WO2005028503A1

WO2005028503A1 - Ｃ型肝炎ウイルス由来ペプチド

Info

Publication number: WO2005028503A1
Application number: PCT/JP2004/014312
Authority: WO
Inventors: Kyogo Itoh; Akira Yamada; Michio Sata
Original assignee: Green Peptide Co., Ltd.
Priority date: 2003-09-22
Filing date: 2004-09-22
Publication date: 2005-03-31
Also published as: CN101230096A; EA200701870A1; EP2267004A2; US20080063643A1; JP4342519B2; JP2009034102A; TW200513260A; CA2539789A1; EA200600639A1; KR20060087574A; CN102659922A; EP1676856A1; EP1676856A4; CN102659922B; CN101230096B; CN1856503A; EP2267004A3; KR20070050993A; JP4342597B2; EA009782B1

Abstract

ＨＬＡ結合モチーフを配列中に含み，かつ，Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）患者で検出される抗体により認識されることを特徴とするＣ型肝炎ウイルス由来ペプチドが開示される。本発明のペプチドはＣ型肝炎ウイルスの診断およびＣ型肝炎の治療，ならびに予後の予測に有用である。

Description

C型肝炎ウィルス由来ペプチド技術分野

この発明は， C型肝炎ウィルス感染の診断および C型肝炎の治療に有用な， C 型肝炎ウィルス（H C V) ペプチドに関するものである。

さらに詳細には，この発明は， H C Vペプチド， H C Vペプチドを含むポリべプチド， H C Vぺプチドもしくは前記ポリぺプチドをコ一ドするヌクレオチド，またはそれらを認識する折体もしくは抗体類似活性物質，前記ヌクレオチドを含有するベクター， H C Vペプチドもしくは前記ポリペプチドを用いて細胞傷害性 T細胞を誘導する誘導方法，あるいは H C Vペプチド，前記ポリペプチド，前記ヌクレオチドもしくは前記抗体 ·抗体類似活性物質を使用した C型肝炎ウイルスの検出方法， C型肝炎の診断，予防もしくは治療方法，および予後の予測方法，ならびにそれらを含む C型肝炎治療用医薬組成物に関するものである。背景技術

ウィルス性肝炎には，主としてウィルスが経口感染する A型肝炎と血液を介して感染する B型肝炎の他に，主に輸血などで感染する C型肝炎などがある。その C型肝炎は，慢性化して肝硬変や肝癌移行する割合が非常に高い疾患の 1つである。

C型肝炎ウィルス（H C V) は，フラビウィルス科に属する 1本鎖 R NAウイルスであり，日本に 2 0 0万人以上，世界中では 1億 7 0 0 0万人も C型肝炎ゥィルス感染者がいると言われている。

この C型肝炎に対しては，インターフェロンとリバピリン併用療法が行われているが， 3〜 4割の患者に対してのみ有効であり，大半の患者に対しては現在有効な治療法がないのが実状である。したがって，安全で有効かつ簡単な上に，低コストの診断ならびに治療ツールを緊急に開発することへの強い社会的要請がある。

細胞性ならびに液性免疫応答の両者は H C V感染を抑制するのに主要な役割を果たしていることを示す証拠がある（WO89/04669) 。過去 1 0余年にわたって高い免疫原性の H C Vぺプチドを見い出す研究が数多くなされ，細胞性または液性免疫応答を誘導することができる数多くの H C Vペプチドが見出されてきた (Hunziker et al.， Mol Immunol. 2001 Dec;38(6):475-84) 。しかしながら，これらのペプチドのいずれも臨床的に有効ではなく，その結果，現在でも予防的にも治療的にも有効な免疫治療の手段がないのが実状である。このことは，主にこれらのべプチドの免疫原性が弱いことに基づいていると考えられる。

また，本発明者らは，いくつかの細胞傷害性 Tリンパ球（C T L) により認識される抗原べプチドが，インビト口でもインビポでも細胞性免疫応答および液性免疫応答の両方を導き出す能力を有していることをすでに報告している

(Gohara et al., J Immunother. 2002 Sep-Oct; 25(5):439_44, Mine et al.， Clin Cancer Res. 2001 Dec; 7(12):3950_62， Tanaka et al., J Immunother. 2003 Jul- Aug; 26(4)：357-66, Mine et al, Cancer Sci. 2003 Jun; 94(6):548·56) 。

さらに，細胞性ならびに液性免疫応答の両者によって認識される H C Vぺプチドは，細胞性免疫応答だけによつて認識されるものよりも免疫原性が高いと考えられる。

かかる社会的要請に応えるための 1つの新しいアプローチとして，細胞性免疫応答ならびに液性免疫応答の両者を誘導することができる H C Vぺプチドが，液性免疫応答だけを有するぺプチドに比べて，より一層高い免疫原性を有しているとの一連の知見が蓄積されてきているので，かかるペプチドを特定するといぅァブローチを挙げることができる。

そこで，かかるペプチドを同定するとともに， H C V感染を抑制するための新規な治療および診断ツールとしての候補となるかどうかを調べることは，有益であると考えられる。

したがって，本発明者らは， H L A— A 2および H L A— A 2 4拘束性細胞傷害性 Tリンパ球（C T L) によって認識されるペプチドと反応性を有する I g G が H C V感染患者の血清中から検出できるかどうかを調べた結果，いくつかの C T Lェピトープに特異的な I g Gが，異なる H L Aクラス Iタイプや異なる H C Vゲノタイプには関係なく， H C V感染患者の大多数に検出されることを見出した。さらに，この結果から，かかるペプチドが，ペプチドをべ一スとする予防および治療用の新しいツールを提供することができることを見出して，この発明を完成するに到った。

したがって，この発明は，細胞性免疫応答ならびに液性免疫応答によって認識され，かつ免疫原性が高いことを特徴とする H C Vペプチドを提供することを目的とする。発明の開示

上記課題を解決するために，この発明は， H L A結合モチーフを配列中に含み，かつ C型肝炎ウィルス感染患者の血中抗体により認識される C型肝炎ウィルス由来ペプチドを提供する。

' この発明は，その好ましい態様として，配列表の配列番号 1〜8、 1 6、 2 0 および 3 8のいずれか 1つで表されるアミノ酸配列を有する C型肝炎ウィルス由来ペプチド，該ペプチドのアミノ酸配列と少なくとも 7 0 %の相同性をもつアミノ酸配列を有する C型 B干炎ウィルス由来ペプチド，および H L A—八2または11

L A— A 2 4拘束性細胞傷害性 T細胞による認識性をさらに有する C型肝炎ウイルス由来べプチドを提供する。

この発明の別の形態は，該 C型肝炎ウィルス由来べプチドを含むポリぺプチドを提供する。この形態の発明は，その好ましい態様として，該ポリペプチドのァミノ酸配列と少なくとも 7 0 %の相同性をもつアミノ酸配列を有するポリべプチド，および H L A— A 2または H L A— A 2 4拘束性細胞傷害性 T細胞による認識性をさらに有するポリぺプチドを提供する。

また，この発明の別の形態は，該 C型肝炎ウィルス由来ペプチドまたは該ポリぺプチドをコ一ドするヌクレオチドを提供する。

この発明のさらに別の形態は，該 C型肝炎ウィルス由来ペプチドまたは該ポリぺプチドを免疫学的に認識することができる抗体および抗体類似活性物質を提供する。

この発明は，さらに別の形態として，上記のヌクレオチドを含有するべクタ一を提供する。また，この発明のさらに別の形態は，該 C型肝炎ウィルス由来ペプチド，該ポリぺプチドをコ一ドする該ヌクレオチドを用いて細胞傷害性 T細胞を誘導する誘導方法を提供する。

この発明は，さらに別の形態として，上記の C型肝炎ウィルス由来ペプチド，ポリペプチド，ヌクレオチド，または抗体もしくは抗体類似活性物質を使用する， C型肝炎ウィルスの検出方法を提供する。

また，この発明の別の形態は，上記の C型肝炎ウィルス由来ペプチド，ポリべプチド，ヌクレオチド，または抗体もしくは抗体類似活性物質を使用する， C型肝炎などの H C V感染関連疾患の診断方法を提供する。

さらに，別の形態として，この発明は，上記 C型肝炎ウィルス由来ペプチド，ポリペプチド，ヌクレオチド，または抗体もしくは抗体類似活性物質を使用する，

C型肝炎などの H C V感染関連疾患の治療方法を提供する。

この発明は，さらに別の形態として，上記の C型肝炎ウィルス由来ペプチド，ポリペプチド，ヌクレオチド，または抗体もしくは抗体類似活性物質を有効成分として含む医薬組成物を提供する。また，その好ましい態様として，該医薬組成物が C型肝炎ウィルスワクチンである医薬組成物が提供される。

C型肝炎などの H C V感染関連疾患の予後の予測方法を提供する。

この発明は，さら別の形態として，上記の C型肝炎ウィルス由来ペプチド，ポリペプチド，ヌクレオチド，または抗体もしくは抗体類似活性物質を含む， C 型肝炎を診断または予後を予測するためのキッ卜が提供される。図面の簡単な説明

図 1は，本発明において， E L I S A法による H C V感染患者の血中 I g G測定結果を示すグラフである。

図 2は，本発明において， E L I S A法による H C V感染患者の血中 I g G測定結果を示すグラフである。

図 3は，本発明において，図 1に示した患者血清中の C一 3 5ペプチド反応性抗体の代表例の吸収 ·溶出実験結果を示すグラフである。

図 4は，本発明における HCV由来の HLA— A24結合ペプチド 6種（No 3, 12， 13, 25， 32， 38) の CTL誘導結果を示すグラフである。図 5は，本発明における HCV由来の HLA— A2結合性ペプチド（No40 から No 57) の CTL誘導結果を示すグラフである。

図 6は，本発明において， ⁵¹C r遊離試験によるペプチド刺激 PBMCの細胞傷害活性の代表的結果を示すグラフである。

図 7は，本発明において， ⁵¹C r遊離試験によるペプチド刺激 PBMCの細胞傷害活性の代表的結果を示すグラフである。

図 8は，本発明において，抗 CD 8モノクローナル抗体を用いた抑制試験によるペプチド刺激 PBMCの細胞傷害性の HL Aクラス I拘束性を確認したグラフである。

図 9は， HCV感染患者血清における抗ペプチド I gGの検出を示すグラフである。

図 10は， HCV感染患者血清における抗ペプチド I gGの検出を示すグラフである。

図 1 1は， HCV感染患者血清中の抗ペプチド I gGの特異性を調べる吸着試験の結果を示すグラフである。

図 12は， HCV感染患者血清中の抗ペプチド I gGの特異性を調べる溶出試験の結果を示すグラフである。

図 13は，ペプチド刺激 PBMCによる I FN—ァ産生を示すグラフである。図 14は，ペプチド刺激 PBMCによる I FN—ァ産生を示すグラフである。図 15は，ペプチド刺激 PBMCの細胞傷害性を示すグラフである。

図 16は，ペプチド刺激 PBMCの細胞傷害性を示すグラフである。

図 17は， NS 5Aを発現する細胞に対するペプチド刺激 PBMCの CTL活性を示すグラフである。

図 18は， NS 5 Aを発現する細胞に対するペプチド刺激 PBMCの CTL活性を示すグラフである。

図 19は， NS 5Aを発現する細胞に対するペプチド刺激 PBMCの CTL活性を示すグラフである。

図 20は，抗 NS 5A— 21321 g G活性の特異性を示すグラフである。図 21は，抗 NS 5A— 21321 g Gによる細胞増殖阻害のアツセィの結果を示すグラフである。

