KR20060087574A

KR20060087574A - Ｃ형 간염 바이러스 유래 펩티드

Info

Publication number: KR20060087574A
Application number: KR1020067005679A
Authority: KR
Inventors: 교고 이토; 아키라 야마다; 미치오 사타
Original assignee: 가부시키가이샤 그린 펩티드
Priority date: 2003-09-22
Filing date: 2004-09-22
Publication date: 2006-08-02
Also published as: EP2267004A2; CN102659922B; EP1676856A1; CN1856503A; US20080063643A1; CN102659922A; CA2539789A1; JP4342597B2; KR20070050993A; EA200701870A1; EA009782B1; TW200513260A; EA200600639A1; JP4342519B2; EP2062590A1; EP1676856A4; JPWO2005028503A1; KR100818578B1; EP2267004A3; CN101230096B

Abstract

HLA 결합 모티프를 서열 중에 포함하고, 또한 C형 간염 바이러스 (HCV) 환자에게서 검출되는 항체에 의해 인식되는 것을 특징으로 하는 C형 간염 바이러스 유래 펩티드가 개시된다. 본 발명의 펩티드는 C형 간염 바이러스의 진단 및 C형 간염의 치료, 그리고 예후의 예측에 유용하다.

Description

Ｃ형 간염 바이러스 유래 펩티드{PEPTIDE ORIGINATING IN HEPATITIS C VIRUS}

본 발명은 C형 간염 바이러스 감염의 진단 및 C형 간염의 치료에 유용한, C형 간염 바이러스 (HCV) 펩티드에 관한 것이다.

또한 상세하게는, 본 발명은 HCV 펩티드, HCV 펩티드를 함유하는 폴리펩티드, HCV 펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 코드하는 뉴클레오티드, 또는 그들을 인식하는 항체 또는 항체 유사 활성 물질, 상기 뉴클레오티드를 함유하는 벡터, HCV 펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 사용하여 세포 상해성 T 세포를 유도하는 유도 방법, 또는 HCV 펩티드, 상기 폴리펩티드, 상기 뉴클레오티드 또는 상기 항체·항체 유사 활성 물질을 사용한 C형 간염 바이러스의 검출 방법, C형 간염의 진단, 예방 또는 치료 방법, 및 예후의 예측 방법, 그리고 그들을 함유하는 C형 간염 치료용 의약 조성물에 관한 것이다.

바이러스성 간염에는 주로 바이러스가 경구 감염되는 A 형 간염과 혈액을 통해 감염되는 B형 간염 외에, 주로 수혈 등에 의해 감염되는 C형 간염 등이 있다. 그 C형 간염은 만성화하여 간경변이나 간암으로 이행하는 비율이 매우 높은 질환의 하나이다.

C형 간염 바이러스 (HCV) 는 플라비바이러스과에 속하는 1본쇄 RNA 바이러스이며, 일본에 200만명 이상, 세계적으로는 1억 7000만명이나 C형 간염 바이러스 감염자가 있는 것으로 알려져 있다.

이 C형 간염에 대하여는 인터페론과 리바비린 병용 요법이 행해지고 있지만, 3∼4할의 환자에 대해서만 유효하고, 대부분의 환자에 대해서는 현재 유효한 치료법이 없는 실정이다. 따라서, 안전하고 유효하고 또한 간단하면서도, 낮은 비용의 진단 및 치료 툴을 긴급히 개발하는 것에 대한 강한 사회적 요청이 있다.

세포성 및 액성 면역 응답의 양자는 HCV 감염을 억제하는 데에 주요한 역할을 하고 있음을 나타내는 증거가 있다 (WO89/04669). 과거 10여년에 걸쳐 높은 면역원성의 HCV 펩티드를 찾아내는 연구가 수없이 행해져, 세포성 또는 액성 면역 응답을 유도할 수 있는 수많은 HCV 펩티드가 발견되어 왔다 (Hunziker et al., Mol Immunol. 2001 Dec; 38(6): 475-84). 그러나, 이들 펩티드는 모두 임상적으로 유효하지 않고, 그 결과, 현재에도 예방적으로나 치료적으로나 유효한 면역 치료의 수단이 없는 실정이다. 이는 주로 이들 펩티드의 면역원성이 약하기 때문인 것으로 생각된다.

또한, 본 발명자들은 몇몇 세포 상해성 T 림프구 (CTL) 에 의해 인식되는 항원 펩티드가, 인 비트로(in vitro)에서나 인 비보(in vivo)에서도 세포성 면역 응답 및 액성 면역 응답의 양방을 도출하는 능력을 갖고 있다는 것을 이미 보고하였다 (Gohara et al., J Immunother. 2002 Sep-Oct; 25(5): 439-44, Mine et al., Clin Cancer Res. 2001 Dec; 7(12): 3950-62, Tanaka et al, J Immunother. 2003 Jul-Aug; 26(4): 357-66, Mine et al., Cancer Sci. 2003 Jun; 94(6): 548-56).

또한, 세포성 및 액성 면역 응답의 양자에 의해서 인식되는 HCV 펩티드는 세포성 면역 응답에 의해서만 인식되는 것보다 면역원성이 높다고 생각된다.

이러한 사회적 요청에 부응하기 위한 하나의 새로운 시도로서, 세포성 면역 응답 및 액성 면역 응답의 양자를 유도할 수 있는 HCV 펩티드가, 액성 면역 응답만을 갖는 펩티드에 비하여, 보다 더 높은 면역원성을 갖고 있다는 일련의 지견이 축적되고 있으므로, 이러한 펩티드를 특정한다는 시도를 들 수 있다.

그래서, 이러한 펩티드를 동정함과 함께, HCV 감염을 억제하기 위한 신규 치료 및 진단 툴로서의 후보가 될지의 여부를 조사하는 일은 유익하다고 생각된다.

따라서, 본 발명자들은 HLA-A2 및 HLA-A24 구속성 세포 상해성 T 림프구 (CTL) 에 의해서 인식되는 펩티드와 반응성을 갖는 IgG 를 HCV 감염 환자의 혈청 중으로부터 검출할 수 있는지 여부를 조사한 결과, 몇몇 CTL 에피토프에 특이적인 IgG 가, 상이한 HLA 클래스 I 타입이나 상이한 HCV 게노 타입(geno type)에는 관계없이, HCV 감염 환자의 대다수에게서 검출되는 것을 알아내었다. 또한, 이 결과로부터, 이러한 펩티드가, 펩티드를 베이스로 하는 예방 및 치료용의 새로운 툴을 제공할 수 있음을 알아내어 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서, 본 발명은 세포성 면역 응답 및 액성 면역 응답에 의해서 인식되고, 또한 면역원성이 높은 것을 특징으로 하는 HCV 펩티드를 제공하는 것을 목적으로 한다.

발명의 개시

상기 과제를 해결하기 위해서, 본 발명은 HLA 결합 모티프를 서열 중에 포함하고, 또한 C형 간염 바이러스 감염 환자의 혈중 항체에 의해 인식되는 C형 간염 바이러스 유래 펩티드를 제공한다.

본 발명은 그 바람직한 양태로서, 서열표의 서열 번호 1∼8, 16, 20 및 38 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 C형 간염 바이러스 유래 펩티드, 그 펩티드의 아미노산 서열과 적어도 70% 의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 C형 간염 바이러스 유래 펩티드, 및 HLA-A2 또는 HLA-A24 구속성 세포 상해성 T 세포에 의한 인식성을 추가로 갖는 C형 간염 바이러스 유래 펩티드를 제공한다.

본 발명의 다른 형태는 그 C형 간염 바이러스 유래 펩티드를 함유하는 폴리펩티드를 제공한다. 이 형태의 발명은 그 바람직한 양태로서, 그 폴리펩티드의 아미노산 서열과 적어도 70% 의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 및 HLA-A2 또는 HLA-A24 구속성 세포 상해성 T 세포에 의한 인식성을 추가로 갖는 폴리펩티드를 제공한다.

또한, 본 발명의 별도의 형태는 그 C형 간염 바이러스 유래 펩티드 또는 그 폴리펩티드를 코드하는 뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명의 또 다른 형태는 그 C형 간염 바이러스 유래 펩티드 또는 그 폴리펩티드를 면역학적으로 인식할 수 있는 항체 및 항체 유사 활성 물질을 제공한다.

본 발명은 또 다른 형태로서, 상기 뉴클레오티드를 함유하는 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명의 또 다른 형태는 그 C형 간염 바이러스 유래 펩티드, 그 폴리펩티드를 코드하는 그 뉴클레오티드를 사용하여 세포 상해성 T 세포를 유도하는 유도 방법을 제공한다.

본 발명은 또 다른 형태로서, 상기 C형 간염 바이러스 유래 펩티드, 폴리펩티드, 뉴클레오티드, 또는 항체 또는 항체 유사 활성 물질을 사용하는, C형 간염 바이러스의 검출 방법을 제공한다.

또한, 본 발명의 다른 형태는 상기 C형 간염 바이러스 유래 펩티드, 폴리펩티드, 뉴클레오티드, 또는 항체 또는 항체 유사 활성 물질을 사용하는, C형 간염 등과 같은 HCV 감염 관련 질환의 진단 방법을 제공한다.

또한, 다른 형태로서, 본 발명은 상기 C형 간염 바이러스 유래 펩티드, 폴리펩티드, 뉴클레오티드, 또는 항체 또는 항체 유사 활성 물질을 사용하는, C형 간염 등과 같은 HCV 감염 관련 질환의 치료 방법을 제공한다.

본 발명은 또 다른 형태로서, 상기 C형 간염 바이러스 유래 펩티드, 폴리펩티드, 뉴클레오티드, 또는 항체 또는 항체 유사 활성 물질을 유효 성분으로서 함유하는 의약 조성물을 제공한다. 또한, 그 바람직한 양태로서, 그 의약 조성물이 C형 간염 바이러스 백신인 의약 조성물이 제공된다.

또한, 다른 형태로서, 본 발명은 상기 C형 간염 바이러스 유래 펩티드, 폴리펩티드, 뉴클레오티드, 또는 항체 또는 항체 유사 활성 물질을 사용하는, C형 간염 등과 같은 HCV 감염 관련 질환의 예후의 예측 방법을 제공한다.

본 발명은 또 다른 형태로서, 상기 C형 간염 바이러스 유래 펩티드, 폴리펩티드, 뉴클레오티드, 또는 항체 또는 항체 유사 활성 물질을 함유하는, C형 간염을 진단 또는 예후를 예측하기 위한 키트가 제공된다.

도 1 은 본 발명에 있어서, ELISA 법에 의한 HCV 감염 환자의 혈중 IgG 측정 결과를 나타내는 그래프이다.

도 2 는 본 발명에 있어서, ELISA 법에 의한 HCV 감염 환자의 혈중 IgG 측정 결과를 나타내는 그래프이다.

도 3 은 본 발명에 있어서, 도 1 에 나타낸 환자 혈청 중의 C-35 펩티드 반응성 항체의 대표예의 흡수·용출 실험 결과를 나타내는 그래프이다.

도 4 는 본 발명에 있어서의 HCV 유래의 HLA-A24 결합 펩티드 6종 (No 3, 12, 13, 25, 32, 38) 의 CTL 유도 결과를 나타내는 그래프이다.

도 5 는 본 발명에 있어서의 HCV 유래의 HLA-A2 결합성 펩티드 (No 40∼No 57) 의 CTL 유도 결과를 나타내는 그래프이다.

도 6 은 본 발명에 있어서, ⁵¹Cr 유리 시험에 의한 펩티드 자극 PBMC 의 세포 상해 활성의 대표적 결과를 나타내는 그래프이다.

도 7 은 본 발명에 있어서, ⁵¹Cr 유리 시험에 의한 펩티드 자극 PBMC 의 세포 상해 활성의 대표적 결과를 나타내는 그래프이다.

도 8 은 본 발명에 있어서, 항 CD8 모노클로날 항체를 사용한 억제 시험에 의한 펩티드 자극 PBMC 의 세포 상해성의 HLA 클래스 I 구속성을 확인한 그래프이 다.

도 9 는 HCV 감염 환자 혈청에 있어서의 항 펩티드 IgG 의 검출을 나타내는 그래프이다.

도 10 은 HCV 감염 환자 혈청에 있어서의 항 펩티드 IgG 의 검출을 나타내는 그래프이다.

도 11 은 HCV 감염 환자 혈청 중의 항 펩티드 IgG 의 특이성을 조사하는 흡착시험의 결과를 나타내는 그래프이다.

도 12 는 HCV 감염 환자 혈청 중의 항 펩티드 IgG 의 특이성을 조사하는 용출 시험의 결과를 나타내는 그래프이다.

도 13 은 펩티드 자극 PBMC 에 의한 IFN-γ 생성을 나타내는 그래프이다.

도 14 는 펩티드 자극 PBMC 에 의한 IFN-γ 생성을 나타내는 그래프이다.

도 15 는 펩티드 자극 PBMC 의 세포 상해성을 나타내는 그래프이다.

