CN101230096B - 来源于c型肝炎病毒的肽 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种来源于C型肝炎病毒的肽，其特征为序列中含有HLA结合基序(binding-motif)，且由从C型肝炎病毒(HCV)患者体内检测出的抗体来识别。本发明的肽可用于C型肝炎病毒的诊断及C型肝炎的治疗、及预后的预测。

Description

来源于C型肝炎病毒的肽
本申请是申请日为2004年9月22日、申请号为200480027443.4(国际申请号为PCT/JP2004/014312)、发明名称为“来源于C型肝炎病毒的肽”的申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及可用于C型肝炎病毒感染的诊断及C型肝炎的治疗的C型肝炎病毒(HCV)肽。
更详细地说，本发明涉及HCV肽、含有HCV肽的多肽、编码HCV肽或前述多肽的核苷酸、或识别上述物质的抗体或类似抗体活性物质、含有前述核苷酸的载体、使用HCV肽或前述多肽诱导细胞毒性T细胞的方法、或使用HCV肽、前述多肽、前述核苷酸或前述抗体·类似抗体活性物质的C型肝炎病毒检测方法、C型肝炎的诊断、预防或治疗方法、及预后的预测方法，以及含有上述物质的C型肝炎治疗用药物组合物。
背景技术
病毒性肝炎主要为病毒经口感染的A型肝炎与通过血液感染的B型肝炎，除此以外，也有主要通过输血等感染的C型肝炎等。该C型肝炎是慢性化后转移为肝硬化或肝癌的机率非常高的疾病之一。
C型肝炎病毒(HCV)是属于黄病毒科的单链RNA病毒，日本有200万人以上、世界中有1亿7000万人为C型肝炎病毒感染者。
对该C型肝炎实施干扰素与利巴韦林(Ribavirin)并用治疗方法，但仅对3～4成的患者有效，对于大多数患者而言目前并无有效的治疗方法。因此，尽快开发出安全有效且简单的低成本诊断、及治疗方法成为强烈的社会需求。
有证据显示(WO89/04669)细胞性及体液性免疫应答两者在抑制HCV感染方面发挥主要作用。在过去的十多年间，众多研究发现高免疫原性的HCV肽，发现多种可诱导细胞性或体液性免疫应答的HCV肽(Hunziker et al.，Mol Immunol.2001 Dec；38(6)：475-84)。然而，这些肽并非都具有临床效果，实际上无论为预防还是为治疗，至今仍然皆没有有效的免疫治疗手段。认为主要原因在于上述肽的免疫原性较弱。
另外，本发明人等已提出数个由细胞毒性T淋巴细胞(CTL)识别出的抗原肽具有在活体内或活体外皆可导出细胞性免疫应答及体液性免疫应答双方的能力(Gohara et al.，J Immunother.2002 Sep-Oct；25(5)：439-44，Mine et al.，Clin Cancer Res.2001 Dec；7(12)：3950-62，Tanaka et al.，J Immunother.2003 Jul-Aug；26(4)：357-66，Mine et al.，Cancer Sci.2003 Jun；94(6)：548-56)。
而且，由细胞性及体液性免疫应答两者识别的HCV肽具有高于仅由细胞性免疫应答识别的肽的免疫原性。
作为顺应社会需求的新对策之一，因已累积可诱导细胞性免疫应答及体液性免疫应答两者的HCV肽与仅具有体液性免疫应答的肽相比，具有更高的免疫原性一连串认知，所以可举出特别指定上述肽的对策。
在确认上述肽的同时，调查其是否可作为抑制HCV感染的新型治疗方法及诊断手段的候补物质是有益的。
因此，本发明人等针对与被HLA-A2及HLA-A24限制性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)识别的肽具有反应性的IgG是否可从HCV感染者的血清中检测出进行调查，结果发现对几个CTL表位具有特异性的IgG与不同的HLA class I型或不同的HCV基因型无关，可由大多数HCV感染患者中检出。并且，由该结果得知，上述肽可提供以肽为基础的预防及治疗用新型方法，从而完成本发明。
因此，本发明的目的为提供一种HCV肽，其特征为，该HCV肽由细胞性免疫应答及体液性免疫应答识别、且具有高免疫原性。
发明内容
为了解决上述课题，本发明提供一种来源于C型肝炎病毒的肽，其特征为序列中含有HLA结合基序(binding-motif)，且由C型肝炎病毒患者的血中抗体来识别。
本发明的优选方案为提供一种具有序列表的序列号1～8、16、20及38中任一种表示的氨基酸序列的来源于C型肝炎病毒的肽、具有与该肽的氨基酸序列具有至少70％同源性的氨基酸序列的来源于C型肝炎病毒的肽、及还具有由HLA-A2或HLA-A24限制性细胞毒性T细胞产生的识别性的来源于C型肝炎病毒的肽。
本发明的其它方案为提供含有该来源于C型肝炎病毒的肽的多肽。作为该方案发明的优选方案，提供一种具有与该多肽的氨基酸序列具有至少70％同源性的氨基酸序列的多肽、及还具有由HLA-A2或HLA-A24限制性细胞毒性T细胞产生的识别性的多肽。
另外，本发明的另一方案为提供一种核苷酸，其为编码该来源于C型肝炎病毒的肽、或该多肽的核苷酸。
本发明的另一方案为提供一种抗体或类似抗体活性物质，其可以免疫学的方式识别该来源于C型肝炎病毒的肽、或该多肽。
作为本发明的另一方案，提供一种含有上述核苷酸的载体。
另外，本发明的另一方案为提供一种细胞毒性T细胞的诱导方法，其特征为使用编码该来源于C型肝炎病毒的肽、或该多肽的该核苷酸来诱导细胞毒性T细胞。
作为本发明的另一方案，提供一种C型肝炎病毒的检测方法，其使用该来源于C型肝炎病毒的肽、多肽、核苷酸、或抗体、或类似抗体活性物质。
另外，作为本发明的另一方案，提供一种C型肝炎等HCV感染相关疾病的诊断方法，其使用上述来源于C型肝炎病毒的肽、多肽、核苷酸、或抗体、或类似抗体活性物质。
而且，另一方案为提供一种C型肝炎等HCV感染相关疾病的治疗方法，其使用上述来源于C型肝炎病毒的肽、多肽、核苷酸、或抗体、或类似抗体活性物质。
本发明的另一方案为提供一种药物组合物，其含有上述来源于C型肝炎病毒的肽、多肽、核苷酸、或抗体、或类似抗体活性物质作为有效成分。另外，作为优选方案，提供一种药物组合物，该药物组合物为C型肝炎病毒疫苗。
作为本发明的另一方案，提供一种C型肝炎等HCV感染相关疾病的预后预测方法，其使用上述来源于C型肝炎病毒的肽、多肽、核苷酸、或抗体、或类似抗体活性物质。
本发明的另一方案为提供一种诊断C型肝炎或预后预测的试剂盒，其含有上述来源于C型肝炎病毒的肽、多肽、核苷酸、或抗体、或类似抗体活性物质。
附图说明
图1是表示本发明中以ELISA法得到的HCV感染患者血中的IgG测定结果的图。
图2是表示本发明中以ELISA法得到的HCV感染患者血中的IgG测定结果的图。
图3是表示本发明中在图1所示患者血清中的C-35肽反应性抗体的代表例的吸收·溶出实验结果的图。
图4是表示本发明中的6种来自HCV的HLA-A24结合肽(No.3、12、13、25、32、38)的CTL诱导结果的图。
图5是表示本发明中的来自HCV的HLA-A2结合性肽(No.40至No.57)的CTL诱导结果的图。
图6是表示本发明中由51Cr游离试验得到的肽刺激PBMC的细胞毒活性的代表性结果的图。
图7是表示本发明中由51Cr游离试验得到的肽刺激PBMC的细胞毒活性的代表性结果的图。
图8是表示本发明中由使用抗CD8单克隆抗体的抑制试验确认肽刺激PBMC的细胞毒性的HLA class I限制性的图。
图9是表示HCV感染患者血清中抗肽IgG的检测图。
图10是表示HCV感染患者血清中抗肽IgG的检测图。
图11是表示对HCV感染患者血清中的抗肽IgG的特异性进行调查的吸附试验结果的图。
图12是表示对HCV感染患者血清中的抗肽IgG的特异性进行调查的溶出试验结果的图。
图13是表示由肽刺激PBMC导致IFN-γ产生的图。
图14是表示由肽刺激PBMC导致IFN-γ产生的图。
图15是表示肽刺激PBMC的细胞毒性的图。
图16是表示肽刺激PBMC的细胞毒性的图。
图17是表示对表达NS5A的细胞的肽刺激PBMC的CTL活性的图。
图18是表示对表达NS5A的细胞的肽刺激PBMC的CTL活性的图。
图19是表示对表达NS5A的细胞的肽刺激PBMC的CTL活性的图。
图20是表示抗NS5A-2132IgG活性的特异性的图。
图21是表示由抗NS5A-2132IgG导致的细胞增殖阻碍分析结果的图。
图22是表示抗NS5A-2132IgG的ADCC活性分析结果的图。
图23是表示各种疾病的抗C-35抗体及抗NS5A-2132抗体的检测图。
图24是表示抗肽抗体的HLA或HCV基因型限制性的图。
图25是表示抗肽抗体的HLA或HCV基因型限制性的图。
图26是表示患者血清中抗NS5A-2132抗体的测定结果的图。
图27是表示患者血清中抗NS5A-2132IgG的测定结果的图。
图28是表示患者血清中抗NS5A抗体的水平及HCV RNA水平的图。
图29是表示世代研究(Cohort Study)的抗C-35抗体及抗NS5A-2132抗体的检测图。
图30是表示世代研究(Cohort Study)的抗NS5A-2132抗体的检测图。
图31是表示本发明中，由Luminex法得到的HCV感染患者血中IgG测定结果的图。
图32是表示本发明中由Luminex法得到的HCV感染患者血中IgG测定结果的图。
图33是表示使用本发明的肽的C型肝炎治疗过程的图。
图34是表示使用本发明的肽的C型肝炎治疗过程的图。
具体实施方式
