KR0154494B1

KR0154494B1 - Hcv 코아 단백질의 융합단백질 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR0154494B1
Application number: KR1019950020883A
Authority: KR
Inventors: 임동수; 성영림; 이은경; 최시영; 전승기
Original assignee: 김은영; 한국과학기술연구원
Priority date: 1995-07-15
Filing date: 1995-07-15
Publication date: 1998-10-15
Also published as: KR970006317A

Abstract

본 발명은 C형 간염 바이러스의 구조단백질의 하나인 코아 단백질을 글루타치온 결합단백질(GST)과 융합시킨 융합단백질, 이를 코드하는 융합유전자, 이를 대장균에서 발현시키기 위한 발현벡터 및 상기 발현벡터로 형질전환된 대장균을 배양하여 가용성 상태로 다량의 HCV 코아 단백질 항원을 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

HCV 코아 단백질의 융합단백질 및 이의 제조방법

제1도는 본 발명에 따른 발현벡터 pGEX/Core의 제조과정을 나타낸 모식도이고,

제2도는 본 발명의 GST-코아 융합단백질에서 코아 단백질의 아미노산 서열 및 염기서열을 나타낸 것이고,

제3a도는 GST-코아 융합단백질을 대장균에서 발현시켜 SDS-젤상에서 전기영동한 결과이고,

제3b도는 GST-코아 융합단백질의 SDS-젤을 웨스턴 블롯팅한 결과이고,

제4도는 GST-코아 융합단백질의 생성을 유도한 세포 파쇄물의 상층액을 GST-아가로즈 친화성 크로마토그래피한 결과이고,

제5도는 GST-코아 융합단백질의 생성을 유도한 세포 파쇄물을 원심분리하여 수득한 분획들을 SDS-젤상에서 전기영동한 결과이고,

제6a도 및 제6b도는 본 발명에 따라 분리정제한 GST-코아 융합단백질을 C형 간염 바이러스에 감염된 환자의 혈청과 반응시켜 간접 ELISA를 수행한 결과이다.

본 발명은 C현 간염 바이러스(hepatitis C virus, HCV)의 구조단백질 중의 하나인 코아 단백질을 글루타치온 결합단백질(GST)과 융합시킨 융합단백질, 상기 융합단백질을 코드하는 융합유전자, 상기 융합유전자를 포함하며 상기 융합단백질을 대장균에서 발현시키기 위한 발현벡터, 상기 발현벡터로 형질전환된 대장균, 그리고 상기 형질전환된 균주를 이용하여 상기 융합단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.

HCV는 주로 수혈에 의해 전염되며 사람에게 감염되어 만성 간염을 일으키는 병원체이고, 만선 간질환 및 간암의 원인이 되기도 한다.(Choo, Q. L. et al., Science, 244, 359-361(1989)). HCV로 감염되었을 때의 증상은 B형 간염 바이러스(HBV)의 경우와 유사하나 HBV보다 만성 간염으로 진행될 확률이 더 크다.

HCV는 약 9.4kb의 크기를 갖는 단일가닥으로 된 RNA바이러스로서 유전자 구조는 플라비바이러스나 페스티바이러스와 유사하다. 또한 HCV는 약 3010개의 아미노산으로 구성된 하나의 폴리펩티드로 이루어지는데, 각각의 HCV 단백질은 숙주세포가 갖고 있는 단백질 분해 효소 시그날라제(signalase)와 바이러스가 갖고 있는 단백질 분해효소(NS3)에 의해 분해되어 코아(core), EI(gp35), E2/NSI(gp70), NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B등의 단백질들을 만든다. 이 중에서 특히 코아 단백질은 HCV의 RNA를 외피하고 있는 뉴클레오캡시드 단백질로서 높은 항원성을 나타내며, HCV의 유전자 유형들 중 염기서열상의 차이점이 가장 적다고 보고되어 있다(Houghton, M. et al., Molecular Biology of the hepatitis C virus : Implications for diagnosis, development and control of viral disease. Hepatology, 14, 381-388(1991).