도 16 은 펩티드 자극 PBMC 의 세포 상해성을 나타내는 그래프이다.

도 17 은 NS5A 를 발현하는 세포에 대한 펩티드 자극 PBMC 의 CTL 활성을 나타내는 그래프이다.

도 18 은 NS5A 를 발현하는 세포에 대한 펩티드 자극 PBMC 의 CTL 활성을 나타내는 그래프이다.

도 19 는 NS5A 를 발현하는 세포에 대한 펩티드 자극 PBMC 의 CTL 활성을 나타내는 그래프이다.

도 20 은 항 NS5A-2132 IgG 활성의 특이성을 나타내는 그래프이다.

도 21 은 항 NS5A-2132 IgG 에 의한 세포 증식 저해의 분석 결과를 나타내는 그래프이다.

도 22 는 항 NS5A-2132 IgG 의 ADCC 활성의 분석 결과를 나타내는 그래프이다.

도 23 은 여러 질환에 있어서의 항 C-35 항체 및 항 NS5A-2132 항체의 검출을 나타내는 그래프이다.

도 24 는 항 펩티드 항체의 HLA 또는 HCV 게노타입 구속성을 나타내는 그래프이다.

도 25 는 항 펩티드 항체의 HLA 또는 HCV 게노타입 구속성을 나타내는 그래프이다.

도 26 은 환자 혈청에 있어서의 항 NS5A-2132 항체의 측정 결과를 나타내는 그래프이다.

도 27 은 환자 혈청에 있어서의 항 NS5A-2132 IgG 의 측정 결과를 나타내는 그래프이다.

도 28 은 환자 혈청에 있어서의 항 NS5A 항체의 레벨 및 HCV RNA 레벨을 나타내는 그래프이다.

도 29 는 코호트 연구에 있어서의 항 C-35 항체 및 항 NS5A-2132 항체의 검출을 나타내는 그래프이다.

도 30 은 코호트 연구에 있어서의 항 NS5A-2132 항체의 검출을 나타내는 그래프트이다.

도 31 은 본 발명에 있어서, 루미넥스법에 의한 HCV 감염 환자의 혈중 IgG 측정 결과를 나타내는 그래프이다.

도 32 는 본 발명에 있어서, 루미넥스법에 의한 HCV 감염 환자의 혈중 IgG 측정 결과를 나타내는 그래프이다.

도 33 은 본 발명의 펩티드를 사용하는 C형 간염의 치료 경과를 나타낸다.

도 34 는 본 발명의 펩티드를 사용하는 C형 간염의 치료 경과를 나타낸다.

발명의 상세한 설명

본 발명에 관련되는 C형 간염 바이러스 유래 펩티드는 HLA 결합 모티프를 서열 중에 포함하고, 또한 C형 간염 바이러스 감염 환자의 혈중 항체에 의해 인식되는 HCV 펩티드이다.

또한, 본 발명에 관련되는 HCV 펩티드는 HLA 결합 모티프, 요컨대 HLA-A2 또는 HLA-A24 결합 모티프를 그 서열 중에 함유하고 있다. 또한, 이 HCV 펩티드는 세포성 면역 응답 및 액성 면역 응답에 의해서 인식됨과 함께, 면역원성이 높은 것을 특징으로 하고 있다.

이러한 HCV 펩티드로서는 예를 들어, 하기 표 1 및 표 3 에 기재된 펩티드가 포함된다. 본 발명에 있어서 특히 바람직한 HCV 펩티드의 하나는 이하의 아미노산 서열을 갖는 HLA-A2 결합성 모티프를 갖는 펩티드:

C-35: YLLPRRGPRL (서열 번호 1)

이다. HCV 감염 환자에 있어서는 이 펩티드에 대한 펩티드 반응성 IgG 항체의 검출률 및 HCV 감염증 특이성이, 각각 93% 와 100% 로 매우 높다. 또한 본 발 명에 있어서 특히 바람직한 별도의 HCV 펩티드는 이하의 아미노산 서열을 갖는 HLA-A24 결합성 모티프를 갖는 펩티드:

NS5A-2132: RYAPACKPL (서열 번호 2)

E2-488: HYAPRPCGI (서열 번호 3)

E1-213: VYEAADMIM (서열 번호 4)

NS3-1081: VYHGAGSKTL (서열 번호 5)

C-176: IFLLALLSCL (서열 번호 6)

C-173: SFSIFLLALL (서열 번호 7)

EYVLLLFLL (서열 번호 8)

PYIEQGMQL (서열 번호 16)

IFTITKILL (서열 번호 20)

SFAIKWEYVL (서열 번호 38)

이다. 특히, NS5A-2132 는 HLA-A24 양성의 많은 환자에게 있어서, 세포성 면역 및 액성 면역의 양방을 유도할 수 있다.

본 발명에 관련되는 HCV 펩티드는 그 펩티드의 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 갖는 펩티드이어도 된다.

또한, 본 발명에 관련되는 HCV 펩티드는 HLA-A2 또는 HLA-A24 구속성 세포 상해성 T 세포 (CTL) 에 의한 인식성을 갖는 펩티드를 추가로 함유하고 있어도 된다. 세포 내에서 제조된 항원 단백이 세포 내에서 분해된 펩티드로 이루어지 는, 이 HLA 에 결합가능한 항원 펩티드에는 HLA 의 타입마다 그 서열에 모티프가 있어, 세포 상해성 T 세포 (CTL) 는 이 항원 펩티드와 HLA 의 복합체를 인식하여 HCV 감염 세포를 상해한다.

본 발명에 관련되는 폴리펩티드는 상기한 바와 같은 본 발명의 펩티드의 아미노산 서열을 그 아미노산 서열 중에 함유하고 있고, 그 아미노산의 총수는 특별히 한정되지 않는다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드에 있어서, 이 펩티드를 구성하는 아미노산을 초과하는 나머지의 아미노산은 그 펩티드의 아미노산의 N-말단측 및/또는 C-말단측에, 또는 그들의 양측에 위치하고 있다. 따라서, 이 폴리펩티드는 상기 펩티드의 기능 및 작용과 실질적으로 동일한 기능과 작용을 갖고 있다. 또, 본 명세서에 있어서, 단지 「펩티드」 라고 기재한 경우라도, 특별한 언급이 없는 경우에는 「폴리펩티드」 도 포함되는 것으로 한다.

상기한 바와 같이 하여 결정된 아미노산 서열을 갖는 펩티드는 통상의 화학적 합성법, 단백 분자의 효소적 분해법, 원하는 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열을 발현하도록 형질 전환한 숙주를 사용한 유전자 재조합 기술 등에 의해 얻을 수 있다.

목적으로 하는 그 펩티드를 화학적 합성법으로 제조하는 경우에는 통상의 펩티드 화학에 있어서 그 자체 공지된 관용되어 있는 수법에 의해서 제조할 수 있고, 예를 들어 펩티드 합성기를 사용하여, 고상 합성법에 의해 합성할 수 있다. 이렇게 하여 얻어진 조펩티드는 단백질 화학에 있어서 통상 사용되는 정제 방법, 예를 들어, 염석법, 한외 여과법, 역상 크로마토그래피법, 이온 교환 크로마토그래피 법, 어피니티 크로마토그래피법 등에 의해서 정제할 수 있다.

한편, 원하는 그 펩티드를 유전자 재조합 기술로 생산하는 경우에는 예를 들어, 상기에 의해 합성한 목적하는 아미노산 서열을 코드하는 DNA 단편을 적당한 발현 벡터에 삽입하고, 이 발현 벡터를 사용하여 미생물이나 동물 세포를 형질 전환하고, 얻어진 형질 전환체를 배양함으로써, 원하는 그 펩티드를 얻을 수 있다. 사용할 수 있는 발현 벡터로서는 당해 기술분야에서 공지인 플라스미드, 바이러스벡터 등을 사용할 수 있다.

이 펩티드 생산 기술에 있어서의 발현 벡터를 사용한 숙주 세포의 형질 전환 방법으로서는 그 자체 공지된 방법, 예를 들어, 염화칼슘법, 인산칼슘 공침전법, DEAE 덱스트란법, 리포펙틴법, 전기 천공법 등을 이용할 수 있고, 사용하는 숙주 세포에 기초하여 적절히 선택하는 것이 좋다. 얻어진 펩티드는 배양한 배지로부터 회수한 세포 추출액 또는 배양 상청으로부터 상기 정제법에 의해 정제할 수 있다.

본 발명의 다른 형태의 하나로서의 뉴클레오티드는 상기 C형 간염 바이러스 유래 펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 함유하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하고 있고, 리보뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드를 포함하고 있다. 또한, 그 뉴클레오티드는 당해 분야에서 기지의 방법에 의해서 개변되어 있어도 된다. 그 뉴클레오티드의 개변에는 예를 들어, 공지된 표지, 메틸화, 「caps」, 아날로그에 의한 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 치환, 뉴클레오티드내 개변 등이 포함된다. 뉴클레오티드내 개변에는 예를 들어, 비이온성 개변 (예 를 들어, 메틸인산, 인산트리에스테르, 포스포아미데이트 등), 이온성 개변 (예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등), 예를 들어 단백질 (예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그널 펩티드 등) 과 같은 펜단트 부분을 포함하는 개변, 킬레이트제 (예를 들어, 금속, 붕소 등) 에 의한 개변 등을 들 수 있다.

상기 뉴클레오티드 서열은 HCV 의 게놈 중에 코드되어 있는 HCV 항원의 펩티드 및 폴리펩티드 서열을 제공하는 것을 가능하게 하고, 또한 진단 시험이나 백신의 성분으로서, 유용한 펩티드를 제공할 수 있다.

본 발명의 뉴클레오티드가 얻어지면, HCV 감염 관련 질환을 진단하는 데에 유용한, 또는 혈액 중 또는 혈액 제제 중의 HCV 감염을 스크리닝하는 데에 유용한 뉴클레오티드 프로브 및 펩티드의 구축이 가능해진다. 이 뉴클레오티드 서열로부터, 예를 들어 24개 내지 30개의 뉴클레오티드 또는 그보다 긴 DNA 올리고머를 합성할 수 있다. 이 뉴클레오티드는 피험자의 혈청 중의 HCV RNA 를 검출하기 위한, 또한 혈액 또는 혈액 제제 중의 HCV 의 존재를 스크리닝하기 위한 프로브로서도 사용할 수 있다.

또한, 이 뉴클레오티드 서열은 HCV 에 대한 항체의 존재를 진단하는 시약으로서도 유용한 HCV 특이적 펩티드의 설계 및 생산을 가능하게 한다. 또한, 이 서열에 유래하는 정제 펩티드에 대한 항체는 HCV 감염자 및 HCV 감염 혈액 제제 중의 HCV 항원을 검출하기 위해서도 사용할 수 있다.

본 발명의 별도의 형태의 하나로서의 항체는 그 C형 간염 바이러스 유래 펩티드, 그 폴리펩티드에 반응성을 갖는 키메라 항체, 개변 항체, 1가 항체, Fab, F(ab')₂, Fab', 단일쇄 Fv (scFv) 단백질 및 단일 도메인 항체가 포함된다. 또한, 이 항체는 그 펩티드 또는 그 폴리펩티드를 면역학적으로 인식할 수 있다.

본 발명의 별도의 형태의 하나로서의 벡터는 그 뉴클레오티드를 함유하고 있어, 선택된 숙주 세포를 형질 전환할 수 있는 구축물이며, 그 숙주 중에서 이종의 코드 서열을 발현시킬 수 있다. 이 발현 벡터는 클로닝 벡터 또는 삽입용 벡터 중 어느 것이나 된다.

클로닝 벡터로서는 예를 들어, 플라스미드, 바이러스 (예를 들어, 아데노 바이러스 벡터) 등이 사용된다. 또한 그 클로닝 벡터는 숙주 세포를 형질 전환할 수 있고, 또한, 세포 내에서 뉴클레오티드를 복제할 수 있는 능력을 갖고 있는 레플리콘 (예를 들어, 플라스미드, 크로모솜, 바이러스, 코스미드 등) 이다.

한편, 삽입용 벡터는 숙주 세포 속에서는 레플리콘으로서는 기능하지 않지만, 숙주를 안정적으로 형질 전환하기 위해서, 숙주 중의 레플리콘 (전형적으로는 크로모솜) 에 주류물(駐留物)을 삽입하는 능력을 갖는 벡터이다.

