JPH05508219A - 抗ｈｃｖ抗体の免疫アッセイに使用するｃ型肝炎ウイルス（ｈｃｖ）抗原の組合せ - Google Patents

抗ｈｃｖ抗体の免疫アッセイに使用するｃ型肝炎ウイルス（ｈｃｖ）抗原の組合せ

Info

Publication number
JPH05508219A
JPH05508219A JP91507636A JP50763691A JPH05508219A JP H05508219 A JPH05508219 A JP H05508219A JP 91507636 A JP91507636 A JP 91507636A JP 50763691 A JP50763691 A JP 50763691A JP H05508219 A JPH05508219 A JP H05508219A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
hcv
antigen
domain
combination
antigens
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP91507636A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2733138B2 (ja
Inventor
ヒュートン，マイケル
チュー，チウーリン
クオ，ジョージ
Original Assignee
カイロン　コーポレイション
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=24005897&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=JPH05508219(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by カイロン　コーポレイション filed Critical カイロン　コーポレイション
Publication of JPH05508219A publication Critical patent/JPH05508219A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP2733138B2 publication Critical patent/JP2733138B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
    • G01N33/5767—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis non-A, non-B hepatitis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
    • C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 抗１（ＣＩ’抗体の免　ア、乙±Δ」ヨ使」Ｌｔ擾−立１此犬ユニまｌ匠Ｉ見址 金並 置皿 １皿丘旦 本発明は、ＨＣＶ　（以前は、非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスと呼ばれていた）の免疫 ７ノセイの分野に関する。特に、本発明は、抗ＨＣｖ抗体の広範囲な免疫アッセ イを可能にする１（ＣＶ抗原の組成物に関する。
ｉ東 以前、非Ａ非Ｂ型肝炎（ＮＡＮＢＨ）として知られていた疾病は、伝染性の疾患 あるいは疾患群であり、ウィルスが誘発すると考えられていた。そしてウィルス に関連する他の形態の肝臓疾患とは区別し得ると見なされていた。これらの他の 形態の疾患には、公知の肝炎ウィルス、すなわち、Ａ型肝炎ウィルス（ＭＡＹ） 、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）およびΔ肝炎ウィルス（ＨＤＶ）、およびサイト メガロウィルス（ＣＭＶ）またはエプスタイン−バーウィルス（ＥＢＹ）によっ て引き起こされる肝炎が包含される。ＮＡＮＢＨは、輸血した個体において初め て同定された。ヒトからチンパンジーへの伝染およびチンパンジー間における一 連の継代は、ＮＡＮＢＨが、１種または複数種の伝染性感染因子によるという証 拠を与えた。疫学的証拠によると、ＮＡＮＢＨには次の３つの型が存在し得るこ とが示唆される二つまり、飲料水媒介の流行型；血液または非経口伝染型；およ び散発（集団取得（ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ　ａｃｑｕｉｒｅｄ））型の３つの型で ある。しかし、最近まで、ＮＡＮＢＨに関与する伝染性因子は同定されておらず 、ＮＡＮＢＨの臨床診断および同定は、主に他のウィルスマーカーを排除するこ とによって行われてきた。推定されるＮＡＮＢＨ抗原および抗体を検出するため に使用される方法としては、寒天ゲル拡散法、対同免疫電気泳動法、免疫蛍光顕 微鏡法、免疫電子顕微鏡法、放射免疫アッセイ、および酵素結合免疫吸着検定法 がある。しかし、これらのアッセイのいずれも、ＮＡＮＢＩ（の診断テストとし て用いるために、十分に感度が高く、特異的であり、かつ再現性があるとは証明 されていない。
１９８７年に、Ｃｈｉｒｏｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　（本已願の所有者）の 科学者たちは、血液媒介のＮＡＮＢＨに明らかに関係している核酸を初めて同定 した。ＥＰＯ公開Ｎｏ、　３１８．２１６号、Ｈｏｕｇｈｔｏｎら、５ｃｉｅｎ ｃｅ　２４４：３５９　（１９８９）を参照のこと。これらの文献には、新規な ウィルスクラスである、Ｃ型肝炎ウィルス（ｌ（ＣＶ）からの単離物のクローニ ングが記載されている。これらの文献に記載のプロトタイプ単離物は、ｒｌ（Ｃ ’／ＩＪと名付けられた。ＨＣＶは、ＲＮＡゲノムを有するフラビ様ウィルスで ある。
本願に参考のために援用した、米国特許出願第４５６．６３７号（Ｈｏｕｇｈ　 ｔｏｎら）は、ＨＣＶ　ｃＤＮＡを発現することによる様々な組換え）ＩＣＶボ ワペプチドの調製、およびこれらのボッペプチドをＨＣＶ、ｔｎ者由来の血清と の免疫反応性について、スクリーニングすることについて記載している。このよ うな限定されたスクリーニングにより、テストしたポリペプチドのうち、特に５ −１−Ｌ　Ｃ１００、Ｃ３３ｃ、　ＣＡ２７９ａおよびＣＡ２９０ａとして同定 された５つのポリペプチドの免疫原性が高いことが示された。これらの５つのポ リペプチドのうち、５−ｉ−ｉは、推定されるＮＳ４ドメインに存在し、０１０ ０は、推定されるＮＳ３およびＮＳ４ドメインに広がっており、Ｃ３３ｃは、推 定されるＮＳ３ドメインに存在し、ＣＡ２７９ａおよびＣＡ２９０ａは、推定さ れるＣドメインに存在する。さらに、このスクリーニングにより、テストしたシ ングルポリペプチドのいずれも、すべての血清と免疫学的に反応性があるわけで はないことが示された。従って、ＨＣＶ陽性個体由来のすべてのまたはより多く の試料と反応する、改良されたテストが望まれる。
及豆旦鼠丞 出願人は、ＨＣＶ抗原の血清学的研究をさらに行い、今日までに同定されている シングルＨＣ’／ポリペプチドは、いずれモスべての血清に対して免疫学的に反 応性をもつわけではないことを確認した。ＨＣＶを有する個体からのすべての血 清に対して普遍的に反応するシングルポリペプチドがないのは、特に、ＨＣＶエ ピトープにおける株間の多様性、個体間での体液応答における多様性、および／ または疾病状態の血清学上の多様性に起因する。
これらのさらなる研究により、いずれのシングルＨＣＶポリペプチドよりもより 効果的な、ＨＣＩ／抗体の検出を提供するＨＣＶ抗原の組合せの同定が可能にな った。
従って、本発明の１つの局面は、ＨＣＶ抗原の組合せであって、（ａ）Ｃドメイ ンからの第１　ＨＣＶ抗原、および（ｂ）以下からなる群から選択される少なく とも１つの別のＨＣＶ抗原、 （ｉ）　ＮＳ３ドメインからノＨＣＶ抗原、（百）　ＮＳ４ドメインからのＨＣ Ｖ抗原、（ｉｉｉ）ＳドメインからのＨＣＶ抗原、および（ｉｖ）　ＮＳ５ドメ インからのＨＣＶ抗原を含む、ＨＣＶ抗原の組合せ。
１つの実施態様では、ＨＣＶ抗原の組合せは、複数の抗原を含む融合タンパク質 の形態である。他の実施態様では、抗原の組合せは、共通の固体マトリックスに 結合した複数の個体抗原の形態である。さらに他の実施態様では、抗原の組合せ は、個体抗原の混合物の形態である。
本発明の他の局面は、ＨＣＶに対する抗体を含むと思われる哺乳類体成分中に、 該抗体を検出する方法である。この方法では、抗原抗体反応を起こさせる条件下 で、該哺乳類体成分を上記のＨＣＶ抗原の組合せに接触させる工程；および該抗 体および該抗原の免疫複合体の存在を検出する工程とを包含する。
本発明の他の局面は、ＨＣＶに対する抗体を含むと思われる哺乳類体成分中に、 該抗体を検出する別の方法である。この方法では、抗原抗体反応を起こさせる条 件下で、該哺乳類体成分を、以下を含むＨＣＶ抗原のパネルに同時または連続し て接触させる工程； （ａ）Ｃドメインからの第１　ＨＣＶ抗原、および（１））以下からなる群から 選択される少なくとも１つの別のＨＣＶ抗原、 （ｉ）　ＮＳ３ドメインからのＨＣＶ抗原、（百）　ＮＳ４ドメインからのＨＣ Ｖ抗原、（ｉｉｉ）　ＳドメインからのＨＣＶ抗原、および（ｉｖ）　ＮＳ５ド メインからのＨＣＶ抗原、そして、該抗体および該抗原の免疫複合体の存在を検 出する工程とを包含する方法。
本発明の他の局面は、ＨＣＶに対する抗体を含むと思われる哺乳類体成分中に、 該抗体を検出するアッセイを実施するための牛、トである。このキットは、パッ ケージされた状態で、（ａ）前記ＨＣＶ抗原の組合せ、 （ｂ）標準コントロール試薬、および （Ｃ）該アッセイを実施するための説明書、を組合せて含む。
図面の簡単な説明 図面において、 図１は、ＨＣＶポリタンパク質のｃＤＮＡセンスおよびアンチセンス鎖のヌクレ オチド配列、およびセンス鎖によってコードされるアミノ酸配列である。
図２は、ＨＣＶポリペプチドの推定されるドメインを示す、図１のアミノ酸配列 の概略図である。