図 22は，抗 NS 5 A— 2132 I gGの ADCC活性のアツセィの結果を示すグラフである。

図 23は，種々の疾患における抗 C— 35抗体および抗 NS 5 A-2132抗体の検出を示すグラフである。

図 24は，抗ペプチド抗体の HL Aまたは HCVゲノタイプ拘束性を示すグラフである。

図 25は，抗ペプチド抗体の HL Aまたは HCVゲノタイプ拘束性を示すダラフである。

図 26は，患者血清における抗 NS 5 A— 2132抗体の測定の結果を示すグラフである。

図 27は，患者血清における抗 N S 5A-2132 I g Gの測定の結果を示すグラフである。

図 28は，患者血清における抗 NS 5 A抗体のレベルおよび HCV RNAレベルを示すグラフである。

図 29は，コホート研究における抗 C— 35抗体および抗 NS 5 A— 2132 抗体の検出を示すグラフである。

図 30は，コホート研究における抗 NS 5 A— 2132抗体の検出を示すダラフである。

図 31は，本発明において，ルミネックス法による HCV感染患者の血中 I g

G測定結果を示すグラフである。

図 32は，本発明において，ルミネックス法による HCV感染患者の血中 I g

G測定結果 ¾示すグラフである。

図 33は，本発明のペプチドを用いる C型肝炎の治療の経過を示す。

図 34は，本発明のぺプチドを用いる C型肝炎の治療の経過を示す。発明の詳細な説明

この発明に係る C型肝炎ウイルス由来べプチドは， H L A結合モチ一フを配列中に含み，かつ C型肝炎ウイルス感染患者の血中抗体により認識される H C Vぺプチドである。 '

また，この発明に係る HCVペプチドは， HLA結合モチーフ，つまり HLA —A2または HLA— A 24結合モチーフをその配列中に含んでいる。さらに，この H C Vぺプチドは，細胞性免疫応答および液性免疫応答によつて認識されるとともに，免疫原性が高いことを特徴としている。

かかる HCVペプチドとしては，例えば，下記の表 1および表 3に挙げられるペプチドが含まれる。本発明において特に好ましい HCVペプチドの 1つは，以下のアミノ酸配列を有する H LA-A2結合性モチ一フを有するぺプチド： C-35 ： YLLPRRGPRL (配列番号 1 )

である。 HCV感染患者においては，このペプチドに対するペプチド反応性 I g

G抗体の検出率および H C V感染症特異性が，それぞれ 93%と 100%と非常に高い。また本発明において特に好ましい別の HCVペプチドは，以下のァミノ酸配列を有する HLA— A 24結合性モチーフを有するペプチド：

NS 5A-2132 ： RYAPACKPL (配列番号 2)

E 2-488 ： HYAPRPCG I (配列番号 3)

E 1 -213 ： VYEAADM I M (配列番号 4)

NS 3 - 1081 ： VYHGAGSKTL (配列番号 5)

C一 176 ： I FLLALLSCL (配列番号 6)

C~ 173 ： SFS I FLLALL (配列番号 7 )

EYVLLLFLL (配列番号 8)

PYI EQGMQL (配列番号 16)

I FT I TK I LL (配列番号 20)

SFA I KWEYVL (配列番号 38)

である。特に， NS 5A—2132は， HLA— A 24陽性の多くの患者において，細胞性免疫および液性免疫の両方を誘導することができる。

この発明に係る H C Vぺプチドは，該ぺプチドのァミノ酸配列と少なくとも 7 0 %, 好ましくは 8 0 %以上，さらに好ましくは 9 0 %以上の相同性を有するぺプチドであってもよい。

また，この発明に係る H C Vペプチドは， H L A— A 2または HL A— A 2 4 拘束性細胞傷害性 T細胞（C T L) による認識性を有するペプチドをさらに含んでいてもよい。細胞内で製造された抗原タンパクが細胞内で分解されたペプチドからなる，この H L Aに結合可能な抗原ペプチドには， HL Aのタイプごとにその配列にモチーフがあり，細胞傷害性 T細胞（C T L) はこの抗原ペプチドと H 八との複合体を認識して H C V感染細胞を傷害する。

この発明に係るポリぺプチドは，上記のようなこの発明のぺプチドのアミノ酸配列をそのアミノ酸配列中に含有しており，そのアミノ酸の総数は特に限定されるものではない。また，この発明のポリペプチドにおいて，このペプチドを構成するアミノ酸を超える残りのアミノ酸は，該ペプチドのアミノ酸の N—末端側および Zまたは C一末端側に，あるいはそれらの両側に位置している。したがって，このポリぺプチドは，上記べプチドの機能ならびに作用と実質的に同様の機能と作用を有している。なお，本明細書において，「ペプチド」と単に記載した場合. でも，特に断りのない場合には，「ポリペプチド」をも包含して理解すべきものとする。

上記のようにして決定されたアミノ酸配列を有するペプチドは，通常の化学的合成法，タンパク分子の酵素的分解法，目的のアミノ酸配列をコードする塩基配列を発現するように形質転換した宿主を用いた遺伝子組換え技術などにより得ることができる。

目的とする該ぺプチドを化学的合成法で製造する場合には，通常のぺプチド化学においてそれ自体公知の慣用されている手法によって製造することができ，例えば，ペプチド合成機を使用して，固相合成法により合成することができる。このようにして得られた粗ペプチドは，タンパク質ィ匕学において通常使用されている精製方法，例えば，塩析法，限外ろ過法，逆相クロマトグラフィー法，イオン交換クロマトグラフィー法，ァフィ二ティークロマトグラフィー法などによって精製することができる。

一方，所望の該ペプチドを遺伝子組換え技術で生産する場合には，例えば，上記により合成した目的のアミノ酸配列をコードする D NA断片を適当な発現べクターに組込み，この発現ベクターを用いて微生物や動物細胞を形質転換して，得られた形質転換体を培養することによって，所望の該ぺプチドを得ることができる。使用できる発現ベクターとしては，当該技術分野において公知であるプラスミド，ウィルスベクターなどを用いることができる。

このペプチド生産技術における発現ベクターを用いた宿主細胞の形質転換方法としては，それ自体公知の方法，例えば，塩化カルシウム法，リン酸カルシウム共沈殿法， D E A Eデキストラン法，リポフエクチン法，エレクト口ポレーション法などが使用でき，使用する宿主細胞に基づいて適宜選択するのがよい。得られたペプチドの精製は，培養した培地から回収した細胞抽出液もしくは培養上清から上記精製法により行うことができる。

この発明の別の形態の 1つとしてのヌクレオチドは，上記の C型肝炎ウイルス由来べプチドまたは上記のポリぺプチドを含有するオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドを含んでいて，リポヌクレオチドあるいはデォキシヌクレオチドを含んでいる。また，該ヌクレオチドは，当該分野で既知の方法によって改変されていてもよい。該ヌクレオチドの改変には，例えば，公知の標識，メチル化，「c a p s」，アナログによる天然ヌクレオチド 1つ以上の置換，ヌクレオチド内改変などが含まれる。ヌクレオチド内改変には，例えば，非イオン性改変（例えば，メチルリン酸，リン酸トリエステル，ホスホアミデートなど），イオン性改変（例えば，ホスホロチォエート，ホスホロジチォエートなど），例えばタンパク質（例えば，ヌクレアーゼ，毒素，抗体，シグナルペプチドなど）のようなペンダント部分を含む改変，キレート剤（例えば，金属，ホウ素など）による改変などが挙げられる。

上記のヌクレオチド配列は， H C Vのゲノム中にコードされている H C V抗原のペプチドおよびポリペプチド配列を提供することを可能にし，また診断試験やワクチンの成分として，有用なペプチドを提供することができる。

この発明のヌクレオチドが得られると， H C V感染関連疾患を診断するのに有用な，または血液中もしくは血液製剤中の H C V感染をスクリ一ニングするのに有用なヌクレオチドプローブならびにべプチドの構築が可能となる。このヌクレォチド配列から，例えば 24個ないし 30個のヌクレオチドあるいはそれより長い DNAオリゴマーを合成することが可能である。このヌクレオチドは，被験者の血清中の HCV RN Aを検出するための，また血液もしくは血液製剤中の H CVの存在をスクリーニングするためのプローブとしても使用することができる。また，このヌクレオチド配列は， HCVに対する抗体の存在を診断する試薬としても有用な HCV特異的プチドの設計ならびに生産を可能にする。さらに，この配列に由来する精製べプチドに対する抗体は， H C V感染者ならびに H C V 感染血液製剤中の HCV抗原を検出するためにも使用することができる。

この発明の別の形態の 1つとしての抗体は，該 C型肝炎ウィルス由来ペプチド，該ポリペプチドに反応性を有するキメラ抗体，改変抗体，一価抗体， Fab, F (ab' ) ₂, Fab' , 単一鎖 Fv (s c F v) タンパク質ならびに単一ドメイン抗体が含まれる。また，この抗体は，該ペプチドまたは該ポリペプチドを免疫学的に認識することができる。

この発明の別の形態の 1つとしてのベクターは，該ヌクレオチドを含有していて，選択された宿主細胞を形質転換し得る構築物であって，該宿主中で異種のコード配列を発現させることができる。この発現ベクターは，クローニングベクタ一あるいは組み込み用ベクターの何れであってもよい。

クローニングベクターとしては，例えば，プラスミド，ウィルス（例えば，ァデノウィルスべクタ一）などが使用される。また該クローニングベクターは，宿主細胞を形質転換することができ，かつ，細胞内でヌクレオチドの複製を行う能力を有しているレブリコン（例えば，プラスミド，クロモソ一ム，ウィルス，コスミドなど）である。

他方，組み込み用ベクターは，宿主細胞中ではレブリコンとしては働かないが，宿主を安定に形質転換するために，宿主中のレブリコン（典型的には，クロモソーム）に駐留物を組み込む能力を有するベクターである。

この発明の別の形態の 1つとして，該ぺプチドを用いることによって H C V細胞を標的にする細胞傷害性 T細胞を誘導する誘導方法が含まれる。この発明の誘導方法は，例えば， HLA— A2を発現している細胞に該ペプチドを添加して H LA-A2上に提示させ，このペプチドを H L A— A 2により提示した細胞で T 細胞を刺激し，この T細胞を CTLに誘導することからなっているのがよい。この方法において使用する HLA— A2発現細胞は， HCV患者の血液から採取したものでよいが，非 H L A— A 2発現細胞に H LA— A2をコードする遺伝子を導入して作成することもできる。したがって，この発明に係る該ペプチドは， H CVの検出ならぴに診断のために使用することができるばかりではなく， C型肝炎ウィルス関連疾患のワクチンなどの医薬組成物として有用である。

また，このようにして誘導された CTLは， HCV感染細胞を標的にして該 H CV感染細胞を攻撃するので，該ペプチドと同様に，細胞療法などの医薬組成物としても使用することができる。

さらに，この発明の別の形態である該 C型肝炎ウィルス由来ペプチド，ポリべプチド，ヌクレオチドおよび Zまたは抗体 ·抗体類似活性物質は， H C V感染を検出 ·診断するのに有用である。