따라서, HCV의 코아 단백질을 이용하여 C형 간염을 예방하거나 치료하기 위한 연구가 계속 진행되었으며, 그 결과 생쥐와 사람의 세포독성 T세포에 의해 인지되는 코아 단백질 에피토프들의 위치가 확인되었다(Shirai M. et al., Journal of Virology, 68, 3334-3342(1994)).

또한, 상기 코아 단백질은 수혈에 의한 NANB환자에서 알라닌 아미노전이효소가 최고수치로 나타나기 전에 환자의 혈청과 반응하므로 진단시약의 한 구성성분으로 유용하게 쓰이고 있으며, 특히 코아 단백질에 대한 IgM 항체는 급성 HCV 감염에 대한 유용한 지표가 되고 있다(Meisel et al., Proc. European HCV Cancer Group Meeting, Venice, (1992)).

이에, 본 발명자들은 C형 간염에 대한 진단제제로서 사용할 수 있는 HCV 코아 단백질을 쉽게 제조할 수 있는 방법을 개발하기 위해 연구를 계속한 결과, GST 유전자와 상기 코아 단백질의 유전자의 융합유전자를 포함하는 발현벡터를 개발하였고, 이 발현벡터로 형질전환된 대장균에서 발현된 수용성 융합단백질이 HCV 간염에 대한 항원성을 가져 C형 간염 진단에 유용하게 사용될 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 HCV의 코아 단백질을 포함하는, C형 간염진단에 유용한 수용성 융합단백질, 및 상기 융합단백질을 코드하는 융합유전자를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 융합유전자를 포함하는 발현벡터 및 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 융합단백질의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적에 따라, 본 발명에서는 글루타치온 결합단백질(GST)에 코아 단백질을 다량 발현시키기 위하여 C형 간염 바이러스(HCV)의 C-말단이 제거된 코아 단백질이 융합된 융합단백질 및 상기 융합단백질을 코드하는 융합유전자를 제공한다.

상기 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 융합유전자를 포함하는 발현벡터, 특히 pGEX/Core 및 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환제, 특히 대장균주 DH5α및 BL-21을 제공한다.

상기 또 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 형질전환체를 배양한 후 세포 파쇄액으로부터 GST-코아 융합단백질을 분리하는 것을 포함하는, GST-코아 융합단백질의 제조방법이 제공된다.

본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

일반적으로 30개 이상의 아미노산으로 구성된 펩타이드는 펩타이드 합성법에 의해 합성하기 어려운 반면, 아미노산 30개 이하의 펩타이드는 대장균에서 직접 발현시킬 경우 불안정하여 분해되기 쉬우므로, 대장균의 단백질과 융합시킨 융합단백질의 형태로 발현시키는 것이 바람직하다. 융합단백질 제조에 사용할 수 있는 단백질 중 특히 글루타치온 결합단백질(Glutathione-S-transferase: GST)은 글루타치온 S-트란스퍼라제의 글루타치온 결합부위면을 'tac' 프로모터에 연결하여 대장균에서 이소프로필 티오갈락토사이드(IPTG)를 이용하여 유도시킬 경우 다량 발현되며 글루타치온을 이용한 친화성 칼럼에 의해 쉽게 분리되는 장점을 갖고 있다.

본 발명에 있어서, 상기 GST와 HCV 코아 단백질의 융합단백질을 코드하는 융합유전자는 GST 유전자의 3'-말단에 상기 코아 단백질의 B세포 및 T세포 에피토프들을 코드하는 뉴클레오티드 서열을 공지된 DNA조작방법, 예를 들면, 제한효소 절단, DNA리가제에 의한 연결, PCR 방법 등을 사용하여 연결시킴으로써 제조할 수 있으며, 화학적 DNA 합성방법에 따라 전체 DNA를 제조할 수도 있다.

