WO2006080340A1

WO2006080340A1 - Ｃ型肝炎ウイルス由来ペプチドとインターフェロンとの併用療法

Info

Publication number: WO2006080340A1
Application number: PCT/JP2006/301130
Authority: WO
Inventors: Kyogo Itoh; Michio Sata; Shigeru Yutani; Akira Yamada
Original assignee: Green Peptide Co., Ltd.
Priority date: 2005-01-28
Filing date: 2006-01-25
Publication date: 2006-08-03
Also published as: JPWO2006080340A1

Abstract

　ＨＣＶ関連疾患を有する患者を治療する方法であって，前記患者に，患者のＨＬＡと適合したＨＬＡ結合モチーフを配列中に含み，かつ，Ｃ型肝炎ウイルス患者で検出される抗体により認識されるＣ型肝炎ウイルス由来ペプチドと，インターフェロンまたは肝庇護剤の少なくとも一種類以上、好ましくはインターフェロンとを組み合わせて投与することを含む方法が開示される。本発明の方法は、特にインターフェロン，リバビリン不応症例，肝細胞癌発生治療後症例に対して適用することができる，慢性肝炎に対する新しい治療法である。また，患者のＨＬＡと適合したＨＬＡ結合モチーフを配列中に含み，かつ，Ｃ型肝炎ウイルス患者で検出される抗体により認識されるＣ型肝炎ウイルス由来ペプチドを含む，インターフェロンまたは肝庇護剤の少なくとも一種類以上、好ましくはインターフェロンと併用してＨＣＶ関連疾患を有する患者を治療するための医薬組成物も開示される。

Description

明細書

C型肝炎ウィルス由来ペプチドとインターフェロンとの併用療法

技術分野

[0001] 本発明は， C型肝炎の治療に関する。

背景技術

[0002] ウィルス性肝炎には，主としてウィルスが経口感染する A型肝炎と血液を介して感染する B型肝炎や C型肝炎がある。この C型肝炎は，慢性ィ匕して肝硬変や肝癌に移行する割合が非常に高い疾患の 1つである。

[0003] C型肝炎ウィルス (HCV)は，フラビウィルス科に属する 1本鎖 RNAウィルスであり，日本に 200万人以上，世界中では約 1億 7000万人の C型肝炎ウィルス感染者がいると言われている。

[0004] 慢性 C型肝炎患者の肝臓では，慢性の炎症が継続している。この炎症の継続こそが肝硬変への移行，強いては肝細胞癌発生の素地となるものである。肝硬変患者では年率 7— 8%という高率で肝細胞癌の発生を認め，慢性肝炎患者でもその発生率は年率 2%に達する（Tsubota A, et al, Hepatology 19 ： 1088-1094, 1994)。また，患者血清 ALT値が高、ほど肝癌の発生リスクが高、ことは広く知られて、る。このことから，肝細胞癌を予防するためには，肝細胞の慢性の炎症を収束させることが重要であると考えられる。

[0005] 現在， C型慢性肝炎に対する抗ウィルス療法は，インターフェロン単独もしくはリバビリンとの併用療法が広く行われている。インターフェロン 'リバビリン併用療法における著効率は， 24週投与で約 30%, 48週投与で約 40%である（McHutchison JG et si, N Engl J Med 339; 1485, 1998)。しかし，その効果は，ウィルスの遺伝子型〔ジエノタイプ〕やウィルス量によって異なり，ジエノタイプ 1や高ウィルス量では，効果が低いとされている。ジエノタイプ 1での効果は， 24週投与で約 15%, 48週で約 3 0%であり，高ウィルス量（> 2 X 10⁶copies/ml)では， 24週で約 25%, 48週で約 35 〜40%である（McHutchison JG et si, N Engl J Med 339; 1485, 1998, Man ns MP et al, Lancet 358; 958, 2001)。 [0006] 最近，長期作用型のぺグ 'インターフロンが開発され，各施設で大規模なトライアルが行われている。その効果は，全体では単独療法で約 30%,リバビリンとの併用療法では約 55%であり，難治性のジエノタイプ 1では単独療法で約 20%,リバビリン併用療法で約 45%である。高ウィルス量（> 2 X 10⁶copies/ml)では，単独療法で約 20%,リバビリン併用療法で，約 50%である。ジエノタイプ 1かつ高ウィルス量での効果に至っては，単独療法で約 15%,リバビリン併用療法で約 40%となっている (Fried