本发明所述来源于C型肝炎病毒的肽是含有HLA结合基序(binding-motif)、且可由C型肝炎病毒患者的血中抗体识别出的HCV肽。
另外，本发明的HCV肽在其序列中含有HLA结合基序，即，HLA-A2或HLA-A24结合基序。且该HCV肽由细胞性免疫应答及体液性免疫应答识别，同时，显示较高的免疫原性。
作为上述HCV肽，例如可包含下述表1及表3所举出的肽。本发明中特别优选的HCV肽之一为包含具有以下氨基酸序列的HLA-A2结合性基序的肽：
C-35：YLLPRRGPRL(序列号1)
对于HCV感染者而言，对该肽的肽反应性IgG抗体的检测率及HCV感染症特异性分别为93％与100％，非常高。另外，本发明中特别优选的其它HCV肽为包含具有以下氨基酸序列的HLA-A24结合性基序的肽：
NS5A-2132：RYAPACKPL(序列号2)
E2-488：HYAPRPCGI(序列号3)
E1-213：VYEAADMIM(序列号4)
NS3-1081：VYHGAGSKTL(序列号5)
C-176：IFLLALLSCL(序列号6)
C-173：SFSIFLLALL(序列号7)
EYVLLLFLL(序列号8)
PYIEQGMQL(序列号16)
IFTITKILL(序列号20)
SFAIKWEYVL(序列号38)
特别是NS5A-2132，对于多数HLA-A24阳性患者而言，可诱导细胞性免疫及体液性免疫两者。
本发明的HCV肽也可为与该肽的氨基酸序列具有至少70％、优选为80％或80％以上、更优选为90％或90％以上同源性的肽。
另外，本发明的HCV肽也可以进一步含有由HLA-A2或HLA-A24限制性细胞毒性T细胞(CTL)识别的肽。由在细胞内制造的抗原蛋白质在细胞内分解出的肽构成的、可与该HLA结合的抗原肽中，每个HLA型均在该序列内存在基序(motif)，细胞毒性T细胞(CTL)可识别该抗原肽与HLA的复合体来破坏HCV感染细胞。
本发明的多肽在该氨基酸序列中含有上述本发明的肽的氨基酸序列，该氨基酸的总数并无特别限定。另外，在本发明的多肽中，超过构成该肽的氨基酸的其余氨基酸位于该肽的氨基酸N-末端及/或C-末端侧、或上述两侧。因此，该多肽具有与上述肽的功能及作用实质相同的功能及作用。需要说明的是，本说明书中，即使仅记载“肽”时，只要无特别否定时，均应当理解为包含“多肽”。
具有如上所述地定义的氨基酸序列的肽可使用下述方法得到：一般的化学合成法，蛋白质分子酶分解法，使用进行了转化、使编码目标氨基酸序列的碱基序列表达的宿主的基因重组技术等。
采用化学合成法制造作为目标的该肽时，可依据一般的肽化学中公知的惯用方法进行制造，例如使用肽合成机由固相合成法合成。如此得到的粗肽可由蛋白质化学中一般使用的纯化方法、例如盐析法、极限过滤法、逆相色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法等而纯化。
另一方面，以基因重组技术生产所希望的该肽时，例如可以将编码上述合成的目标氨基酸序列的DNA片段插入适当的表达载体中，使用该表达载体对微生物或动物细胞实施转化，培养得到的转化体，从而得到所希望的该肽。作为可使用的表达载体，可使用该技术领域内公知的质粒、病毒载体等。
作为该肽生产技术中使用表达载体的宿主细胞转化方法，可使用公知方法，例如氯化钙法、磷酸钙共沉淀法、DEAE葡聚糖法、脂质转染(Lipofectin)法、电穿孔法(electroporation)等，可依据所使用的宿主细胞进行适当选择。得到的肽的纯化可采用上述纯化法对从培养后的培养液中回收的细胞提取液或培养上清液进行纯化。
作为该发明的其它方案之一的核苷酸，包括含有上述来源于C型肝炎病毒的肽或上述多肽的寡核苷酸或聚核苷酸，包括核糖核苷酸或去氧核苷酸。另外，该核苷酸也可以利用本领域的已知方法进行改变。该核苷酸的改变例如包含公知的标记、甲基化、“caps”、由类似物取代1个或1个以上天然核苷酸、核苷酸内改变等。核苷酸内改变可举出例如非离子性改变(例如，甲基磷酸、磷酸三酯、磷酰胺酯等)、离子性改变(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、例如蛋白质(例如，核酸水解酶、毒素、抗体、信号肽等)的修饰部分的改变，利用螯合剂(例如金属、硼等)的改变等。
上述核苷酸序列可提供一种被编码在HCV的基因组中的HCV抗原的肽及多肽序列，另外，可以提供用作诊断试验或疫苗成分的有用的肽。
一旦获得本发明的核苷酸，就可构筑核苷酸探针及肽，上述核苷酸探针及肽在诊断HCV感染相关疾病方面，或筛选血液中或血液制剂中的HCV感染方面是有用的。由该核苷酸序列可合成例如24至30个核苷酸或更长的DNA寡聚物。该核苷酸还可作为用于检测受试者血清中的HCV RNA、或用于筛选血液或血液制剂中HCV存在的探针而使用。
另外，该核苷酸序列可设计、生产出作为诊断对HCV的抗体存在的试药也有用的HCV特异性肽。且对于来自该序列的纯化肽的抗体，也可用于检测HCV感染者及HCV感染血液制剂中的HCV抗原。
作为本发明的另一方案之一的抗体包括来自该C型肝炎病毒的肽、对该多肽具有反应性的嵌合抗体、改变抗体、单价抗体、Fab、F(ab’)2、Fab’、单链Fv(scFv)蛋白质以及单一结构域抗体。另外，该抗体可以免疫学的方式识别该肽或该多肽。
作为本发明的另一方案之一的载体为含有该核苷酸、可以将所选择的宿主细胞转化的构筑物，可以在该宿主中表达不同种类的编码序列。该表达载体可为克隆用载体或插入用载体任一。
作为克隆用载体例如可使用质粒、病毒(例如腺病毒质粒载体)等。另外，该克隆用载体是可转化宿主细胞、且具有在细胞内进行核苷酸复制能力的复制子(例如，质粒、染色体、病毒、粘粒等)。
另一方面，插入用载体虽在宿主细胞中不发挥复制子的作用，但其是为了稳定地转化宿主而具有将驻留物插入宿主中的复制子(典型例为染色体)内的能力的载体。
作为本发明的其它方案之一，包括通过使用该肽诱导以HCV细胞作为目标的细胞毒性T细胞的诱导方法。本发明的诱导方法为，例如在表达HLA-A2的细胞中添加该肽，使其表达在HLA-A2上，以由HLA-A2表达该肽的细胞刺激T细胞后，诱导该T细胞转化为CTL。该方法中所使用的HLA-A2表达细胞可由HCV患者的血液中采集，但也可在非HLA-A2表达细胞中导入编码HLA-A2的基因而制成。因此，本发明的该肽不仅可用于HCV检测及诊断，也可作为C型肝炎病毒相关疾病的疫苗等药物组合物使用。
另外，如上所述地诱导出的CTL因以HCV感染细胞作为目标，攻击该HCV感染细胞，因此，可与该肽同样地用作细胞治疗法等的药物组合物。
而且，作为本发明的其它方案的该来源于C型肝炎病毒的肽、多肽、核苷酸及/或抗体、类似抗体活性物质可用于检测、诊断HCV感染。
HCV的检测及HCV相关疾病的诊断，例如利用与编码该肽的核酸序列的相互作用及/或反应性，根据该肽存在的检测、对应核酸序列存在量的检测、在该肽的个体中活体分布的确定/或来自个体的检体中存在量的确定来进行。换言之，可通过将该肽作为标记物进行检定来进行HCV的检测及HCV相关疾病的诊断。另外，该测定可使用公知的测定方法进行，作为这种测定方法，例如可举出利用抗原抗体反应系统、酶反应系统、PCR反应系统等的方法。
HCV相关疾病的治疗效果的确认及预后的预测可通过监测罹患HCV相关疾病的受试者体内具有对该肽的反应性的抗体的血中浓度来进行。特优选测定出受试者血中的抗C-35IgG或抗NS5A-2132IgG的水平。
作为本发明的另一方案的药物组合物例如可举出疫苗。疫苗由来源于C型肝炎病毒的肽、多肽及/或核苷酸组成，适当含有医学上可接受的助剂及/或载体。作为助剂可使用可强化免疫应答的助剂，例如freund的不完全助剂、氢氧化铝胶等。另外，作为载体例如可使用PBS、蒸馏水等稀释剂、生理盐水等。
本发明的药物组合物可根据其使用方式，例如通过口服、静脉给药或皮下给药等非口服或经皮途径进行给药。作为其剂型例如可举出片剂、颗粒剂、软胶囊剂、硬胶囊剂、液剂、油剂、乳化剂等。该药物组合物的给药量，可依据给药患者的症状等适当改变，一般而言成人每日给药量以该肽量计可以为0.1～10mg，给药间隔可以为数日或数月一次。
本说明书中所引用的所有专利及参考文献内容皆为本说明书的一部分。另外，作为本案所要求的优先权的基础的日本专利申请2003-330258号说明书及附图的内容皆引用作为本案说明书的一部分。
实施例
由实施例更详细地说明本发明。但这些实施例仅为更具体说明本发明所举例，本发明并不限定于以下的实施例。
需要说明的是，以下实施例所使用的氨基酸的简称如下。
A为丙氨酸、C为胱氨酸、D为天门冬氨酸、E为谷氨酸、F为苯丙氨酸、G为甘氨酸、H为组氨酸、I为异亮氨酸、K为赖氨酸、L为亮氨酸、M为蛋氨酸、P为脯氨酸、R为精氨酸、S为丝氨酸、T为苏氨酸、V为缬氨酸、Y表示酪氨酸。
实施例1：与HCV感染者血清中的HCV肽具有反应性的IgG的检测
肽
使用具有来自HCV基因型1b蛋白质的保存区域的HLA-A2结合性基序或HLA-A24结合性基序的合成肽(如表1)。作为阴性对照组使用具有HLA-A2结合性基序的来自HIV的肽。上述肽均使用市售品，其纯度由逆相高压液相色谱法进行分析的结果为90％或90％以上。
表1
  No   肽名   改变名   区域   序列 序列号   HCV患者(n＝12)   健康人(n＝10)
  阳性   阳性
  人数   ％   人数   ％
  3   1bA24-2132   NS5A-2132   NS5A   RYAPACKPL   2   12   100   1   10
