JPH0873497A - Ｃ型肝炎ウイルス感染又はグループ判定のためのエピトープキメラ抗原ペプチド、その製法、及びそれを使用する感染又はグループ判定法 - Google Patents
Ｃ型肝炎ウイルス感染又はグループ判定のためのエピトープキメラ抗原ペプチド、その製法、及びそれを使用する感染又はグループ判定法Info
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- JPH0873497A JPH0873497A JP6232073A JP23207394A JPH0873497A JP H0873497 A JPH0873497 A JP H0873497A JP 6232073 A JP6232073 A JP 6232073A JP 23207394 A JP23207394 A JP 23207394A JP H0873497 A JPH0873497 A JP H0873497A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ゲノムＲＮＡ又
はそのｃＤＮＡによってコードされるグループＩ又はII
ＨＣＶ関連抗原上の異なる２つ以上のエピトープをペ
プチド性つなぎ目を介して接合して成る、それぞれグル
ープＩ又はIIＨＣＶ感染を特異的に判別するためのエピ
トープキメラ抗原ペプチド、その製法、及びそれを用い
るＨＣＶグループ判定又はＨＣＶ判定方法。 【効果】 従来グループ判別が困難であった血清等の検
体であっても、本発明のエピトープキメラ抗原によって
その判別が可能となり、ＨＣＶのグルーピング判別、Ｈ
ＣＶ感染判定に精度良く使用することができる。
はそのｃＤＮＡによってコードされるグループＩ又はII
ＨＣＶ関連抗原上の異なる２つ以上のエピトープをペ
プチド性つなぎ目を介して接合して成る、それぞれグル
ープＩ又はIIＨＣＶ感染を特異的に判別するためのエピ
トープキメラ抗原ペプチド、その製法、及びそれを用い
るＨＣＶグループ判定又はＨＣＶ判定方法。 【効果】 従来グループ判別が困難であった血清等の検
体であっても、本発明のエピトープキメラ抗原によって
その判別が可能となり、ＨＣＶのグルーピング判別、Ｈ
ＣＶ感染判定に精度良く使用することができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス感染
判定又はグループ判定に使用するためのエピトープキメ
ラ抗原ペプチド、その製法、及びそれを使用する感染又
はグループ判定法に係る。
判定又はグループ判定に使用するためのエピトープキメ
ラ抗原ペプチド、その製法、及びそれを使用する感染又
はグループ判定法に係る。
【０００２】
【従来の技術】非Ａ非Ｂ型肝炎は伝染性の肝炎でありウ
イルスを媒体として伝播すると考えられている。非Ａ非
Ｂ型肝炎の伝播経路はいまだ明らかになっていない部分
が多いが、輸血、血液製剤により引き起こされる非Ａ非
Ｂ型肝炎は、Ｂ型肝炎のスクリーニング体制が確立され
た今日、輸血後肝炎として医療上の大きな問題点となっ
ている。
イルスを媒体として伝播すると考えられている。非Ａ非
Ｂ型肝炎の伝播経路はいまだ明らかになっていない部分
が多いが、輸血、血液製剤により引き起こされる非Ａ非
Ｂ型肝炎は、Ｂ型肝炎のスクリーニング体制が確立され
た今日、輸血後肝炎として医療上の大きな問題点となっ
ている。
【０００３】１９８９年非Ａ非Ｂ型肝炎に関連したウイ
ルス遺伝子の一部がクローニングされ、Ｃ型肝炎ウイル
ス（ＨＣＶ）と命名された。ほぼ同時期に本出願人を含
む多くの研究グループによりＨＣＶ遺伝子が数多く単離
され、その構造上の特徴が明らかとなった（Science 24
4: 359-362(1989)及びScience 244: 362-344(1989)）。
ルス遺伝子の一部がクローニングされ、Ｃ型肝炎ウイル
ス（ＨＣＶ）と命名された。ほぼ同時期に本出願人を含
む多くの研究グループによりＨＣＶ遺伝子が数多く単離
され、その構造上の特徴が明らかとなった（Science 24
4: 359-362(1989)及びScience 244: 362-344(1989)）。
【０００４】推定されるＨＣＶ遺伝子は約９４００塩基
からなる＋鎖のＲＮＡをゲノムとして持ち、約３０００
アミノ酸からなる一つながりのポリペプチドをコードし
ていると考えられている。予想されるアミノ酸配列はフ
ラビウイルスあるいはペスチウイルスと相同性を持ち、
これらのウイルスに近縁のウイルスであろうと考えられ
ている。これらのウイルス構造との比較から、ＨＣＶゲ
ノムによってコードされるポリペプチドは、１本のポリ
ペプチドとして細胞内において合成された後に、アミノ
末端から構造蛋白質であるコア、エンベロープ（Ｅ
１）、ＮＳ１またはＥ２（ＮＳ１／Ｅ２）と、非構造蛋
白質であるＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５に切断さ
れ、それぞれの機能を果たすと考えられている。
からなる＋鎖のＲＮＡをゲノムとして持ち、約３０００
アミノ酸からなる一つながりのポリペプチドをコードし
ていると考えられている。予想されるアミノ酸配列はフ
ラビウイルスあるいはペスチウイルスと相同性を持ち、
これらのウイルスに近縁のウイルスであろうと考えられ
ている。これらのウイルス構造との比較から、ＨＣＶゲ
ノムによってコードされるポリペプチドは、１本のポリ
ペプチドとして細胞内において合成された後に、アミノ
末端から構造蛋白質であるコア、エンベロープ（Ｅ
１）、ＮＳ１またはＥ２（ＮＳ１／Ｅ２）と、非構造蛋
白質であるＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５に切断さ
れ、それぞれの機能を果たすと考えられている。
【０００５】これらの非構造蛋白質のうちＮＳ３、ＮＳ
４のアミノ酸配列を比較することによりＨＣＶは少なく
とも２種類のグループ（グループＩ、グループII）に分
類可能であることが明らかとなった[Tsukiyama-Kohara
et al. Virus Genes (1991)5: 243-254] 。ひとつはカ
イロン社により分離されたＨＣＶと核酸、アミノ酸レベ
ルでの相同性の高いグループＩと、核酸、アミノ酸レベ
ルでの相同性の低いグループIIとに分類される（本出願
人による特開平５−８４０８５号公報）。
４のアミノ酸配列を比較することによりＨＣＶは少なく
とも２種類のグループ（グループＩ、グループII）に分
類可能であることが明らかとなった[Tsukiyama-Kohara
et al. Virus Genes (1991)5: 243-254] 。ひとつはカ
イロン社により分離されたＨＣＶと核酸、アミノ酸レベ
ルでの相同性の高いグループＩと、核酸、アミノ酸レベ
ルでの相同性の低いグループIIとに分類される（本出願
人による特開平５−８４０８５号公報）。
【０００６】グループＩ ＨＣＶとグループII ＨＣＶ
との違いについては未だ明らかになっていない部分が多
いが、金井［Kanai et al., Lancet (1992) 339: 1543
］や吉岡［Yoshioka et al., Hepatology (1992) 16:
293-299］等はグループII感染患者の方がグループＩ感
染患者よりもインターフェロン治療が効果的であること
を報告している。このことはグループ判別を効率良く行
なうことにより、インターフェロン治療がより効果的に
行なえるようになることを示唆している。
との違いについては未だ明らかになっていない部分が多
いが、金井［Kanai et al., Lancet (1992) 339: 1543
］や吉岡［Yoshioka et al., Hepatology (1992) 16:
293-299］等はグループII感染患者の方がグループＩ感
染患者よりもインターフェロン治療が効果的であること
を報告している。このことはグループ判別を効率良く行
なうことにより、インターフェロン治療がより効果的に
行なえるようになることを示唆している。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明者等は、詳細な
検討により、ＮＳ４領域のグループＩとII間のアミノ酸
配列が最も異なる領域（1676から1760まで）の配列を持
つペプチドは、グループＩ由来の配列を持つものはグル
ープＩ ＨＣＶに感染した患者血清中の抗体と反応し、
グループII由来の配列を持つものはグループII ＨＣＶ
に感染した患者血清中の抗体と反応すること、さらにこ
れらの配列を持つペプチドを組み合わせ、患者血清との
反応性を調べることにより、患者が何れのグループに属
するＨＣＶに感染しているのかを判別することが可能と
なることを明らかにしてきた（特願平５−１９４１８５
号）。
検討により、ＮＳ４領域のグループＩとII間のアミノ酸
配列が最も異なる領域（1676から1760まで）の配列を持
つペプチドは、グループＩ由来の配列を持つものはグル
ープＩ ＨＣＶに感染した患者血清中の抗体と反応し、
グループII由来の配列を持つものはグループII ＨＣＶ
に感染した患者血清中の抗体と反応すること、さらにこ
れらの配列を持つペプチドを組み合わせ、患者血清との
反応性を調べることにより、患者が何れのグループに属
するＨＣＶに感染しているのかを判別することが可能と
なることを明らかにしてきた（特願平５−１９４１８５
号）。
【０００８】しかしながら、多くの血清を検索するなか
で、グループ判別が困難な患者血清が、低い比率ではあ
るが存在することが今回初めて明らかになった。
で、グループ判別が困難な患者血清が、低い比率ではあ
るが存在することが今回初めて明らかになった。
【０００９】したがって、本発明は、これらの判別困難
であった血清でもグループ判別可能になるエピトープキ
メラ抗原ペプチド及びその製造方法を提供することを目
的とする。
であった血清でもグループ判別可能になるエピトープキ
メラ抗原ペプチド及びその製造方法を提供することを目
的とする。
【００１０】本発明はまた、このようなエピトープキメ
ラ抗原ペプチドをＨＣＶ感染又はグループ判定に使用す
ることを目的とする。
ラ抗原ペプチドをＨＣＶ感染又はグループ判定に使用す
ることを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明は、Ｃ型肝炎ウイ
ルス（ＨＣＶ）ゲノムＲＮＡ又はそのｃＤＮＡによって
コードされるグループＩ ＨＣＶ関連抗原上の異なる２
つ以上のエピトープをペプチド性つなぎ目を介して接合
して成る、グループＩ ＨＣＶ感染を特異的に判別する
ためのエピトープキメラ抗原ペプチドを提供する。
ルス（ＨＣＶ）ゲノムＲＮＡ又はそのｃＤＮＡによって
コードされるグループＩ ＨＣＶ関連抗原上の異なる２
つ以上のエピトープをペプチド性つなぎ目を介して接合
して成る、グループＩ ＨＣＶ感染を特異的に判別する
ためのエピトープキメラ抗原ペプチドを提供する。
【００１２】本発明はまた、ＨＣＶゲノムＲＮＡ又はそ
のｃＤＮＡによってコードされるグループII ＨＣＶ関
連抗原上の異なる２つ以上のエピトープをペプチド性つ
なぎ目を介して接合して成る、グループII ＨＣＶ感染
を特異的に判別するためのエピトープキメラ抗原ペプチ
ドを提供する。
のｃＤＮＡによってコードされるグループII ＨＣＶ関