MW et al, N Engl J Med 347; 975, 2002)。実際の臨床現場では，ウィルス量は > 500KIUのことが多く，その効果は 20%程度とされている（Sjogen MH, et al: AASLD, 2001)。この様に，治療効果が最大でも，約半数の患者にしか効果がなく，インターフェロン (ぺグ 'インターフェロンを含む）とリバビリンとの併用療法に不応であった症例に対しては現在のところ新たなる治療法がない。

[0007] また，慢性 C型肝炎または C型肝硬変に肝細胞癌が合併した症例では，肝細胞癌に対する根治治療が優先される。しかし，肝細胞癌の特徴として多中心性の発育をするため，肝細胞の炎症が継続する限り肝細胞癌は再発し，その再発率は 1年で 20 %, 3年で 50%と極めて高い。

[0008] 非特許文献 l :Tsubota A, et al, Hepastology 19 ： 1088-1094, 1994

非特許文献 2 :McHutchison JG et si, N Engl J Med 339; 1485, 1998 非特許文献 3 : Manns MP et al, Lancet 358; 958, 2001

非特許文献 4: Fried MW et al, N Engl J Med 347; 975, 2002

非特許文献 5 : Sjogen MH, et al: AASLD, 2001

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0009] したがって，本発明は， HCV関連疾患の新しい治療法を提供することを目的とする。特に，本発明は，インターフロン Zリバビリン不応症例，肝細胞癌発生治療後症例に対して，慢性肝炎に対する新しい治療法を提供することを目的とする。

課題を解決するための手段

[0010] 本発明は， HCV関連疾患を有する患者を治療する方法であって，前記患者に，患者の HLAと適合した HLA結合モチーフを配列中に含み，かつ， C型肝炎ウィルス患者で検出される抗体により認識される c型肝炎ウィルス由来ペプチドと，インターフェロンまたは肝庇護剤 (hepatoprotector)の少なくとも 1種類以上とを組み合わせて投与することを含む方法を提供する。好ましくは、 C型肝炎ウィルス由来ペプチドとインターフェロンとを組み合わせて投与する。

[0011] 本明細書において用いる場合，「HCV関連疾患」とは， C型肝炎ウィルスの感染によって引き起こされる疾患を意味し，例えば，急性および慢性の肝炎，肝硬変，および肝細胞癌が含まれる。「組み合わせて投与する」とは， HCV関連疾患の治療のために設計される投与計画にぉ、て， C型肝炎ウィルス由来ペプチドとインターフエ口ンまたは肝庇護剤の少なくとも 1種類以上とを同時にまたは別々に投与することを意味する。例えば，ペプチドとインターフェロンとをそれぞれ 1ヶ月に 1回力も数回ずつ，同日にまたは別々の日に投与してもよく，あるいはペプチドを一定期間投与した後に ,インターフェロンを一定期間投与してもよい。好ましくは，ペプチドを一定期間投与して患者の血漿中の投与ペプチドにたいする抗体上昇，もしくは，細胞傷害性 T細胞 (CTL)の増加が認められた後に，ペプチドとインターフェロンとをそれぞれ 1ヶ月に 1回力も数回ずつ，同日にまたは別々の日に投与する。更に好ましくは，ペプチドを一定期間投与して患者の血漿中の投与ペプチドにたいする抗体価の上昇と細胞傷害性 T細胞の増加が認められた後に，ペプチドとインターフェロンとをそれぞれ 1ケ月に 1回力も数回ずつ，同日にまたは別々の日に投与する。なお，本発明における組み合わせ投与には，インターフェロンを一定期間投与する治療に応答しな力つた患者に，別の投与計画としてペプチドを単独で投与することは含まれな、。

[0012] 別の観点においては，本発明は，患者の HLAと適合した HLA結合モチーフを配列中に含み，かつ， C型肝炎ウィルス患者で検出される抗体により認識される C型肝炎ウィルス由来ペプチドを含む，インターフェロンまたは肝庇護剤の少なくとも 1種類以上と併用して HCV関連疾患を有する患者を治療するための医薬組成物を提供する。