HCVの検出ならびに HCV関連疾患の診断は，例えば，該ペプチドをコードする核酸配列との相互作用および /または反応性を利用して，該ぺプチドの存在の検出，相応する核酸配列存在量の検出，該ペプチドの個体中での生体分布の決定および Zまたは個体由来の検体中の存在量の決定などによって行うことができる。つまり，！！の検出ならびに！！じ関連疾患の診断は，該ペプチドをマーカーとして検定することによって行うことができる。また，その測定は，それ自体公知の測定手法で行うことができ，かかる測定方法としては，例えば，抗原抗体反応系，酵素反応系， PCR反応系などを利用した方法が挙げられる。

H C V関連疾患の治療効果の確認および予後の予測は， H C V関連疾患に罹患している被験者において，該ペプチドに対する反応性を有する抗体の血中濃度をモニターすることによって行うことができる。特に好ましくは，被験者の血中の抗 C— 35 I gGまたは抗 NS 5 A—21321 gGのレベルを測定する。この発明のさらに別の形態である医薬組成物としては，例えば，ワクチンが挙げられる。ワクチンは， c型肝炎ウィルス由来ペプチド，ポリペプチドおよび z またはヌクレオチドからなっていて，医薬的に許容される補助剤および Zまたは担体を適宜含有していてもよい。補助剤としては，免疫応答を強化し得るアジュパント，例えばフロイントの不完全アジュパント，水酸ィ匕アルミニウムゲルなどを使用することができる。また，担体としては，例えば， P B S , 蒸留水などの希釈剤，生理食塩水などを使用することができる。

この発明の医薬組成物は，その使用形態に応じて，例えば，経口，静脈投与や皮下投与などの非経口または経皮経路で投与することができる。その剤形としては，例えば，錠剤，顆粒剤，ソフトカプセル剤，ハードカプセル剤，液剤，油剤, 乳化剤などが挙げられる。かかる医薬組成物の投与量は，投与する患者の症状などにより，適宜変動し得るが，一般的には，成人に対して 1日当たり，該ぺプチド量として 0. 1〜1 O m gであるのがよく，投与間隔としては数日もしくは数ヶ月に 1回投与するのがよい。

本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。また，本出願が有する優先権主張の基礎となる出願である日本特許出願 2 0 0 3 - 3 3 0 2 5 8号の明細書および図面に記載の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。実施例

この発明を実施例によりさらに詳細に説明する。ただし，これらの実施例はこの発明をより具体的に説明するために例示的に示したものであり，この発明は以下の実施例により限定されるものではない。

なお，以下の実施例において使用したアミノ酸の略語は次の通 0である。

Αはァラニン， Cはシスティン， Dはァスパラギン酸， Eはグルタミン酸， F はフエ二ルァラニン， Gはグリシン， Hはヒスチジン， Iはイソロイシン， Kはリジン， Lはロイシン， Mはメチォニン， Pはプロリン， Rはアルギニン， Sはセリン， Tはトレオニン， Vはバリン， Yはチロシンをそれぞれ意味する。実施例 1 ： H C V感染患者の血清における H C Vペプチドと反応性を有する I g Gの検出

ぺプチド

H C Vゲノタイプ 1 b夕ンパク質の保存領域からの H L A— A 2結合性モチーフまたは HL A— A 2 4結合性モチーフを有する合成ペプチドを使用した（表 1 ) 。ネガティブコントロールとして， HL A— A 2結合性モチ一フを有する H I V由来ペプチドを使用した。これらのペプチドはいずれも市販品を使用し，その純度は逆相高圧液体クロマ卜グラフィ一で分析したところ 9 0 %以上であつた。表 1

£0S8J0/S00Z OAV 2 1 DA24-2990 NS5B-2990 NS5B WFMWCLLLL 58 7 58 0 0 3 1bA24-789 E2-789 E2 AFYGVWPLL 59 0 0 0 0 4 1bA24-1727 NS4B-1727 NS4B QFKQKALGL 60 1 8 0 0

1bA24-2613 NS5B-2613 NS5B QYSPGQRVEF 61 0 0 0 0 6 1bA24-1727 NS4B-1727 NS4B QFKQKALGLL 62 3 25 0 0 カツ卜オフ値は 1 · 83である。

検出率を，カットオフ値で陽性な患者の数で算出した (平均 ±3SD),

NS5A—2132は， 0.202であり， C— 35は， 0. 13である。

統計解祈を， ²試験で行った。

EL I SA

血清中のペプチド特異的 I 8&は£ I S Aによって測定した。まず，各ぺプチドをジメチルスルホキシド（DMSO) に溶解し，一 80 で保存した。ぺプチドを，クロスリンカ一としてのジサクシンイミジルスべレート（DSS) を含む 0. 1 M炭酸ナトリゥム Z炭酸水素ナトリゥム溶液で希釈した。 E L I S Aプレートにペプチド 2 O g/ゥエルで 4°Cで一夜反応させて結合させた。ゥエルを 0. 05%Twe e n 20—PBS (PBST) で 3回洗浄し，プレートをブロックエース（登録商標）でブロックして 4°Cで一夜放置した。血漿または血清サンプルを 0. 05%Twe e n 20— B 1 o c k Ac eで 100倍， 200 倍および 400倍にそれぞれ希釈し，得られたサンプルを各ゥエル当り 100 1ずつ添加した。サンプルを 37 °Cで 2時間培養した後，プレートを PBSTで 9回洗浄し， 1000倍希釈ゥサギ抗ヒト I gG (τ鎖特異的）を各ゥエル当り 100 1添加して 37 °Cで 2時間培養した。さらに， P B S Tで 9回洗浄した後， 100倍希釈マウス抗ゥサギ I gGと共有結合させた西洋ヮサビパーすキシダーゼ ·デキストランポリマ—を各ゥエル当り 100 1添加し，プレートを室温で 40分間培養した。プレートを洗浄した後，テトラメチルベンジジン基質溶液を各ゥエル当り 100 1添加し， 2. 0Mリン酸を添加して反応を停止させた。カットオフ値を，健常者の光密度コントロールの平均 ±3 SDとして算出した。ぺプチド特異的 I g Gの吸収ならびに溶出

各ゥエル当り 100 1の血漿または血清サンプルを 0. 05%Twe en2 0— B l o c k Ac e (登録商標）で希釈し，プレートのゥエル中に固定したペプチド（各ゥエル当り 20 g) に 37°Cで 2時間吸収させた。この操作を 3 回繰り返した後，上清中のペプチド特異的 I gGレベルを EL I SAで測定した。初回の吸着でペプチド固定プレートに結合させた抗体を，各ゥエル当り 30 1 の 5Μ NaC 1 Ζ5 OmMクェン酸バッファ（pH3. 0) (1. 0M Tr i s - HC 1の 0. 05 %Twe e n 20 - B 1 o c k Ac e (pH7. 5) で中和した）によって溶出し，溶出した分画中のペプチド特異的 I gGレベルを EL I S Aで測定した。ぺプチド特異的 C T Lアツセィ

ペプチド特異的 CTLの検出に使用する方法は当該技術分野において慣用されている方法である。 PBMCをゥエル当たり 1 x 10⁵個の細胞になるように U 底型 96ウェルマイク口カルチャープレートの各ゥエルに入れ， 10 Mのぺプチドとともに 200 1の培地中で培養した。この培地の組成は， 45%RPM 1—1640と， 45%AIM— V (登録商標）と， 10%ゥシ胎児血清（〇 S) と， 10 OUZm 1のインターロイキン 2 (I L-2) と， ImM MEM 非必須アミノ酸溶液と，からなつている。培養 3日目， 6日日，そして 9日目にそれぞれ培地半分を除いて，対応するペプチド（20 gZml) を含んだ新しい培地と入れ替えた。培養 12日日に，培養した細胞を採取し，対応するべプチドまたはネガティブコントロールとしての H I Vペプチドのいずれかを予め付着させた C I R-A2402細胞または T 2に応答するインターフェロンガンマ

(I FN-r) の産生能を試験した。各ペプチドに対して 4個のゥエルを使用し, ァッセィは 2回行つた。 H I Vぺプチドに応答するバックグラウンド I F N—ァ産生は得られたデータ値から差し引いた。抑制アツセィには，ペプチド反応性 C TLは， CD 8単離キットを用いて精製し，そのペプチド特異的 I FN— r産生を， 2 O xgZmlの抗 HLAクラス I (W6/32, I gG2a) モノクロ一ナル抗体，抗 CD8 (Nu-T s/c, I gG2 a) モノクロ一ナル抗体または抗 HLAクラス I I (H— DR— 1， I gG2 a) モノクローナル抗体のいずれかの存在下において測定した。バックグラウンド I FN—ァ産生は得られたデー夕値から控除した。

値は平均 +Z— SDとして示している。統計的分析は，マン'ウィットニー U検定 (Mann -Wh i t n e y U) 試験およびカイ 2乗試験を用いて行つた。 P<0. 05値は統計学的に有意であると考えられる。

H C Vぺプチドに対する抗体の検出

HCV感染患者 12名と健常者 (HD) 10名の血清について 62種類の各べプチドに対して反応する I gGレベルを測定した（表 1) 。各ペプチドに対する抗体の陽性率を表 1に示した。その結果， HCV感染患者の血中 I gGと高率に反応し，かつ健常人血清とはほとんど反応しないペプチドが複数見い出された。例えば， No 3の NS 5A— 2132 (HC Vの NS 5 Aタンパクの 2132 番から 2140番に相当，以下同様に省略する）， No l l (NS 3-126 6) , No 12 (E2-488) ， No 13 (El— 213) , No 22 (NS 2-947) , No 25 (N S 3— 1081) , No 32 (C—176) , No 38 (C- 173) , No 40 (C一 35) ， No 62 (NS 5B-2990) などが挙げられる。代表的な EL I S A法による HCV感染患者の血中 I g G測定結果を図 1および図 2に示す。

図 1に示した患者血清では C -35に対する I g G抗体が検出された。

図 2の（A) — (D) に示した 4名の患者血清中にはそれぞれ NS 5 A— 21 32 (A) ， NS 3- 1081 (B) , E 2— 488および E 1 - 213 (C) , C— 176および C— 173 (D) 反応性 I g G抗体が検出された。これらのべプチド反応性抗体のぺプチド特異性は，吸収ならびに溶出試験によつて確認した。

図 1に示した患者血清中の C— 35ぺプチド反応性抗体の吸収 ·溶出実験結果を代表例として図 3に示す。この抗体は C— 35により吸収されたが，無関係なペプチドである NS 5 A_2252によっては吸収されなかった（図 3上段）。さらにこの抗体は C— 35吸着画分より溶出された（図 3下段）。

表 1の中でも C -35ぺプチド反応性抗体は HC V感染者では 100%，一方，健常人では 0 %と， H C V特異性が高かつた。 H C Vの C— 35ペプチドの配列は種々のウィルス，たとえば H I V— 1の t e tタンパク（54— 58番のアミノ酸配列）や e n Vタンパク（5— 9， 158— 162， 717— 727のアミノ酸配列）と部分的に相同性を示した。また， HTLV_ Iの種々のタンパク (po l 724-755, r ex 5— 9， r e x 310-313, t ax 70— 74など）とも相同性を示した。そこで， C— 35ペプチド反応性抗体を H C V感染症関連疾患 60例（慢性 C型肝炎 22例，肝硬変 20例，肝癌 18 例）， B型肝炎ウィルス感染者 24例， B型肝炎ウィルスワクチン接種者 10例, 健常人 27例，自己免疫疾患患者 22例， HTLV— I感染者 10例，および H IV感染者 3例，計 156例について 2重盲検法で調べた。その結果を表 2に示す。この結果より， C一 35ぺプチド反応性抗体の H C V特異性および検出率はそれぞれ 88. 5%および 93. 3%であった。ぺプチド特異的 C T L活性の誘発