본 발명의 별도의 형태의 하나로서, 그 펩티드를 사용함으로써 HCV 세포를 표적으로 하는 세포 상해성 T 세포를 유도하는 유도 방법이 포함된다. 본 발명의 유도 방법은 예를 들어, HLA-A2 를 발현하고 있는 세포에 그 펩티드를 첨가하여 HLA-A2 상에 제시시키고, 이 펩티드를 HLA-A2 에 의해 제시한 세포로 T 세포를 자극하고, 이 T 세포를 CTL 에 유도하는 것으로 이루어져 있는 것이 바람직하다. 이 방법에 있어서 사용하는 HLA-A2 발현 세포는 HCV 환자의 혈액으로부터 채취한 것이어도 되지만, 비 FHLA-A2 발현 세포에 HLA-A2 를 코드하는 유전자를 도입하여 제작할 수도 있다. 따라서, 본 발명에 관련되는 그 펩티드는 HCV 의 검출 및 진단을 위해 사용할 수 있을 뿐만 아니라, C형 간염 바이러스 관련 질환의 백신 등의 의약 조성물로서도 유용하다.

또한, 이렇게 하여 유도된 CTL 은 HCV 감염 세포를 표적으로 하여 그 HCV 감염 세포를 공격하므로, 그 펩티드와 마찬가지로, 세포 요법 등의 의약 조성물로서도 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 형태인 그 C형 간염 바이러스 유래 펩티드, 폴리펩티드, 뉴클레오티드 및/또는 항체·항체 유사 활성 물질은 HCV 감염을 검출·진단하는 데에 유용하다.

HCV 의 검출 및 HCV 관련 질환의 진단은 예를 들어, 그 펩티드를 코드하는 핵산 서열과의 상호 작용 및/또는 반응성을 이용하여, 그 펩티드의 존재의 검출, 상응하는 핵산 서열 존재량의 검출, 그 펩티드의 개체 중에서의 생체 분포의 결정 및/또는 개체 유래의 검체 중의 존재량의 결정 등에 의해서 행할 수 있다. 요컨대, HCV 의 검출 및 HCV 관련 질환의 진단은 그 펩티드를 마커로 하여 검정함으로써 행할 수 있다. 또한, 그 측정은 그 자체 공지된 측정 수법으로 행할 수 있고, 이러한 측정 방법으로서는 예를 들어, 항원 항체 반응계, 효소 반응계, PCR 반응계 등을 이용한 방법을 들 수 있다.

HCV 관련 질환의 치료 효과의 확인 및 예후의 예측은 HCV 관련 질환에 걸린 피험자에 있어서, 그 펩티드에 대한 반응성을 갖는 항체의 혈중 농도를 모니터함으 로써 행할 수 있다. 특히 바람직하게는 피험자의 혈중의 항 C-35 IgG 또는 항 NS5A-2132 IgG 의 레벨을 측정한다.

본 발명의 또 다른 형태인 의약 조성물로서는 예를 들어, 백신을 들 수 있다. 백신은 C형 간염 바이러스 유래 펩티드, 폴리펩티드 및/또는 뉴클레오티드로 이루어져 있고, 의약적으로 허용되는 보조제 및/또는 담체를 적절히 함유하고 있어도 된다. 보조제로서는 면역 응답을 강화할 수 있는 아주반트, 예를 들어 프로인트의 불완전 아주반트, 수산화알루미늄 겔 등을 사용할 수 있다. 또한, 담체로서는 예를 들어, PBS, 증류수 등의 희석제, 생리 식염수 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 의약 조성물은 그 사용 형태에 따라, 예를 들어, 경구, 정맥 투여나 피하 투여 등의 비경구 또는 경피 경로로 투여할 수 있다. 그 제형으로서는 예를 들어, 정제, 과립제, 소프트 캡슐제, 하드 캡슐제, 액제, 유제, 유화제 등을 들 수 있다. 이러한 의약 조성물의 투여량은 투여하는 환자의 증상 등에 따라, 적절히 변동할 수 있지만, 일반적으로는 성인에 대하여 1일당, 그 펩티드량으로서 0.1∼10mg 인 것이 바람직하고, 투여 간격으로서는 수일 또는 수개월에 1회 투여하는 것이 바람직하다.

본 명세서에 있어서 명시적으로 인용되는 모든 특허 및 참고 문헌의 내용은 모두 본 명세서의 일부로서 여기에 인용한다. 또한, 본 출원이 갖는 우선권 주장의 기초가 되는 출원인 일본 특허출원 2003-330258호의 명세서 및 도면에 기재된 내용은 모두 본 명세서의 일부로서 여기에 인용한다.

본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다. 단, 이들의 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위해서 예시적으로 나타낸 것으로, 본 발명이 이하의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

또, 이하의 실시예에서 사용한 아미노산의 약어는 다음과 같다.

A 는 알라닌, C 는 시스테인, D 는 아스파르트산, E 는 글루타민산, F 는 페닐알라닌, G 는 글리신, H 는 히스티딘, I 는 이소류신, K 는 리신, L 은 류신, M 은 메티오닌, P 는 프롤린, R 은 알기닌, S 는 세린, T 는 트레오닌, V 는 발린, Y 는 티로신을 각각 의미한다.

실시예 1: HCV 감염 환자의 혈청에 있어서의 HCV 펩티드와 반응성을 갖는 IgG 의 검출

펩티드

HCV 게노타입 1b 단백질의 보존 영역으로부터의 HLA-A2 결합성 모티프 또는 HLA-A24 결합성 모티프를 갖는 합성 펩티드를 사용하였다 (표 1). 음성 대조로서 HLA-A2 결합성 모티프를 갖는 HIV 유래 펩티드를 사용하였다. 이들의 펩티드는 모두 시판품을 사용하고, 그 순도는 역상 고압 액체 크로마토그래피로 분석한 바 90% 이상이었다.

컷오프치는 1.83 이다.

	No.	40
		양성률
HCV 감염증 관련 질환	60	56(93.3%)
B형 간염 바이러스 감염자	24	0 (0%)
B형 간염 바이러스 백신 접종자	10	0 (0%)
건강인	27	0 (0%)
자기 면역 질환 환자	22	0 (0%)
HTLV-1 감염자	10	8 (80%)
HIV 감염자	3	3 (100%)
총수	156	67

		C-35
감수성		93.3%
감수성		88.5%
OD율
		P＜0.001

검출률을, 컷오프치에서 양성인 환자의 수로 산출하였다 (평균±3SD).

NS5A-2132 은 0.202 이고, C-35 는 0.13 이다.

통계 해석을, χ² 시험으로 행하였다.

ELISA

혈청 중의 펩티드 특이적 IgG 는 ELISA 에 의해서 측정하였다. 우선, 각 펩티드를 디메틸술폭사이드 (DMSO) 에 용해하여, -80℃ 에서 보존하였다. 펩티드를, 크로스 링커로서의 디숙신이미딜수베레이트 (DSS) 를 함유하는 0.1M 탄산나트륨/탄산수소나트륨 용액으로 희석하였다. ELISA 플레이트에 펩티드 20μg/웰로 4℃ 에서 하룻밤 반응시켜 결합시켰다. 웰을 0.05% Tween20-PBS (PBST) 로 3회 세정하고, 플레이트를 블록 에이스 (등록 상표) 로 블록하여 4℃ 에서 하룻밤 방치하였다. 혈장 또는 혈청 샘플을 0.05% Tween20-Block Ace 로 100배, 200배 및 400배로 각각 희석하고, 얻어진 샘플을 각 웰당 100μl 씩 첨가하였다. 샘플을 37℃ 에서 2시간 배양한 후, 플레이트를 PBST 로 9회 세정하고, 1000배 희석한 토끼 항 인간 IgG (γ쇄 특이적) 룰 각 웰당 100μl 첨가하여 37℃ 에서 2시간 배양하였다. 또한, PBST 로 9회 세정한 후, 100배 희석한 마우스 항 토끼 IgG 와 공유 결합시킨 서양 고추냉이 퍼옥시다제·덱스트란 폴리머를 각 웰당 100μl 첨가하여, 플레이트를 실온에서 40분간 배양하였다. 플레이트를 세정한 후, 테트라메틸벤지딘 기질 용액을 각 웰당 100μl 첨가하고, 2.0M 인산을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 컷오프치를, 건강인의 광밀도 컨트롤의 평균 ±3SD 로서 산출하였다.

펩티드 특이적 IgG 의 흡수 및 용출

각 웰당 100μl 의 혈장 또는 혈청 샘플을 0.05% Tween20-Block Ace (등록상표) 로 희석하고, 플레이트의 웰 중에 고정된 펩티드 (각 웰당 20μg) 에 37℃ 에서 2시간 흡수시켰다. 이 조작을 3회 반복한 후, 상청 중의 펩티드 특이적 IgG 레벨을 ELISA 로 측정하였다. 초회의 흡착으로 펩티드 고정 플레이트에 결합시킨 항체를, 각 웰당 30μl 의 5M NaCl/50mM 시트르산버퍼 (pH3.0) (1.0M Tris-HCl 의 0.05% Tween20-Block Ace (pH7.5) 로 중화하였다) 에 의해서 용출시키고, 용출된 분획 중의 펩티드 특이적 IgG 레벨을 ELISA 로 측정하였다.

펩티드 특이적 CTL 분석

펩티드 특이적 CTL 의 검출에 사용하는 방법은 당해 기술분야에서 관용되고 있는 방법이다. PBMC 를 웰당 1×10⁵개의 세포가 되도록 U 밑바닥형 96웰 마이크로 컬처 플레이트의 각 웰에 넣고, 10μM 의 펩티드와 함께 200μl 의 배지 중에서 배양하였다. 이 배지의 조성은 45% RPMI-1640 과, 45% AIM-V (등록상표) 와, 10% 소 태아 혈청 (FCS) 과, 100U/ml 의 인터류신 2 (IL-2) 와, 1mM MEM 비필수 아미노산 용액으로 이루어져 있다. 배양 3일째, 6일째, 그리고 9일째에 각각 배지 절반을 제외하고, 대응하는 펩티드 (20μg/ml) 를 포함한 새로운 배지와 교체하였다. 배양 12일째에, 배양한 세포를 채취하여, 대응하는 펩티드 또는 음성 대조로서의 HIV 펩티드 중 어느 하나를 미리 부착시킨 CIR-A2402 세포 또는 T2 에 응답하는 인터페론 감마 (IFN-γ) 의 생성능을 시험하였다. 각 펩티드에 대하여 4개의 웰을 사용하고, 분석은 2회 행하였다. HIV 펩티드에 응답하는 백그라운드 IFN-γ 생성은 얻어진 데이터치에서 빼었다. 억제 분석에는 펩티드 반응성 CTL 은 CD8 단리 키트를 사용하여 정제하고, 그 펩티드 특이적 IFN-γ 생성을, 20μg/ml 의 항 HLA 클래스 I (W6/32, IgG2a) 모노클로날 항체, 항 CD8 (Nu-Ts/c, IgG2a) 모노클로날 항체 또는 항 HLA 클래스 II (H-DR-1, IgG2a) 모노클로날 항체 중 어느 하나의 존재 하에서 측정하였다. 백그라운드 IFN-γ 생성은 얻어진 데이터치로부터 공제하였다.

통계

수치는 평균+/-SD 로서 나타내고 있다. 통계적 분석은 맨·위트니 U 검정 (Mann-Whitney U) 시험 및 카이제곱 시험을 이용하여 행하였다. P<0.05치는 통계학적으로 유의하다고 생각된다.

HCV 펩티드에 대한 항체의 검출

HCV 감염 환자 12명과 건강인 (HD) 10명의 혈청에 관해서 62종의 각 펩티드에 대하여 반응하는 IgG 레벨을 측정하였다 (표 1). 각 펩티드에 대한 항체의 양성률을 표 1 에 나타냈다. 그 결과, HCV 감염 환자의 혈중 IgG 와 고율로 반응하고, 또한 건강인 혈청과는 거의 반응하지 않는 펩티드가 복수 발견되었다.

예를 들어, No 3 의 NS5A-2132 (HCV 의 NS5A 단백의 2132번부터 2140번에 상당, 이하 동일하게 생략), No 11 (NS3-1266), No 12 (E2-488), No 13 (E1-213), No 22 (NS2-947), No 25 (NS3-1081), No 32 (C-176), No 38 (C-173), No 40 (C-35), No 62 (NS5B-2990) 등을 들 수 있다. 대표적인 ELISA 법에 의한 HCV 감염 환자의 혈중 IgG 측정 결과를 도 1 및 도 2 에 나타낸다.

도 1 에 나타낸 환자 혈청에서는 C-35 에 대한 IgG 항체가 검출되었다.

도 2 의 (A)-(D) 에 나타낸 4명의 환자 혈청 중에는 각각 NS5A-2132 (A), NS3-1081 (B), E2-488 및 E1-213 (C), C-176 및 C-173 (D) 반응성 IgG 항체가 검출되었다 이들의 펩티드 반응성 항체의 펩티드 특이성은 흡수 및 용출 시험에 의해서 확인하였다.

도 1 에 나타낸 환자 혈청 중의 C-35 펩티드 반응성 항체의 흡수·용출 실험 결과를 대표예로서 도 3 에 나타낸다. 이 항체는 C-35 에 의해 흡수되었지만, 무관계한 펩티드인 NS5A-2252 에 의해서는 흡수되지 않았다 (도 3 상단). 또한 이 항체는 C-35 흡착 획분으로부터 용출되었다 (도 3 하단).