[0013] 好ましくは，投与される C型肝炎ウィルス由来ペプチドは，患者の血液中に存在する抗 HCV抗体のペプチド反応性もしくは細胞傷害性 T細胞 (CTL)の存在に基づヽて選択される。更に好ましくは抗 HCV抗体のペプチド反応性と細胞傷害性 T細胞 (C TL)の両方の存在に基づいて選択される。

[0014] また好ましくは， C型肝炎ウィルス由来ペプチドは，配列番号 1— 8, 16, 20および 38のいずれか 1つで表されるアミノ酸配列を有する。また好ましくは， C型肝炎ウィルス由来ペプチドは， HLA— A2または HLA— A24拘束性細胞傷害性 T細胞による認識性を有する。

[0015] インターフェロンの好ましい投与量は，インターフェロンの種類，ジエノタイプ，ウイルス量等により異なるが，一般に 300万 IU— 1000万 IUである。例えば，ぺグ 'インタ一フエロンの場合は，ぺガシス（中外製薬株式会社）は， 90もしくは 180 /z g,ぺグ 'ィントロン (シエーリングブラウ）は 1. 5Zkg体重で投与することができる。

[0016] 本発明において好ましくは，患者は，インターフェロンによる治療またはインターフェロンとリバビリンとの併用による治療に応答しない患者である。発明の効果

[0017] 本発明の C型肝炎ウィルス由来ペプチドとインターフェロンまたは肝庇護剤の少なくとも 1種類以上とを併用して投与することによって、 HCV関連疾患を有する患者を治療し得、特に、 C型肝炎ウィルス由来ペプチドとインターフェロンとを併用することによつて、インターフェロン単独またはインターフェロンとリバビリンとの併用による治療に応答しない患者に対しても優れた改善効果を得ることができる。このような中でも、本発明の、 C型肝炎ウィルス由来ペプチドと併用する薬剤としては、インターフェロンとの併用が好ましい。

図面の簡単な説明

[0018] [図 1]図 1は， C型肝炎ウィルス由来ペプチドとインターフェロンの併用による C型肝炎の治療の経過を示す。

[図 2]図 2は， C型肝炎ウィルス由来ペプチドとインターフェロンの併用による C型肝炎の治療の経過を示す。

[図 3]図 3は， C型肝炎ウィルス由来ペプチドとインターフェロンの併用による C型肝炎の治療の経過を示す。

[図 4]図 4は， C型肝炎ウィルス由来ペプチドとインターフェロンの併用による C型肝炎の治療の経過を示す。発明を実施するための最良の形態

[0019] 本発明者らは，先に， HLA— A2および HLA— A24拘束性細胞傷害性 Tリンパ球

(CTL)によって認識されるいくつかのペプチドと反応性を有する IgGが，異なる HL Aクラス Iタイプや異なる HCVゲノタイプには関係なく， HCV感染患者の大多数に検出されることを見出した。さらに，これらのペプチドが対応する HLAの HCV患者の P BMC力もペプチド特異的 CTLを誘導しうることを見出した。

[0020] これらの結果に基づいて， HLA— A24の患者 8症例と— A2患者 3症例の標準治療 (IFN療法もしくはリバビリン併用療法)無効症例に対し， HCVlb由来ペプチドを投与したところ，ペプチドによる免疫賦活作用は大多数の症例にて，またウィルス量の低下は半数以上の症例で認められた。中間評価では副作用としては投与部位の軽度炎症反応が認められたが，それ以外の副作用は認められな力つた。

[0021] 本発明らはさらに， 2クール以上の 0. 3mgペプチド投与によって免疫賦活作用が確認された 4症例に対して，低用量もしく通常量のぺグ ·インターフェロンを併用したところ，低用量ぺグ 'インターフェロン投与の 2症例にウィルス量が著明低下 (検出限界以下)すること，および，通常量を投与した残りの 2例のうち 1例においてもウィルス量が低下することを見出した。すなわち，本発明は，ペプチドと低用量もしくは通常量のインターフェロンとを組み合わせて投与することにより HCV関連疾患を有する患者を治療する方法を提供する。

[0022] 本発明に係る C型肝炎ウィルス由来ペプチド (HCVペプチド）は， C型肝炎ウィルス由来の蛋白質の部分アミノ酸配列を含み，かつ，患者の HLAと適合する HLA結合モチーフを配列中に含む。このペプチドは， C型肝炎ウィルス感染患者の血中抗体により認識されることができる。

