KR20170093677A - Arsntd를 융합파트너로 이용한 수용성 및 활성형 재조합단백질의 생산방법 및 그 생산물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 단백질폴딩 유도기술인 퓨젼 단백질 발현 기술을 이용하여 대장균에서 수용성 유전자재조합 단백질을 효율적으로 생산하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 인플루엔자 항원 단백질인 헤마글루티닌(hemagglutinin; HA) 항원 중 면역특이성을 유도하는 HA1 부위와 단백질수용성 발현유도 융합파트너인 ARSNTD(Aminoacyl tRNA synthetase N-terminal domain)을 융합하여 ARSNTD-HA 융합단백질을 수용성으로 발현하고 이를 삼중체로 자가 조립을 유도하여 감염을 효과적으로 방어하는 예방백신으로 개발하는 것이고, 또한 인간 파필로마 바이러스(Human Papilloma virus, HPV)의 L1을 ARSNTD-L1 융합단백질로 발현하여 수용성 캡시드를 형성하고 HPV의 감염을 효과적으로 방어하는 예방백신의 개발에 관한 것이다.

Description

ARSNTD를 융합파트너로 이용한 수용성 및 활성형 재조합단백질의 생산방법 및 그 생산물{A MANUFACTURING METHOD FOR SOLUBLE AND ACTIVE RECOMBINANT PROTEIN USING Aminoacyl tRNA synthetase N-terminal domain AS FUSION PARTNER AND A PRODUCT THEREOF}

본 발명은 ARSNTD를 융합파트너로 이용한 수용성 및 활성형 재조합단백질의 생산방법 및 생산물에 관한 것이다.

유전자 재조합 인플루엔자 백신 및 파필로마바이러스 백신 등 재조합 단백질백신에 있어 이를 수용성으로 만들기 위해서는 융합파트너를 이용한 단백질의 발현 시스템이 필요하다. 기존의 융합파트너들의 경우 퓨전파트너의 크기가 큰 문제를 가지거나, 멀티머 형성에 문제를 가지고 있다. 특히 기존 특허[대한민국 특허 10-0890579]에서 이용되어진 LysRS나 LysN등은 이합체를 형성하여 멀티머 형성을 방해하기도 하고, 기존 융합파트너의 경우 유래가 대장균이기 때문에 해당 시스템을 이용하여 생산된 백신은 면역반응을 일으키는 등의 문제가 대두되었다.

계절형 인플루엔자 바이러스의 높은 항원변이성과 판데믹 종의 잦은 출현은 높은 의료비 부담과 에볼라, 메르스와 같은 다른 감염성 질병처럼 인간 건강에 있어 중대한 사회경제학적 손실을 일으킨다[1, 42, 43, 44].

인플루엔자 A 바이러스의 헤마글루티닌(HA) 표면 항원은 자연면역의 중요한 요소이며 수용체 부착이나 막의 융합 같은 세포 부착에 있어 중요한 역할을 한다[5, 33]. 삼량체 막 관통 단백질인 바이러스 HA는 각각 여러 개의 이황화결합을 가지고 있는 HA1 과 HA2, 2개의 단위체로 구성되어 있다[14, 15]. HA단백질은 인플루엔자백신에서 감염으로부터 보호하는 항체를 유도하는 주요 항원으로 알려져 있다.

재조합 기술을 사용한 HA 생산은 전통적인 인플루엔자 바이러스 항원 생산에 있어 계란에서의 HA생산이 긴 시간이 걸리는 점, 계란공급에 따라 영향을 받는 점, 세포 기반 배양법의 높은 비용 등 여러 문제점을 해결할 수 있다[6]. 재조합 기술은 여러 세포 배양 시스템에서의 바이러스유사입자(VLP) 백신 생산을 가능하게 한다[45]. 세균에서 재조합 항원은 한 달 이내에 생산 가능하며 비용이 적고 전통적 생산 방법에 비해 스케일 업이 쉽다[25]. 그러나 이러한 시스템은 전통적인 생산 시스템에 비해 박테리아 내에서 효과적인 재조합 바이러스 HA 생산은 빠르고 안전하지만 몇 가지 실제적인 문제점이 있다[9].

HA 단백질의 조립 문제와 적절한 접힘에 있어서의 어려움은 대장균에서 백신 항원을 만드는데 있어 가장 큰 장애물이다[10]. 박테리아에서 생산 시 재조합 HA의 발현 수준은 높지만 종종 적절하게 접혀 삼량체를 이루는데 실패한다[27, 30, 36]. 기존의 특허기술(특허등록번호 10-0890579)에서 명시된 LysRS를 신규 융합 파트너로 사용한 과거의 연구는 LysRS의 이량체가 HA가 삼량체로 이루는 것을 방해 한다. 이뿐 아니라 LysRS의 너무 항원성이 높아서 원하는 목적단백질보다 LysRS에 대한 항체생성이 더 많은 문제를 보여주었다[11].

최근 연구에 따르면 폴돈 이라는 자연적으로 삼량체를 이루는 박테리오파지 T4 피브리틴을 HA의 C 말단에 붙이는 것이 재조합 HA의 수용성 발현을 가능하게 해준다고 한다. 포유류 세포에서 발현되는 철을 함유한 세포내 단백질인 페리틴과 결합된 재조합 HA 가 자발적으로 조립되어 페리틴 표면에 9개의 삼량체 바이러스 스파이크를 생성한다는 것이 증명되었다[8]. 이러한 연구들은 재조합 HA 항원이 적절하게 접혀 삼량체를 이루는 것을 돕고 융합된 단백질에 대항해 생산되는 원치 않는 항체에의 생산을 피할 수 있는 다른 효과적인 융합태그가 필요하다는 것을 보여준다[24, 27].

바이러스 유래 단백질을 이용한 재조합단백질백신이나 저온에 적응시켜 그 병원성이 약화된 바이러스를 이용한 생백신은 인플루엔자 바이러스 예방에 실제로 좋은 효과를 나타내고 있다. 하지만 상기한 바와 같이 재조합 단백질백신의 경우 제대로 기능을 하는 바이러스 항원의 생산을 하는데 있어서 많은 어려움이 있다. 포유류 세포 등 진핵생물을 이용하는데 따른 많은 시간과 비용이 드는 문제점이 있고 대장균과 같은 원핵생물을 이용할 때는 제대로 protein folding이 되지 않거나 중화항체를 생산하지 못하는 문제점들이 존재하였다. 이처럼 대장균에서 발현된 재조합 바이러스 항원을 백신으로 사용하는데 있어 인플루엔자 헤마글루티닌 당단백질 막의 수용성 발현과 HA 단량체가 세포와의 결합과 면역원성에 중요한 삼량체를 이뤄야 하는 등의 과제가 요구된다.

본 발명은 상기의 문제점을 해결하고, 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 재조합 단백질을 생산함에 있어 이를 수용성으로 만들기 위해서는 융합파트너를 이용한 단백질의 발현 시스템을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 ARSNTD(Aminoacyl tRNA synthetase N-terminal domain)을 융합파트너로 이용한 단백질의 생산방법을 제공한다.