連抗原上の異なる２つ以上のエピトープをペプチド性つ
なぎ目を介して接合して成る、グループII ＨＣＶ感染
を特異的に判別するためのエピトープキメラ抗原ペプチ
ドを提供する。
【００１３】グループＩ ＨＣＶ及びグループII ＨＣ
Ｖには、遺伝子構造が互いに異なる領域が存在すること
が、本発明者らの研究によって判明してきている（特願
平５−１９４１８５号）。例えば、ＮＳ４領域中アミノ
酸番号1676〜1764のアミノ酸配列は、ＨＣＶのグループ
ＩとグループIIとで大きく相違し、両者の識別を可能に
する。このようにＨＣＶグループＩとIIの識別を可能に
する領域は、ＮＳ４領域以外にも存在し、例えばコア領
域にも存在することが今回判明した。ＨＣＶグループＩ
及びグループIIについては、前述のとおり、カイロン社
により分離されたＨＣＶ株（Ｃ5-1-1 ：国際公開番号Ｗ
Ｏ89／04669 号）との核酸、アミノ酸レベルでの相同性
の比較によって決定され、相同性のより高い（通常80％
以上）ＨＣＶ株をグループＩ、相同性のより低い（通常
80％未満）ＨＣＶ株をグループIIと称している。グルー
プII ＨＣＶ株の中にはカイロン社のグループＩ ＨＣ
Ｖ株との相同性が約50％と極めて低いものも存在する。
したがって、ＨＣＶゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列上
には、ＮＳ４領域及びコア領域以外にもＨＣＶグループ
ＩとグループIIを識別可能にする他の領域も存在するも
のと推定される。
Ｖには、遺伝子構造が互いに異なる領域が存在すること
が、本発明者らの研究によって判明してきている（特願
平５−１９４１８５号）。例えば、ＮＳ４領域中アミノ
酸番号1676〜1764のアミノ酸配列は、ＨＣＶのグループ
ＩとグループIIとで大きく相違し、両者の識別を可能に
する。このようにＨＣＶグループＩとIIの識別を可能に
する領域は、ＮＳ４領域以外にも存在し、例えばコア領
域にも存在することが今回判明した。ＨＣＶグループＩ
及びグループIIについては、前述のとおり、カイロン社
により分離されたＨＣＶ株（Ｃ5-1-1 ：国際公開番号Ｗ
Ｏ89／04669 号）との核酸、アミノ酸レベルでの相同性
の比較によって決定され、相同性のより高い（通常80％
以上）ＨＣＶ株をグループＩ、相同性のより低い（通常
80％未満）ＨＣＶ株をグループIIと称している。グルー
プII ＨＣＶ株の中にはカイロン社のグループＩ ＨＣ
Ｖ株との相同性が約50％と極めて低いものも存在する。
したがって、ＨＣＶゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列上
には、ＮＳ４領域及びコア領域以外にもＨＣＶグループ
ＩとグループIIを識別可能にする他の領域も存在するも
のと推定される。
【００１４】本発明のＨＣＶ関連抗原上のエピトープに
は、ＮＳ４及びコア領域上のエピトープの他に、これら
領域以外のＨＣＶグループＩ及びIIを区別する他の領域
のエピトープも包含される。本発明においては、そのよ
うなエピトープがＨＣＶのＮＳ４領域又はコア領域上に
存在することが好ましい。エピトープの具体例は、下記
の説明から明らかであろう。
は、ＮＳ４及びコア領域上のエピトープの他に、これら
領域以外のＨＣＶグループＩ及びIIを区別する他の領域
のエピトープも包含される。本発明においては、そのよ
うなエピトープがＨＣＶのＮＳ４領域又はコア領域上に
存在することが好ましい。エピトープの具体例は、下記
の説明から明らかであろう。
【００１５】コア領域のペプチドを用いたグループ判別 上述したように、ＨＣＶにはグループＩとIIの異なる種
類が存在しており、グループＩとIIはアミノ酸配列に部
分的な相違を有している。両者の配列をＨＣＶ遺伝子全
体にわたって比較することにより、ＮＳ４以外にもグル
ープ特異的に配列が異なる領域がコア領域のアミノ酸番
号61から80にあたる領域に存在することが今回判明し
た。この領域についてグループＩとIIを比較した結果を
下記に示す。
類が存在しており、グループＩとIIはアミノ酸配列に部
分的な相違を有している。両者の配列をＨＣＶ遺伝子全
体にわたって比較することにより、ＮＳ４以外にもグル
ープ特異的に配列が異なる領域がコア領域のアミノ酸番
号61から80にあたる領域に存在することが今回判明し
た。この領域についてグループＩとIIを比較した結果を
下記に示す。
【００１６】
【表１】 上記の領域に於てグループ内でアミノ酸配列は保存され
ているのに対し、グループ間でアミノ酸配列が異なって
いる。この領域の配列が抗原性を持ち、グループ判別の
抗原として用いることが可能か否かを明らかにするた
め、それぞれのアミノ酸配列を持つペプチドを作製し、
患者血清との反応性を調べた（下記実施例１参照）。
ているのに対し、グループ間でアミノ酸配列が異なって
いる。この領域の配列が抗原性を持ち、グループ判別の
抗原として用いることが可能か否かを明らかにするた
め、それぞれのアミノ酸配列を持つペプチドを作製し、
患者血清との反応性を調べた（下記実施例１参照）。
【００１７】その結果、血清との反応性はＮＳ４領域を
用いた場合の反応性と比較すると反応する血清数が少な
いことから、グループ判別のための主要なエピトープを
提供しているとは考えられないが、ＨＣＶグループ特異
的に反応していることは、ＰＣＲ法及びＮＳ４領域を用
いた判別結果との比較により明らかとなった。さらに詳
細に検討すると、ＮＳ４領域には反応せず、この領域に
のみグループ特異的に反応する患者血清が、グループＩ
の血清に於て少数ながら存在することが明らかになっ
た。
用いた場合の反応性と比較すると反応する血清数が少な
いことから、グループ判別のための主要なエピトープを
提供しているとは考えられないが、ＨＣＶグループ特異
的に反応していることは、ＰＣＲ法及びＮＳ４領域を用
いた判別結果との比較により明らかとなった。さらに詳
細に検討すると、ＮＳ４領域には反応せず、この領域に
のみグループ特異的に反応する患者血清が、グループＩ
の血清に於て少数ながら存在することが明らかになっ
た。
【００１８】コア領域上のグループＩ又はグループII
ＨＣＶ特異的抗原のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号９
又は１０に示す。
ＨＣＶ特異的抗原のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号９
又は１０に示す。
【００１９】上記の結果、コア領域の配列を持つペプチ
ドを用いた判別方法は、ＮＳ４領域を用いたものと比較
すると、その検出率に於て大きく劣るものの、少数の患
者血清に於て検出可能となることから、ＮＳ４領域を用
いた判別方法を相補することが期待出来ることを示唆し
ている。
ドを用いた判別方法は、ＮＳ４領域を用いたものと比較
すると、その検出率に於て大きく劣るものの、少数の患
者血清に於て検出可能となることから、ＮＳ４領域を用
いた判別方法を相補することが期待出来ることを示唆し
ている。
【００２０】ＮＳ４領域ペプチドのエピトープ解析 ＮＳ４領域のうちグループＩ ＨＣＶに於ては、グルー
プＩ ＨＣＶのポリプロテイン1676から1760に相当する
アミノ酸配列を持つC14-1-2 抗原、グループIIＨＣＶに
於ては、グループII ＨＣＶのポリプロテイン1680から
1764に相当するアミノ酸配列を持つC14-2-2 抗原を、抗
原として用いることによりグループ判別が可能である
（本出願人による特願平５−１９４１８５号）。
プＩ ＨＣＶのポリプロテイン1676から1760に相当する
アミノ酸配列を持つC14-1-2 抗原、グループIIＨＣＶに
於ては、グループII ＨＣＶのポリプロテイン1680から
1764に相当するアミノ酸配列を持つC14-2-2 抗原を、抗
原として用いることによりグループ判別が可能である
（本出願人による特願平５−１９４１８５号）。
【００２１】患者血清中に存在する抗体は、これらのグ
ループ特異的抗原へ単独に、もしくは両者に結合する。
グループＩに対応するC14-1-2 抗原に単独に結合した場
合には、患者はグループＩ ＨＣＶに感染しており、グ
ループIIに対応するC14-2-2抗原に単独に結合した場合
には、患者はグループII ＨＣＶに感染していることが
明白に判定可能である。
ループ特異的抗原へ単独に、もしくは両者に結合する。
グループＩに対応するC14-1-2 抗原に単独に結合した場
合には、患者はグループＩ ＨＣＶに感染しており、グ
ループIIに対応するC14-2-2抗原に単独に結合した場合
には、患者はグループII ＨＣＶに感染していることが
明白に判定可能である。
【００２２】一方両者に反応する抗体が検出された場合
でも、その反応性が異なっていることから、判別可能で
ある。すなわちグループＩに感染している場合にはC14-
1-2抗原と強く反応し、これは希釈した血清が各抗原と
反応して生じる、ELISA 反応の基質反応産物の与える吸
光度を比較することにより判定することができる。しか
しながらこのような血清に於ては、血清中に存在するＨ
ＣＶに対する抗体が、グループＩ及びII抗原両者に、反
応の強さは異なるものの非特異的に反応する場合もあ
り、このような反応を出来るだけ抑えることが望まし
い。
でも、その反応性が異なっていることから、判別可能で
ある。すなわちグループＩに感染している場合にはC14-
1-2抗原と強く反応し、これは希釈した血清が各抗原と
反応して生じる、ELISA 反応の基質反応産物の与える吸
光度を比較することにより判定することができる。しか
しながらこのような血清に於ては、血清中に存在するＨ
ＣＶに対する抗体が、グループＩ及びII抗原両者に、反
応の強さは異なるものの非特異的に反応する場合もあ
り、このような反応を出来るだけ抑えることが望まし
い。
【００２３】上記反応を生じせしめる領域を見いだすた
めに、C14-1-2 抗原、C14-2-2 抗原と抗体との反応特異
性を調べた。実施例２に具体的な方法を記載したが、C1
4-1-2 抗原と患者血清中の抗体との反応は、ペプチド１
−Ｗ、１−Ｘ、１−Ｙを反応に加えることにより阻害さ
れ、さらに１−Ｗで阻害が認められたものについては、
１−Ｗの配列を分断化した配列を持つ１−Ｗa を加える
と反応の阻害が認められた。
めに、C14-1-2 抗原、C14-2-2 抗原と抗体との反応特異
性を調べた。実施例２に具体的な方法を記載したが、C1
4-1-2 抗原と患者血清中の抗体との反応は、ペプチド１
−Ｗ、１−Ｘ、１−Ｙを反応に加えることにより阻害さ
れ、さらに１−Ｗで阻害が認められたものについては、
１−Ｗの配列を分断化した配列を持つ１−Ｗa を加える
と反応の阻害が認められた。
【００２４】一方C14-2-2 抗原と患者血清中の抗体との
反応は、ペプチド２−Ｗ、２−Ｘ、２−Ｙを反応に加え
ることにより阻害され、さらに２−Ｗで阻害が認められ
たものについては、２−Ｗの配列を分断化した配列を持
つ２−Ｗa を加えると反応の阻害が認められた。
反応は、ペプチド２−Ｗ、２−Ｘ、２−Ｙを反応に加え
ることにより阻害され、さらに２−Ｗで阻害が認められ
たものについては、２−Ｗの配列を分断化した配列を持
つ２−Ｗa を加えると反応の阻害が認められた。
【００２５】これらの結果からC14-1-2 抗原上の患者血
清の認識配列（エピトープ）は１−Ｗa （配列番号
