CN101696974B

CN101696974B - Hla抗体特异性检测方法及细胞盘与试剂盒

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Publication number: CN101696974B
Application number: CN 200910235570
Authority: CN
Inventors: 才新
Original assignee: Individual
Current assignee: Cai xin
Priority date: 2009-09-29
Filing date: 2009-09-29
Publication date: 2013-03-06
Anticipated expiration: 2029-09-29
Also published as: CN101696974A

Abstract

本发明涉及一种HLA抗体特异性检测方法及细胞盘与试剂盒，属于免疫检测领域。一种一种HLA抗体特异性检测方法，步骤如下：(1)待测血清分别与取自不同供体的外周血淋巴细胞进行抗体抗原反应，(2)检测抗体抗原反应的结果，(3)数据处理获得HLA抗体特异性；其特征在，通过对所取供体的选择来达到调整HLA抗原频率，使得测出来的PRA值比待测血清PRA值低，从而减少了由于HLA抗原重叠现象对HLA抗体特异性检测带来的限制，使本方法能够检测具有更高PRA值血清的HLA抗体特异性，且能够对待测血清进行一次性筛查其HLA抗体特异性，使HLA抗体特异性检测方法向前跨越式地进步，造福大众。

Description

HLA抗体特异性检测方法及细胞盘与试剂盒

技术领域

本发明涉及医学检测方法及试剂，特别是一种HLA抗体特异性检测方法及细胞盘与试剂盒。

背景技术

在临床医学上，一些疾病会引发肾脏病变，当病人的肾脏疾病发展到只能依靠透析来维持生命时，则称其为终末期肾病(end stage renal disease，ESRD)。对于终末期肾病病人，肾移植是一种长期有效的治疗方法。人们在进行器官移植的研究中发现，与移植有关的抗原为HLA-I类和-II类抗原，如表1所示，为目前HLA配型中需要做配型检测五个HLA基因位点的HLA抗原：即HLA-A，-B，-Cw，-DR，-DQ位点的HLA抗原(R.Holdsworth，C.K.Hurley，S.G.E.Marsh，M.Lau，H.J.Noreen，J.H.Kempenich，M.Setterholm and M.Maiers，The HLAdictionary 2008：a summary of HLA-A，-B，-C，-DRB1/3/4/5，and-DQB1 alleles and theirassociation with serologically defined HLA-A，-B，-C，-DR，and-DQ antigens，Tissue Antigens(73)，95-170，2009))。

表1：HLA抗原表(HLA-A，-B，-Cw，-DR，-DQ位点)

HLA-A	HLA-B	HLA-B(连续上一列)	HLA-Cw	HLA-DR	HLA-DQ
						1	5	53	1	1	1
2	7	54	2	103	2
						3	8	55	3	2	3
9	12	56	4	3	4
						10	13	57	5	4	5
11	14	58	6	5	6
						19	15	59	7	6	7
23	16	60	8	7	8
						24	17	61	9	8	9
25	18	62	10	9
						26	21	63		10
28	22	64		11
						29	27	65		12

30	35	67	13
				31	37	70	14
32	38	71	15
				33	39	72	16
34	40	73	17
				36	41	75	18
43	42	76	51
				66	44	77	52
68	45	4005	53
				69	46	7801
74	47	8101
				8001	48	8201
	49	Bw4
					50	Bw6
	51
					52

由于输血和妊娠等原因，在暴露于异体HLA抗原后，病人体液免疫系统可以产生抗HLA抗体。肾移植初步成功的关键取决于受体血液中是否含有HLA抗体以及HLA抗体的特异性，即如果患者血液中没有可以识别供者HLA抗原的抗体，则更可能移植成功，因此，为了保证移植肾的存活，移植前对受体进行HLA抗体特异性检测，不仅是绝对必要的，而且有助于快速地找到适合的供体肾。准确灵敏的抗体检测分析方法能够预测并杜绝肾移植超急性排斥(hyperacute rejection)的发生，同时也可以显著地降低肾移植术后早期急性排斥(early acuterejection)的发生。

人们为了提高抗体检测的灵敏性，随着抗体检测生物技术的发展，逐步出现了抗体抗原吸附剂测定(ELISA)和流式点阵仪(Luminex)两种检测方法。两种检测方法早期使用从细胞表面获取的HLA抗原，进而过渡到使用人工合成的HLA抗原(recombinant HLA antigen)去检测病人血清中的HLA抗体。目前国外主要使用Luminex xMAP微颗粒外裹人工合成的单一HLA抗原，在流式点阵仪上检测HLA抗体的特异性。这种方法使用从细胞株获取的天然HLA抗原(natural HLA antigen)或者使用人工合成的HLA抗原。ELISA和Luminex两种检测方法的优势是，一次操作可以检测多个待测标本，检测速度相对较快。然而，使用从细胞株提取的天然抗原或者使用人工合成抗原进行抗体检测也存在一些缺点。第一，从细胞株提取的天然抗原或者人工合成抗原黏贴到微颗粒表面和培养孔表面后，抗原的立体空间位置可能改变，直接影响到抗体识别抗原的灵敏性；第二，不同的微颗粒和培养孔表面人工合成抗原浓度很难保持相同，致使反应强度无法一致；第三，在从获取细胞株天然抗原或者制作人工合成抗原过程中，HLA抗原蛋白出现部分降解，裸露的非正常结构可以产生非特异性抗体结合；第四，人工合成抗原中氨基酸三维折叠形式的细微改变，也可以影响抗体对抗原的识别。以上诸多缺陷，致使两种方法的检测结果中存在着一些临床上无法解释的问题，这就要求在HLA抗体检测领域内尽快建立一种创新的以正常细胞为载体、以未加改变的天然抗原为基础的抗体特异性检测方法。