日を　るためのン熊 １盈 ｒＨＣＶ抗原」は、ＨＣＶの単離体に見いだされるエピトープを決定する、少な くとも５個のアミノ酸、より普通には、少なくとも８個から１０個のアミノ酸の ポリペプチドを指す。好ましくは、エピトープは、ＨＣＶに特有である。抗原が 、英数字コードで示されるときには、エピトープは、英数字によって特定される ＨＣＶドメインからのものである。
ＨＣＶ抗原を特徴づけるのに使用される「合成の」は、ＨＣＶ抗原が、天然源か らの単離されるか、または化学合成または組換え合成のような人工によるもので あることを示す。
「ドメイン」は、図２に示すＨＣＶポリタンパク質のセグメントを指し、これら は、通常、ＨＣＶの推定される構造および非構造タンパク質に対応する。ドメイ ンの記号は、一般に、ワラビライルスタンパフ質を名付けるのに使用される従来 の方法に従う。図２に示すドメインの位置は、およそのものである。
記号ｒＮｓＪは、「非構造」　ドメインを指し、ｒＳＪは、エンベロープドメイ ンを指し、「Ｃ」は、ヌクレオカプシドまたはコアドメインを指す。
「融合ポリペプチド」は、一種または複数種のＨＣＶ抗原が、アミノ酸の１本の 連続する鎖の一部となっているポリペプチドを指し、天然には存在しないもので ある。ＨＣＶ抗原は、ペプチド結合によって互いに直接結合され得るかまたは、 介在アミノ酸配列によって分離され得る。融合ポリペプチドはまた、ＨＣＶ以外 のアミノ酸配列を含み得る。
「共通固体マトリックス」は、個々のＨＣＶ抗原、または）ＩＣＶ抗原を含む融 合ポリペプチドが、共有結合または疎水性吸着のような非共有結合手段によって 結合している固体を指す。
「哺乳類体成分」は、通常、個体によって生産される抗体を含む、哺乳類個体（ 例えば、ヒト）の流体または組織を指す。このような成分は、当該技術分野にお いて公知であり、限定されないが、血液、血漿、血清、を椎液、リンパ液、呼吸 器の分泌物、腸管または尿生性殖器管、涙、唾液、乳汁、白血球細胞、および骨 髄種を含む。
「免疫学的に反応性をもつ」は、問題の抗原が、）ＩＣＶに感染した個体由来の 血清の重要な部分に通常存在する抗ＨＣＶ抗体と、特異的に反応し得ることを意 味する。
「免疫複合体」は、抗体が、抗原上のエピトープと結合するときに形成される組 合せまたは集合体を指す。
賎口υ１主１１亘 図２は、ＨＣＶポリタンパク質の推定ドメインを示す。組合せに用いられる抗原 が由来するドメインは、Ｃ５５（またはＥ）、ＮＳ３、ＮＳ４およびＮＳ５であ る。Ｃドメインは、ＨＣＶのヌクレオカプシドタンパク質を決定すると考えられ る。Ｃドメインは、図１のポリタンパク質のＮ末端から、アミノ酸１２０位付近 まで伸長している。Ｓドメインは、ピリオンエンベロープタンパク質、おそらく はマトリックス（Ｍ）タンパク質を決定すると考えられ、図１のアミノ酸１２０ 位付近から、アミノ酸４００位まで伸長している考えられる。ＮＳ３ドメインは 、アミノ酸１０５０位付近から、アミノ酸１６４０位まで伸長し、ウィルスプロ テアーゼを構成すると考えられる。ＮＳ４ドメインは、ＮＳ３の末端から、アミ ノ酸２０００位付近まで伸長している。ＮＳ４タンパク質の機能は、現時点では 不明である。最後に、ＮＳ５ドメインは、アミノ酸２０００位付近から、ポリタ ンパク質の末端まで伸長し、ウィルスポリメラーゼに対応すると考えられる。
図１に示す配列は、ＨＣＶＩ単離体の配列である。血液を媒介としたＨＣＶのそ の他の株の配列は、特に、エンベロープ（Ｓ）およびヌクレオカプシド（Ｃ）　 ド、メインにおいて、図１の配列と異なり得ることが予想される。このように異 なる配列を有するＨＣＶ抗原の使用は、本発明の範囲内にあるものとする。但し 、その改変は、ＨＣＶに感染したヒト由来の血清に対する抗原の免疫学的反応性 を著しく退化させるものではない。
一般に、）Ｉｃ’／抗原は、ドメイン全体または切形のドメインを含み、ドメイ ンフラグメントの抗原性は、当業者により容易にスクリーニングされる。組合せ に用いられる個体ＨＣ■抗原は、好ましくは固定されたドメインの免疫優勢部分 （すなわち、ポリペプチドの免疫学的反応性に主に関与する部分）を含み得る。
Ｃドメインの場合、Ｃドメイン抗原は、このドメインの全配列の大半を含むのが 好ましい。Ｃ２２と名付けられた抗原（以下の実施例４を参照）は、特に好まし い。Ｓドメイン抗原は、好ましくは、ドメインのＮ末端の、疎水性サブドメイン を含む。
この疎水性サブドメインは、図１のアミノ酸１９９位付近からアミノ酸３２８位 まで伸びている。Ｓ２と名付けられたＨＣＶ抗原（以下の実施例３を参照）は、 特に好ましい。この疎水性サブドメイ゛／の下流側の配列は、必要に応じて、Ｓ ドメイン抗原に含まれ得る。
好ましいＮＳ３ドメイン抗原は、Ｃ３３ｃと名付けられた抗原である。この抗原 は′、図１のアミノ酸１１９２位から１４５７位を含む。
好ましいＮＳ４抗原は、図１のアミノ酸１５６９位から１９３１位を含むＣ１０ ０である。好ましいＮＳ５抗原は、図１のアミノ酸２０５４位から２４６４位を 含む。