또 본 발명은 ARSNTD을 융합파트너로 사용하여 인플루엔자 헤마글루티닌 (HA)항원을 수용성 삼중체의 형태로 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 헤마글루티닌 (HA)항원은 헤마글루티닌 단백질의 HA1 부위인 것이 바람직하고, 상기 헤마글루티닌 (HA)항원은 H1형 인플루엔자 바이러스 유래 HA인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또 본 발명은 ARSNTD-HA 삼중체 융합단백질을 백신항원으로 사용하는 인플루엔자 예방백신을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 백신은 ARSNTD의 N 말단 부위를 ARSNTD 융합짝으로 사용하고 헤마글루티닌 HA1 부위를 항원으로 사용하는 것이 바람직하고, 상기 백신은 H1형 인플루엔자 바이러스 유래 HA를 백신항원으로 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 ARSNTD을 융합파트너로 사용하여 파필로마 바이러스(HPV)를 수용성 캡시드의 형태로 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 방법은 HPV 단백질의 L1 부위를 항원으로 사용하는 것이 바람직하고, 상기 방법은 HPV 바이러스유래 L1를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또 본 발명은 ARSNTD-L1 캡시드 융합단백질을 백신항원으로 사용하는 파필로마 바이러스(HPV) 예방백신을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 백신은 Aminoacyl tRNA synthetase N-terminal domain의 N 말단 부위를 융합짝으로 사용하고 HPV L1 부위를 항원으로 사용하는 것이 바람직하고, 상기 백신은 HPV 유래 L1를 백신항원으로 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또 본 발명은 다음 단계를 포함하는 ARSNTD 백신의 생산방법을 제공한다: a) 바이러스 유사입자(VLP, Virus-like Particle)의 유전자를 ARSNTD와 융합된유전자를 제조하는 방법; 및 b) ARSNTD와 바이러스유사입자가 퓨전된 상태로 발현하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 방법은 b) 단계에서 발현된 단백질을 정제하는 단계를 추가로 포함하고, 상기 방법은 정제된 단백질을 모노머 이상으로 중합시키는 것을 추가적으로 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

이하 본 발명을 설명한다.

본 발명에서는 재조합 HA의 용해도를 향상시키기 위해 우리는 RNA 상호작용 기능이 있는 단백질의 N-말단 도메인을 바이러스 항원 단백질의 융합파트너로 사용하였다. 이러한 융합을 통해 수용성으로 인플루엔자 항원단백질인 헤마글루티닌(hemagglutinin; HA) 삼중체(trimer)를 매우 효율적으로 생산함에 성공하였고 이는 실험동물을 대상으로 면역시 매우 우수한 방어면역을 제공하는 백신으로의 효능을 검증하였다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서는 포유류의 ARS의 4개의 도메인 중 첫 번째 도매인인 약 70 아미노산 크기의 ARSNTD(aminoacyl tRNA synthetase N-terminal domain)를 박테리아에서의 바이러스 단백질의 수용성 발현을 위한 결합 파트너로 사용하였다. ARSNTD는 대장균이나 효모의 tRNA ligase에는 존재하지 않으며 사이즈는 작지만 LysRS처럼 RNA와 상호작용하는 기능을 일부 가지고 있다. 상호작용 한 RNA가 샤페론처럼 작용하기 때문에 ARSNTD가 응집되기 쉬운 단백질의 용해도를 향상시킬 수 있다[12, 13]. ARSNTD의 큰 용해도는 그것의 작은 크기에도 불구하고 결합되어 있는 바이러스 단백질의 용해도를 향상 시킬 수 있다[28]. 게다가 ARSNTD의 작은 크기는 멀티머를 형성해야만 하는 단백질들을 생산을 가능하게 하고, 불필요한 면역반응을 일으키는 항체생성요소를 감소시킬 수 있다. 따라서 ARSNTD는 기존의 한계를 뛰어넘은 융합파트너라고 할 수 있다.

더 철저하게 융합 파트너에 대한 원치 않는 항체의 생성을 피하기 위해 재조합 항원을 접종하고자 하는 동물(쥐 혹은 토끼) 로부터 ARSNTD를 클로닝 하였다. 궁극적으로 인체를 대상으로 백신을 개발하기 위하여 인체유래 ARSNTD를 융합파트너로 사용할 수 있다.

이러한 유전자 재조합 단백질을 발현, 생산, 정제하였다. 정제항원을 쥐를 대상으로 하는 면역 후 공격접종으로부터 탁월하게 보호하는 예방기능을 입증하였다. 즉 본 연구에서 사용된 수용성 재조합단백질이 쥐에서의 면역원성 실험을 통하여 효과적인 항원으로 사용될 수 있는지에 대하여 백신을 접종한 쥐에게 바이러스로 공격접종하여 사망률과 몸무게의 변화를 측정하여 이를 근간으로 본 백신이 효과적으로 작용하고 있다는 것을 증명하였다. 이를 중화항체실험을 통하여 바이러스를 불활성화 시키는 중화항체가 생산되었다는 것을 실험으로 입증하였다. 이러한 결과들은 유행성독감, 팬더믹, 및 고병원성조류인플루엔자 예방백신을 더욱 저렴하고 신속하게 개발하는 방법으로 사용될 것으로 예상된다.

PR8 H1N1 바이러스에 대한 예방효능은 대장균에서 발현된 백신항원이 자연형의 형태로 적절하게 접힘에 기인함을 보여준다. 따라서 병원성 인플루엔자 바이러스에 대한 예방백신항원에 적합하고 향후 항원변이에, 계절성 인플루엔자 그리고 H3, H5, H7, B 바이러스 등의 다른 종에 대한 향후 백신 연구에 기대될 수 있는 기능적 삼량체를 포함한다는 강력한 증거를 보여주었다[26, 39, 40, 41].

또한 본 발명은 대장균에서 인유두종바이러스(Human Papiloma Virus, 이하 HPV) 백신의 생산에도 적용가능하다.

자궁경부암은 매년 약 493,000건의 새로운 진단과 274,000명의 사망자를 발생시키는 세계 여성들의 두 번째로 높은 사망 원인이다. 대부분, 약 85%의 경우가 개발도상국에서 발생하고, 상대적으로 젊은 여성들에게서 암이 발생하기 때문에 짧은 생의 이유가 된다[46]. 8가지의 대표적인 형(HPV 16, 18, 45, 31, 33, 52, 58 과 35)은 전세계적으로 모든 자궁경부암의 85%를 차지하고 그 중에서도 인유두종바이러스 16과 18형은 약 70%를 차지한다[47].

유두종바이러스(PVs)는 상당히 다양한 그룹으로 구성되어 있고, 대부분의 포유동물들과 새들을 감염시킬 수 있다. 사람에서는 다양한 인유두종바이러스(HPV)형들이 계통발생학적으로 구별된 그룹으로 나뉘어져 있고, 대부분의 높은 감염위험이 있는 인유두종바이러스형은 알파-유두종바이러스(alpha-papillomaviruses)에 속해있다[48]. 이 속(genus)은 점막에 악성신생물(malignant neoplasms)과 암을 일으킬 수 있는 인유두종바이러스 16형과 18형이 포함되어 있다[49].

인유두종바이러스는 두 가닥의 DNA를 가진 껍질이 없는 작은 바이러스이다. 이것은 E1, E2, E4, E5, E6와 E7인 6개의 조절 단백질들과 L1과 L2인 캡시드(capsid) 단백질들을 인코딩하는 약 8kb의 원형 유전체를 가지고 있다[50]. 8개의 개방형 해독틀 open reading frames, ORFs)은 또한 초기(nonstructural)와 진행단계(structural) 바이러스 유전자들로 나뉜다. 초기단계의(early, E) E1 과 E2 단백질은 바이러스 DNA를 기저층에서 에피좀(episome)으로 유지시켜주고, E6와 E7은 세포순환 증식을 자극시켜 주기 위해 초기 단계에서 발현이 된다. 세포순환 기능조절 때문에, E6와 E7은 발현된 고위험군 인유두종바이러스형에 의해 E6와 E7은 발암 단백질이다. E4와 E5는 증식의 향상에 관련되어 있지만, E5는 인유두종바이러스에 의한 발암의 진행단계에 꼭 참여되는 것은 아니다. 왜냐하면, E5 코딩서열은 숙주세포의 DNA에 통합(integration)되는 동안 없어지기 때문이다. 진행단계(late, L)의 L1과 L2 단백질들은 감염된 조직의 상층에서 발현이 된다. L1은 주요 캡시드 단백질이고, 마이너(minor)인 L2 단백질은 아마도 패키징(packaging)과 감염성을 향상시켜줄 것이다[51-54].