표 1 중에서도 C-35 펩티드 반응성 항체는 HCV 감염자에서는 100%, 한편, 건강인에서는 0% 로, HCV 특이성이 높았다. HCV 의 C-35 펩티드의 서열은 여러 바이러스, 예를 들어 HIV-1 의 tet 단백 (54-58번의 아미노산 서열) 이나 env 단백 (5-9, 158-162, 717-727 의 아미노산 서열) 과 부분적으로 상동성을 나타냈다. 또한, HTLV-I 의 여러 단백 (pol 724-755, rex 5-9, rex 310-313, tax 70-74 등) 과도 상동성을 나타냈다. 그래서, C-35 펩티드 반응성 항체를 HCV 감염증 관련 질환 60예 (만성 C형 간염 22예, 간경변 20예, 간암 18예), B형 간염 바이러스 감염자 24예, B형 간염 바이러스 백신 접종자 10예, 건강인 27예, 자기 면역 질환 환자 22예, HTLV-I 감염자 10예, 및 HIV 감염자 3예, 계 156예에 관해서 2중 맹검법으로 조사하였다. 그 결과를 표 2 에 나타낸다. 이 결과에서, C-35 펩티드 반응성 항체의 HCV 특이성 및 검출률은 각각 88.5% 및 93.3% 이었다.

펩티드 특이적 CTL 활성의 유발

HLA-A24 결합 펩티드 6종 (No 3, 12, 13, 25, 32, 38) 및 HLA-A2 결합 펩티드 18종 (No 40 부터 No 57 까지) 을 HLA-A24 또는 HLA-A2 양성의 HCV 감염 환자 각 5명의 말초혈 단핵구 (PBMC) 와 배양하였다. 컨트롤로서 그 PBMC 를 HIV 펩티드와 배양하였다. 그리고, 그들의 배양 PBMC 에 관해서, 대응하는 펩티드를 펄스한 C1R-A2402 세포 또는 T2 세포에 응답하는 IFN-γ 생성능을 조사하였다. 그 결과, HLA-A24 결합 펩티드 6종 (No 3, 12, 13, 25, 32, 38) 은 HLA-A24 양성 HCV 환자 10명의 PBMC 에서 CTL 을 유도할 수 있었다 (도 4). 또한, HLA-A24 결합성 펩티드에 의한 (B) HCV 유래의 HLA-A2 결합성 펩티드 (No 40 부터 No 57) 에 의한 HLA-A2 양성 HCV 환자 5명의 PBMC 에서 CTL 을 유도할 수 있었다 (도 5).

또한, 펩티드 자극 PBMC 의 세포 상해 활성은 ⁵¹Cr 유리 시험에 의해서 확인하였다. 그 대표적 결과를 도 6, 및 도 7 에 나타낸다.

도 6 은 HCV 유래의 HLA-A24 결합성 펩티드 (No 3, 12, 13, 25, 32, 38) 에 의해 HLA-A24 양성 HCV 환자 PBMC 에서 유도된 CTL 의 세포 상해 활성을 나타낸다. 유도 펩티드를 부착시킨 C1R-A2402 세포 (도면 중에서는 C1RA2402 로 표시) 에 대한 세포 상해 작용은 컨트롤의 HIV 펩티드를 부착시킨 C1R-A2402 세포 (도면 중에서는 C1RA2402HIV 와 표시) 에 비하여 유의하게 높았다.

도 7 은 HCV 유래의 HLA-A2 결합성 펩티드 (No 40, 41) 에 의해 HLA-A2 양성 HCV 환자 말초혈 PBMC 에서 유도된 CTL 의 세포 상해 활성을 나타낸다. 유도 펩티드를 부착시킨 T2 세포 (도면 중에서는 T2 로 표시) 에 대한 세포 상해 작용은 컨트롤의 HIV 펩티드를 부착시킨 T2 세포 (도면 중에서는 T2 HIV 로 표시) 에 비하여 유의하게 높았다.

그 결과, 이들 PBMC 는 대응하는 펩티드 (음성 대조로서의 HIV 펩티드 이외) 를 미리 장전한 C1R-A2402 및 T2 세포에 대하여 유의차 레벨의 세포 상해성을 나타냈다.

이 세포 상해성의 HLA 클래스 I 구속성은 항 CD8 모노클로날 항체를 사용한 억제 시험에 의해서 확인하였다 (도 8). 도 8 은 CTL 활성의 항 CD8 항체에 의한 억제의 대표예를 도시한다. HCV 유래의 HLA-A2 결합성 펩티드 (No 40) 에 의해 HLA-A2 양성 HCV 환자 PBMC 에서 유도된 CTL 의 세포 상해 활성은 항 CD8 항체에 의해 억제되었지만, 항 CD4 나 컨트롤의 항 CD14 항체에서는 억제되지 않았다.

실시예 2: HLA -A24 양성 HCV 감염 환자의 혈청에 있어서의 HCV 펩티드와 반응성을 갖는 IgG 의 검출

피험자

더욱 광범하게, HLA-A24 양성의 HCV 감염 환자에 있어서, HCV 펩티드와 반응성을 갖는 IgG 을 검출하였다. 60명의 HCV1b⁺ 환자는 제 2 세대 또는 제 3 세대 면역 분석 시험에 의해 판정하고, 항 HCV 항체 (Ab) 에 관해서 셀로포지티브이었다. 환자의 혈청 중의 HCV 의 게노타입은 RT-PCR 에 의해 판정하였다. 혈청 샘플링시의 환자의 진단은 생화학적 분석, 초음파 검사, 컴퓨터 연동 단층 촬영, 및 조직학적 소견에 의해 행하였다. 진단 결과는 이하와 같다: 만성 간염 (CH, n=24), 간경변 (LC, n=18), 및 간세포암 (HCC, n=18). 음성 대조로서는 정상인 간기능을 갖고, 간염 바이러스의 병력을 갖지 않은 20명의 건강한 도너 (HD) 로부터의 혈청 샘플을 사용하였다.

펩티드 및 펩티드 반응성 항체의 측정

HCV1b 단백질이 잘 보존된 영역에 유래하고, HLA-A24 분자와의 높은 결합 스코어 (Bioinformatics and Molecular Analysis Section, NIH, Bethesda, MD) 에 기초하여 선택된 44종의 합성 펩티드를 사용하였다. 음성 대조로서는 HLA-A24 결합 모티프를 갖는 HIV 유래 펩티드 (RYLRDQQLLGI (서열 번호 63)) 를 사용하였다. 결합 스코어 및 서열을 표 3 에 나타낸다. 혈청 IgG 에 대한 펩티드의 반응성에 관한 스크리닝용으로는 BioSyntehsis (Lewisville, TX) 또는 SynPep (Dublin, CA) 로부터 이들의 탈염 등급 (>70%) 펩티드를 구입하였다. 그 후의 실험에는 정제한 펩티드 (>90%) 를 사용하였다. 펩티드 특이적 IgG 의 혈장 레벨은 효소 항체법 (ELISA) 에 의해 측정하였다. 혈장 샘플에 있어서의 항 펩티드 IgG 의 특이성 시험은 펩티드 반응성 IgG 의 흡수 및 용출에 의해 행하였다.

펩티드 특이적 CTL 의 분석

펩티드 특이적 CTL 전구체 세포의 검출에 사용한 방법은 Hida 등 (Cancer Immunol Immunother 2002; 51: 219-228) 에 기재된 바와 같다. 저해 시험을 위해서는 20μg/ml 의 항 HLA 클래스 I (W6/32, IgG2a), 항 CD8 (Nu-Ts/c, IgG2a), 항 CD4 (Nu-Th/i, IgG1b), 및 항 HLA-클래스 II (H-DR-1, IgG) 모노클로날 항체를 사용하였다.

NS5A 유전자로 트랜스펙션한 세포에 대한 펩티드 자극 PBMC 의 CTL 활성

NS5A, HLA-A2402, 및 HLA-A2601 의 cDNA 는 각각 Huh7 (NNU50-1) 세포, C1R-A2402 세포, 및 KE4-CTL 세포로부터 RT-PCR 에 의해 얻고, 발현 벡터 pCR3.1 (Invitrogen, San Diego, CA) 에 클로닝하였다. Huh7 (NNU50-1) 세포주는 HCV1b 에 감염됨 세포주에 유래하는 레플리콘 세포이고, NS3 으로부터 NS5B 의 단백질을 발현한다 (Kishine et al., Biochem Biophys Res Commun 2002; 293: 993-999). 이어서, 100ng 의 NS5A, HLA-A2402 또는 NS5A, 및 HLA-A2601cDNA (음성 대조로서) 를, 0.6μl 의 Fugene6 (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) 을 포함하는 100μl 의 Opti-MEM (Invitrogen) 속에서 혼합하여, 30분간 인큐베이트하였다. 다음으로 혼합물 100μl 를 COS-7 세포 (1×10⁴ 세포) 에 첨가하여, 이것을 6시간 인큐베이트하였다. 20% FCS 를 포함하는 100μl 의 RPMI-1640 배지를 혼합물에 첨가하고, COS-7 세포를 2일간 배양하여 NS5A 2132-2140 자극 PBMC (2×10⁵ 세포/웰) 를 첨가하였다. 18시간 인큐베이트한 후, 100μl 의 상청을 빼내어, IFN-γ 농도를 3웰의 분석으로 ELISA 에 의해 측정하였다. 안정된 트랜스펙턴트 세포주를 제작하기 위해서, pCR3.1-NS5A 또는 pCR3.1-HLA-A3101 (음성 대조) 중 어느 하나를, Gene Pulser (BioRAD, Richmond, CA) 를 사용하여, C1R-A2402 세포에 일렉트로포레이션에 의해 트랜스펙션하였다. 이들 세포를 게네테신 (G418) 의 존재 하에서 30-40일간 배양하여, 게네테신 내성 세포를 회수하였다. 트랜스펙턴트 중의 NS5A 단백질의 발현은 항 NS5 폴리클로날 항체 (Abcam Limited, Cambridge, UK) 를 사용하는 웨스턴 블롯 분석에 의해 행하였다.

증식 저해 및 항체 의존성 세포성 세포 상해 ( ADCC )

Huh7 세포주를, 평저 96웰 마이크로 컬처 플레이트의 웰 속에서 여러 혈청의 존재 하에서 24, 48, 및 72시간 인큐베이트하였다. 인큐베이트 후, 세포 계수 키트-8 (10μl/웰) (Dojindo, Japan) 로 Huh7 세포를 세었다. ADCC 분석을 위해서는 HLA-A24 양성의 HD 로부터 새롭게 단리한 PBMC 를, 여러 환자 또는 HD (음성 대조로서) 로부터의 비기능화 혈청 (56℃, 30분간) 을 함유하는 10% FCS 및 RPMI-1640 배지로 1.5시간 프리인큐베이트하였다. C1R-A2402 세포 및 C1R 세포 (음성 대조로서) 를 NS5A 2132-2140 펩티드 (10μM) 와 함께 2시간 인큐베이트하고, Na₂ ⁵¹CrO₄ 로 1.5시간 방사성 표지하고, 세정하여, 표적 세포로서 사용하였다. 펩티드 자극 PBMC 를, 96 U 밑바닥 마이크로 컬처 플레이트의 웰 속에서, 40, 20, 및 10 대 1 의 이펙터 대 표적 세포 (E/T) 비로, 표적 세포와 함께 인큐베이트하였다. 37℃ 에서 6시간 인큐베이트한 후, 무세포 상청을 회수하여 ADCC 활성을 측정하였다 (Shomura, et al., Br J Cancer 2004; 90: 1563-1571).

통계학

통계학적 분석은 스튜던트 t 검정 및 맨·위트니 U 검정을 이용하여 행하였다. P<0.05 의 값을 통계학적으로 유의한 것으로 하였다.

HCV -펩티드에 대한 액성 응답의 검출

펩티드에 대한 액성 응답을 스크리닝하기 위해서, HCV-1b 에 감염된 12명의 환자의 혈장에 있어서, 44종의 펩티드에 대한 각각의 IgG 반응성의 레벨을 측정하였다. 10명의 HD 의 혈장을 음성 대조로서 사용하였다. 펩티드 반응성 IgG 의 레벨은 연속 희석한 혈장 샘플에 관해서 ELISA 에 의해 측정하고, 각 샘플의 흡광도 (OD) 치를 나타냈다. 1:100 의 혈장 희석에서의 이들 펩티드의 컷오프치를 0.18OD {10명의 HD 의 평균 (0.08)+2SD (0.05×2) 로 하였다. NS5A-2132, C-176, E2-488, E1-213, C-173, 및 NS3-1081 펩티드에 대한 유의한 레벨 (1:100 의 혈청 희석에서 >0.18OD) 의 IgG 반응성은 12명의 환자의 혈장 중, 각각 12, 11, 10, 9, 8, 및 5명에서 검출할 수 있었다 (도 9). 예측된 바와 같이, 이들 펩티드는 모두 10명의 HD 로부터의 혈장에 대해서는 반응성을 갖고 있지 않았다. 펩티드 특이적 IgG 에 대한 펩티드의 반응성을 표 3 에 정리한다.

a) 12명의 HCV-1b⁺ 환자의 혈청 중의 펩티드 특이적 IgG 의 레벨을 ELISA 에 의해 측정하였다.