[0023] 好ましくは，本発明に係る C型肝炎ウィルス由来ペプチドは，細胞傷害性 T細胞を誘導することができ，このようにして誘導された CTLは， HCV感染細胞を標的にしてこの細胞を攻撃する。

[0024] C型肝炎ウィルス由来ペプチドとしては，例えば， HLA— A2結合モチーフを有するペプチドとしては下記の表 2の No40— 57, HLA—A24結合モチーフを有するぺプチドとしては下記の表 1の No3— 39および表 2の No60— 66として表されるぺプチドが含まれる。

[表 1]

No ペプチド名領域配列配列番号

3 NS5A-2132 NS5A RYAPACKPL 2

4 E2-717 E2 EYVI 1 1 FLL 8

5 NS3-1100 NS3 MYTNVDQDL 9

6 NS4A-1773 NS4A QYLAGLSTL 10

7 E2-790 E2 LYGVWPLLL 11

8 NS3-1031 NS3 AYSQQTRGL 12

9 NS2-834 NS2 HYKLFLARL 13

10 NS3-1292 NS3 TYATYGKFL 14

11 NS3-1266 NS3 AYMSKAHG! 15

12 E2-488 E2 HYAPRPCGI 3

13 E1-213 E1 VYEAADMIM 4

14 NS4B-1716 NS4B PYIEQGMQL 16

15 NS4B-1767 NS4B NFISGIQYL 17

16 NS2-910 NS2 PYFVRAHGL 18

17 NS4A-1727 NS4A QFKQKAIGL 19

18 NS2-885 NS2 IFTITKILL 20

19 C-135 C GYIPIVGAPL 21

20 E2-631 E2 MYVGGVEHRL 22

21 NS2-932 NS2 HYVQMALMKL 23

22 NS2-947 NS2 TYVYDHLTPL 24

23 NS4B-1854 NS4B GYGAGVAGAL 25

24 NS3-1243 NS3 AYAAQGYKVL 26

25 NS3-1081 NS3 VYHGAGSKTL 5

26 E2-787 E2 AYALYGVWPL 27

27 E2-617 E2 HYPCTVNFTI 28

28 NS3-1417 NS3 YYRGLDVSVI 29

29 NS5A-2146 NS5A TFLVGLNQYL 30

30 NS2-822 NS2 VFVGLILLTL 31

31 NS3-1556 NS3 EFWESV Gし 32

32 C-176 C IFLL^LLSCL 6 ペプチド名領域配列配列

NS2-837 NS2 LFLARLIWWL 33

NS2-848 NS2 YFITRAEAHL 34

NS4B-1792 NS4B AFTASITSPL 35

NS5A-1990 NS5A DFKTWLQSKL 36

NS5A-2121 NS5A FFTEVDGVRL 37

C-173 C SFS!FLU\LL 7

E2-711 E2 SFAIKWEYVL 38

C-35 C YLLPRRGPRL 1

C-132 C DLMGYIPLV 39

C-178 c LU\LLSCLTV 40

E1-220 E1 ILHTPGCV 41

E2-363 E2 S VGNWAKV 42

E2-401 (HVR) SLLAPGAKQNV 43

NS3-1073 NS3 CINGVCWTV 44

NS3-1169 NS3 LLCPAGHAV 45

NS3-1287 NS3 KLVALGINAV 46

NS3-1406 NS3 TGAPVTYSTY 47

NS4B-1789 NS4B SLMAFTAAV 48

NS4B-1807 NS4B LLFNILGGWV 49

NS4B-1851 NS4B ILAGYGAGV 50

NS5A-2252 NS5A ILDSFDPLV 51

NS5B-2692 NS5B RLIVFPDLGV 52

NS5B-2727 NS5B GLQDCTMLV 53

C-150 C ALAHGVRAL 54

C-168 C NLPGCSFSI 55

NS5B-2422 NS5B SYTWTGALI 56

NS5B-2482 NS5B HYRDVLKEM 57

NS5B-2990 NS5B WFMWCLLLL 58

E2-789 E2 AFYGVWPLL 59

NS4B-1727 NS4B QFKQKALGL 60

