの抗体の何れとも
反応するものが望ましい。しかしながら、コア領域とN
S4領域はHCV遺伝子上で大きく離れていることか
ら、HCV遺伝子からこれらの配列のみを一つながりの
ものとして取り出すことは困難である。
【0027】そこで本発明者等は、HCVのグループ判
別を可能にする領域上に存在する互いに異なる2つ以上
のエピトープを組み合わせた人工的に構築したエピトー
プキメラ抗原、例えばC14-1-2 抗原のグルーピング抗原
として最適な性質と、それを相補するコア抗原の性質と
を兼ね備えたキメラ抗原を構築することにより、HCV
グループ判別だけでなくHCV感染判定の確度を高め得
ることを見出した。
【0028】本発明によって可能となったエピトープキ
メラ抗原は、明らかになったエピトープをただ単純に結
合させることによって作製できるものではない。すなわ
ち、単純にエピトープ配列を組み合わせた場合には、エ
ピトープの接合によって生じる配列が、新たなエピトー
プとなり、非特異反応を生じさせる可能性が生じる。ま
たペプチドが短鎖の場合には立体構造が取れないため
に、正常な立体構造が形成された場合にはエピトープと
して機能する配列が、エピトープとして機能しないこと
がある。そのため、ペプチドの鎖長を長くすることによ
り、短鎖ペプチドでは見いだせなかったこのような配列
がエピトープとして機能し、目的とする機能以外の働き
をする可能性がある。
【0029】本発明は、このような問題点を解決する方
法をも示すものである。
【0030】エピトープキメラ抗原は以下の手順に従う
ことにより効率的に設計することができる。始めにエピ
トープペプチドの性質を調べることが重要である。即ち
エピトープはそれに結合する抗体の結合部位(パラトー
プ)と水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、
疎水結合等により非共有的に結合する。結合が成立する
ためにはエピトープ上のこれらの力が作用する部位と、
パラトープ上の作用する部位とが一定の空間配置を取る
ことが必要である。すなわちエピトープとして機能する
配列からなるペプチドが、エピトープとして機能するた
めには、パラトープに結合できる立体構造を取ることが
必要である。一方ペプチドの高次構造は、ペプチドの長
さが変わるペプチドにアミノ酸が付加されることにより
変化することが予想されることから、エピトープキメラ
抗原において、エピトープペプチドを単に付加した場合
には抗原性を失う可能性が生じる。そのためエピトープ
キメラ抗原を設計する際にはこのような構造変化を生じ
させない工夫をする必要がある。そのため組み合わせる
エピトープペプチドの本来の構造を知る必要がある。
【0031】エピトープペプチドの構造を知るために
は、結晶構造のエックス線回析、核磁気共鳴(NMR )分
析により構造が分析できているものであれば、それを用
いればよいが、一般にはこのような例は少ないことか
ら、アミノ酸配列からその2次構造予測を行なう方法、
例えばChouとFasman等によって開発された計算式[Chou
P.Y. & Fasman G. D. (1974) Biochemistry 13: 211-22
2; Chou P.Y. & Fasman G.D. (1974) Biochemistry 13:
222-245; Chou P.Y. & Fasman G. D. (1978) Ann. Re
v. Biochem. 47: 251-276]やRobson等によって開発され
た計算式[Robson B.& Suzuki E. (1976) J. Mol. Biol.
107: 327-356; Garnier, J., OsguthorpeD. J. & Robs
on B. (1978) J. Mol. Biol. 120: 97-120] などを利用
し解析を行なう。さらにHoppとWoods [Hopp T. P. & Wo
ods K.R. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 382
4-3828] やKyteとDoolittle [Kyte J. & Doolittle R.
F. (1982) J. Mol. Biol. 157: 105-132]等によって開
発された計算式に従い、蛋白質の疎水−親水プロットを
行ないエピトープペプチドが示す性質に関する情報を得
ておくことが好ましい。さらにJameson とWolf[Jameson
B.A. & Wolf H.(1988)Comput. Applic. in Bioscience
s 4: 181-186]によって提唱されている計算式に従い,
目的とするペプチドの抗原性に関する予測した性質も知
っておくことは好ましいことである。さらにJanin 等や
Emini 等によって提唱されている表面部位の予測法[Jan
in J., Wodak S., Levitt M. & Maigret B. (1978) J.