众所周知，天然抗原存在于有核细胞表面，其中最易获得的是T淋巴细胞和B淋巴细胞，其中T淋巴细胞表面携带I类HLA抗原，B淋巴细胞表面携带I类和II类两种HLA抗原。在HLA抗体检测发展过程中，惟一使用以淋巴细胞为载体和天然抗原的检测方法是补体依赖型淋巴细胞毒实验方法(complement-dependent cytotoxicity，CDC)。在临床上，该方法使用至今已经有几十年的历史了。在进行CDC测试时，待测血清中的HLA抗体能够识别淋巴细胞表面上的HLA抗原；通过补体的协同作用，可以杀伤淋巴细胞，进而依据细胞杀伤程度来判断抗体的特异性。然而，CDC检测方法存在三大致命问题。第一，根据补体介导的抗原抗体反应原理，依据显微镜下观察死亡淋巴细胞和正常细胞的比例，以判断抗体的存在，得出的抗体特异性非常局限，且当抗体浓度低时，病人虽然已被致敏但是没有足够的抗体量去杀死淋巴细胞，因此会得出假阴性结果，致使CDC方法的灵敏性较差；而在实际的肾移植过程中，只要患者体内存在抗移植物的HLA抗体，移植后HLA抗体浓度可以迅速上升，就很可能会引起急性排斥反应；第二，使用CDC方法检测HLA抗体时，由于大量高频率抗原的存在，细胞目录中存在大量抗原重叠(antigen masking)现象，即由于一些抗原的频率非常高，会导致细胞目录中大多数细胞反应呈阳性，这些阳性反应的细胞上还有其他HLA抗原，如果待测血清中含有多种HLA抗体时，呈阳性反应的细胞几乎占满整个细胞目录，CDC检测方法就无法找出抗体的特异性，因为其它低频率的HLA抗原会被高频率抗原的阳性反应所掩盖；第三，CDC方法是通过补体介导的抗原抗体反应原理，显微镜下观察死亡淋巴细胞的比例，以判断抗体的存在，而I类和II类抗体同时存在时，不能检测出II类抗体，同时要求细胞目录中的细胞必须是活细胞，否则难以测出阳性反应，因此细胞一旦丧失活性，就会导致检测假阴性。

HLA抗体特异性包括针对单一HLA抗原的抗体和针对交叉反应组(cross reactive group，CREG)的抗体。Takemoto等(1994)提出交叉反应组配型的概念，即由于某些HLA抗原氨基酸分子结构相近，HLA抗原分子之间具有公共抗原决定簇，可与同一种HLA抗体发生交叉反应，这些与同一种HLA抗体发生反应的HLA抗原决定簇称为交叉反应组；目前常规检测的I类HLA抗原可归纳为9个交叉反应组，如表2所示，摘自(Glenn E.Rodey，“HLA beyondtears：introduction to human histocompatibility”，the third and fourth chapters，2nd edition，2000)。

表2交叉反应组类型及各组所包含的抗原

对于查找抗体特异性，由于HLA抗原基因的多态性，每个HLA基因位点产生若干HLA抗原蛋白，在人群中找到HLA抗原完全相同的两个个体的概率非常小，但可通过与待测血清反应的I类HLA抗原与各交叉反应组中的HLA抗原类型进行比较，分析阳性反应的HLA抗原覆盖了哪些交叉反应组的抗原，从而找出抗体特异性。但是该方法也会受到天然细胞中抗原重叠现象的限制，当待测血清的HLA抗体比较复杂时以及高频率HLA抗原的存在，这两种因素会导致待测血清PRA值非常高，当达到某一个值时，如80％以上时，则难以查找出HLA抗体特异性。对于这一部分具有高PRA值的患者而言，需要花费更多的时间和费用去采用多种检测方法来检查HLA抗体特异性，如需要肾移植时，则只能采用一对一的交叉配型方法寻找合适的供体肾，增加了寻找匹配肾源的难度。

PRA值，指群体反应性抗体，即待测血清与随机供体群中每个供体的HLA抗原进行抗原抗体反应，呈阳性反应的供体数量与该随机供体群内个体总数的比例。

PRA测定值：指待测血清与测定方法所采用的每一个供体血清分别进行抗原抗体反应，呈阳性反应的供体数量与所采用的供体总数的比值。

发明内容

针对上述领域的不足，本发明提供一种HLA抗体检测方法及细胞盘，该方法基于天然的HLA抗原及荧光标记的抗原抗体反应，结合流式细胞仪检测，能够提高HLA抗体检测的灵敏性，并通过调整供体细胞目录中的HLA抗原频率，减少了抗原重叠现象对于查找HLA抗体特异性的限制，使该方法能够检测出具有更高PRA值血清的HLA抗体特异性，解决了一部分具有高PRA值的患者的HLA抗体检测难题，为该方法配套设计的细胞盘有助于提高检测HLA抗体特异性的效率。

一种HLA抗体特异性检测方法，步骤如下：

(1)待测血清分别与取自不同供体的外周血淋巴细胞进行抗原抗体反应，

(2)检测抗原抗体反应的结果，

(3)数据处理获得HLA抗体特异性；

所述外周血淋巴细胞包含T淋巴细胞和B淋巴细胞，所述淋巴细胞携带的HLA抗原包含HLA-A，-B，-Cw，-DR，-DQ位点的所有HLA抗原，所述HLA抗原的发生频率为：每种HLA抗原至少出现在两份供体细胞中，其中Bw4所附属的供体占供体总份数的50-55％，Bw6占50-55％，A1占10-15％，A2占25-30％，A3占15-19％，A11占5-15％，A24占10-20％，Cw7占25-30％，Cw9为20-25％；