  4   1bA24-717   E2-717   E2   EYVLLLFLL   8   2   17   0   0
  5   1bA24-1100   NS3-1100   NS3   MYTNVDQDL   9   0   0   0   0
  6   1bA24-1773   NS4A-1773   NS4A   QYLAGLSTL   10   0   0   0   0
  7   1bA24-790   E2-790   E2   LYGVWPLLL   11   0   0   0   0
  8   1bA24-1031   NS3-1031   NS3   AYSQQTRGL   12   0   0   0   0
  9   1bA24-834   NS2-834   NS2   HYKLFLARL   13   0   0   0   0
  10   1bA24-1292   NS3-1292   NS3   TYATYGKFL   14   1   8   0   0
  11   1bA24-1266   NS3-1266   NS3   AYMSKAHGI   15   6   50   0   0
  12   1bA24-488   E2-488   E2   HYAPRPCGI   3   9   75   0   0
  13   1bA24-213   E1-213   E1   VYEAADMIM   4   6   50   0   0
  14   1bA24-1716   NS4B-1716   NS4B   PYIEQGMQL   16   1   8   0   0
  15   1bA24-1767   NS4B-1767   NS4B   NFISGIQYL   17   0   0   0   0
  16   1bA24-910   NS2-910   NS2   PYFVRAHGL   18   0   0   0   0
  17   1bA24-1727   NS4A-1727   NS4A   QFKQKAIGL   19   3   25   0   0
  18   1bA24-885   NS2-885   NS2   IFTITKILL   20   5   42   0   0
  19   1bA24-135   C-135   C   GYIPIVGAPL   21   1   8   0   0
  20   1bA24-631   E2-631   E2   MYVGGVEHRL   22   0   0   0   0
  21   1bA24-932   NS2-932   NS2   HYVQMALMKL   23   5   42   0   0
  22   1bA24-947   NS2-947   NS2   TYVYDHLTPL   24   7   58   0   0
  23   1bA24-1854   NS4B-1854   NS4B   GYGAGVAGAL   25   2   17   0   0
  24   1bA24-1243   NS3-1243   NS3   AYAAQGYKVL   26   2   17   0   0
  25   1bA24-1081   NS3-1081   NS3   VYHGAGSKTL   5   6   50   0   0
  26   1bA24-787   E2-787   E2   AYALYGVWPL   27   2   17   0   0
  27   1bA24-617   E2-617   E2   HYPCTVNFTI   28   4   33   0   0
  28   1bA24-1417   NS3-1417   NS3   YYRGLDVSVI   29   2   17   0   0
  29   1bA24-2146   NS5A-2146   NS5A   TFLVGLNQYL   30   2   17   0   0
  30   1bA24-822   NS2-822   NS2   VFVGLILLTL   31   4   33   0   0
  31   1bA24-1556   NS3-1556   NS3   EFWESVFTGL   32   0   0   0   0
  32   1bA24-176   C-176   C   IFLLALLSCL   6   7   58   0   0
  33   1bA24-837   NS2-837   NS2   LFLARLIWWL   33   0   0   0   0
  34   1bA24-848   NS2-848   NS2   YFITRAEAHL   34   1   8   1   10
  35   1bA24-1792   NS4B-1792   NS4B   AFTASITSPL   35   0   0   0   0
  36   1bA24-1990   NS5A-1990   NS5A   DFKTWLQSKL   36   1   8   0   0
  37   1bA24-2121   NS5A-2121   NS5A   FFTEVDGVRL   37   1   8   0   0
  38   1bA24-173   C-173   C   SFSIFLLALL   7   7   58   0   0
  39   1bA24-711   E2-711   E2   SFAIKWEYVL   38   1   8   0   0
  40   1bA2-35   C-35   C   YLLPRRGPRL   1   12   100   0   0
  41   1bA2-132   C-132   C   DLMGYIPLV   39   0   0   0   0
  42   1bA2-178   C-178   C   LLALLSCLTV   40   1   8   0   0
  43   1bA2-220   E1-220   E1   ILHTPGCV   41   3   25   0   0
  44   1bA2-363   E2-363   E2   SMVGNWAKV   42   0   0   0   0
  45   1bA2-401   E2-401   (HVR)   SLLAPGAKQNV   43   0   0   3   30
  46   1bA2-1073   NS3-1073   NS3   CINGVCWTV   44   0   0   0   0
  47   1bA2-1169   NS3-1169   NS3   LLCPAGHAV   45   1   8   2   20
  48   1bA2-1287   NS3-1287   NS3   KLVALGINAV   46   1   8   0   0
  49   1bA2-1406   NS3-1406   NS3   TGAPVTYSTY   47   1   8   0   0
  50   1bA2-1789   NS4B-1789   NS4B   SLMAFTAAV   48   0   0   0   0
  51   1bA2-1807   NS4B-1807   NS4B   LLFNILGGWV   49   0   0   0   0
  52   1bA2-1851   NS4B-1851   NS4B   ILAGYGAGV   50   0   0   1   10
  53   1bA2-2252   NS5A-2252   NS5A   ILDSFDPLV   51   0   0   0
  54   1bA2-2692   NS5B-2692   NS5B   RLIVFPDLGV   52   1   8   0   0
  55   1bA2-2727   NS5B-2727   NS5B   GLQDCTMLV   53   2   17   1   10
  56   1bA2-150   C-150   C   ALAHGVRAL   54   0   0   1   10
  57   1bA2-168   C-168   C   NLPGCSFSI   55   0   0   1   10
  60   1bA24-2422   NS5B-2422   NS5B   SYTWTGALI   56   0   0   0   0
  61   1bA24-2482   NS5B-2482   NS5B   HYRDVLKEM   57   3   25   1   10
  62   1bA24-2990   NS5B-2990   NS5B   WFMWCLLLL   58   7   58   0   0
  63   1bA24-789   E2-789   E2   AFYGVWPLL   59   0   0   0   0
  64   1bA24-1727   NS4B-1727   NS4B   QFKQKALGL   60   1   8   0   0
  65   1bA24-2613   NS5B-2613   NS5B   QYSPGQRVEF   61   0   0   0   0
  66   1bA24-1727   NS4B-1727   NS4B   QFKQKALGLL   62   3   25   0   0