NS5B-2613 NS5B QYSPGQRVEF 61

NS4B-1727 NS4B QFKQKALGLL 62 [0027] 好ましいペプチドとしては，例えば， No3の NS5A— 2132(HCVの NS5Aタンパクの 2132番カら 2140番にネ目当，以下同様に省略する）， Noll (NS3— 1266), N ο12(Ε2-488), Νο13(Ε1— 213), No22(NS2— 947) , Νο25 (NS3— 1081) , No32(C-176), No38(C-173), No40(C— 35), No62(NS5B— 2990) , No4(E2-717), Nol4(NS4B— 1716), Nol8 (NS2— 885) , No39(E2— 71 1)などが挙げられる。

[0028] 本発明において特に好ましい HCVペプチドの 1つは，以下のアミノ酸配列を有する HLA— A2結合性モチーフを有するペプチド：

C 35： YLLPRRGPRL (配列番号 1)

である。 HCV感染患者においては，このペプチドに対するペプチド反応性 IgG抗体の検出率および HCV感染症特異性が，それぞれ 93 %と 100%と非常に高い。

[0029] また本発明において特に好ましい別の HCVペプチドは，以下のアミノ酸配列を有する HLA— A24結合性モチーフを有するペプチド：

NS5A—2132:RYAPACKPL (配列番号 2)

E2-488: HYAPRPCGI (配列番号 3)

E 1— 213： VYEAADMIM (配列番号 4)

NS 3— 1081： VYHGAGSKTL (配列番号 5)

C 176： IFLLALLSCL (配列番号 6)

C 173： SFSIFLLALL (配列番号 7)

E2-717: EYVLLLFLL (配列番号 8)

NS4B-1716: PYIEQGMQL (配列番号 16)

NS 2— 885： IFTITKILL (配列番号 20)

E2-711: SFAIKWEYVL (配列番号 38)

である。特に， NS5A— 2132は， HLA— A24陽性の多くの患者において，細胞性免疫および液性免疫の両方を誘導することができる。

[0030] また，本発明に係る HCVペプチドは， HLA— A2または HLA— A24拘束性細胞傷害性 T細胞 (CTL)による認識性を有するペプチドをさらに含んでいてもよい。細胞内で製造された抗原タンパクが細胞内で分解されたペプチドからなる，この HLAに結合可能な抗原ペプチドには， HLAのタイプごとにその配列にモチーフがあり，細胞傷害性 T細胞 (CTL)はこの抗原ペプチドと HLAとの複合体を認識して HCV感染細胞を傷害する。

[0031] 本発明に係る HCVペプチドは，通常の化学的合成法，タンパク分子の酵素的分解法，目的のアミノ酸配列をコードする塩基配列を発現するように形質転換した宿主を用いた遺伝子組換え技術などにより製造することができる。

[0032] 目的とするペプチドをィ匕学的合成法で製造する場合には，通常のペプチド化学においてそれ自体公知の慣用されている手法によって製造することができ，例えば，ぺプチド合成機を使用して，固相合成法により合成することができる。このようにして得られた粗ペプチドは，タンパク質ィ匕学において通常使用されている精製方法，例えば，塩析法，限外ろ過法，逆相クロマトグラフィー法，イオン交換クロマトグラフィー法 ,ァフィユティークロマトグラフィー法などによって精製することができる。

[0033] 一方，所望のペプチドを遺伝子組換え技術で生産する場合には，例えば，合成またはクローユングした目的のアミノ酸配列をコードする DNA断片を適当な発現べクタ一に組込み，この発現ベクターを用いて微生物や動物細胞を形質転換して，得られた形質転換体を培養することによって，所望のペプチドを得ることができる。使用できる発現ベクターとしては，当該技術分野において公知であるプラスミド，ウィルスべクターなどを用いることができる。

[0034] このペプチド生産技術における発現ベクターを用いた宿主細胞の形質転換方法としては，それ自体公知の方法，例えば，塩化カルシウム法，リン酸カルシウム共沈殿法， DEAEデキストラン法，リポフエクチン法，エレクト口ポレーシヨン法などが使用でき，使用する宿主細胞に基づいて適宜選択するのがよい。得られたペプチドの精製は，培養した培地から回収した細胞抽出液もしくは培養上清から上記精製法により行うことができる。

