JPH06141873A - Ｃ型肝炎ウイルス構成ポリぺプチドをコードする遺伝子が組み込まれたウイルスベクターおよびその利用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）構成ポリペプチ
ド発現用ベクター、このベクターを用いたＨＣＶ構成ポ
リペプチドの製造方法、及びこの利用法を提供する。 【構成】 ＨＣＶ構成ポリペプチドをコードする遺伝子
の上流に狂犬病ウイルスのＧ蛋白質のシグナル配列をコ
ードする遺伝子断片を組み込んだトランスファーベクタ
ーをバキュロウイルスに導入することによって得られる
ＨＣＶ構成ポリペプチドの高発現が可能なウイルスベク
ターを提供する。本発明により得られるＨＣＶ外被糖蛋
白は、Ｃ型肝炎診断法やワクチン材料として有効であ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はＣ型肝炎ウイルス構成ポ
リペプチド発現用ベクターに関する。さらに詳細には、
異種ウイルスのシグナル配列の下流にＣ型肝炎ウイルス
構成ポリペプチドをコードする遺伝子を組み込んだプラ
スミドを昆虫ウイルスに導入することによって得られる
ウイルスベクター、これを昆虫細胞に感染、培養するこ
とによって得られるＣ型肝炎ウイルス構成ポリペプチ
ド、及びこの利用法に関する。

【０００２】

【発明の背景及び従来技術】ウイルス性肝炎にはＡ型肝
炎(伝染性肝炎)とＢ型肝炎(血清肝炎)の２種類があるこ
とは古くから知られていた。これは主として感染経路の
相違に基づいたもので、Ａ型肝炎は経口感染で流行を起
こし、Ｂ型肝炎は主として血液を介して伝播されるもの
であることが確認された。これらの２つの肝炎の原因ウ
イルスは既に分離同定され、Ａ型肝炎ウイルスはピコル
ナウイルスに属する直径27nmのＲＮＡウイルスであり(F
inestone, S.M. et al., Science 182 p.1026(1973))、
一方、Ｂ型肝炎ウイルスはヘパドナウイルスに属する直
径42nmのエンベロープを有するＤＮＡウイルスであるこ
とが突き止められた(Dane, O.S., et al., Lancet,I p.
695(1970))。現在ではこれらの肝炎ウイルスの免疫血清
学的診断方法が確立され、その予防対応策もほぼ確立さ
れている。

【０００３】これらの２つの肝炎ウイルスの確定診断方
法が確立されるに従い、このいずれにも属さない非Ａ非
Ｂ型肝炎の存在が明らかになってきた(Prince,A.M.,et
al.,Lancet I p.241(1974))。輸血後肝炎は、Ｂ型肝炎
ウイルス表面抗原(HBsAg)のスクリーニングの導入によ
り大幅に減少したがゼロにはならず、しかも、発生した
肝炎患者からは、Ａ型、Ｂ型肝炎の感染の証拠は得られ
なかった。このことから、この肝炎は一般に非Ａ非Ｂ型
肝炎と呼ばれた。この種の肝炎は、わが国では散発性肝
炎の約50％、輸血後肝炎の約90％以上にのぼり、さらに
慢性肝炎、肝硬変、肝癌の50％以上が非Ａ非Ｂ型肝炎に
起因すると推定されており大きな社会問題となってい
る。

【０００４】これとは別に、インド、ミャンマー、アフ
ガニスタン、または北アフリカなどで経口感染で流行す
る第２のウイルス性非Ａ非Ｂ型肝炎が存在することが明
らかになった(Khuroo,M.S. Am.J.Med., 68 p.818(198
0))。これは、一般には水系、または流行性非Ａ非Ｂ型
肝炎と呼ばれている。わが国では、この肝炎の流行は観
察されていないが、渡航者による流行地からの肝炎の輸
入は若干観られるようである(福原ら、第25回日本肝臓
学会総会講演要旨集)。

【０００５】本発明は、上記で言う前者の主に血液を介
して感染する血液型非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスに関するも
のであり、本明細書中ではこのウイルスをＣ型肝炎ウイ
ルス（ＨＣＶ）と呼ぶ。

【０００６】Ｃ型肝炎は、患者血清中のウイルス濃度が
10²〜10³と低いこと、同じ接種材料で再感染を起こした
チンパンジーが存在するなど抗体の存在が疑わしいこ
と、感染実験モデルがチンパンジー、マーモセットに限
られることなどの問題点のため、その研究に困難を来た
している。このため、Ｃ型肝炎については未だウイルス
本体の分離同定はなされておらず、また、この種類の肝
炎の治療法、及び予防法は確立されてはいない。この肝
炎の病因ウイルスが感染性を有することは、1978年アメ
リカの研究グループにより、チンパンジーを用いた感染
実験で証明された(Tabor,E.,et al., Lancet I p.463(1
978))。しかし、世界中の多くの努力にもかかわらず、1
0年以上経た現在も、病因ウイルスの実態は判明してい
ない。

【０００７】最近になってＨＣＶのｃＤＮＡを捕らえた
という報告が米国のカイロン社(Choo,Q. et al., Scien
ce, 244, p.359(1989); Kuo,G.et al.,Science, 244,p.
362(1989))、及び、自治医科大学の岡本ら(日本肝臓学
会、1990年)によって相次いで発表され、このウイルス
遺伝子の全容が明らかにされつつある。

【０００８】しかし、Ｃ型肝炎の直接的な診断法や将来
のワクチン材料の候補として、ＨＣＶの構造蛋白の同定
とその抗原抗体検出系の確立が所望されているが、現在
のところ、当該構造蛋白を効率的に発現させた例はな
い。

【０００９】

【発明の目的】このような状況のもとに、本発明者らは
質、量の両面において効率のよいＨＣＶ構造蛋白の発現
を目的として研究を重ねた結果、狂犬病ウイルスのＧ蛋
白のシグナル配列を導入したプラスミドを含有するバキ
ュロウイルスをベクターとする発現系（ウイルスベクタ
ー）を構築することにより、ＨＣＶ外被糖蛋白の発現量
を飛躍的に上昇させ、且つ培地中へ分泌させることに成
功した。かかる効果により発現産物は培養上清から容易
に短時間で精製できるようになり、精製標品の性状も安
定となった。さらに、本発明のウイルスベクターは、外
被糖蛋白のみならず非構造蛋白質のポリメラーゼやプロ
テアーゼと推定される蛋白質の分泌発現にも応用可能で
ある。

【００１０】すなわち、本発明は、発現と回収が極めて
困難であるＨＣＶ構成ポリペプチドを高効率で発現可能
なウイルスベクター、このベクターを用いたＨＣＶ構成
ポリペプチドの製造方法及びこのようにして得られた発
現蛋白の利用法を提供するものである。

【００１１】

【発明の構成及び効果】カイロン社は、1989年ＨＣＶの
ｃＤＮＡを報告した後、さらに、米国人Ｃ型肝炎患者血
清由来のＨＣＶの全塩基配列を初めて報告した（欧州特
許公開公報：EP388232，1990年９月19日公開）。本発明
者らも、日本人Ｃ型肝炎患者血清よりＨＣＶに由来する
抗原ペプチド配列をコードしている遺伝子をクローニン
グすることに成功し、全塩基配列を決定している（特願
平3-203884）。その結果、ＨＣＶは約10kbのプラス鎖Ｒ
ＮＡウイルスで、アミノ酸の親水／疎水性プロフィール
からフラビあるいはペスティウイルスに近縁なウイルス
であることが明らかとなった。この塩基配列から予測さ
れるアミノ酸配列をもとにDoolitleらの手法に基づき親
水性／疎水性領域の解析を行ない近縁のペスティウイル
スとの比較を行なった結果、ポリペプチドのＮ端側は構
造蛋白質で、Ｃ端側は非構造蛋白質、さらにポリペプチ
ドのＮ端よりコア蛋白質、続いて 162〜363位及び364〜
729位に２つの外被糖蛋白質の存在が示唆された。これ
らの外被糖蛋白質を仮にE-1及びE-2と呼ぶ。これら外被
糖蛋白質はウイルス表面抗原と考えられることから、中
和モノクローナル抗体の作製やワクチン開発の第１のタ
ーゲットとなるものであり、免疫学的見地から非常に意
義深いものと思われる。本発明者らはウイルス構造蛋白
の同定とその抗原抗体系の確立ならびにワクチン開発を
目的として、外被糖蛋白と考えられる領域に着目し、当
該蛋白の発現を試みた。

【００１２】本発明に用いられるＨＣＶ遺伝子として、
特にＨＣＶの外被糖蛋白領域をコードする遺伝子断片が
挙げられる。例えば、好ましくは配列表配列番号１記載
のアミノ酸配列のうち、アミノ酸順位で162〜363位また
は364〜729位をコードする塩基配列またはその一部から
なる遺伝子断片である。さらに好ましくは、アミノ酸順
位で192〜330位または390〜683位をコードする塩基配列
を含む遺伝子断片である。また、本発明において、ＨＣ
Ｖ遺伝子として、Ｃ型肝炎の非構造蛋白質のポリメラー
ゼやプロテアーゼと推定される蛋白領域をコードする遺
伝子断片も使用可能である。配列表配列番号１記載のア
ミノ酸及び塩基配列は、日本人Ｃ型肝炎患者血清由来の
ものであるが、株が異なるＨＣＶ遺伝子断片も本発明に
より発現可能である。

【００１３】本発明は、ＨＣＶ構成ポリペプチドの効率
の良い発現用ベクターとして、翻訳後の修飾を受け培地
中への分泌発現が可能なウイルスベクターを使用するこ
とを提案する。使用しうるウイルスの中ではバキュロウ
イルスとりわけオートグラファ・カリフォルニカ・核多
核体病ウイルス(AcNPV)を特に挙げることができる。昆
虫ウイルスであるバキュロウイルスは、殺虫剤としての
応用を目的とした研究が長く行なわれてきたが、発現ベ
クターとしての可能性をSmithらが示して以来この方面
の研究が盛んになった。バキュロウイルス発現系は高効
率な蛋白質の産生と本来の蛋白質と同等な修飾が期待で
きることから、さまざまな異種抗原の発現に用いられて
いる。これまでにもいくつかの研究グループがヒト免疫
不全ウイルス抗原、単純ヘルペスウイルス抗原などを発
現させ、この発現系を用いる有効性を証明している。

【００１４】そこで、先に本発明者らは、バキュロウイ
ルス−昆虫細胞系を構築し、ＨＣＶ外被糖蛋白の発現を
試みたが、その発現量は0.1μg/ml以下という極めて微
量であり、かつ発現蛋白は感染細胞破壊後の不溶性画分
に局在しているために、該蛋白質を界面活性剤なしに回
収することは不可能であった。