상기 융합유전자를 포함하는 발현벡터는 상기 융합유전자 전체를 제조한 후 이를 적당량 발현벡터에 삽입하거나, HCV 코아 단백질을 코드하는 뉴클레오티드 서열을 먼저 제조한 후 이를 GST 유전자를 포함하는 기존 발현벡터의 GST의 3'-말단에 삽입함으로써 제조할 수 있다. 예를 들면, HCV 코아 유전자를 함유하고 있는 공지된 벡터 HCV C740(Hijikata, M. et al., Proc. NatI, Acad, Sci. USA, 88, 5547-5551(1991))를 주형으로 하고 합성 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 코아 단백질의 유전자를 합성한 후, 이를 상품화된 발현벡터, 예를 들어, pGEX-2T(미국 뉴잉글랜드 Biolab사 제품)에 함유되어 있는 GST유전자의 3'-말단에 연결함으로써, HCV 코아 단백질과 GST의 융합단백질을 대장균내에서 용해된 상태로 발현시킬 수 있는 발현벡터를 제작한다.

본 발명의 발현벡터는 HCV 코아 단백질의 B세포 및 T세포 에피토프들과 HCV 수용체에 대한 결합부위를 포함하는 코아 단백질을 코드하는 유전자를, 대장균의 GST 유전자의 3'-말단에 결합시킨 융합유전자를 포함한다. 상기 코아 단백질은 C-말단의 68개의 아미노산(또는 204bp)이 제거된 것으로 123개의 아미노산으로 이루어진 코아 단백질이 바람직하며, 가장 바람직하게는 제2도에 나타낸 아미노산 서열이다.

상기 발현벡터로 적당한 균주, 예를 들어, 대장균 DH5α또는 BL-21을 형질전환시킨 후, 적합한 조건에서 상기 형질전환체를 배양함으로써 GST-코아 단백질의 융합단백질을 발현시킨다. 대장균에서 발현된 융합단백질은 세포를 파쇄하여 얻은 세포추출물을 원심분리하여 상층액을 회수한 후 글루타치온 친화성 크로마토그래피(Smith and Johnson, Gene, 67, 31-40 (1988))로 분리, 정제함으로써 용이하게 회수 할 수 있다. 상기 융합 단백질을 적절한 단백질 분해효소, 예를 들어, 트롬빈으로 절단한 후 상기와 동일한 방법에 의하여 GST를 제거하고 코아 단백질만을 분리, 정제할 수 있다.

본 발명에 의해 생산된 코아 단백질 및 이들을 포함하는 융합단백질들은 HCV 코아에 특이적인 항체의 생산을 위한 항원으로 사용될 수 있고, 또한 예방용 및 치료용 세포독성 T세포를 유도하는 백신제제에 이용될 수 있다. 뿐만 아니라 HCV 감염여부를 진단하기 위한 코아 항체 감지에도 유용할 것이다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명한다. 단, 본 발명의 범위가 이들로만 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

[발현벡터 pGEX/Core의 제조 및 대장균 DH5α의 형질전환]

HCV 타입의 2의 코아 단백질을 코드하는 유전자를 포함하는 공지된 HCV C740(Hijikata, M. et al., Proc. NatI. Acad. Sci. USA, 88, 5547-5551(1991)) 클론을 주형으로 하고, 프라이머들로서 BamHI인식서열을 포함하는 하기 5'-말단 프라이머 및 EcoRI 인식서열을 포함하는 하기 3'-말단 프라이머를 사용하여 PCR(polymerase chain reaction)방법에 의해 전체 코아 단백질을 코드하는 염기서열의 DNA 단편을 합성하였다.