[0035] C型肝炎ウィルス由来ペプチド力もなるワクチンは，上記のようにして製造したぺプチドを，医薬的に許容される補助剤および Zまたは担体と適宜混合することにより調製する。補助剤としては，免疫応答を強化し得るアジュバント，例えばフロイントの不完全アジュバント，水酸ィ匕アルミニウムゲルなどを使用することができる。また，担体としては，例えば， PBS,蒸留水などの希釈剤，生理食塩水などを使用することができる。

[0036] ペプチドワクチンは，その使用形態に応じて，例えば，経口または静脈投与や皮下投与など経皮経路で投与することができる。その剤形としては，例えば，錠剤，顆粒剤，ソフトカプセル剤，ハードカプセル剤，液剤，油剤，乳化剤などが挙げられる。か力る医薬組成物の投与量は，投与する患者の症状などにより，適宜変動し得るが，一般的には，成人に対して 1日当たり，ペプチド量として 0. l— 10mgが好ましく，投与間隔としては数日ないし数ケ月に 1回投与することが好ましい。

[0037] 好ましくは，投与される C型肝炎ウィルス由来ペプチドは，患者の血液中に存在する抗 HCV抗体のペプチド反応性もしくは細胞傷害性 T細胞 (CTL)の存在に基づヽて選択される。更に好ましくは抗 HCV抗体のペプチド反応性と細胞傷害性 T細胞 (C TL)の両方の存在に基づいて選択される。ここで，「抗 HCV抗体のペプチド反応性」とは，投与すべきペプチドのいずれかが，患者の血液中に存在する抗 HCV抗体により認識されることをヽぅ。それぞれの患者における抗 HCV抗体のペプチド反応性を検査して，各人に適するペプチドのみを投与する，いわゆるテーラーメイド型の投与により，より高い治療効果を期待することができる。がんペプチドワクチン臨床試験における経験により，テーラーメイド型投与により二次免疫の賦活が速やかに誘導されるため，より安全により良い臨床効果が発現することが立証されている（Mine et al, Clin.Can.Res. 929-937,2004)。

[0038] 本発明の方法において用いられるインターフェロンとしては，巿販のインターフエ口ン製剤のいずれを使用してもよい。インターフェロンは，例えば，皮下注射または筋肉注射により投与することができる。インターフェロンの好ましい投与量は， 300万 IU 一 1000万 IU (インターフェロンの種類，ジエノタイプ，ウィルス量により変化），ぺグ' インターフェロンの好ましい投与量は，ぺガシス（中外製薬株式会社）は， 90もしくは 180 /z g,ぺグ ·イントロンは 1. 5Zkg体重である。本発明にしたがってペプチドワクチンと併用することにより， C型肝炎を治療するために通常用いられる用量より少ない用量のインターフェロンで治療効果を得ることができる。特に好ましくは，インターフエロンはペプチドワクチンにより患者の抗体価が上昇した後に投与を開始する。このことにより，インターフェロンによる治療効果を上げることができる。

[0039] さらに本発明においては、インターフェロンの代わりに、またはインターフェロンに加えて、 1種類またはそれ以上の肝庇護剤 (hepatoprotector)を C型肝炎ウィルス由来ぺプチドと併用してもよい。肝庇護剤とは、肝臓の炎症を抑制する機能を有する薬剤であり、例えば、抗炎症剤や肝機能改善剤、肝臓製剤、漢方製剤等が挙げられる。坑炎症剤としては、例えば、グリチルリチン製剤（強力ネオミノファーゲン C等）、副腎皮質ホルモン（コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、ベタメタゾン、プレドニゾロン及びこれらの誘導体等)等が挙げられる。肝機能改善剤としては、例えば、ウルソデォキシコール酸、アミノエチルスルホン酸、グルクロン酸アミド、グルクロン酸ナトリウム、グルクロノララタトン、プロポルフィリンニナトリウム、ジクロロ酢酸ジイソポロピルアミン、チォプロニン、ポリェンホスファチジルコリン、グルタチオン、メチルメチォニンスルホ -ゥムクロライド、マロチラートなどが挙げられる。肝臓製剤としては、肝臓加水分解物、肝臓抽出物などが挙げられる。漢方製剤としては、ショウサイコトウ、ダイサイコトゥ等が挙げられる。