【００１５】このように、ＨＣＶ構成ポリペプチドの場
合には非常に発現効率が悪く、現状のままでは産業上の
利用に耐えうるものではない。これはバキュロウイルス
の発現系のみならず、翻訳後の修飾が期待される他の発
現系すなわち酵母や動物細胞を用いても発現効率は非常
に悪いのが現状である。事実、これまでのところＨＣＶ
の外被糖蛋白の効率の良い発現ならびに産物の精製に関
する報告はまだない。

【００１６】本発明においてＨＣＶ蛋白を高発現させる
ために、ＨＣＶのシグナル様配列を異種ウイルス由来の
シグナル配列で置換することを提案する。例えば、狂犬
病ウイルスのＧ蛋白のシグナル配列をコードする遺伝子
断片を目的のＨＣＶ遺伝子断片と結合させ、昆虫ウイル
スに導入した組換えウイルスベクターを用いると、本来
のシグナル様配列を有するＨＣＶ遺伝子断片の場合と比
較して、目的とする蛋白の発現量を、約50倍以上に上昇
させることができる。本発明に用いられるシグナル配列
として、好ましくは、下記のアミノ酸配列をコードする
塩基配列を含む遺伝子断片が用いられる。 Met Val Pro Gln Ala Leu Leu Leu Val Pro Ile Leu Gly Phe Ser Ser Cys Phe Gly Lys Phe

【００１７】さらに好ましくは、下記塩基配列からなる
遺伝子断片が用いられる。 AGACTTAGGG AAAG ATG GTT CCG CAA GCT CTT CTG CTT GTA CCC ATT CTG GGT TTT TCC TCG TGT TTC GGG AAA TTC 上記アミノ酸配列及び塩基配列は配列表配列番号２に記
載している。

【００１８】当該シグナル配列をコードする遺伝子断片
は、狂犬病ウイルスのＧ蛋白をコードする遺伝子断片を
鋳型とし、図１(c)に示したプライマーを用いたＰＣＲ
法により増幅して得られる。また、当該シグナル配列を
コードする遺伝子断片は、上記塩基配列を基にＤＮＡ合
成機を用いて得ることもできる。なお、当該シグナル配
列をコードする遺伝子断片を組み込んだプラスミドは、
大腸菌に導入された状態で、Escherichia coli DH5α/p
UC-N913：微工研条寄第1631号（FERM BP-1631）として
寄託されている。

【００１９】目的遺伝子をウイルスベクター内に導入す
るためには、目的遺伝子を組み込むベクターとして、バ
キュロウイルスゲノムと細胞内相同的組換えが可能なト
ランスファーベクターを選択する必要がある。このよう
なトランスファーベクターとして、バキュロウイルス由
来のポリヘドリンプロモーターを含有するベクターが挙
げられる。このようなベクターの好ましい一例として、
pVL1393（フナコシ社）などのように市販の物を使用す
ることができる。そして、このトランスファーベクター
のポリヘドリンプロモーター下流に狂犬病ウイルスＧ蛋
白のシグナル配列及びＨＣＶ遺伝子を結合させた融合遺
伝子断片を挿入した組換えトランスファーベクターを構
築する。

【００２０】当該組換えトランスファーベクターを野性
株のバキュロウイルス、例えばAcNPVのＤＮＡととも
に、昆虫細胞にトランスフェクションすると、当該トラ
ンスファーベクター内のポリヘドリンプロモーター領域
とAcNPVのＤＮＡ内のポリヘドリンプロモーター領域が
細胞内相同的組換えを起こすことによって、目的のＨＣ
Ｖ遺伝子が挿入された組換えバキュロウイルスが得られ
る。この組換えバキュロウイルスを昆虫細胞に感染さ
せ、最終的にはＣ型肝炎患者血清を用いたウエスタンブ
ロットを行ない、該蛋白質を発現する組換えバキュロウ
イルスを作出する。本発明に用いられる昆虫細胞の好ま
しい一例として、スポドプテラフルペギルダ（Sf）が挙
げられる。

【００２１】このように純化された組換えバキュロウイ
ルスを感染しやすい昆虫細胞（Sf）に感染させ27℃の生
育条件下で培養を行ない、適当な培養時間後培養液を遠
心して上清を回収し、公知の分離精製方法で発現蛋白を
精製回収する。

【００２２】精製方法の一例としては、Ni²⁺ ニトリロ
トリ酢酸（Ni²⁺-NTA）アガロースゲルを用いたアフィニ
ティークロマトグラフィーが好ましい。この場合、得ら
れるＨＣ蛋白のＣ端に６個のヒスチジンが付加するよう
に、ＰＣＲ用のプライマー配列を設定しておく必要があ
る（図１(a)DNA38及び(b)DNA31）。

【００２３】従来の遺伝子組換えによる発現法では、Ｈ
ＣＶ蛋白質は細胞内に局在し、細胞破壊後も不溶性画分
に蓄積するため回収が極めて困難であり、また発現量も
微量であった。しかしながら、ＨＣＶ本来のシグナル様
配列を異種ウイルスのシグナル配列で置換したＨＣＶ遺
伝子断片を組み込んだプラスミドを含有するウイルスベ
クターを用いると、ＨＣＶ蛋白の培地中への分泌発現が
飛躍的に上昇し、発現蛋白質の回収が容易となった。そ
の結果、発現量は5〜10μg/mlを達成し、ＨＣＶ本来の
シグナル様配列の場合と比較して50倍以上上昇した。

【００２４】本発明により得られるＨＣＶ外被糖蛋白を
用いると、血清中の抗ＨＣＶ抗体の検出が可能な免疫学
的測定系の構築が可能である。また、当該蛋白を動物に
免疫することにより抗ＨＣＶ抗体を得ることができ、得
られる抗ＨＣＶ抗体はＨＣＶ及びこの関連抗原の免疫学
的検出に使用可能である。さらに、本発明のＨＣＶ外被
糖蛋白はＨＣワクチンとしての応用も可能である。

【００２５】最近では蛋白質のエピトープ解析、あるい
は抗体測定試薬の開発に合成ペプチドが用いられるよう
になってきたが、この方法ではシークエンシャルなエピ
トープを捕らえることはできても、蛋白質の高次構造や
糖鎖に対するエピトープを捕らえることは困難である。
本発明で得られる蛋白質は上述のような問題を含むこと
なく、Ｃ型肝炎関連抗体測定試薬やワクチンとしての利
用に適した蛋白質である。

【００２６】以下、実施例に沿って本発明を更に詳細に
説明するが、これらの実施例は本発明の種々の具体例を
説明するものであって、本発明はこれらの実施例に限定
されるものではない。

【００２７】

【実施例】（１）ＰＣＲ法によるＨＣＶ外被糖蛋白をコードする遺
伝子断片の増幅 Ｃ型肝炎患者血清由来のＨＣＶの外被糖蛋白領域、E-1
(162〜363位)またはE-2(364〜729位)領域をコードする
遺伝子断片を鋳型とし、図１(a)(b)に示した遺伝子断
片、37及び38または30及び31をそれぞれプライマーとし
て、ＰＣＲ法を用いて増幅した。具体的には、10mM Tri
s-HCl pH8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂, 0.01％ゼラチ
ン, 100 nM dNTPs, 100 pM プライマー, 20 U/ml Taq p
olymerase の混液100μl中で94℃ 30 秒, 55℃ 30秒, 7
2℃ １分を１サイクルとして35サイクル反応させた（パ
ーキンエルマーシータス社製のサーマルサイクラーを使
用）。各々のアンチセンスのプライマーには5'側に６個
のヒスチジンが付加するようにプライマー配列を設定し
た。ＰＣＲ法によって増幅した遺伝子断片E-1およびE-2
をフェノール／クロロホルムで抽出精製後、これを制限
酵素XhoＩとEcoRＩで消化した。

【００２８】（２）ＰＣＲ法による狂犬病ウイルスＧ蛋
白のシグナル配列の増幅 Escherichia coli DH5α/pUC-N913（微工研条寄第1631
号(FERM BP-1631)）より得られる狂犬病ウイルスのＧ蛋
白コードする遺伝子断片を鋳型とし、図１(c)に示した
遺伝子断片をプライマーとして、実施例（１）と同様に
ＰＣＲ法で、該蛋白のシグナル配列部位を増幅し、得ら
れた遺伝子断片をXbaＩとXhoＩで消化した。

【００２９】（３）組換えトランスファーベクターの構
築 プラスミドpcDNA II（インヴィトロジェン社製）をXba
ＩとXhoＩで消化し、フェノール／クロロホルムで抽出
精製後、このプラスミドと先のXbaＩとXhoＩで消化した
狂犬病ウイルスＧ蛋白のシグナル配列を混合し、修飾酵
素T4 DNA ligaseを作用させて連結反応を行なった。連
結反応は宝酒造社製のライゲーションキットのプロトコ
ールに従って行なった。

【００３０】Methods in ENZYMOLOGY Vol. 152 p153に
従い、大腸菌 JM109 を形質転換し、アンピシリン 50μ
g/ml を含む寒天培地で生育してくるコロニーからプラ
スミドを調製した。このようにして得られた狂犬病Ｇ蛋
白のシグナル配列を含むプラスミドを pcKGss と命名し
た。

【００３１】このプラスミドを XhoＩと EcoRＩで消化
し、フェノール／クロロホルムで抽出精製した。先にＰ
ＣＲ法で増幅し、XhoＩと EcoRＩで消化しておいたE-
1、E-2の遺伝子断片を同様の手法を用いて pcKGss のXh
oＩ- EcoRＩの部位に挿入した。このようにして得られ
た狂犬病Ｇ蛋白シグナルとE-1あるいはE-2との融合遺伝
子を含むプラスミドを pcKGss3738 あるいは pcKGss303
1 と各々命名した。

【００３２】組換えトランスファーベクターを構築する
ために、次にpcKGss3738, pcKGss3031を XbaＩで消化し
更にT4 DNA polymerase で切断部位を平滑末端に修復し
た。これに 0.2μg/ml の EcoRＩリンカーを２μl加え
てリンカーライゲーションを行ない、XbaＩの認識配列
を EcoRＩに変更した。これを EcoRＩで消化し、挿入遺
伝子断片を１％のアガロースゲルにて回収した。遺伝子
断片の大きさは E-1の場合約455 bp で、 E-2 の場合約
１kb であった。これらの EcoRＩ遺伝子断片を EcoRＩ
で消化後脱リン酸化したトランスファーベクター pVL13
93 （フナコシ社）に挿入した。ライゲーション反応は
前述の宝酒造社製のライゲーションキットで行なった。
このようにして E-1、E-2 の組換えトランスファーベク
ター pVLKGss3738（図２）および pVLKGss3031 を得た
（図３）。