HLA— A24結合ペプチド 6種（No 3, 12, 13， 25， 32, 38) および HLA— A 2結合ペプチド 18種（No 40から No 57まで）を HLA — A24もしくは HLA— A2陽性の H C V感染患者各 5名の末梢血単核球（ P BMC) と培養した。コントロールとして該 PBMCを H I Vペプチドと培養した。そして，それらの培養 PBMCについて，対応するペプチドをパルスした C 1R-A2402細胞または T 2細胞に応答する I FN—ァ産生能を調べた。その結果， HLA— A24結合ペプチド 6種（No 3, 12， 13， 25, 32， 38) は， HLA— A24陽性 HCV患者 10名の PBMCから CTLを誘導することができた（図 4) 。また， HLA— A24結合性ペプチドによる（B) H CV由来の HLA— A2結合性ペプチド（No 40から No 57) による HLA 一 A 2陽性 H C V患者 5名の PBMCから CTLを誘導することができた（図 5) 。

さらに，ペプチド刺激 PBMCの細胞傷害活性は⁵¹ C r遊離試験によって確認した。その代表的結果を図 6、および図 7に示す。

図 6は， HCV由来の HLA— A24結合性ペプチド（No 3， 12, 13,

25， 32， 38) により HLA— A24陽性 HCV患者 PBMCから誘導された CTLの細胞傷害活性を示す。誘導ペプチドを付着させた C 1R-A2402 細胞（図中では C 1RA2402と表示）に対する細胞傷害作用はコントロールの H I Vペプチドを付着させた C 1 R— A2402細胞（図中では C 1 RA24

02H I Vと表示）に比べ有意に高かった。

図 7は，；^1< ¥由来の1"11^八ー八2結合性ぺプチド（No 40, 41) により

HLA-A2陽性 H C V患者末梢血 P B M Cから誘導された C T Lの細胞傷害活性を示す。誘導べプチドを付着させた T 2細胞（図中では T 2と表示）に対する細胞傷害作用はコントロールの H I Vペプチドを付着させた T 2細胞（図中では

T2H I Vと表示）に比べ有意に高かった。

その結果，これらの PBMCは，対応するペプチド（ネガティブコントロールとしての H I Vペプチド以外）を予め装填した C 1 R-A2402および T 2細胞に対して有意差レベルの細胞傷害性を示した。

この細胞傷害性の H L Aクラス I拘束性は抗 C D 8モノクローナル抗体を用いた抑制試験によって確認した（図 8) 。図 8は， CTL活性の抗 CD 8抗体による抑制の代表例を示す。 HCV由来の HLA— A2結合性ペプチド（No 40) により H L A— A 2陽性 H C V患者 P B M Cから誘導された C T Lの細胞傷害活性は抗 C D 8抗体により抑制されたが，抗 C D 4やコントロールの抗 C D 14抗体では抑制されなかった。実施例 2 ： HLA-A24陽性 H C V感染患者の血清における H C Vぺプチドと反応性を有する I gGの検出

被験者

さらに広範に， HLA— A24陽性の HCV感染患者において， HCVぺプチドと反応性を有する I gGの検出を行った。 60名の HCV1 b⁺患者は，第 2 世代または第 3世代ィムノアッセィ試験により判定して，抗 HCV抗体（Ab) についてセロポジティブであった。患者の血清中の HCVのゲノタイプは RT— PCRにより判定した。血清サンプリングの際の患者の診断は，生化学的分析，超音波検査，コンピュータ連動断層撮影，および組織学的所見により行った。診断の結果は以下のとおりである：慢性肝炎（CH, n=24) ，肝硬変 (LC, n=l 8) ，および肝細胞癌 (HCC, n=18) 。陰性対照としては，正常な肝機能を有し，肝炎ウィルスの病歴を有しない 20名の健康なドナー（HD) からの血清サンプルを用いた。ぺプチドおよびべプチド反応性抗体の測定

HCV1 bタンパク質のよく保存された領域に由来し， HLA— A24分子との高い結合スコア（B i o i n f o rma t i c s and Mo l e c u l a r An a 1 y s i s S e c t i on, NIH， Be t he s da, MD) に基づいて選択された 44種の合成ペプチドを用いた。陰性対照としては HL A— A 24結合モチーフを有する H I V由来ペプチド（RYLRDQQLLGI (配列番号 63) ) を用いた。結合スコアおよび配列を表 3に示す。血清 I gGに対するペプチドの反応性についてのスクリーニング用には， B i oSyn t eh s i s (Lewi s v i l l e, TX) または S y ηΡ e p (Dub l i n, C A) からこれらの脱塩等級（>70%) ペプチドを購入した。その後の実験には精製したペプチド（>90%) を用いた。ペプチド特異的 I gGの血漿レベルは，酵素抗体法 (EL I SA) により測定した。血漿サンプルにおける抗ペプチド I gGの特異性の試験は，ペプチド反応性 I gGの吸収および溶出により行った。ぺプチド特異的 C T Lのアツセィ

ペプチド特異的 CTL前駆体細胞の検出に用いた方法は Hida ら（Cancer Immunol Immunother 2002； 51： 219-228) に記載されるとおりである。阻害試験のためには， 20 gZm 1の抗 HLAクラス I (W6ノ 32'， I gG2 a) , 抗 CD8 (Nu-Ts/c, I gG2 a) ，抗 CD4 (Nu— Th/i， I gG 1 b) , および抗 HLA—クラス I I (H— DR— 1, I gG) モノクローナル抗体を用いた。

NS 5 A遺伝子でトランスフエクションした細胞に対するべプチド刺激 P B M C の CTL活性

NS 5A, HLA-A2402, および HL A— A 2601の t DNAは，それぞれ Huh7 (NNU50— 1) 細胞， C1R— A2402細胞，および KE 4— CTL細胞から RT— PCRにより得て，発現ベクター pCR3. 1 (I n v i t r ogen, S an D i e go, CA) にクローニングした。 Huh 7 (NNU50-1) 細胞株は， HCV1 bに感染した細胞株に由来するレブリコン細胞であり， N S 3から N S 5 Bの夕ンパク質を発現する（Kishine et al.， Biochem Biophys Res Commun 2002; 293: 993-999) 。次に， 100 n gの N S 5 A, HLA— A2402または NS 5 A, および HL A— A 2601 c DN A (陰性対照として）を， 0. 6 1の Fugene 6 (Roche Mo l e c u 1 a r B i ochemi c a l s, I nd i anapo l i s, IN) を含む 10 1の Op t i -MEM (I nv i t r ogen) 中で混合し， 30分；ートした。次に混合物 10 1を COS— 7細胞（1x10⁴細胞）に加え，これを 6時間インキュベートした。 20%FCSを含む 100 1 の RPMI— 1640培地を混合物に加え， COS— 7細胞を 2日間培養し， N S 5 A 2132— 2140刺激 PBMC ( 2 x 10⁵細胞ノゥェル）を加えた。 18時間インキュベートした後， 100 1の上清を取り出し， I FN—ァ濃度を 3ゥエルのアツセィで EL I SAにより測定した。安定なトランスフエクタント細胞株を作製するために，， PCR 3. 1— NS 5八または 01 3. 1— HL A— A 3101 (陰性対照）のいずれかを， Gene Pu l s e r (B i oR AD, R i c hmond, CA) を用いて， C 1 R— A 2402細胞にエレクト口ポレーシヨンによりトランスフエクシヨンした。これらの細胞をゲネテシン (G418) の存在下で 30— 40日間培養し，ゲネテシン耐性細胞を回収した。トランスフエクタント中の NS 5 Aタンパク質の発現は，抗 NS 5ポリクローナル抗体 (Abe am L i m i t ed, C amb r i d g e, UK) を用いるゥエスタンブロット分析により行った。増殖阻害および抗体依存性細胞性細胞傷害（ADC C)

Huh 7細胞株を，平底 96ウェルマイク口カルチヤ一プレートのゥエル中で種々の血清の存在下で 24， 48，および 72時間インキュベートした。インキュベ一ト後，細胞計数キット— 8 (10 1ノウエル） (Do j i ndo, J a pan) で Huh 7細胞を数えた。 AD C Cアツセィのためには， HLA— A 24陽性の HDから新たに単離した PBMCを，種々の患者または HD (陰性対照として）からの非働化血清（56°C， 30分間）を含む 10%FCSおよび R PM I— 1640培地で 1. 5時間プレインキュペートした。 C1R— A240 2細胞および C 1 R細胞（陰性対照として）を NS 5A 2132— 2140ぺプチド（10 M) とともに 2時間インキュベートし， Na₂ ⁵¹C r0₄で 1. 5時間放射性標識し，洗浄し，標的細胞として用いた。ペプチド刺激 PBMCを， 96 U底マイクロカルチヤ一プレートのゥエル中で， 40， 20, および 10対 1のエフェクター対標的細胞 (Ε/Ύ) 比で，標的細胞とともにインキュベートした。 37でで 6時間インキュベートした後，無細胞上清を回収して ADCC活性を測定した（Shomura, et al.， Br J Cancer 2004； 90： 1563- 1571) 。統計学

統計学的分析は，スチューデント t検定およびマン 'ウィットニー U検定を用いて行った。 P<0. 05の値を統計学的に有意とした。

H C V—ぺプチドに対する液性応答の検出

ぺプチドに対する液性応答をスクリーニングするために， HC V— 1 bに感染した 12名の患者の血漿において， 44種のぺプチドに対するそれぞれの I g G 反応性のレベルを測定した。 10名の HDの血漿を陰性対照として用いた。ぺプチド反応性 I gGのレベルは，連続希釈した血漿サンプルについて EL I SAにより測定し、各サンプルの吸光度 (OD) 値を示した。 1 ： 100の血漿希釈でのこれらのペプチドのカットオフ値を 0. 18〇D {10名の110の平均（0. 08) +2 SD (0. 05x2) } とした。 NS 5A— 2132， C- 176, E 2-488, E 1 -213, C一 173, および N S 3— 1081ペプチドに対する有意なレベル（1 : 100の血清希釈で >0. 180D) の I gG反応性は， 12名の患者の血漿中，それぞれ 12， 11, 10， 9, 8, および 5名で検出できた（図 9) 。予測されたように，これらのペプチドのいずれも， 10名の HDからの血漿に対しては反応性を有していなかった。ペプチド特異的 I gG に対するペプチドの反応性を表 3にまとめる。表 3. HCV拘束性ペプチドおよびペプチド特異的 IgG^a)に対する反応性