所述数据处理指，依次记录所有供体的HLA抗原类型及其抗原抗体反应结果，比较阴性反应供体与阳性反应供体所包含的HLA抗原，在阳性反应供体所包含的HLA抗原中扣除阴性反应供体所包含的HLA抗原，再将余下的阳性反应供体所包含的I类HLA抗原与9种交叉反应组比较，找出所剩下的阳性反应供体覆盖的I类HLA抗原所包括的交叉反应组；再将余下的阳性反应孔所覆盖的II类HLA抗原与单一II类HLA抗原进行比较。

所述检测抗原抗体反应的结果采用荧光素标记抗原抗体反应中的淋巴细胞。

所述荧光素标记抗原抗体反应中的淋巴细胞指加入荧光素异硫氰酸标记的二抗和分别特异性标记T淋巴细胞和B淋巴细胞的两种荧光标记抗体；所述两种荧光标记抗体与所述异硫氰酸荧光素三者之间的荧光颜色不同。

所述特异性标记T淋巴细胞的荧光标记抗体为CD3-PerCP，所述特异性标记B淋巴细胞的荧光标记抗体为CD19-PE。

所述检测采用流式细胞仪进行检测。

所述不同供体的外周血淋巴细胞为60-200份。

所述不同供体的外周血淋巴细胞为96份。

一种HLA抗体特异性检测细胞盘，在96孔细胞培养板的反应孔中分别有取自于96个供体的外周血淋巴细胞，其特征在于：所述外周血淋巴细胞包含T淋巴细胞和B淋巴细胞，所述淋巴细胞携带的HLA抗原包含HLA-A，-B，-Cw，-DR，-DQ位点的所有HLA抗原，所述HLA抗原的发生频率为：每种HLA抗原至少出现在两份供体细胞中，其中Bw4所附属的供体占供体总份数的50-55％，Bw6占50-55％，A1占10-15％，A2占25-30％，A3占15-19％，A11占5-15％，A24占10-20％，Cw7占25-30％，Cw9为20-25％；

一种HLA抗体特异性检测试剂盒，包括上述细胞盘和用于HLA抗体特异性检测的试剂。

所述试剂指荧光素异硫氰酸标记的羊抗人二抗，CD3-PerCP和CD19-PE，阴性对照血清和阳性对照血清。

本发明的检测方法的原理是，通过待测血清与已知HLA抗原类型的一批供体进行抗原抗体反应，判断每个供体的反应结果，在阳性反应供体的HLA抗原中扣除阴性反应供体所包含的HLA抗原，阳性反应供体剩下的阳性HLA抗原就是待测血清的HLA抗体特异性。在这个原理下，由于这些供体覆盖了目前要检测的5个HLA位点的所有抗原，而供体之间会有HLA抗原的重叠，一些高频抗原甚至在50％以上的供体中重复出现，一旦待测血清的HLA抗体种类较多，且其中有抗这种高频率HLA抗原的抗体时，所有携带该抗原的供体都会呈阳性反应，而阳性反应的供体细胞上还携带其他未与HLA抗体反应的HLA抗原，这些HLA抗原属于假阳性反应，需要用阴性反应供体包含的HLA抗原来核对并扣除，如果由于高频率HLA抗原的原因导致阴性反应供体份额太低，也就无法完全扣除阳性反应供体携带的假阳性反应的HLA抗原，即高频率HLA抗原会限制对其他HLA抗体特异性的查找。本发明通过选择合适的已知HLA抗原类型的供体与待测血清进行反应，由于将携带高频率HLA抗原如，Bw4、Bw6、A1、A2、A3、A11、A24、Cw7、Cw9等HLA抗原的供体份额降低，因此，反应后，阳性反应的供体比例会比随机情况下测出来的降低，即PRA测定值低于PRA值，也即阴性反应的供体所覆盖的HLA抗原类型被人为地增加了，在阳性反应供体所覆盖的HLA抗原中能够扣除更多的假阳性反应的HLA抗原，使那些PRA值高于某一临界值的血清，在现有天然HLA抗原的方法检测不出HLA抗体特异性时，用本发明的方法却能够检测出结果，即能测出具有更高PRA值血清的HLA抗体特异性，最大限度降低了HLA抗原重叠对HLA抗体特异性检测的限制。在查找HLA抗体特异性中，将剩下的阳性HLA抗原与目前归纳的交叉反应组进行比较，从而将剩下的阳性HLA抗原划分为交叉反应组的成员和单一HLA抗原，这些交叉反应组和单一HLA抗原就是待测血清的HLA抗体特异性。由于所选的供体所携带的HLA抗原总体上覆盖了目前在HLA配型检测中检测的如表1所示的5个HLA位点下的所有HLA抗原，因此本方法所检测HLA抗体特异性是待测血清的完整的HLA抗体特异性。本发明的方法采取了天然抗原的优势，又极大限度地解决了由天然抗原所带来的抗原重叠问题，能对PRA值更高的血清进行HLA抗体特异性检测，而所选供体细胞包含的HLA抗原类型包括所有需配型的5个位点下的HLA抗原，能够对待测血清进行一次性筛查其HLA抗体特异性，使HLA抗体特异性检测方法向前跨越式地进步，造福大众。