３）、１−Ｘ（配列番号４）、１−Ｙ（配列番号５）に
あり、C14-2-2 抗原上の患者血清の認識配列（エピトー
プ）は２−Ｗa （配列番号６）、２−Ｘ（配列番号
７）、２−Ｙ（配列番号８）にあることが判明した。
清の認識配列（エピトープ）は１−Ｗa （配列番号
３）、１−Ｘ（配列番号４）、１−Ｙ（配列番号５）に
あり、C14-2-2 抗原上の患者血清の認識配列（エピトー
プ）は２−Ｗa （配列番号６）、２−Ｘ（配列番号
７）、２−Ｙ（配列番号８）にあることが判明した。
【００２６】エピトープキメラ抗原の設計 グループＩ ＨＣＶ感染判別抗原としては、C14-1-2 抗
原が適しており、患者血清中の抗体は１−Ｗa 、１−
Ｘ、１−Ｙペプチドをエピトープとして認識し結合して
いる。一方患者血清のうち少数はC14-1-2 に対する抗体
を持っていないが、コア領域に対する抗体を持ってい
る。グループ判別抗原としてはこれらの抗体の何れとも
反応するものが望ましい。しかしながら、コア領域とＮ
Ｓ４領域はＨＣＶ遺伝子上で大きく離れていることか
ら、ＨＣＶ遺伝子からこれらの配列のみを一つながりの
ものとして取り出すことは困難である。
原が適しており、患者血清中の抗体は１−Ｗa 、１−
Ｘ、１−Ｙペプチドをエピトープとして認識し結合して
いる。一方患者血清のうち少数はC14-1-2 に対する抗体
を持っていないが、コア領域に対する抗体を持ってい
る。グループ判別抗原としてはこれらの抗体の何れとも
反応するものが望ましい。しかしながら、コア領域とＮ
Ｓ４領域はＨＣＶ遺伝子上で大きく離れていることか
ら、ＨＣＶ遺伝子からこれらの配列のみを一つながりの
ものとして取り出すことは困難である。
【００２７】そこで本発明者等は、ＨＣＶのグループ判
別を可能にする領域上に存在する互いに異なる２つ以上
のエピトープを組み合わせた人工的に構築したエピトー
プキメラ抗原、例えばC14-1-2 抗原のグルーピング抗原
として最適な性質と、それを相補するコア抗原の性質と
を兼ね備えたキメラ抗原を構築することにより、ＨＣＶ
グループ判別だけでなくＨＣＶ感染判定の確度を高め得
ることを見出した。
別を可能にする領域上に存在する互いに異なる２つ以上
のエピトープを組み合わせた人工的に構築したエピトー
プキメラ抗原、例えばC14-1-2 抗原のグルーピング抗原
として最適な性質と、それを相補するコア抗原の性質と
を兼ね備えたキメラ抗原を構築することにより、ＨＣＶ
グループ判別だけでなくＨＣＶ感染判定の確度を高め得
ることを見出した。
【００２８】本発明によって可能となったエピトープキ
メラ抗原は、明らかになったエピトープをただ単純に結
合させることによって作製できるものではない。すなわ
ち、単純にエピトープ配列を組み合わせた場合には、エ
ピトープの接合によって生じる配列が、新たなエピトー
プとなり、非特異反応を生じさせる可能性が生じる。ま
たペプチドが短鎖の場合には立体構造が取れないため
に、正常な立体構造が形成された場合にはエピトープと
して機能する配列が、エピトープとして機能しないこと
がある。そのため、ペプチドの鎖長を長くすることによ
り、短鎖ペプチドでは見いだせなかったこのような配列
がエピトープとして機能し、目的とする機能以外の働き
をする可能性がある。
メラ抗原は、明らかになったエピトープをただ単純に結
合させることによって作製できるものではない。すなわ
ち、単純にエピトープ配列を組み合わせた場合には、エ
ピトープの接合によって生じる配列が、新たなエピトー
プとなり、非特異反応を生じさせる可能性が生じる。ま
たペプチドが短鎖の場合には立体構造が取れないため
に、正常な立体構造が形成された場合にはエピトープと
して機能する配列が、エピトープとして機能しないこと
がある。そのため、ペプチドの鎖長を長くすることによ
り、短鎖ペプチドでは見いだせなかったこのような配列
がエピトープとして機能し、目的とする機能以外の働き
をする可能性がある。
【００２９】本発明は、このような問題点を解決する方
法をも示すものである。
法をも示すものである。
【００３０】エピトープキメラ抗原は以下の手順に従う
ことにより効率的に設計することができる。始めにエピ
トープペプチドの性質を調べることが重要である。即ち
エピトープはそれに結合する抗体の結合部位（パラトー
プ）と水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、
疎水結合等により非共有的に結合する。結合が成立する
ためにはエピトープ上のこれらの力が作用する部位と、
パラトープ上の作用する部位とが一定の空間配置を取る
ことが必要である。すなわちエピトープとして機能する
配列からなるペプチドが、エピトープとして機能するた
めには、パラトープに結合できる立体構造を取ることが
必要である。一方ペプチドの高次構造は、ペプチドの長
さが変わるペプチドにアミノ酸が付加されることにより
変化することが予想されることから、エピトープキメラ
抗原において、エピトープペプチドを単に付加した場合
には抗原性を失う可能性が生じる。そのためエピトープ
キメラ抗原を設計する際にはこのような構造変化を生じ
させない工夫をする必要がある。そのため組み合わせる
エピトープペプチドの本来の構造を知る必要がある。
ことにより効率的に設計することができる。始めにエピ
トープペプチドの性質を調べることが重要である。即ち
エピトープはそれに結合する抗体の結合部位（パラトー
プ）と水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、
疎水結合等により非共有的に結合する。結合が成立する
ためにはエピトープ上のこれらの力が作用する部位と、
パラトープ上の作用する部位とが一定の空間配置を取る
ことが必要である。すなわちエピトープとして機能する
配列からなるペプチドが、エピトープとして機能するた
めには、パラトープに結合できる立体構造を取ることが
必要である。一方ペプチドの高次構造は、ペプチドの長
さが変わるペプチドにアミノ酸が付加されることにより
変化することが予想されることから、エピトープキメラ
抗原において、エピトープペプチドを単に付加した場合
には抗原性を失う可能性が生じる。そのためエピトープ
キメラ抗原を設計する際にはこのような構造変化を生じ
させない工夫をする必要がある。そのため組み合わせる
エピトープペプチドの本来の構造を知る必要がある。
【００３１】エピトープペプチドの構造を知るために
は、結晶構造のエックス線回析、核磁気共鳴（NMR ）分
析により構造が分析できているものであれば、それを用
いればよいが、一般にはこのような例は少ないことか
ら、アミノ酸配列からその２次構造予測を行なう方法、
例えばChouとFasman等によって開発された計算式[Chou
P.Y. & Fasman G. D. (1974) Biochemistry 13: 211-22
2; Chou P.Y. & Fasman G.D. (1974) Biochemistry 13:
222-245; Chou P.Y. & Fasman G. D. (1978) Ann. Re
v. Biochem. 47: 251-276]やRobson等によって開発され
た計算式[Robson B.& Suzuki E. (1976) J. Mol. Biol.
107: 327-356; Garnier, J., OsguthorpeD. J. & Robs
on B. (1978) J. Mol. Biol. 120: 97-120] などを利用
し解析を行なう。さらにHoppとWoods [Hopp T. P. & Wo
ods K.R. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 382
4-3828] やKyteとDoolittle [Kyte J. & Doolittle R.
F. (1982) J. Mol. Biol. 157: 105-132]等によって開
発された計算式に従い、蛋白質の疎水−親水プロットを
行ないエピトープペプチドが示す性質に関する情報を得
ておくことが好ましい。さらにJameson とWolf[Jameson
B.A. & Wolf H.(1988)Comput. Applic. in Bioscience
s 4: 181-186]によって提唱されている計算式に従い，
目的とするペプチドの抗原性に関する予測した性質も知
っておくことは好ましいことである。さらにJanin 等や
Emini 等によって提唱されている表面部位の予測法[Jan
in J., Wodak S., Levitt M. & Maigret B. (1978) J.
Mol. Biol.125: 357-386; Emini E., Hughes J.V., Per
low D.S., & Boger J. (1965) J.Biol. 55:836-839] 、
Karplus 等によって提唱されている蛋白質の可塑性予測
法[Karplus P.A. & Schulz G.E. (1985) Naturwiss. 7
2: 212-213]で得られる情報も抗原性を予想する際に役
立つ。
は、結晶構造のエックス線回析、核磁気共鳴（NMR ）分
析により構造が分析できているものであれば、それを用
いればよいが、一般にはこのような例は少ないことか
ら、アミノ酸配列からその２次構造予測を行なう方法、
例えばChouとFasman等によって開発された計算式[Chou
P.Y. & Fasman G. D. (1974) Biochemistry 13: 211-22
2; Chou P.Y. & Fasman G.D. (1974) Biochemistry 13:
222-245; Chou P.Y. & Fasman G. D. (1978) Ann. Re
v. Biochem. 47: 251-276]やRobson等によって開発され
た計算式[Robson B.& Suzuki E. (1976) J. Mol. Biol.
107: 327-356; Garnier, J., OsguthorpeD. J. & Robs
on B. (1978) J. Mol. Biol. 120: 97-120] などを利用
し解析を行なう。さらにHoppとWoods [Hopp T. P. & Wo
ods K.R. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 382
4-3828] やKyteとDoolittle [Kyte J. & Doolittle R.
F. (1982) J. Mol. Biol. 157: 105-132]等によって開
発された計算式に従い、蛋白質の疎水−親水プロットを
行ないエピトープペプチドが示す性質に関する情報を得
ておくことが好ましい。さらにJameson とWolf[Jameson
B.A. & Wolf H.(1988)Comput. Applic. in Bioscience
s 4: 181-186]によって提唱されている計算式に従い，
目的とするペプチドの抗原性に関する予測した性質も知
っておくことは好ましいことである。さらにJanin 等や
Emini 等によって提唱されている表面部位の予測法[Jan
in J., Wodak S., Levitt M. & Maigret B. (1978) J.