E2 631 -640 MYVGGVEHRL 22 420 0 0

E2 711-720 SFAIKWEYVL 38 20 1 0

E2 717-725 EYVLLLFLL 8 432 2 0

E2 787-796 AYALYGVWPL 27 200 2 0

E2 789-797 AFYGVWPLL 59 20 0 0

E2 790-798 LYGVWPLLL 11 200 0 0

NS2 822-831 VFVQLILLTL 31 30 2 0

NS2 834-842 HYKLFLARL 13 60 0 0

NS2 837-846 LFLARLIWWL 33 36 0 0

NS2 848-856 YFITREAHL 34 30 1 1

NS2 885-893 IFTITKILL 20 20 3 0

NS2 910-918 PYFVRAHGL 18 24 0 0

NS2 932-941 HYVQMALMKL 23 396 3 0

NS2947-956 TYVYDHLTPL 24 300 2 0

NS3 1031-1039 AYSQQTRGL 12 200 0 0

NS3 1081-1090 WHGAGSKTL 5 200 5 0

NS3 1100-1108 MYTNVDQDL 9 336 0 0

NS3 1243-1252 AYAAQGYKVL 26 200 2 0

NS3 1266-1274 AYMSKAHGI 15 75 2 0

NS3 1292-1300 TYSTYGKFL 14 200 1 0

NS3 1417-1426 YYRGLDVSV! 29 50 2 0

NS3 1556-1565 EFWESVFTGL 32 40.32 0 0

NS4B 1716-1724 PYIEQGMQL 16 36 1 0

NS4B 1727-1735 QFKQKAIGL 19 20 3 0

NS4B 1727-1735 QFKQKALGL 60 20 1 0

NS4B 1727-1736 QFKQKALGLL 62 20 1 0

NS4B 1767-1775 NFISGIQYL 17 36 0 0

NS4B 1773-1781 QYLAGLSTL 10 300 0 0

NS4B 1792-1801 AFTASITSPL 35 28 0 0

NS4B 1854-1863 GYGAGVAGAL 25 280 2 0

NS5A 1990-1999 DFKTWLQSKL 36 26.4 1 0

NS5A2121-2130 FFTEVDGVRL 37 24 1 0

NS5A2132-2140 RYAPACKPL 2 480 12 1 40 NS5A2146-2156 TFLVGLNQYし 30 43.2 2 0

41 NS5B 2442-2451 SYTWTGALI 56 50 0 0

42 NS5B 2482-2491 HYRDVLKEM 57 46.2 3 1

43 NS5B 2613-2622 QYSPGQRVEF 61 132 0 0

44 NS5B 2990-2998 WFMWCLLLL 58 30 3 0 a) 12名の HCV— 1 b⁺患者の血清中のペプチド特異的 IgGのレベルを ELISAにより測定した _c カットオフ値は 0.18であると決定された。 b) HLA— A24分子に対するペプチドの結合スコアは Bioinformatics and Molecular Analysis Section,NIH，Bethesda,MD (http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla bind/)を用いて検索した。

90%以上の純度を有する上述の 6種の各ペプチド，ならびに陰性対照べプチドを， 60名の HCV 1 b+患者（CH， n=24 ； LC, 11=18 ;ぉょぴ¾[ CC, n= 18) ならびに 20名の HDの血清からの各血清サンプルに対する反応性について試験した（図 10) 。

これらの各サンプルについて 100 ： 1希釈の値をプロットした。 I gG (0 D値）の平均土 SDは以下のとおりであった： NS 5 A— 2132 (0. 48 土 0. 36) ， E 2-488 (0. 18±0. 19) ， E 1 - 213 (0. 1 0±0. 21) , NS 3 -1081 (0. 036±0. 14) , C—176 (0. 09±0. 14) および C— 173 (0. 04±0. 13) 。 *はマン ·ウィットニー U検定による Pく 0. 05を示す。 NS 5 A— 2132, E 2-488, E1— 213，または C -173に対して反応性を有する I g Gの平均レベルは， HDのものより統計学的に有意に高かったが， NS 3— 1081 または C一 176の場合にはそうではなかった。 NS 5A— 2132， E2— 4 88, E 1 - 213, C- 173, NS 3- 10810, および C— 176ぺプチドに対して有意なレベルの反応性を示す I gG (1 ： 100の血清希釈において >0. 101 OD) が，試験した 60名の患者の血漿のそれぞれ 57 (9 5%) , 44 (73%) , 28 (47%) , 23 (38%) ， 21 (35%) ，および 17 (28%) において検出できた。これに対し， 20名の HDの血清はすべて，有意なレベルの I gGは検出できなかった（図 10) 。

次に，これらの各ペプチドに反応性を有する I gGのペプチド特異性を，吸収および溶出試験により確認した。各血清サンプルを，対応するペプチドまたは無関係なペプチド（HI V；陰性対照として用いる）のいずれかに， 37°Cで 3回吸収させ， EL I S Aによりペプチド特異的 I gGを測定した（図 11) 。溶出試験では，第 1回の吸収の後にぺプチド固定化プレートに結合した I g G分子を対応するペプチドまたは無関係なペプチドで溶出した後に， EL I S Aにより溶出画分中のペプチド特異的 I gGのレベルを測定した。代表的結果について 3回の測定の OD値の平均土 SDが図示される（図 12) 。 *は両側スチューデント t検定により P<0. 05を示す。

予測されたように， 6種のぺプチドに対する各 I g Gはすべて対応するべプチドにより吸収されたが，無関係なペプチド（H IVペプチド）により吸収されなかった。さらに，この I gGは，対応するペプチドによって結合画分から溶出されたが，無関係なペプチドによっては溶出されなかった。これらの結果を合わせると，各べプチドに反応性を有する I g Gは HC V 1 b由来べプチドに対して特異的であることが示唆される。ぺプチド特異的細胞性応答の誘導

HCV1 bに感染している HLA— A24陽性の患者 (n= 12, 6名の CH， 3名の LC, 3名の HCC) および HCVに感染していない HL A— A 24陽性の HD (n=5) からの PBMCを， 6種の各ペプチド（純度 >90%) または対照 HI Vペプチドとともに 13日間培養し，対応するペプチドでパルスした C 1 R-A2402細胞に応答した I FN産生について調べた。 HLA— A24陽性 HCVl b+の患者 (n= 12) および HD (n = 5) からの PBMCを 6種のペプチドで， 4つのゥエル（15 X 10⁴ノウエル）で刺激した。培養の第 1 4日に，各ゥエルからのペプチド刺激 PBMC (80— 120 X 10⁴Zゥェル）を別々に回収し，等量に 4つに分割した。そのうち 2つを，対応するべプチドでパルスした C 1 R-A2402細胞に応答して I F N—ァを産生する能力について別々に試験した。残りの 2つは，陰性対照ペプチド（HIV) を用いた細胞で試験した。 HIVペプチド（<50pgZml) に応答して産生された I F N—ァをパックグラウンドとして差し引いた。 *は両側スチューデント t検定により Pく 0. 05を示す。

C一 173， C一 176， E1— 213， E 2 - 488, NS 3— 1081，および NS 5 A— 2132の HCVペプチドは， 12名の患者のそれぞれ 1 , 3， 4, 6， 2, および 7名（図 13， 14) ，および 5名の HDのそれぞれ 0， 0， 1， 1， 1, および 1名から，有意なレベル（P<0. 05) の I FN—ァ産生を誘導した（データ示さず）。これらの 6種のペプチドのうち， NS 5A— 21 32ペプチドは， 12名の患者の 7名からの PBMCおよび試験した 60名の H CV1 b+患者の 57名の血清において，細胞性免疫および液性免疫により認識された。 " これらのペプチド刺激 PBMCの細胞傷害性を， 6時間の⁵¹ C r遊離アツセィにより確認した（図 15) 。 I FN—ァ産生アツセィ（上述）によりポジティブの応答を示すペプチド刺激 PBMCを，インビトロで I L— 2のみで培養して増殖させた。次に，標準的な 6時間の⁵¹ Cr遊離アツセィにより，対応するべプチドまたは H I Vペプチド（陰性対照）でパルスした C 1R-A2402細胞に対する細胞傷害性について， 3つの異なる E/T細胞比で試験した。代表的な結果を図示する。値は特異的溶解の％の平均土 SDで表す。 *は両側スチューデント t検定により Pく 0'· 05を示す。 NS 5A— 2132， E2— 488，または E 1-213ペプチドで刺激した PBMCは，対応するペプチドを予め負荷した C 1 R-A2402細胞に対して有意なレベルの細胞傷害性を示したが， HI Vペプチドでは示さなかった（図 15) 。

図 15に示される実験において用いたペプチド刺激 PBMCを， 20 n g/m 1の抗 HLA—クラス I (W6/32, I g G 2 a) , 抗 HL A—クラス I I (H-DR- 1, I gG2 a) ，抗 CD8 (Nu-Ts/c, I gG2 a) ，および抗 CD4 (Nu-Th/ i, I gG 1) モノクローナル抗体 (mAb) の存在下で，対応するペプチドでパルスした C 1R-A2402細胞に対する細胞傷害性について試験した。抗 CD 14 (JML-H14, I gG2 a) mAbを陰性対照として用いた。 3つの異なる EZT比で 6時間の⁵¹ C r遊離アツセィを行った。値は特異的傷害の％の平均土 SDで表す（図 16) 。 *は両側スチュ一デント t検定により P<0. 05を表す。

3種のペプチドのそれぞれでパルスした C 1 R-A2402細胞に対する細胞傷害性は，抗 HLA—クラス I (W6Z32) または CD 8モノクローナル抗体 (mAb) により阻害されたが，試験した他の mAbのいずれによっても阻害されなかった。このことは，ペプチド特異的細胞傷害性が，主として CD8+T細胞により HLA—クラス I拘束性で媒介されることを示す（図 16) 。これに対し，残りの 3種のペプチド（C— 173， C一 176，または N S 3— 108 1) で朿!]激した PBMCではそのような細胞傷害性は検出できなかった（デ一夕示さず）。

次に， NS 5 Aおよび HLA— A2401遺伝子で一過性にコトランスフエクシヨンした COS— 7細胞を標的細胞として用いることにより， NS 5 A-21 32ぺプチド刺激 P BMCが自然にプロセスされて生じたぺプチドを認識するか否かを調べた。陰性対照としては， NS 5 Aおよび HLA— A2601遺伝子で一過性にコトランスフエクシヨンした COS— 7細胞を用いた。患者 # 1および #2からの NS 5 A-2132ペプチド刺激 P BMCが， NS 5 Aおよび HL A -A2401遺伝子で一過性にコトランスフエクシヨンした COS— 7細胞を標的細胞として認識して I FN—ァを産生する活性について試験した。陰性対照としては， NS 5八ぉょび111^八ー八2601遺伝子で一過性でコトランスフエクシヨンした COS— 7細胞を用いた。値は， E/T比 20 ： 1での 3回のアツセィにおける I FN—ァ産生の％の平均士 SDを表す（図 17) 。 *は両側スチユーデント t検定により P<0. 05を示す。

予測されたように， CTL活性を示した（図 13) 患者 # 1および #2からのペプチド刺激 PBMCは， NS 5 Aおよび HLA— A2401遺伝子でコトランスフエクシヨンした COS— 7細胞を認識して，有意な量の I FN— rを産生した（図 17) 。これに対し，これらの PBMCは，陰性対照として用いた NS 5 Aおよび HL A— A 2601遺伝子を有する C O S— 7細胞には反応しなかった。また， CTL活性を示さなかった他の 2名の患者（#3および #4) からのぺプチド刺激 PBMCも， NS 5 Aおよび HLA— A2401遺伝子でコトランスフェクシヨンした COS— 7細胞の認識により有意な量の I FN—ァを産生しなかつた（データ示さず）。