为了验证本发明HLA抗原频率调整后，如表2所示的每个交叉反应组所代表的HLA抗体特异性的PRA测定值与PRA值的变化，本发明针对目前9种交叉反应组所代表的HLA抗体特异性进行模拟实验分析。模拟实验分析结果如表9及图4所示，那些含有高频HLA抗原的交叉反应组的PRA测定值比PRA值有所降低，而越是PRA值高的交叉反应组，其PRA测定值降低的幅度越大。从表9中看到，个别交叉反应组的PRA测定值比PRA值有所升高，这是因为在调整高频率HLA抗原的同时，为了保证这个细胞盘覆盖表1所示的所有抗原，因此，一些低频HLA抗原的供体比例被适当调高而引起的，本发明对抗原频率进行调整，主要目的在于人为地增加检测过程中阴性反应的比例，以使具有高PRA值的血清也能检测到HLA抗体特异性，因此那些个别PRA值低的交叉反应组的PRA测定值升高的变化并不影响达到本法的目的。

本发明的方法采用了天然HLA抗原来检查HLA抗体特异性，检测血清与供体细胞反应的结果时，可以采用本领域现有技术中的常用方法来实现。而本发明优选采用荧光标记抗原抗体复合物，由于所采用的淋巴细胞包括携带I类HLA抗原的T淋巴细胞和携带I、II类HLA抗原的B淋巴细胞，因此采用荧光素标记抗原抗体反应中的淋巴细胞指加入荧光素异硫氰酸标记的二抗和分别特异性标记T淋巴细胞和B淋巴细胞的两种荧光标记抗体；所述两种荧光标记抗体与所述异硫氰酸荧光素三者之间的荧光颜色不同，这样通过两两结合的荧光颜色判断每一个供体中是T细胞和/或B细胞发生了阳性反应，从而能够同时分析、检测I、II类HLA抗体特异性。

本发明进一步优选分别特异性标记T淋巴细胞荧光标记抗体为CD3-PerCP，特异性标记B淋巴细胞的荧光标记抗体为CD19-PE。两种荧光标记抗体常用、易得，稳定。

检测荧光值可以采用本领域常用的手段，本发明优选采用流式细胞仪检测荧光值，通过荧光反应强度值来判断抗原抗体反应，能清晰地分别检测到每份供体细胞上T细胞与B细胞的荧光强度，通过T细胞与B细胞的荧光值差异，能够精确判断B细胞上的II类HLA抗原是否结合了抗体而发出荧光，提高同时查找I、II类HLA抗体特异性的灵敏度，摈弃了CDC方法以补体介导的抗原抗体反应杀伤淋巴细胞来反映HLA抗体的特异性，对抗体的浓度没有要求，且对于T淋巴细胞与B淋巴细胞的活性也没有严格的要求，仅仅需要其表面的抗原具备结合活性即可。

本发明的方法所选的已知HLA抗原类型的供体份数，只要满足“HLA抗原包含HLA-A，-B，-Cw，-DR，-DQ位点的所有HLA抗原，所述HLA抗原的发生频率为：每种HLA抗原至少出现在两份供体细胞中，其中Bw4所附属的供体占供体总份数的50-55％，Bw6占50-55％，A1占10-15％，A2占25-30％，A3占15-19％，A11占5-15％，A24占10-20％，Cw7占25-30％，Cw9为20-25％；”这些条件即可。为了便于分析和寻找合适的供体，本发明优选60-200份，若份数太少，很难覆盖表1所示的所有抗原，如果份数太多，则检测和分析的工作量太大，检测工作的效率会很低，不适合现实需要。

本发明进一步优选96份供体，当选用流式细胞仪时，可以一次性检测所有供体的抗原抗体反应结果，简化了检测步骤。

本发明的另一贡献是提供一种细胞盘：将按本发明的检测方法中选择供体外周血淋巴细胞的方法选择96份外周血淋巴细胞做成细胞盘，细胞盘包含表1所列的HLA抗原。细胞盘载体是96孔细胞培养板，可直接用于流式细胞仪自动检测系统，提高检测效率，方便使用。

为了使本发明的检测方法与细胞盘得以良好的推广应用，提高实验便捷度，本发明的再一项贡献是将细胞盘做成试剂盒，试剂盒中还包括上述检测方法中所需用到的一些主要试剂。

总的来说，本发明的检测方法及细胞盘，创造性地调整供体细胞的抗原频率，使采用天然抗原时，高频率HLA抗原的抗原重叠现象对本方法的限制低于其他方法，即能检测那些PRA值较高的血清的抗体特异性，并集合了CDC细胞板与流式微颗粒方法的优点，摈弃了这些方法中存在的缺陷，使本发明的检测方法、细胞盘不仅仅能够一次性检测出I类和II类HLA抗体特异性，且检测过程相较于目前的CDC方法及基于ELISA反应的人工合成抗原包被的LAT，LATM板方法，具有便捷，灵敏，特异性好且低成本的特点，为肾移植研究及临床医疗提供了一种实用的辅助手段和工具。