인유두종바이러스는 72개 오량체의 캡소미어(pentameric capsomeres)로 구성되어 있으며, 이것은 주요 캡시드 단백질인 L1으로 되어있고 정이십면체 격자로 배열되어 있다. 마이너 캡시드 단백질인 L2 역시 바이러스 표면에 존재하지만 L1 단백질의 30분의 1정도만을 차지하고 있다[55,56]. 바이러스 입자는 분자간 이황화결합으로 안정화 되어있다. 인유두종바이러스의 L1 단백질에는 몇 개의 시스테인이 있지만, 오직 두 개의 시스테인(16형 에서는 175번과 428번 아미노산)만이 결합에 관여하고, 이 시스테인은 다른 형들 사이에서 보존된다. 이 시스테인이 인유두종바이러스 입자를 만드는데 중요한 이유는 175번과 428번의 시스테인만이 밖으로 노출되기 때문일 것이다[57,58].

다른 것들을 제외한 L1 단백질만이나 L1/L2단백질이 다양한 세포타입에서 발현될 때, 바이러스유사입자(VLPs)는 본질적으로 자가조합(self-assembly)이 된다. VLPs는 구조적, 면역학적으로 자연적으로 발생한 전염성 인유두종바이러스와 매우 유사하고, 접종 후에 중화항체를 생산할 수 있다[59,60]. 그래서 연구자들은 인유두종바이러스 백신을 개발하기 위해 L1 단백질에 초점을 맞춰왔다. 일반적으로, 재조한 VLPs는 BSC-1, 곤충세포, 효모, 박테리아와 같은 다양한 종류의 세포에서 발현되었다[61-64]. 현재 예방을 위한 라이선스를 가진 백신에는 이가 백신과 사가 백신이 있다. Cervarix^TM(GlaxoSmith-Kline)은 인유두종바이러스 16형과 18형의 L1 항원을 함유한 이가 백신이다. 두 타입의 인유두종바이러스의 L1 단백질은 곤충 세포에서 생산되어 항원으로 사용되었다. Gadasil(Merck and Co.)은 인유두종바이러스 16형과 18형 뿐만 아니라 6형과 11형에 대한 사가 백신이다. 이 백신 또한 L1 단백질을 항원으로 사용하였으며, 단백질은 효모(Saccharomyces cerevisiae)에서 생산하였다. 이 백신들은 각각 2009년과 2006년에 FDA 승인을 받았다[65-67]. 하지만 이 백신들은 적은 발현 레벨과 높은 생산 비용 때문에 상대적으로 비싸다는 단점이 있다. 이러한 문제점은 가장 많은 양의 인유두종바이러스 백신을 필요로 하는 개발도상국에 제공할 때 큰 문제가 된다[68].

본 발명에서는, 대장균에서 인유두종바이러스 16형의 VLPs를 생산하는 효율적인 방법을 기술하였다. 재조합 HPV 16L1의 용해도를 향상시키기 위하여 앞서 기술한 ARSNTD 융합파트너로 사용하였다. 이것을 통해 수용성으로 인유두종바이러스의 VLPs를 대장균에서 효율적으로 생산하였고, 이는 동물실험을 통하여 기존에 상용화 되어있는 곤충세포 유래 VLP 백신과 비슷한 면역원성을 갖는 것을 검증하였다.

구체적으로는 ARSNTD의 작은 크기 때문에 원치 않는 항체의 생성을 막을 수 있고, 궁극적으로 인체를 대상으로 백신을 개발하기 위하여 인체유래 ARSNTD(hARSNTD)를 융합 파트너로 사용하였다.

이러한 유전자 재조합 단백질을 박테리아 시스템을 이용하여 인유두종바이러스의 고위험군인 16형의 캡소미어(capsomeres)와 VLPs를 생산하였다. 사용된 HPV 16L1 서열은 대장균에서 발현 레벨을 높이기 위하여 코돈 최적화(codon optimization)을 하였고, hARSNTD는 L1 단백질의 수용성을 높이기 위하여 L1의 N 말단에 융합시켰다. 이러한 시도들로, 우리는 대장균에서 효과적으로 수용성의 HPV 16L1 융합 단백질을 얻었다.

대장균 유래 정제항원을 전자현미경을 통해 구조분석을 하였다. 융합 단백질은 30-40nm의 동종의 캡소미어를 이루는 것을 확인하였고, TEV protease이용하여 절단된 단백질의 경우 일반적인 인유두종바이러스 VLPs의 크기인 55nm보다 훨씬 큰 100nm의 동종의 VLPs가 확인되었다. 대장균 유래 VLPs의 크기는 B 세포 수용기에 낮은 레벨로 교차 결합 (cross-linking)되어 작은 크기의 캡소미어에 대한 항체가 VLPs에 대한 항체보다 더 약하게 유도되기 때문에 우리의 VLPs가 다른 VLPs보다 더 높은 면역원성을 유도할 수 있다[75]. 다양한 면역 보조제와 함께 우리의 대장균 유래 VLPs를 쥐에 주사했을 때, Cervarix^TM의 면역원성과 비슷한 수치를 확인하였다.

결론적으로 본 발명은 높은 비용으로 상용화 되고 있는 백신의 생산법을 대체하는 방법을 제공한다. 현재, 두 가지의 상용화된 백신인 Gadasil과 Cervarix^TM는 높은 비용 때문에 이러한 백신을 가장 필요로 하는 개발도상국에 사용되기는 적합하지 않다. 이 두 가지의 백신은 실제 지금까지 생산되는 백신들 중 가장 비싸다[22]. 그러므로 예방 백신의 생산비용 절감은 개발도상국을 위한 중요한 절차이다. 우리는 대장균에서 HPV 16형 VLPs와 캡소미어를 생산하였다. 우리가 생산한 대장균 유래 VLPs는 상용화되어 있는 백신을 대신하여 더욱 저렴하고 효과적인 방법으로 개발되어 자궁경부암을 위한 백신으로서 사용될 수 있는 잠재성을 보여주었다.

본 발명은 이전의 생산에 3-6개월이 소요되는 유정란 기반 백신 생산법과 세포기반 백신 생산법을 대체하는 방법을 제공하며, 기존 장기간의 기간이 소요되는 생산방법은 급속도로 감염이 확산되는 판데믹을 예방하는 기술로 사용함에 한계가 있었다. 본 별명에 의하면 짧은 시간 내에 인플루엔자예방 백신 생산에 대한 안정적인 파이프라인을 제공하여 팬더믹의 예방 뿐 아니라 매년 유행하는 계절형 인플루엔자 백신에게까지 응용될 수 있으며, 우리는 대장균에서 HPV 16형 VLPs와 캡소미어를 생산하였다. 본 발명에서 생산한 대장균 유래 VLPs는 상용화되어 있는 백신을 대신하여 더욱 저렴하고 효과적인 방법으로 개발되어 자궁경부암을 위한 백신으로서 사용될 수 있는 잠재성을 보여주었다.