ＨＣＶ抗原は、）ＩＣＶのアミノ酸配列全体を含むポリペプチドの形態であり得 るか、またはＵＣＶに外因性の配列を含み得る（すなわち、外因性配列を含む融 合タンパク質の形態であり得る）。組換えによって生産されたＨＣｖ抗原の場合 、ＳＯＤ、α因子またはユビキチン等との融合タンパク質として抗原を生産する ことにより（同一出願人による米国特許第４．７５１．１８０号、第４、８７０ ．００８号、および１９８９年８月７日出願の米国特許出願筒３９０゜５９９号 を参照のこと。これらには、本願に参考のために援用する。これらには、ＳＯＤ 、α因子およびユビキチン融合タンパク質の発現を記載している）、抗原の発現 レベルが増加し、および／または抗原の水溶解性が増加し得る。α因子とユビキ チンとの融合のような融合タンパク質は、発現宿主によってプロセシングされ、 異種配列が除去される。α因子は、分泌システムであるが、ユピ牛チン融合物は 細胞質中に残存する。
さらに、抗原の組合せは、融合タンパク質として生産され得る。例えば、Ｃ２２ およびＣ３３ｃをコードするＤＮＡの連続フラグメントが、構築され得、発現ベ クターにクローニングされ、Ｃ２２およびＣ３３ｃの融合タンパク質を発現する のに使用され得る。
同様に、Ｃ２２およびＣ１００；　Ｃ２２および５２ｉＣ２２およびＮＳ５抗原 ；Ｃ２２、Ｃ３３ｃおよびＳ２；Ｃ２２、Ｃ１００およびＳ２；Ｃ２２、Ｃ３３ ｃ、Ｃ１００およびＳ２の融合タンパク質が作成され得る。例示したドメインか らの別のフラグメントも使用され得る。
賎ｉｔ二鼠裂 本発明の１（Ｃｊ／抗原は、好ましくは、組換えまたは公知の固相化学合成によ って生産される。しかし、ＨＣＶ抗原は、抗原に対する抗体を用いるアフィニテ ィークロマトグラフィーを使用して、無関連なＨＣＶまたはＨＣＶ粒子から単離 され得る。
組換え技術によって生産される場合には、抗原をコードするＤＮＡを構築し、こ のＤＮＡを発現ベクターにクローニングし、細菌、酵母、昆虫または哺乳類細胞 のような宿主細胞を形質転換し、このようなりＮＡを発現して抗原を生産する、 標準手法が用いられ得る。前記のように、発現を向上させ、精製を容易にし、ま たは溶解性を同上させるためには、抗原を融合タンパク質として発現させること が望ましい。代表的なＨＣＶ抗原を生産する特定の手法例は、以下の実施例、お よび特許出願第４５６．６３７号において記載する。
アッセイに　用する抗、の 複数の１（ＣＶ抗原は、２つまたはそれ以上の抗原を含む融合タンパク質の形態 にＨＣＶ抗原を生産するか、それらを個々に共通の固体マトリックス上に固定化 するか、または物理的にそれらを混合することにより、組合せられる。抗原の融 合タンパク質はまた、固体マトリックスに固定化（結合）され得る。
タンパク質を固体マトリックスに共有結合または非共有結合させる方法および手 段は、当該技術分野において公知である。
固体表面の特性は、アッセイフォーマットにより異なり得る。
ミクロタイターウェルで実施されるアッセイでは、固体表面は、ウェルまたはカ ップの壁であり得る。ビーズを用いるアッセイでは、固体表面は、ビーズの表面 であり得る。ディ、７ブステイノク（ｄｉｐｓｔｉｃｋ）　（すなわち、織物ま たは紙などの多孔性または繊維性物質からできた固体）を用いるアッセイでは、 表面は、ディノブスティノクを形成する物質の表面であり得る。凝集アッセイで は、固体表面は、ラテックスまたはゼラチン粒子の表面であり得る。個々の抗原 が、マトリックスに結合される場合には、それらは、表面上に均一に分布される かまたは、結合抗原のパターンが認められるように、帯のようなパターンで表面 に分布され得る。
抗原の簡単な混合物では、任意の適切な溶剤または分散培地における抗原が含ま れる。
、の組ムせを　るアッセイフォーマットＨＣＶ抗原は、抗体を検出するための既 知の抗原を用いる、実質的にすべてのアッセイフォーマットにおいて使用され得 る。
これらのアッセイのすべてに共通の特性は、抗原と、ＥＩＣＶ抗体を含むと思わ れる体成分とを、成分中に存在する任意のこのような抗体と抗原とが結合する条 件下で、接触させることである。このような条件とは、通常、過剰の抗原を用い た生理的温度、ｐＨおよびイオン強度である。抗原と試料とをインキコベートさ せ、次に抗原を含む免疫複合体が検出される。
免疫アッセイの設計は、非常に多様であり、多くのフォー例えば、固体支持体ま たは免疫沈降を用い得る。はとんどのアッセイでは、標識された抗体またはポリ ペプチドを使用し、その標識は、例えば、酵素分子、蛍光分子、化学発光分子、 放射性分子、または染料分子であり得る。免疫複合体からのシグナルを増幅させ るアッセイもまた知られている。その例としては、ビオチンおよびアビジンを用 いるアッセイ、ならびにＥＬＩＳＡアッセイのような、酵素で標識され媒介され た免疫アッセイが挙げられる。
免疫アッセイは、限定されるわけではないが、異種または同種フォーマットであ り、標準型または競合型であり得る。
異種フォーマットの場合、通常、インキュベーション後、試料をポリペプチドか ら容易に分離するために、ポリペプチドは固体マトリックスまたは支持体に結合 される。使用され得る固体支持体の例としては、ニトロセルロース（例えば、膜 またはミクロタイターウェルの形態ン、ポリ塩化ビニル（例えば、シートまたは ミクロタイターウェルの形態）、ポリスチレンラテックス（例えば、ビーズまた はミクロタイタープレートの形態）、ホリフノ化ビニリデン（イムロン（Ｉｍｍ ｕｌ。