次に， NS 5 A遺伝子で安定にトランスフエクトし標的細胞として用いた C 1 R-A2402細胞に対する細胞傷害性を試験した。 N S 5 A遺伝子で安定にトランスフエクトした C 1 R-A2402細胞における HL A— A 24分子の発現，および HLA— A31遺伝子（陰性対照）で安定にトランスフエクトした C 1R -A2402細胞における HLA— A31分子の発現を， FACS c anを用いるフローサイトメトリー分析により確認した（図 18) 。

次に， NS 5 A遺伝子で安定にトランスフエクトした C 1 R-A2402細胞を標的細胞とする細胞傷害性を 6時間の⁵¹ C r遊離アツセィにより試験した。陰性対照遺伝子 (HLA-A3101) で安定にトランスフエクトした C 1R— A2402細胞を陰性対照として用い， NS 5A— 2132ぺプチドでパルスした C1R— A2402細胞を陽性対照として用いた。 3つの異なる E/T比で 6 時間の⁵¹ C r遊離アツセィを行った。値は特異的溶解の％の平均土 SDで表す。 *は両側スチュ一デント t検定により P<0. 05を示す。 NS 5A—2132 ペプチドで刺激した PBMCは，陰性対照遺伝子でトランスフエクトした C 1 R — A 2402細胞に対する細胞傷害性と比較して， NS 5 A遺伝子でトランスフェクトした C 1 R-A2402細胞，および対応するペプチドで予めパルスしたトランスフエクトしていない C 1 R-A2402細胞の両方に対して，より高いレベルの細胞傷害性を示した（図 19) 。これらの結果は， NS 5 A-2132 ペプチド刺激 PBMCが HCV 1 b⁺細胞のHLA— A2402分子上の自然にプロセスされて生じたペプチドを首尾よく認識したことを示唆する。抗 NS 5 A— 2132 I g Gについてのさらなる研究

抗ぺプチド I g Gの生物学的役割の可能性をさらによく理解するために，吸収および溶出アツセィにより，抗 NS 5A— 2132 I gGが全 NS 5タンパク質を認識するか否かを調べた。 NS 5 A— 2132および H I Vペプチドをそれぞれ陽性対照および陰性対照として用いた（吸収試験および溶出試験の詳細は上述を参照）。その結果，抗ペプチド I gGは，全 NS 5タンパク質では吸収も溶出もされなかった（図 20) 。このことは，このペプチド I gGは全 NS 5タンパク質とは反応しなかつたことを示唆する。

次に， Huh 7細胞を，患者血清（血清が高レベルの抗 NS 5 A— 2132活性を有する 2名の HC VI b+患者からの血清）の存在下で 3日間までインキュベ一トした。陰性対照としては， 2名の HDからの血清および FCSを用いた。生存可能な Huh7 (NNU 50— 1) 細胞の数を細胞計数キット 8 (1 0 u I ウエル）で数え， 3回のアツセィの平均値を示す。試験した血清はいずれも，これらの培養条件下では Hu h 7 (NNU 50-1) 細胞の増殖を阻害しなかつた（図 21) 。また，抗 NS 5A— 2132 I g Gが AD C C活性を媒介する能力を有するか否かを調べた。 HLA— A24陽性の HDから新たに単離した PB MCを，上述の 4種の非働化血清の存在下で，このペプチドで予めパルスした C 1R— A2402細胞に対する細胞傷害性について試験した。しかし，これらの条件では試験した血清のいずれも ADCC活性を示さなかった（図 22) 。実施例 3. HCV感染者の予後の予測

被験者

血清は， 1995年から 2002年のコホート研究における， HC V関連疾患を有する 33名の患者から得た。 33名の患者のフォ口一ァップ調査の結果は表 4に示される。慢性肝炎 (CH, n=68) , 肝硬変 (LC, n = 43) ，および肝細胞瘟（HCC, n=52) を有する患者の血清も分析に用いた。これらの患者は，最初の血清サンプリングの際に，生化学および組織学的所見，超音波検査，およびコンピュータ連動断層撮影により診断した。抗 HCV抗体は，化学発光酵素ィムノアッセィ（CLE I A) キット（Lum i pu 1 s e I I HC V, F u j i r e b i o I nc. , Tokyo, J ap an) により，または第 2世代もしくは第 3世代酵素ィムノアッセィ試験（SRL, Tokyo, J a p an) により測定した。血清中の HCV— RNAは RT— PCR (SRL, T o ky o, J ap an) を用いて検出した。 HCVゲノタイプは，患者の血清中の HCVを RT— PCR (SRL, Tokyo, J ap an) で直接シークェンシングすることにより決定した。 HCV感染していない被験者からも血清を得た。これは，自己免疫疾患を有する 24名の被験者（全身性エリテマトーデスを有する 6名の患者，ベーチェット病を有する 1名の患者およびァトピー性皮膚炎を有する 17名の患者）， B型肝炎ウィルス（HBV) 感染の 17症例（HBV表面抗原にポジティブ），ヒト免疫不全ウィルス（HIV) を有する 3名の患者，およびヒト T細胞白血病ウィルスタイプ I (HTLV— 1) 感染を有する 10症例を含む。陰性対照として， HBVの肝炎ウィルスまたはワクチン接種の履歴を有さず，正常な肝機能を有する 37名からの血清を試験した。表 4： 1995年および 2002年の診断結果

CH,慢性肝炎； LC, fl干硬変； HCC,肝癌;

ASC,無症候性健康キャリアぺプチド

純度 90%以上の次の 2つのペプチドは， B IOSYNTHES I S (Lew i s v i 1 1 e, TX) から購入した； HCV1 bコアタンパク質 35-44

(YLLPRRGPRL (配列番号 1) ； HL A— A 2拘束性 CTL活性を誘導することができる），ぉょびHCVl bNS 5Aタンパク質2132— 2140 (RYAPACKPL (配列番号 2) ； HL A— A 24拘束性 CTL活性を誘導することができる）。陰性対照としては， HLA— A2結合モチーフ（SLYN TVATL (配列番号 64) ) および HLA_ A 24結合モチーフ（RYLRD QQLLG I (配列番号 63) ) を有する H I V由来ペプチドを用いた。ぺプチドに反応性を有する抗体の測定

ペプチド特異的 I gGのレベルは，酵素抗体法（EL I SA) により測定した。簡単には，各ペプチドをジメチルスルホキシド（DMSO) に溶解し，一 20°C で保存した。化学架橋剤であるジサクシンイミジルスべレート（DSS) (P I ERCE, Roc k f o r d, I L) を含む 0. 1 M炭酸バッファで希釈したぺプチド（20 g ウエル）を EL I S Aプレートに結合させた。 0. 05%T we e η 20-PBS (PBST) でゥエルを 3回洗浄した。プレートを B i o c k Ac e (Yu k i j i r u s h i , Tokyo, J ap an) で 4°Cで一晚ブロッキングした。血清サンプルを 0. 05%Twe e n 20-B 1 o c kA c eで 100倍， 200倍， 400倍に希釈し， 100 1ノウエルのサンプルを各ゥエルに加えた。 37 °Cで 2時間インキュベートした後，プレートを PBS Tで 9回洗浄し， 10 1/ゥエルの 1000倍希釈ゥサギ抗ヒト I gG (r 鎖特異的）（DAKO, G l o s t rup, Denma r k) とともに 37°Cで 2時間ィンキュベ一トした。 9回洗浄した後， 100 1 ウエルの 1 : 100 希釈抗ゥサギ I g G結合西洋ヮサビパーォキシダーゼ ·デキストランポリマー (En V i s i on, DAKO) を各ゥエルに加え，プレートを室温で 40分間インキュベートした。洗した後， 10 1 ゥエルのテトラメチルベンチジン基質溶液（KPL, Gu i l d f o r d, UK) を加え， 1. 0Mのリン酸を加えることにより反応を停止させた。統計学

統計学的分析は， χ ²を検定を用いて行った。 ρ<0. 05の値を統計学的に有意であるとした。交叉反応性， HLA拘束性，およびゲノタイプ拘束性 HCV 1 b由来ペプチドに対して反応性を有する 2つの抗体の交叉反応性を調ベた。 60名の HCV患者，およびコホート研究に含まれていない患者（CH， n = 22, LC, n=21, および HCC， n= 17) の血清を，コアの 35— 44 (C一 35) および NS 5Aの 2132— 2140 (NS 5A— 2132) のべプチドに対する反応性について調べた。自己免疫疾患を有する 24名の被験者， HBV感染の 17症例および HTLV—1感染の 10症例からも血清を入手した。 37名の HDからの血清を陰性対照として用いた。連続希釈した血清サンプルのペプチド反応性 I gGのレベルを EL I S Aにより測定した。各サンプルの吸光度 (OD) の値を示した。 100 ： 1の血清希釈での ODの代表的な結果を示す。カットオフ値は 0. 093 (HDからの〇Dの平均 + 2 SD) に設定した。統計学的分析は χ ²検定を用いて実施した。 ρく 0. 05の値を統計学的に有意とした。

その結果， HCV陽性患者の 56/60 (93. 3%) において有意なレベルの抗 C— 35 I gGが検出され， 3群（CH， LC, および HCC患者）の間で I gGレベルには有意な差がなかった（図 23) 。 HTLV—1患者を除き，他の群からの血清は抗 C— 35抗体にポジティブではなかった。 HTLV— 1 +被験者の 8/10症例の血清において，低いが有意なレベルの抗 C一 35 I gGが検出された。患者の 45/60 (75%) で有意なレベルの抗 NS 5 A— 213

2 I gGが検出された。 I gGレベルは， 3群の間では， CH患者では高く， L Cでは中程度であり， HCC患者では低かった（p<0. 05 V s CH) (図 2

3) 。他の群からの血清についても，試験した症例の大部分で抗 NS 5 A— 21

32 I gGがポジティブであった。さらに， 3Z37の HDの血清は抗 NS 5 A -2132 I g Gがポジティブであった。

次に， HCV関連疾患を有する 29名の患者で， HLA—クラス I A表現型と，抗 C— 35 I gGまたは抗 NS 5 A— 2132 I g Gのレベルとの間の相関を調ベた。 HLA—クラス I A表現型は標準的な血清学的方法により決定した。 9名の患者は HLA— A2陽性， 13名の患者は A24陽性，および残りの 7名の患者は A 2陰性， A 24陰性であった。抗 C— 35およぴ抗 N A 5 A 2132は，標準的 EL I S Aにより測定し，各患者の 100 ： 1の血清希釈での OD値を図示した。いずれの抗体も， HLA—クラス I A表現型の相違にかかわらず， HC V感染患者の大部分で検出された（図 24) 。

次に， HCV— l b (n=29) , HCV- 2 a (n= 16) および HCV— 2b感染（n=3) を有する患者において， HCVゲノタイプと，抗 C— 351 gGまたは抗 NS 5A-21321 g Gのレベルとの間の相関を二重盲検法で調ベた。 HCVゲノタイプは，，患者の血清中の HCVを直接シークェンスすることにより決定した。すべての被験者の 100 ： 1希釈での結果を図 25に示す。抗 C一 35および抗 NA 5 A 2132は，標準的な EL I S Aにより測定し，各患者の 100 : 1の血清希釈での〇D値を図示した。カツトオフ値は 0. 093 (HDからの ODの平均 +2 SD) に設定した。