컷오프치는 0.18 이라고 결정되었다.

b) HLA-A24 분자에 대한 펩티드의 결합 스코어는 Bioinformatics and Molecular Analysis Section, NIH, Bethesda, MD (http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/) 를 사용하여 검색하였다.

90% 이상의 순도를 갖는 상기 기술한 6종의 각 펩티드, 및 음성 대조 펩티드를, 60명의 HCV1b⁺ 환자 (CH, n=24; LC, n=18; 및 HCC, n=18) 그리고 20명의 HD 의 혈청으로부터의 각 혈청 샘플에 대한 반응성에 관해서 시험하였다 (도 10).

이들의 각 샘플에 관해서 100:1 희석의 값을 플롯하였다. IgG (OD값) 의 평균 ±SD 는 이하와 같았다: NS5A-2132 (0.48±0.36), E2-488 (0.18±0.19), E1-213 (0.10±0.21), NS3-1081 (0.036±0.14), C-176 (0.09±0.14) 및 C-173 (0.04±0.13). * 는 맨·위트니 U 검정에 의한 P<0.05 를 나타낸다. NS5A-2132, E2-488, E1-213, 또는 C-173 에 대하여 반응성을 갖는 IgG 의 평균 레벨은 HD 의 것보다 통계학적으로 유의하게 높았지만, NS3-1081 또는 C-176 의 경우에는 그렇지 않았다. NS5A-2132, E2-488, E1-213, C-173, NS3-10810, 및 C-176 펩티드에 대하여 유의한 레벨의 반응성을 나타내는 IgG (1:100 의 혈청 희석에 있어서 >0.101 OD) 가, 시험한 60명의 환자의 혈장의 각각 57 (95%), 44 (73%), 28 (47%), 23 (38%), 21 (35%), 및 17 (28%) 에 있어서 검출할 수 있었다. 이것에 대하여, 20명의 HD 의 혈청은 전부, 유의한 레벨의 IgG 는 검출할 수 없었다 (도 10).

다음으로, 이들 각 펩티드에 반응성을 갖는 IgG 의 펩티드 특이성을, 흡수 및 용출 시험에 의해 확인하였다. 각 혈청 샘플을, 대응하는 펩티드 또는 무관계한 펩티드 (HIV; 음성 대조로서 사용한다) 중 어느 하나에, 37℃ 에서 3회 흡수시키고, ELISA 에 의해 펩티드 특이적 IgG 를 측정하였다 (도 11). 용출 시험에서는 제 1 회의 흡수 후에 펩티드 고정화 플레이트에 결합한 IgG 분자를 대응하는 펩티드 또는 무관계한 펩티드로 용출시킨 후에, ELISA 에 의해 용출 획분 중의 펩티드 특이적 IgG 의 레벨을 측정하였다. 대표적 결과에 대해서 3회의 측정의 OD값의 평균 ±SD 가 도시된다 (도 12). * 는 양측 스튜던트 t 검정에 의해 P<0.05 를 나타낸다.

예측된 바와 같이, 6종의 펩티드에 대한 각 IgG 는 모두 대응하는 펩티드에 의해 흡수되었지만, 무관계한 펩티드 (HIV 펩티드) 에 의해 흡수되지 않았다. 또한 이 IgG 는 대응하는 펩티드에 의해서 결합 획분으로부터 용출되었지만, 무관계한 펩티드에 의해서는 용출되지 않았다. 이들의 결과를 합치면, 각 펩티드에 반응성을 갖는 IgG 는 HCV1b 유래 펩티드에 대하여 특이적임이 시사된다.

펩티드 특이적 세포성 응답의 유도

HCV1b 에 감염되어 있는 HLA-A24 양성의 환자 (n=12, 6명의 CH, 3명의 LC, 3명의 HCC) 및 HCV 에 감염되어 있지 않은 HLA-A24 양성의 HD (n=5) 로부터의 PBMC 를, 6종의 각 펩티드 (순도>90%) 또는 대조 HIV 펩티드와 함께 13일간 배양하여, 대응하는 펩티드로 펄스한 C1R-A2402 세포에 응답한 IFN 생성에 관해서 조사하였다. HLA-A24 양성 HCV1b⁺ 의 환자 (n=12) 및 HD (n=5) 로부터의 PBMC 를 6종의 펩티드에서, 4개의 웰 (15×10⁴/웰) 로 자극하였다. 배양의 제 14 일에, 각 웰로부터의 펩티드 자극 PBMC (80-120×10⁴/웰) 를 따로따로 회수하고, 등량으로 4개로 분할하였다. 그 중 2개를, 대응하는 펩티드로 펄스한 C1R-A2402 세포에 응답하여 IFN-γ 를 생성하는 능력에 대해 따로따로 시험하였다. 나머지 2개는 음성 대조 펩티드 (HIV) 를 사용한 세포로 시험하였다. HIV 펩티드 (<50pg/ml) 에 응답하여 생성된 IFN-γ 을 백그라운드로 하여 빼었다. * 는 양측 스튜던트 t 검정에 의해 P<0.05 를 나타낸다.

C-173, C-176, E1-213, E2-488, NS3-1081, 및 NS5A-2132 의 HCV 펩티드는 12명의 환자의 각각 1, 3, 4, 6, 2, 및 7명 (도 13, 14), 및 5명의 HD 의 각각 0, 0, 1, 1, 1, 및 1명으로부터, 유의한 레벨 (p<0.05) 의 IFN-γ 생성을 유도하였다 (데이터 나타내지 않음). 이들 6종의 펩티드 중, NS5A-2132 펩티드는 12명의 환자의 7명으로부터의 PBMC 및 시험한 60명의 HCV1b⁺ 환자의 57명의 혈청에 있어서, 세포성 면역 및 액성 면역에 의해 인식되었다.

이들의 펩티드 자극 PBMC 의 세포 상해성을, 6시간의 ⁵¹Cr 유리 분석에 의해 확인하였다 (도 15). IFN-γ 생성 분석 (상기 기술) 에 의해 포지티브의 응답을 나타내는 펩티드 자극 PBMC 를, 인 비트로로 IL-2 만으로 배양하여 증식시켰다. 다음으로, 표준 6시간의 ⁵¹Cr 유리 분석에 의해, 대응하는 펩티드 또는 HIV 펩티드 (음성 대조) 로 펄스한 C1R-A2402 세포에 대한 세포 상해성에 관해서, 3개의 상이한 E/T 세포비로 시험하였다. 대표적인 결과를 도시한다. 값은 특이적 용해의 % 의 평균 ±SD 로 나타낸다. * 는 양측 스튜던트 t 검정에 의해 P<0.05 를 나타낸다. NS5A-2132, E2-488, 또는 E1-213 펩티드로 자극한 PBMC 는 대응하는 펩티드를 미리 부하한 C1R-A2402 세포에 대하여 유의한 레벨의 세포 상해성을 나타내었지만, HIV 펩티드에서는 나타내지 않았다 (도 15).

도 15 에 나타내는 실험에 있어서 사용한 펩티드 자극 PBMC 를, 20μg/ml 의 항 HLA-클래스 I (W6/32, IgG2a), 항 HLA-클래스 II (H-DR-1, IgG2a), 항 CD8 (Nu-Ts/c, IgG2a), 및 항 CD4 (Nu-Th/i, IgG1) 모노클로날 항체 (mAb) 의 존재 하에서, 대응하는 펩티드로 펄스한 C1R-A2402 세포에 대한 세포 상해성에 대해 시험하였다. 항 CD14 (JML-H14, IgG2a) mAb 를 음성 대조로서 사용하였다. 3개의 상이한 E/T 비로 6 시간의 ⁵¹Cr 유리 분석을 행하였다. 값은 특이적 상해의 % 의 평균 ±SD 로 나타낸다 (도 16). * 는 양측 스튜던트 t 검정에 의해 P<0.05 를 나타낸다.

3종의 펩티드의 각각에 펄스한 C1R-A2402 세포에 대한 세포 상해성은 항 HLA-클래스 I (W6/32) 또는 CD8 모노클로날 항체 (mAb) 에 의해 저해되었지만, 시험한 다른 mAb 의 어느 것에 의해서도 저해되지 않았다. 이는 펩티드 특이적 세포 상해성이, 주로 CD8⁺ T 세포에 의해 HLA-클래스 I 구속성으로 매개되는 것을 나타낸다 (도 16). 이것에 대하여, 나머지 3종의 펩티드 (C-173, C-176, 또는 NS3-1081) 로 자극한 PBMC 에서는 그러한 세포 상해성은 검출할 수 없었다 (데이터 나타내지 않음).

다음으로, NS5A 및 HLA-A2401 유전자로 일과성으로 코트랜스펙션한 COS-7 세포를 표적 세포로서 사용함으로써, NS5A-2132 펩티드 자극 PBMC 가 자연스럽게 프로세스되어 생긴 펩티드를 인식하는지 여부를 조사하였다. 음성 대조로서는 NS5A 및 HLA-A2601 유전자로 일과성으로 코트랜스펙션한 COS-7 세포를 사용하였다. 환자 #1 및 #2 로부터의 NS5A-2132 펩티드 자극 PBMC 가, NS5A 및 HLA-A2401 유전자로 일과성으로 코트랜스펙션한 COS-7 세포를 표적 세포로서 인식하여 IFN-γ 를 생성하는 활성에 관해서 시험하였다. 음성 대조로서는 NS5A 및 HLA-A2601 유전자로 일과성으로 코트랜스펙션한 COS-7 세포를 사용하였다. 값은 E/T 비 20:1 에서의 3회의 분석에 있어서의 IFN-γ 생성의 % 의 평균 ±SD 를 나타낸다 (도 17). * 는 양측 스튜던트 t 검정에 의해 P<0.05 를 나타낸다.

예측된 바와 같이, CTL 활성을 나타낸 (도 13) 환자 #1 및 #2 로부터의 펩티드 자극 PBMC 는 NS5A 및 HLA-A2401 유전자로 코트랜스펙션한 COS-7 세포를 인식하여, 유의한 양의 IFN-γ 을 생성하였다 (도 17). 이것에 대하여, 이들 PBMC 는 음성 대조로서 사용한 NS5A 및 HLA-A2601 유전자를 갖는 COS-7 세포에는 반응하지 않았다. 또한, CTL 활성을 나타내지 않은 다른 2명의 환자 (#3 및 #4) 로부터의 펩티드 자극 PBMC 도, NS5A 및 HLA-A2401 유전자로 코트랜스펙션한 COS-7 세포의 인식에 의해 유의한 양의 IFN-γ 를 생성하지 않았다 (데이터 나타내지 않음).

다음으로, NS5A 유전자로 안정적으로 트랜스펙트하고 표적 세포로서 사용한 C1R-A2402 세포에 대한 세포 상해성을 시험하였다. NS5A 유전자로 안정적으로 트랜스펙트한 C1R-A2402 세포에 있어서의 HLA-A24 분자의 발현 및 HLA-A31 유전자 (음성 대조) 로 안정적으로 트랜스펙트한 C1R-A2402 세포에 있어서의 HLA-A31 분자의 발현을, FACScan 을 사용하는 플로사이토메트리 분석에 의해 확인하였다 (도 18).

다음으로, NS5A 유전자로 안정적으로 트랜스펙트한 C1R-A2402 세포를 표적 세포로 하는 세포 상해성을 6시간의 ⁵¹Cr 유리 분석에 의해 시험하였다. 음성 대조 유전자 (HLA-A3101) 로 안정적으로 트랜스펙트한 C1R-A2402 세포를 음성 대조로서 사용하고, NS5A-2132 펩티드로 펄스한 C1R-A2402 세포를 양성 대조로서 사용하였다. 3개의 상이한 E/T 비로 6시간의 ⁵¹Cr 유리 분석을 행하였다. 값은 특이적 용해의 % 의 평균 ±SD 로 나타낸다. * 는 양측 스튜던트 t 검정에 의해 P<0.05 를 나타낸다. NS5A-2132 펩티드로 자극한 PBMC 는 음성 대조 유전자로 트랜스펙트한 C1R-A2402 세포에 대한 세포 상해성과 비교하여, NS5A 유전자로 트랜스펙트한 C1R-A2402 세포, 및 대응하는 펩티드로 미리 펄스한 트랜스펙트하지 않은 C1R-A2402 세포의 양방에 대하여, 보다 높은 레벨의 세포 상해성을 나타내었다 (도 19). 이들의 결과는 NS5A-2132 펩티드 자극 PBMC 가 HCV1b⁺ 세포의 HLA-A2402 분자 상의 자연스럽게 프로세스되어 생긴 펩티드를 순조롭게 인식하였음을 시사한다.