ｎＴｎ）として知られる）、ジアゾ化紙、ナイロン膜、活性化ビーズ、およびブ ａティンＡビーズがある。例えば、　ＤｙｎａｔｅｃｂイムロンＴＪもしくはイ ムロン１″２ミクロタイタープレートまたは０．２５インチのポリスチレンビー ズ（８１’Ｅ　標準プラスチ７クボール（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　Ｐｌａｓｔｉｃ 　Ｂａ１ｌ））が、異種フォーマットに使用され得る。抗原性ポリペプチドを含 む固体支持体は、通常、テスト試料から分離した後、結合抗体の検出前に洗浄さ れる。標準および競合フォーマ、）が当該技術分野において公知である。
同種フォーマットでは、テスト試料は、溶液中で、抗原の組合せとインキュベー トされる。例えば、このフォーマットは、形成さ糺る任意の抗原抗体複合体を沈 降させ得る条件下であり得る。これらのアッセイには、標準および競合アッセイ の両方が当該技術分野において公知である。
標準フォーマットでは、抗体抗原複合体を形成するＨＣＶ抗体の量は、直接モニ ターされる。このモニターは、抗ＨＣ’／抗体上のエピトープを認識する標識さ れた抗異種（例えば、抗ヒト）抗体が、複合体の形成によって結合するか否かを 決定することによって成し遂げられ得る。競合フォーマットでは、試料中のＨＣ ’／抗体の量は、複合体内における既知の量の標識された抗体（または他の競合 リガンド）の結合に対する競合効力をモニターすることによって推定される。
抗ＨＣＶ抗体を含む形成された複合体（または、競合アッセイの場合には、競合 抗体の量）は、フォーマットに従って、任意の多数の公知の技術によって検出さ れる。例えば、複合体中の標識されていないＨＣＶ抗体は、標識（例えば、酵素 標識）と複合した抗異種１ｇの結合体を用いて検出され得る。　免疫沈降または 凝集アッセイフォーマットでは、ＨＣＶ抗原と抗体との反応により、溶液または 懸濁液から沈降し、沈降物の可視層または膜を形成するネットワークが形成され る。テスト試料中に、抗ＨＣＶ抗体が存在しない場合には、可視沈降物は形成さ れない。
ＨＣＶ抗原は、通常、これらの免疫アッセイにおいて使用されるようにキットの 形態にパッケージされる。キットは、通常、別々の容器に、抗原の組合せく固体 マトリックスにすでに結合しているか、または抗原をマトリックスに結合させる 試薬と共に、それぞれ別々に存在している）コントロール抗体ｍ製物（陽性およ び／または陰性）、アッセイフォーマットが同一のものを要求する際の標識され た抗体、および標識がシグナルを直接生成しないならば、シグナル発生試薬（例 えば、酵素基質）を含む。アッセイを実施するための指導書（例えば、書面、テ ープ、ＶＣＲＳＣＤ−ＲＯＭ等）は、通常、キットニ含まれる。
以下の実施例は、本発明を例示することを目的としており、本発明を決して限定 するものではない。
（以下余白） ｇＡｌ　：　ＨＣＶ几、Ｃ３３Ｃの合成ＨＣ’／抗原Ｃ３３ｃはＮＳ３ドメイン 由来の配列を含有する。特に図１のアミノ酸１１９２位から１４５７位を含有す る。この抗原はヒトのスーパーオキシドジスムターゼ（５ＯＤ）との融合タンパ ク質としてバクテリア内で以下のように生産された。ベクターｐＳＯＤｃｆｌ　 （Ｓｔｅｉｎｅｒら（１９８６）　、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　５８：９）は、Ｅｃ ｏＲＩおよびＢａａ＋旧で完全消化され、得られたＥｃｏＲＩ、　Ｂａｍ旧断片 は、以下のリンカ−に連結されて、ｐｃｆｌＥＦが形成された。
ＧＡＴＣＣＴＧ　ＧＡＡ　ＴＴＣＴＧＡ　ＴＡＡＧＡＣＣＴＴ　ＡＡＧ　ＡＣＴ 　ＡＴＴ　ＴＴＡ　Ａアミノ酸１１９２から１４５７をコードし、ＥｃｏＲＩ末 端を有するｃＤＮＡクローンがｐｃｆｌＥＦに挿入され、ｐｃｆ　ＩＥＦ／Ｃ３ ３ｃが形成される。
この発現構築物をＤ１２１０　Ｅ、　ｃｏｌｉ細胞に形質転換した。
この形質転換細胞を用いて、Ｎ末端にＳＯＤを有し、Ｃ末端Ｃ３３ｃ　ＢＣＶ抗 ［ラインフレームで有する融合タンパク質を発現させる。発現は、１５ｍ１の形 質転換細胞の一晩培養物をアンピシリン（１００μｓ／ｍｌ）含有するＬ５０ｈ ＋１のルリアブイヨンに接種することにより行われる。細胞をＯ，Ｄ、　０．３ になるまで増殖させ、■ＰＴＧを最終濃度２ｏ＋Ｍになるように添加して、細胞 の濃度が０．Ｄ。
１に達するまで増殖を続行した。その時点で３，０ＯＯＸ　ｇで４℃にて２０分 間遠心分離機にかけて採取した。バックした細胞は一８０℃で数カ月保存可能で ある。
５ＯＤ−Ｃ３３ｃのポリペプチドを精製するために、ポリペプチドが発現される 細菌細胞を浸透圧衝撃および機械的破砕に供し、５ＯＤ−Ｃ３３ｃを含む不溶性 画分を単離して、ＮａＣ１アルカリ溶液で分画抽出にかけ、そして抽出物中の融 合ポリペプチドをＳ−セファロースおよびＱ−セファロースのカラムでクロマト グラフィーにより精製した。
浸透圧衝撃および機械的破砕により得た粗抽出物を以下の手順により調製した。