【００３３】また、E-1、E-2の本来のシグナル様配列を
含む組換えトランスファーベクターpVL3638（図２）及
びpVL2931（図３）を実施例（１）〜（３）と同様にし
て得た。この際、E-1増幅用のプライマーには図１(a)の
36及び38を、E-2増幅には図１(b)の29及び31のプライマ
ーを使用した。

【００３４】（４）組換えバキュロウイルスの作出 組換えバキュロウイルスの作出は基本的には Summers
と Smith らの方法に従った(Summers, M. D. and Smit
h, G. E. (1987) "A Manual of Methods for Baculovir
us Vectors and Insect Cell Culture Procedures." Te
xas AgriculturalExperimental Station Bulletin No.
1555 )。親株には AcNPV 由来の AcRP23-LacZ を用い
た。このウイルスはポリヘドリンプロモーターの下流に
LacZ 遺伝子が挿入しており、X gal(5-Bromo-4-chloro-
3-indolyl-β-D-galactopyranoside)入りのアガロース
プレート上で青色のプラークを形成するが、相同的組換
えを起こした組換えバキュロウイルスでは透明なプラー
クを形成するようになる。このウイルスＤＮＡ 100 ng
と組換えトランスファーベクター pVLKGss3738 1μgあ
るいは pVLKGss3031 1μg を混合し、蒸留水で 10μl
とした。これに１mg/mlのリポフェクチン４μl（ＢＲＬ
社製）と蒸留水４μlを添加し、添付のプロトコールに
従い、昆虫細胞 Sf21 にコトランスフェクションを行な
った。

【００３５】27℃ 48 時間培養後上清を回収し、これを
10％ＦＣＳを含む TC100（ギブコ社製）培地で 10倍お
よび 100倍に希釈してプラークアッセイを行なった。感
染３日後 300μg/mlとなるように X galを添加し、翌日
にニュートラルレッドで染色した。プラークの中から透
明なプラークを選別し組換えバキュロウイルス VLKGss3
738 および VLKGss3031 を作出した。組換えバキュロウ
イルスが各々 E-1および E-2 を発現していることをＣ
型肝炎患者血清を用いたウエスタンブロット法で確認し
た。

【００３６】また、E-1、E-2の本来のシグナル様配列を
含む組換えバキュロウイルスVL3638及びVL2931を上記と
同様にして得た。

【００３７】（５）組換えバキュロウイルスによる E-1
の発現 35 mm ディッシュに昆虫細胞 Sf 21 を 1.0〜1.5×106
／dish となるように 10％ＦＣＳ入り TC 100 で希釈し
てまいた。細胞がディッシュに着床するまで約20分間室
温に静置後、上清を吸引除去して組換えウイルス VLKGs
s3738 (約３×107pfu／ml ) 100μl を接種した。室温
に１時間静置してウイルスが充分に細胞に吸着した後、
無血清培地 Sf 900（ギブコ社製）をディッシュあたり
約２ml 注入した。27℃ 72 時間培養後遠心分離により
細胞を集め、100μl の PBS (８mM NaH₂PO₄, 1.5 mM KH
₂PO₄, 140 mM NaCl, 27 mM KCl) に懸濁した。

【００３８】一方、培養上清をセントリコン10（アミコ
ン社製）で遠心により20〜40倍に濃縮した。これらの懸
濁液ならびに濃縮液について下記の SDS-PAGE、ウエス
タンブロット法で抗原産生の有無を調べた。

【００３９】すなわち、サンプルを等量のサンプル処理
バッファー（10 mM Tris - HCl pH7.5, 10％ SDS, ５％
２ME, 25％ glyserol, 0.02％ BPB)と混合し、３分間
煮沸した後 10〜20％のグラディエントＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲルで電気泳動を行なった。電気泳動した
サンプルを 0.25％ CBB(Coomassie Brilliant Blue R-2
50 ナカライテスク社製）溶液で染色した。また、同様
に電気泳動したサンプルをセミドライエレクトロブロッ
ター（ザルトリウス社製）で電気的にイモビロン PVDF
トランスファーメンブラン（ミリポア社製）に移行し、
該フィルターを５％ スキムミルク溶液で１時間室温で
反応させ、次にＣ型肝炎患者血清と１時間反応させた。
フィルターを TBST (50 mM Tris−HCl pH7.9, 150 mM N
aCl, 0.05％Tween 20 )で洗浄後、抗ヒト IgG アルカリ
フォスファターゼ結合抗体（バイオラッド社製）と室温
で１時間反応させた。TBST で洗浄後発色基質 BCIP (5-
Bromo-4-chloro-3-indolylphosphate-p-Toluidine Sal
t)と NBT(Nitroblue Tetrazolium chloride )（ギブコ
社製）を指定量加えて発色させた。その結果、培養上清
の濃縮液中に分子量約 28kDa, 25kDaならびに22kDa の
バンドが検出された。これらのバンドは N-グリカナー
ゼ処理で消失し、新たに 17 kDa のバンドが観察される
ことから糖蛋白であることが判明した（図４）。この 1
7 kDa のバンドは本発明の E-1 の遺伝子断片から推定
される分子量とほぼ一致した。

【００４０】一方、E-1 の本来のシグナル様配列を含む
組換えバキュロウイルス VL3638 を感染させた昆虫細胞
の培養上清にも 28 kDa, 25kDa, 22kDa のバンドが検出
できたが、極めて微量であった（図４）。

【００４１】陰性対象である野生株 AcNPV を感染させ
た昆虫細胞を用いた場合には細胞懸濁液中にも培養上清
濃縮液中にもＣ型肝炎患者血清と反応するバンドは見ら
れなかった（図４）。

【００４２】（６）組換えバキュロウイルスによる E-2
の発現 （５）と同様の方法で組換えバキュロウイルス VLKGss3
031 を昆虫細胞に感染させ、細胞懸濁液ならびに培養上
清の濃縮液を SDS-PAGE、ウエスタンブロット法にかけ
抗原性の有無を調べた。その結果、培養上清の濃縮液中
には分子量約 45 kDa のバンドが検出された。このバン
ドは N-グリカナーゼ処理で消失し、新たに 35 kDa の
バンドが検出されることから糖蛋白であることが判明し
た（図５）。この35 kDa のバンドは本発明の E-2 の遺
伝子断片から推定される分子量とほぼ一致した。また、
細胞懸濁液中には 35 kDa から 46 kDa にかけて複数の
バンドが検出された。

【００４３】一方, E-2 の本来のシグナル様配列を含む
組換えバキュロウイルス VL2931 を感染させた昆虫細胞
の培養上清にも 45 kDa のバンドが検出されたが、極め
て微量であった（図５）。

【００４４】陰性対象である野生株 AcNPV を感染させ
た昆虫細胞では、細胞懸濁液中にも培養上清濃縮液中に
もＣ型肝炎患者血清と反応するバンドは見られなかった
（図５）。

【００４５】（７）E-2 蛋白質の精製 E-2 のＣ端には６個のヒスチジンが付加するようにトラ
ンスファーベクターを構築しているので、発現蛋白を N
i²⁺−NTA アガロースゲル（キアゲン社）を用いたアフ
ィニティークロマトグラフィーで精製した。VLKGss3031
組換えウイルスを昆虫細胞に感染させた培養上清 30 ml
をセントリコン10 で濃縮後等量のバッファー A-1 (10
mM Hepes pH7.9, 5 mM MgCl₂, 0.1 mM EDTA, 1 mM DT
T, 0.1 mMPMSF, 10 mM NaF, 830 mM NaCl, 34％ glycer
ol, 1.6 mM imidazole)と混和し、４℃で 45 分間撹拌
した。これを 15,000 rpm 10 分間遠心後上清を回収
し、0.5 ml の Ni²⁺−NTA アガロースゲルと４℃で１時
間撹拌した。サンプルの吸着したアガロースゲルをカラ
ムに詰め、８mM イミダゾールを含むバッファーＤ（10
mM Hepes pH7.9, 5 mM MgCl₂, 0.1 mM EDTA, 50 mM NaC
l, １mM DTT, 17％glycerol, 0.1 mM PMSF, 10 mM Na
F)で洗浄した。

【００４６】次に、バッファーＤに 80 mM のイミダゾ
ールを加え、これを溶出液として E-2 を溶出させた。
このワンステップの精製法で SDS-PAGE 後の CBB 染色
で単一バンドとなるまで精製することができた（図
６）。

【００４７】このように、これまで大量発現ならびに精
製が困難であったＨＣＶの外被糖蛋白を、狂犬病ウイル
スのＧ蛋白のシグナルを利用して大量に分泌発現させる
ことに成功した。その結果精製も容易となった。

【００４８】（８）精製 E-2 蛋白質による E-2 抗体の
測定 （５）の方法で精製したE-2蛋白質を用いてELISA系を構
築し、非Ａ非Ｂ型肝炎患者血中のE-2抗体を調べた。精
製E-2蛋白質を１μg/mlとなるように0.05M Carbonate b
uffer (pH9.8), 0.02％ NaN₃で希釈し、ヌンク社製のEL
ISAプレートに各ウェルあたり100μlずつ分注し、37℃
１時間あるいは４℃に一晩静置した。抗原を回収後、10
％スキムミルクの入ったPBST(0.15 M PBS pH7.4, 0.05
％ Tween20)溶液を各ウェルに滴下し１時間37℃で反応
させた。次に、10％スキムミルク-PBSTで100倍に希釈し
た患者血清を各ウェルに100μlずつ滴下して1時間37℃
で反応させた。血清を吸引除去後各ウェルをPBSTで５回
洗浄し、抗ヒトIgGパーオキシダーゼ結合抗体（バイオ
ラッド社製）と１時間37℃で反応させた。PBSTで洗浄
後、テトラメチルベンジジン（TMBZ）溶液を200μl加え
て発色させ、450nmの吸光度を測定してE-2抗体を調べ
た。

【００４９】慢性非Ａ非Ｂ型肝炎患者30例、肝硬変患者
16例、正常人10例を調べた結果、表１に示したように、
E-2抗体陽性者はそれぞれ29例 (96％)、14例 (88％)、0
(0％) であり、E-2抗体測定がＣ型肝炎の診断に有効で
あることが示された。

【００５０】

【表１】

【００５１】（９）E-1, E-2蛋白質に対するマウス抗体
の調製 各精製E-1およびE-2蛋白質をマウスあたり10μgずつフ
ロイントコンプリートアジュバントを用いて腹腔に接種
した。接種2週後に各抗原を10μgずつ追加免疫し、更に
６日後に採血して抗体産生の有無をウエスタンブロット
法で調べた。実施例（３）に従い５％スキムミルクTBST
で100倍希釈したマウス抗血清を用いてウエスタンブロ
ットを行なった。その結果、E-1およびE-2に対する抗体
が誘導されていることを確認した（図７）。