Mol. Biol.125: 357-386; Emini E., Hughes J.V., Per
low D.S., & Boger J. (1965) J.Biol. 55:836-839] 、
Karplus 等によって提唱されている蛋白質の可塑性予測
法[Karplus P.A. & Schulz G.E. (1985) Naturwiss. 7
2: 212-213]で得られる情報も抗原性を予想する際に役
立つ。
【0032】ここで上記の各種解析を行なう際に重要な
ことは、エピトープ解析を行なった条件でのエピトープ
ペプチドの情報を得ておくことである。例えば実施例に
示したものでは、C14 抗原という約100 アミノ酸からな
る配列と抗体とを反応させる際に、短鎖ペプチドを加え
ることによる結合阻害によりエピトープ解析を行なった
が、この場合にはエピトープは長い配列の中で機能して
いるものであるから、上記の解析はこの長い配列を元に
行なう。
【0033】エピトープキメラ抗原に於ては、これらの
予測法によって得られるエピトープペプチドの予測構造
が変化しないように、キメラ抗原ペプチドを設計する必
要がある。
【0034】さらにエピトープキメラ抗原に於ては、エ
ピトープペプチドのつなぎ目が新たなエピトープを提供
しないように設計されねばならない。この予測は以下の
方法によって成し得る。
【0035】一つはつなぎ目によって生じるペプチド配
列を用いて遺伝子情報、蛋白構造情報バンクを検索し、
一致する配列が無いことを確認する。もしくは一致する
配列があったとしても抗原性が無いことが確認できれば
良い。
【0036】本発明においては、つなぎ目のペプチド配
列が抗原性をもたないか又は抗原性が低いと予測される
配列を持つようにアミノ酸を付加、もしくは欠失させる
ことにより設計する。付加すべきアミノ酸としては、例
えばイソロイシン、ロイシン、バリン等の疎水的な性質
を持つアミノ酸が好ましく、疎水性アミノ酸を付加する
ことによってペプチド性つなぎ目の疎水性が増しエピト
ープとして機能する可能性を低くすることができる。す
なわちエピトープキメラペプチドにおいてエピトープと
して機能させるには、分子表面にエピトープが露出して
いることが肝要であり、疎水的な性質を付加することに
より、分子表面に露出させる可能性を低くすることがで
きる。
【0037】すなわち、本発明のエピトープキメラ抗原
ペプチドにおいては、ペプチド性つなぎ目は抗原性をも
たないか又は低抗原性であることを特徴とする。
【0038】上記の方法に従い最適な感染HCVグルー
プ判別抗原として配列番号1に示す配列からなるペプチ
ドGR1EPV5 、配列番号2に示す配列からなるペプチドGR
1EPV4 を設計した。
【0039】エピトープキメラ抗原の作製 本発明のエピトープキメラ抗原は、化学合成法により、
又は遺伝子工学的手法を用いて作製することができる。
【0040】化学合成法の場合、該方法は、HCVゲノ
ムRNA又はそのcDNAによってコードされるグルー
プI又はグループII HCV関連抗原上の異なる2つ以
上のエピトープの各々を従来のペプチド合成法を用いて
合成する段階、ペプチド性つなぎ目を別個に合成する段
階、エピトープとエピトープの間をペプチド性つなぎ目
を介して結合する段階を包含する。ペプチド合成法は周
知の技術であり、例えば日本生化学会編、生化学実験講
座1「タンパク質の化学IV−化学修飾とペプチド合成」
(1981年)東京化学同人に記載される種々の手法が使用
され得る。長鎖ペプチドの場合には、通常、固相法が用
いられる。またアミノ酸の保護及び脱保護の技術もペプ
チド合成において一般的に使用される。
【0041】遺伝子工学的手法の場合、該方法は、エピ
トープキメラ抗原ペプチドをコードするDNA断片を作
製する段階、該DNA断片をベクターに組み込んで複製
可能な発現ベクターを構築する段階、該発現ベクターを
宿主細胞に導入し、ペプチドを発現する形質転換体を得
る段階、さらに該形質転換体を培養し発現産物を発現さ
せて発現したペプチドを回収する段階を含む。この製造
方法も本発明の一部である。
【0042】例えば配列番号1及び2に示すアミノ酸配
列を有するキメラペプチドをコードするDNA断片は実
施例3に示すように作製することが可能である。さらに
実施例4に示すように形質転換体を取得し、形質転換体
を培養し、該ペプチドを分離、回収することが可能であ
る。
【0043】遺伝子工学的な手法に於て発現に用いる発
現ベクターとしては、実施例に示した大腸菌を宿主と
し、大腸菌トリプトファンオペロンの制御化に発現させ
るベクター以外にも、大腸菌を宿主としては、大腸菌ト
リプトファンオペロン以外にもTacプロモーター、T
rcプロモーター、lacプロモーター、PhoAプロ
モーター、λプロモーター等を利用したベクターを用い
ることが可能である。また大腸菌以外にも酵母を宿主と
し、解糖系遺伝子、たとえばグリセロアルデヒド−3−
燐酸デヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ
I、II、ピルビン酸キナーゼ、ホスホグリセリンキナー
ゼ、トリオースイソメラーゼ等の酵母で慣用に用いられ
ているプロモーターを利用した発現ベクターを用いて発
現させることも可能である。さらに昆虫細胞を宿主とし
バキュロウイルスをベクターとした発現系、哺乳類細胞
例えばCHO細胞や、COS細胞 HeLa細胞等を宿
主とし、慣用的に用いられる組み込み型発現ベクターや
ワクチニアウイルスをベクターとした発現系、アデノウ
イルスや慣用的に用いられるウイルスをベクターとした
発現系を利用しても発現可能である。
【0044】さらに遺伝子工学的手法を用いる場合に
は、キメラ抗原ペプチドを他のペプチドとの融合蛋白質
として発現させることも慣用的に用いられる手段であ
る。
【0045】上記の方法に基づくならば、グループI又
はグループ II と同様に、グループIII (Okamoto et a
l, J. Gen. Virol. 72:2697-2704(1991))に属するHC
Vゲノムから、グループIII を特異的に区別するエピト
ープ領域を取り出してエピトープキメラ抗原ペプチドを
作製することが可能であり、これを用いることによりグ
ループIII に感染している患者血清のグループ判別を行
なうことができる。
【0046】遺伝子工学的に発現させ回収したグルーピ
ングに好適なキメラ抗原ペプチドを用いてHCV感染患
者の血清中のグループI特異的な抗体を検出すると、実
施例5に示すごとく、それ以前に用いていた抗原のみで
は検出不可能であった患者血清のグループ判定を行なう
ことが可能となった。
【0047】したがって、本発明はさらに、エピトープ
キメラ抗原ペプチドと、HCVに感染したと推定される
試料中のグループI又はグループII特異的な抗体との免
疫学的反応を行なった後、生成する抗原−抗体複合体の
濃度又は存在を測定することを含む、HCVグループ判
定方法を提供する。
【0048】本発明はまた、エピトープキメラ抗原ペプ
チドと、HCVに感染したと推定される試料中のHCV
関連抗体との免疫学的反応を行なった後、生成する抗原
−抗体複合体の濃度又は存在を測定することを含む、H
CV感染判定方法を提供する。
【0049】抗原−抗体複合体の濃度又は存在は、エン
ザイムイムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、イムノ
ドットブロッティング等の公知の一般的方法を用いて測
定することができる。上記判定の精度は、それぞれのグ
ループ抗原に対する抗体価を測定することによりさらに
向上する。また田中ら(T.Tanaka ら,Hepatology 19:13
47〜1353,1994) により提唱されている判別方法を用い
ることもできる。
【0050】以下実施例により本発明を詳細に説明する
が、本発明は実施例に限定されるものではない。
【0051】
【実施例】
実施例1 コア領域ペプチドを用いたグループ判別 配列番号9及び10の配列を持つペプチドをアプライド
バイオシステム社のペプチド合成機(Model:43
0A)を用いて合成し、逆相クロマトグラフィーにより
目的のペプチドを精製した。精製したペプチドが目的の
配列であることはアミノ酸シークエンサーの分析により
確認した。
【0052】このペプチドを2.5 μg/mlの濃度となるよ
うに8M尿素を含む0.1Mの燐酸緩衝液(pH7.5 )に希釈し
た。希釈した抗原をヌンク社のマルチモジュールプレー
トにウェルあたり 100μlのせ、室温に2 時間静置し
た。抗原希釈液を除いた後、ウェルあたり 100μlのブ
ロッキング液[0.5 %カゼイン、0.15M NaCl、2.5mM ED
TA、0.1M燐酸緩衝液(pH7.0 )]を加え室温に2 時間静
置し抗原をプレートに固定した。
【0053】各ウェルに検体希釈液[0.5 %カゼイン、
0.5M NaCl 、2.5mM EDTA、0.1M燐酸緩衝液(pH7.0 )]
によって11倍に希釈した非A非B型慢性肝炎患者血清 1
00μlを加え45分静置した。ウェルを0.1% Tween20を
含むPBS で洗浄した後、 100μlのホースラディッシュ
パーオキシダーゼによって標識された抗ヒトIgG 抗体を
加え、45分静置した。ウェルを0.1% Tween20を含むPBS
で洗浄した後、常法に従い、発色法により酵素活性を計
測した。その結果を表2にまとめて示す。また比較のた
め、C14−1−2及びC14−2−2抗原を用いてグ
ループ判別した結果と、PCR法によりグループ判別し
た結果を表中に示した。
【0054】
【表2】 表から明らかなように、ほとんどの検体に於てはC14
−1−2及びC14−2−2抗原を用いることによりグ
ループ判別が可能であったが、検体番号16のように配
列番号9のペプチドを用いることにより始めて血清学的
にグループ判別が可能になるものが存在することが判明
した。
【0055】実施例2 C14−1−2抗原のエピトー
プ解析 精製したC14−1−2ペプチドを2.5 μg/mlの濃度と
なるように8M尿素を含む0.1Mの燐酸緩衝液(pH7.