切断值为1.83。
表2
  No.   40
  阳性率
 HCV感染症相关疾病   60   56(93.3％)
 B型肝炎病毒感染者   24   0(0％)
 B型肝炎病毒疫苗接种者   10   0(0％)
 健康人   27   0(0％)
 自身免疫疾病患者   22   0(0％)
 HTLV-1感染者   10   8(80％)
 HIV感染者   3   3(100％)
 总数   156   67
  C-35
 检测率   93.3％
 HCV特异性   88.5％
 OD率
  P＜0.001
检测率按切断值为阳性的患者的数目计算(平均±3SD)。
NS5A-2132为0.202，C-35为0.13。
统计解析以χ2试验进行。
ELISA
血清中的肽特异性IgG由ELISA测定。首先将各肽溶解于二甲基亚砜(DMSO)，于-80℃保存。将肽用含有作为交联剂的二琥珀酰亚胺基辛二酸酯(DSS)的0.1M碳酸钠/碳酸氢钠溶液稀释。在ELISA平板中，使肽按20μg/孔在4℃下反应一夜而结合。孔以0.05％Tween20-PBS(PBST)清洗3次，平板以Block-Ace(注册商标)密封，于4℃下放置一晚。将血浆或血清样品用0.05％的Tween20-BlockAce分别稀释100、200及400倍，每孔添加100μl所得的各样品。样品于37℃下培养2小时后，将平板用PBST清洗9次，每孔添加100μl稀释1000倍的兔子抗人类IgG(γ链特异性)，并于37℃下培养2小时。再以PBST清洗9次后，每孔添加100μl稀释100倍的与老鼠抗兔子IgG共价键合的西洋芥末过氧化酶·葡聚糖聚合物，将平板于室温下培养40分钟。清洗平板后，每孔添加100μl四甲基联苯胺基质溶液，添加2.0M磷酸使反应停止。切断值由健康者的光密度对照组的平均±3SD算出。
肽特异性IgG的吸收及溶出
将每孔100μl的血浆或血清样品以0.05％Tween20-Block Ace(注册商标)稀释，使固定在平板的孔中的肽(每孔20μg)于37℃下吸收2小时。此操作重复3次后，利用ELISA测定上清液中的肽特异性IgG水平。将在初次吸附中结合于肽固定平板上的抗体用各孔为30μl的5M NaCl/50mM柠檬酸缓冲液(pH3.0)(以1.0M Tris-HCl的0.05％Tween20-Block Ace(pH7.5)进行中和)进行溶出，利用ELISA测定溶出的部分的肽特异性IgG水平。
肽特异性CTL测定
肽特异性CTL的检测中采用的方法可使用本领域的惯用方法。将PBMC添加至U底型96孔微量培养平板的各孔中，直至每孔含1×105个细胞，与10μM的肽同时于200μl的培养基中进行培养。该培养基的组成为45％RPMI-1640、45％AIM-V(注册商标)、10％牛胎血清(FCS)、100U/ml的干扰素2(IL-2)、与1mM MEM非必须氨基酸溶液。培养第3天、第6天、第9天时各除去一半培养基，换上含有所对应的肽(20μg/ml)的新培养基。培养第12天采集培养后的细胞，进行对应的肽或作为阴性对照组的HIV肽中任一种产生对预先附着的CIR-A2402细胞或T2发生应答的干扰素γ(IFN-γ)的能力的试验。对于各肽，使用4个孔，进行2次测试。所得的值减去对HIV肽发生应答的本底IFN-γ的产生。对于抑制测试，肽反应性CTL使用CD8分离试剂盒进行纯化，该肽特异性IFN-γ的产生在20μg/ml的抗HLAclass I(W6/32，IgG2a)单克隆抗体、抗CD8(Nu-Ts/c，IgG2a)单克隆抗体或抗HLA class II(H-DR-1，IgG2a)单克隆抗体中的任一种的存在下进行测定。从所得的值中减去本底IFN-γ的产生。
统计
其值以平均值+/-SD表示。统计分析使用Mann-Whitney U检定或标准试验来进行。p＜0.05的值有统计学意义。
对HCV肽的抗体检测
对于12名HCV感染患者与10名健康者(HD)的血清，测定其对62种肽产生反应的IgG水平(表1)。对各肽的抗体阳性率如表1所示。其结果发现多个与HCV感染者的血中IgG进行高比率反应、且几乎不与健康人血清反应的肽。
例如，No3的NS5A-2132(相当于HCV的NS5A蛋白质的第2132号至第2140号，以下相同故省略)、No11(NS3-1266)、No12(E2-488)、No13(E1-213)、No22(NS2-947)、No25(NS3-1081)、No32(C-176)、No38(C-173)、No40(C-35)、No62(NS5B-2990)等。由代表性的ELISA法所得的HCV感染患者的血中IgG测定结果如图1及图2所示。
图1所示的患者血清中检测出对C-35的IgG抗体。
图2的(A)-(D)所示的4名患者血清中分别检测出NS5A-2132(A)、NS3-1081(B)、E2-488及E1-213(C)、C-176及C-173(D)反应性IgG抗体。这些肽反应性抗体的肽特异性可由吸收及溶出试验加以确认。
以图1所示的患者血清中的C-35肽反应性抗体的吸收·溶出实验结果作为代表例示于图3。该抗体虽被C-35吸收，但未被作为无关系的肽的NS5A-2252吸收(图3上段)。而且该抗体由C-35吸收部分溶出(图3下段)。
表1中C-35肽反应性抗体于HCV感染者中为100％，而健康人中为0％，显示高HCV特异性。HCV的C-35肽的序列与各种病毒，例如HIV-1的tet蛋白质(第54至第58号的氨基酸序列)或env蛋白质(5-9、158-162、717-727的氨基酸序列)显示部分同源性。另外，HTLV-1的各种蛋白质(pol 724-755、rex 5-9、rex 310-313、tax 70-74等)皆显示同源性。针对HCV感染症相关疾病60例(慢性C型肝炎22例、肝硬化20例、肝癌18例)、B型肝炎病毒感染者24例、B型肝炎病毒疫苗接种者10例、健康人27例、自身免疫疾病患者22例、HTLV-I感染者10例、及HIV感染者3例、共计156例进行双盲检定调查C-35肽反应性抗体。其结果如表2所示。由该结果得知，C-35肽反应性抗体的HCV特异性及检测率分别为88.5％及93.3％。
肽特异性CTL活性的诱发
将6种HLA-A24结合肽(No3、12、13、25、32、38)及18种HLA-A2结合肽(由No40至No57)与HLA-A24或HLA-A2阳性的HCV感染者各5名的末梢血单核细胞(PBMC)进行培养。作为对照组，将该PBMC与HIV肽进行培养。对上述培养PBMC，调查对脉冲对应的肽的C1R-A2402细胞或T2细胞发生应答的IFN-γ产生能力。其结果为6种HLA-A24结合肽(No3、12、13、25、32、38)可由10名HLA-A24阳性HCV患者的PBMC诱导出CTL(图4)。另外，来自HCV的HLA-A2结合性肽(No40至No57)可由5名HLA-A2阳性HCV患者的PBMC诱导出CTL(图5)。
而且，由肽刺激PBMC的细胞毒活性可采用51Cr游离试验加以确认。其代表性结果如图6及图7所示。
图6表示由来自HCV的HLA-A24结合性肽(No3、12、13、25、32、38)从HLA-A24阳性HCV患者PBMC诱导的CTL的细胞毒活性。对附着诱导肽的C1R-A2402细胞(图中以C1RA2402表示)的细胞毒作用，与作为对照组的附着HIV肽的C1R-A2402细胞(图中以C1RA2402HIV表示)相比显著高。
图7表示由来自HCV的HLA-A2结合性肽(No40、41)从HLA-A2阳性HCV患者末梢血PBMC诱导的CTL的细胞毒活性。对附着诱导肽的T2细胞(图中以T2表示)的细胞毒作用，与对照组的附着HIV肽的T2细胞(图中以T2HIV表示)相比为显著高。
由结果得知，这些PBMC对预先填装了对应肽(作为阴性对照组的HIV肽除外)的C1R-A2402及T2细胞显示有意差水平的细胞毒性。
该细胞毒性的HLA class I限制性使用抗CD8单克隆抗体的抑制试验来确认(图8)。图8表示利用CTL活性的抗CD8抗体进行抑制的代表例。由来源于HCV的HLA-A2结合性肽(No40)由HLA-A2阳性HCV患者PBMC诱导出的CTL细胞毒活性可被抗CD8抗体抑制，但未被抗CD4或对照组的抗CD14抗体抑制。
实施例2：对HLA-A24阳性HCV感染患者血清中的HCV肽具有反 应性的IgG检测
受试者
在更大范围内，对HLA-A24阳性的HCV感染患者，检测对HCV肽具有反应性的IgG。60名HCV1b+患者采用第2代或第3代免疫测试进行判断，抗HCV抗体(Ab)为血清阳性。患者血清中的HCV的基因型采用RT-PCR进行判定。血清取样时的患者诊断通过生化学分析、超音波检查、计算机连动断层摄影、及组织学观察来进行。诊断结果如下所示：慢性肝炎(CH，n＝24)、肝硬化(LC，n＝18)、及肝细胞癌(HCC，n＝18)。作为阴性对照，使用有正常肝功能，无肝炎病毒病历的20名健康提供者(HD)的血清样品。
肽及肽反应性抗体的测定
使用来自HCV1b蛋白质保存良好的区域、基于与HLA-A24分子的高结合中心(Bioinformatics and Molecular Analysis Section，NIH，Bethesda，MD)选择的44种合成肽。作为阴性对照组使用具有HLA-A24结合基序的来自HIV的肽(RYLRDQQLLGI(序列号63))。结合评分及序列如表3所示。为了筛选肽对血清IgG的反应性，使用由BioSyntehsis(Lewisville，TX)或SynPep(Dublin，CA)购得的上述脱盐等级(＞70％)的肽。之后的实验使用经纯化的肽(＞90％)。肽特异性IgG的血浆水平由酶抗体法(ELISA)测定。血浆样品的抗肽IgG的特异性试验利用肽反应性IgG的吸收及溶出来进行。