【００５２】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：9391 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（cDNA to viral RNA） 起源 生物名：非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス 配列 CACTCCCCTG TGAGGAACTA CTGTCTTCAC GCAGAAAGCG TCTAGCCATG GCGTTAGTAT 60 GAGTGTCGTG CAGCCTCCAG GACCCCCCCT CCCGGGAGAG CCATAGTGGT CTGCGGAACC 120 GGTGAGTACA CCGGAATTGC CAGGACGACC GGGTCCTTTC TTGGATCAAC CCGCTCAATG 180 CCTGGAGATT TGGGCGTGCC CCCGCAAGAC TGCTAGCCGA GTAGTGTTGG GTCGCGAAAG 240 GCCTTGTGGT ACTGCCTGAT AGGGTGCTTG CGAGTGCCCC GGGAGGTCTC GTAGACCGTG 300 CACC ATG AGC ACG AAT CCT AAA CCT CAA AGA AAA ACC AAA CGT AAC ACC 349 Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr 1 5 10 15 AAC CGC CGC CCA CAG GAG GTC AAG TTC CCG GGC GGT GGT CAG ATC GTT 397 Asn Arg Arg Pro Gln Glu Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val 20 25 30 GGT GGA GTT TAC CTG TTG CCG CGC AGG GGC CCC AGG TTG GGT GTG CGC 445 Gly Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg 35 40 45 GCG ATC AGG AAG ACT TCC GAG CGG TCG CAA CCC CGT GGA AGG CGA CAG 493 Ala Ile Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln 50 55 60 CCT ATC CCC AAG GCT CGC CGG CCC GAG GGC AGG GCC TGG GCT CAG CCC 541 Pro Ile Pro Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Ala Trp Ala Gln Pro 65 70 75 GGG TAT CCT TGG CCC CTC TAT GGC AAT GAG GGC ATG GGG TGG GCA GGA 589 Gly Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Met Gly Trp Ala Gly 80 85 90 95 TGG CTC CTG TCA CCC CGC GGC TCC CGG CCT AGT TGG GGC CCC ACG GAC 637 Trp Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp 100 105 110 CCC CGG CGT AGG TCG CGT AAT TTG GGT AAG GTC ATC GAT ACC CTC ACA 685 Pro Arg Arg Arg Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr 115 120 125 TGC GGC CTC GCC GAC CTC ATG GGG TAC GTT CCG CTC GTC GGC GGC CCC 733 Cys Gly Leu Ala Asp Leu Met Gly Tyr Val Pro Leu Val Gly Gly Pro 130 135 140 CTA GGG GGC GCT GCC AGG GCC TTG GCA CAT GGT GTC CGG GTT CTG GAG 781 Leu Gly Gly Ala Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu 145 150 155 GAC GGC GTG AAC TAT GCA ACA GGG AAC ATG CCC GGT TGC TCT TTT TCT 829 Asp Gly Val Asn Tyr Ala Thr Gly Asn Met Pro Gly Cys Ser Phe Ser 160 165 170 175 ATC TTC CTC TTG GCT CTG CTG TCC TGT CTG ACC GTA CCA GCT TCC GCT 877 Ile Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Leu Thr Val Pro Ala Ser Ala 180 185 190 CAT GAG GTG CGT AAC GCG TCC GGG GTA TAC CAT GTC ACG AAC GAC TGC 925 His Glu Val Arg Asn Ala Ser Gly Val Tyr His Val Thr Asn Asp Cys 195 200 205 TCC AAC TCA AGC ATT GTG TTT GAG GCG GCG GAC TTG ATC ATG CGT ACT 973 Ser Asn Ser Ser Ile Val Phe Glu Ala Ala Asp Leu Ile Met Arg Thr 210 215 220 CCC GGG TGC GTG CCC TGC GTT CGG GAG GGT AAC TCC TCC CGC TGC TGG 1021 Pro Gly Cys Val Pro Cys Val Arg Glu Gly Asn Ser Ser Arg Cys Trp 225 230 235 GTA GCG CTC ACT CCC ACG CTC GCG GCC AGG AAT GCT ACC ATC CAC ACT 1069 Val Ala Leu Thr Pro Thr Leu Ala Ala Arg Asn Ala Thr Ile His Thr 240 245 250 255 ACG ACA ATA CGA CAC CAC GTC GAT TTG CTC GTT GGG GCG GCT GCT CTC 1117 Thr Thr Ile Arg His His Val Asp Leu Leu Val Gly Ala Ala Ala Leu 260 265 270 TGC TCT GCT ATG TAC GTG GGG GAC CTC TGC GGA TCT GTT TTC CTC GTC 1165 Cys Ser Ala Met Tyr Val Gly Asp Leu Cys Gly Ser Val Phe Leu Val 275 280 285 TCT CAG CTG TTC ACC TTC TCG CCC CGC CGG CAT GCG ACA TTG CAG GAC 1213 Ser Gln Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg Arg His Ala Thr Leu Gln Asp 290 295 300 TGC AAT TGT TCG ATC TAC CCC GGC CAC GCG TCA GGT CAC CGC ATG GCC 1261 Cys Asn Cys Ser Ile Tyr Pro Gly His Ala Ser Gly His Arg Met Ala 305 310 315 TGG GAC ATG ATG ATG AAC TGG TCA CCT ACA ACA GCC CTC GTA GTG TCG 1309 Trp Asp Met Met Met Asn Trp Ser Pro Thr Thr Ala Leu Val Val Ser 320 325 330 335 CAG TTA CTC CGG ATC CCA CAA GCC GTC ATC GAC ATG GTG GCG GGG GCC 1357 Gln Leu Leu Arg Ile Pro Gln Ala Val Ile Asp Met Val Ala Gly Ala 340 345 350 CAC TGG GGA GTC CTG GCG GGC CTT GCC TAC TAT TCC ATG GCG GGG AAC 1405 His Trp Gly Val Leu Ala Gly Leu Ala Tyr Tyr Ser Met Ala Gly Asn 355 360 365 TGG GCT AAG GTT TTG ATT GTG ATG CTA CTT TTT GCC GGC GTT GAC GGG 1453 Trp Ala Lys Val Leu Ile Val Met Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp Gly 370 375 380 CAC ACC CTC ACA ACG GGG GGG CAC GCT GCC CAC CTC ACC AGC GGG TTC 1501 His Thr Leu Thr Thr Gly Gly His Ala Ala His Leu Thr Ser Gly Phe 385 390 395 GCG GGC CTC TTT ACA CCT GGG CCG TCT CAG AGA ATC CAG CTT ATA AAC 1549 Ala Gly Leu Phe Thr Pro Gly Pro Ser Gln Arg Ile Gln Leu Ile Asn 400 405 410 415 ACC AAT GGC AGT TGG CAC ATC AAC AGG ACT GCC CTG AAC TGC AAT GAC 1597 Thr Asn Gly Ser Trp His Ile Asn Arg Thr Ala Leu Asn Cys Asn Asp 420 425 430 TCC CTC CAG ACT GGG TTC CTT GCC GCC CTG TCC TAC ACA TAC AGG TTC 1645 Ser Leu Gln Thr Gly Phe Leu Ala Ala Leu Ser Tyr Thr Tyr Arg Phe 435 440 445 AAC TCG TCC GGA TGC CCG GGG CGC ATG GCC AGC TGC CGC TCC ATT GAC 1693 Asn Ser Ser Gly Cys Pro Gly Arg Met Ala Ser Cys Arg Ser Ile Asp 450 455 460 AAG TTC GAC CAG GGA TGG GGT CCC ATC ACT TAT GCT GAT CCT AAA GAC 1741 Lys Phe Asp Gln Gly Trp Gly Pro Ile Thr Tyr Ala Asp Pro Lys Asp 465 470 475 CCG GAC CAG AGG CCT TAT TGC TGG CAC TAC GCA CCA CAA CAG TGT GGT 1789 Pro Asp Gln Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Ala Pro Gln Gln Cys Gly 480 485 490 495 ATC ATA CCC CGG TCC GAG GCG TGC GGT CCA GTG TAT TGC TCT ACC CCA 1837 Ile Ile Pro Arg Ser Glu Ala Cys Gly Pro Val Tyr Cys Ser Thr Pro 500 505 510 AGC CCT GTT GTG GTG GGG ACG ACC GAT CGT TTC GGT GCC CCT ACG TAT 1885 Ser Pro Val Val Val Gly Thr Thr Asp Arg Phe Gly Ala Pro Thr Tyr 515 520 525 AAC TGG GGG GAT AAT GAG ACG GAC GTG CTG CTC CTA AAC AAC ACG CGG 1933 Asn Trp Gly Asp Asn Glu Thr Asp Val Leu Leu Leu Asn Asn Thr Arg 530 535 540 CCG CCG CAA GGC AAC TGG TTC GGC TGT ACA TGG ATG AAT AGC ACT GGG 1981 Pro Pro Gln Gly Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp Met Asn Ser Thr Gly 545 550 555 TTC ACC AAG ACG TGC GGG GCC CCC CCG TGT AAC ATC GGG GGG GTC GGC 2029 Phe Thr Lys Thr Cys Gly Ala Pro Pro Cys Asn Ile Gly Gly Val Gly 560 565 570 575 AAT AAC ACC TTG ACC TGC CCC ACG GAC TGC TTC CGG AAG CAC CCC GAG 2077 Asn Asn Thr Leu Thr Cys Pro Thr Asp Cys Phe Arg Lys His Pro Glu 580 585 590 GCC ACG TAC TCA AAA TGT GGC TCG GGG CCT TGG TTG ACA CCT AGG TGC 2125 Ala Thr Tyr Ser Lys Cys Gly Ser Gly Pro Trp Leu Thr Pro Arg Cys 595 600 605 ATG GTT GAC TAC CCA TAC AGG CTC TGG CAC TAC CCC TGC ACT GTC AAC 2173 Met Val Asp Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro Cys Thr Val Asn 610 615 620 TTC TCC ATC TTT AAG GTT AGG ATG TAT GTG GGG GGC GTG GAG CAC AGG 2221 Phe Ser Ile Phe Lys Val Arg Met Tyr Val Gly Gly Val Glu His Arg 625 630 635 CTT AAT GCT GCA TGC AAC TGG ACC CGA GGA GAG CGT TGT GAC TTG GAC 2269 Leu Asn Ala Ala Cys Asn Trp Thr Arg Gly Glu Arg Cys Asp Leu Asp 640 645 650 655 GAC AGG GAC AGA TCG GAG CTC AGC CCG TTA CTG CTC TCC ACA ACA GAG 2317 Asp Arg Asp Arg Ser Glu Leu Ser Pro Leu Leu Leu Ser Thr Thr Glu 660 665 670 TGG CAG GTT CTG CCC TGC TCT TTC ACC ACC CTA CCG GCT CTG TCC ACT 2365 Trp Gln Val Leu Pro Cys Ser Phe Thr Thr Leu Pro Ala Leu Ser Thr 675 680 685 GGC TTG ATC CAC CTC CAT CAG AAC ATC GTG GAC GTG CAA TAC CTG TAC 2413 Gly Leu Ile His Leu His Gln Asn Ile Val Asp Val Gln Tyr Leu Tyr 690 695 700 