상기 PCR 결과 생성된 DNA 단편들을 BamHI과 EcoRI제한효소로 절단한 후, 592bp의 DNA절편을 정제하였다. 정제된 592bp의 DNA 절편을 pTZ19U 대장균 클로닝 벡터(입수처 : 다까라사, 일본)에 도입하여 pTZ19U/Core 벡터를 제조하였다. 이어서, 상기 플라스미드 pTZ19U/Core를 EcoRI 및 BamHI로 처리하여 약 590bp의 DNA 절편을 수득한 후, 이를 pGEX-2T(미국 뉴잉글랜드 Biolab사 제품)의 GST유전자의 3'쪽에 존재하는 BamHI과 EcoRI 클로닝 부위에 T4 DNA리가제로 연결시켜 pGEX-2T/Core(W) 클론을 수득하였다.

상기 플라스미드 pGEX-2T/Core(W)를 ClaI 및 EcoRI으로 처리하고 클레나우(Klenow) 효소로 절단된 DNA의 양말단을 평활말단(blunt end)으로 만든 다음, T4 DNA 리가제에 의해 연결시켰다. 수득한 재조합 플라스미드로 대장균 DH5α를 칼슘 클로라이드(CaCl₂) 방법(Maniatis et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Habor Laboratory, 250-251(1982))에 의해 형질전환시켰다.

이 재조합 균주로부터 플라스미드 DNA를 분리한 후 EcoRI 및 BamHI 제한효소로 절단하여 아가로즈젤상에서 전기영동시킨 결과 원하는 재조합 DNA임을 확인하였고, 이 재조합 플라스미드를 대장균 발현베터 pGEX-2T/Core라 명명하였다(제1도 참조). 상기 플라스미드 pGEX-2T/Core로 형질전환된 대장균 DH5α는 1995년 7월 7일자로 한국과학기술연구원 유전공학연구소 부설 유전자은행에 기탁번호 제 KCTC 8675P호로서 기탁하였다.

제1도에서 pGEX-2T 벡터는 GST의 선도 염기서열 및 폴리링커 부위(polylinker site)를 포함하며, 이어서 종결암호가 연결되어 있다.

GST의 선도 염기서열과 폴리링커 부위 사이에 단백질 분해효소 트롬빈 절단부위가 존재하여 이를 화살표로 표시하였다. 또한, 이 벡터에는 lac 억제자(lac repressor)를 발현하는 lacI 유전자와 tac 프로모터(ptac)가 존재한다.

본 발명의 pGEX/Core 벡터는 tac 프로모터에 의해 C-말단이 제거된 GST-코아 융합단백질을 발현할 수 있는 GST-코아 유전자를 포함하며, GST-코아 유전자 뒤에는 발현벡터에서 유래하는 6개의 아미노산을 코드하는 유전자와 TGA 종결코돈(termination codon)이 존재한다.

pGEX/Core 벡터에 삽입된 363bp의 염기서열을 결정한 결과, C-말단의 68개 아미노산(또는 204bp)이 제거된 HCV 코아서열의 특성을 가지고 있음을 확인할 수 있었다(제2도 참조).

[실시예 2]

[GST-코아 융합단백질의 대장균에서의 발현]

상기 실시예 1에서 제조한 pGEX/Core로 형질전환된 대장균 DH5α 균주를 엠피실린을 포함하는 영양액체배치(1% 트립톤, 0.5% 효모추출물, 0.5% NaCl, 0.2% 포도당, 100㎍/㎖ 엠피실린)에서 37℃로 12내지 14시간 동안 배양한 후, 이 배양액 500㎕를 영양액체배지 5㎖에 접종하여 37℃에서 2x10⁸세포(600nm에서 흡광도가 0.5내지 0.8)가 되도록 배양하였다. 최종농도가 0.5mM이 되도록 이 소프로필-베타-디오갈락토시드(isopropyl-β-D-thiogalactoside : IPTG)를 넣어 4시간 동안 GST-코아 융합단백질의 생성을 유도시켰다. 이 때, IPTG를 가하지 않은 시료를 동일한 조건에서 배양시켰다. 융합단백질을 생성하도록 유도된 배양액과 유도되지 않은 배양액을 각각 200㎕씩 취하여 4000Xg에서 2분간 원심분리하여 세포를 수득하였다. 수득된 각 세포를 8M 우레아-SDS 시료용액(0.01M 인산 나트륨 pH 7.2, 1% β-메르캅토에탄올, 1% SDS, 8M 우레아)에서 녹이고 5분간 끓인 후 12% 폴리아크릴아미드 젤 전기영동(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)을 실시하여 융합단백질의 생성을 확인하였다(제3a도 참조).