Mol. Biol.125: 357-386; Emini E., Hughes J.V., Per
low D.S., & Boger J. (1965) J.Biol. 55:836-839] 、
Karplus 等によって提唱されている蛋白質の可塑性予測
法[Karplus P.A. & Schulz G.E. (1985) Naturwiss. 7
2: 212-213]で得られる情報も抗原性を予想する際に役
立つ。
【００３２】ここで上記の各種解析を行なう際に重要な
ことは、エピトープ解析を行なった条件でのエピトープ
ペプチドの情報を得ておくことである。例えば実施例に
示したものでは、C14 抗原という約100 アミノ酸からな
る配列と抗体とを反応させる際に、短鎖ペプチドを加え
ることによる結合阻害によりエピトープ解析を行なった
が、この場合にはエピトープは長い配列の中で機能して
いるものであるから、上記の解析はこの長い配列を元に
行なう。
ことは、エピトープ解析を行なった条件でのエピトープ
ペプチドの情報を得ておくことである。例えば実施例に
示したものでは、C14 抗原という約100 アミノ酸からな
る配列と抗体とを反応させる際に、短鎖ペプチドを加え
ることによる結合阻害によりエピトープ解析を行なった
が、この場合にはエピトープは長い配列の中で機能して
いるものであるから、上記の解析はこの長い配列を元に
行なう。
【００３３】エピトープキメラ抗原に於ては、これらの
予測法によって得られるエピトープペプチドの予測構造
が変化しないように、キメラ抗原ペプチドを設計する必
要がある。
予測法によって得られるエピトープペプチドの予測構造
が変化しないように、キメラ抗原ペプチドを設計する必
要がある。
【００３４】さらにエピトープキメラ抗原に於ては、エ
ピトープペプチドのつなぎ目が新たなエピトープを提供
しないように設計されねばならない。この予測は以下の
方法によって成し得る。
ピトープペプチドのつなぎ目が新たなエピトープを提供
しないように設計されねばならない。この予測は以下の
方法によって成し得る。
【００３５】一つはつなぎ目によって生じるペプチド配
列を用いて遺伝子情報、蛋白構造情報バンクを検索し、
一致する配列が無いことを確認する。もしくは一致する
配列があったとしても抗原性が無いことが確認できれば
良い。
列を用いて遺伝子情報、蛋白構造情報バンクを検索し、
一致する配列が無いことを確認する。もしくは一致する
配列があったとしても抗原性が無いことが確認できれば
良い。
【００３６】本発明においては、つなぎ目のペプチド配
列が抗原性をもたないか又は抗原性が低いと予測される
配列を持つようにアミノ酸を付加、もしくは欠失させる
ことにより設計する。付加すべきアミノ酸としては、例
えばイソロイシン、ロイシン、バリン等の疎水的な性質
を持つアミノ酸が好ましく、疎水性アミノ酸を付加する
ことによってペプチド性つなぎ目の疎水性が増しエピト
ープとして機能する可能性を低くすることができる。す
なわちエピトープキメラペプチドにおいてエピトープと
して機能させるには、分子表面にエピトープが露出して
いることが肝要であり、疎水的な性質を付加することに
より、分子表面に露出させる可能性を低くすることがで
きる。
列が抗原性をもたないか又は抗原性が低いと予測される
配列を持つようにアミノ酸を付加、もしくは欠失させる
ことにより設計する。付加すべきアミノ酸としては、例
えばイソロイシン、ロイシン、バリン等の疎水的な性質
を持つアミノ酸が好ましく、疎水性アミノ酸を付加する
ことによってペプチド性つなぎ目の疎水性が増しエピト
ープとして機能する可能性を低くすることができる。す
なわちエピトープキメラペプチドにおいてエピトープと
して機能させるには、分子表面にエピトープが露出して
いることが肝要であり、疎水的な性質を付加することに
より、分子表面に露出させる可能性を低くすることがで
きる。
【００３７】すなわち、本発明のエピトープキメラ抗原
ペプチドにおいては、ペプチド性つなぎ目は抗原性をも
たないか又は低抗原性であることを特徴とする。
ペプチドにおいては、ペプチド性つなぎ目は抗原性をも
たないか又は低抗原性であることを特徴とする。
【００３８】上記の方法に従い最適な感染ＨＣＶグルー
プ判別抗原として配列番号１に示す配列からなるペプチ
ドGR1EPV5 、配列番号２に示す配列からなるペプチドGR
1EPV4 を設計した。
プ判別抗原として配列番号１に示す配列からなるペプチ
ドGR1EPV5 、配列番号２に示す配列からなるペプチドGR
1EPV4 を設計した。
【００３９】エピトープキメラ抗原の作製 本発明のエピトープキメラ抗原は、化学合成法により、
又は遺伝子工学的手法を用いて作製することができる。
又は遺伝子工学的手法を用いて作製することができる。
【００４０】化学合成法の場合、該方法は、ＨＣＶゲノ
ムＲＮＡ又はそのｃＤＮＡによってコードされるグルー
プＩ又はグループII ＨＣＶ関連抗原上の異なる２つ以
上のエピトープの各々を従来のペプチド合成法を用いて
合成する段階、ペプチド性つなぎ目を別個に合成する段
階、エピトープとエピトープの間をペプチド性つなぎ目
を介して結合する段階を包含する。ペプチド合成法は周
知の技術であり、例えば日本生化学会編、生化学実験講
座１「タンパク質の化学IV−化学修飾とペプチド合成」
（1981年）東京化学同人に記載される種々の手法が使用
され得る。長鎖ペプチドの場合には、通常、固相法が用
いられる。またアミノ酸の保護及び脱保護の技術もペプ
チド合成において一般的に使用される。
ムＲＮＡ又はそのｃＤＮＡによってコードされるグルー
プＩ又はグループII ＨＣＶ関連抗原上の異なる２つ以
上のエピトープの各々を従来のペプチド合成法を用いて
合成する段階、ペプチド性つなぎ目を別個に合成する段
階、エピトープとエピトープの間をペプチド性つなぎ目
を介して結合する段階を包含する。ペプチド合成法は周
知の技術であり、例えば日本生化学会編、生化学実験講
座１「タンパク質の化学IV−化学修飾とペプチド合成」
（1981年）東京化学同人に記載される種々の手法が使用
され得る。長鎖ペプチドの場合には、通常、固相法が用
いられる。またアミノ酸の保護及び脱保護の技術もペプ
チド合成において一般的に使用される。
【００４１】遺伝子工学的手法の場合、該方法は、エピ
トープキメラ抗原ペプチドをコードするＤＮＡ断片を作
製する段階、該ＤＮＡ断片をベクターに組み込んで複製
可能な発現ベクターを構築する段階、該発現ベクターを
宿主細胞に導入し、ペプチドを発現する形質転換体を得
る段階、さらに該形質転換体を培養し発現産物を発現さ
せて発現したペプチドを回収する段階を含む。この製造
方法も本発明の一部である。
トープキメラ抗原ペプチドをコードするＤＮＡ断片を作
製する段階、該ＤＮＡ断片をベクターに組み込んで複製
可能な発現ベクターを構築する段階、該発現ベクターを
宿主細胞に導入し、ペプチドを発現する形質転換体を得
る段階、さらに該形質転換体を培養し発現産物を発現さ
せて発現したペプチドを回収する段階を含む。この製造
方法も本発明の一部である。
【００４２】例えば配列番号１及び２に示すアミノ酸配
列を有するキメラペプチドをコードするＤＮＡ断片は実
施例３に示すように作製することが可能である。さらに
実施例４に示すように形質転換体を取得し、形質転換体
を培養し、該ペプチドを分離、回収することが可能であ
る。
列を有するキメラペプチドをコードするＤＮＡ断片は実
施例３に示すように作製することが可能である。さらに
実施例４に示すように形質転換体を取得し、形質転換体
を培養し、該ペプチドを分離、回収することが可能であ
る。
【００４３】遺伝子工学的な手法に於て発現に用いる発
現ベクターとしては、実施例に示した大腸菌を宿主と
し、大腸菌トリプトファンオペロンの制御化に発現させ
るベクター以外にも、大腸菌を宿主としては、大腸菌ト
リプトファンオペロン以外にもＴａｃプロモーター、Ｔ
ｒｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰｈｏＡプロ
モーター、λプロモーター等を利用したベクターを用い
ることが可能である。また大腸菌以外にも酵母を宿主と
し、解糖系遺伝子、たとえばグリセロアルデヒド−３−
燐酸デヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ
Ｉ、II、ピルビン酸キナーゼ、ホスホグリセリンキナー
ゼ、トリオースイソメラーゼ等の酵母で慣用に用いられ
ているプロモーターを利用した発現ベクターを用いて発
現させることも可能である。さらに昆虫細胞を宿主とし
バキュロウイルスをベクターとした発現系、哺乳類細胞
例えばＣＨＯ細胞や、ＣＯＳ細胞 ＨｅＬａ細胞等を宿
主とし、慣用的に用いられる組み込み型発現ベクターや
ワクチニアウイルスをベクターとした発現系、アデノウ
イルスや慣用的に用いられるウイルスをベクターとした
発現系を利用しても発現可能である。
現ベクターとしては、実施例に示した大腸菌を宿主と
し、大腸菌トリプトファンオペロンの制御化に発現させ
るベクター以外にも、大腸菌を宿主としては、大腸菌ト
リプトファンオペロン以外にもＴａｃプロモーター、Ｔ
ｒｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰｈｏＡプロ
モーター、λプロモーター等を利用したベクターを用い
ることが可能である。また大腸菌以外にも酵母を宿主と
し、解糖系遺伝子、たとえばグリセロアルデヒド−３−
燐酸デヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ
Ｉ、II、ピルビン酸キナーゼ、ホスホグリセリンキナー
ゼ、トリオースイソメラーゼ等の酵母で慣用に用いられ
ているプロモーターを利用した発現ベクターを用いて発
現させることも可能である。さらに昆虫細胞を宿主とし
バキュロウイルスをベクターとした発現系、哺乳類細胞
例えばＣＨＯ細胞や、ＣＯＳ細胞 ＨｅＬａ細胞等を宿
主とし、慣用的に用いられる組み込み型発現ベクターや
ワクチニアウイルスをベクターとした発現系、アデノウ
イルスや慣用的に用いられるウイルスをベクターとした
発現系を利用しても発現可能である。
【００４４】さらに遺伝子工学的手法を用いる場合に
は、キメラ抗原ペプチドを他のペプチドとの融合蛋白質
として発現させることも慣用的に用いられる手段であ
る。
は、キメラ抗原ペプチドを他のペプチドとの融合蛋白質
として発現させることも慣用的に用いられる手段であ
る。
【００４５】上記の方法に基づくならば、グループＩ又
はグループ II と同様に、グループIII （Okamoto et a
l, J. Gen. Virol. 72:2697-2704(1991)）に属するＨＣ
Ｖゲノムから、グループIII を特異的に区別するエピト
ープ領域を取り出してエピトープキメラ抗原ペプチドを
作製することが可能であり、これを用いることによりグ
ループIII に感染している患者血清のグループ判別を行
なうことができる。
はグループ II と同様に、グループIII （Okamoto et a
l, J. Gen. Virol. 72:2697-2704(1991)）に属するＨＣ
Ｖゲノムから、グループIII を特異的に区別するエピト
ープ領域を取り出してエピトープキメラ抗原ペプチドを
作製することが可能であり、これを用いることによりグ
ループIII に感染している患者血清のグループ判別を行
なうことができる。
【００４６】遺伝子工学的に発現させ回収したグルーピ
ングに好適なキメラ抗原ペプチドを用いてＨＣＶ感染患
者の血清中のグループＩ特異的な抗体を検出すると、実
施例５に示すごとく、それ以前に用いていた抗原のみで
は検出不可能であった患者血清のグループ判定を行なう
ことが可能となった。
ングに好適なキメラ抗原ペプチドを用いてＨＣＶ感染患
者の血清中のグループＩ特異的な抗体を検出すると、実
施例５に示すごとく、それ以前に用いていた抗原のみで
は検出不可能であった患者血清のグループ判定を行なう
ことが可能となった。
【００４７】したがって、本発明はさらに、エピトープ
キメラ抗原ペプチドと、ＨＣＶに感染したと推定される
試料中のグループＩ又はグループII特異的な抗体との免
疫学的反応を行なった後、生成する抗原−抗体複合体の
濃度又は存在を測定することを含む、ＨＣＶグループ判
定方法を提供する。
キメラ抗原ペプチドと、ＨＣＶに感染したと推定される
試料中のグループＩ又はグループII特異的な抗体との免
疫学的反応を行なった後、生成する抗原−抗体複合体の
濃度又は存在を測定することを含む、ＨＣＶグループ判
定方法を提供する。
【００４８】本発明はまた、エピトープキメラ抗原ペプ
チドと、ＨＣＶに感染したと推定される試料中のＨＣＶ
関連抗体との免疫学的反応を行なった後、生成する抗原
−抗体複合体の濃度又は存在を測定することを含む、Ｈ
ＣＶ感染判定方法を提供する。
チドと、ＨＣＶに感染したと推定される試料中のＨＣＶ
関連抗体との免疫学的反応を行なった後、生成する抗原
−抗体複合体の濃度又は存在を測定することを含む、Ｈ
ＣＶ感染判定方法を提供する。
【００４９】抗原−抗体複合体の濃度又は存在は、エン
ザイムイムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、イムノ
ドットブロッティング等の公知の一般的方法を用いて測
定することができる。上記判定の精度は、それぞれのグ
ループ抗原に対する抗体価を測定することによりさらに
向上する。また田中ら(T.Tanaka ら，Hepatology 19:13
47〜1353，1994) により提唱されている判別方法を用い
ることもできる。
ザイムイムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、イムノ
ドットブロッティング等の公知の一般的方法を用いて測
定することができる。上記判定の精度は、それぞれのグ
ループ抗原に対する抗体価を測定することによりさらに
向上する。また田中ら(T.Tanaka ら，Hepatology 19:13
47〜1353，1994) により提唱されている判別方法を用い
ることもできる。
【００５０】以下実施例により本発明を詳細に説明する
が、本発明は実施例に限定されるものではない。
が、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００５１】
実施例１ コア領域ペプチドを用いたグループ判別 配列番号９及び１０の配列を持つペプチドをアプライド
バイオシステム社のペプチド合成機（Ｍｏｄｅｌ：４３
０Ａ）を用いて合成し、逆相クロマトグラフィーにより
目的のペプチドを精製した。精製したペプチドが目的の
配列であることはアミノ酸シークエンサーの分析により
確認した。
バイオシステム社のペプチド合成機（Ｍｏｄｅｌ：４３
０Ａ）を用いて合成し、逆相クロマトグラフィーにより
目的のペプチドを精製した。精製したペプチドが目的の
配列であることはアミノ酸シークエンサーの分析により
確認した。
【００５２】このペプチドを2.5 μg/mlの濃度となるよ
うに8M尿素を含む0.1Mの燐酸緩衝液（pH7.5 ）に希釈し
た。希釈した抗原をヌンク社のマルチモジュールプレー
トにウェルあたり 100μｌのせ、室温に2 時間静置し
た。抗原希釈液を除いた後、ウェルあたり 100μｌのブ
ロッキング液［0.5 ％カゼイン、0.15M NaCl、2.5mM ED
TA、0.1M燐酸緩衝液（pH7.0 ）］を加え室温に2 時間静
置し抗原をプレートに固定した。
うに8M尿素を含む0.1Mの燐酸緩衝液（pH7.5 ）に希釈し
た。希釈した抗原をヌンク社のマルチモジュールプレー
トにウェルあたり 100μｌのせ、室温に2 時間静置し
た。抗原希釈液を除いた後、ウェルあたり 100μｌのブ
ロッキング液［0.5 ％カゼイン、0.15M NaCl、2.5mM ED
TA、0.1M燐酸緩衝液（pH7.0 ）］を加え室温に2 時間静
置し抗原をプレートに固定した。
【００５３】各ウェルに検体希釈液［0.5 ％カゼイン、
0.5M NaCl 、2.5mM EDTA、0.1M燐酸緩衝液（pH7.0 ）］
によって11倍に希釈した非Ａ非Ｂ型慢性肝炎患者血清 1
00μｌを加え４５分静置した。ウェルを0.1% Tween20を
含むPBS で洗浄した後、 100μｌのホースラディッシュ
パーオキシダーゼによって標識された抗ヒトIgG 抗体を
加え、45分静置した。ウェルを0.1% Tween20を含むPBS
で洗浄した後、常法に従い、発色法により酵素活性を計
測した。その結果を表２にまとめて示す。また比較のた
め、Ｃ１４−１−２及びＣ１４−２−２抗原を用いてグ
ループ判別した結果と、ＰＣＲ法によりグループ判別し
た結果を表中に示した。
0.5M NaCl 、2.5mM EDTA、0.1M燐酸緩衝液（pH7.0 ）］
によって11倍に希釈した非Ａ非Ｂ型慢性肝炎患者血清 1
00μｌを加え４５分静置した。ウェルを0.1% Tween20を
含むPBS で洗浄した後、 100μｌのホースラディッシュ
パーオキシダーゼによって標識された抗ヒトIgG 抗体を
加え、45分静置した。ウェルを0.1% Tween20を含むPBS
で洗浄した後、常法に従い、発色法により酵素活性を計
測した。その結果を表２にまとめて示す。また比較のた
め、Ｃ１４−１−２及びＣ１４−２−２抗原を用いてグ
ループ判別した結果と、ＰＣＲ法によりグループ判別し
た結果を表中に示した。
【００５４】
【表２】 表から明らかなように、ほとんどの検体に於てはＣ１４
−１−２及びＣ１４−２−２抗原を用いることによりグ
ループ判別が可能であったが、検体番号１６のように配
列番号９のペプチドを用いることにより始めて血清学的
にグループ判別が可能になるものが存在することが判明
した。
−１−２及びＣ１４−２−２抗原を用いることによりグ
ループ判別が可能であったが、検体番号１６のように配
列番号９のペプチドを用いることにより始めて血清学的
にグループ判別が可能になるものが存在することが判明
した。
【００５５】実施例２ Ｃ１４−１−２抗原のエピトー
プ解析 精製したＣ１４−１−２ペプチドを2.5 μg/mlの濃度と
なるように８Ｍ尿素を含む０．１Ｍの燐酸緩衝液（pH7.