도 1은 ARSNTD와 HAgd 서열분석 (A) 대장균에서 융합단백질의 발현을 위해 사용된 pGE-ARSNTD 벡터의 개략적 도해. (B) 인간, 쥐, 토끼에서 유래된 각 ARSNTD 서열 간의 비교, E.coli는 ARSNTD 서열이 없음. (C) 구형 머리 도메인은 HA1 소단위에서 HA 63-286 아미노산으로 구성되어있음. (D) TEV 프로테아제를 사용해 6개의 히스티딘 태그가 없는 순수한 ARSNTD를 얻을 수 있으며 재조합 단백질 ARSNTD-HAgd가 융합 태그 MLNS와 타겟 단백질 HAgd로 나눠질 수 있음. (E) 삼량체 헤마글루티닌의 구형 머리 도메인의 개략적 도해.
도 2는 ARSNTD 혹은 LysN와 융합된 단백질의 대장균에서의 수용성 발현 (A) 쥐, 토끼의 LysRS의 대장균에서의 용해도 비교 (B) 인간, 쥐, 토끼의 ARSNTD의 대장균에서의 발현 수준 비교(C-E) 각 ARSNTD-HAgd의 수용성 발현 (F) 각 ARSNTD-eGFP의 수용성 발현.
도 3은 니켈 크로마토그래피를 이용한 ARSNTD-융합 단백질의 정제 (A-B) 정제된 ARSNTD-HAgd 단백질 분획. (C-D) 정제된 ARSNTD 융합 eGFP 단백질분획.
도 4는 젤 여과 크로마토그래피를 이용한 융합 항원의 소단위체 상태 결정. (A) mARSNTD-HAgd와 rARSNTD-HAgd의 분배계수(Kav)를 이용해 결정된 분자량 설명. (B-C) SDS PAGE를 통한 ARSNTD-융합 HAgd 분획의 분석 (D) 대조군 mARSNTD-eGFP의 분배계수(Kav)를 이용해 결정된 분자량 설명. (E) SDS-PAGE에 의해 분석된 각각의 ARSNTD-융합 eGPF의 분획. (F) ARSNTD-HAgd와 ARSNTD-eGFP의 소중합체적 상태의 개략적 도해.
도 5는 PR8 바이러스 챌린지에 대해 ARSNTD-융합 HAgd 접종이 쥐를 보호한다. (A) ARSNTD 융합 HAgd 항원과 대조군 ARSNTD 융합 eGFP가 접종된 바이러스 챌린지 쥐들의 체중 변화. (B) 접종된 바이러스 챌린지 된 쥐들의 생존율. (C) 예방접종을 하지 않고 바이러스에 감염된 쥐의 체중 변화. (D) 예방점종 되지 않고 바이러스에 감염된 쥐들의 생존율.
도 6은 바이러스 중화실험 A, C. mARSNTD-HAgd 와 rARSNTD-HAgd에 대한 쥐의 항혈청이 검측 가능할 정도의 HI와 중화항체를 포함함. B,D. rARSNTD-HAgd에 대한 토끼의 항혈청은 쥐의 항혈청에 비해 더 많은 HI와 중화항체를 포함하고 있음.
도 7은 대장균 LysRS에 융합된 A/PR/8 HAgd 단백질의 수용성 발현 및 정제. (A) 대장균 벡터 pGE-LysRS(4) 벡터에 HAgd 유전자를 삽입. (B) 대장균에서 LysRS-HAgd 융합단백질의 수용성 발현. 수용성 단백질 형태로 발현된 융합단백질을 분리 및 정제.
도 8은 마우스 모델 LysRS-HAgd 융합단백질 백신 접종.(A) LysRS-HAgd 단백질을 세 그룹(목적단백질, 목적단백질에 Alum 혼합, PBS만 투여)의 마우스의 복강을 통해 2주 간격으로 2차례 투여. (B) boosting 접종 전과 공격접종 전 두 차례 마우스 혈청을 분리 및 2주간 독감 바이러스 PR8 이용한 생존능력 확인.
도 9는 LysRS-HAgd 융합단백질 특이항체역가 및 바이러스 중화항체가 측정.(A) ELISA 실험을 통하여 마우스 혈청 내에 존재하는 항체가 PBS를 접종하여 생긴 항체인지, LysRS와 HAgd에 대한 항체인지를 구별하는 실험결과. LysRS단백질만 플레이트에 코팅하여 얻은 항체가와 LysRS-HAgd 단백질을 코팅시킨 플레이트에서 얻은 OD 값을 비교한 데이터. (B) 백신접종 혈청의 바이러스 중화능력을 시험하기 위한 hemagglutinin inhibition (HI) assay의 실시.
도 10는 LysRS-HAgd 백신의 공격접종에 대한 방어능력 시험.세 그룹의 마우스에 치사량의 야생형 A/PR/8 바이러스를 공격접종 시, LysRS-HAgd 접종군을 포함한 모든 마우스들은 급격한 몸무게 감소를 보이며 감염 후 7일 내에 모두 사망함.
도 11은 HPV 16L1 융합 단백질의 발현과 정제. (A) HPV 16L1 융합 단백질의 도해(hARSNTD -16L1). (B) 대장균에서의 hARSNTD-16L1의 발현과 SDS-PAGE 분석. 배양은 37℃와 30℃, 그리고 20℃에서 IPTG의 첨가와 비첨가로 수행. SM; size marker, T; total, S; soluble, P; pellet (C) 니켈 친화성 크로마토그래피를 이용한 hARSNTD -16L1의 정제. CE; crude extract, FT; flow through (unbound), W; washing. 번호는 용출된 분획의 숫자. (D) 정제된 hARSNTD -16L1의 SDS-PAGE분석.
도 12는 TEV protease를 이용한 hARSNTD-16L1의 절단. (A) 정제된 hARSNTD-16L1 단백질의 절단. hARSNTD-16L1과 TEV protease는 대조군. 단백질은 2ug씩 로딩되었고 TEV protease는 2U으로 로딩. (B) 웨스턴 블롯 (western blot)을 이용한 융합 단백질과 융합 파트너의 확인. 첫 번째 항체 (1^stantibody)는 anti-his (1:1000)이고, 두 번째 항체 (2^ndantibody)는 anti-mouse (1:10000). (C) 절단 후 수용성 테스트. 시간별로 얻어진 각 샘플은 원심분리 후 상층액을 분석. 샘플은 각 1ug으로 로딩됨.
도 13은 정제된 융합 단백질과 TEV protease에 의해 절단된 단백질의 구조적 특징 분석. (A) PBS로 희석된 융합 단백질의 구조는 TEM확인. 사진은 100,000배 확대. (B) TEV protease에 의해 절단된 단백질의 용해물 구조의 TEM확인. 사진은 50,000배로 확대.
도 14는 다양한 면역 보조제를 사용한 대장균 유래 VLP의 면역반응. (A) 면역원성 테스트를 위한 그룹의 요약. (B) 다양한 면역 보조제와 함께 대장균 유래 VLP를 매 2주 간격으로 쥐에 접종. 쥐의 혈청은 ELISA를 이용하여 대장균 유래 VLP의 항체 생성을 분석하기 위하여 사용. (C) 혈청에 있는 대장균 유래 HPV 16L1에 특이적인 항체는 효모 유래 HPV 16L1이 코팅된 ELISA를 통해 확인. (D) 혈청에 있는 ARSNTD에 특이적인 항체는 정제된 ARSNTD 단백질이 코팅된 ELISA에 의해 분석. (E) B와 C의 항체가. (F) 1번 그룹의 혈청에 있는 항체를 웨스턴 블롯에 사용. * 는 Cervarix^TM, +는 TEV protease. 와 는 ARSNTD 이나 TEV protease가 아님.
도 15는 대장균 유래 HPV 16L1 VLP에 특이적인 IFN- 생성확인. (A) 그룹별로 접종된 쥐의 지라세포를 분리하여 효모유래 VLP로 자극. ELISPOT을 통하여 지라세포 배양액에서 사이토카인이 분비됨을 확인.

이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재한 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.