肽特异性CTL的测定
在肽特异性CTL前体细胞的检测中使用的方法如Hida等(CancerImmunol Immunother 2002；51：219-228)所记载的内容。阻碍试验使用20μg/ml的抗HLA class I(W6/32，IgG2a)、抗CD8(Nu-Ts/c，IgG2a)、抗CD4(Nu-Th/i，IgG1b)、及抗HLA-class II(H-DR-1，IgG)单克隆抗体。
对由NS5A基因进行了转染的细胞的肽刺激PBMC的CTL活性
NS5A、HLA-A2402及HLA-A2601的cDNA分别利用RT-PCR由Huh7(NNU50-1)细胞、C1R-A2402细胞及KE4-CTL细胞得到，在表达载体pCR3.1(Invitrogen，SanDiego，CA)中进行克隆(cloning)。Huh7(NNU50-1)细胞株是来自感染HCV1b的细胞株的复制子细胞，由NS3表达NS5B的蛋白质(Kishine et al.，Biochem Biophys ResCommun 2002；293：993-999)。其次，将100ng的NS5A、HLA-A2402或NS5A、及HLA-A2601cDNA(作为阴性对照组)混合在含有0.6μl的Fugene6(Roche Molecular Biochemicals，Indianapolis，IN)的100μl的Opti-MEM(Invitrogen)中，进行30分钟的培养。其次将100μl的混合物添加于COS-7细胞(1×104细胞)中，将其培养6小时。将100μl含有20％FCS的RPMI-1640培养基添加到混合物中，培养COS-7细胞2天，加入NS5A 2132-2140刺激PBMC(2×105细胞/孔)。培养18小时后，取出100μl的上清液，对3孔进行ELISA测定得到IFN-γ浓度。为了制造出稳定的转染子细胞株，将pCR3.1-NS5A或pCR3.1-HLA-A3101(阴性对照)中的任一种使用Gene Pulser(BioRAD，Richmond，CA)，在C1R-A2402细胞子，利用电穿孔法(electroporation)进行转染。将上述细胞在新霉素(G418)的存在下培养30～40天，回收新霉素抗性细胞。转染子中的NS5A蛋白质的表达由使用抗NS5多克隆抗体(Abcam Limited，Cambridge，UK)进行蛋白质印迹法分析。
增殖阻碍及抗体依赖性细胞性细胞毒(ADCC)
将Huh7细胞株在平底96孔微量培养平板的孔中，于各种血清存在下培养24、48及72小时。培养后以细胞计数试剂盒-8(10μl/孔)(Dojindo，Japan)计算Huh7细胞。为了进行ADCC测定，将由HLA-A24阳性的HD新分离出的PBMC，在含有各种患者或HD(作为阴性对照)的不活化血清(56℃，30分钟)的10％FCS及RPMI-1640培养基中预培养1.5小时。将C1R-A2402细胞及C1R细胞(作为阴性对照)与NS5A2132-2140肽(10μM)一起培养2小时，以Na2 51CrO4进行1.5小时的放射性标记，经清洗后作为目标细胞使用。将肽刺激PBMC于96U底微量培养平板的孔中以40、20及10比1的效应子与目标细胞之比(E/T)，与目标细胞一同进行培养。在37℃培养6小时后，回收无细胞上清液，测定ADCC活性(Shomura，et al.，Br J Cancer 2004；90：1563-1571)。
统计学
统计学分析使用标准t检定及Mann-Whitney U检定进行。P＜0.05的值有统计学意义。
对HCV-肽的体液性免疫应答的检测
为了筛选对肽的体液性免疫应答，对感染HCV-1b的12名患者的血浆，测定对44种肽的各IgG反应性水平。使用10名HD的血浆作为阴性对照组。肽反应性IgG的水平利用ELISA测定连续稀释的血浆样品，得到各样品的吸光度(OD)。将1∶100的血浆稀释的上述肽的切断值作为0.18OD{10名HD平均(0.08)+2SD(0.05×2)}。对NS5A-2132、C-176、E2-488、E1-213、C-173、及NS3-1081肽为有意义水平(1∶100的血清稀释下＞0.18OD)的IgG反应性在12名患者的血浆中分别可以检测出12、11、10、9、8及5名(图9)。如预测所述，上述肽中的任一种对10名HD的血浆均不具有反应性。对肽特异性IgG的肽反应性归纳如表3所示。
表3.对HCV限制性肽及肽特异性IgGa)的反应性
  编号   区域   肽   序列编号   对肽特异性IgG的反应性
  结合评分b)   患者(n＝12)   HD(n＝10)
  1   C 135-144   GYIPLVGAPL   21   504   1   0
  2   C 173-182   SFSIFLLALL   7   24   8   0
  3   C 176-185   IFLLALLSCL   6   36   11   0
  4   E1 213-221   VYEAADMIM   4   37.5   9   0
  5   E2 488-496   HYAPRPCGI   3   60   10   0
  6   E2 617-626   HYPCTVNFTI   28   75   2   0
  7   E2 631-640   MYVGGVEHRL   22   420   0   0
  8   E2 711-720   SFAIKWEYVL   38   20   1   0
  9   E2 717-725   EYVLLLFLL   8   432   2   0
  10   E2 787-796   AYALYGVWPL   27   200   2   0
  11   E2 789-797   AFYGVWPLL   59   20   0   0
  12   E2 790-798   LYGVWPLLL   11   200   0   0
  13   NS2 822-831   VFVGLILLTL   31   30   2   0
  14   NS2 834-842   HYKLFLARL   13   60   0   0
  15   NS2 837-846   LFLARLIWWL   33   36   0   0
  16   NS2 848-856   YFITREAHL   34   30   1   1
  17   NS2 885-893   IFTITKILL   20   20   3   0
  18   NS2 910-918   PYFVRAHGL   18   24   0   0
  19   NS2 932-941   HYVQMALMKL   23   396   3   0
  20   NS2 947-956   TYVYDHLTPL   24   300   2   0
  21   NS3 1031-1039   AYSQQTRGL   12   200   0   0
  22   NS3 1081-1090   VYHGAGSKTL   5   200   5   0
  23   NS3 1100-1108   MYTNVDQDL   9   336   0   0
  24   NS3 1243-1252   AYAAQGYKVL   26   200   2   0
  25   NS3 1266-1274   AYMSKAHGI   15   75   2   0
  26   NS3 1292-1300   TYSTYGKFL   14   200   1   0
  27   NS3 1417-1426   YYRGLDVSVI   29   50   2   0
  28   NS3 1556-1565   EFWESVFTGL   32   40.32   0   0
  29   NS4B 1716-1724   PYIEQGMQL   16   36   1   0
  30   NS4B 1727-1735   QFKQKAIGL   19   20   3   0
  31   NS4B 1727-1735   QFKQKALGL   60   20   1   0
  32   NS4B 1727-1736   QFKQKALGLL   62   20   1   0
  33   NS4B 1767-1775   NFISGIQYL   17   36   0   0
  34   NS4B 1773-1781   QYLAGLSTL   10   300   0   0
  35   NS4B 1792-1801   AFTASITSPL   35   28   0   0
  36   NS4B 1854-1863   GYGAGVAGAL   25   280   2   0
  37   NS5A 1990-1999   DFKTWLQSKL   36   26.4   1   0
  38   NS5A 2121-2130   FFTEVDGVRL   37   24   1   0
  39   NS5A 2132-2140   RYAPACKPL   2   480   12   1
  40   NS5A 2146-2156   TFLVGLNQYL   30   43.2   2   0