GGT ATA GGG TCA GCG GTT GTC TCC TTT GCA ATC AAA TGG GAG TAT GTC 2461 Gly Ile Gly Ser Ala Val Val Ser Phe Ala Ile Lys Trp Glu Tyr Val 705 710 715 GTG TTG CTT TTC CTT CTC CTG GCG GAC GCG CGC GTC TGT GCC TGC TTG 2509 Val Leu Leu Phe Leu Leu Leu Ala Asp Ala Arg Val Cys Ala Cys Leu 720 725 730 735 TGG ATG ATG CTG CTG ATA GCC CGA GCC GAG GCC GCC TTA GAG AAC CTG 2557 Trp Met Met Leu Leu Ile Ala Arg Ala Glu Ala Ala Leu Glu Asn Leu 740 745 750 GTG GCC CTC AAT GCA GCG TCC GTT GCC GGA GCG CAC GGC ATC CTC TCC 2605 Val Ala Leu Asn Ala Ala Ser Val Ala Gly Ala His Gly Ile Leu Ser 755 760 765 TTC CTC GTG TTC TTC TGT GCC GCT TGG TAC ATC AAG GGC AGG CTG GTC 2653 Phe Leu Val Phe Phe Cys Ala Ala Trp Tyr Ile Lys Gly Arg Leu Val 770 775 780 CCT GGG GCG GCA TAT GCT TTC TAT GGC GCA TGG CCG CTG CTC CTG CTC 2701 Pro Gly Ala Ala Tyr Ala Phe Tyr Gly Ala Trp Pro Leu Leu Leu Leu 785 790 795 CTC TTG ACA TTA CCA CCA CGA GCT TAC GCC ATG GAC CGG GAG ATG GCT 2749 Leu Leu Thr Leu Pro Pro Arg Ala Tyr Ala Met Asp Arg Glu Met Ala 800 805 810 815 GCA TCG TGC GGA GGC GCG GTT TTT GTG GGT CTG GCA TTA TTG ACC TTG 2797 Ala Ser Cys Gly Gly Ala Val Phe Val Gly Leu Ala Leu Leu Thr Leu 820 825 830 TCC CCA TAT TAC AAG GTG TTC CTC GCT AGG CTC ATA TGG TGG TTG CAA 2845 835 840 845 TAT CTT ATC GCC AGA GCT GAG GCG CAC TTG CAT GTG TGG GTT CCC CCC 2893 Tyr Leu Ile Ala Arg Ala Glu Ala His Leu His Val Trp Val Pro Pro 850 855 860 CTC AAC GTC CGG GGA GGC CGC GAT GCC ATC ATC CTC CTC ACG TGT GCA 2941 Leu Asn Val Arg Gly Gly Arg Asp Ala Ile Ile Leu Leu Thr Cys Ala 865 870 875 GTC CAC CCA GAG CTA ATC TTT GAT ATC ACC AAA CTT CTG ATT GCC ATA 2989 Val His Pro Glu Leu Ile Phe Asp Ile Thr Lys Leu Leu Ile Ala Ile 880 885 890 895 CTC GGA CCG CTC ATG GTG CTC CAA GCT GGC ATA ACT AGG GTG CCG TAC 3037 Leu Gly Pro Leu Met Val Leu Gln Ala Gly Ile Thr Arg Val Pro Tyr 900 905 910 TTC GTA CGC GCT CAA GGG CTC ATT CGT GCA TGC ATG TTA GTG CGG AAA 3085 Phe Val Arg Ala Gln Gly Leu Ile Arg Ala Cys Met Leu Val Arg Lys 915 920 925 GTC GCT GGG GGT CAT TAT GTC CAA ATG GCC TTC ATG AGA CTG GGC GCG 3133 Val Ala Gly Gly His Tyr Val Gln Met Ala Phe Met Arg Leu Gly Ala 930 935 940 CTG ACG GGC ACG TAC GTC TAT AAT CAC CTC ACC CCA CTG CGG GAT TGG 3181 Leu Thr Gly Thr Tyr Val Tyr Asn His Leu Thr Pro Leu Arg Asp Trp 945 950 955 GCC CAC GCC GGC CTA CGG GAC CTT GCG GTA GCA GTG GAG CCT GTC ACC 3229 Ala His Ala Gly Leu Arg Asp Leu Ala Val Ala Val Glu Pro Val Thr 960 965 970 975 TTC TCT GAC ATG GAG ACC AAG ATC ATC ACC TGG GGG GCA GAC ACC GCG 3277 Phe Ser Asp Met Glu Thr Lys Ile Ile Thr Trp Gly Ala Asp Thr Ala 980 985 990 GCG TGT GGG GAC ATC ATC CTG GGC CTA CCT GTC TCC GCC CGA AGG GGA 3325 Ala Cys Gly Asp Ile Ile Leu Gly Leu Pro Val Ser Ala Arg Arg Gly 995 1000 1005 AGG GAG ATA CTC CTG GGG CCG GCC GAT AGT CTA GTA GGG CAG GGG TGG 3373 Arg Glu Ile Leu Leu Gly Pro Ala Asp Ser Leu Val Gly Gln Gly Trp 1010 1015 1020 CGA CTC CTT GCG CCC ATC ACG GCC TAC TCC CGA CAG ACC CGG GGC CTA 3421 Arg Leu Leu Ala Pro Ile Thr Ala Tyr Ser Arg Gln Thr Arg Gly Leu 1025 1030 1035 CTT GGT TGC ATC ATC ACG AGT CTC ACA GGC CGG GAC AAG AAC CAG GTC 3469 Leu Gly Cys Ile Ile Thr Ser Leu Thr Gly Arg Asp Lys Asn Gln Val 1040 1045 1050 1055 GAG GGG GAG GTT CAA GTG GTC TCC ACC GCA ACA CAA TCT TTC CTG GCG 3517 Glu Gly Glu Val Gln Val Val Ser Thr Ala Thr Gln Ser Phe Leu Ala 1060 1065 1070 ACC TGC GTC AAC GGC GTA TGT TGG ACT GTC TAC CAT GGT GCT GGC TCA 3565 Thr Cys Val Asn Gly Val Cys Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Ser 1075 1080 1085 AAG ACT CTA GCC GGC CCA AAA GGC CCA ATC GCC CAG ATG TAC ACT AAT 3613 Lys Thr Leu Ala Gly Pro Lys Gly Pro Ile Ala Gln Met Tyr Thr Asn 1090 1095 1100 GTA GAC CAG GAT CTC GTC GGC TGG CCG GCG CCC CCC GGG GCG CGT TCC 3661 Val Asp Gln Asp Leu Val Gly Trp Pro Ala Pro Pro Gly Ala Arg Ser 1105 1110 1115 CTG ACA CCA TGC ACC TGT GGC AGC TCG GAC CTT TAC TTG GTT ACG AGA 3709 Leu Thr Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg 1120 1125 1130 1135 CAT GCA GAT GTT ATT CCG GTG CGC CGG CGG GGC GAC AAT AGA GGG AGC 3757 His Ala Asp Val Ile Pro Val Arg Arg Arg Gly Asp Asn Arg Gly Ser 1140 1145 1150 TTG CTC TCC CCC AGG CCT GTC TCC TAC TTG AAG GGC TCT TCG GGT GGC 3805 Leu Leu Ser Pro Arg Pro Val Ser Tyr Leu Lys Gly Ser Ser Gly Gly 1155 1160 1165 CCA CTG CTC TGC CCT TCG GGG CAC GCT GTG GGC GTC TTC CGG GCC GCT 3853 Pro Leu Leu Cys Pro Ser Gly His Ala Val Gly Val Phe Arg Ala Ala 1170 1175 1180 GTA TGC ACC CGG GGG GTT GCA AAG GCG GTG GAT TTT GTC CCC GTT GAG 3901 Val Cys Thr Arg Gly Val Ala Lys Ala Val Asp Phe Val Pro Val Glu 1185 1190 1195 TCC ATG GAA ACT ACT ATG CGG TCC CCG GTC TTC ACA GAC ACG TCA TCT 3949 Ser Met Glu Thr Thr Met Arg Ser Pro Val Phe Thr Asp Thr Ser Ser 1200 1205 1210 1215 CCC CCG GCC GTA CCG CAA ACA TTC CAA GTG GCC CAT CTA CAC GCT CCC 3997 Pro Pro Ala Val Pro Gln Thr Phe Gln Val Ala His Leu His Ala Pro 1220 1225 1230 ACT GGC AGC GGC AAG AGC ACT AGA GTG CCG GCC GCA TAT GCG ACC CAA 4045 Thr Gly Ser Gly Lys Ser Thr Arg Val Pro Ala Ala Tyr Ala Thr Gln 1235 1240 1245 GGG TAC AAG GTG CTT GTC CTG AAC CCG TCT GTT GCC GCT ACC TTA GGT 4093 Gly Tyr Lys Val Leu Val Leu Asn Pro Ser Val Ala Ala Thr Leu Gly 1250 1255 1260 TTT GGG GCG TAT ATG TCT AAA GCA CAT GGT ACC GAC CCT AAC ATC AGG 4141 Phe Gly Ala Tyr Met Ser Lys Ala His Gly Thr Asp Pro Asn Ile Arg 1265 1270 1275 ACT GGG GTA AGG ACC ATT ACC ACG GGC GCC CCC ATT ACG TAC TCC ACC 4189 Thr Gly Val Arg Thr Ile Thr Thr Gly Ala Pro Ile Thr Tyr Ser Thr 1280 1285 1290 1295 TAT GGC AAG TTC CTT GCC GAC GGT GGT TGC TCC GGG GGC GCT TAC GAC 4237 1300 1305 1310 ATC ATA ATG TGC GAT GAG TGC CAC TCA ACT GAC TCA ACT ACC ATC TTG 4285 Ile Ile Met Cys Asp Glu Cys His Ser Thr Asp Ser Thr Thr Ile Leu 1315 1320 1325 GGC ATC GGC ACA GTC CTG GAC CAA GCG GAG ACG GCT GGA GCA CGG CTT 4333 Gly Ile Gly Thr Val Leu Asp Gln Ala Glu Thr Ala Gly Ala Arg Leu 1330 1335 1340 GTC GTG CTC GCC ACC GCT ACG CCT CCA GGA TCG GTC ACC GTG CCA CAC 4381 Val Val Leu Ala Thr Ala Thr Pro Pro Gly Ser Val Thr Val Pro His 1345 1350 1355 CCC AAT ATC GAG GAG GTG GCC CTG TCG AAC ACT GGA GAG ATC CCC TTC 4429 Pro Asn Ile Glu Glu Val Ala Leu Ser Asn Thr Gly Glu Ile Pro Phe 1360 1365 1370 1375 TAT GGC AAA GCC ATC CCC ATC GAA GCC ATC ATG GGG GGA AGG CAC CTC 4477 Tyr Gly Lys Ala Ile Pro Ile Glu Ala Ile Met Gly Gly Arg His Leu 1380 1385 1390 ATT TTC TGT CAC TCC AAG AAG AAG TGC GAC GAG CTT GCC GCA AAG CTG 4525 Ile Phe Cys His Ser Lys Lys Lys Cys Asp Glu Leu Ala Ala Lys Leu 1395 1400 1405 TCA GGC CTC GGA ATC AAT GCT GTA GCG TAT TAC CGG GGT CTT GAT GTG 4573 Ser Gly Leu Gly Ile Asn Ala Val Ala Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Val 1410 1415 1420 TCC GTC ATA CCG ACC AGC GGA GAC GTC GTT GTC GTG GCA ACA GAC GCT 4621 Ser Val Ile Pro Thr Ser Gly Asp Val Val Val Val Ala Thr Asp Ala 1425 1430 1435 CTA ATG ACG GGC TAT ACC GGT GAC TTT GAT TCA GTG ATC GAC TGT AAT 4669 Leu Met Thr Gly Tyr Thr Gly Asp Phe Asp Ser Val Ile Asp Cys Asn 1440 1445 1450 1455 ACG TGT GTC ACC CAG ACA GTC GAC TTC AGC TTG GAC CCC ACC TTC ACC 4717 Thr Cys Val Thr Gln Thr Val Asp Phe Ser Leu Asp Pro Thr Phe Thr 1460 1465 1470 ATT GAG ACG ACG ACC GTG CCC CAA GAC GCA GTG TCG CGC TCG CAG CGG 4765 Ile Glu Thr Thr Thr Val Pro