本发明各步骤的原理如下：

1.荧光反应原理见图1：淋巴细胞(Ly，lymphocyte)表面带有多种HLA抗原。如果待测血清中含有HLA抗体，而且这些HLA抗体可以识别供体细胞表面多种抗原中的一种HLA抗原时，这些HLA抗体就可以特异地与HLA抗原结合。羊抗人免疫球蛋白的二抗通过识别HLA抗体的Fc片段而特异地结合到HLA抗体上，二抗上偶联有异硫氰酸荧光素，FITC，其显色为淡绿色；用CD3-Per-CP，绿色，标记T淋巴细胞；用CD19-PE，黄色，标记B淋巴细胞。三种不同颜色的荧光两两组合，用于检测T和B淋巴细胞上FITC的荧光强度。当某个反应孔中T和B淋巴细胞上的FITC荧光强度同时超过阴性对照时，说明待测血清中存在抗I类抗原的HLA抗体；当某个反应孔中B淋巴细胞上的FITC荧光强度超过阴性对照但是T淋巴细胞上的FITC荧光强度没有超过阴性对照时，说明待测血清中仅存在抗II类抗原的HLA抗体；当某个反应孔中T和B淋巴细胞上的FITC荧光强度同时超过阴性对照，同时B淋巴细胞上的FITC荧光强度非常高，且明显地超出T淋巴细胞上的FITC荧光强度，说明待测血清中同时存在抗I类和II类抗原的HLA抗体。

2数据分析：本发明中，通过待测血清分别与一系列已知HLA抗原配型、取自于正常人的外周血淋巴细胞中的T淋巴细胞和B淋巴细胞进行抗原抗体反应，并对反应产物进行双荧光标记，然后用流式细胞仪检测每份供体细胞中T淋巴细胞与B淋巴细胞荧光反应结果，通过初步比较两种细胞的荧光强度判断与该份供体细胞反应的HLA抗体是I类还是II类，或两类同时存在，如表。依次记录所有反应孔的HLA抗原类型及其荧光反应结果，比较阴性反应供体与阳性反应供体所覆盖的HLA抗原，在阳性反应供体所覆盖的HLA抗原中扣除阴性反应孔所覆盖的HLA抗原，再将剩下的阳性反应孔所覆盖的I类HLA抗原与表2所示的9种交叉反应组相比较，找出所述剩下的阳性反应孔所覆盖的I类HLA抗原包括在哪些交叉反应组中，这些交叉反应组就是待测血清的HLA抗体特异性；尽管II类HLA抗原频率也可能很高，但由于II类HLA抗原种类较少，因此通过简单的扣除法就可以找出阳性反应的II类HLA抗原，从而判断其对应的II类HLA抗体特异性。

3.调整抗原频率的目的：本发明通过调低了高频率抗原的份额后，PRA测定值自然会降低，即所选的供体中有更多的供体反应为阴性，通过统计阳性反应孔和阴性反应孔分别包含的抗原类型，当PRA测定值降低后，能够扣除更多在阳性反应孔中所包含的阴性反应抗原，缩小了查找真正有特异性反应的抗原的范围，便于在交叉反应组中找到该待测血清的HLA抗体特异性；同时将低频率抗原的供体细胞份额调高，并保证每种抗原至少在两个供体细胞中存在，这样保证了抗原反应有至少一次重复，提高检测的特异性，尽量排除假阳性。对比实验证明，本发明的方法与流式细胞仪筛选颗粒和流式点阵仪微颗粒方法相比，如表6、8所示，两者在HLA抗体检测的灵敏性和特异性上无显著差异。

4.用本发明的方法测PRA值：由于调整了细胞目录的HLA抗原频率，使PRA测定值与血清自身的PRA值不同，用本方法在临床HLA抗体检测报告中所报告的PRA值，是通过该方法检测到的HLA抗体特异性去与待测血清所来源的人群的HLA抗原资料库进行模拟抗原抗体反应而得到。

附图说明

图1.本发明的荧光标记及荧光反应示意图

图2A.I类HLA抗原表及反应分析结果记录。

斜体数字表示HLA抗体特异性

经扣除阴性重叠HLA抗原后，待测血清的I类抗体特异性包括A2，A23，A24，A68，A69，B57和B58，修正得到的PRA值为74％

图2B.II类HLA抗原表及反应分析结果记录。

斜体数字表示HLA抗体特异性

待测血清的II类抗体特异性是DR4，修正得到的PRA值为28％

图3.一份供体细胞在流式细胞仪检测抗体荧光强度示意图

上图左为淋巴细胞群的位置显示，上图右为T淋巴细胞群和B淋巴细胞群的位置显示。

中图左为T淋巴细胞上FITC荧光强度，图中浅蓝色是阴性对照，深蓝色为T淋巴细胞上FITC的荧光强度，说明血清中有HLA抗体结合到T淋巴细胞上。

中图右为中图左的统计学数据，荧光强度为median(中位数)栏下的数据，以M1表示阴性对照的荧光强度，以M2表示抗体的荧光强度。

下图左和下图右具有与中图左和中图右相同的功能，用于显示B淋巴细胞上FITC的荧光强度。

图4抗原频率调整对交叉反应组PRA测定值的影响

横坐标表示交叉反应组类型，纵坐标表示各交叉反应组所对应的抗体分别与随机人群及细胞盘反应的PRA测定值，白色柱图代表与随机人群的HLA抗原反应得出的PRA测定值，近似于待测血请的PRA值；黑色柱图代表本发明细胞盘的PRA测定值。

具体实施方式

本发明所采用的试剂：

细胞分层液(Ficoll-Hypaque)：Lymphocyte Separation Medium(LSM)，商购于Cellgro，Lot#25-072-CI，产品信息：