１グラムのバックした細胞を０．０２Ｍ　Ｔｒｉｓ　ＨＣＩ、ｐＨ７，５，１０ ｍＭ　ＥＤＴＡ、　２０％、のスクロースを含有する１０ｍ１の溶液中に懸濁し て、水上で１０分間インキュベートした。
次に細胞を４．０００　Ｘ　ｇで１５分間４℃にて遠心分離機にかけてベレット 状にした。上清を除去後、細胞ペレットを１０ｍ１の緩衝液ＡＩ　（０，ＯＩＭ 　Ｔｒｉｓ　ＨＣＩ、　ｐＨ７，５，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、　１４ｍＭβメルカプ トエタノール［ＢＭＥ］　）に再懸濁して、氷上で１０分間インキニーベートし た。細胞を再び４．０００　Ｘ　ｇで１５分間４℃でベレット状にした。透明な 上清（ペリプラズム画分Ｉ）を除去後、細胞ペレットを緩衝液Ａ１に再懸濁して 、氷上で１０分間インキュベートして、再び４，０ＯＯＸｇで１５分間４℃で遠 心分離機にかけた。
透明の上清（ペリプラズム画分ＩＩ）を除去後、細胞ペレ・ノ）を５ｍｌの緩衝 液Ａ２　（０，０２Ｍ　Ｔｒｉｓ　ＢＣＩ、ｐＨ７，５，１４ｍＭ　ＢＭＥ、　 １ｎＭＥＤＴＡ、１ｍＭ　ＰＭＳＦ）に再懸濁した。細胞を破砕させるため、懸 濁液（５ｍｌ）および７．５ｍｌのダイノミル型の無鉛酸洗浄ガラスピーズ（直 径０．１０−０．１５ｍｍ）　（Ｇｌｅｎ−Ｍｉｌｌｓ　（株）から入手）をフ ァルコンチューブに入れて、２分間最高速度でボルナ・ツクスにかけ、続いて少 なくとも２分間氷上で冷した。ボルナ・ノクスー冷却工程をさらに４回繰り返し た。ポルテックス後、スラリーを低い吸引力でガラス漏斗を用いて濾過した。ガ ラスピーズを２回、緩衝液Ａ２で洗浄し、モして濾液と洗浄液を混ぜ合わせた。
粗抽出物の不溶性画分を２０．０ＯＯＸ　ｇで１５分間４℃で遠心分離機にかけ て回収し、１０ｍ１の緩衝液Ａ２で２回洗浄し、５＋ａｌのＭＩＬＬｌ−Ｑ水に 再懸濁した。
最終濃度が各々２Ｏｎ＋ＭになるようにＮａＯＨ（２Ｍ）およびＮａＣ１（２Ｍ ）を懸濁液に添加し、混合物を１分間ポルテックスにかけ、２０、０ＯＯＸ　ｇ で２０分間４℃で遠心分離機にかけ、そして上溝を維持することにより、５ＯＤ −Ｃ３３ｃ含有画分を、不溶性物質から単離した。
Ｓ−セファロースで５ＯＤ−Ｃ３３ｃを精製するために、上清画分を最終濃度が ６Ｍ尿素、Ｏ，０５Ｍ　Ｔｒｉｓ　ＨＣＩ、ｐＨ７、ｓ、１４！ＩＭ　ＢＭＥ、 　ＩＩＩＭＥＤＴＡになるように調整した。この画分を、緩衝液Ｂ（０，０５Ｍ Ｔｒｉｓ　ｔ［ｃｌ、ｐ［，５，１４ｄ　ＢＭＥ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ）で平衡化 したＳ−セファロース速流動（１５Ｘ　ＬＯｃｉ）のカラムにかけた。カラムに かけた後、カラムをカラムの２倍容の緩衝液Ｂで洗浄した。通過および洗浄画分 を回収した。アプライおよび洗浄の流速は１ｍ１７分であり、回収された画分は １ｎ＋１であった。５ＯＤ−Ｃ３３ｃ含有画分を同定するため、画分の部分標本 をＳＤＳを含有する１０％のポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析して、 クーマシーブルーで染色した。画分をさらにＳＯＤに対する抗体を用いてウェス タン法によっても分析した。５ＯＤ−Ｃ３３ｃ含有画分をプールした。
５ＯＤ−Ｃ３３ｃを緩衝液Ｂで平衡化したＱ−セファロースカラム（１、５ｃｍ Ｘ　５ｃｚ）でさらに精製した。Ｓ−セファロース上でのクロマトグラフィーか ら得た５ＯＤ−Ｃ３３ｃを含有するプールされた画分を、カラムにかけた。カラ ムを緩衝液Ｂで洗浄して、６０ｍ１の緩衝液Ｂ中のＮａＣ１０，０から０．４Ｍ のグラジェントで溶出させた。アプライ、洗浄、および溶出の流速はｉｎ＋ｌ／ 分であり、回収された画分は１ｍｌであった。Ｑ−セファロースカラムからの全 画分をＳ−セファロースカラムの時と同様に分析した。カラムから溶出された５ ＯＤ−Ｃ３３ｃのピークは約０．２Ｍ　ＮａＣ１の時点であった。
Ｑ−セファロースカラムから得た５ＯＤ−Ｃ３３ｃは、ポリアクリルアミドＳＤ ＳゲルおよびヒトＳＯＤに対するモノクローナル抗体を用いたイムノプロットで の分析によると、約９０％以上の純度であった。
２　：　Ｉ（ＣＶ抗　Ｃ１００）合 Ｈｃｖ抗原ｃｘｏｏは、ＮＳ３ドメインおよびＮＳ４ドメイン由来の配列を含有 する。より詳しくは、図１のアミノ酸１５６９位から１９３１位までを含有する 。この抗原は酵母で生産された。上述のアミノ酸をフードしＥｃｏＲ１末端を有 する１２７０ｂｐのｃＤＮＡ断片が調製された。
この断片が直接Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｊａｅ　ＡＤＨ２／ＧＡＰプロモーターに 融合されている酵母発現ベクターの構築は、ｉ’ｃＲ法を用いたＣＩＱＯ配列の 増幅、次いで増幅された配列をクローニングベクターに連結することを含むプロ トフールによってなされる。クローニングの後、Ｃ１００配列を取り出して、Ａ ＤＨ２／ＧＡＰプロモータを含有する配列と共に、酵母ベクターの大きな断片に 連結させて、酵母発現ベクターを得る。