  41   NS5B 2442-2451   SYTWTGALI   56   50   0   0
  42   NS5B 2482-2491   HYRDVLKEM   57   46.2   3   1
  43   NS5B 2613-2622   QYSPGQRVEF   61   132   0   0
  44   NS5B 2990-2998   WFMWCLLLL   58   30   3   0
a)12名HCV-1b+患者血清中肽特异性IgG水平利用ELISA进行测定。决定切断值为0.18。
b)对HLA-A24分子的肽结合评分使用Bioinformatics andMolecular Analysis Section，NIH，Bethesda，MD(http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind)进行检索。
就具有90％或90％以上纯度的上述6种肽、及阴性对照肽对由60名HCV1b+患者(CH，n＝24；LC，n＝18；及HCC，n＝18)及20名HD的血清得到的各血清样品的反应性进行试验(图10)。
对上述各样品的100∶1稀释值进行制图。IgG(OD值)的平均值±SD如下所述：NS5A-2132(0.48±0.36)、E2-488(0.18±0.19)、E1-213(0.10±0.21)、NS3-1081(0.036±0.14)、C-176(0.09±0.14)及C-173(0.04±0.13)。*表示Mann-Whitney U检定得到的P＜0.05。对NS5A-2132、E2-488、E1-213、或C-173具有反应性的IgG的平均水平比HD高，且有统计学意义，但在NS3-1081或C-176的情况下并非如此。对NS5A-2132、E2-488、E1-213、C-173、NS3-10810、及C-176肽显示有意义水平的反应性的IgG(1∶100的血清稀释下＞0.101OD)在接受试验的60名患者血浆中可分别得到57(95％)、44(73％)、28(47％)、23(38％)、21(35％)、及17(28％)的检测结果。相对于此，所有20名HD的血清均未检测出有意义水平的IgG(图10)。
其次，对上述各肽具有反应性的IgG的肽特异性利用吸收及溶出试验加以确认。使各血清样品在37℃下被对应的肽或无关系的肽(HIV；作为阴性对照组使用)中的任一种吸收3次，利用ELISA测定出肽特异性IgG(图11)。溶出试验中，用对应的肽或无关系的肽溶出第一次吸收后结合在肽固定化平板上的IgG分子后，利用ELISA测定出溶出部分中的肽特异性IgG的水平。对于代表性结果，3次测定的OD值平均值±SD如图所示(图12)。*表示两边标准t检定得到的P＜0.05。
如预测所示，对6种肽的各IgG虽被所有对应的肽吸收，但未被无关系的肽(HIV肽)吸收。而且，该IgG由对应的肽从结合部分溶出，但未被无关系的肽溶出。综合这些结果可知，与各肽具有反应性的IgG对来自HCV1b的肽具有特异性。
肽特异性细胞性免疫应答的诱导
将由感染HCV1b的HLA-A24阳性患者(n＝12，6名CH，3名LC，3名HCC)及未感染HCV的HLA-A24阳性的HD(n＝5)得到的PBMC，与6种肽(纯度＞90％)或对照HIV肽一同培养13天，研究应答以对应的肽实施了脉冲的C1R-A2402细胞的IFN的产生。将由HLA-A24阳性HCV1b+的患者(n＝12)及HD(n＝5)得到的PBMC用6种肽在4个孔(15×104/孔)中进行刺激。在培养的第14天，回收各孔所得的肽刺激PBMC(80-120×104/孔)后，分成等量的4份。分别对其中的2个就与以对应肽实施了脉冲的C1R-A2402细胞发生应答、产生IFN-γ的能力进行试验。剩下的2个则以使用阴性对照肽(HIV)的细胞进行试验。减去作为背景的对HIV肽(＜50pg/ml)发生应答所产生的IFN-γ。*表示利用两边标准t检定得到的P＜0.05。
C-173、C-176、E1-213、E2-488、NS3-1081、及NS5A-2132的HCV肽在12名患者中分别有1、3、4、6、2及7名(图13、14)、及在5名HD中分别有0、0、1、1、1及1名诱导出有意义水平(p＜0.05)的IFN-γ产生(数据未示出)。上述6种肽之中，NS5A-2132肽在12名患者中有7名的PBMC及接受试验的60名HCV1b+患者中有57名的血清中，由细胞性免疫及体液性免疫被识别。
上述肽刺激PBMC的细胞毒性利用6小时的51Cr游离测试加以确定(图15)。将利用IFN-γ产生测试(上述)显示阳性应答的肽刺激PBMC，在体外仅在IL-2中进行培养，使其增殖。然后，利用标准的6小时51Cr游离测试，对利用对应的肽或HIV肽(阴性对照)实施了脉冲的C1R-A2402细胞的细胞毒性，以3种不同的E/T细胞比进行试验。代表结果如图所示。其值以特异性溶解％的平均值±SD表示。*表示利用两边标准t检定得到的P＜0.05。以NS5A-2132、E2-488、或E1-213肽刺激的PBMC对预先负荷对应的肽的C1R-A2402细胞显示有意义水平的细胞毒性，但在HIV肽中并未显示(图15)。
将图15所示实验中使用的肽刺激PBMC，在20μg/ml的抗HLA-class I(W6/32，IgG2a)、抗HLA-class II(H-DR-1，IgG2a)、抗CD8(Nu-Ts/c，IgG2a)、及抗CD4(Nu-Th/i，IgG1)单克隆抗体(mAb)的存在下，对以对应的肽实施了脉冲的C1R-A2402细胞的细胞毒性进行试验。抗CD14(JML-H14，IgG2a)mAb作为阴性对照组使用。以3种不同的E/T比进行6小时51Cr游离测试。其值以特异性毒％的平均值±SD表示(图16)。*表示利用两边标准t检定得到的P＜0.05。
以3种肽分别实施了脉冲的C1R-A2402细胞的细胞毒性虽被抗HLA-class I(W6/32)或CD8单克隆抗体(mAb)阻碍，但未被试验的其它mAb中的任一种阻碍。这表示肽特异性细胞毒性主要以由CD8+T细胞产生的HLA-class I限制性为媒介(图16)。相对于此，以残余的3种肽(C-173、C-176、或NS3-1081)刺激的PBMC中无法测出上述细胞毒性(数据未示出)。
然后，将以NS5A及HLA-A2401基因实施了暂时性共转染的COS-7细胞作为目标细胞使用，由此对NS5A-2132肽刺激PBMC是否识别出自然过程中产生的肽进行调查。作为阴性对照，使用以NS5A及HLA-A2601基因实施了暂时性共转染的COS-7细胞。对由患者#1及#2得到的NS5A-2132肽刺激PBMC可识别出以NS5A及HLA-A2401基因实施了暂时性共转染的COS-7细胞作为目标细胞、产生IFN-γ的活性进行试验。作为阴性对照，使用以NS5A及HLA-A2601基因进行了暂时性共转染的COS-7细胞。其值以E/T比20∶1的3次测试的IFN-γ产生％的平均值±SD表示(图17)。*表示利用两边标准t检定得到的P＜0.05。
如预测所述，由显示CTL活性(图13)的患者#1及#2得到的肽刺激PBMC可识别经NS5A及HLA-A2401基因共转染的COS-7细胞，产生有意义量的IFN-γ(图17)。相对于此，上述PBMC并不与作为阴性对照使用的具有NS5A及HLA-A2601基因的COS-7细胞反应。另外，由不显示CTL活性的其它2名患者(#3及#4)得到的肽刺激PBMC也未因经NS5A及HLA-A2401基因共转染的COS-7细胞的识别而产生有意义量的IFN-γ(无数据)。
接下来，对以NS5A基因稳定地进行转染、用作目标细胞的C1R-A2402细胞的细胞毒性进行试验。以NS5A基因稳定地进行了转染的C1R-A2402细胞的HLA-A24分子的表达、及以HLA-A31基因(阴性对照)稳定地进行了转染的C1R-A2402细胞的HLA-A31分子的表达，使用FACScan进行流动细胞计算分析加以确认(图18)。
然后，以由NS5A基因稳定地进行了转染的C1R-A2402细胞作为目标细胞的细胞毒性由6小时51Cr游离测试进行试验。将以阴性对照基因(HLA-A3101)稳定地进行了转染的C1R-A2402细胞作为阴性对照使用，将以NS5A-2132肽实施了脉冲的C1R-A2402细胞作为阳性对照使用。以3个不同的E/T比进行6小时51Cr游离测试。其值以特异性溶解的％平均值±SD表示。*表示利用两边标准t检定得到的P＜0.05。以NS5A-2132肽实施了刺激的PBMC，与对以阴性对照基因进行了转染的C1R-A2402细胞的细胞毒性比较，显示比用NS5A基因进行了转染的C1R-A2402细胞、及用对应的肽预先进行了脉冲的未转染C1R-A2402细胞双方更高水平的细胞毒性(图19)。这些结果暗示NS5A-2132肽刺激PBMC可良好地识别HCV1b+细胞的HLA-A2402分子上自然过程产生的肽。
对抗NS5A-2132IgG做进一步研究
为了更好地了解抗肽IgG的生物学作用的可能性，利用吸收及溶出测定，对抗NS5A-2132IgG是否可识别全NS5蛋白质进行调查。NS5A-2132及HIV肽分别作为阳性对照及阴性对照使用(吸收试验及溶出试验的详细内容如上所述)。结果抗肽IgG在全NS5蛋白质中未被吸收，也未被溶出(图20)。这表示该肽IgG未与全NS5蛋白质反应。