5 ）に希釈した。希釈した抗原をヌンク社のマルチモジ
ュールプレートにウェルあたり 200μｌのせ、室温に2
時間静置した。抗原希釈液を除いた後、ウェルあたり 2
00μｌのブロッキング液［0.5 ％カゼイン、0.15M NaC
l、2.5mM EDTA、0.1M燐酸緩衝液（pH7.0 ）］を加え室
温に2 時間静置した。このように抗原をプレートに固定
した。検体２０μl と化学合成したペプチド（0.1 ｍｇ
／ｍｌ）２０μl を等量混和し、室温１時間静置した。
これに検体希釈液を 200μl 加えた後にペプチドを固定
したプレートに加えた。３０℃１時間反応させた後、洗
浄を行ない、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトIgG （マウス
モノクローナル抗体）を加え３０℃１時間反応させた。
洗浄した後、ｏ−フェニレンジアミン溶液を加え、３０
℃１時間反応させた後１Ｍ硫酸溶液を加えることにより
反応を停止させ、比色計で 492ｎｍの発色を測定した。
プ解析 精製したＣ１４−１−２ペプチドを2.5 μg/mlの濃度と
なるように８Ｍ尿素を含む０．１Ｍの燐酸緩衝液（pH7.
5 ）に希釈した。希釈した抗原をヌンク社のマルチモジ
ュールプレートにウェルあたり 200μｌのせ、室温に2
時間静置した。抗原希釈液を除いた後、ウェルあたり 2
00μｌのブロッキング液［0.5 ％カゼイン、0.15M NaC
l、2.5mM EDTA、0.1M燐酸緩衝液（pH7.0 ）］を加え室
温に2 時間静置した。このように抗原をプレートに固定
した。検体２０μl と化学合成したペプチド（0.1 ｍｇ
／ｍｌ）２０μl を等量混和し、室温１時間静置した。
これに検体希釈液を 200μl 加えた後にペプチドを固定
したプレートに加えた。３０℃１時間反応させた後、洗
浄を行ない、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトIgG （マウス
モノクローナル抗体）を加え３０℃１時間反応させた。
洗浄した後、ｏ−フェニレンジアミン溶液を加え、３０
℃１時間反応させた後１Ｍ硫酸溶液を加えることにより
反応を停止させ、比色計で 492ｎｍの発色を測定した。
【００５６】結果を表３に示す。表３に示した検体は全
てＨＣＶグループＩに属すことはｔｒｐＥ・Ｃ１４−１
−２（特願平５−１９４１８５号）との反応性より明ら
かであり、グループＩの配列を持つペプチドを加えるこ
とによりｔｒｐＥ・Ｃ１４−１−２との反応が阻害され
ていることが明らかである。これらの結果からＣ１４−
１−２抗原に於て患者血清中の抗体は阻害のかかったペ
プチドにエピトープが存在していることが明らかになっ
た。
てＨＣＶグループＩに属すことはｔｒｐＥ・Ｃ１４−１
−２（特願平５−１９４１８５号）との反応性より明ら
かであり、グループＩの配列を持つペプチドを加えるこ
とによりｔｒｐＥ・Ｃ１４−１−２との反応が阻害され
ていることが明らかである。これらの結果からＣ１４−
１−２抗原に於て患者血清中の抗体は阻害のかかったペ
プチドにエピトープが存在していることが明らかになっ
た。
【００５７】
【表３】 実施例３ エピトープキメラ抗原ペプチドをコードする
遺伝子の作製 ［ＨＣＶグループ判定に適したエピトープキメラ抗原遺
伝子の構築］ 以下のＤＮＡをＤＮＡ合成機（ＡＢＩ：Ｍｏｄｅｌ３９
４Ａ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ：Ｍｏｄｅｌ８７００）を用
いて合成した。
遺伝子の作製 ［ＨＣＶグループ判定に適したエピトープキメラ抗原遺
伝子の構築］ 以下のＤＮＡをＤＮＡ合成機（ＡＢＩ：Ｍｏｄｅｌ３９
４Ａ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ：Ｍｏｄｅｌ８７００）を用
いて合成した。
【００５８】ＥＰ１：ＧＣＧＡＡＴＴＣＧＣＣＴＣＡＣ
ＡＣＣＴＣＣＣＴＴＡＣＡＴＣ； ＥＰ２Ｒ：ＧＧＧＴＡＣＣＴＡＣＣＡＣＧＧＧＡＧＣＡ
ＧＣＡＧＣＴＣ； ＣＯＲＥ−Ｆ：ＡＧＧＴＡＣＣＣＣＴＡＡＡＧＣＴＣＧ
ＴＣＧＴＣＣＧＧＡＡＧＧＴＣＧＴＧＣＴ； ＣＯＲＥ−Ｒ：ＴＣＣＣＨＨＨＴＴＧＡＧＣＣＣＡＡＧ
ＣＡＣＧＡＣＣＴＴＣＣＧＧＡＣＧ； Ｖ４ＸＹＺ：ＡＧＡＣＣＣＧＧＧＴＡＣＣＡＣＧＧＧＡ
ＧＣＡＧＣＡＧＣ； ＥＰ５：ＡＣＣＣＧＧＧＡＧＴＧＴＧＧＴＣＡＴＴＧＴ
ＧＧＧＴＡＧＧ；および ＥＰ６：ＧＡＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＣＡＡＴＣＧＡＡＣ
ＴＣＣＣＧＧＴＡＧＡＧＧＡＣＴＴＣ。
ＡＣＣＴＣＣＣＴＴＡＣＡＴＣ； ＥＰ２Ｒ：ＧＧＧＴＡＣＣＴＡＣＣＡＣＧＧＧＡＧＣＡ
ＧＣＡＧＣＴＣ； ＣＯＲＥ−Ｆ：ＡＧＧＴＡＣＣＣＣＴＡＡＡＧＣＴＣＧ
ＴＣＧＴＣＣＧＧＡＡＧＧＴＣＧＴＧＣＴ； ＣＯＲＥ−Ｒ：ＴＣＣＣＨＨＨＴＴＧＡＧＣＣＣＡＡＧ
ＣＡＣＧＡＣＣＴＴＣＣＧＧＡＣＧ； Ｖ４ＸＹＺ：ＡＧＡＣＣＣＧＧＧＴＡＣＣＡＣＧＧＧＡ
ＧＣＡＧＣＡＧＣ； ＥＰ５：ＡＣＣＣＧＧＧＡＧＴＧＴＧＧＴＣＡＴＴＧＴ
ＧＧＧＴＡＧＧ；および ＥＰ６：ＧＡＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＣＡＡＴＣＧＡＡＣ
ＴＣＣＣＧＧＴＡＧＡＧＧＡＣＴＴＣ。
【００５９】ＥＰ１とＥＰ２Ｒ及びＶ４ＸＹＺはグルー
プＩのＨＣＶ ｃＤＮＡからペプチドＸ、Ｙ、Ｚ領域を
コードする配列を取り出すためのプライマーである。Ｅ
Ｐ５とＥＰ６はグループＩのＨＣＶ ｃＤＮＡからペプ
チドＶ、Ｗａ領域をコードする配列を取り出すためのプ
ライマーである。
プＩのＨＣＶ ｃＤＮＡからペプチドＸ、Ｙ、Ｚ領域を
コードする配列を取り出すためのプライマーである。Ｅ
Ｐ５とＥＰ６はグループＩのＨＣＶ ｃＤＮＡからペプ
チドＶ、Ｗａ領域をコードする配列を取り出すためのプ
ライマーである。
【００６０】これらのプライマーを用いてＰＣＲ法によ
り配列を取り出した。反応は１ｎｇのＨＣＶ ｃＤＮＡ
（Ｃ６−７９）（本出願人らによる特願平５−１９３１
０４号）、100 ｐｍｏｌプライマー（ＥＰ１とＥＰ２Ｒ
またはＥＰ１とＶ４ＸＹＺまたはＥＰ５とＥＰ６）を加
え、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、２．
５ｍＭ ＭｇＣｌ2 、0.01％ゼラチン、０．２ｍＭ ｄ
ＮＴＰ、２．５Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａ
ｓｅとなるよう 100μｌの反応液を調製し、ミネラルオ
イルを重層して９４℃、３０秒、５５℃、１分、７２
℃、２分の条件で２５サイクル反応を行なわせた。また
ＣＯＲＥ−ＦとＣＯＲＥ−Ｒをそれぞれ２μｇ加え、１
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、２．５ｍＭ
ＭｇＣｌ2 、0.01％ゼラチン、０．２ｍＭ ｄＮＴ
Ｐ、２．５Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
となるよう 100μｌの反応液を調製し、ミネラルオイル
を重層して９４℃、３０秒、５０℃、１分、７２℃、２
分の条件で１５サイクル反応を行なわせた。反応液の一
部をアガロース電気泳動し、ＥＰ１とＥＰ２Ｒの組み合
わせでは約 140ｂｐの、ＥＰ１とＶ４ＸＹＺの組み合わ
せでは約 150ｂｐの、ＣＯＲＥ−ＦとＣＯＲＥ−Ｒの組
み合せでは約５０ｂｐの断片、ＥＰ５とＥＰ６の組み合
せでは約 100ｂｐの断片を分離した。分離したＤＮＡ断
片をアガロース切片からＭｅｒｍａｉｄ Ｋｉｔ（Ｂｉ
ｏ１０１社）を用いメーカーの推奨する方法に従いＴＥ
溶液中に回収した。回収したＤＮＡ断片を２５ｎｇのｐ
ＧＥＭ−Ｔベクターと共に２０μｌの反応液［５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ ＭｇＣ
ｌ2 ，１ｍＭ ＡＴＰ，１０ｍＭ ＤＴＴ，Ｔ４ ＤＮ
Ａリガ−ゼ］中で１６℃、１時間反応させた。反応液の
一部を用い大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎ社）をＨａｎａｈａｎの方法[ DNA cloning: A pract
ical approach (ed. D. M. Glover), vol. 1, p109-, I
RC press, (1885)]に従って形質転換した。アンピシリ
ン耐性のコロニーを選択し、形質転換体のDNA をミニプ
レパレーション法により調製し、制限酵素で切断するこ
とにより両断片が環状化しているプラスミドを持つ形質
転換体を選択した。
り配列を取り出した。反応は１ｎｇのＨＣＶ ｃＤＮＡ
（Ｃ６−７９）（本出願人らによる特願平５−１９３１
０４号）、100 ｐｍｏｌプライマー（ＥＰ１とＥＰ２Ｒ
またはＥＰ１とＶ４ＸＹＺまたはＥＰ５とＥＰ６）を加
え、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、２．
５ｍＭ ＭｇＣｌ2 、0.01％ゼラチン、０．２ｍＭ ｄ
ＮＴＰ、２．５Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａ
ｓｅとなるよう 100μｌの反応液を調製し、ミネラルオ
イルを重層して９４℃、３０秒、５５℃、１分、７２
℃、２分の条件で２５サイクル反応を行なわせた。また
ＣＯＲＥ−ＦとＣＯＲＥ−Ｒをそれぞれ２μｇ加え、１
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、２．５ｍＭ
ＭｇＣｌ2 、0.01％ゼラチン、０．２ｍＭ ｄＮＴ
Ｐ、２．５Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
となるよう 100μｌの反応液を調製し、ミネラルオイル
を重層して９４℃、３０秒、５０℃、１分、７２℃、２
分の条件で１５サイクル反応を行なわせた。反応液の一
部をアガロース電気泳動し、ＥＰ１とＥＰ２Ｒの組み合
わせでは約 140ｂｐの、ＥＰ１とＶ４ＸＹＺの組み合わ
せでは約 150ｂｐの、ＣＯＲＥ−ＦとＣＯＲＥ−Ｒの組
み合せでは約５０ｂｐの断片、ＥＰ５とＥＰ６の組み合
せでは約 100ｂｐの断片を分離した。分離したＤＮＡ断
片をアガロース切片からＭｅｒｍａｉｄ Ｋｉｔ（Ｂｉ
ｏ１０１社）を用いメーカーの推奨する方法に従いＴＥ
溶液中に回収した。回収したＤＮＡ断片を２５ｎｇのｐ
ＧＥＭ−Ｔベクターと共に２０μｌの反応液［５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ ＭｇＣ
ｌ2 ，１ｍＭ ＡＴＰ，１０ｍＭ ＤＴＴ，Ｔ４ ＤＮ
Ａリガ−ゼ］中で１６℃、１時間反応させた。反応液の
一部を用い大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎ社）をＨａｎａｈａｎの方法[ DNA cloning: A pract
ical approach (ed. D. M. Glover), vol. 1, p109-, I
RC press, (1885)]に従って形質転換した。アンピシリ
ン耐性のコロニーを選択し、形質転換体のDNA をミニプ
レパレーション法により調製し、制限酵素で切断するこ
とにより両断片が環状化しているプラスミドを持つ形質
転換体を選択した。
【００６１】ＥＰ１とＥＰ２Ｒとを用いて生じた断片の
クローニングされているプラスミドＤＮＡをＫｐｎＩと
ＥｃｏＲＩで切断し、電気泳動を行なうことにより約１
４０ｂｐの断片を分離し、Ｍｅｒｍａｉｄ Ｋｉｔ（Ｂ
ｉｏ１０１社）を用いメーカーの推奨する方法に従いＴ
Ｅ溶液中に回収した。またＣＯＲＥ−ＦとＣＯＲＥ−Ｒ
の組み合わせで生じた断片のクローニングされているプ
ラスミドＤＮＡをＫｐｎＩとＳｍａＩで切断し、電気泳
動を行なうことにより約６０ｂｐの断片を分離し、Ｍｅ
ｒｍａｉｄ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ１０１社）を用いメーカー