Ｃ１００のＰＣＲ増幅は、鋳型として、５ａｉｌの消化により直鎖状にされたベ クターｐＳ３−５６ＣＩａａｍ’を用いて行われた。ｐＢＲ３２２の誘導体であ るｐＳ３−５６は、ヒトスーパーオキシドジスムターゼ遺伝子の上流にＡＤｉ１ ２／ＧＡＰＤＩ（）＼イブリッド酵母プロモーター、および下流にアルファ因子 転写ターミネータ−からなる発現カヤ１トを含有する。
増幅に用いられるオリゴヌクレオチドのプライマーは発現ベクターへのクローニ ングを促進し、翻訳終止コドンを導入するように設計された。特に、新規な５° −Ｅｌｉｎｄｌｌｌおよび３°−３ａｉｌ部位がＰＣＲオリゴヌクレオチドで作 成された。５ａｉｌ部位を含有するオリゴヌクレオチドはまた二重終止コドン、 ＴＡＡおよびＴＧＡをコードする。Ｈｉｎｄｌ目部位を含有するオリゴヌクレオ チドはまたＡＵＧコドンの上流のすぐ近くにあるｐｇａｐ６３由来の非翻訳リー グ配列を含有する。ｐＥｃｏ６３ＧＡＰＤＨ遺伝子はＨｏ１ｌａｎｄ＆■ｏ１１ ａｎｄ　（１９８０）およびＫｎｉｓｋｅｒｎら（１９８６）に記載されてｔす る。
Ｇｌｏｏｍの直接発現に用いられたＰＣＲプライマー配列は、以下の通りである 。
５　’　ＧＡＧ　ＴＧＣＴＣＡ　ＡＧＣＴＴＣＡＡＡ　ＡＣＡ　ＡＡＡ　ＴＧＧ 　ＣＴＣＡＣＴ　ＴＴＣＴＡＴ　ＣＣＣＡＧＡ　ＣＡＡ　ＡＧＣＡＧＡ　ＧＴ　 ３　’および ５’　ＧＡＧ　ＴＧＣＴＣＧ　ＴＣＧ　ＡＣＴ　ＣＡＴ　ＴＡＧ　ＧＧＧ　Ｇ触 ＡＣＡ　ＴＧＧ　ＴＴＣＣＣＣＣＧＧ　ＧＡＧ　ＧＣＧ　ＡＡ　３’　。
プライマーおよび鋳型を利用したＰＣＨによる増幅はＣｅｔｕｓ−Ｐｅｒｋｉｎ −Ｅｌｍｅｒ　ＰＣＲキｙ）を用いたものであり、製造元の指示に従ッテ行った 。ＰＣＲ条件は、１分間９４°Ｃ，２分間３７°Ｃ，３分間７２℃で２９サイク ルであり、最終インキュベーションは７２℃で１０分間であった。ＤＮＡは４℃ から一２０’Ｃで一晩保存され得る。
増幅後、ＰＣＨの産物をＨｉｎｄｌｌｌおよびＳａｌ＋で消化した。１．１ｋｂ の主産物をゲル上で電気泳動により精製して、そして溶出された精製産物をｐＢ Ｒ３２２の５ａｉｌ−Ｈｉｎｄｌｌｌの大きな断片に連結させた。正確な組換え 物を単離するために、コンピテントＨＢＩＯ１細胞を組換えベクターで形質転換 させ、クローニング後、所望の組換え物を、クローンから取り出したＢｉｎｄｌ 　１Ｉ−Ｓａｌ　Ｉ断片の予想されるサイズを基に同定した。正確なサイズの旧 ｎｄ１１１−Ｓａ１１断片を含有するりｏ−：／のＩつをｐＢＲ３２２／Ｃ１０ ０−ｄと命名した。このクローンが増幅したＣ１００を含有することをＨｉｎｄ ｌｌ［−３ａｉｌ断片の直接配列分析によって確認した。
Ｃ１００を含有する発現ベクターは、ｐＢ１＋３２２／Ｃ１００−ｄ由来のＨｉ ｎ＋１１［１−５ａｉｌ断片をｐＢＳ２４．１の１３．Ｌｋｂ　ＢａｍＨＩ−Ｓ ａｉｌ断片およびＡＤＨ２／ＧＡＰプロモーターを含有する１３６９ｂ＋ｎ　Ｂ ａｍＨＩ−Ｈｉｎｄｌｌ＋断片を連結することにより構築された（後者の断片は 欧州特許第１６４゜５５６号に記載されている）。ｐＢ３２４．１ベクターは、 同一出願人による１９８９年７月１９日出願ノＵ、　Ｓ、　Ｓ、　Ｎ、　３８２ ．８０５＋：主に記載されている。ＡＤＨ２／ＧＡＰプロモーター断片は、ベク ターｐＰＧＡＰ／ＡＧ／Ｈｉｎｄ１１１をＨｉｎｄｌｌｌおよびＢａｎ＋Ｈ１で 消化して、次に１３６９ｂｐの断片をゲル上で精製することにより得られた。
フンピテンｌ−ＨＢＩＯＩ細胞を組換えベクターで形質転換して、正確な組換え 物を、クローン化されたベクターのＢａｍＨｌおよびＳａｌ＋消化により生じる ２４６４ｂｐ断片および１３．１ｋｂ断片の生成により同定した。クローン化さ れた正確な組換えベクターの１つをｐｃｉｏｏ−ａ＃３と命名した。
Ｃ１００を発現させるために、Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉ ａｅ株ＡＢ１２２　（ＭＡＴａ　１ｅｕ２　ｕｒａ３−５３　ｐｒｂ　１−１１ ２２　ｐｅｐ４−３　ｐｒｃｌ−４０７［ｃｉｒ−０１）のコンピテント細胞を 発現ベクターｐＣ１００−ｄＳ３で形質転換した。形質転換された細胞をＵＲＡ −ソルビトールに置いて、個々の形質転換細胞をＬａｕ−プレート上にひろげた 。
個々のクローンを２％のグルコースを用いたＬｅｕ−、ｕｒａ−培地で３０℃に て２４〜３６時間培養した。２％グルコースを含有する１リツトルの酵母エキス トラクトペプトン培地（ＹＥＰ）に１０ａ＋１の一晩培養物を接種して、そして 得られた培養物を４０Ｏｒｐｍの攪拌速度、１分間に１リツトルの培地に付き１ すｙトルの空気の通気率（すなわち１　ｖｖｍ）で３０°Ｃにて４８時間増殖さ せた。
培地のｐＨは制御しなかった。培養物をＮｅｗ　Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ　５ｅｉｅ ｎｃｅ社製のＢｉｏＦｌｏ　ＩＩ発酵槽で増殖させた。発酵に続いて、細胞を単 離させて、Ｃ１００の発現について分析した。
形質転換された細胞により発現したＣ１００ポリペプチドの分析を、Ｌｅｕ−プ レートから得た単一酵母コロニーから調製した細胞溶解物および粗抽出物で行っ た。細胞溶解物および粗抽出物をＳＤＳポリアクリアミドゲル電気泳動、および ウェスタンプロットにより分析した。ウェスタンプロットは、酵母で発現した５ ＯＤ−Ｃ１００ポリペプチドに対するウサギのポリクローナル抗体でプローブし て行った。ｃｉｏｏポリペプチドの予想サイズは３６４個のアミノ酸であった。