接下来，将Huh7细胞在患者血清(由2名血清具有高水平抗NS5A-2132活性的HCV1b+患者得到的血清)的存在下培养3天。作为阴性对照组，使用由2名HD得到的血清及FCS。可生存的Huh7(NNU50-1)细胞数目以细胞计算试剂盒8(10μl/孔)计算，算出3次测定所得的平均值。任一试验血清在上述培养条件下均不阻碍Huh7(NNU50-1)细胞的增殖(图21)。另外，对抗NS5A-2132IgG是否具有媒介ADCC活性的能力进行调查。将由HLA-A24阳性的HD新分离出的PBMC，在上述4种不活化血清的存在下，对用该肽预先进行了脉冲的C1R-A2402细胞的细胞毒性进行试验。然而，这些条件下任一试验血清均未显示ADCC活性(图22)。
实施例3.HCV感染者的预后预测
受试者
血清为由1995年至2002年的世代研究(Cohort Study)中具有HCV相关疾病的33名患者所得。33名患者的详细调查结果如表4所示。具有慢性肝炎(CH，n＝68)、肝硬化(LC，n＝43)、及肝细胞癌(HCC，n＝52)的病患血清也用于分析。这些患者在最初血清采样时，利用生化学及组织学所见、超音波检查、及计算机连续断层摄影进行诊断。抗HCV抗体由化学发光酶免疫测试(CLEIA)试剂盒(LumipulseII HCV，Fujirebio Inc.，Tokyo，Japan)、或第2代或第3代酶免疫测试试验(SRL，Tokyo，Japan)进行测定。血清中的HCV-RNA可使用RT-PCR(SRL，Tokyo，Japan)进行检测。HCV基因型是由患者血清中的HCV以RT-PCR(SRL，Tokyo，Japan)直接定序来决定的。也由未感染HCV的受试者中得到血清。包括具有自身免疫疾病的24名受试者(6名全身性红斑性狼疮患者、1名白塞病患者及17名异位性皮肤炎患者)、17例B型肝炎病毒(HBV)感染(HBV表面抗原为阳性)、3名感染人类免疫不全病毒(HIV)的患者、及10例人类T细胞白血病病毒型I(HTLV-1)感染。作为阴性对照，对由不具HBV肝炎病毒或无疫苗接种经历、具有正常肝脏功能的37名受试者得到的血清进行试验。
表4：1995年及2002年的诊断结果
  1995   n   2002   n   性别(M/F)   年龄±SD
  CH   17   CH   12   3/9   67.7±11.9
  LC   3   2/1   59.0±7.9
  有CH；HCC   1   -/1   82
  有CH；HCC   1   1/-   65
  LC   1   LC   1   -/1   69
  ASC   4   CH   1   -/1   75
  ASC   1   -/1   76
  HCV感染的过去病历   2   -/2   57.7±6.36
  HCV感染的过去病历   11   HCV感染的过去病历   11   2/9   68.8±10.71
  合计   33   33   8/25   67.1±10.6
CH，慢性肝炎；LC，肝硬化；HCC，肝癌；
ASC，无症候性健康载体
肽
纯度为90％或90％以上的以下2个肽由BIOSYNTHESIS(Lewisville，TX)购得；HCV1b中心蛋白质35-44(YLLPRRGPRL(序列号1)；可诱导HLA-A2限制性CTL活性)，及HCV1bNS5A蛋白质2132-2140(RYAPACKPL(序列号2)；可诱导HLA-A24限制性CTL活性)。作为阴性对照，使用具有HLA-2A结合基序(SLYNTVATL(序列号64))及HLA-A24结合基序(RYLRDQQLLGI(序列号63))的来源于HIV的肽。
对肽具有反应性的抗体测定
肽特异性IgG的水平可由酶抗体法(ELISA)测定。简言之，将各肽溶解于二甲亚砜(DMSO)，-20℃下保存。将用含有作为化学交联剂的二琥珀酰亚胺二辛酸酯(DSS)(PIERCE，Rockford，1L)的0.1M碳酸缓冲液稀释的肽(20μg/孔)结合于ELISA平板上。以0.05％Tween20-PBS(PBST)将孔清洗3次。平板以Block Ace(Yukijirushi，Tokyo，Japan)在4℃下封阻一晚。将血清样品以0.05％Tween20-BlockAce稀释100倍、200倍、400倍，将100μl/孔的样品加入各孔中。37℃下培养2小时后，将平板用PBST清洗9次，与100μl/孔的1000倍稀释兔子抗人类IgG(γ链特异性)(DAKO，Glostrup，Denmark)一同在37℃下培养2小时。清洗9次后，将100μl/孔的1∶100稀释抗兔子IgG结合西洋芥末过氧化酶·葡聚糖聚合物(En Vision，DAKO)添加于各孔中，将平板在室温下培养40分钟。清洗后，添加100μl/孔的四甲基联苯胺基质溶液(KPL，Guildford，UK)，加入1.0M磷酸使反应停止。
统计学
统计学分析使用χ2检定进行，p＜0.05的值有统计学意义。
交叉反应性、HLA限制性、及基因型限制性
研究对来源于HCV1b的肽具有反应性的2种抗体的交叉反应。研究60名HCV患者、及未含在世代研究中的患者(CH，n＝22，LC，n＝21，及HCC，n＝17)的血清对中心的35-44(C-35)及NS5A的2132-2140(NS5A-2132)的肽的反应性。也取得具有自身免疫疾病的24名受试者、HBV感染的17例及HTLV-1感染的10例受试者的血清。将由37名HD取得的血清作为阴性对照使用。连续稀释的血清样品的肽反应性IgG水平利用ELISA进行测定。给出各样品的吸光度(OD)值。给出稀释为100∶1的血清的OD代表性结果。切断值设定为0.093(由HD的OD平均+2SD)。统计学分析使用χ2检定进行，p＜0.05的值有统计学意义。
结果检测出HCV阳性患者的56/60(93.3％)为有意义水平的抗C-35IgG，在3组(CH，LC，及HCC患者)之间的IgG水平不存在有意义差(图23)。除去HTLV-1患者，由其它组得到的血清对抗C-35抗体不显示阳性。对HTLV-1+受试者的8/10例的血清检测出较低、但是有意义水平的抗C-35IgG。检测出患者的45/60(75％)为有意义水平的抗NS5A-2132IgG。IgG水平在3组间，CH患者较高，LC为中等程度，HCC患者较低(p＜0.05vsCH)(图23)。对于由其它组得到的血清，进行试验的大部分病例的抗NS5A-2132IgG也显示阳性。而且3/37的HD的血清的抗NS5A-2132IgG也显示阳性。
接下来，对具有HCV相关疾病的29名病患研究HLA-class IA表达型、与抗C-35IgG或抗NS5A-2132IgG的水平间的相关性。HLA-class IA表达型可由标准血清学方法决定。9名患者为HLA-2A阳性、13名患者为A24阳性、及剩下7名患者为A2阴性，A24阴性。抗C-35及抗NA5A 2132利用标准ELISA测定，各患者100∶1的血清稀释时的OD值如图所示。任一抗体不管其HLA-class IA表达型的差异，均在大部分HCV感染者中被检出(图24)。
然后，对于HCV-1b(n＝29)、HCV-2a(n＝16)及HCV-2b感染(n＝3)的患者，使用双盲检定研究HCV基因型与抗C-35IgG或抗NS5A-2132IgG的水平间的相关性。HCV基因型可通过将患者血清中的HCV直接定序来决定。所有受试者的稀释100∶1时的结果如图25所示。抗C-35及抗NA5A 2132利用标准ELISA测定，各患者的100∶1的血清稀释时的OD值如图所示。切断值设定为0.093(由HD的OD平均+2SD)。
抗C-35抗体分别在26/30的HCV-1b、15/15的HCV-2a、及3/3的HCV-2b感染者中被检出。同样地抗NS5A-2132抗体分别在23/30的HCV-1b、10/16的HCV-2a、及3/3的HCV-2b感染者的血清中被检测出(图25)。这些结果表示，在HCV阳性患者中，不管HLA-class IA亚型的差异、及HCV基因型的差异，均可检出抗C-35抗体及抗NS5A-2132抗体双方。
以上的结果表示抗NS5A-2132抗体的水平与HCV感染个体的预后相关，但与抗C-35抗体并无关系。
然后，重新准备CH(n＝24)、LC(n＝22)、HCC(n＝26)、HD(n＝9)的血清，测定抗NS5A-2132IgG的水平(图26)。CH、LC、HCC及HD组的平均值±SD分别为0.51±0.24、0.27±0.20、0.26±0.23、0.08±0.07。LC及HCC患者的抗NS5A-2132抗体的水平明显低于CH患者(p＜0.05，高于HD。为了将上述结果与利用标准第3代测试进行测定的结果进行比较，对于所有血清使用市售的试剂盒(第3代测试，SRL)测定抗HCV抗体的水平。其水平以指数表示(左边柱状图)。以指数表示的抗HCV水平与抗NS5A-2132水平之间的关系如右边柱状图表示。利用第3代测试测定的抗HCV抗体水平在3组间并无有意义的差异(CH，10±2.7；LC，11±1.4；HCC，11±1.1)(图27)。而且，对于这些血清使用市售的试剂盒(SRL，Japan)测定HCV RNA水平。HCC患者的HCV RNA水平(360±269.6)比CH患者(610±347.3)或LC患者(610±246.4)低(p＜0.05)(图28)。然而，抗NS5A抗体的水平与HCV RNA水平之间并无明确相关性(图28)。
世代研究的结果