항 NS5A -2132 IgG 에 관한 추가적인 연구

항 펩티드 IgG 의 생물학적 역할의 가능성을 더욱 잘 이해하기 위해서, 흡수 및 용출 분석에 의해, 항 NS5A-2132 IgG 가 전체 NS5 단백질을 인식하는지 여부를 조사하였다. NS5A-2132 및 HIV 펩티드를 각각 양성 대조 및 음성 대조로서 사용하였다 (흡수시험 및 용출 시험의 상세한 내용은 상기 기술한 내용을 참조). 그 결과, 항 펩티드 IgG 는 전체 NS5 단백질에서는 흡수도 용출도 되지 않았다 (도 20). 이는 이 펩티드 IgG 는 전체 NS5 단백질과는 반응하지 않았음을 시사한다.

다음으로, Huh7 세포를, 환자 혈청 (혈청이 고레벨의 항 NS5A-2132 활성을 갖는 2명의 HCV1b⁺ 환자로부터의 혈청) 의 존재 하에서 3일간까지 인큐베이트하였다. 음성 대조로서는 2명의 HD 로부터의 혈청 및 FCS 를 사용하였다. 생존가능한 Huh7 (NNU50-1) 세포의 수를 세포 계수 키트 8 (10μl/웰) 로 세어, 3회의 분석의 평균치를 나타낸다. 시험한 혈청은 모두, 이들의 배양 조건 하에서는 Huh7 (NNU50-1) 세포의 증식을 저해하지 않았다 (도 21). 또한, 항 NS5A-2132 IgG 가 ADCC 활성을 매개하는 능력을 갖는지 여부를 조사하였다. HLA-A24 양성의 HD 에서 새롭게 단리한 PBMC 를, 상기 기술한 4종의 비기능화 혈청의 존재 하에서, 이 펩티드로 미리 펄스한 C1R-A2402 세포에 대한 세포 상해성에 관해서 시험하였다. 그러나, 이들 조건에서는 시험한 혈청이 모두 ADCC 활성을 나타내지 않았다 (도 22).

실시예 3. HCV 감염자의 예후의 예측

피험자

혈청은 1995년부터 2002년의 코호트 연구에 있어서의, HCV 관련 질환을 갖는 33명의 환자로부터 얻었다. 33명의 환자의 폴로업 (follow up) 조사의 결과는 표 4 에 나타낸다. 만성 간염 (CH, n=68), 간경변 (LC, n=43), 및 간세포암 (HCC, n=52) 을 갖는 환자의 혈청도 분석에 사용하였다. 이들 환자는 최초의 혈청 샘플링시에, 생화학 및 조직학적 소견, 초음파 검사, 및 컴퓨터 연동 단층 촬영에 의해 진단하였다. 항 HCV 항체는 화학 발광 효소 면역 분석 (CLEIA) 키트(Lumipulse II HCV, Fujirebio Inc., Tokyo, Japan) 에 의해, 또는 제 2 세대 또는 제 3 세대 효소 면역 분석 시험 (SRL, Tokyo, Japan) 에 의해 측정하였다. 혈청 중의 HCV-RNA 는 RT-PCR (SRL, Tokyo, Japan) 을 사용하여 검출하였다. HCV 게노타입은 환자의 혈청 중의 HCV 를 RT-PCR (SRL, Tokyo, Japan) 로 직접 시퀀싱함으로써 결정하였다. HCV 감염되어 있지 않은 피험자로부터도 혈청을 얻었다. 이것은 자기 면역 질환을 갖는 24명의 피험자 (전신성 홍반성 낭창을 갖는 6명의 환자, 베체트병을 갖는 1명의 환자 및 아토피성 피부염을 갖는 17명의 환자), B형 간염 바이러스 (HBV) 감염의 17 증례 (HBV 표면 항원에 포지티브), 인간 면역 부전 바이러스 (HIV) 를 갖는 3명의 환자, 및 인간 T 세포 백혈병 바이러스 타입 I (HTLV-1) 감염을 갖는 10 증례를 포함한다. 음성 대조로서, HBV 의 간염 바이러스 또는 백신 접종의 이력을 갖지 않고, 정상적인 간기능을 갖는 37명으로부터의 혈청을 시험하였다.

CH, 만성 간염; LC, 간경변; HCC, 간암; ASC, 무증후성 건강 캐리어

펩티드

순도 90% 이상의 다음 2개의 펩티드는 BIOSYNTHESIS (Lewisville, TX) 로부터 구입하였다 ; HCV1b 코어 단백질 35-44 (YLLPRRGPRL (서열 번호 1) ; HLA-A2 구속성 CTL 활성을 유도할 수 있다), 및 HCV1bNS5A 단백질 2132-2140 (RYAPACKPL (서열 번호 2); HLA-A24 구속성 CTL 활성을 유도할 수 있다). 음성 대조로서는 HLA-A2 결합 모티프 (SLYNTVATL (서열 번호 64)) 및 HLA-A24 결합 모티프 (RYLRDQQLLGI (서열 번호 63)) 를 갖는 HIV 유래 펩티드를 사용하였다.

펩티드에 반응성을 갖는 항체의 측정

펩티드 특이적 IgG 의 레벨은 효소 항체법 (ELISA) 에 의해 측정하였다. 간단하게는 각 펩티드를 디메틸술폭사이드 (DMSO) 에 용해하고, -20℃ 에서 보존하였다. 화학 가교제인 디숙신이미딜수베레이트 (DSS) (PIERCE, Rockford, IL) 를 함유하는 0.1M 탄산 버퍼로 희석한 펩티드 (20μg/웰) 를 ELISA 플레이트에 결합시켰다. 0.05% Tween20-PBS (PBST) 로 웰을 3회 세정하였다. 플레이트를 Block Ace (Yukijirushi, Tokyo, Japan) 로 4℃ 에서 하룻밤 블로킹하였다. 혈청 샘플을 0.05% Tween20-Block Ace 로 100배, 200배, 400배로 희석하고, 100μl/웰의 샘플을 각 웰에 첨가하였다. 37℃ 에서 2시간 인큐베이트한 후, 플레이트를 PBST 로 9회 세정하고, 100μl/웰의 1000배 희석한 토끼 항 인간 IgG (γ쇄 특이적) (DAKO, Glostrup, Denmark) 와 함께 37℃ 에서 2시간 인큐베이트하였다. 9회 세정한 후, 100μl/웰의 1:100 희석 항 토끼 IgG 결합 서양 고추냉이 퍼옥시다제·덱스트란 폴리머 (En Vision, DAKO) 를 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 40분간 인큐베이트하였다. 세정한 후, 100μl/웰의 테트라메틸벤지딘 기질 용액 (KPL, Guildford, UK) 을 첨가하고, 1.0M 의 인산을 첨가함으로써 반응을 정지시켰다.

통계학

통계학적 분석은 χ² 검정을 사용하여 행하였다. p<0.05 의 값을 통계학적으로 유의한 것으로 하였다.

교차 반응성, HLA 구속성, 및 게노타입 구속성

HCV1b 유래 펩티드에 대하여 반응성을 갖는 2개의 항체의 교차 반응성을 조사하였다. 60명의 HCV 환자, 및 코호트 연구에 포함되지 않은 환자 (CH, n=22, LC, n=21, 및 HCC, n=17) 의 혈청을, 코어의 35-44 (C-35) 및 NS5A 의 2132-2140 (NS5A-2132) 의 펩티드에 대한 반응성에 관해서 조사하였다. 자기 면역 질환을 갖는 24명의 피험자, HBV 감염의 17증례 및 HTLV-1 감염의 10증례로부터도 혈청을 입수하였다. 37명의 HD로부터의 혈청을 음성 대조로서 사용하였다. 연속 희석한 혈청 샘플의 펩티드 반응성 IgG 의 레벨을 ELISA 에 의해 측정하였다. 각 샘플의 흡광도 (OD) 의 값을 나타냈다. 100:1 의 혈청 희석에서의 OD 의 대표적인 결과를 나타낸다. 컷오프치는 0.093 (HD 로부터의 OD 의 평균 +2SD) 으로 설정하였다. 통계학적 분석은 χ² 검정을 사용하여 실시하였다. p<0.05 의 값을 통계학적으로 유의한 것으로 하였다.

그 결과, HCV 양성 환자의 56/60 (93.3%) 에 있어서 유의한 레벨의 항 C-35 IgG 가 검출되고, 3군 (CH, LC, 및 HCC 환자) 사이에서 IgG 레벨에는 유의한 차가 없었다 (도 23). HTLV-1 환자를 제외하고, 다른 군으로부터의 혈청은 항 C-35 항체에 포지티브가 아니었다. HTLV-1+피험자의 8/10 증례의 혈청에 있어서, 낮지만 유의한 레벨의 항 C-35 IgG 가 검출되었다. 환자의 45/60 (75%) 에서 유의한 레벨의 항 NS5A-2132 IgG 가 검출되었다. IgG 레벨은 3군 사이에서는, CH 환자에서는 높고, LC 에서는 중간 정도이고, HCC 환자에서는 낮았다 (p<0.05vsCH) (도 23). 다른 군으로부터의 혈청에 관해서도, 시험한 증례의 대부분에서 항 NS5A-2132 IgG 가 포지티브이었다. 또한, 3/37 의 HD의 혈청은 항 NS5A-2132 IgG 가 포지티브이었다.

다음으로, HCV 관련 질환을 갖는 29명의 환자에서, HLA-클래스 IA 표현형과, 항 C-35 IgG 또는 항 NS5A-2132 IgG 의 레벨 사이의 상관을 조사하였다. HLA-클래스 IA 표현형은 표준 혈청학적 방법에 의해 결정하였다. 9명의 환자는 HLA-A2 양성, 13명의 환자는 A24 양성, 및 나머지 7명의 환자는 A2 음성, A24 음성이었다. 항 C-35 및 항 NA5A 2132 는 표준적 ELISA 에 의해 측정하고, 각 환자의 100:1 의 혈청 희석에서의 OD값을 도시하였다. 어느 항체나, HLA-클래스 I A 표현형의 상이에 관계없이, HCV 감염 환자의 대부분에서 검출되었다 (도 24).

다음으로, HCV-1b (n=29), HCV-2a (n=16) 및 HCV-2b 감염 (n=3) 을 갖는 환자에 있어서, HCV 게노타입과, 항 C-35 IgG 또는 항 NS5A-2132 IgG 의 레벨 사이의 상관을 이중 맹검법으로 조사하였다. HCV 게노타입은 환자의 혈청 중의 HCV 를 직접 시퀀스함으로써 결정하였다. 모든 피험자의 100:1 희석에서의 결과를 도 25 에 나타낸다. 항 C-35 및 항 NA5A 2132 는 표준적인 ELISA 에 의해 측정하고, 각 환자의 100:1 의 혈청 희석에서의 OD값을 도시하였다. 컷오프치는 0.093 (HD 로부터의 OD 의 평균+2SD) 으로 설정하였다.

항 C-35 항체는 각각, 26/30 의 HCV-1b, 15/15 의 HCV-2a, 및 3/3 의 HCV-2b 감염 환자에서 검출되었다. 마찬가지로, 항 NS5A-2132 항체는 각각, 23/30 의 HVC1b, 10/16 의 HCV-2a, 및 3/3 의 HCV-2b 감염 환자로부터의 혈청 중에서 검출되었다 (도 25). 이들의 결과는 HCV 양성 환자에 있어서는 HLA-클래스 IA 서브 타입의 상이 및 HCV 게노타입의 상이에 관계없이, 항 C-35 항체 및 항 NS5A-2132 항체의 양방이 검출된 것을 나타낸다.

이상의 결과는 항 NS5A-2132 항체의 레벨은 HCV 감염 개체의 예후와 상관하지만, 항 C-35항체는 상관하지 않는 것을 시사한다.

다음으로, CH (n=24), LC (n=22), HCC (n=26), HD (n=9) 의 혈청을 새롭게 준비하고, 항 NS5A-2132 IgG 의 레벨을 측정하였다 (도 26). CH, LC, HCC 및 HD 군의 평균 ±SD 는 각각 0.51±0.24, 0.27±0.20, 0.26±0.23, 0.08±0.07 이었다. LC 및 HCC 환자에게 있어서의 항 NS5A-2132 항체의 레벨은 CH 환자보다 유의하게 낮았지만 (p<0.05), HD 보다 높았다. 이들의 결과를 표준 제 3 세대 분석에 의해 측정한 결과와 비교하기 위해서, 모든 혈청에 대해서 시판 중인 키트 (제 3 세대 분석, SRL) 를 사용하여 항 HCV 항체의 레벨을 측정하였다. 레벨은 지수로서 나타낸다 (좌 칼럼). 지수로 나타내는 항 HCV 의 레벨과 항 NS5A-2132 레벨 사이의 상관은, 우 칼럼에 나타낸다. 제 3 세대 분석에 의해 측정한 항 HCV 항체의 레벨은 3군 사이에서 유의하게 상이하지 않았다 (CH; 10±2.7, LC; 11±1.4, HCC; 11±1.1) (도 27). 또한, 이들 혈청에 대해서, 시판 중인 키트 (SRL, Japan) 를 사용하여 HCV RNA 레벨을 측정하였다. HCC 환자의 HCV RNA 레벨 (360±269.6) 은 CH 환자 (610±347.3) 또는 LC 환자 (610±246.4) 보다 낮았다 (P<0.05) (도 28). 그러나, 항 NS5A 항체의 레벨과 HCV RNA 레벨 사이에는 분명한 상관은 없었다 (도 28).