商品编号： 25-072，Liquid

浓度 1.077～1.080g/mL

成分

泛影酸

96.219g/L

Diatrizoic acid

聚蔗糖

61.363g/L

Polysucrose 400

NaOH(pH adjustment) as necessary

pH 6.0～9.0

磷酸缓冲液(PBS，不含钙镁离子)，pH7.4：

商购于SIGMA-ALDRICH，Lot#D5652-10L。

成分 (g/L)

KH2PO4 0.2

KCl 0.2

NaCl 8.0

Na2HPO4(无水) 1.15

RPMI-1640：商购于SIGMA-ALDRICH，Lot#R8758，

流式细胞仪洗涤缓冲液：含1％FCS和0.1％Sodium Azide，pH7.4的磷酸缓冲液，

细胞冷冻液：含15％二甲基亚砜的RPMI-1640

实施例1.调整所选供体细胞目录的HLA抗原频率

表3本发明HLA抗原调整方案

主动调整抗原种类	中国人群HLA抗原频率(％)	调整后细胞盘中HLA抗原频率(％)
			Bw4	66	50-55
Bw6	62	50-55
			A1	21	10-15
A2	54	25-30
			A3	22	15-19
A11	33	5-15
			A24	33	10-20
Cw7	44	25-30
			Cw9	30	20-25

抗原频率调整原则：

除表3中所列的HLA抗原频率之外，所选的供体细胞HLA抗原还需要覆盖表1所列的所有抗原，且每个抗原至少出现两次。

实施例2制作细胞盘

步骤1.选择细胞供体：

在正常健康成年人中，随机选取志愿者捐献外周血，共需150到250个志愿者作为候选细胞供体的来源。

细胞供体HLA组织配型鉴定，编号并记录细胞HLA抗原类型。

根据供体的HLA抗原配型、实施例1中的表3的数据及抗原频率调整原则，选取96个供体，分别抽取静脉外周血100ml。

步骤2.采用细胞分层液(Ficoll-Hypaque)获取单核细胞层(PBMC)，内含大量外周血淋巴细胞。用磷酸缓冲液(PBS)洗涤细胞两次，细胞计数。(请调整格式)

步骤3.96份供体外周血淋巴细胞分别加入到在96孔细胞培养板的孔中，每孔200,000个细胞。并记录每份供体的编号，位置及其所包含的HLA抗原类型，如图2所示。

图2A为该细胞盘的I类HLA抗原表，图2B为II类HLA抗原表。

步骤4.用含10％FCS的RPMI-1640溶液洗盘一次。

步骤5.在96孔细胞培养板的每个反应孔内加入细胞冷冻液。

在-20℃冷冻条件下冷冻细胞盘。然后用铝箔将细胞盘封裹起来，置于液氮气相长期保存，也可置于-80℃低温冰箱短期保存待用，制成的细胞盘其抗原频率如表4

表4细胞盘中抗原频率

注(中国人群的HLA抗原频率参见NMDP网站

http://bioinformatics.nmdp.org/HLA/Haplotype_Frequencies/index.html)

步骤6.制作细胞盘试剂盒

试剂盒内放置有细胞盘，带有FITC的羊抗人二抗抗体(商购自Jackson ImmunoResearchLaboratories，Inc.)，用于标记T淋巴细胞和B淋巴细胞的识别抗体CD3-PerCP和CD19-PE(商购自Becton Dickinson)，阴性对照血清(正常人血清)，阳性对照血清(含抗HLA抗体的血清)。

实施例3.检测HLA抗体特异性

1.在室温下(22℃)解冻两个实施例2中制作的细胞盘，一个细胞盘作为基值检测盘，另一个细胞盘作为标本检测盘。一次检测多份血清时，只需要一个基值检测盘。

2.用含10％FCS的RPMI-1640溶液洗盘一次，再用流式细胞仪洗涤缓冲液洗盘一次。

3.在基值检测盘和标本检测盘的一个孔内加入25μl阳性对照血清。

4.在基值检测盘的其余95孔内分别加入25μl阴性对照血清。

5.在标本检测盘的另一个孔内加入25μl阴性对照血清，在其余94孔内分别加入25μl病人待测血清。

6.全部基值检测盘和标本检测盘在4℃培养30分钟。

7.用流式细胞仪洗涤缓冲液洗盘三次。

8.加入FITC标记的二抗，避光在4℃培养10分钟。

9.加入CD3-PerCP(商购自Becton Dickinson)和CD19-PE(商购自Becton Dickinson)，避光在4℃培养20分钟。

10.用流式细胞仪洗涤缓冲液洗盘三次。

11.在基值检测盘和标本检测盘的全部反应孔内，加入100μl流式细胞仪洗涤缓冲液。

12.将细胞从细胞盘转移到流式细胞仪玻璃管中(商购自Kimble Glass Inc.)

13.用流式细胞仪测量每个玻璃管中T淋巴细胞和B淋巴细胞的FITC荧光强度。

判断某份供体HLA抗原与待测血清反应的结果的方法如下：

T_M1表示T淋巴细胞的本底荧光强度，T_M2表示T淋巴细胞上HLA抗体的荧光强度；B_M1表示B淋巴细胞的本底荧光强度，B_M2表示B淋巴细胞上HLA抗体的荧光强度；

(1)T_M2-T_M1大于40时，I类抗体阳性；

(2)B_M2-B_M1大于100，但是T_M2-T_M1小于40时，II类抗体阳性；(3)T_M2-T_M1大于40，B_M2-B_M1大于100，且B_M2-T_M2大于100时，I类和II类抗体同时阳性。

注：阳性阈值取自ASHI Laboratory Manual，4th Edition，2000，Volume II，Chapter VI，Flow Cytometry。