の推奨する方法に従いＴＥ溶液中に回収した。回収した
断片とＥｃｏＲＩとＳｍａＩで切断したｐＴ７Ｔ３１９
Ｕ（ファルマシア社）とＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて
連結反応させ、反応液の一部を用い、大腸菌ＳＵＲＥ
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ社）を形質転換した。アンピシリ
ン耐性のコロニーを選択し、形質転換体のＤＮＡをミニ
プレパレーション法により調製し、制限酵素で切断する
ことにより両断片が結合環状化しているプラスミドを持
つ形質転換体を選択した。得られたプラスミドをＳｍａ
ＩとＢａｍＨＩで切断し、ＥＰ５とＥＰ６で生じた断片
のクローニングされているプラスミドＤＮＡをＢａｍＨ
ＩとＳｍａＩで切断し、電気泳動を行なうことにより 1
00ｂｐの断片を分離し、Ｍｅｒｍａｉｄ Ｋｉｔ（Ｂｉ
ｏ１０１社）を用い回収した断片と、Ｔ４ ＤＮＡリガ
ーゼを用いて連結反応させた。反応液の一部を用い、大
腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ社）を形質
転換した。アンピシリン耐性のコロニーを選択し、形質
転換体のDNA をミニプレパレーション法により調製し、
制限酵素で切断することにより両断片が結合環状化して
いるプラスミドを持つ形質転換体を選択した。このよう
にしてＧＲ１ＥＰＶ５遺伝子断片を持つプラスミドを構
築した。
クローニングされているプラスミドＤＮＡをＫｐｎＩと
ＥｃｏＲＩで切断し、電気泳動を行なうことにより約１
４０ｂｐの断片を分離し、Ｍｅｒｍａｉｄ Ｋｉｔ（Ｂ
ｉｏ１０１社）を用いメーカーの推奨する方法に従いＴ
Ｅ溶液中に回収した。またＣＯＲＥ−ＦとＣＯＲＥ−Ｒ
の組み合わせで生じた断片のクローニングされているプ
ラスミドＤＮＡをＫｐｎＩとＳｍａＩで切断し、電気泳
動を行なうことにより約６０ｂｐの断片を分離し、Ｍｅ
ｒｍａｉｄ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ１０１社）を用いメーカー
の推奨する方法に従いＴＥ溶液中に回収した。回収した
断片とＥｃｏＲＩとＳｍａＩで切断したｐＴ７Ｔ３１９
Ｕ（ファルマシア社）とＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて
連結反応させ、反応液の一部を用い、大腸菌ＳＵＲＥ
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ社）を形質転換した。アンピシリ
ン耐性のコロニーを選択し、形質転換体のＤＮＡをミニ
プレパレーション法により調製し、制限酵素で切断する
ことにより両断片が結合環状化しているプラスミドを持
つ形質転換体を選択した。得られたプラスミドをＳｍａ
ＩとＢａｍＨＩで切断し、ＥＰ５とＥＰ６で生じた断片
のクローニングされているプラスミドＤＮＡをＢａｍＨ
ＩとＳｍａＩで切断し、電気泳動を行なうことにより 1
00ｂｐの断片を分離し、Ｍｅｒｍａｉｄ Ｋｉｔ（Ｂｉ
ｏ１０１社）を用い回収した断片と、Ｔ４ ＤＮＡリガ
ーゼを用いて連結反応させた。反応液の一部を用い、大
腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ社）を形質
転換した。アンピシリン耐性のコロニーを選択し、形質
転換体のDNA をミニプレパレーション法により調製し、
制限酵素で切断することにより両断片が結合環状化して
いるプラスミドを持つ形質転換体を選択した。このよう
にしてＧＲ１ＥＰＶ５遺伝子断片を持つプラスミドを構
築した。
【００６２】構築したプラスミド1 μg をEcoRI 、BamH
I で切断した（50mM Tris-HCl [pH7.5], 7mM MgCl2 ,
100mM NaCl, 10 units EcoRI, 10 units BamHI／反応液
量10μl で37℃１時間反応）後、この反応液をアガロー
ス電気泳動にかけ約 250bpの断片を分離した。分離した
断片をＭｅｒｍａｉｄ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ１０１社）を用
い回収した。一方ｐＴｒｐＴｒｐＥ 1μg をEcoRI 、Ba
mHI で切断した（50mMTris-HCl [pH7.5], 7mM MgCl2 ,
100mM NaCl, 10 units EcoRI, 10 units BamHI／反応
液量10μl で37℃１時間反応）後、この反応液をアガロ
ースにかけ約3Kbpの断片を分離した。分離した断片をガ
ラスパウダー法により回収した。回収した両断片をＴ４
ＤＮＡリガーゼを用いて連結反応させた。反応液の一
部を用い、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎ社）を形質転換した。アンピシリン耐性のコロニーを
選択し、形質転換体のDNA をミニプレパレーション法に
より調製し、制限酵素で切断することにより両断片が結
合環状化しているプラスミドを持つ形質転換体を選択し
た。このようにしてＧＲ１ＥＰＶ５遺伝子発現プラスミ
ド、ｐＴｒｐＧＲ１ＥＰＶ５を構築した。このプラスミ
ドを大腸菌に移入後、通商産業省工業技術院生命工学工
業技術研究所特許微生物寄託センターに平成６年７月７
日付で寄託し、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４４２２を得
た。
I で切断した（50mM Tris-HCl [pH7.5], 7mM MgCl2 ,
100mM NaCl, 10 units EcoRI, 10 units BamHI／反応液
量10μl で37℃１時間反応）後、この反応液をアガロー
ス電気泳動にかけ約 250bpの断片を分離した。分離した
断片をＭｅｒｍａｉｄ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ１０１社）を用
い回収した。一方ｐＴｒｐＴｒｐＥ 1μg をEcoRI 、Ba
mHI で切断した（50mMTris-HCl [pH7.5], 7mM MgCl2 ,
100mM NaCl, 10 units EcoRI, 10 units BamHI／反応
液量10μl で37℃１時間反応）後、この反応液をアガロ
ースにかけ約3Kbpの断片を分離した。分離した断片をガ
ラスパウダー法により回収した。回収した両断片をＴ４
ＤＮＡリガーゼを用いて連結反応させた。反応液の一
部を用い、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎ社）を形質転換した。アンピシリン耐性のコロニーを
選択し、形質転換体のDNA をミニプレパレーション法に
より調製し、制限酵素で切断することにより両断片が結
合環状化しているプラスミドを持つ形質転換体を選択し
た。このようにしてＧＲ１ＥＰＶ５遺伝子発現プラスミ
ド、ｐＴｒｐＧＲ１ＥＰＶ５を構築した。このプラスミ
ドを大腸菌に移入後、通商産業省工業技術院生命工学工
業技術研究所特許微生物寄託センターに平成６年７月７
日付で寄託し、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４４２２を得
た。
【００６３】ＥＰ１とＶ４ＸＹＺの組み合わせで生じた
断片の挿入されているプラスミドをＥｃｏＲＩとＳｍａ
Ｉで切断し生じる約 150ｂｐの断片を、電気泳動により
分離し、Ｍｅｒｍａｉｄ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ１０１社）を
用いメーカーの推奨する方法に従いＴＥ溶液中に回収し
た。回収した断片とＥｃｏＲＩとＳｍａＩで切断したｐ
ＴｒｐＧＲ１ＥＰＶ５とＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて
連結反応させ、反応液の一部を用い、大腸菌ＸＬ１−Ｂ
ｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ社）を形質転換した。その
結果ＧＲ１ＥＰＶ４遺伝子発現プラスミド、ｐＴｒｐＧ
Ｒ１ＥＰＶ４を構築した。このプラスミドを大腸菌に移
入後、同センターに平成６年７月７日付で寄託し、受託
番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４４２１を得た。
断片の挿入されているプラスミドをＥｃｏＲＩとＳｍａ
Ｉで切断し生じる約 150ｂｐの断片を、電気泳動により
分離し、Ｍｅｒｍａｉｄ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ１０１社）を
用いメーカーの推奨する方法に従いＴＥ溶液中に回収し
た。回収した断片とＥｃｏＲＩとＳｍａＩで切断したｐ
ＴｒｐＧＲ１ＥＰＶ５とＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて
連結反応させ、反応液の一部を用い、大腸菌ＸＬ１−Ｂ
ｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ社）を形質転換した。その
結果ＧＲ１ＥＰＶ４遺伝子発現プラスミド、ｐＴｒｐＧ
Ｒ１ＥＰＶ４を構築した。このプラスミドを大腸菌に移
入後、同センターに平成６年７月７日付で寄託し、受託
番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４４２１を得た。
【００６４】実施例４ エピトープキメラ抗原の発現と
精製 ｐＴｒｐＧＲ１ＥＰＶ４またはｐＴｒｐＧＲ１ＥＰＶ５
で形質転換された大腸菌を 100μg/mlアンピシリンを含
むＬＢ培地で３７℃一夜培養した。これを１％濃度で 1
00μg/mlアンピシリンを含むＭ９−ＣＡに接種し３７℃
一夜培養した。培養終了後遠心により菌体を集め、50ml
のLysis 液［50mM Tris-HCl (pH8.5),30mM NaCl, 5mM
EDTA ］に再懸濁し、1ml のリゾチーム液（10mg/ml Lys
ozyme）を加え、37℃において１時間処理した。この懸
濁液を超音波処理（150W、90秒で２回）にかけることに
より細胞を破壊した。15000rpmで、４℃において30分間
遠心し不溶性分画を回収した。不溶性分画を50mlのＮＰ
４０を１％含むＡ溶液［50mM Tris-HCl (pH8.5) ］に再
懸濁しホモジナイズ（1500rpm で５ストローク）した。
懸濁液を15000rpmで、４℃において30分間遠心し不溶性
分画を回収した。不溶性分画を50mlの2M尿素を含むＡ溶
液に再懸濁しホモジナイズ（1500rpm で５ストローク）
した。懸濁液を15000rpmで、４℃において30分間遠心し
不溶性分画を回収した。不溶性分画を50mlの６M 尿素を
含むＡ溶液に再懸濁しホモジナイズ（1500rpm で５スト
ローク）した。懸濁液を15000rpmで、４℃において30分
間遠心し可溶性分画を回収した。
精製 ｐＴｒｐＧＲ１ＥＰＶ４またはｐＴｒｐＧＲ１ＥＰＶ５
で形質転換された大腸菌を 100μg/mlアンピシリンを含
むＬＢ培地で３７℃一夜培養した。これを１％濃度で 1
00μg/mlアンピシリンを含むＭ９−ＣＡに接種し３７℃
一夜培養した。培養終了後遠心により菌体を集め、50ml
のLysis 液［50mM Tris-HCl (pH8.5),30mM NaCl, 5mM
EDTA ］に再懸濁し、1ml のリゾチーム液（10mg/ml Lys
ozyme）を加え、37℃において１時間処理した。この懸
濁液を超音波処理（150W、90秒で２回）にかけることに
より細胞を破壊した。15000rpmで、４℃において30分間
遠心し不溶性分画を回収した。不溶性分画を50mlのＮＰ
４０を１％含むＡ溶液［50mM Tris-HCl (pH8.5) ］に再
懸濁しホモジナイズ（1500rpm で５ストローク）した。
懸濁液を15000rpmで、４℃において30分間遠心し不溶性