为了在各个水平下进一步调查抗NS5A-2132抗体与HCV阳性患者的预后的相关性，对1990年至2002年进行的每年筛选HCV感染居民的世代研究所得的样品进行2种抗体的血清水平研究。为了进行该研究，于1995年及2002年由相同个体取样2次，33名患者共计66份血清。1995年时上述33名患者的诊断为，CH(n＝17)、LC(n＝1)、无症候性载体(ASC)(n＝4)、及HCV感染的过去病例(自然康复个体)(n＝11)，2002年时为CH(n＝13)、LC(n＝4)、HCC(n＝2)、无症候性载体(ASC)(n＝1)、及HCV感染的过去病例(n＝13)。即，7年间26名患者中并未观察到疾病的进展，而剩下7名患者中则观察到疾病的进展(表4)。以1995年及2002年的100∶1血清稀释时测定的各病患中抗C-35抗体及抗NS5A-2132IgG的OD值如图29所示。如预测所述，33病例中的大部分，不论疾病状态如何，1995年测定的抗C-35抗体水平与2002年测定的水平几乎相等。相对于此，对于疾病进展的7名患者而言，1995年测定的抗NS5A抗体水平在2002年测定时减少。另一方面，对于疾病未进展的25例中的大部分而言，该值与2002年的测定值几乎相等。疾病进展的7名患者的血清中1995年的抗NS5A-2132抗体的中央值±SD(0.67±0.13)与2002年的测定值(0.27±0.11)相比有意义地高(p＜0.05)。
然后，将33名受试者分为5组(CH、LC、HCC、HCV感染的过去病例〔康复的个体〕，及ASC)，将2002年的100∶1血清稀释时的2种抗体的水平进行制图(图30)。统计学分析使用χ2检定进行。p＜0.05中有统计学意义。抗C-35抗体的水平在CH、LC及HCC组皆高，已痊愈的个体组变得非常低或无法检测出。另一方面，抗NS5A-2132抗体的水平在CH、康复个体及ASC组较高，LC组为中等程度，HCC患者最低(p＜0.05vsCH)。
实施例4：由luminex法检测与HLA-A24+HCV感染患者血清的 HCV肽具有反应性的IgG
使用认为灵敏度高于ELISA法的Luminex法，与实施例1相同，进行与HLA-A24+HCV感染患者血清的HCV肽具有反应性的IgG的检测。
对肽对微小珠子的结合
将肽分别如下所述地结合在依据制造者的指示将各萤光色素含有量识别编码化(以下称为颜色编码)的微小珠子(Luminex公司制，xMAP Multi-Analyte COOH Beads)上。在过滤平板的各孔中放入100μl经颜色编码化的未调制的微小珠子，经吸引后以清洗用缓冲液(磷酸缓冲液生理食盐水(PBS)(pH7.4±0.1)、Tween(注册商标)20(0.05％v/v))清洗2次后同时吸引各孔。接下来放入50μl 0.1M MES(2-吗啉代乙磺酸)缓冲液(pH7.0)，各孔添加各10μl的EDC(N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐)(1mg/ml/0.1M MES缓冲液(pH7.0))。在各孔内混合数百μl的肽(1mg/ml，0.1M MES缓冲液，pH7.0)与该经过清洗的微小珠子。然后，将与肽混合的微小珠子在暗处、室温下反应20分钟后，再在各孔中添加10μl EDC(1mg/ml/0.1M MES缓冲液(pH7.0))，在暗处、室温下使其反应20分钟，将该操作重复2次。吸引剩余液体后，在各孔中添加100μl 1Mtris-盐酸缓冲液(pH7.0)，在暗处、室温下使其反应15分钟。接下来，将各孔的珠子用上述清洗用缓冲液进行3次清洗，在Block-Ace(注册商标)中放入0.05％叠氮化钠后调整以保存用溶液进行回收。
微小珠子混合物的调制
调制各孔的微小珠子时，将在如上所述地经过颜色编码化的微小珠子上结合肽得到的珠子溶液放入过滤平板，使每孔中约有5000个微小珠子(各孔中1种珠子约1μl)。另外，混合10种等量的如上所述地调制的微小珠子，用上述清洗用缓冲液(PBS，TWEEN(注册商标)20(0.05％v/v))稀释至总量约25μl，调制珠子混合物。
样品的调制
使用血清。将血清使用反应用缓冲液(PBS(pH7.4±0.1)、Tween(注册商标)20(0.05％v/v)、牛胎血清白蛋白(BSA)10mg/ml)稀释至100～1000倍，分别调制100μl的血清稀释液。
抗肽抗体测定
作为生物素化二次抗体，将生物素化羊抗人类IgG(γ链特异性)用上述反应用缓冲液稀释后进行使用。作为萤光色素标记链霉抗生物素蛋白，将经PE(藻红素)标记的链霉抗生物素蛋白(SRPE)1mg/ml用上述反应用缓冲液稀释(1/50稀释)至20μl进行使用。
过滤平板的各孔中放入100μl上述清洗用缓冲液，继续吸引除去。该清洗操作进行2次。然后，在各孔中放入25μl上述珠子混合物，将该96孔的过滤平板用该清洗用缓冲液清洗2次。清洗后，在所有孔中分别放入100μl上述样品。接下来，封住过滤平板，在暗处、室温下使用平板震荡器(300rpm)震荡2小时后，进行吸引。继续在各孔中分别放入100μl上述清洗用缓冲液，吸引除去。该清洗操作进行3次。
然后，在各孔中分别放入100μl作为生物素化二次抗体的生物素化羊抗人类IgG(γ链特异性)，封住过滤平板，在暗处、室温下使用平板震荡器(300rpm)震荡1小时。然后，进行吸引，在各孔中分别放入100μl上述清洗用缓冲液，吸引除去。该清洗操作进行3次。
接下来，在各孔中分别加入100μl SRPE，封住过滤平板，在暗处、室温下使用平板震荡器(300rpm)震荡30分钟。然后进行吸引，在各孔中分别放入100μl上述清洗用缓冲液，吸引除去。该清洗操作进行3次。然后，在各孔中分别放入100μl该清洗用缓冲液，使用平板震荡器(300rpm)震荡2～3分钟后，将得到的50μl样品用萤光闪烁计数系统进行测定。结果如图31及32、及表5所示。
表5
No 肽名 改变名 区域 序列 序列号   HCV患者(n＝10)   健康人(n＝10)
  阳性   阳性
  人数   ％   人数   ％
  4   1bA24-717   E2-717   E2   EYVLLLFLL   8   6   60   2   20
  14   1bA24-1716   NS4B-1716   NS4B   PYIEQGMQL   16   6   60   1   10
  18   1bA24-885   NS2-885   NS2   IFTITKILL   20   9   90   2   20
  39   1bA24-711   E2-711   E2   SFAIKWEYVL   38   6   60   2   20
实施例5：使用来源于C型肝炎病毒的肽疫苗的HCV感染治疗
对HLA-A2阳性或HLA-A24阳性的HCV感染者，研究使用本发明的来源于C型肝炎病毒的肽的疫苗的抗病毒效果。受试者均为感染HCV1b、且对利用干扰素与利巴韦林的治疗无反应的患者。来源于C型肝炎病毒的肽C-35、NS5A-2132、E2-488、E1-213及NS3-1081在适合GMP的条件下合成、纯化、制成冻干粉末进行保存。C-35、NS5A-2132、E2-488及NS3-1081的肽溶解在少量的DMSO(1mg/10～25μl)中，E1-213溶解在7％碳酸氢钠注射液(碳酸氢钠)(1mg/15μl)中。分别以注射用生理食盐水进行稀释(1～2mg/ml)，通过0.22μm滤器灭菌。该溶液与等量助剂(Montanide ISA-51)混合，得到乳化剂注射剂。其中对HLA-A2阳性的3名受试者给予C-35注射剂，对HLA-A24阳性的5名受试者给予NS5A-2132注射剂。给药方式为2星期内，每次将含有0.3mg肽的乳化剂注射于侧腹部。持续监测HCVRNA的量及GOT、GPT、γ-GTP、AFP的值。
结果如图33及图34所示。由上述图可知，接受试验的受试者在疫苗给药开始后几乎全部出现HCV RNA的量显著降低，证明本发明的肽作为抗HCV疫苗是有效的。
产业上的利用性
本发明的来源于C型肝炎病毒的肽将HLA结合基序包含在其序列中，被与C型肝炎病毒具有反应的抗体识别，同时，还具有由HLA-A2或HLA-A24限制性细胞毒性T细胞的识别性。
因此，本发明的来源于C型肝炎病毒的肽可用作对HCV感染所引起的疾病有效的疫苗。
                        序列表
Figure S2008100809383D00331
Figure S2008100809383D00341
Figure S2008100809383D00351
Figure S2008100809383D00361
Figure S2008100809383D00371
Figure S2008100809383D00381

Claims (8)

1.一种来源于C型肝炎病毒的肽，所述肽被从C型肝炎病毒患者中检测出的抗体识别，该肽由序列号2表示的氨基酸序列构成。
2.如权利要求1所述的来源于C型肝炎病毒的肽，其特征为，该肽还具有利用HLA-A24限制性细胞毒性T细胞的识别性。
3.一种核苷酸，其特征为，该核苷酸编码如权利要求1或2所述的来源于C型肝炎病毒的肽。
4.一种载体，其特征为含有如权利要求3所述的核苷酸。
5.一种细胞毒性T细胞的诱导方法，其特征为使用如权利要求1或2所述的来源于C型肝炎病毒的肽在体外诱导出细胞毒性T细胞。
6.一种药物组合物，其特征为含有如权利要求1或2所述的来源于C型肝炎病毒的肽作为有效成分。
7.如权利要求6所述的药物组合物，其特征为，药物组合物为C型肝炎病毒疫苗。
8.一种诊断C型肝炎病毒感染症或预测预后的试剂盒，其特征为含有如权利要求1或2所述的来源于C型肝炎病毒的肽。
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