[0040] HCV関連疾患の治療効果の確認は， HCV関連疾患に罹患している被験者の血中抗体価，すなわちペプチドに対する反応性を有する抗体の血中濃度を， ELISA 等の慣用の方法によりモニターすることによって行うことができる。また， HCV RNA の量を RT— PCR等の慣用の方法により測定することにより，ウィルス量をモニターすることがでさる。

[0041] 本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。また，本出願が有する優先権主張の基礎となる出願である日本特許出願 2005— 020982号の明細書および図面に記載の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。

実施例

[0042] 本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。ただし，これらの実施例は本発明をより具体的に説明するために例示的に示したものであり，本発明は以下の実施例により限定されるものではない。

[0043] ペプチド、に ^ ^^する^: ：の沏 I定患者血液中のペプチド特異的抗体のレベルは，酵素抗体法 (ELISA)により測定した。簡単には，各ペプチドをジメチルスルホキシド（DMSO)に溶解し， — 20°Cで保存した。化学架橋剤であるジサクシンイミジルスべレート（DSS) (PIERCE, Rockf ord, IL)を含む 0. 1M炭酸バッファで希釈したペプチド（20 μ gZゥエル）を ELISA プレートに結合させた。 0. 05%Tween20— PBS (PBST)でゥエルを 3回洗浄した。プレートを Block Ace (Yukijirushi, Tokyo, Japan)により 4°Cでー晚ブロッキングした。血清サンプルを 0. 05%Tween20— BlockAceで 100倍， 200倍， 400倍に希釈し， 100 μ 1Ζゥエルのサンプルを各ゥエルに加えた。 37°Cで 2時間インキュベートした後，プレートを PBSTで 9回洗浄し， 100 1Zゥエルの 1000倍希釈ゥサギ抗ヒト IgG ( y鎖特異的） (DAKO, Glostrup, Denmark)とともに 37°Cで 2時間インキュペートした。 9回洗浄した後， 100 1Zゥエルの 1 : 100希釈抗ゥサギ IgG結合西洋ヮサビパーォキシダーゼ 'デキストランポリマー（En Vision, DAKO)を各ゥエルに加え，プレートを室温で 40分間インキュベートした。洗浄した後， 100 1Zゥエルのテトラメチルベンチジン基質溶液（KPL, Guildford, UK)をカ卩え， 1. 0Mのリン酸をカロえることにより反応を停止させた。

[0044] ペプチドワクチンの投与

HLA -A2陽性または HL A— A24陽性の HC V感染者にお!、て，本発明の C型肝炎ウィルス由来ペプチドを用いたワクチンの抗ウィルス効果を調べた。被験者はヽずれも， HCVlbに感染しており，インターフェロン +リバビリンもしくはインターフエ口ン単独による治療に応答しな力つた患者である。

[0045] C型肝炎ウィルス由来ペプチド C— 35, NS5A- 2132, E2— 488, E1— 213および NS3— 1081は GMP適合下に合成し，精製し，凍結乾燥粉末として保存した。投与直前に 0. 3mgのペプチドを少量の DMSOに溶解し，生理食塩水 0. 3mlをカロえ，さらに不完全フロイントアジュバント 0. 3mlをカ卩えてディスポ 'シリンジ（B'broun 社）で混合し，ェマルジヨン化した。各ペプチドのェマルジヨン（合計 0. 6mlZぺプチド)を大腿部や側背部，腹部などの皮下組織内に各々別々に注射した。

[0046] まず，患者のリンパ球と血漿中のペプチドに対する CTL及び抗体の有無を検査して，個々の患者ごとにいずれもが陽性 (優先選択)，もしくはいずれかが陽性であるべプチドのみを投与した。投与は， 2週間ごとに， 1回あたり 0. 3mgのペプチドを含むェマルジヨンを側胸部，もしくは大腿部や腹部に注射することにより行った。投与は， 6 回投与を 1クールとし， 1クール終了後の有害事象，血液検査による免疫賦活の有無 , ウィルス安定度など総合的に判定した。次に，第 2クールを開始し，合計 12回投与した。なお，投与前に，個々のペプチド皮内反応溶液（10 gZO. 05ml)による皮内反応にてアレルギー反応陰性を確認し，アレルギー反応陽性を示したペプチドは投与しな力つた。