코호트 연구의 결과

항 NS5A-2132 항체와 HCV 양성 환자의 예후의 상관을 개개의 레벨로 더욱 조사하기 위해서, 1990년부터 2002년에 행하여진, HCV 에 감염되어 있는 거주자를 매년 스크리닝하는 코호트 연구로부터의 샘플에 관해서 2개의 항체의 혈청 레벨을 조사하였다. 이 연구를 위해서는 1995년 및 2002년에 같은 개체로부터 2회 채취한 33명의 환자로부터의 합계 66 의 혈청을 사용하였다. 1995년 시점에서의 이들 33명의 환자의 진단은 CH (n=17), LC (n=1), 무증후성 캐리어 (ASC) (n=4), 및 HCV 감염의 과거 병력 (자연 회복한 개체) (n=11) 이고, 2002년 시점에서는 CH (n=13), LC (n=4), HCC (n=2), 무증후성 캐리어 (ASC) (n=1), 및 HCV 감염의 과거 병력 (n=13) 이었다. 즉, 7년 사이에, 26명의 환자에서는 질환의 진행이 관찰되지 않았지만, 나머지 7명의 환자에서는 진행이 관찰되었다 (표 4). 1995년 및 2002년에 100:1 의 혈청 희석으로 측정한 각 환자에게 있어서의 항 C-35 항체 및 항 NS5A-2132 IgG 의 OD값을 도 29 에 나타낸다. 예측된 바와 같이, 33 증례의 대부분에 있어서는 질환의 상태에 관계없이, 1995년에 측정한 항 C-35 항체의 레벨과 2002년에 측정한 레벨은 거의 같았다. 이것에 대하여, 1995년에 측정한 항 NS5A 항체의 레벨은 질환이 진행된 7명의 환자 전부에 있어서는 2002년에 측정하였을 때에 감소하여 있었다. 한편, 질환이 진행되지 않은 25 증례의 대부분에 있어서 2002년에 측정한 값과 거의 같았다. 질환이 진행된 7명의 환자의 혈청 중의 1995년의 시점에서의 항 NS5A-2132 항체의 중앙치 ±SD (0.67±0.13) 는 2002년에 측정한 값 (0.27±0.11) 보다 유의하게 높았다 (p<0.05).

다음으로, 33명의 피험자를 5개의 군 (CH, LC, HCC, HCV 감염의 과거의 병력 [회복된 개체], 및 ASC) 으로 나눠, 2002년에 있어서의 100:1 의 혈청 희석에서의 2개의 항체의 레벨을 플롯하였다 (도 30). 통계학적 분석은 χ² 검정을 사용하여 행하였다. p<0.05 의 값을 통계학적으로 유의한 것으로 하였다. 항 C-35 항체의 레벨은 CH, LC, 및 HCC 에서는 모두 높고, 치유된 개체에서는 매우 낮아지거나 검출할 수 없었다. 한편, 항 NS5A-2132 항체의 레벨은 CH, 회복된 개체 및 ASC 에서 높고, LC 에서 중간 정도이고, HCC 환자에서 가장 낮았다 (p<0.05vsCH).

실시예 4: 루미넥스 ( Luminex ) 법에 의한 HLA -A24+ HCV 감염 환자의 혈청에 있어서의 HCV 펩티드와 반응성을 갖는 IgG 의 검출

ELISA 법보다 감도가 높다고 생각되는 루미넥스 (Luminex) 법을 이용하여, 실시예 1 과 동일하게 하여, HLA-A24+HCV 감염 환자의 혈청에 있어서의 HCV 펩티드와 반응성을 갖는 IgG 를 검출하였다.

펩티드의 미소 비드에 대한 결합

펩티드를, 제조자의 지시에 따라 각 형광 색소의 함유량을 식별 코드 (이하, 컬러 코드) 화한 미소 비드 (Luminex사 제조, xMAP Multi-Analyte COOH Beads) 에 각각 다음과 같이 하여 결합하였다. 필터 플레이트의 각 웰에 컬러 코드화한 미조제의 미소 비드를 100μl 씩 넣어 흡인하고, 그 후 세정용 완충액 (인산 완충액 생리 식염수 (PBS) (pH7.4±0.1), Tween (등록상표) 20 (0.05% v/v)) 으로 2회 세정하여 각 웰을 동시에 흡인하였다. 다음으로 0.1M MES (2-모르폴리노에탄술폰산) 완충액 (pH 7.0) 50μl 를 넣고, EDC (N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드염산염) (1mg/ml/0.1M MES 완충액 (pH 7.0)) 를 각 웰 10μl 씩 첨가하였다. 수백 μl 의 펩티드 (1mg/ml, 0.1M MES 완충액, pH 7.0) 를 이 세정한 미소 비드와 각 웰 내에서 혼합하였다. 그 후 펩티드와 혼합한 미소 비드를, 어두운 곳에서 20분간, 실온에서 반응시킨 후, 추가로 EDC (1mg/ml/0.1M MES 완충액 (pH 7.0)) 를 각 웰 10μl 씩 첨가하고, 어두운 곳에서, 20분간 실온에서 반응시키는 조작을 2회 반복하였다. 잉여액을 흡인 후, 1M 트리스염산 완충액 (pH7.0) 을 각 웰 100μl 씩 첨가하고, 어두운 곳에서, 15분간 실온에서 반응시켰다. 다음으로, 각 웰의 비드를 상기 세정용 완충액으로 3회 세정하고, 블록 에이스 (등록상표) 에 0.05% 아지화나트륨을 넣어 조정한 보존용 용액으로 회수하였다.

미소 비드 믹스의 조제

각 웰의 미소 비드를 조제할 때에는 상기 한 바와 같이 컬러 코드화한 미소 비드에 펩티드를 결합시켜 얻은 비드 용액을 필터 플레이트의 각 웰당 미소 비드가 약 5000개가 되도록 넣어 (각 웰당 비드 1종류 약 1μl) 조제한다. 또한, 이와 같이 조제한 미소 비드를 10종류 등량으로 섞고, 상기 세정용 완충액 (PBS, TWEEN (등록상표) 20 (0.05% v/v)) 으로 총량이 약 25μl 가 되도록 희석하여 비드 믹스를 조제하였다.

샘플의 조제

혈청을 사용하였다. 혈청을 반응용 완충액 (PBS (pH 7.4±0.1), Tween (등록상표) 20 (0.05% v/v), 소 태아 혈청 알부민 (BSA) 10mg/ml) 을 사용하여 100∼1000배 희석한 혈청 희석액을 각각 100μl 조제하였다.

항 펩티드 항체 측정

비오틴화 2차 항체로서는 비오틴화 염소 항 인간 IgG (감마쇄 특이적) 를 상기 반응용 완충액으로 희석하여 사용하였다. 형광 색소 표지 스트렙토아비딘으로서는 PE (피코에리트린) 로 표지한 스트렙토아비딘 (SRPE) 1mg/ml 를 상기 반응용 완충액으로 20μl 로 희석 (1/50 희석) 하여 사용하였다.

필터 플레이트의 각 웰에 상기 세정용 완충액을 100μl 넣고, 계속해서 흡인 제거하였다. 이 세정 조작을 2회 행하였다. 다음으로, 각 웰에 상기 비드 믹스를 25μl 넣은 96웰의 필터 플레이트를 그 세정용 완충액으로 2회 세정하였다. 세정 후, 모든 웰에 상기 샘플을 각각 100μl 넣었다. 다음으로 필터 플레이트에 커버를 하여 어두운 곳에서, 2시간 실온에서 플레이트 쉐이커 (300rpm) 를 사용하여 진탕한 후, 흡인하였다. 계속해서, 각 웰에 상기 세정용 완충액을 각각 100μl 넣어 흡인 제거하였다. 이 세정 조작을 3회 행하였다.

다음으로, 각 웰에 비오틴화 2차 항체로서 비오틴화 염소 항 인간 IgG (감마쇄 특이적) 를 각각 100μl 넣고, 필터 플레이트에 커버를 하여 어두운 곳에서 1시간 실온에서 플레이트 쉐이커 (300rpm) 를 사용하여 진탕하였다. 그 후, 흡인하여, 각 웰에 상기 세정용 완충액을 각각 100μl 넣어 흡인 제거하였다. 이 세정 조작을 3회 행하였다.

계속해서, 각 웰에 SRPE 를 각각 100μl 넣고, 필터 플레이트에 커버를 하여 어두운 곳에서 30분간 실온에서 플레이트 쉐이커 (300rpm) 를 사용하여 진탕하였다. 그 후, 흡인하여, 각 웰에 상기 세정용 완충액을 각각 100μl 넣어 흡인 제거하였다. 이 세정 조작을 3회 행하였다. 그 후, 각 웰에 그 세정용 완충액을 각각 100μl 넣고, 플레이트 쉐이커 (300rpm) 를 사용하여 2∼3분간 진탕한 후, 얻어진 샘플 50μl 를 형광 플로메트리 시스템으로 측정하였다. 결과를 도 31 및 32, 및 표 5 에 나타낸다.

실시예 5: C형 간염 바이러스 유래 펩티드 백신을 사용하는 HCV 감염의 치료

HLA-A2 양성 또는 HLA-A24 양성의 HCV 감염자에 있어서, 본 발명의 C형 간염 바이러스 유래 펩티드를 사용한 백신의 항 바이러스 효과를 조사하였다. 피험자는 모두, HCV1b 에 감염되어 있어, 인터페론+리바비린에 의한 치료에 응답하지 않은 환자이다. C형 간염 바이러스 유래 펩티드 C-35, NS5A-2132, E2-488, E1-213 및 NS3-1081 은 GMP 적합 하에 합성하고, 정제하여, 동결 건조 분말로서 보존하였다. C-35, NS5A-2132, E2-488 및 NS3-1081 의 펩티드는 소량의 DMSO 에 용해 (1mg/10∼25μl) 하고, E1-213 은 7% 탄산수소나트륨 주사액 (메이론) 에 용해 (1mg/15μl) 하였다. 이들을 각각 주사용 생리 식염수로 희석 (1∼2 mg/ml) 하고, 0.22μM 의 필터를 통해서 멸균하였다. 이 용액을 등량의 아주반트 (Montanide ISA-51) 와 혼합하여 에멀션 주사제를 얻었다. 이 중 HLA-A2 양성의 피험자 3명에게는 C-35 주사제를, HLA-A24 양성의 피험자 5명에게는 NS5A-2132 주사제를 투여하였다. 투여는 2주간마다, 1회당 0.3mg 의 펩티드를 함유하는 에멀션을 측복부에 주사함으로써 행하였다. HCV RNA 의 양 및 GOT, GPT, γ-GTP, AFP 의 값을 계속적으로 모니터하였다.

결과를 도 33 및 도 34 에 나타낸다. 이들 도면을 통해 알 수 있는 바와 같이, 시험한 대부분의 피험자에게 있어서, 백신 투여 개시 후 HCV RNA 의 양이 현저히 저하되어 있어, 본 발명의 펩티드가 항 HCV 백신으로서 유효하다는 것이 실증되었다.

본 발명에 관련되는 C형 간염 바이러스 유래 펩티드는 HLA 결합 모티프를 그 서열 중에 포함하고 있어, C형 간염 바이러스에 반응하는 항체에 의해 인식됨과 함께, 추가로 HLA-A2 또는 HLA-A24 구속성 세포 상해성 T 세포에 의한 인식성을 갖고 있다.

따라서, 본 발명의 C형 간염 바이러스 유래 펩티드는 HCV 감염에 기인하는 질환에 대하여 유효한 백신으로 될 수 있다.