Gln Asp Ala Val Ser Arg Ser Gln Arg 1475 1480 1485 CGG GGT AGG ACT GGC AGG GGC AGG GGG GGC ATA TAC AGG TTT GTA ACT 4813 Arg Gly Arg Thr Gly Arg Gly Arg Gly Gly Ile Tyr Arg Phe Val Thr 1490 1495 1500 CCG GGG GAA CGG CCC TCG GGC ATG TTC GAT TCC CCG GTC CTG TGC GAG 4861 Pro Gly Glu Arg Pro Ser Gly Met Phe Asp Ser Pro Val Leu Cys Glu 1505 1510 1515 TGC TAT GAC GCG GGC TGT GCT TGG TAC GAG CTC ACC CCC GCT GAG ACC 4909 Cys Tyr Asp Ala Gly Cys Ala Trp Tyr Glu Leu Thr Pro Ala Glu Thr 1520 1525 1530 1535 TCG GTT AGG TTG CGG GCT TAC CTA AAT ACA CCA GGA TTG CCC GTT TGC 4957 Ser Val Arg Leu Arg Ala Tyr Leu Asn Thr Pro Gly Leu Pro Val Cys 1540 1545 1550 CAG GAC CAT CTG GAG TTC TGG GAG AGC GTC TTC ACA GGC CTC ACC CAT 5005 Gln Asp His Leu Glu Phe Trp Glu Ser Val Phe Thr Gly Leu Thr His 1555 1560 1565 ATA GAT GCC CAC TTC CTG TCC CAG ACC AAG CAG GCA GGA GAT AAC TTC 5053 Ile Asp Ala His Phe Leu Ser Gln Thr Lys Gln Ala Gly Asp Asn Phe 1570 1575 1580 CCC TAC CTG GTG GCA TAC CAA GCC ACG GTG TGC GCC AGG GCT CAG GCC 5101 Pro Tyr Leu Val Ala Tyr Gln Ala Thr Val Cys Ala Arg Ala Gln Ala 1585 1590 1595 CCA CCT CCA TCG TGG GAT CAA ATG TGG AAG TGT CTC ATA CGG CTA AAA 5149 Pro Pro Pro Ser Trp Asp Gln Met Trp Lys Cys Leu Ile Arg Leu Lys 1600 1605 1610 1615 CCC ACG CTG CAC GGG CCA ACG CCC CTG CTG TAT AGG CTA GGG GCC GTC 5197 Pro Thr Leu His Gly Pro Thr Pro Leu Leu Tyr Arg Leu Gly Ala Val 1620 1625 1630 CAA AAT GAG GTC ACC CTC ACA CAC CCC ATA ACC AAA TAC ATC ATG GCA 5245 Gln Asn Glu Val Thr Leu Thr His Pro Ile Thr Lys Tyr Ile Met Ala 1635 1640 1645 TGC ATG TGG GCC GAC CTG GAA GTC GTC ACC AGC ACC TGG GTG CTG GTA 5293 Cys Met Trp Ala Asp Leu Glu Val Val Thr Ser Thr Trp Val Leu Val 1650 1655 1660 GGC GGA GTC CTC GCA GCT CTG GCC GCA TAT TGC CTG ACA ACA GGC AGT 5341 Gly Gly Val Leu Ala Ala Leu Ala Ala Tyr Cys Leu Thr Thr Gly Ser 1665 1670 1675 GTG GTT ATC GTG GGT AGG ATC ATC TTG TCC GGG AGG CCG GCT GTC GTT 5389 Val Val Ile Val Gly Arg Ile Ile Leu Ser Gly Arg Pro Ala Val Val 1680 1685 1690 1695 CCC GAT AGG GAA GTC CTC TAC CGG GAG TTC GAT GAA ATG GAA GAA TGC 5437 Pro Asp Arg Glu Val Leu Tyr Arg Glu Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys 1700 1705 1710 GCC TCG CAC CTC CCT TAC ATC GAA CAG GGA ATG CAA CTC GCC GAG CAA 5485 Ala Ser His Leu Pro Tyr Ile Glu Gln Gly Met Gln Leu Ala Glu Gln 1715 1720 1725 TTC AAG CAG AAG GCG CTC GGG TTG TTG CAA ACA GCC ACC AAG CAG GCG 5533 Phe Lys Gln Lys Ala Leu Gly Leu Leu Gln Thr Ala Thr Lys Gln Ala 1730 1735 1740 GAG GCT GCC GCT CCC GTG GTG GGG TCC AAG TGG CGA GCT TTT GAG ACC 5581 Glu Ala Ala Ala Pro Val Val Gly Ser Lys Trp Arg Ala Phe Glu Thr 1745 1750 1755 TTC TGG GCA AAG CAC ATG TGG AAT TTC ATC AGC GGG ATA CAG TAC TTA 5629 1760 1765 1770 1775 GCG GGC TTA TCC ACC CTG CCT GGG AAC CCC GCG ATA GCA TCA CTG ATG 5677 Ala Gly Leu Ser Thr Leu Pro Gly Asn Pro Ala Ile Ala Ser Leu Met 1780 1785 1790 GCA TTC ACA GCC TCT ATC ACC AGC CCG CTC ACC ACC CAG AAC ACC CTC 5725 Ala Phe Thr Ala Ser Ile Thr Ser Pro Leu Thr Thr Gln Asn Thr Leu 1795 1800 1805 CTG TTT AAC ATC TTG GGG GGG TGG GTA GCC GCC CAA CTC GCT CCC CCC 5773 Leu Phe Asn Ile Leu Gly Gly Trp Val Ala Ala Gln Leu Ala Pro Pro 1810 1815 1820 AGC GCT GCT TCG GCT TTC GTG GGC GCT GGT ATC GCT GGT GCG GCT GTT 5821 Ser Ala Ala Ser Ala Phe Val Gly Ala Gly Ile Ala Gly Ala Ala Val 1825 1830 1835 GGC AGC ATA GGT CTT GGG AAG GTG CTA GTG GAC ATT CTG GCG GGC TAT 5869 Gly Ser Ile Gly Leu Gly Lys Val Leu Val Asp Ile Leu Ala Gly Tyr 1840 1845 1850 1855 GGG GCA GGG GTG GCT GGC GCG CTC GTG GCC TTC AAG GTC ATG AGC GGC 5917 Gly Ala Gly Val Ala Gly Ala Leu Val Ala Phe Lys Val Met Ser Gly 1860 1865 1870 GAG GCG CCC TCT GCC GAG GAC CTG ATC AAT TTG CTC CCT GCC ATC CTC 5965 Glu Ala Pro Ser Ala Glu Asp Leu Ile Asn Leu Leu Pro Ala Ile Leu 1875 1880 1885 TCT CCT GGT GCC CTG GTC GTC GGA GTC GTG TGT GCA GCA ATA CTG CGT 6013 Ser Pro Gly Ala Leu Val Val Gly Val Val Cys Ala Ala Ile Leu Arg 1890 1895 1900 CGG CAT GTG GGC CCG GGA GAG GGG GCC GTG CAG TGG ATG AAC CGG CTG 6061 Arg His Val Gly Pro Gly Glu Gly Ala Val Gln Trp Met Asn Arg Leu 1905 1910 1915 ATA GCG TTC GCT TCG CGG GGT AAC CAT GTC TCC CCC ACG CAC TAT GTG 6109 Ile Ala Phe Ala Ser Arg Gly Asn His Val Ser Pro Thr His Tyr Val 1920 1925 1930 1935 CCT GAG AGC GAC GCC GCA GCG CGT GTC ACT CAG GTC CTC TCC AGC CTT 6157 Pro Glu Ser Asp Ala Ala Ala Arg Val Thr Gln Val Leu Ser Ser Leu 1940 1945 1950 ACC ATC ACC CAG CTG CTG AAG AGG CTC CAC CAG TGG ATT AAT GAG GAC 6205 Thr Ile Thr Gln Leu Leu Lys Arg Leu His Gln Trp Ile Asn Glu Asp 1955 1960 1965 TGT TCT ACG CCG TGT TCC GGC TCG TGG CTG AGG GAT GTT TGG GAC TGG 6253 Cys Ser Thr Pro Cys Ser Gly Ser Trp Leu Arg Asp Val Trp Asp Trp 1970 1975 1980 GTG TGC ACG GTG TTG AGT GAC TTC AAG ACC TGG CTC CAG TCC AAG CTC 6301 Val Cys Thr Val Leu Ser Asp Phe Lys Thr Trp Leu Gln Ser Lys Leu 1985 1990 1995 CTG CCG CGG TTA CCG GGT GTC CCT TTC CTC TCA TGC CAA CGT GGG TAC 6349 Leu Pro Arg Leu Pro Gly Val Pro Phe Leu Ser Cys Gln Arg Gly Tyr 2000 2005 2010 2015 AAG GGA GTC TGG CGG GGG GAC GGC ATC ATG CAC ACC ACC TGC CCA TGT 6397 Lys Gly Val Trp Arg Gly Asp Gly Ile Met His Thr Thr Cys Pro Cys 2020 2025 2030 GGA GCA CAG ATC GCC GGA CAT GTC AAA AAC GGT TCC ATG AGG ATC ATC 6445 Gly Ala Gln Ile Ala Gly His Val Lys Asn Gly Ser Met Arg Ile Ile 2035 2040 2045 GGG CCG AAA ACC TGC AGC AAC ACG TGG CAT GGA ACA TTC CCC ATC AAC 6493 Gly Pro Lys Thr Cys Ser Asn Thr Trp His Gly Thr Phe Pro Ile Asn 2050 2055 2060 GCG TAC ACC ACG GGC CCC TGC ACG CCT TCC CCG GCG CCA AAC TAT TCC 6541 Ala Tyr Thr Thr Gly Pro Cys Thr Pro Ser Pro Ala Pro Asn Tyr Ser 2065 2070 2075 AAG GCG CTG TGG CGG GTG GCT GCT GAG GAG TAC GTG GAG GTC ACG CGG 6589 Lys Ala Leu Trp Arg Val Ala Ala Glu Glu Tyr Val Glu Val Thr Arg 2080 2085 2090 2095 GTG GGG GAT TTC CAC TAC GTG ACG GGC ATA ACC ACC GAC AAC GTA AAG 6637 Val Gly Asp Phe His Tyr Val Thr Gly Ile Thr Thr Asp Asn Val Lys 2100 2105 2110 TGC CCA TGT CAG GTT CCA GCT CCT GAG TTT TTC ACG GAG GTG GAT GGG 6685 Cys Pro Cys Gln Val Pro Ala Pro Glu Phe Phe Thr Glu Val Asp Gly 2115 2120 2125 GTG CGG TTG CAC AGG TAC GCC CCG GTG TGC AAA CCT CTC TTA CGG GAT 6733 Val Arg Leu His Arg Tyr Ala Pro Val Cys Lys Pro Leu Leu Arg Asp 2130 2135 2140 GAG GTT GTA TTC CAG GTC GGG CTC AAT CAA TAC CTG GTT GGG TCA CAG 6781 Glu Val Val Phe Gln Val Gly Leu Asn Gln Tyr Leu Val Gly Ser Gln 2145 2150 2155 CTC CCA TGC GAG CCC GAA CCG GAC GTA GCA GTG CTC ACT TCC ATG CTC 6829 Leu Pro Cys Glu Pro Glu Pro Asp Val Ala Val Leu Thr Ser Met Leu 2160 2165 2170 2175 ACC GAC CCC TCC CAC ATT ACA GCA GAG GCG GCT AAG CGT AGG TTG GCC 6877 Thr Asp Pro Ser His Ile Thr Ala Glu Ala Ala Lys Arg Arg Leu Ala 2180 2185 2190 AGG GGG TCT CCC CCC TCC TTG GCC AGC TCT TCA GCT AGC CAG CTG TCT 6925 Arg Gly Ser Pro Pro Ser Leu Ala Ser Ser Ser Ala Ser Gln Leu Ser 2195 2200 2205 GCG CCC TCC TTG AGG GCG ACA TGC ACT ACC CAT TCT TCC TAT AAT CTT 6973 Ala Pro Ser Leu Arg Ala Thr Cys Thr Thr His Ser Ser Tyr Asn Leu 2210 2215 2220 GAC TCT CCG GAC GTC GAC CTC ATT GAG GCC AAC CTC CTG TGG CGG CAG 7021 Asp Ser Pro Asp Val Asp Leu Ile Glu Ala Asn Leu Leu Trp Arg Gln 2225 2230 2235 GAG ATG GGC GGA AAC ATC ACC CGC GTG GAG TCG GAG AAC AAG GTG GTA 7069 Glu Met Gly Gly Asn Ile Thr Arg