[실시예 1] 유전자 클로닝

pGE-ARSNTD 벡터가 발현 벡터로 사용 되었으며 위 벡터는 pGE-LysRS(4)를 원본으로 디자인 되었다(12). 첫 번째로 pGE-LysRS(4) 내의 LysRS 유전자를 제한효소 NdeI과 KpnI을 이용해 제거하였다. 쥐와 토끼의 ARSNTD를 중합효소 연쇄반응(PCR)을 통해 증폭시킨 후 mARSNTD와 rARSNTD를 pGE-LysRS(4)에 삽입하였다. 위 ARSNTD를 포함한 pGE-ARSNTD 벡터는 T7promoter 아래 수용성 발현을 돕기 위해 D6, 즉 6개의 아스파르트산이 연결되어 있으며(21) SG 스페이스 링커, TEV 단백질가수분해효소(protease) 인식 절단 장소(ENLYFQ/)와 제한효소 자리 (GTGSDIVDKL: KpnI/BamHI/EcoRV/SalI/HindIII) 그리고 6개의 히스티딘 태그를 가지고 있다 (도 1D). TEV 프로테아제를 사용해 6 히스티딘 태그가 없는 순수한 ARSNTD를 얻을 수 있으며 재조합 단백질 ARSNTD-HAgd가 융합 태그 ARSNTD와 타겟 단백질 HAgd로 분리되도록 디자인 된 것이다. (A/Puerto Rico/8/34(H1N1) 종의 HAgd cDNA 는 역전사중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 통해 증폭되었으며 pGE-ARSNTD 벡터의 KpnI과 SalI의 절단 자리 사이에 삽입되었다(도. 1A). 인간, 쥐, 토끼에서 유래된 각 ARSNTD서열간을 비교하였으며 참고로 대장균은 ARSNTD 서열이 없다(도 1B). 본 실험에 사용한 globular 도메인은 HA1 소단위에서 HA 63-286 아미노산으로 구성되었고 이는 바이러스에 존재하는 자연형의 삼량체 헤마글루티닌(도. 1E)의 구형 머리 도메인의 부분에 해당된다

[실시예 2] 단백질 발현 및 정제

모든 재조합 단백질은 대장균 숙주 BL21(DE3)pLysS에서 과발현 되었으며 수용성 세포 용해물 분획으로부터 정제되었다. 최초 배양은 암피실린 50μg/ml과 클로로암페니콜 30 μg/ml 이 포함된 3ml LB에서 37℃로 하루 동안 배양하였다. 대형 배양은 최초배양에서 2.5ml을 접종하여 500ml LB에서 OD_600nm 가 0.5~0.7에 도달할 때까지 37℃에서 이루어졌다.

세포들은 3000g에서 채취되었다. 초음파 분해를 통해 얻은 세포 용해물들은 12,000g에서 10분 동안 원심분리 되었으며 수용성과 펠렛 분획으로 나눠졌다.

단백질 발현은 다양한 온도에서 1mM IPTG첨가에 의해 유도되었다(도 2). ARSNTD-융합 단백질과 LysN-융합단백질의 수용성 발현 정도를 테스트 하였다. 모든 융합 단백질의 용해도는 약간 증가하였다. 수용성으로 발현된 ARSNTD-융합 단백질과 LysN-융합단백질의 양은 차이가 없었다. LysN보다 작은 사이즈의 ARSNTD가 융합 파트너로서 선택되었다. 왜냐하면 작은 크기의 융합 파트너에 대한 항체의 생성이 적기 때문이다. ARSNTD 융합 단백질 중에 ARSNTD 융합 HAgd는 20℃에서 40% 더 많이 수용성으로 발현되었다(도2,D-E). mARSNTD-HAgd 와 rARSNTD-HAgd를 쥐와 토끼에 접종될 면역원으로 선택하였다. ARSNTD-융합 eGFP를 대조군 단백질로서 사용되었으며 그것의 수용성은 25℃에서 50% 더 증가하였다(도2, F). 결과적으로 쥐 유래 융합 파트너(mARSNTD, mLysN, mLysRS) 의 발현 정도가 토끼 유래 융합 파트너들보다 높았다.

단백질들은 니켈 친화성 크로마토그래피에 의해 정제 되었다. 각각의 수용성 분획은 A 버퍼 [50 mM TrisHCl(pH 7.5), 300 mM 염화나트륨, 10% 글리세롤, 2mM 2-머캡토에탄올, 트리톤X-100 0.05%, and 10mM 이미다졸]으로 이퀼리브리엄 하였으며 A 버퍼로 미리 이퀼리브리엄 한 Ni-NTA 컬럼 레진(GE Healthcare Life Sciences, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK) 에 넣었다. A 버퍼로 세척한 이후에 B 버퍼를 이용해 10-300mM 범위의 직선형 그라디언트 이미다졸로 단백질을 용출시킨다. SDS-PAGE 이후에 관심 있는 단백질을 포함한 분획을 모아 농축한 이후 C 버퍼 [50 mM TrisHCl(pH 8.0), 100 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, and 0.1% Tween 20]에 대해 투석한다. 정제된 단백질의 농도는 대조군으로서 농도를 알고 있는 BSA(Amresco, Solon, OH, USA)를 이용해 결정한다.

500ml에서 배양된 각각의 ARSNTD 융합 단백질들은 단일 단계 니켈 크로마토그래피를 사용해 분리하였다. 세포 용해와 분획화 이후 대부분의 ARSNTD 융합 단백질이 있는 수용성 분획을 니켈 컬럼에 로딩 한 후 10-300mM 범위의 이미다졸 직선형 변화도로 나왔다. ARSNTD 6-히스티딘 태그를 가진 융합 단백질이 수용성 분획에서 효과적으로 정제되었다. 정제된 단백질의 SDS-PAGE 분석에서 대부분의 단백질들이 예상된 분자량의 위치로 이동하였으며 적절한 접힘에 성공적이었다. ARSNTD 융합 단백질의 분자량은 36kDa에서 40kDa 범위였다(도. 3). 정제된 단백질은 수거되어 버퍼 교환을 위해 투석하였다. 각각의 정제된 융합 단백질은 농축되어 농도를 알고있는 BSA와의 비교를 통해 정량하였다. 융합된 단백질의 최종 농도는 약 1mg/ml이었다.

[실시예 3] 젤 여과 크로마토그래피에 의한 삼량체분석

정제된 재조합 단백질의 소중합체적 상태의 분석은 4℃에서 Superdex-200 analytical gel-filtration column을 이용한 젤 여과 크로마토그래피를 통해 분석한다. T컬럼은 buffer [50 mM TrisHCl(pH 7.5), 300 mM NaCl, 2mM 2-머캡토에탄올 트리톤X-100 0.05%] 로 이퀼리브리엄을 이루며 넓은 범위의 분자량 마커 페리틴(440kDa), 알돌레이즈(158kDa), 콘알부민(75kDa), 오발부민(44kDa), 불루 덱스트란 2000(GE HealthCare)을 통해 조정한다.

mARSNTD-HAgd는 17.67ml 용출되었으며 분배계수를 이용해 분자량은 140.54kDa로 결정되었다. rARSNTD-HAgd 는 17.60ml 용출되었으며 그것의 분자량은 143.87kDa 였다. ARSNTD 융합 HAgd의 각각의 분자량은 그것들의 생화학적 상태가 대부분 삼량체임을 보여주었다(도 4A). 위 결과를 통해 새로 형성된 HAgd의 구조가 본래 바이러스 단백질의 구조를 가짐을 알 수 있었다. ARSNTD-HAgd의 분자량은 120kDa(예상된 삼량체의 분자량) 보다 컸는데 그 이유는 ARSNTD-HAgd가 삼각형 모양을 이루기 때문이다. 이에 더해 ARSNTD의 유연한 구조가 융합 단백질의 크기를 조금 이동시킬 수 있다. SDS-PAGE에 의해 분석된 ARSNTD와 ARSNTD 융합 단백질의 데이터에서 매우 비슷한 결과를 볼 수 있었다. 대조군 단백질인 mARSNTD-eGFP를 젤 여과 크로마토그래피를 수행하여 12.80ml 와 22.50ml가 용출되었다(도 4B). 후자의 분자량은 34.2kDa이었다. mARSNTD-eGFP의 생화학적 상태는 소중합체(30%) 와 단량체(70%) 의 혼합물 상태였다(도. 4D-E). 이러한 결과는 융합 파트너 ARSNTD가 HAgd가 본래의 삼량체를 이룸 과 eGFP가 단량체를 이룸을 돕는 것을 보여준다. 이렇게 분리된 단백질은 SDS-PAGE분석결과 대부분의 단백질이 예상되는 분자량에 해당되어 정제되었음을 확인하였다(도 4B, 4C, 4F).