5 )に希釈した。希釈した抗原をヌンク社のマルチモジ
ュールプレートにウェルあたり 200μlのせ、室温に2
時間静置した。抗原希釈液を除いた後、ウェルあたり 2
00μlのブロッキング液[0.5 %カゼイン、0.15M NaC
l、2.5mM EDTA、0.1M燐酸緩衝液(pH7.0 )]を加え室
温に2 時間静置した。このように抗原をプレートに固定
した。検体20μl と化学合成したペプチド(0.1 mg
/ml)20μl を等量混和し、室温1時間静置した。
これに検体希釈液を 200μl 加えた後にペプチドを固定
したプレートに加えた。30℃1時間反応させた後、洗
浄を行ない、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトIgG (マウス
モノクローナル抗体)を加え30℃1時間反応させた。
洗浄した後、o−フェニレンジアミン溶液を加え、30
℃1時間反応させた後1M硫酸溶液を加えることにより
反応を停止させ、比色計で 492nmの発色を測定した。
【0056】結果を表3に示す。表3に示した検体は全
てHCVグループIに属すことはtrpE・C14−1
−2(特願平5−194185号)との反応性より明ら
かであり、グループIの配列を持つペプチドを加えるこ
とによりtrpE・C14−1−2との反応が阻害され
ていることが明らかである。これらの結果からC14−
1−2抗原に於て患者血清中の抗体は阻害のかかったペ
プチドにエピトープが存在していることが明らかになっ
た。
【0057】
【表3】 実施例3 エピトープキメラ抗原ペプチドをコードする
遺伝子の作製 [HCVグループ判定に適したエピトープキメラ抗原遺
伝子の構築] 以下のDNAをDNA合成機(ABI:Model39
4A,Millipore:Model8700)を用
いて合成した。
【0058】EP1:GCGAATTCGCCTCAC
ACCTCCCTTACATC; EP2R:GGGTACCTACCACGGGAGCA
GCAGCTC; CORE−F:AGGTACCCCTAAAGCTCG
TCGTCCGGAAGGTCGTGCT; CORE−R:TCCCHHHTTGAGCCCAAG
CACGACCTTCCGGACG; V4XYZ:AGACCCGGGTACCACGGGA
GCAGCAGC; EP5:ACCCGGGAGTGTGGTCATTGT
GGGTAGG;および EP6:GAGGATCCTTATCAATCGAAC
TCCCGGTAGAGGACTTC。
【0059】EP1とEP2R及びV4XYZはグルー
プIのHCV cDNAからペプチドX、Y、Z領域を
コードする配列を取り出すためのプライマーである。E
P5とEP6はグループIのHCV cDNAからペプ
チドV、Wa領域をコードする配列を取り出すためのプ
ライマーである。
【0060】これらのプライマーを用いてPCR法によ
り配列を取り出した。反応は1ngのHCV cDNA
(C6−79)(本出願人らによる特願平5−1931
04号)、100 pmolプライマー(EP1とEP2R
またはEP1とV4XYZまたはEP5とEP6)を加
え、10mM Tris−HCl(pH8.3)、2.
5mM MgCl2 、0.01%ゼラチン、0.2mM d
NTP、2.5U Taq DNA Polymera
seとなるよう 100μlの反応液を調製し、ミネラルオ
イルを重層して94℃、30秒、55℃、1分、72
℃、2分の条件で25サイクル反応を行なわせた。また
CORE−FとCORE−Rをそれぞれ2μg加え、1
0mM Tris−HCl(pH8.3)、2.5mM
MgCl2 、0.01%ゼラチン、0.2mM dNT
P、2.5U Taq DNA Polymerase
となるよう 100μlの反応液を調製し、ミネラルオイル
を重層して94℃、30秒、50℃、1分、72℃、2
分の条件で15サイクル反応を行なわせた。反応液の一
部をアガロース電気泳動し、EP1とEP2Rの組み合
わせでは約 140bpの、EP1とV4XYZの組み合わ
せでは約 150bpの、CORE−FとCORE−Rの組
み合せでは約50bpの断片、EP5とEP6の組み合
せでは約 100bpの断片を分離した。分離したDNA断
片をアガロース切片からMermaid Kit(Bi
o101社)を用いメーカーの推奨する方法に従いTE
溶液中に回収した。回収したDNA断片を25ngのp
GEM−Tベクターと共に20μlの反応液[50mM
Tris−HCl(pH7.5),10mM MgC
2 ,1mM ATP,10mM DTT,T4 DN
Aリガ−ゼ]中で16℃、1時間反応させた。反応液の
一部を用い大腸菌XL1−Blue(Stratage
n社)をHanahanの方法[ DNA cloning: A pract
ical approach (ed. D. M. Glover), vol. 1, p109-, I
RC press, (1885)]に従って形質転換した。アンピシリ
ン耐性のコロニーを選択し、形質転換体のDNA をミニプ
レパレーション法により調製し、制限酵素で切断するこ
とにより両断片が環状化しているプラスミドを持つ形質
転換体を選択した。
【0061】EP1とEP2Rとを用いて生じた断片の