抗 C— 35抗体は，それぞれ， 26/30の HCV— 1 b， 15/15の HC V-2 a, および 3 Z 3の HCV— 2 b感染患者で検出された。同様に，抗 NS 5 A— 2132抗体は，それぞれ， 23Z30の HVC l b, 10Z16の HC V-2 a, および 3ノ3の HCV— 2 b感染患者からの血清中で検出された（図 25) 。これらの結果は， HCV陽性患者においては， HLA—クラス IAサブタイプの相違および HCVゲノタイプの相違にかかわらず，抗 C一 35抗体および抗 NS 5 A— 2132抗体の両方が検出されたことを示す。

以上の結果は，抗 NS 5A— 2132抗体のレベルは HCV感染個体の予後と相関するが，抗 C一 35抗体は相関しないことを示唆する。

次に， CH (n = 24) ， LC (n=22) , HCC (n=26) , HD (n =9) の血清を新たに用意し，抗 NS 5A— 2132 I gGのレベルを測定した (図 26) 。 CH， LC, HCCおよび HD群の平均土 SDはそれぞれ 0. 5 1±0. 24, 0. 27±0. 20， 0. 26± 0. 23, 0. 08 ±0. 0 7であった。 LCおよび HCC患者における抗 NS 5 A— 2132抗体のレベルは CH患者より有意に低かったが（p<0. 05) , HDより高かった。これらの結果を標準的な第 3世代アツセィにより測定した結果と比較するために，すべての血清について，市販のキット（第 3世代アツセィ， SRL) を用いて抗 HC V抗体のレベルを測定した。レベルは指数として示される（左カラム）。指数で示される抗 HCVのレベルと抗 NS 5 A— 2132のレベルとの間の相関は，右カラムに示される。第 3世代アツセィにより測定した抗 HCV抗体のレベルは 3 群の間で有意に相違しなかった（CH ; 10±2. 7， LC； 11±1. 4， HCC ; 1 1± 1. 1) (図 27) 。さらに，これらの血清について，市販のキット（SRL, J ap an) を用いて HCV RNAレベルを測定した。 HC C患者の HCV RNAレベル（360±269. 6) は， CH患者（610 ± 347. 3) または LC患者（6 1 0 ± 246. 4) より低かった（p< 0. 05) (図 28) 。しかし，抗 NS 5 A抗体のレベルと HCV RNAレベルとの間には明らかな相関はなかった（図 28) 。コホート研究の結果

抗 NS 5A— 2132抗体と HCV陽性患者の予後との相関を個々のレベルでさらに調べるために， 1990年から 2002年に行われた， HCVに感染している住人を毎年スクリーニングするコホート研究からのサンプルについて 2つの抗体の血清レベルを調べた。この研究のためには， 1995年および 2002年に同じ個体から 2回採取した 33名の患者からの合計 66の血清を用いた。 19 95年の時点におけるこれらの 33名の患者の診断は， CH (n=l 7) , LC (n-1) ，無症候性キャリア（ASC) (n = 4) ，および HCV感染の過去の病歴（自然回復した個体）（n= 1 1) であり， 2002年の時点では， CH (n= 13) , LC (n = 4) , HCC (η=2) , 無症候性キャリア（AS C) (n= 1) , および HCV感染の過去の病歴（n=13) であった。すなわち， 7年間の間に， 26名の患者では疾患の進行が観察されなかったが，残りの 7名の患者では進行が観察された（表 4) 。 1995年および 2002年に 10 0 ： 1の血清希釈で測定した各患者における抗 C— 35抗体および抗 NS 5 A -2132 180の00値を図29に示す。予測されたように， 33症例の大部分においては，疾患の状態にかかわらず， 1995年に測定した抗 C一 35抗体のレベルと 2002年に測定したレベルとはほぼ等しかった。これに対し， 19 95年に測定した抗 N S 5 A抗体のレベルは，疾患が進行した 7名の患者すベてにおいては 2002年に測定したときに減少していた。一方，疾患が進行しなかつた 25症例の大部分において 2002年で測定した値とほぼ等しかった。疾患が進行した 7名の患者の血清中の 1995年の時点における抗 NS 5A-213 2抗体の中央値土 SD (0. 67±0. 13) は， 2002年に測定した値 (0. 27土0. 1 1) より有意に高かった（p<0. 05) 。

次に， 33名の被験者を 5つの群（CH, LC, HCC, HCV感染の過去の病歴 [回復した個体] ，および AS C) に分け， 2002年における 100 : 1 の血清希釈での 2つの抗体のレベルをプロットした（図 30) 。統計学的分析は, χ²検定を用いて行った。 Ρく 0. 05の値を統計学的に有意とした。抗 C一 3 5抗体のレベルは， CH, LC, および HCCではいずれも高く，治癒した個体では非常に低くなるか検出できなくなった。一方，抗 NS 5Α— 2132抗体のレベルは CH，回復した個体および AS Cで高く， LCで中程度であり， HC C患者で最も低かった（p<0. 05v s CH) 。実施例 4：ルミネックス（Luminex) 法による HL A— A 24 +HC V感染患者の血清における HCVペプチドと反応性を有する I gGの検出

EL I S A法より感度が高いと考えられるルミネックス（Luminex) 法を用いて、実施例 1と同様にして、 HLA— A24+HCV感染患者の血清における HCVペプチドと反応性を有する I gGの検出を行った。ぺプチドの微小ビーズへの結合

ペプチドを、製造者の指示に従って各蛍光色素の含有量を識別コ一ド（以下、カラーコ一ド）ィ匕した微小ビーズ（Luminex社製、 xMAP Multi-Analyte COOH Beads) にそれぞれ次のようにして結合した。フィルタープレートの各ゥエルにカラ一コード化した未調製の微小ビーズを 100 ^1ずつ入れて吸引し、その後洗浄用緩衝液 (リン酸緩衝液生理食塩水 (PBS) (pH7. 4±0. 1) 、 Tween (登録商標） 20 (0. 05%v/v) ) で 2回洗浄し各ゥエルを同時に吸引した。次に 0. 1M MES (2—モルホリノエタンスルホン酸）緩衝液（pH 7. 0) 50 lを入れ、 EDC (N-ェチル ·Ν'-(3-ジメチルァミノプロピル) -カルポジィミド塩酸塩） ( 1 mg/ml/ 0. 1 M ME S緩衝液 (pH 7. 0) ) を各ゥエル lO lずつ添加した。数百 lのペプチド（lmg/ml, 0. 1M MES緩衝液、 pH 7. 0) をこの洗浄した微小ピーズと各ゥエル内で混合した。その後ペプチドと混合した微小ビーズを、暗所で 20分間、室温で反応させた後、さらに EDC (1 mg/ml/ 0. 1M MES緩衝液 (_PH 7. 0) ) を各ゥエル 1 O 1ずつ添加し、暗所で、 20分間室温で反応させる操作を 2回繰り返した。余剰液を吸引後、 1Mトリス塩酸緩衝液 (ρΗ7. 0) を各ゥエル 100 1ずつ添加し、暗所で、 15分間室温で反応させた。次に、各ゥエルのピーズを上記洗浄用緩衝液で 3回洗浄し、ブロックエース（登録商標）に 0. 05 %アジ化ナトリウムを入れて調整した保存用溶液で回収した。微小ビーズミックスの調製

各ゥエルの微小ビーズを調製するときは、上記のようにカラーコード化した微小ビーズにぺプチドを結合させて得たビーズ溶液をフィルタープレートの各ゥェル当たり微小ビーズが約 5000個になるように入れて（各ゥエル当たりビーズ 1種類約 l l) 調製する。また、このように調製した微小ビ一ズを 10種類等量で混ぜて、上記洗浄用緩衝液（PBS、 TWEEN (登録商標） 20 (0.05% v /v) ) で総量が約 25 1になるように希釈してピ一ズミックスを調製した。サンプルの調製

血清を使用した。血清を反応用緩衝液 (PBS (pH 7. 4±0. 1) 、

Tween (登録商標） 20 (0. 05%v/v) 、牛胎児血清アルブミン（B S A) 10 mg/ml) を用いて 100〜： L 000倍希釈した血清希釈液をそれぞれ 1 00 l調製した。抗ペプチド抗体測定

ピオチン化二次抗体としては、ピオチン化ャギ抗ヒト I gG (ガンマ鎖特異的）を上記反応用緩衝液で希釈して使用した。蛍光色素標識ストレプトアビジンとしては、 PE (フィコエリスリン）で標識したストレプトアビジン（SRPE) 1 mg/ml を上記反応用緩衝液で 2 O I に希釈（1 50希釈）して使用した。フィルタープレートの各ゥエルに上記洗浄用緩衝液を 100 l入れ、続いて吸引除去した。この洗浄操作を 2回行った。次に、各ゥエルに上記ビーズミックスを 25 l入れた 96ゥエルのフィルタープレートを該洗浄用緩衝液で 2回洗浄した。洗浄後、全てのゥエルに上記サンプルをそれぞれ 100 l入れた。次にフィルタープレートにカバーをして喑所で、 2時間室温でプレートシエ一カー (300 r pm) を用いて振とうした後、吸引した。続いて、各ゥエルに上記洗浄用緩衝液をそれぞれ 10,0 l入れ、吸引除去した。この洗浄操作を 3回行つた。

次に、各ゥエルにピオチン化二次抗体としてピオチン化ャギ抗ヒト I gG (ガンマ鎖特異的）をそれぞれ 100 入れ、フィルタープレートにカバーをして暗所で 1時間室温でプレートシェーカー（300 r pm) を用いて振とうした。その後、吸引して、各ゥエルに上記洗浄用緩衝液をそれぞれ 100 1入れ、吸引除去した。この洗浄操作を 3回行った。

続いて、各ゥエルに SRPEをそれぞれ 100 1入れて、フィルタープレートにカバーをして喑所で 30分間室温でプレートシェーカー（300 r pm) を用いて振とうした。その後、吸引して、各ゥエルに上記洗浄用緩衝液をそれぞれ 100 1入れ、吸引除去した。この洗浄操作を 3回行った。その後、各ゥエルに該洗浄用緩衝液をそれぞれ 100 l入れて、プレートシェーカー（300 r pm) を用いて 2 3分間振とうした後、得られたサンプル 50 1を蛍光フローメトリーシステムで測定した。結果を図 31および 32、および表 5に示す。

実施例 5 ： C型肝炎ウィルス由来ペプチドワクチンを用いる HCV感染の治療 HLA— Α2陽性または HLA— Α24陽性の HCV感染者において，本発明の C型肝炎ウィルス由来ペプチドを用いたワクチンの抗ウィルス効果を調べた。被験者はいずれも， HCV1 bに感染しており，インターフェロン +リバビリンによる治療に応答しなかった患者である。 C型肝炎ウィルス由来ペプチド C一 3 5, NS 5A - 2132， E 2-488, E 1 - 213および N S 3 - 1081 は GMP適合下に合成し，精製し，凍結乾燥粉末として保存した。 C—35， N S 5 A- 2132, E2-488および N S 3— 1081のぺプチドは，少量の DMSOに溶解 (lmg/10〜25 1) し， E 1— 213は 7%炭酸水素ナトリウム注射液（メイロン）に溶解 (lmg/15 1) した。これらをそれぞれ注射用生理食塩水で希釈（l〜2mgZml) し， 0. 22 ΠΙのフィルタを通して滅菌した。この溶液を等量のアジュバント（Mon t an i d e I SA -51) と混合して，ェマルジヨン注射剤を得た。このうち HLA— A2陽性の被験者 3名には C一 35注射剤を， HLA— A24陽性の被験者 5名には NS 5 A— 2132注射剤を投与した。投与は， 2週間ごとに， 1回あたり 0. 3mg のペプチドを含むェマルジョンを側腹部に注射することにより行った。 HCV RNAの量および G〇T， GPT，ァー GTP， AF Pの値を継続的にモニターした。