<110> KURUME UNIVERSITY <120> HEPATITIS C VIRUS DERIVED PEPTIDES <130> PIK9002WO <150> JP 2003-330258 <151> 2003-09-22 <160> 64 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Hepatitis C Virus <400> 1 Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu 1 5 10 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Hepatitis C Virus <400> 2 Arg Tyr Ala Pro Ala Cys Lys Pro Leu 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Hepatitis C Virus <400> 3 His Tyr Ala Pro Arg Pro Cys Gly Ile 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Hepatitis C Virus <400> 4 Val Tyr Glu Ala Ala Asp Met Ile Met 1 5 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Hepatitis C Virus <400> 5 Val Tyr His Gly Ala Gly Ser Lys Thr Leu 1 5 10 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Hepatitis C Virus <400> 6 Ile Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Leu 1 5 10 <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> Hepatitis C Virus <400> 7 Ser Phe Ser Ile Phe Leu Leu Ala Leu Leu 1 5 10 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Hepatitis C Virus <400> 8 Glu Tyr Val Leu Leu Leu Phe Leu Leu 1 5 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Hepatitis C Virus <400> 9 Met Tyr Thr Asn Val Asp Gln Asp Leu 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Hepatitis C Virus <400> 10 Gln Tyr Leu Ala Gly Leu Ser Thr Leu 1 5 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Hepatitis C Virus <400> 11 Leu Tyr Gly Val Trp Pro Leu Leu Leu 1 5 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Hepatitis C Virus <400> 12 Ala Tyr Ser Gln Gln Thr Arg Gly Leu 1 5 <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Hepatitis C Virus <400> 13 His Tyr Lys Leu Phe Leu Ala Arg Leu 1 5 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Hepatitis C Virus <400> 14 Thr Tyr Ala Thr Tyr Gly Lys Phe Leu 1 5 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Hepatitis C Virus <400> 15 Ala Tyr Met Ser Lys Ala His Gly Ile 1 5 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Hepatitis C Virus <400> 16 Pro Tyr Ile Glu Gln Gly Met Gln Leu 1 5 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Hepatitis C Virus <400> 17 Asn Phe Ile Ser Gly Ile Gln Tyr Leu 1 5 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Hepatitis C Virus <400> 18 Pro Tyr Phe Val Arg Ala His Gly Leu 1 5 <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Hepatitis C Virus <400> 19 Gln Phe Lys Gln Lys Ala Ile Gly Leu 1 5 <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Hepatitis C Virus <400> 20 Ile Phe Thr Ile Thr Lys Ile Leu Leu 1 5 <210> 21 <211> 10 <212> PRT <213> Hepatitis C Virus <400> 21 Gly Tyr Ile Pro Ile Val Gly Ala Pro Leu 1 5 10 <210> 22 <211> 10 <212> PRT <213> Hepatitis C Virus <400> 22 Met Tyr Val Gly Gly Val Glu His Arg Leu 1 5 10 <210> 23 <211> 10 <212> PRT <213> Hepatitis C Virus <400> 23 His Tyr Val Gln Met Ala Leu Met Lys Leu 1 5 10 <210> 24 <211> 10 <212> PRT <213> Hepatitis C Virus <400> 24 Thr Tyr Val Tyr Asp His Leu Thr Pro Leu 1 5 10 <210> 25 <211> 10 <212> PRT <213> Hepatitis C Virus <400> 25 Gly Tyr Gly Ala Gly Val Ala Gly Ala Leu 1 5 10 <210> 26 <211> 10 <212> PRT <213> Hepatitis C Virus <400> 26 Ala Tyr Ala Ala Gln Gly Tyr Lys Val Leu 1 5 10 <210> 27 <211> 10 <212> PRT <213> Hepatitis C Virus <400> 27 Ala Tyr Ala Leu Tyr Gly Val Trp Pro Leu 1 5 10 <210> 28 <211> 10 <212> PRT <213> Hepatitis C Virus <400> 28 His Tyr Pro Cys Thr Val Asn Phe Thr Ile 1 5 10 <210> 29 <211> 10 <212> PRT <213> Hepatitis C Virus <400> 29 Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Val Ser Val Ile 1 5 10 <210> 30 <211> 10 <212> PRT <213> Hepatitis C Virus <400> 30 Thr Phe Leu Val Gly Leu Asn Gln Tyr Leu 1 5 10 <210> 31 <211> 10 <212> PRT <213> Hepatitis C Virus <400> 31 Val Phe Val Gly Leu Ile Leu Leu Thr Leu 1 5 10 <210> 32 <211> 10 <212> PRT <213> Hepatitis C Virus <400> 32 Glu Phe Trp Glu Ser Val Phe Thr Gly Leu 1 5 10 <210> 33 <211> 10 <212> PRT <213> Hepatitis C Virus <400> 33 Leu Phe Leu Ala Arg Leu Ile Trp Trp Leu 1 5 10 <210> 34 <211> 10 <212> PRT <213> Hepatitis C Virus <400> 34 Tyr Phe Ile Thr Arg Ala Glu Ala His Leu 1 5 10 <210> 35 <211> 10 <212> PRT <213> Hepatitis C Virus <400> 35 Ala Phe Thr Ala Ser Ile Thr Ser Pro Leu 1 5 10 <210> 36 <211> 10 <212> PRT <213> Hepatitis C Virus <400> 36 Asp Phe Lys Thr Trp Leu Gln Ser Lys Leu 1 5 10 <210> 37 <211> 10 <212> PRT <213> Hepatitis C Virus <400> 37 Phe Phe Thr Glu Val Asp Gly Val Arg Leu 1 5 10 <210> 38 <211> 10 <212> PRT <213> Hepatitis C Virus <400> 38 Ser Phe Ala Ile Lys Trp Glu Tyr Val Leu 1 5 10 <210> 39 <211> 9 <212> PRT <213> Hepatitis C Virus <400> 39 Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val 1 5 <210> 40 <211> 10 <212> PRT <213> Hepatitis C Virus <400> 40 Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Leu Thr Val 1 5 10 <210> 41 <211> 8 <212> PRT <213> Hepatitis C Virus <400> 41 Ile Leu His Thr Pro Gly Cys Val 1 5 <210> 42 <211> 9 <212> PRT <213> Hepatitis C Virus <400> 42 Ser Met Val Gly Asn Trp Ala Lys Val 1 5 <210> 43 <211> 11 <212> PRT <213> Hepatitis C Virus <400> 43 Ser Leu Leu Ala Pro Gly Ala Lys Gln Asn Val 1 5 10 <210> 44 <211> 9 <212> PRT <213> Hepatitis C Virus <400> 44 Cys Ile Asn Gly Val Cys Trp Thr Val 1 5 <210> 45 <211> 9 <212> PRT <213> Hepatitis C Virus <400> 45 Leu Leu Cys Pro Ala Gly His Ala Val 1 5 <210> 46 <211> 10 <212> PRT <213> Hepatitis C Virus <400> 46 Lys Leu Val Ala Leu Gly Ile Asn Ala Val 1 5 10 <210> 47 <211> 10 <212> PRT <213> Hepatitis C Virus <400> 47 Thr Gly Ala Pro Val Thr Tyr Ser Thr Tyr 1 5 10 <210> 48 <211> 9 <212> PRT <213> Hepatitis C Virus <400> 48 Ser Leu Met Ala Phe Thr Ala Ala Val 1 5 <210> 49 <211> 10 <212> PRT <213> Hepatitis C Virus <400> 49 Leu Leu Phe Asn Ile Leu Gly Gly Trp Val 1 5 10 <210> 50 <211> 9 <212> PRT <213> Hepatitis C Virus <400> 50 Ile Leu Ala Gly Tyr Gly Ala Gly Val 1 5 <210> 51 <211> 9 <212> PRT <213> Hepatitis C Virus <400> 51 Ile Leu Asp Ser Phe Asp Pro Leu Val 1 5 <210> 52 <211> 10 <212> PRT <213> Hepatitis C Virus <400> 52 Arg Leu Ile Val Phe Pro Asp Leu Gly Val 1 5 10 <210> 53 <211> 9 <212> PRT <213> Hepatitis C Virus <400> 53 Gly Leu Gln Asp Cys Thr Met Leu Val 1 5 <210> 54 <211> 9 <212> PRT <213> Hepatitis C Virus <400> 54 Ala Leu Ala His Gly Val Arg Ala Leu 1 5 <210> 55 <211> 9 <212> PRT <213> Hepatitis C Virus <400> 55 Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile 1 5 <210> 56 <211> 9 <212> PRT <213> Hepatitis C Virus <400> 56 Ser Tyr Thr Trp Thr Gly Ala Leu Ile 1 5 <210> 57 <211> 9 <212> PRT <213> Hepatitis C Virus <400> 57 His Tyr Arg Asp Val Leu Lys Glu Met 1 5 <210> 58 <211> 9 <212> PRT <213> Hepatitis C Virus <400> 58 Trp Phe Met Trp Cys Leu Leu Leu Leu 1 5 <210> 59 <211> 9 <212> PRT <213> Hepatitis C Virus <400> 59 Ala Phe Tyr Gly Val Trp Pro Leu Leu 1 5 <210> 60 <211> 9 <212> PRT <213> Hepatitis C Virus <400> 60 Gln Phe Lys Gln Lys Ala Leu Gly Leu 1 5 <210> 61 <211> 10 <212> PRT <213> Hepatitis C Virus <400> 61 Gln Tyr Ser Pro Gly Gln Arg Val Glu Phe 1 5 10 <210> 62 <211> 10 <212> PRT <213> Hepatitis C Virus <400> 62 Gln Phe Lys Gln Lys Ala Leu Gly Leu Leu 1 5 10 <210> 63 <211> 11 <212> PRT <213> Human Immunodeficiency Virus <400> 63 Arg Tyr Leu Arg Asp Gln Gln Leu Leu Gly Ile 1 5 10 <210> 64 <211> 9 <212> PRT <213> Human Immunodeficiency Virus <400> 64 Ser Leu Tyr Asn Thr Val Ala Thr Leu 1 5

Claims

HLA 결합 모티프를 서열 중에 포함하고, 또한 C형 간염 바이러스 환자에게서 검출되는 항체에 의해 인식되는 것을 특징으로 하는 C형 간염 바이러스 유래 펩티드.
제 1 항에 있어서,

상기 펩티드가 서열 번호 1∼8, 16, 20 및 38 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 C형 간염 바이러스 유래 펩티드.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

서열 번호 1∼8, 16, 20 및 38 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 70% 의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 C형 간염 바이러스 유래 펩티드.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,

HLA-A2 또는 HLA-A24 구속성 세포 상해성 T 세포에 의한 인식성을 추가로 갖는 것을 특징으로 하는 C형 간염 바이러스 유래 펩티드.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 C형 간염 바이러스 유래 펩티 드를 함유하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제 5 항에 기재된 폴리펩티드의 아미노산 서열과 적어도 70% 의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제 5 항 또는 제 6 항에 있어서,

HLA-A2 또는 HLA-A24 구속성 세포 상해성 T 세포에 의한 인식성을 추가로 갖는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 C형 간염 바이러스 유래 펩티드, 또는 제 5 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 기재된 폴리펩티드를 코드하는 것, 또는 이들에 대하여 상보적인 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 뉴클레오티드.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 C형 간염 바이러스 유래 펩티드, 또는 제 5 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 기재된 폴리펩티드를 인식하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 항체 유사 활성 물질.
제 8 항에 기재된 뉴클레오티드를 함유하는 것을 특징으로 하는 벡터.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 C형 간염 바이러스 유래 펩티 드, 또는 제 5 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 기재된 폴리펩티드를 사용하여 세포 상해성 T 세포를 유도하는 것을 특징으로 하는 세포 상해성 T 세포의 유도 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 C형 간염 바이러스 유래 펩티드, 제 5 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 기재된 폴리펩티드, 제 8 항에 기재된 뉴클레오티드, 또는 제 9 항에 기재된 항체 또는 항체 유사 활성 물질을 사용하는 것을 특징으로 하는 간염 바이러스의 검출 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 C형 간염 바이러스 유래 펩티드, 제 5 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 기재된 폴리펩티드, 제 8 항에 기재된 뉴클레오티드, 또는 제 9 항에 기재된 항체 또는 항체 유사 활성 물질을 사용하는 것을 특징으로 하는 C형 간염 바이러스 감염증의 진단 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 C형 간염 바이러스 유래 펩티드, 제 5 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 기재된 폴리펩티드, 제 8 항에 기재된 뉴클레오티드, 또는 제 9 항에 기재된 항체 또는 항체 유사 활성 물질을 사용하는 것을 특징으로 하는 C형 간염 바이러스 감염증의 예방 또는 치료 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 C형 간염 바이러스 유래 펩티 드, 제 5 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 기재된 폴리펩티드, 제 8 항에 기재된 뉴클레오티드, 또는 제 9 항에 기재된 항체 또는 항체 유사 활성 물질을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
제 15 항에 있어서,

의약 조성물이 C형 간염 바이러스 백신인 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 C형 간염 바이러스 유래 펩티드, 제 5 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 기재된 폴리펩티드, 제 8 항에 기재된 뉴클레오티드, 또는 제 9 항에 기재된 항체 또는 항체 유사 활성 물질을 사용하는 것을 특징으로 하는 C형 간염 바이러스 감염증의 예후의 예측 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 C형 간염 바이러스 유래 펩티드, 제 5 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 기재된 폴리펩티드, 제 8 항에 기재된 뉴클레오티드, 또는 제 9 항에 기재된 항체 또는 항체 유사 활성 물질을 함유하는 것을 특징으로 하는 C형 간염 바이러스 감염증을 진단 또는 예후를 예측하기 위한 키트.