[0047] HCV RNAの量および GOT, GPT, AFPの値を継続的にモニターした。 HCV RNAの測定は，測定キット（アンプリコア HCV モニター v2. 0 シリーズ（ロッシュ社)）を用いて RT— PCRにより行った。感度は，定性法で 0. 05KIUZml以上，定量法で 0. 05— 50001^11；71111でぁる。110^の陰性化とは，定性法により HCV R NAが検出されなヽことを表す。

[0048] インターフェロンの投与

さらに， 2クール以上の 0. 3mgペプチド投与によって免疫賦活作用が確認された 4 症例に対して，インターフェロン併用療法を行った。インターフェロン投与は， PEG— IFN90 /Z g (商品名ぺガシス）を週 1回皮下注射することにより行った。この投与量は常用量の約 1Z2である。

[0049] 結果を図 1—4に示す。 4例のうち 2例において，インターフェロン併用療法の開始力 8週間（8回投与)までに HCVの陰性ィ匕が認められた。これらの症例のうち一例は IFN単独，もう一例は IFNZリバビリン併用で無効であった症例である。また，これまでの中間評価では特筆すべき副作用はなかった。

[0050] すなわち，本発明にしたがって，ペプチドワクチンとインターフェロンとを組み合わせて投与することにより，慢性 c型肝炎の治療が可能であることが明らかになった。産業上の利用可能性

[0051] 本発明によれば、 C型肝炎ウィルス由来ペプチドとインターフェロンまたは肝庇護剤の少なくとも 1種類以上とを併用して投与することによって、 HCV関連疾患を有する患者を治療しえるため、有用である。特に、 C型肝炎ウィルス由来ペプチドとインターフェロンとを併用することによって、インターフェロン単独またはインターフェロンとリバビリンとの併用による治療に応答しな、患者に対しても優れた改善効果を得ることができるため、有用である。

Claims

請求の範囲

[1] HCV関連疾患を有する患者を治療する方法であって，前記患者に，患者の HLA と適合した HLA結合モチーフを配列中に含み，かつ， C型肝炎ウィルス患者で検出される抗体により認識される C型肝炎ウィルス由来ペプチドと，インターフェロンまたは肝庇護剤の少なくとも 1種類以上とを組み合わせて投与することを含む方法。

[2] 前記 C型肝炎ウィルス由来ペプチドが，前記患者の血液中に存在する抗 HCV抗体のペプチド反応性に基づ、て選択される，請求項 1記載の方法。

[3] 前記 C型肝炎ウィルス由来ペプチドが，配列番号 1— 8, 16, 20および 38のいずれか 1つで表されるアミノ酸配列を有することを特徴とする，請求項 1または 2に記載の方法。

[4] 前記 C型肝炎ウィルス由来ペプチドが， HLA— A2または HLA— A24拘束性細胞傷害性 T細胞による認識性を有することを特徴とする，請求項 1 3のヽずれかに記載の方法。

[5] インターフェロンが， 1回投与あたり 300万 IU— 1000万 IUの用量で投与される，請求項 1 4のいずれかに記載の方法。

[6] 前記患者が，インターフェロンによる治療またはインターフェロンとリバビリンとの併用による治療に応答しな、患者である，請求項 1 5の、ずれかに記載の方法。

[7] 患者の HLAと適合した HLA結合モチーフを配列中に含み，かつ， C型肝炎ウィルス患者で検出される抗体により認識される C型肝炎ウィルス由来ペプチドを含む，ィンターフェロンまたは肝庇護剤の少なくとも 1種類以上と併用して HCV関連疾患を有する患者を治療するための医薬組成物。

[8] 前記 C型肝炎ウィルス由来ペプチドが，前記患者の血液中に存在する抗 HCV抗体のペプチド反応性に基づ、て選択される，請求項 7記載の医薬組成物。

[9] 前記 C型肝炎ウィルス由来ペプチドが，配列番号 1— 8, 16, 20および 38のいずれカ 1つで表されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項 7または 8に記載の医薬組成物。

[10] 前記 C型肝炎ウィルス由来ペプチドが， HLA— A2または HLA— A24拘束性細胞傷害性 T細胞による認識性を有することを特徴とする請求項 7— 9の、ずれかに記載の医薬組成物。