[실시예 4] 면역 및 공격접종

토끼실험은 영인프론티어(가산동, 대한민국)에 위치한 동물시설에서 진행되었다. 완전프로인트항원 보강제로 유화시킨 rARSNTD 융합 단백질을 각 토끼 등의 여러 부위에 피내 주사하였다. 첫 번째 접종으로부터 4주 후 단백질과 보조제 혼합물을 2주마다 2번 추가적으로 부스팅 하였다. 토끼의 혈청은 각각의 부스팅으로 부터 일 주 이후에 모아 원심분리하고 70°C에서 보관하였다. 위 실험 계획은 영인 프론티어의 동물실험관련 위원회(IACUC)에서 평가 및 승인 되었다.

쥐 실험은 6주령 암컷 BALB/c(12마리, Orient-Bio) 에 이루어 졌다. 각 집단의 쥐(집단 당 3마리) 에 4μg의 정제된 ARSNTD 융합 재조합 단백질과 50μg의 백반 보충제(Thermo SCIENTIFIC)를 0일차(초기), 14일차(첫번째 부스팅), 28일차(2번째 부스팅)에 복강 내로 접종하였다. PBS 접종한 쥐를 대조군으로 사용하였다. 혈청 표본은 각 부스팅 뒤 일주일 후에 아이블리딩을 통해 얻어졌으며 일부는 70°C에서 보관하였다. 위 실험계획은 연세 실험동물연구센터(YLARC) (Permit number: IACUC-A-201503-202-02)에서 평가 및 승인되었다. 21일후(2차 접종 이후) 모든 쥐들은 Avertin 으로 마취된 상태에서 LD_50, 10³ PFU의 A/Puerto Rico/8/34(H1N1) 양의 바이러스를 비강내로 접종하여 챌린지 하였다. 챌린지 한 쥐들의 생존률과 체중 변화는 2주간 매일 측정되었다. 쥐 실험은 한국 식품의약품 안전처(KFDA) 지침의 권고사항에 엄격히 따라 수행하였다. 위 실험계획은 연세 실험동물연구센터(YLARC)에서 평가 및 승인되었다.

백신접종의 대조군으로서 10³ PFU 의 PR834 바이러스에 의해 감염된 3마리의 쥐는 모두 죽었으며 10² PFU의 PR8 바이러스에 의해 감염된 2마리의 쥐는 최대 23% 체중감소를 보였으며 천천히 회복되었다(도. 5C-D).

실제 백신접종 실험에서는 2차 접종일로부터 21일 후 모든 쥐는 에버틴으로 마취된 상태에서 치사량(1LD50) 10^3 PFU의 H1N1 A/Puerto Rico/8/34 바이러스를 비강내로 접종하여 챌린지 하였다. 챌린지 된 쥐들의 생존률과 체중변화는 14일간 매일 측정하였다. ARSNTD 융합 HAgd(mARSNTD+HAgd: 마리수=3, rARSNTD+HAgd: 마리수=3) 항원은 12마리중 6마리에 접종되었다. 비록 며칠 후 10%정도 체중감소를 보였으나 6마리의 면역된 쥐들은 모두 체중이 회복되었으며 생존했다. ARSNTD 융합 eGFP(mARSNTD+eGFP: 3 mice, rARSNTD+eGFP: 3 mice)는 12마리 중 6마리에 접종되어 대조군으로 사용하였다. 6마리의 대조군 쥐는 체중감소가 증가하였으며 일주 후 모두 사망하였다(도 5A-B). 위 결과를 통하여 본 발명에서 개발한 유전자재조합 항원단백질이 매우 우수한 백신효능을 나타냄을 검증하였다.

[실시예 5] 바이러스 중화 실험

ARSNTD-HAgd 융합 단백질이 백신 항원으로의 사용여부와 보호적 항체를 유발할수 있는지를 시험하기 위해 쥐와 토끼로부터 얻은 항혈청으로 마이크로중화시험을 수행하였다.

쥐의 혈액 샘플은 아이블리딩을 통해 채취되었으며 상온에서 응결되도록 하였다. 응혈들을 제거하고 샘플들은 마이크로원심분리기에서 4℃, 10분 동안 5500rpm으로 원심분리 하였다. 정제된 혈청은 살균된 마이크로원심분리 용기로 옮겨져 56°C에서 30분 동안 열로 불활성화시켰다. 열로 불활성화 된 혈청은 MEM과 함께 희석되어 1/2 연속희석법으로 96 칸 플레이트에 희석되었다. 인플루엔자 바이러스에 대한 중화항체의 역가를 분석하기 위해 동일한 양(50μl)의 인플루엔자 바이러스(100 PFU) 희석된 혈청에 첨가하여 혼합하였다. 바이러스와 혈청을 포함한 96칸 플레이트는 37°C에서 2시간 동안 배양되었다. 위 혼합물은 융합 MDCK세포를 담은 24칸 플레이트에 흡수시켰다. 한천을 덮어씌운 플레이트는 32℃ 5% CO₂ 배양기에서 배양되었다. 감염 이후 4일간세포의 단일 층을 크리스털 바이올렛으로 염색하였다. 각 분석에서 혈청들은 2개씩 희석, 분석되었으며 각 분석들은 최소 2번씩 시행되었다. 중화 역가는 대조군에 비해 50% 플라크가 감소된 양에 해당하는 희석 본으로 계산되었다.

상동의 PR8 바이러스에 대한 HI 나 중화항체를 가지지 않은 ARSNTD-eGFP 단백질에 대한 항혈청을 음성대조군으로 하였다(도 6A-D). 반면에 쥐의 mARSNTD-HAgd와 rARSNTD-HAgd 에 대한 항혈청에서 감지될만한 수준의 HI와 중화항체가 발견 되었다(도 6A 및 C). 더불어 rARSNTD-HAgd에 대한 토끼의 항혈청에서 쥐의 항혈청보다 더 많은 HI와 중화항체가 생산되었다(도 6B 및 D). 위 결과는 도 5에서 동물실험으로 검증된 백신효능과 실제로 바이러스를 불활화하는 중화기능과 일치함을 보여준다.

[실시예 6] 대장균 LysRS 융합을 통한 독감바이러스 A/PR/8 HAgd 단백질 발현 및 정제

대장균 벡터 pGE-LysRS(4) 벡터에 HA-GD 유전자를 삽입하였다 (도 7A). 대장균에서 LysRS-HAgd 융합단백질을 발현한 결과 도 7B와 같이 대부부이 수용성 단백질 형태로 발현되었다. 발현된 융합단백질을 분리 및 정제하여 고순도의 단백질을 확보하였다. 생산된 융합단백질의 농도는 약 2.31mg/ml 이었다.