제3a도는 GST-코아 융합단백질을 대장균에서 발현시켜 12% SDS-PAGE한 것으로서, 제1열은 pGEX-2T 플라스미드로 형질전환시킨 대장균을 IPTG로 유도하지 않은 것이고, 제2열은 pGEX-2T 플라스미드로 형질절환시킨 대장균을 IPTG로 유도한 것이고, 제3열은 코아 단백질 유전자 전체를 갖고 있는 pGEX-2T/Core(W) 플라스미드로 형질전환시킨 대장균을 IPTG로 유도한 것이고, 제4열은 C-말단이 제거된 123개 아미노산의 코아 단백질의 유전자를 갖고 있는 pGEX/Core 플라스미드로 형질전환시킨 대장균을 IPTG로 유도한 것이고, 제5열은 생성된 GST-코아 융합단백질을 바로 GST-아가로즈 친화성 칼럼을 통과시켜 분리정제한 것이다. 이 결과, 코아 단백질 전체를 코드하고 있는 GST-코아(W) 융합단백질은 대량 발현되지 않았으나, C-말단이 제거된 123개 아미노산의 코아 단백질을 함유하고 있는 GST-코아 융합단백질은 기대했던대로 분자량 약 42kDa 정도 크기의 단백질로서 생성됨을 확인하였다.

약 42kDa의 GST-코아 융합단백질의 항원성을 확인하기 위해 토끼에서 제조한 코아 단백질에 대한 폴리클로날 항체를 탐침으로 사용한 웨스텐 블롯팅 실험(Western blot, Towbin et al., Proc. NatI. Acad. Sci. USA. 76, 4350(1979))을 수행한 결과, 발현된 GST-코아 융합단백질이 코아 단백질에 특이적인 항원성을 갖고 있음을 확인하였다(제3b도 참조).

제3b도에서 제1열은 C-말단이 제거된 GST-코아 융합단백질을 친화성 칼럼을 통과시켜 분리정제한 것이고, 제2열은 pGEX/Core 플라스미드로 형질전환시킨 대장균을 IPTG로 유도한 세포 추출물을 나타내며, 제3열은 pGEX-2T 플라스미드로 형질전환시킨 대장균을 IPTG로 유도시킨 세포 추출물을 나타내며, 제4열은 제3열의 조건에서 IPTG로 유도시키지 않은 세포 추출물(UNI)을 12% SDS-폴리아크릴아미드 젤로 분리한 것을 나타낸다. 제3b도에서 보듯이, 토끼에서 제조한 코아의 폴리클로날 항체가 GST-코아 융합단백질들과 특이적으로 반응함을 알 수 있었다.

[실시예 3]

[GST-코아 융합단백질의 분리 및 정제]