クローニングされているプラスミドDNAをKpnIと
EcoRIで切断し、電気泳動を行なうことにより約1
40bpの断片を分離し、Mermaid Kit(B
io101社)を用いメーカーの推奨する方法に従いT
E溶液中に回収した。またCORE−FとCORE−R
の組み合わせで生じた断片のクローニングされているプ
ラスミドDNAをKpnIとSmaIで切断し、電気泳
動を行なうことにより約60bpの断片を分離し、Me
rmaid Kit(Bio101社)を用いメーカー
の推奨する方法に従いTE溶液中に回収した。回収した
断片とEcoRIとSmaIで切断したpT7T319
U(ファルマシア社)とT4 DNAリガーゼを用いて
連結反応させ、反応液の一部を用い、大腸菌SURE
(Stratagen社)を形質転換した。アンピシリ
ン耐性のコロニーを選択し、形質転換体のDNAをミニ
プレパレーション法により調製し、制限酵素で切断する
ことにより両断片が結合環状化しているプラスミドを持
つ形質転換体を選択した。得られたプラスミドをSma
IとBamHIで切断し、EP5とEP6で生じた断片
のクローニングされているプラスミドDNAをBamH
IとSmaIで切断し、電気泳動を行なうことにより 1
00bpの断片を分離し、Mermaid Kit(Bi
o101社)を用い回収した断片と、T4 DNAリガ
ーゼを用いて連結反応させた。反応液の一部を用い、大
腸菌XL1−Blue(Stratagen社)を形質
転換した。アンピシリン耐性のコロニーを選択し、形質
転換体のDNA をミニプレパレーション法により調製し、
制限酵素で切断することにより両断片が結合環状化して
いるプラスミドを持つ形質転換体を選択した。このよう
にしてGR1EPV5遺伝子断片を持つプラスミドを構
築した。
【0062】構築したプラスミド1 μg をEcoRI 、BamH
I で切断した(50mM Tris-HCl [pH7.5], 7mM MgCl2 ,
100mM NaCl, 10 units EcoRI, 10 units BamHI/反応液
量10μl で37℃1時間反応)後、この反応液をアガロー
ス電気泳動にかけ約 250bpの断片を分離した。分離した
断片をMermaid Kit(Bio101社)を用
い回収した。一方pTrpTrpE 1μg をEcoRI 、Ba
mHI で切断した(50mMTris-HCl [pH7.5], 7mM MgCl2 ,
100mM NaCl, 10 units EcoRI, 10 units BamHI/反応
液量10μl で37℃1時間反応)後、この反応液をアガロ
ースにかけ約3Kbpの断片を分離した。分離した断片をガ
ラスパウダー法により回収した。回収した両断片をT4
DNAリガーゼを用いて連結反応させた。反応液の一
部を用い、大腸菌XL1−Blue(Stratage
n社)を形質転換した。アンピシリン耐性のコロニーを
選択し、形質転換体のDNA をミニプレパレーション法に
より調製し、制限酵素で切断することにより両断片が結
合環状化しているプラスミドを持つ形質転換体を選択し
た。このようにしてGR1EPV5遺伝子発現プラスミ
ド、pTrpGR1EPV5を構築した。このプラスミ
ドを大腸菌に移入後、通商産業省工業技術院生命工学工
業技術研究所特許微生物寄託センターに平成6年7月7
日付で寄託し、受託番号FERM P−14422を得
た。
【0063】EP1とV4XYZの組み合わせで生じた
断片の挿入されているプラスミドをEcoRIとSma
Iで切断し生じる約 150bpの断片を、電気泳動により
分離し、Mermaid Kit(Bio101社)を
用いメーカーの推奨する方法に従いTE溶液中に回収し
た。回収した断片とEcoRIとSmaIで切断したp
TrpGR1EPV5とT4 DNAリガーゼを用いて
連結反応させ、反応液の一部を用い、大腸菌XL1−B
lue(Stratagen社)を形質転換した。その
結果GR1EPV4遺伝子発現プラスミド、pTrpG
R1EPV4を構築した。このプラスミドを大腸菌に移
入後、同センターに平成6年7月7日付で寄託し、受託
番号FERM P−14421を得た。
【0064】実施例4 エピトープキメラ抗原の発現と
精製 pTrpGR1EPV4またはpTrpGR1EPV5
で形質転換された大腸菌を 100μg/mlアンピシリンを含
むLB培地で37℃一夜培養した。これを1%濃度で 1
00μg/mlアンピシリンを含むM9−CAに接種し37℃
一夜培養した。培養終了後遠心により菌体を集め、50ml
のLysis 液[50mM Tris-HCl (pH8.5),30mM NaCl, 5mM
EDTA ]に再懸濁し、1ml のリゾチーム液(10mg/ml Lys
ozyme)を加え、37℃において1時間処理した。この懸
濁液を超音波処理(150W、90秒で2回)にかけることに
より細胞を破壊した。15000rpmで、4℃において30分間
遠心し不溶性分画を回収した。不溶性分画を50mlのNP
40を1%含むA溶液[50mM Tris-HCl (pH8.5) ]に再
懸濁しホモジナイズ(1500rpm で5ストローク)した。
懸濁液を15000rpmで、4℃において30分間遠心し不溶性