例如一个反应孔的检测结果如图3所示，图3上图左显示淋巴细胞群的位置，上图右显示T淋巴细胞群和B淋巴细胞群的位置。在区分T淋巴细胞和B淋巴细胞之后，中图左显示T淋巴细胞上FITC荧光强度。图中浅蓝色是阴性对照，深蓝色是HLA抗体结合到HLA抗原后T淋巴细胞上FITC的荧光强度。中图右显示中图左的统计学数据，荧光强度以中位数表示，T_M1代表阴性(273)，即本底值，当T_M2-T_M1大于40时，为阳性，该孔中T_M2等于501，I类抗体为阳性。图3的下图表示B淋巴细胞的荧光反应，由于B_M2-B_M1大于100，B_M2-T_M2大于100，同时中图左T_M2-T_M1大于40，该待测血清I类和II类HLA抗体都呈阳性。

14.依照第13步的方法依次计算判断每个反应孔的结果，并记录在如图2A所示的I类HLA抗原表和图2B所示的II类抗原表中。阳性反应记为8，阴性反应记为1。

统计阴性反应孔所覆盖的抗原类型，在阳性反应孔所覆盖的抗原中将其扣除掉；统计出剩下的阳性反应孔中初步认为呈阳性反应的HLA抗原，将阳性反应HLA抗原与表2中所列的各交叉反应组的抗原进行比较，看阳性反应抗原属于哪些交叉反应组，这些交叉反应组就是HLA抗体特异性。而那些不属于交叉反应组成员的单一阳性反应HLA抗原也是该份待测血清的HLA抗体特异性。

如图2A中，经阴性反应孔与阳性反应孔进行比较扣除后，得出斜体字标记的呈阳性反应的抗原为：A2，A23，A24，A68，A69，B57和B58，这在表2中正好是交叉反应组2C，说明待测血清的HLA抗体特异性为2C；通过图2B中扣除阴性抗原后，得到发生阳性反应的II类HLA抗原，从而可得知，待测血清中存在抗DR4的抗体，抗体特异性为DR4。实施例4.本发明的检测方法与流式细胞仪筛选颗粒方法比较灵敏性

在国外HLA抗体检测的几种方法中，目前以流式细胞仪筛选颗粒(flow screening beads)的灵敏性(sensitivity)为最佳，通常作为判断一个病人是否已被致敏的最佳标准。

本实验，总共使用26例病人血清标本，分别以流式细胞仪筛选颗粒(购于One Lambda，

Class I Screening Test，Lot# FL1-30和

Class II Screening Test，Lot#FL2-30，操作步骤参照产品使用说明书)和本发明实施例2制得的细胞盘以及实施例3的检测分析步骤，检测每份血清中I类HLA抗体和II类HLA抗体的有无情况，因此共有52组数据，52组数据来源的示意如表5。

表5灵敏性比较数据

将本发明细胞盘检测的结果与流式细胞仪筛选颗粒的结果比较，绘制卡方表表6

表6灵敏性比较卡方表

	本发明抗体检测呈阳性	本发明抗体检测呈阴性
			流式细胞仪筛选颗粒阳性	36	0
流式细胞仪筛选颗粒阴性	12	4

假设细胞盘方法的灵敏性比流式细胞仪筛选颗粒的灵敏性低。表6的数据经卡方处理，计算Yates卡方值为6.547，Yates p值小于0.05(0.0105)，说明本发明细胞盘检测方法的灵敏性不低于流式细胞仪筛选颗粒的灵敏性。

实施例5.本发明检测方法和流式点阵仪微颗粒比较特异性

通过对比细胞盘和流式点阵仪微颗粒(购于One LAMBDA，

Single AntigenHLA Class I-Combi，Lot#LS1A04和

Single Antigen HLA Class II AntibodyDetection Test-Group 1，Lot#LS2A01)的检测结果，可以说明在细胞盘的抗体检测结果中出现假阳性的情况，进而验证本发明细胞盘检测方法的特异性(specificity)。

对26例病人血清标本分别进行流式点阵仪微颗粒检测(操作步骤参照OneLambda使用说明书)和本发明实施例2制得的细胞盘以及实施例3的检测步骤。

在统计分析HLA抗体所能识别的HLA抗原的时候，以下三种情况决定最终的对比组数，第一，一个标本可以有一种或多种HLA抗体；第二，通常一个标本只含有I类抗体或者II类抗体，但是也可以同时含有I类和II类抗体；第三，当I类抗体的PRA测定值在90％以上的时候，就不进行II类抗体的统计分析，对比数据如表7所示意，得出78组对比数据绘制成卡方表，如表8表7特异性比较数据

表8特异性比较卡方表

	本发明抗体检测系统阳性	本发明抗体检测系统阴性
			流式点阵仪微颗粒阳性	56	5
流式点阵仪微颗粒阴性	9	8

假设本发明细胞盘检测方法的特异性比流式点阵仪微颗粒方法的特异性低。表8的数据经卡方处理，计算Yates卡方值为11.794，Yates p值小于0.001(0.0006)，说明本发明细胞盘检测方法的特异性和流式点阵仪微颗粒方法的特异性两者完全可比。