플라스미드 pGEX/Core로 칼슘 클로라이드(CaCl₂) 방법에 따라 대장균 BL-2l 균주를 형질전환시킨 후, 이를 엠피실린이 첨가된 영양액체배지 100㎕ 중에서 37℃로 12 내지 14시간 동안 배양한 다음, 영양액체배지(엠피실린 함유) 1ℓ에 접종하여 600nm에서 흡광도가 0.5 내지 0.8이 될 때까지 배양시키고, 최종농도가 0.5mM이 되도록 IPTG를 가한 후 4시간 더 배양하였다. 배양액을 4℃에서 400Xg로 15분간 원심분리하여 세포 침전물을 얻은 다음 포스페이트 완충액(PBS : 8g NaCl, 0.2g KCl, 1.15g Na₂HPO₄, 0.2g KH₂PO₄pH 7.2, 1mM DTT, 0.1mM PMSF)으로 1회 세척하여 10㎖의 PBS 용액에 현탁시킨 후, 초음파 처리 장치(Branson사 Sonifier 450)에서 초음파 처리하여(강도 5, 2분 : 3회) 현미경하에서 세포가 파쇄된 것을 확인하고 4℃에서 12000rpm으로 30분간 원심분리하여 상층액을 취하였다. 이 상층액을 5㎖의 글루타치온 아가로즈(Sigma사, 단백질 결합능력 8㎎/㎖)로 채운 칼럼(직경 1.5㎝ x 높이 5㎝)에 통과시키고 50㎖의 PBS 완충액으로 칼럼을 세척하였다. 5mM의 환원된 글루타치온을 함유하고 있는 50mM 트리스(Tris)용액(pH 8.0)으로 친화성 칼럼에 결합된 GST-코아 단백질을 용출시켜 1.2㎖씩 분획하였다. 각각의 분획을 5㎕씩 취하여 램리 시료 용액(Laemmli UK, Nature(London), 227, 680-685(1970))에 가한 후, 12% SDS-PAGE를 시행하였으며, 그 결과를 제4도에 나타내었다.

제4도에서 보듯이 GST-코아 융합단백질은 친화성 칼럼에 의해 쉽게 분리됨을 알 수 있었고, 약 12㎖의 용출용액으로 칼럼에 결합한 단백질을 모두 분리정제할 수 있었다.

[실시예 4]

[GST-코아 융합단백질의 생산량 및 수율 측정]

상기 발현된 GST-코아 융합단백질은 상층액에도 존재하지만 불용성 침전물로 존재할 수도 있으므로 이를 확인하고 또한 친화성 칼럼을 통과시켰을 때의 수율을 확인하기 위해 다음 실험을 실시하였다.

pGEX/Core 플라스미드로 형질전환된 대장균 BL-21 균주를 엠피실린을 함유하는 영양액체배양배지 5㎖에 접종하여 600nm에서 흡광도가 0.5내지 0.8이 되도록 배양하였다. 이 배양액에 최종농도가 0.5mM이 되도록 IPTG를 가하고 4시간 더 배양한 후 4000Xg에서 10분간 원심분리하여 PBS 용액으로 1회 세척하고 500㎕의 PBS의 현닥시킨 다음 상기조건에서 초음파로 세포를 파쇄하였다. 세포 파쇄액 중 5㎕는 보존하고 나머지 세포 파쇄액은 12000rpm에서 15분간 원심분리하여 수용성 분획과 비수용성 분획으로 분리하였다. 수용성 분획을 상기 실시예 3에서 기술한 바와 같이 글루타치온 아가로즈 친화성 칼럼을 통과시켜 GST-코아 융합단백질을 분리정제한 후 12% SDS-PAGE를 실시하였으며, 그 결과를 제5도에 나타내었다.

제5도에서 제1열은 상기 500㎕의 세포 파쇄액 중 5㎕를 우레아-SDS 시료용액에 녹인 것이며, 제2열은 상기 비수용성 분획 40㎕를 SDS-우레아 시료용액에 녹인 것이며, 제3열은 상기 수용성 분획 5㎕를 램리 시료용액에 녹인 것이며, 제4열은 친화성 칼럼을 통과시켜 분리정제한 GST-코아 융합단백질을 나타낸 것이다. 이 결과에서 보듯이, GST-코아 융합단백질은 대부분 수용성 분획에서 존재하는 것을 알수 있었다. 또한 덴시토, 메트리 스캐닝한 결과 정제된 GST-코아 융합단백질은 84% 이상의 순도를 나타내었는데, 이는 42kDa 융합단백질을 한 단계의 친화성 칼럼을 이용하여 84%의 순도로 분리정제할 수 있음을 보여준다. GST-코아 융합단백질의 단계별 수율은 하기 표1에 나타내었다. 약 5㎖의 재조합 대장균의 배양액으로부터 약 6㎎의 GST-코아융합단백질이 생성되는 것으로 보아, 전체 단백질의 50% 이상이 융합단백질로 구성되어 있고 한 단계의 친화성 칼럼에 의해 84%의 순도로 GST-코아 융합단백질이 분리정제됨을 알 수 있었다. 단백질의 정량은 브래드포드 방법(Bradford M. M, Anal, Biochem. 72, 248-254(1976) ; BioRad사 Protein assay kit 사용)에 의하여 수행하였다.