分画を回収した。不溶性分画を50mlの2M尿素を含むＡ溶
液に再懸濁しホモジナイズ（1500rpm で５ストローク）
した。懸濁液を15000rpmで、４℃において30分間遠心し
不溶性分画を回収した。不溶性分画を50mlの６M 尿素を
含むＡ溶液に再懸濁しホモジナイズ（1500rpm で５スト
ローク）した。懸濁液を15000rpmで、４℃において30分
間遠心し可溶性分画を回収した。
【００６５】６Ｍ尿素を含む溶液で可溶化した抗原溶液
から、ＳセファーロースＨＰカラム（ファルマシア社）
を用いたイオン交換法とＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ｐｇ（フ
ァルマシア社）を用いたゲル濾過法によりエピトープキ
メラ抗原ペプチドＧＲ１ＥＰＶ４（配列番号２のアミノ
酸配列を含む）及びＧＲ１ＥＰＶ５（配列番号１のアミ
ノ酸配列を含む）を精製した。
から、ＳセファーロースＨＰカラム（ファルマシア社）
を用いたイオン交換法とＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ｐｇ（フ
ァルマシア社）を用いたゲル濾過法によりエピトープキ
メラ抗原ペプチドＧＲ１ＥＰＶ４（配列番号２のアミノ
酸配列を含む）及びＧＲ１ＥＰＶ５（配列番号１のアミ
ノ酸配列を含む）を精製した。
【００６６】実施例５ エピトープキメラ抗原ペプチド
と患者血清との反応 エピトープキメラ抗原ペプチドを2.5 μg/mlの濃度とな
るように8M尿素を含む0.1Mの燐酸緩衝液（pH7.5 ）に希
釈した。希釈した抗原をヌンク社のマルチモジュールプ
レートにウェルあたり 100μｌのせ、室温で2 時間静置
した。抗原希釈液を除いた後、ウェルあたり 100μｌの
ブロッキング液［0.5 ％カゼイン、0.15M NaCl、2.5mM
EDTA、0.1M燐酸緩衝液（pH7.0 ）］を加え室温で2 時間
静置し抗原をプレートに固定した。
と患者血清との反応 エピトープキメラ抗原ペプチドを2.5 μg/mlの濃度とな
るように8M尿素を含む0.1Mの燐酸緩衝液（pH7.5 ）に希
釈した。希釈した抗原をヌンク社のマルチモジュールプ
レートにウェルあたり 100μｌのせ、室温で2 時間静置
した。抗原希釈液を除いた後、ウェルあたり 100μｌの
ブロッキング液［0.5 ％カゼイン、0.15M NaCl、2.5mM
EDTA、0.1M燐酸緩衝液（pH7.0 ）］を加え室温で2 時間
静置し抗原をプレートに固定した。
【００６７】各ウェルに検体希釈液［0.5 ％カゼイン、
0.5M NaCl 、2.5mM EDTA、0.1M燐酸緩衝液（pH7.0 ）］
によって11倍に希釈した非Ａ非Ｂ型慢性肝炎患者血清 1
00μｌを加え４５分静置した。ウェルを0.1% Tween20を
含むPBS で洗浄した後、 100μｌのホースラディッシュ
パーオキシダーゼによって標識された抗ヒトIgG 抗体を
加え、45分静置した。ウェルを0.1% Tween20を含むPBS
で洗浄した後、常法に従い、発色法により酵素活性を計
測した。その結果を表４にまとめて示す。また比較のた
め、Ｃ１４−１−２及びＣ１４−２−２抗原を用いてグ
ループ判別した結果と、ＰＣＲ法によりグループ判別し
た結果を表中に示した。
0.5M NaCl 、2.5mM EDTA、0.1M燐酸緩衝液（pH7.0 ）］
によって11倍に希釈した非Ａ非Ｂ型慢性肝炎患者血清 1
00μｌを加え４５分静置した。ウェルを0.1% Tween20を
含むPBS で洗浄した後、 100μｌのホースラディッシュ
パーオキシダーゼによって標識された抗ヒトIgG 抗体を
加え、45分静置した。ウェルを0.1% Tween20を含むPBS
で洗浄した後、常法に従い、発色法により酵素活性を計
測した。その結果を表４にまとめて示す。また比較のた
め、Ｃ１４−１−２及びＣ１４−２−２抗原を用いてグ
ループ判別した結果と、ＰＣＲ法によりグループ判別し
た結果を表中に示した。
【００６８】
【表４】 Ｃ１４−１−２と同じエピトープを持つＧＲ１ＥＰＶ４
抗原ペプチドは、ほとんどＣ１４−１−２と同じ反応性
を示した。しかしながらグループII ＨＣＶ感染患者血
清でＣ１４−１−２に比較的強い反応を示した血清２
２、２５について反応が弱くなっており、余分なエピト
ープを除くことにより判別が容易になっていることは明
らかである。
抗原ペプチドは、ほとんどＣ１４−１−２と同じ反応性
を示した。しかしながらグループII ＨＣＶ感染患者血
清でＣ１４−１−２に比較的強い反応を示した血清２
２、２５について反応が弱くなっており、余分なエピト
ープを除くことにより判別が容易になっていることは明
らかである。
【００６９】コア領域のグループ判別エピトープを含む
ＧＲ１ＥＰＶ５抗原では、ＧＲ１ＥＰＶ４同様血清２
２、２５での判別が容易になっているのに加え、さらに
血清番号７、１６において反応性が向上しており、この
抗原を用いることにより、感染しているＨＣＶのグルー
プ判別が容易になったことは明らかである。
ＧＲ１ＥＰＶ５抗原では、ＧＲ１ＥＰＶ４同様血清２
２、２５での判別が容易になっているのに加え、さらに
血清番号７、１６において反応性が向上しており、この
抗原を用いることにより、感染しているＨＣＶのグルー
プ判別が容易になったことは明らかである。
【００７０】
【発明の効果】従来グループ判別が困難であった血清等
の検体であっても、本発明のエピトープキメラ抗原によ
ってその判別が可能となり、ＨＣＶのグルーピング判別
だけでなくＨＣＶ感染判定にも精度良く使用することが
できる。本発明に従えば、抗原抗体反応を利用した方法
に於て常に問題となる抗原抗体間の非特異反応の軽減、
抗原抗体間の特異反応の反応性向上を図ることができ、
抗原抗体反応を利用した免疫学的診断方法に適用するた
めのペプチド抗原の機能向上を達成できる。
の検体であっても、本発明のエピトープキメラ抗原によ
ってその判別が可能となり、ＨＣＶのグルーピング判別
だけでなくＨＣＶ感染判定にも精度良く使用することが
できる。本発明に従えば、抗原抗体反応を利用した方法
に於て常に問題となる抗原抗体間の非特異反応の軽減、
抗原抗体間の特異反応の反応性向上を図ることができ、
抗原抗体反応を利用した免疫学的診断方法に適用するた
めのペプチド抗原の機能向上を達成できる。
【００７１】
配列番号：１ 配列の長さ：321 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類： ハイポセティカル： YES アンチセンス： NO 配列 ATCGAT ATG AAA GCT ATC TTC GTT CTG AAA GGT TCT CTG GAC CGT GAC 48 Met Lys Ala Ile Phe Val Leu Lys Gly Ser Leu Asp Arg Asp 1 5 10 CCA GAA TTC GCC TCA CAC CTC CCT TAC ATC GAA CAG GGA ATG CAG CTT 96 Pro Glu Phe Ala Ser His Leu Pro Tyr Ile Glu Gln Gly Met Gln Leu 15 20 25 30 GCC GAG CAA TTC AAG CAG AAG GCG CTC GGA TTG CTG CAA ACA GCC ACC 144 Ala Glu Gln Phe Lys Gln Lys Ala Leu Gly Leu Leu Gln Thr Ala Thr 35 40 45 AAG CAC GCG GAG GCT GCT GCT CCC GTG GTA GGT ACC CCT AAA GCT CGT 192 Lys His Ala Glu Ala Ala Ala Pro Val Val Gly Thr Pro Lys Ala Arg 50 55 60 CGT CCG GAA GGT CGT GCT TGG GCT CAA CCC GGG AGT GTG GTC ATT GTG 240 Arg Pro Glu Gly Arg Ala Trp Ala Gln Pro Gly Ser Val Val Ile Val 65 70 75 GGT AGG ATC ATC TTG TCC GGG AGG CCG GCT GTT ATT CCC GAC AGG GAA 288 Gly Arg Ile Ile Leu Ser Gly Arg Pro Ala Val Ile Pro Asp Arg Glu 80 85 90 GTC CTC TAC CGG GAG TTC GAT TGATAAGGAT CC 321 Val Leu Tyr Arg Glu Phe Asp 95 100 配列番号：２ 配列の長さ：279 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類： ハイポセティカル： YES アンチセンス： NO 配列 ATCGAT ATG AAA GCT ATC TTC GTT CTG AAA GGT TCT CTG GAC CGT GAC 48 Met Lys Ala Ile Phe Val Leu Lys Gly Ser Leu Asp Arg Asp 1 5 10 CCA GAA TTC GCC TCA CAC CTC CCT TAC ATC GAA CAG GGA ATG CAG CTT 96 Pro Glu Phe Ala Ser His Leu Pro Tyr Ile Glu Gln Gly Met Gln Leu 15 20 25 30 GCC GAG CAA TTC AAG CAG AAG GCG CTC GGA TTG CTG CAA ACA GCC ACC 144 Ala Glu Gln Phe Lys Gln Lys Ala Leu Gly Leu Leu Gln Thr Ala Thr 35 40 45 AAG CAC GCG GAG GCT GCT GCT CCC GTG GTA GGT CGT GGG AGT GTG GTC 192 Lys His Ala Glu Ala Ala Ala Pro Val Val Gly Arg Gly Ser Val Val 50 55 60 ATT GTG GGT AGG ATC ATC TTG TCC GGG AGG CCG GCT GTT ATT CCC GAC 240 Ile Val Gly Arg Ile Ile Leu Ser Gly Arg Pro Ala Val Ile Pro Asp 65 70 75 AGG GAA GTC CTC TAC CGG GAG TTC GAT TGATAAGGAT CC 279 Arg Glu Val Leu Tyr Arg Glu Phe Asp 80 85 配列番号：３ 配列の長さ： 15 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ala Val Ile Pro Asp Arg Glu Ala Leu Tyr Gln Glu Phe Asp Glu 1 5 10 15 配列番号：４ 配列の長さ： 27 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Glu Cys Ala Ser His Leu Pro Tyr Ile Glu Gln Gly Met Gln Leu Ala 1 5 10 15 Glu Gln Phe Lys Gln Arg Ala Leu Gly Leu Leu 20 25 配列番号：５ 配列の長さ： 22 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Glu Gln Phe Lys Gln Arg Ala Leu Gly Leu Leu Gln Thr Ala Thr Lys 1 5 10 15 Gln Ala Glu Ala Ala Ala 20 配列番号：６ 配列の長さ： 16 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Val Val Val Thr Pro Asp Lys Glu Ile Leu Tyr Glu Ala Phe Asp Glu 1 5 10 15 配列番号：７ 配列の長さ： 27 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Glu Cys Ala Ser Lys Ala Ala Leu Ile Glu Glu Gly Gln Arg Met Ala 1 5 10 15 Glu Met Leu Lys Ser Lys Ile Gln Gly Leu Leu 20 25 配列番号：８ 配列の長さ： 22 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Glu Met Leu Lys Ser Lys Ile Gln Gly Leu Leu Gln Gln Ala Ser Lys 1 5 10 15 Gln Ala Gln Asp Ile Lys 20 配列番号：９ 配列の長さ： 20 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド ハイポセティカル： NO 配列 Phe Arg Gln Pro Ile Pro Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Thr Trp 1 5 10 15 Ala Gln Pro Gly 20 配列番号：１０ 配列の長さ： 20 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド ハイポセティカル： NO 配列 Arg Arg Gln Pro Ile Pro Lys Asp Arg Arg Ser Thr Gly Lys Ser Trp 1 5 10 15 Gly Lys Pro Gly 20