分画を回収した。不溶性分画を50mlの2M尿素を含むA溶
液に再懸濁しホモジナイズ(1500rpm で5ストローク)
した。懸濁液を15000rpmで、4℃において30分間遠心し
不溶性分画を回収した。不溶性分画を50mlの6M 尿素を
含むA溶液に再懸濁しホモジナイズ(1500rpm で5スト
ローク)した。懸濁液を15000rpmで、4℃において30分
間遠心し可溶性分画を回収した。
【0065】6M尿素を含む溶液で可溶化した抗原溶液
から、SセファーロースHPカラム(ファルマシア社)
を用いたイオン交換法とSuperdex75pg(フ
ァルマシア社)を用いたゲル濾過法によりエピトープキ
メラ抗原ペプチドGR1EPV4(配列番号2のアミノ
酸配列を含む)及びGR1EPV5(配列番号1のアミ
ノ酸配列を含む)を精製した。
【0066】実施例5 エピトープキメラ抗原ペプチド
と患者血清との反応 エピトープキメラ抗原ペプチドを2.5 μg/mlの濃度とな
るように8M尿素を含む0.1Mの燐酸緩衝液(pH7.5 )に希
釈した。希釈した抗原をヌンク社のマルチモジュールプ
レートにウェルあたり 100μlのせ、室温で2 時間静置
した。抗原希釈液を除いた後、ウェルあたり 100μlの
ブロッキング液[0.5 %カゼイン、0.15M NaCl、2.5mM
EDTA、0.1M燐酸緩衝液(pH7.0 )]を加え室温で2 時間
静置し抗原をプレートに固定した。
【0067】各ウェルに検体希釈液[0.5 %カゼイン、
0.5M NaCl 、2.5mM EDTA、0.1M燐酸緩衝液(pH7.0 )]
によって11倍に希釈した非A非B型慢性肝炎患者血清 1
00μlを加え45分静置した。ウェルを0.1% Tween20を
含むPBS で洗浄した後、 100μlのホースラディッシュ
パーオキシダーゼによって標識された抗ヒトIgG 抗体を
加え、45分静置した。ウェルを0.1% Tween20を含むPBS
で洗浄した後、常法に従い、発色法により酵素活性を計
測した。その結果を表4にまとめて示す。また比較のた
め、C14−1−2及びC14−2−2抗原を用いてグ
ループ判別した結果と、PCR法によりグループ判別し
た結果を表中に示した。
【0068】
【表4】 C14−1−2と同じエピトープを持つGR1EPV4
抗原ペプチドは、ほとんどC14−1−2と同じ反応性
を示した。しかしながらグループII HCV感染患者血
清でC14−1−2に比較的強い反応を示した血清2
2、25について反応が弱くなっており、余分なエピト
ープを除くことにより判別が容易になっていることは明
らかである。
【0069】コア領域のグループ判別エピトープを含む
GR1EPV5抗原では、GR1EPV4同様血清2
2、25での判別が容易になっているのに加え、さらに
血清番号7、16において反応性が向上しており、この
抗原を用いることにより、感染しているHCVのグルー
プ判別が容易になったことは明らかである。
【0070】
【発明の効果】従来グループ判別が困難であった血清等
の検体であっても、本発明のエピトープキメラ抗原によ
ってその判別が可能となり、HCVのグルーピング判別
だけでなくHCV感染判定にも精度良く使用することが
できる。本発明に従えば、抗原抗体反応を利用した方法
に於て常に問題となる抗原抗体間の非特異反応の軽減、
抗原抗体間の特異反応の反応性向上を図ることができ、
抗原抗体反応を利用した免疫学的診断方法に適用するた
めのペプチド抗原の機能向上を達成できる。
【0071】
【配列表】
配列番号:1 配列の長さ:321 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類: ハイポセティカル: YES アンチセンス: NO 配列 ATCGAT ATG AAA GCT ATC TTC GTT CTG AAA GGT TCT CTG GAC CGT GAC 48 Met Lys Ala Ile Phe Val Leu Lys Gly Ser Leu Asp Arg Asp 1 5 10 CCA GAA TTC GCC TCA CAC CTC CCT TAC ATC GAA CAG GGA ATG CAG CTT 96 Pro Glu Phe Ala Ser His Leu Pro Tyr Ile Glu Gln Gly Met Gln Leu 15 20 25 30 GCC GAG CAA TTC AAG CAG AAG GCG CTC GGA TTG CTG CAA ACA GCC ACC 144 Ala Glu Gln Phe Lys Gln Lys Ala Leu Gly Leu Leu Gln Thr Ala Thr 35 40 45 AAG CAC GCG GAG GCT GCT GCT CCC GTG GTA GGT ACC CCT AAA GCT CGT 192 Lys His Ala Glu Ala Ala Ala Pro Val Val Gly Thr Pro Lys Ala Arg 50 55 60 CGT CCG GAA GGT CGT GCT TGG GCT CAA CCC GGG AGT GTG GTC ATT GTG 240 Arg Pro Glu Gly Arg Ala