[실시예 5]

[GST-코아 융합단백질의 항원성 확인]

상기와 같이 분리정제된 GST-코아 융합단백질의 항체결합능을 확인하기 위해, HCV로 감염된 환자의 혈청을 확보하여 단계적으로 희석시킨 후 300ng의 GST-코아 융합단백질 및 GST 단백질과 반응시켜 간접 효소면역측정법(indirect ELISA)을 수행하여 그 결과를 제 6a도에 나타내었다.

제6a도에서 보듯이 GST-코아 융합단백질은 혈청을 100내지 3200배까지 희석한 경우에도 환자(P)와 정상인(N)에 있어서 뚜렷한 흡광도의 차이를 보여 주었는데, 이는 정제된 GST-코아 융합단백질이 항체에 특이적으로 결합한다는 것을 의미한다. 반면에, GST 단백질 300ng을 사용하여 ELISA를 수행한 경우에는 동일한 희석조건하의 환자(P)와 정상인(N) 혈청에서 흡광도의 차이가 관찰되지 않았는데, 이는 환자와 비감염환자의 흡광도 차이가 코아 단백질에서 유래하는 것임을 보여 준다.

항원의 농도가 항체와 특이적으로 반응하는데 어떤 영향을 주는가를 알아보기 위하여, 환자와 정상인의 혈청을 1000배로 희석한 후 5ng에서 800ng까지의 GST-코아 융합단백질 및 GST 단백질 농도에서 간접 ELISA를 수행하여 그 결과를 제6b도에 나타내었다.

제6b도에서 보면, GST-코아 융합단백질과 환자(P)의 혈청과의 반응이 5ng 내지 50ng 사이에서는 농도 의존적으로 일어나며 50ng 내지 800ng 사이에서는 포화상태를 나타낸 반면, 정상인(N)의 혈청을 사용하였을 경우에는 모든 농도에서 흡광도가 기본 흡광도를 나타내었다. 또한, GST 단백질을 환자(P) 및 정상인(N)의 혈청과 반응시켰을 경우에도 기본 흡광도를 나타내었다. 즉, 분리정제된 GST-코아 융합단백질은, 융합단백질임에도 불구하고 HCV 코아 단백질의 특이적인 항원성을 나타내는 것을 알 수 있었으며, 약 50ng 농도에서 진단시약으로서의 효과를 가질 수 있음을 알 수 있었다.

Claims

클루타치온 결합단백질(GST)에 C형 간염 바이러스의 C-말단이 제거된 코아 단백질이 융합된 융합단백질.
제1항에 있어서, 상기 코아 단백질이 하기 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 융합단백질 :
제1항의 융합단백질을 코드하는 융합유전자.
제3항에 있어서, 상기 융합유전자 중에 포함된, HCV 코아 단백질을 코드하는 유전자가 하기 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 융합유전자 :
제3항의 융합유전자를 포함하는 발현벡터.
제5항에 있어서, 발현벡터 pGEX/Core.
제5항의 발현벡터로 형질전환된 형질전환체.
제7항에 있어서, pGEX/Core로 형질전환된 대장균주 DH5α(KCTC 8675P) 또는 pGEX/Core로 형질전환된 대장균주 BL-21.
제7항의 형질전환체를 배양한 후 세포 파쇄액으로부터 GST-코아 융합단백질을 분리하는 것을 포함하는 GST-코아 융합단백질의 제조방법.
항원으로서 제1항의 융합단백질을 포함하는 C형 간염진단용 시약.