实施例6.抗原频率调整对测定的PRA值的影响

以表2所示的交叉反应组所代表的HLA抗体的血清，与实施例2中制得的细胞盘进行模拟反应，即由于某个交叉反应组代表一种HLA抗体血清，该HLA抗体能与该组中的抗原成员都发生结合反应。假如该HLA抗体与本发明实施例2制作的细胞盘发生抗原抗体结合反应，模拟反应结果的计算方法是：某个供体细胞包含有该交叉反应组中的成员，这个供体就视为阳性反应，依次分析每个供体的模拟反应结果，计算所有记为阳性反应的供体份数，占该细胞盘上供体总份数的比值，该比值就是细胞盘所反映出来的该交叉反应组的PRA测定值。以相同的方法，用该交叉反应组分别与由250个随机供体所构成的细胞目录进行比较模拟反应，得出一个PRA值，这个PRA值代表该血清自身的PRA值，通过比较9个交叉反应组的测定PRA值与自身PRA值，见表9及图4。

表9：交叉反应组所的PRA值变化

交叉反应组编号	1C	2C	10C	5C	7C	8C	12C	4C	6C
										自身PRA值(％)	89	75	21	58	42	34	47	76	62
细胞盘测定PRA值(％)	79	66	28	54	40	30	49	64	57

注：本实施例中的PRA值：指随机选取250个供体的外周血淋巴细胞与这些交叉反应组所代表的抗体进行反应所得的PRA测定值。

从表9中数据可以看出，那些PRA值高的交叉反应组，用本发明实施例2的细胞盘测得的PRA测定值都相应降低。本领域临床检查中有一个共识，即当通过某种采用天然细胞HLA抗原检测HLA抗体特异性的方法中，如果待测血清的PRA值高于某个值时，该方法就无法检查到HLA抗体特异性，需改用其他方法检查抗体特异性，如人工单抗原包被的抗原板。而本发明的细胞盘由于经过调整抗原频率，测得的PRA测定值比PRA值要低，因此，本方法能检测具有更高PRA值血清的HLA抗体特异性。

表9中个别交叉反应组的PRA值升高，这是因为在调整HLA抗原频率的过程中，在降调高频率HLA抗原的同时，还要保证覆盖表1中的每一个HLA抗原，这样的结果是，某些低频率HLA抗原在本细胞盘中的频率会略有升高，因此导致某些低PRA值的交叉反应组的PRA测定值反而有所升高，并不影响本方法及本发明细胞盘的到达检测具有更高PRA值血清的HLA抗体特异性这一目的。

Claims

1.一种HLA抗体特异性非诊断目的的检测方法，步骤如下：

（1）待测血清分别与取自不同供体的外周血淋巴细胞进行抗体抗原反应，

（2）检测抗体抗原反应的结果，

（3）数据处理获得HLA抗体特异性；

所述外周血淋巴细胞包含T淋巴细胞和B淋巴细胞，所述淋巴细胞携带的HLA抗原包含HLA-A,-B,-Cw,-DR,-DQ位点的所有HLA抗原，所述HLA抗原的发生频率为：每种HLA抗原至少出现在两份供体细胞中，其中Bw4所附属的供体占供体总份数的50-55%，Bw6占50-55%，A1占10-15%，A2占25-30%，A3占15-19%，A11占5-15%，A24占10-20%，Cw7占25-30%，Cw9占20-25%；

所述数据处理指，依次记录所有供体的HLA抗原类型及其抗原抗体反应结果，比较阴性反应供体与阳性反应供体所包含的HLA抗原，在阳性反应供体所包含的HLA抗原中扣除阴性反应供体所包含的HLA抗原，再将余下的阳性反应供体所包含的Ⅰ类HLA抗原与9种交叉反应组比较，找出所剩下的阳性反应供体覆盖的Ⅰ类HLA抗原所包括的交叉反应组；再将余下的阳性反应孔所覆盖的Ⅱ类HLA抗原与单一Ⅱ类HLA抗原进行比较；

所述不同供体的外周血淋巴细胞为96份。

2.根据权利要求1所述的检测方法，所述步骤（2）检测抗原抗体反应的结果采用荧光素标记抗体抗原反应中的淋巴细胞。

3.根据权利要求2所述的检测方法，所述荧光素标记抗原抗体反应中的淋巴细胞指加入荧光素异硫氰酸标记的二抗和分别特异性标记T淋巴细胞和B淋巴细胞的两种荧光标记抗体；所述两种荧光标记抗体与所述异硫氰酸荧光素三者之间的荧光颜色不同。

4.根据权利要求3所述的检测方法，所述特异性标记T淋巴细胞的荧光标记抗体为CD3-PerCP，所述特异性标记B淋巴细胞的荧光标记抗体为CD19-PE。

5.根据权利要求1～4任一所述的检测方法，所述步骤（2）检测抗原抗体反应的结果采用流式细胞仪进行检测。

6.一种HLA抗体特异性检测细胞盘，在96孔细胞培养板的反应孔中分别有取自于96个供体的外周血淋巴细胞，其特征在于：所述外周血淋巴细胞包含T淋巴细胞和B淋巴细胞，所述淋巴细胞携带的HLA抗原包含HLA-A,-B,-Cw,-DR,-DQ位点的所有HLA抗原，所述HLA抗原的发生频率为：每种HLA抗原至少出现在两份供体细胞中，其中Bw4所附属的供体占供体总份数的50-55%，Bw6占50-55%，A1占10-15%，A2占25-30%，A3占15-19%，A11占5-15%，A24占10-20%，Cw7占25-30%，Cw9为20-25%；

7.一种HLA抗体特异性检测试剂盒，包括用于HLA抗体特异性检测的试剂和权利要求6所述的细胞盘。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，所述试剂指荧光素异硫氰酸标记的羊抗人二抗，CD3-PerCP和CD19-PE，阴性对照血清和阳性对照血清。