Val Glu Ser Glu Asn Lys Val Val 2240 2245 2250 2255 GTT CTA GAC TCT TTC GAG CCG CTT CGA GCG GAG GGG GAT GAG AAT GAA 7117 Val Leu Asp Ser Phe Glu Pro Leu Arg Ala Glu Gly Asp Glu Asn Glu 2260 2265 2270 ATA TCC ATT GCG GCG GAG ATC CTG CGG AAG TCC AAG AAG TTC CCC GCG 7165 Ile Ser Ile Ala Ala Glu Ile Leu Arg Lys Ser Lys Lys Phe Pro Ala 2275 2280 2285 GCG ATA CCC ATA TGG GCA CGG CCG GAT TAC AAT CCT CCA TTG TTA GAG 7213 Ala Ile Pro Ile Trp Ala Arg Pro Asp Tyr Asn Pro Pro Leu Leu Glu 2290 2295 2300 TCT TGG AAG AAC CCG GAC TAC GTC CCT CCG GTG GTA CAC GGG TGC CCA 7261 Ser Trp Lys Asn Pro Asp Tyr Val Pro Pro Val Val His Gly Cys Pro 2305 2310 2315 TTG CCA CCT GTC AAG GCC CCT CCA ATA CCA CCT CCA CGG AGA AAA AGG 7309 Leu Pro Pro Val Lys Ala Pro Pro Ile Pro Pro Pro Arg Arg Lys Arg 2320 2325 2330 2335 ACG GTT GTC CTG ACG GAC TCC ACC GTG TCT TCT GTT TTG GCG GAG CTC 7357 Thr Val Val Leu Thr Asp Ser Thr Val Ser Ser Val Leu Ala Glu Leu 2340 2345 2350 GCT ACC AAA ACC TTC GGC AGC TCC GAA TTG TCG GCC GCC GAC AGC GGC 7405 Ala Thr Lys Thr Phe Gly Ser Ser Glu Leu Ser Ala Ala Asp Ser Gly 2355 2360 2365 ACG GCG ACC GCC CCT CCT GAC CAG ACC TCC GAC AAC GGC GGC AAA GAC 7453 Thr Ala Thr Ala Pro Pro Asp Gln Thr Ser Asp Asn Gly Gly Lys Asp 2370 2375 2380 TCC GAC GCT GAG TCA TGC TCC TCT ATG CCC CCC CTT GAG GGG GAG CCG 7501 Ser Asp Ala Glu Ser Cys Ser Ser Met Pro Pro Leu Glu Gly Glu Pro 2385 2390 2395 GGG GAC CCC GAT CTC AGT GAC GGG TCT TGG TCT ACC GTG AGC GAG GAG 7549 Gly Asp Pro Asp Leu Ser Asp Gly Ser Trp Ser Thr Val Ser Glu Glu 2400 2405 2410 2415 GCT GGT GAG AGC GTC GTC TGC TGC TCA ATG TCC TAC ACA TGG ACA GGT 7597 Ala Gly Glu Ser Val Val Cys Cys Ser Met Ser Tyr Thr Trp Thr Gly 2420 2425 2430 GCC CTG ATC ACG CCA TGC GCC GCG GAA GAA AGC AAG CTG CCC ATC AAC 7645 Ala Leu Ile Thr Pro Cys Ala Ala Glu Glu Ser Lys Leu Pro Ile Asn 2435 2440 2445 GCG TTG AGC AAC TCT TTG CTG CGC CAT CAC AAC ATG GTC TAC GCC ACG 7693 Ala Leu Ser Asn Ser Leu Leu Arg His His Asn Met Val Tyr Ala Thr 2450 2455 2460 ACA TCC CGC AGC GCG GGC CTG CGG CAG AAG AAG GTC ACC TTT GAC AGA 7741 Thr Ser Arg Ser Ala Gly Leu Arg Gln Lys Lys Val Thr Phe Asp Arg 2465 2470 2475 CTG CAG GTC CTG GAT GAC CAT TAC CGG GAC GTG CTT AAG GAG ATG AAG 7789 Leu Gln Val Leu Asp Asp His Tyr Arg Asp Val Leu Lys Glu Met Lys 2480 2485 2490 2495 GCA AAG GCG TCC ACA GTC AAG GCT AAA CTT CTA TCC ATA GAA GAA GCC 7837 Ala Lys Ala Ser Thr Val Lys Ala Lys Leu Leu Ser Ile Glu Glu Ala 2500 2505 2510 TGC CGC CTG ACG CCC CCA CAT TCG GCC AAA TCC AAG TTT GGC TAT GGG 7885 Cys Arg Leu Thr Pro Pro His Ser Ala Lys Ser Lys Phe Gly Tyr Gly 2515 2520 2525 GCA AAG GAC GTC CGG AAC CTA TCC AGC AGG GCC ATC AAC CAC TTC CGC 7933 Ala Lys Asp Val Arg Asn Leu Ser Ser Arg Ala Ile Asn His Phe Arg 2530 2535 2540 TCC GTG TGG GAG GAC TTG CTG GAG GAC ACT GTG ACA CCA ATT GAC ACC 7981 Ser Val Trp Glu Asp Leu Leu Glu Asp Thr Val Thr Pro Ile Asp Thr 2545 2550 2555 ACC GTC ATG GCA AAG AAT GAG GTT TTC TGC GTC CAA CCA GAG AAG GGA 8029 Thr Val Met Ala Lys Asn Glu Val Phe Cys Val Gln Pro Glu Lys Gly 2560 2565 2570 2575 GGC CAG AAG CCA GCC CGC CTT ATC GTA TTC CCA GAT TTG GGA GTT CGG 8077 Gly Gln Lys Pro Ala Arg Leu Ile Val Phe Pro Asp Leu Gly Val Arg 2580 2585 2590 GTA TGC GAG AAG ATG GCT CTC TAC GAT GTG GTC TCC ACC CTT CCT CAA 8125 Val Cys Glu Lys Met Ala Leu Tyr Asp Val Val Ser Thr Leu Pro Gln 2595 2600 2605 GCC GTG ATG GGC TCC TCA TAC GGA TTC CAG TAC TCT CCC GGG CAG CGG 8173 Ala Val Met Gly Ser Ser Tyr Gly Phe Gln Tyr Ser Pro Gly Gln Arg 2610 2615 2620 GTC GAG TTC CTG GTA AAA GCC TGG AAA TCA AAG AAA AAC CCT ATG GGC 8221 Val Glu Phe Leu Val Lys Ala Trp Lys Ser Lys Lys Asn Pro Met Gly 2625 2630 2635 TTC TCA TAT GAC ACC CGC TGT TTT GAC TCA ACG GTC ACT GAG AAT GAC 8269 Phe Ser Tyr Asp Thr Arg Cys Phe Asp Ser Thr Val Thr Glu Asn Asp 2640 2645 2650 2655 ATC CGT GTT GAG GAG TCA ATT TAC CAA TGT TGT GAC TTG GCC CCC GAA 8317 Ile Arg Val Glu Glu Ser Ile Tyr Gln Cys Cys Asp Leu Ala Pro Glu 2660 2665 2670 GCC AGA CAG GCT ATA AAA TCG CTC ACA GAG CGG CTT TAT ATC GGG GGT 8365 Ala Arg Gln Ala Ile Lys Ser Leu Thr Glu Arg Leu Tyr Ile Gly Gly 2675 2680 2685 CCC CTG ACT AAT TCA AAA GGG CAG AGC TGT GGT TAT CGC CGG TGC CGC 8413 2690 2695 2700 GCG AGC GGC GTG CTG ACG ACT AGC TGC GGT AAT ACC CTC ACA TGT TAC 8461 Ala Ser Gly Val Leu Thr Thr Ser Cys Gly Asn Thr Leu Thr Cys Tyr 2705 2710 2715 TTG AAA GCC TCT GCC GCC TGT CGA GCT GCA AAG CTC CAG GAC TGC ACG 8509 Leu Lys Ala Ser Ala Ala Cys Arg Ala Ala Lys Leu Gln Asp Cys Thr 2720 2725 2730 2735 ATG CTC GTG AAC GGG GAC GAC CGT GTC GTT ATC TGC GAA AGC GCG GGA 8557 Met Leu Val Asn Gly Asp Asp Arg Val Val Ile Cys Glu Ser Ala Gly 2740 2745 2750 ACC CAG GAG GAT GCG GCG AGC CTA CGA GTC TTC ACG GAG GCT ATG ACT 8605 Thr Gln Glu Asp Ala Ala Ser Leu Arg Val Phe Thr Glu Ala Met Thr 2755 2760 2765 AGG TAC TCC GCC CCC CCC GGG GAC TTG CCC CAA CCA GAA TAC GAC TTG 8653 Arg Tyr Ser Ala Pro Pro Gly Asp Leu Pro Gln Pro Glu Tyr Asp Leu 2770 2775 2780 GAG TTG ATA ACA TCA TGT TCC TCC AAT GTG TCG GTC GCG CAC GAT GCA 8701 Glu Leu Ile Thr Ser Cys Ser Ser Asn Val Ser Val Ala His Asp Ala 2785 2790 2795 TCT GGC AAA AGG GTG TAC TAC CTC ACT CGC GAT CCC ACC ACC CCC ATC 8749 Ser Gly Lys Arg Val Tyr Tyr Leu Thr Arg Asp Pro Thr Thr Pro Ile 2800 2805 2810 2815 GCA CGG GCT GCG TGG GAA ACA GCT AGA CAC ACT CCA GTT AAC TCC TGG 8797 Ala Arg Ala Ala Trp Glu Thr Ala Arg His Thr Pro Val Asn Ser Trp 2820 2825 2830 CTA GGC AAC ATT ATC ATG TAT GCG CCC ACC TTA TGG GCA AGG ATG ATT 8845 Leu Gly Asn Ile Ile Met Tyr Ala Pro Thr Leu Trp Ala Arg Met Ile 2835 2840 2845 CTG ATG ACC CAT TTC TTC TCC ATC CTT CTA GCT CAG GAG CAA CTT GAA 8893 Leu Met Thr His Phe Phe Ser Ile Leu Leu Ala Gln Glu Gln Leu Glu 2850 2855 2860 AAA GCC CTG GAT TGC CAA ATC TAC GGG GCC TGT TAC TCC ATT GAG CCA 8941 Lys Ala Leu Asp Cys Gln Ile Tyr Gly Ala Cys Tyr Ser Ile Glu Pro 2865 2870 2875 CTT GAC CTA CCT CAG ATC ATT GAA CGA CTC CAT GGT CTT AGC GCA TTT 8989 Leu Asp Leu Pro Gln Ile Ile Glu Arg Leu His Gly Leu Ser Ala Phe 2880 2885 2890 2895 TCA CTC CAT AGT TAC TCT CCA GGT GAG ATC AAT AGG GTG GCT TCA TGC 9037 Ser Leu His Ser Tyr Ser Pro Gly Glu Ile Asn Arg Val Ala Ser Cys 2900 2905 2910 CTC AGG AAA CTT GGG GTA CCG CCC TTG CGA GTC TGG AGA CAT CGG GCC 9085 Leu Arg Lys Leu Gly Val Pro Pro Leu Arg Val Trp Arg His Arg Ala 2915 2920 2925 AGG AAC GTC CGC GCT AAA CTA CTG TCC CAG GGG GGG AGG GCG GCC ACT 9133 Arg Asn Val Arg Ala Lys Leu Leu Ser Gln Gly Gly Arg Ala Ala Thr 2930 2935 2940 TGC GGC AAA TAC CTC TTC AAC TGG GCA GTA AAG ACC AAG CTC AAA CTC 9181 Cys Gly Lys Tyr Leu Phe Asn Trp Ala Val Lys Thr Lys Leu Lys Leu 2945 2950 2955 ACT CCA ATC CCG GCT GCG TCC CAG TTG GAC TTA TCC GGC TGG TTC GTT 9229 Thr Pro Ile Pro Ala Ala Ser Gln Leu Asp Leu Ser Gly Trp Phe Val 2960 2965 2970 2975 GCT GGC TAC AGC GGG GGA GAC ATA TAT CAC AGC CTG TCT CGT GCC CGA 9277 Ala Gly Tyr Ser Gly Gly Asp Ile Tyr His Ser Leu Ser Arg Ala Arg 2980 2985 2990 CCC CGC TGG TTC ATG CTG TGC CTA CTC CTA CTT TCT GTA GGG GTA GGC 9325 Pro Arg Trp Phe Met Leu Cys Leu Leu Leu Leu Ser Val Gly Val Gly 2995 3000 3005 ATC TAC TTG CTC CCC AAT CGA TGAACGGGGA GCTAAACACT CCAGCCAATA 9376 Ile Tyr Leu Leu Pro Asn Arg 3010 GGCCATTTCC TTTTG 9391