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 33/569 Ｌ 33/576 Ｚ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 千葉 幸江 埼玉県入間郡大井町西鶴ケ岡一丁目３番１ 号 東燃株式会社総合研究所内 (72)発明者 長谷川 明 埼玉県入間郡大井町西鶴ケ岡一丁目３番１ 号 東燃株式会社総合研究所内
Claims (12)
- 【請求項１】 Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ゲノムＲＮ
Ａ又はそのｃＤＮＡによってコードされるグループＩ
ＨＣＶ関連抗原上の異なる２つ以上のエピトープをペプ
チド性つなぎ目を介して接合して成る、グループＩ Ｈ
ＣＶ感染を特異的に判別するためのエピトープキメラ抗
原ペプチド。 - 【請求項２】 前記ペプチド性つなぎ目が抗原性をもた
ないか又は低抗原性であることを特徴とする請求項１記
載のエピトープキメラ抗原ペプチド。 - 【請求項３】 前記エピトープが、ＨＣＶのＮＳ４領域
又はコア領域上に存在することを特徴とする請求項１又
は２に記載のエピトープキメラ抗原ペプチド。 - 【請求項４】 前記エピトープが、配列番号３、４、５
及び９に示されるアミノ酸配列をもつペプチドから選択
されることを特徴とする請求項３記載のエピトープキメ
ラ抗原ペプチド。 - 【請求項５】 配列番号１又は２によって示されるアミ
ノ酸配列を有することを特徴とする請求項１記載のエピ
トープキメラ抗原ペプチド。 - 【請求項６】 Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ゲノムＲＮ
Ａ又はそのｃＤＮＡによってコードされるグループII
ＨＣＶ関連抗原上の異なる２つ以上のエピトープをペプ
チド性つなぎ目を介して接合して成る、グループII Ｈ
ＣＶ感染を判別するためのエピトープキメラ抗原ペプチ
ド。 - 【請求項７】 前記ペプチド性つなぎ目が抗原性をもた
ないか又は低抗原性であることを特徴とする請求項６記
載のエピトープキメラ抗原ペプチド。 - 【請求項８】 前記エピトープがＨＣＶのＮＳ４領域又
はコア領域上に存在することを特徴とする請求項６又は
７に記載のエピトープキメラ抗原ペプチド。 - 【請求項９】 前記エピトープが、配列番号６、７、８
及び１０に示されるアミノ酸配列をもつペプチドから選
択される、ことを特徴とする請求項８記載のエピトープ
キメラ抗原ペプチド。 - 【請求項１０】 請求項１〜９のいずれか一項に記載の
エピトープキメラ抗原ペプチドの製造方法であって、該
エピトープキメラ抗原ペプチドをコードするＤＮＡ断片
を作製する段階、該ＤＮＡ断片をベクターに組み込んで
複製可能な発現ベクターを構築する段階、該発現ベクタ
ーで宿主細胞を形質転換する段階、得られた形質転換体
を培養し、発現したペプチドを回収する段階を含むこと
を特徴とする前記方法。 - 【請求項１１】 請求項１〜５のいずれか一項に記載の
エピトープキメラ抗原ペプチド又は請求項６〜９のいず
れか一項に記載のエピトープキメラ抗原ペプチドと、Ｃ
型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に感染したと推定される試料
中のグループＩ又はグループII特異的な抗体との免疫学
的反応を行なった後、生成する抗原−抗体複合体の濃度
又は存在を測定することを含む、ＨＣＶグループ判定方
法。 - 【請求項１２】 請求項１〜９のいずれか一項に記載の
エピトープキメラ抗原ペプチドと、Ｃ型肝炎ウイルス
（ＨＣＶ）に感染したと推定される試料中のＨＣＶ関連
抗体との免疫学的反応を行なった後、生成する抗原−抗
体複合体の濃度又は存在を測定することを含む、ＨＣＶ
感染判定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23207394A JP3665371B2 (ja) | 1994-08-31 | 1994-08-31 | Ｃ型肝炎ウイルス感染又はグループ判定のためのエピトープキメラ抗原ペプチド、その製法、及びそれを使用する感染又はグループ判定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23207394A JP3665371B2 (ja) | 1994-08-31 | 1994-08-31 | Ｃ型肝炎ウイルス感染又はグループ判定のためのエピトープキメラ抗原ペプチド、その製法、及びそれを使用する感染又はグループ判定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0873497A true JPH0873497A (ja) | 1996-03-19 |
| JP3665371B2 JP3665371B2 (ja) | 2005-06-29 |
Family
ID=16933572
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP23207394A Expired - Lifetime JP3665371B2 (ja) | 1994-08-31 | 1994-08-31 | Ｃ型肝炎ウイルス感染又はグループ判定のためのエピトープキメラ抗原ペプチド、その製法、及びそれを使用する感染又はグループ判定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3665371B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6322965B1 (en) * | 1997-02-10 | 2001-11-27 | Advanced Life Science Institute, Inc. | Chimera antigen peptide |
| WO2005028503A1 (ja) * | 2003-09-22 | 2005-03-31 | Green Peptide Co., Ltd. | Ｃ型肝炎ウイルス由来ペプチド |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103472233A (zh) * | 2013-06-21 | 2013-12-25 | 温州大学 | 丙型肝炎检测试剂盒及其应用 |
Citations (7)
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|---|---|---|---|---|
| JPH04330098A (ja) * | 1990-11-03 | 1992-11-18 | Behringwerke Ag | Ｈｃｖ−特異的ペプチド、それらのための剤およびそれらの使用 |
| WO1993006247A1 (en) * | 1991-09-16 | 1993-04-01 | Abbott Laboratories | Hepatitis c assay |
| JPH05148298A (ja) * | 1990-02-16 | 1993-06-15 | United Biomedical Inc | Ｈｃｖに対する抗体の検出、ｈｃｖ感染の診断及びワクチンとしての予防に有用な合成ペプチド |
| JPH05508219A (ja) * | 1990-04-04 | 1993-11-18 | カイロン コーポレイション | 抗ｈｃｖ抗体の免疫アッセイに使用するｃ型肝炎ウイルス（ｈｃｖ）抗原の組合せ |
| JPH06500796A (ja) * | 1991-06-13 | 1994-01-27 | デイド、インターナショナル、インコーポレイテッド | 非ａ非ｂ肝炎のためのイムノアッセイ |
| EP0582243A2 (de) * | 1992-08-07 | 1994-02-09 | Roche Diagnostics GmbH | HCV Peptidantigene und Verfahren zur Bestimmung von HCV |
| JPH06505806A (ja) * | 1992-03-06 | 1994-06-30 | エヌ・ブイ・インノジェネティクス・ソシエテ・アノニム | 免疫学的に重要なエピトープに相当するペプチドの決定方法、及び免疫学的に重要なエピトープに相当するビオチニル化ペプチド又は抗体の決定のための方法におけるその利用、その調製方法及びそれを含む組成物 |
-
1994
- 1994-08-31 JP JP23207394A patent/JP3665371B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (7)
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| EP0582243A2 (de) * | 1992-08-07 | 1994-02-09 | Roche Diagnostics GmbH | HCV Peptidantigene und Verfahren zur Bestimmung von HCV |
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| WO2005028503A1 (ja) * | 2003-09-22 | 2005-03-31 | Green Peptide Co., Ltd. | Ｃ型肝炎ウイルス由来ペプチド |
| EA009782B1 (ru) * | 2003-09-22 | 2008-04-28 | Грин Пептайд Ко., Лтд. | Пептид, происходящий из вируса гепатита с |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3665371B2 (ja) | 2005-06-29 |
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| WO1991004341A1 (en) | Hdv-specific peptides |
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