[실시예 7] 마우스 모델 LysRS-HAgd 융합단백질 백신 접종

Balb/c 마우스를 도 8A와 같이 세 그룹으로 나누어 LysRS-GD 단백질을 복강을 통해 2주 간격으로 2차례 투여하였다. Alum을 면역증강제로 사용하였으며 PBS 접종 그룹을 음성대조군으로 사용하였다. 혈청내 HA GD 특이 항체역가를 측정하기 위해 boosting 접종 전과 공격접종 전 두 차례 마우스 혈액을 확보하여 혈청을 분리하였다(도 8B).

[실시예 8] LysRS-HAgd 융합단백질의 특이항체역가 및 바이러스 중화항체가 측정

Boosting 접종 후 분리한 마우스 혈청에 존재하는 HA GD에 대한 특이 항체역가를 측정하였다. ELISA를 실시하기 위해 LysRS 단백질과 LysRS-HA GD 단백질을 각각 다른 plate에 코팅 시킨 후 마우스 혈청 희석액을 incubation 시킨 후 OD 값을 측정하였다 (도 9A) PBS 접종 혈청은 LysRS, LysRS-HA GD 두 단백질에 대해 모두 음성반응을 보인 반면, LysRS-HA GD 융합단백질로 접종 혈청에서는 1 이상의 OD 값을 나타냈다. 그러나, LysRS 단백질만 코팅시킨 plate에서도 비슷한 수준의 OD 값을 보인 것으로 볼 때, 혈청 내에 존재하는 항체는 대부분 LysRS 단백질에 대한 특이 항체인 것으로 예상된다. 백신접종 혈청의 바이러스 중화능력을 시험하기 위해 hemagglutinin inhibition (HI) assay를 실시한 결과, 백신접종에도 불구하고 바이러스 중화능력을 전혀 보이지 못했다(도 9B). 이러한 결과들은 대장균유래의 융합단백질을 사용하였을 경우 고수용성의 단백질이라 하더라도 마우스에서는 대부분의 항체가 융합단백질에 대해서 발생한다는 것을 보여준다. 이는 타겟 단백질에 대한 특이항체 생산 및 백신으로서의 효능에 심각한 문제점이 될 수 있다.

[실시예 9] LysRS-HA GD 융합단백질 특이항체역가 및 바이러스 중화항체가 측정

각 백신 접종 그룹 마우스에 치사량의 야생형 A/PR/8 바이러스를 공격접종 하였을 때, LysRS-HA GD 접종군을 포함한 모든 마우스들은 급격한 몸무게 감소를 보이며 감염 후 7일 내에 모두 사망하였다(도 10). 이는 실시예 8의 중화항체가 실험 결과와 마찬가지로 LysRS-HA GD 접종이 야생형 바이러스에 대한 방어능력을 전혀 제공하지 못했음을 의미한다.

[실시예 10] 대장균에서의 융합단백질 발현과 정제

대장균 세포질에서의 HPV 16L1 단백질의 수용성 발현을 위하여 hARSNTD의 C-말단에 HPV 16L1을 융합시켜 hARSNTD-L1 형태로 만들었다. 추가적으로 단백질 절단효소 TEV protease가 인식하는 사이트와 6개 히스티딘 꼬리표(histidine tag)를 hARSNTD와 HPV 16L1 사이에 연결 펩타이드 형태로 도입하여 제작 하였다. TEV protease가 인식하는 사이트는 ENLYFQG로 7개의 아미노산을 가지고 있는데, TEV protease에 의해 잘려진 후 타켓단백질에 글라이신이 남기 때문에 우리는 글라이신을 제외한 6개의 아미노산으로 TEV protease의 인식 사이트를 디자인 하였다(도 11A). 이런 연결 펩타이드는 니켈 친화성(affinity) 크로마토그래피를 이용한 한 번의 정제와 그 이후의 단백질 절단효소 TEV protease의 절단을 통한 hARSNTD로부터의 HPV 16L1 분리를 위해 도입되었다.

hARSNTD-16L1은 대장균 숙주 BL21(DE3)pLysS에서 1mM IPTG에 의해 과발현되었다. 단백질의 수용성 정도를 확인하기 위한 작은 양의 배양은 암피실린 50μg/ml과 클로로암페니콜 30 μg/ml 이 포함된 3ml LB에서 37℃로 하루 동안 배양한 후 다음날 같은 농도의 항생제가 들어있는 20ml LB로 0.5ml의 배양된 세포를 옮겨 OD값이 600nm 에서 0.5에 도달할 때까지 37℃에서 배양하였다. 단백질 발현은 다양한 온도에서 1mM IPTG 첨가에 의해 유도되었다. IPTG를 넣은 후 37℃에서 3시간, 30℃에서 4시간 그리고 20℃에서 5시간을 배양하여 단백질을 발현시켰고, 배양된 세포들은 3000rpm에서 채취되었다. 초음파 분해를 통해 얻은 세포 용해물들은 12,000rpm에서 10분 동안 원심분리 되었으며 수용성과 불용성 분획으로 나눠졌다. 이 융합단백질은 37℃에서 불용성으로 발현된 반면, 20℃에서는 90% 이상의 수용성을 가졌다. 발현된 hARSNTD-16L1 단백질의 수용성 정도는 SDS-PAGE를 통해 분석되었다 (도 11B). 대형 배양은 첫 날에 암피실린 50μg/ml과 클로로암페니콜 30 μg/ml 이 포함된 3ml LB에서 37℃로 8시간 배양하다가 같은 농도의 암피실린과 클로로암페니콜이 들어있는 50ml LB로 옮겨 밤새 배양하였다. 다음날 같은 농도의 항생제가 들어있는 500ml LB로 전날 배양한 세포 50ml 중 20ml을 옮겨 OD값이 600nm 에서 0.5~0.7에 도달할 때까지 37℃에서 배양하였다. 그 후 단백질 발현은 1mM IPTG를 넣은 후 20℃에서 5시간 배양하며 유도되었다.

단백질들은 니켈 친화성 크로마토그래피에 의해 정제 되었다. 이를 위하여 크로마토그래피에 사용한 A 버퍼를 넣어 초음파 분해 후 원심분리를 통하여 얻은 세포 용해물을 A 버퍼로 미리 평형화한 Ni-NTA 컬럼(GE Healthcare Life Sciences, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK)에 결합시켰다. 정제에 사용한 A 버퍼의 조성은 50 mM TrisHCl(pH 8.2), 300 mM 염화나트륨, 10% 글리세롤, 2mM 베타-머캡토에탄올, 0.1% Tween-20 and 10mM 이미다졸이다. A 버퍼로 세척한 이후에 300mM 이미다졸이 들어있는 B 버퍼를 이용하여 점진적인 이미다졸 농도(10-300mM) 상황에서 단백질을 용출시켰다. 분리정제 형태는 SDS-PAGE를 통해 분석되었고(도 11C), 관심 있는 단백질을 포함한 분획을 모아 저장 버퍼 [50 mM TrisHCl (pH 8.2), 500 mM NaCl, 5 mM EDTA, and 0.01% Tween-80]를 이용하여 투석하고 농축하였다(도 11D). 융합 단백질의 분자량은 66.2kDa 이다. 정제된 단백질의 농도는 대조군으로서 농도를 알고 있는 BSA(Amresco, Solon, OH, USA)를 이용해 결정하였다. 융합된 단백질의 최종 농도는 약 0.8mg/ml 이었고, 전체적인 분리정제 효율은 대략 1.5mg/0.5L였다.