【００５３】 配列番号：２ 配列の長さ：77 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（cDNA to viral RNA） 起源 生物名：狂犬病ウイルス 株名：西ヶ原株 配列の特徴 15-71 シグナル配列 配列 AGACTTAGGGAAAG ATG GTT CCG CAA GCT CTT CTG CTT GTA CCC ATT CTG 50 Met Val Pro Gln Ala Leu Leu Leu Val Pro Ile Leu -15 -10 GGT TTT TCC TCG TGT TTC GGG AAA TTC 77 Gly Phe Ser Ser Cys Phe Gly Lys Phe -5 1

【図面の簡単な説明】

【図１】ＰＣＲに用いたプライマーの塩基配列を示す図
である。

【図２】E-1発現用組換えトランスファーベクター構築
の概略図を示した図である。

【図３】E-2発現用組換えトランスファーベクター構築
の概略図を示した図である。

【図４】E-1蛋白質のウエスタンブロットの結果を示し
た模式図である。

【図５】E-2蛋白質のウエスタンブロットの結果を示し
た模式図である。

【図６】精製過程のE-2蛋白質の SDS-PAGE 及びウエス
タンブロットの結果を示した模式図である。

【図７】抗E-1, E-2マウス抗体産生をウエスタンブロッ
トで調べた結果を示した模式図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 7/10 8318−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 15/51 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ 21/08 8214−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｖ 8310−2Ｊ 33/576 Ｚ 9015−2Ｊ // Ｃ０７Ｋ 99:00 (72)発明者 星子 和哉 熊本県菊池郡合志町字立山1909−47 Ａ− 102 (72)発明者 濱田 福三郎 熊本県菊池郡西合志町須屋2679−２

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ｃ型肝炎ウイルス構成ポリペプチドをコ
   ードする遺伝子、及び異種ウイルス由来のシグナル配列
   をコードする遺伝子を含有するトランスファーベクター
   を昆虫ウイルスのゲノムの一部に組み込むことにより得
   られるウイルスベクター。
2. 【請求項２】 該異種ウイルス由来のシグナル配列が狂
   犬病ウイルスのＧ蛋白由来のシグナル配列である請求項
   １記載のウイルスベクター。
3. 【請求項３】 該狂犬病ウイルスＧ蛋白のシグナル配列
   をコードする遺伝子が下記のアミノ酸配列をコードする
   塩基配列を含有する遺伝子断片である請求項２記載のウ
   イルスベクター。 Met Val Pro Gln Ala Leu Leu Leu Val Pro Ile Leu Gly Phe Ser Ser Cys Phe Gly Lys Phe
4. 【請求項４】 該狂犬病ウイルスＧ蛋白のシグナル配列
   をコードする遺伝子が下記の遺伝子断片である請求項２
   記載のウイルスベクター AGACTTAGGG AAAG ATG GTT CCG CAA GCT CTT CTG CTT GTA CCC ATT CTG GGT TTT TCC TCG TGT TTC GGG AAA TTC
5. 【請求項５】 該Ｃ型肝炎ウイルス構成ポリペプチドを
   コードする遺伝子がＣ型肝炎ウイルス外被糖蛋白領域を
   コードする塩基配列またはその一部である請求項１記載
   のウイルスベクター。
6. 【請求項６】 該Ｃ型肝炎ウイルス構成ポリペプチドを
   コードする遺伝子が配列表配列番号１記載のアミノ酸配
   列のうち、アミノ酸順位192〜330または390〜683のアミ
   ノ酸配列をコードする塩基配列またはその一部である請
   求項５記載のウイルスベクター。
7. 【請求項７】 該昆虫ウイルスがバキュロウイルスであ
   る請求項１記載のウイルスベクター
8. 【請求項８】 請求項１記載のウイルスベクターを昆虫
   細胞に感染させ、これを培養し、生産されたＣ型肝炎ウ
   イルス構成ポリペプチドを回収することを特徴とする製
   造方法。
9. 【請求項９】 該Ｃ型肝炎ウイルス構成ポリペプチドが
   Ｃ型肝炎ウイルス外被糖蛋白である請求項８記載の製造
   方法。
10. 【請求項１０】 請求項８記載の方法により得られるＣ
    型肝炎ウイルス構成ポリペプチドを抗原として使用し、
    調製される抗Ｃ型肝炎ウイルス抗体。
11. 【請求項１１】 請求項８記載の方法により得られるＣ
    型肝炎ウイルス構成ポリペプチドを抗原として使用する
    ことを特徴とする抗Ｃ型肝炎ウイルス抗体及びこの関連
    抗体の免疫学的検出方法。
12. 【請求項１２】 請求項８記載方法により得られるＣ型
    肝炎ウイルス構成ポリペプチドからなるＣ型肝炎ワクチ
    ン。
13. 【請求項１３】 請求項１０記載の抗体を使用すること
    を特徴とするＣ型肝炎ウイルス及びこの関連抗原の免疫
    学的検出方法。