結果を図 33および図 34に示す。これらの図から明らかなように，試験したほとんどの被験者において，ワクチン投与開始後 HCV RN Aの量が顕著に低下しており，本発明のペプチドが抗 HCVワクチンとして有効であることが実証された。産業上の利用性

この発明に係る C型肝炎ウイルス由来べプチドは， H L A結合モチーフをその配列中に含んでいて， C型肝炎ウィルスに反応する抗体により認識されるとともに，さらに H L A— A 2または H L A— A 24拘束性細胞傷害性 T細胞による認識性を有している。

したがって，この発明の C型肝炎ウィルス由来ペプチドは， HCV感染に起因する疾患に対して有効なワクチンとなり得る。

Claims

請求の範囲

I. HL A結合モチーフを配列中に含み，かつ， C型肝炎ウィルス患者で検出される抗体により認識されることを特徴とする C型肝炎ウィルス由来ペプチド。

2. 前記べプチドが配列番号 1〜 8、 16、 20および 38のいずれか 1つで表されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項 1に記載の C型肝炎ウイルス由来ペプチド。

3. 配列番号 1〜8、 16、 20および 38のいずれか 1つのアミノ酸配列と少なくとも 70%の相同性をもつアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項 1または 2に記載の C型肝炎ウィルス由来ペプチド。

4. HLA— A2または HLA— A24拘束性細胞傷害性 T細胞による認識性をさらに有することを特徴とする請求項 1〜 3のいずれか 1つに記載の C型肝炎ウィルス由来ペプチド。

5. 請求項 1〜 4のいずれか 1つに記載の C型肝炎ウィルス由来べプチドを含むことを特徴とするポリペプチド。

6. 請求項 5に記載のポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも 70 %の相同性をもつアミノ酸配列を有することを特徴とするポリぺプチド。

7. HLA— A2または HLA— A24拘束性細胞傷害性 T細胞による認識性をさらに有することを特徴とする請求項 5または 6に記載のポリぺプチド。

8. 請求項 1〜4のいずれか 1つに記載の C型肝炎ウィルス由来ペプチド，または請求項 5〜 7のいずれか 1つに記載のポリぺプチドをコ一ドすること，またはこれらに対して相補的な配列を有することを特徴とするヌクレオチド。

9. 請求項 1〜4のいずれか 1つに記載の C型肝炎ウィルス由来ペプチド，または請求項 5〜 7のいずれか 1つに記載のポリぺプチドを認識することを特徴とする抗体または抗体類似活性物質。

10. 請求項 8に記載のヌクレオチドを含有することを特徴とするベクター。

I I. 請求項 1〜4のいずれか 1つに記載の C型肝炎ウィルス由来ペプチド，または請求項 5〜 7のいずれか 1つに記載のポリぺプチドを用いて細胞傷害性 T 細胞を誘導することを特徴とする細胞傷害性 T細胞の誘導方法。

1 2 . 請求項 1〜4のいずれか 1つに記載の C型肝炎ウィルス由来ペプチド，請求項 5〜 7のいずれか 1つに記載のポリぺプチド，請求項 8に記載のヌクレオチド，または請求項 9に記載の抗体もしくは抗体類似活性物質を使用することを特徴とする肝炎ウィルスの検出方法。

1 3 . 請求項 1〜4のいずれか 1つに記載の C型 B干炎ウィルス由来ペプチド，請求項 5〜 7のいずれか 1つに記載のポリぺプチド，請求項 8に記載のヌクレオチド，あるいは請求項 9に記載の抗体または抗体類似活性物質を使用することを特徴とする C型肝炎ウィルス感染症の診断方法。

1 4. 請求項 1〜4のいずれか 1つに記載の C型肝炎ウィルス由来ペプチド，請求項 5〜7のいずれか 1つに記載のポリペプチド，請求項 8に記載のヌクレオチド，あるいは請求項 9に記載の抗体または抗体類似活性物質を使用することを特徴とする C型肝炎ウィルス感染症の予防または治療方法。

1 5 . 請求項 1〜4のいずれか 1つに記載の C型肝炎ウィルス由来ペプチド，請求項 5〜 7のいずれか 1つに記載のポリぺプチド，請求項 8に記載のヌクレオチド，あるいは請求項 9に記載の抗体または抗体類似活性物質を有効成分として含むことを特徴とする医薬組成物。

1 6 . 医薬組成物が C型肝炎ウィルスワクチンであることを特徴とする請求項 1 5に記載の医薬組成物。

1 7 . 請求項 1〜4のいずれか 1つに記載の C型肝炎ウィルス由来ペプチド，請求項 5〜 7のいずれか 1つに記載のポリペプチド，請求項 8に記載のヌクレオチド，あるいは請求項 9に記載の抗体または抗体類似活性物質を使用することを特徴とする C型肝炎ウィルス感染症の予後の予測方法。

1 8 . 請求項 1〜4のいずれか 1つに記載の C型 ffp炎ウィルス由来ペプチド，請求項 5〜 7のいずれか 1つに記載のポリぺプチド，請求項 8に記載のヌクレオチド，あるいは請求項 9に記載の抗体または抗体類似活性物質を含むことを特徴とする C型肝炎ウィルス感染症を診断または予後を予測するためのキット。 1/32

8654327011 患者 4

溶出

図 1

(A)

希釈倍率希釈倍率

(0 (D)

図 2

差替え用紙（規則 26) 2/32

吸取

n

0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 〗.00 1.20 溶出

図 3

4/32

患者 1 患者 2

- 100 200 300 0 55555555 4444444444 5 4444444 4445555555 444444444455555555.

72345677 02345689 0 Ο23456- 7890234567 02345678902345611Ί111

o i IE I■ -隱ー E- f J!

患者 3 455555555 444

7 67890234561 患者 4

函ー 111 iliii -—-—國-讀|

IFN- 產物 (pg/ml) IFN- 産物（Pg/ml)

0 100 200 300 100 200 300

患者 5

IFN- r 産物 (Pg/ml)

100 200 300

図 5

差替え用紙（規則 26) 5/32

患者 7/ペプチド 3 患者 8/ぺプチド 12

E/T率 E/T率患者 10/ぺプチド 12 患者 8/ぺプチド 32

患者 10/ぺプチド 38

E/T率

図 6 差替え用紙（規則 26) 6/32

ぺプチド 40 ぺプチド 41

H I

% 特異的な溶解

20 40 60 80 100

図 8

差替え用紙（規則 26) 図9

ZZIL

zie^TO/ oordr/x3d eossro/sooz; ΟΛ\ Anti-C 173-182 IgG Anti-C 176-185 IgG Anti-El 213-222 IgG

Anti-E2488-496 IgG Anti-NS3 1081-1090 IgG

Anti-NS5A 2132-2140 IgG

図 10

C173-182 E488-496

0.43 0.45 0.47 0.49 (OD) 0.3 0.35 0.4 0.45 0.5 (OD) C176-185 NS31081-1090

0.24 0.25 0.26 0.27 0.34 0.35 0.36 0.37 0.38 0.39

(OD) (OD)

E2213-221 NS5A 2132-2140

E2 213-221 NS5A2132-2140 mv fflV no peptide no peptide

0.35 0.36 0.37 0.38 0.39 (OD) 0.6 (OD) 図 1 1

C173-182 E488-496

(OD) C176-185 NS31081-1090

E2213-222 NS5A 2132-2140

fflV peptide HIV peptide

no peptide no peptide

0.05 0.06 0.07 0.08 (OD) 0.05 0.06 0.07 0.08 (OD) 図 12

zzivv

£0S8Z0/S00J OAV Pt.7 Pt.8 Pt.9

0 50 100 150 200 250 0 50 100 150 200 50 100 150 200 250 IFN-γ (pg/ml) IFN-Y (pg/ml) IFN-γ (pg/ml)

Pt.10 Pt.ll Pt.12

C173-182 C173-182 C173-182

C176-185 C176-185 C176-185

El 213-221 El 213-221 El 213-221

E2488-496 E2 488-496 E2488-496

NS3 1081-1090] NS3 1081-10901 NS3 1081-1090

NS5A 2132-214' NS5A 2132-214 NS5A 2132-214

fflV

No peptide mv mv

No peptide! No peptide

50 100 150 200 50 100 150 200 50 100 150 200 250 IFN-γ (pg/ml) IFN-γ (pg ml) IFN-γ (pg/ml)

図 14

pVIused C1R Hl- ppteulsed C1RA2 Peid準-- —

% lysis

o CO o o o o

100 /3t. wl 21221P3-

t

zuno/toozdr/Ud El 213 - 221 NS5A 2132-2140

10 20 40 10 20 40

E/T ratio E/T ratio

-Θ- Anti-Class II antibody

5 10 20

E/T ratio 図 16

15/32

寸 vo

卜

C1R-A2402 transfected with NS5A C1R-A2402 transfected with HLA-A31

0 10° 10¹ 10² 10³ 0 10° 10¹ 10² 10³

図 18

E/T ratio

図 19

Absorbed with _Pt>1 Eluted with Pt.l

0.3 0.35 0.4 . 0.45 0.5 (QD) 0.05 0.06 0.07 (OD)

図 20

No

0 50 100

, lysis 図 21

0 24 48 72

Time course (hour)

図 22

Anti-C35IgG Anti-NS5A2132 ¾G

immne

disease disease

図 23

Anti-NS5A 2132 IgG

Anti-C35 IgG

1

o

A2 A24 A2(-)， A24(-)

HLA type HLAtype

図 24

図 25

Anti.腿 2132 IgG Anti-C35IgG

CH LC HCC Past history of ASC

HCV infection

図 26

aNS5 Aig - The third anti-HCV antibody s Disiano

CCCCH L H Index

O Is) 4^. O 00

Index

£

CH LC HCC 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

Diagnosis

Anti-NS5A2132IgG(OD)

図 28

No disease progression

Disease rogression

year year

· ^Θ'： CH→CH •X : CH→LCwithHCC ^"： ASC—ASC 寺： CH→LC -E ： LC→LC ： ASC→CH "■■:CH→CHwithHCC -6-： ASC→Past history ： Past history^→Past history 図 29

Anti-NS5A 2132 IgG

CH LC HCC HD

Diagnosis 図 30

HDauents Pdets pa-n fluorescence intensity fluorescence intensity

to t

o Cn o t 00 o o O o o o o o o o o 〇〇〇 o o

7 70tiE22 An¾S 8∞893 Anti:2- --

CTQ

Q

s Patient Huetso Pan

fluorescence intensity fluorescence intensity

00 〇 t 00

o 〇 o o o o o 〇 o o

o o 〇 o

1 1 1 1 i o o 〇〇 o

g 61724 AntiNS4B775G AntiE2712 I--,-

ore

era Q

Z IQZ zuno/toozdr/Ud §の

(ini/Sd)人-匪 (T^ra/^Sd)人- il ooz 09T 001 OS ooe 002 001

Z o

HCV-RHA CV-RNA

ェ o

Zl£nO/tOOZd£/lDd eossro/sooz; OAV

πε丽 toozdf/ェ:) d C0S8Z0/S00i OAV