Trp Ala Gln Pro Gly Ser Val Val Ile Val 65 70 75 GGT AGG ATC ATC TTG TCC GGG AGG CCG GCT GTT ATT CCC GAC AGG GAA 288 Gly Arg Ile Ile Leu Ser Gly Arg Pro Ala Val Ile Pro Asp Arg Glu 80 85 90 GTC CTC TAC CGG GAG TTC GAT TGATAAGGAT CC 321 Val Leu Tyr Arg Glu Phe Asp 95 100 配列番号:2 配列の長さ:279 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類: ハイポセティカル: YES アンチセンス: NO 配列 ATCGAT ATG AAA GCT ATC TTC GTT CTG AAA GGT TCT CTG GAC CGT GAC 48 Met Lys Ala Ile Phe Val Leu Lys Gly Ser Leu Asp Arg Asp 1 5 10 CCA GAA TTC GCC TCA CAC CTC CCT TAC ATC GAA CAG GGA ATG CAG CTT 96 Pro Glu Phe Ala Ser His Leu Pro Tyr Ile Glu Gln Gly Met Gln Leu 15 20 25 30 GCC GAG CAA TTC AAG CAG AAG GCG CTC GGA TTG CTG CAA ACA GCC ACC 144 Ala Glu Gln Phe Lys Gln Lys Ala Leu Gly Leu Leu Gln Thr Ala Thr 35 40 45 AAG CAC GCG GAG GCT GCT GCT CCC GTG GTA GGT CGT GGG AGT GTG GTC 192 Lys His Ala Glu Ala Ala Ala Pro Val Val Gly Arg Gly Ser Val Val 50 55 60 ATT GTG GGT AGG ATC ATC TTG TCC GGG AGG CCG GCT GTT ATT CCC GAC 240 Ile Val Gly Arg Ile Ile Leu Ser Gly Arg Pro Ala Val Ile Pro Asp 65 70 75 AGG GAA GTC CTC TAC CGG GAG TTC GAT TGATAAGGAT CC 279 Arg Glu Val Leu Tyr Arg Glu Phe Asp 80 85 配列番号:3 配列の長さ: 15 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド 配列 Ala Val Ile Pro Asp Arg Glu Ala Leu Tyr Gln Glu Phe Asp Glu 1 5 10 15 配列番号:4 配列の長さ: 27 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド 配列 Glu Cys Ala Ser His Leu Pro Tyr Ile Glu Gln Gly Met Gln Leu Ala 1 5 10 15 Glu Gln Phe Lys Gln Arg Ala Leu Gly Leu Leu 20 25 配列番号:5 配列の長さ: 22 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド 配列 Glu Gln Phe Lys Gln Arg Ala Leu Gly Leu Leu Gln Thr Ala Thr Lys 1 5 10 15 Gln Ala Glu Ala Ala Ala 20 配列番号:6 配列の長さ: 16 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド 配列 Val Val Val Thr Pro Asp Lys Glu Ile Leu Tyr Glu Ala Phe Asp Glu 1 5 10 15 配列番号:7 配列の長さ: 27 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド 配列 Glu Cys Ala Ser Lys Ala Ala Leu Ile Glu Glu Gly Gln Arg Met Ala 1 5 10 15 Glu Met Leu Lys Ser Lys Ile Gln Gly Leu Leu 20 25 配列番号:8 配列の長さ: 22 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド 配列 Glu Met Leu Lys Ser Lys Ile Gln Gly Leu Leu Gln Gln Ala Ser Lys 1 5 10 15 Gln Ala Gln Asp Ile Lys 20 配列番号:9 配列の長さ: 20 配列の型:アミノ酸 配列の種類:ペプチド ハイポセティカル: NO 配列 Phe Arg Gln Pro Ile Pro Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Thr Trp 1 5 10 15 Ala Gln Pro Gly 20 配列番号:10 配列の長さ: 20 配列の型:アミノ酸 配列の種類:ペプチド ハイポセティカル: NO 配列 Arg Arg Gln Pro Ile Pro Lys Asp Arg Arg Ser Thr Gly Lys Ser Trp 1 5 10 15 Gly Lys Pro Gly 20