*[실시예 11] TEV protease를 이용한 융합단백질의 절단

융합 단백질 hARSNTD-16L1은 TEV 버퍼[50 mM Tris-Cl (pH 8.0), 0.5 mM EDTA, 1 mM DTT]에서 AcTEV protease(Invitrogen)에 의해 절단된다. 절단조건을 최적화하기 위하여, 여러 반응 온도와 조건을 테스트하였다. 그 결과 융합 단백질이 25℃에서 5시간동안 반응시켰을 때 TEV protease에 의하여 점차적으로 hARSNTD-6xhis-tev site(Gx)와 HPV 16L1으로 절단되는 것을 확인하였다(도 12A). 또한 우리는 융합 단백질과 잘려진 융합 파트너를 히스티딘 꼬리표 항체를 이용한 웨스턴 블롯(western blot)을 통하여 확인하였다(도 12B). 잘려진 융합 파트너 hARSNTD는 hARSNTD의 C 말단에 있는 히스티딘 꼬리표 때문에 검출할 수 있다. 이 연구에서 사용된 AcTEV protease 역시 히스티딘 꼬리표를 가지고 있기 때문에 같이 검출이 되었다.

TEV protease로 절단 후 잘려진 HPV 16L1의 수용성을 알아보기 위하여, protease를 처리한 전체 용해물을 원심분리를 통하여 수용성과 불용성 분획으로 나누어 SDS-PAGE로 확인하였다(도 12C). 대부분의 융합 단백질과, 절단된 융합 파트너, 그리고 절단된 HPV 16L1은 수용성을 유지하였으며 이것은 융합단백질이 특정 protease가 그것을 인식할 수 있는 인식 사이트에 작용하여 두 개로 적절하게 잘려질 수 있고, 그에 따라 정확한 타켓 단백질을 도출시킬 수 있다는 것을 보여주었다.

[실시예 12] 정제된 단백질의 구조적 특징 분석

정제된 융합 단백질과 절단된 단백질의 구조를 분석하기 위하여 투과전자현미경 (transmission electron microscopy)을 사용하였다. 이를 위하여 융합 단백질과 TEV protease를 처리한 용해물을 PBS[2.67mM KCl, 1.47mM KH₂PO₄,137.93mMNaCl,8.1mMNa₂HPO₄]를 이용하여 50 ng/ul로 희석하고, 희석된 샘플의 3ul를 카본 코팅 그리드(carbon-coated grid)에 올리고 네가티브염색법(negative staining)으로 염색하였다. 그 결과 융합 단백질은 30-40nm 사이즈의 캡소미어(capsomeres)를 형성하였고, 심지어 절단된 HPV 16L1은 본래의 인유두종바이러스의 크기인 50nm보다 큰 100nm 이상의 바이러스유사입자(VLPs)를 형성하였다(도 13A and 13B). 이것은 대장균 유래 단백질이 자가조합으로 바이러스유사입자 (self-assembled VLPs)를 만들 수 있고, 게다가 융합 단백질 또한 동종의 캡소미어 (homogenous capsomeres)를 형성할 수 있다는 것을 나타낸다.

[실시예 13] 다양한 면역 보조제(adjuvants)를 이용한 절단된 단백질의 면역원성

절단된 단백질의 면역원성을 확인하기 위하여, 우리는 Balb/c 쥐(그룹당 세 마리)에 다양한 면역 보조제 조합으로 2주 간격으로 세 번 주사하였다. 면역 보조제는 L-pampo(CHA vaccine institute), CIA06(EYEGENE Inc.) 그리고 alum을 사용하였고, 대조군은 EYEGENE에서 효모유래 HPV 16L1 항원, 상용되고 있는 효모유래 HPV VLP인 Cervarix^TM그리고 융합 파트너인 hARSNTD를 사용하였다. 융합 파트너를 대조군으로 사용한 이유는 면역원성 테스트에 사용된 단백질에 절단된 융합 파트너가 함유되어있기 때문이다. 음성대조군으로 사용된 쥐는 PBS만을 주사하였다. 면역원성 테스트를 위한 8개의 그룹은 도 14A에 정리되어 있다. 모든 항원들은 같은 4ug의 농도로 쥐의 근육 내로 주사하였다.

세 번째 접종한 뒤 일주일 후, 아이블리딩(eye-bleeding)을 통해 얻어진 혈청은 ELISA를 이용하여 HPV 16L1에 대한 특정 IgG 항체를 확인하기 위하여 사용되었다. 접종에 사용된 대장균 유래 VLP와 효모 유래 VLP를 코팅하였을 때, Cervarix^TM를 접종한 쥐에서 가장 높은 면역반응이 나타났고, alum과 함께 대장균 유래 VLP를 접종한 쥐에서 얻은 항체 값은 Cervarix^TM와 비슷한 값을 보였다. 심지어 면역 보조제 없이 접종한 대장균 유래 VLP를 접종한 쥐에서도 HPV 16L1 특정 면역반응이 나타났다(도 14B,C and E). 하지만, 융합 파트너인 hARSNTD에서는 예상했던 것과 같이 어떠한 면역반응도 나타나지 않았다(도 14D).

우리는 위의 결과를 확인하기 위하여, 1번 그룹의 혈청을 첫 번째 항체(1^stantibody)로 사용하여 웨스턴 블롯(western blot)을 시행하였다. 융합 파트너인 hARSNTD에 대한 항체는 대장균 유래 VLP를 접종한 쥐에서 유도되지 않았고, Cervarix^TM에는 대장균 유래 VLP를 접종한 쥐에서 얻은 항체가 결합하였다(도 14F and G). 위 결과를 통해, 인유두종바이러스에 대한 특정 항체가 대장균에서 정제된 VLP를 접종하였을 때 생산되었다는 것을 검증하였다.

[실시예 14] 절단된 단백질의 면역반응을 통한 사이토카인(cytokine) 생성

다양한 면역 보조제와 함께 항원을 접종한 쥐의 지라세포(splenocytes)에서 나온 Th1-type의 레벨을 평가하기 위하여, ELISPOT(Enzyme-Linked ImmunoSpot)을 이용하여 IFN-γ의 생성을 측정하였다. 지라세포는 세 번째 접종까지 끝난 쥐에서 분리되었고, 이것은 효모 유래 VLP에 의해 자극되었다. Cervarix^TM가 접종된 쥐의 IFN-γ 레벨이 가장 높았지만, alum과 함께 우리의 절단된 단백질을 접종한 5번째 그룹의 IFN-γ 레벨 또한 다른 그룹보다 월등히 높았다(도 15A). 위 결과를 통해, 우리가 대장균에서 생산한 VLP가 Cervarix^TM와 유사하게 인유두종바이러스에 특이적인 사이토카인을 생성하는 것을 확인하였다.

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약어:

LysRS: Lysyl tRNA Synthetase.

HAgd: Hemagglutinin globular domain

eGFP: Enhanced Green Fluorescent Protein

TEV protease: Tobacco Etch Virus nuclear inclusion a endopeptidase

PR8 (H1N1): A/Puerto Rico/8/34 (H1N1)

Claims (4)

1. ARSNTD(Aminoacyl tRNA synthetase N-terminal domain)을 융합파트너로 이용한 단백질의 생산방법.
2. 다음 단계를 포함하는 ARSNTD 백신의 생산방법:
   a) 바이러스 유사입자(VLP, Virus-like Particle)의 유전자를 ARSNTD와 융합된유전자를 제조하는 방법;및
   b) ARSNTD와 바이러스유사입자가 퓨전된 상태로 발현하는 방법.
3. 제2항에 있어서, 상기 방법은 b) 단계에서 발현된 단백질을 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
4. 제3항에 있어서, 상기 방법은 정제된 단백질을 모노머 이상으로 중합시키는 것을 추가적으로 포함하는 방법.
   

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