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12N 15/09 ZNA C12P 21/02 C 9282−4B G01N 33/53 D 33/569 L 33/576 Z //(C12N 1/21 C12R 1:19) (C12P 21/02 C12R 1:19) (72)発明者 千葉 幸江 埼玉県入間郡大井町西鶴ケ岡一丁目3番1 号 東燃株式会社総合研究所内 (72)発明者 長谷川 明 埼玉県入間郡大井町西鶴ケ岡一丁目3番1 号 東燃株式会社総合研究所内

Claims (12)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 C型肝炎ウイルス(HCV)ゲノムRN
    A又はそのcDNAによってコードされるグループI
    HCV関連抗原上の異なる2つ以上のエピトープをペプ
    チド性つなぎ目を介して接合して成る、グループI H
    CV感染を特異的に判別するためのエピトープキメラ抗
    原ペプチド。
  2. 【請求項2】 前記ペプチド性つなぎ目が抗原性をもた
    ないか又は低抗原性であることを特徴とする請求項1記
    載のエピトープキメラ抗原ペプチド。
  3. 【請求項3】 前記エピトープが、HCVのNS4領域
    又はコア領域上に存在することを特徴とする請求項1又
    は2に記載のエピトープキメラ抗原ペプチド。
  4. 【請求項4】 前記エピトープが、配列番号3、4、5
    及び9に示されるアミノ酸配列をもつペプチドから選択
    されることを特徴とする請求項3記載のエピトープキメ
    ラ抗原ペプチド。
  5. 【請求項5】 配列番号1又は2によって示されるアミ
    ノ酸配列を有することを特徴とする請求項1記載のエピ
    トープキメラ抗原ペプチド。
  6. 【請求項6】 C型肝炎ウイルス(HCV)ゲノムRN
    A又はそのcDNAによってコードされるグループII
    HCV関連抗原上の異なる2つ以上のエピトープをペプ
    チド性つなぎ目を介して接合して成る、グループII H
    CV感染を判別するためのエピトープキメラ抗原ペプチ
    ド。
  7. 【請求項7】 前記ペプチド性つなぎ目が抗原性をもた
    ないか又は低抗原性であることを特徴とする請求項6記
    載のエピトープキメラ抗原ペプチド。
  8. 【請求項8】 前記エピトープがHCVのNS4領域又
    はコア領域上に存在することを特徴とする請求項6又は
    7に記載のエピトープキメラ抗原ペプチド。
  9. 【請求項9】 前記エピトープが、配列番号6、7、8
    及び10に示されるアミノ酸配列をもつペプチドから選
    択される、ことを特徴とする請求項8記載のエピトープ
    キメラ抗原ペプチド。
  10. 【請求項10】 請求項1〜9のいずれか一項に記載の
    エピトープキメラ抗原ペプチドの製造方法であって、該
    エピトープキメラ抗原ペプチドをコードするDNA断片
    を作製する段階、該DNA断片をベクターに組み込んで
    複製可能な発現ベクターを構築する段階、該発現ベクタ
    ーで宿主細胞を形質転換する段階、得られた形質転換体
    を培養し、発現したペプチドを回収する段階を含むこと
    を特徴とする前記方法。
  11. 【請求項11】 請求項1〜5のいずれか一項に記載の
    エピトープキメラ抗原ペプチド又は請求項6〜9のいず
    れか一項に記載のエピトープキメラ抗原ペプチドと、C
    型肝炎ウイルス(HCV)に感染したと推定される試料
    中のグループI又はグループII特異的な抗体との免疫学
    的反応を行なった後、生成する抗原−抗体複合体の濃度
    又は存在を測定することを含む、HCVグループ判定方
    法。
  12. 【請求項12】 請求項1〜9のいずれか一項に記載の
    エピトープキメラ抗原ペプチドと、C型肝炎ウイルス
    (HCV)に感染したと推定される試料中のHCV関連
    抗体との免疫学的反応を行なった後、生成する抗原−抗
    体複合体の濃度又は存在を測定することを含む、HCV
    感染判定方法。
JP23207394A 1994-08-31 1994-08-31 C型肝炎ウイルス感染又はグループ判定のためのエピトープキメラ抗原ペプチド、その製法、及びそれを使用する感染又はグループ判定法 Expired - Lifetime JP3665371B2 (ja)

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