ゲル分析の結果、発現したポリペプチドは３９．９にのＭＷ、を有していた。
側方の分析法は、ともに発現されたＣ１００ポリペプチドが全細胞溶解物中に存 在するが、粗抽出物には存在しないことを示した。これらの結果は、発現された Ｃ１００ポリペプチドが不溶性であることを示唆している。
３　：　ＦＩＣＶ　Ｓ：１） ＢＣＶ抗原Ｓ２は、Ｓドメインの疎水性Ｎ末端からの配列を含有し、図１のアミ ノ酸１９９位から３２８位を含む。
Ｓ２ポリペプチドをコードする発現ベクターの構築およびそれを酵母で発現させ るためのプロトコールは、実施例２で記載のｃｉｏｏポリペプチドの発現に用い たものと類似していた。
ＰＣＲ反応のための鋳型は、Ｈｉｎｄｌｌｌでの消化により直線化されたベクタ ーｐＢＲ３２２／Ｐｉ１４ａであった。Ｐｉ１４ａはアミノ酸１９９から３２８ をコードするｃＤＮＡクローンである。
Ｓ２をコードする配列のＰＣＨによる増幅のためのプライマーとして用いられる オリゴヌクレオチドは以下の通りである。
Ｓ２配列の５゛領域においては： ５’　ＧＡＧ　ＴＧＣＴＣＡ　ＡＧＣＴＴＣＡＡＡ　ＡＣＡ　ＡＡＡ　ＴＧＧ　 ＧＧＣＴＣＴＡＣＣＡＣＧ　ＴＣＡ　ＣＣＡ　ＡＴＧ　ＡＴＴ　ＧＣＣＣＴＡ　 ＡＣ３’　；および Ｓ２配列の３゛領域においては： ５’ＧＡＧ　ＴＧＣＴＣＧ　ＴＣＧ　ＡＣＴ　ＣＡＴ　ＴＡＡ　ＧＧＧ　ＧＡＣ ＣＡＧ　ＴＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＡ　ＴＣＣＣＡＴ　ＧＣＣＡＴ　３’　。
５゛領域のプライマーによってＨｉｎｄｌ１１部位およびＡＴＧ開始コドンが増 幅生産物に導入される。３′領域のプライマーにより、翻訳終止コドンおよびＳ ａｌ１部位が増幅生産物に導入される。
ＰＣＲ条件は、１分間９４℃、２分間３７℃、３分間７２℃で２９サイクルであ り、最終イン−８ニベーシヨンは７２℃で１０分間であった。
ＰＣＲ反応の主な生産物はゲル精製された４１３ｂｐの断片であった。精製断片 を、ＨｉｎｄｌｌｌおよびＳａｉ＋断片で消化したｐＢＲ３２２から得た大きな 断片に連結させて、プラスミドｐＢＲ３２２／Ｓ２ｄを作成した。
４１３ｂｐの旧ｎｄｌｌｌ−Ｓａｉｌ　Ｓ２断片と、ＡＤＨ２／ＧＡＰプロモー タを含有する１、　３６ｋｂのＢａＪｌ−Ｈｉｎｄｌｌｌ断片、および酵母ベク ターｐＢＳ２４、ｌのＢａ１ｌＨ１−３ａｔ　Ｉの大きな断片との連結により、 クローン化された組換えベクターが作成された。正しい組換えベクターはＢａ１ ｌＨ１および５ａｉｌで消化した後の１．７７ｋｂの断片の存在により同定され た。増幅配列から構築され、ＡＤ＋（２／ＧＡＰプロモーターに直接融合された Ｓ２をコードする配列を含有する発現ベクタ−は、ｐｓ２ｄｓ９と命名された。
４　：　）ＩＣＶ　Ｃの合 Ｉ（Ｃ’／抗原Ｃ２２は、Ｃドメインに由来し、図１のアミノ酸１−１２２を含 有する。
Ｃポリペプチドをコードする発現ベクターの構築、および酵母中でそれを発現さ せるためのプロトフールは、上述の０１００ポリペプチドの発現に用いられたも のと下記の点を除いて同様であった。
ＰＣＲ反応のための鋳型は、Ｈｉｎｄｌｌｌで直鎖状にされたＰＢＲ３２２／Ａ ｇ３０ａであった。Ａｇ３０は、アミノ酸１−１２２をコードするｅＤＮＡクロ ーンである。Ｃをコードする配列をＰＣＨによって増幅させるためのプライマー として用いられるオリゴヌクレオチドは以下の通りである。
Ｃ配列の５°領域においては： ５　’　ＧＡＧ　ＴＧＣＡＧＣＴＴＣＡＡＡ　ＡＣＡ　ＡＡＡ　ＴＧＡ　ＧＣＡ 　ＣＧＡＡＴＣＣＴＡ　ＡＡＣＣＴＣＡＡＡ　ＡＡＡ層彷ＡＣ３’。
および Ｃ配列の３°領域においては： ５　’　ＧＡＧ　ＴＧＣＴＣＧ　ＴＣＧ　ＡＣＴ　ＣＡＴ　ＴＡＡ　ＣＣＣＡＡ Ａ　ＴＴＧ　ＣＧＣＧＡＣＣＴＡ　ＣＧＣＣＧＧ　ＧＧＧ　ＴＣＴ　ＧＴ　３’ 　。
５°領域のプライマーによって旧ｎｄ　Ｉ　Ｉ　１部位が増幅生産物に導入され 、３°領域のプライマーによって、翻訳終止コドンおよびＳａｉ　１部位が導入 される。ＰＣＲ条件は、１分間９４°Ｃ１２分間３７℃、３分間７２℃で２９＋ ｊイクルであり、最終インキュベーションは７２℃で１０分間であった。
ＰＣＲ増幅による主産物は３１１１ｂｐのポリヌクレオチドである。
この断片をｐＢＲ３２２の大きな５ａｌｌ−［１ｉｎｄｌｌｌ断片に連結させて プラスミドｐＢＲ３２２／Ｃ２を作成した。
ｐＢＲ３２２／Ｃ２から取り出した３８１ｂｐのＨｉｎｄｌｌｌ−Ｓａｉｌ　Ｃ コード断片と、ＡＤＨ２／ＧＡＰプロモータを含有する１、　３６ｋｂのＢａｍ Ｈ−Ｈ１ｎｄｌｌＩ断片、および酵母ベクターｐＢＳ２４．１のＢａｍＨＩ−Ｓ ａｌ　Ｉの大きな断片との連結により、クローン化された組換えベクターが作成 された。正しい組換えベクターは、ＢａｍＨＩおよびＳａｌ　Ｉで消化した後の １７４ｋｂの断片の存在により同定された。この増幅配列から構築され、直接Ａ Ｄ）１２／ＧＡＰプロモーターに融合されたＣをコードする配列を含有する発現 ベクターは、ｐＣ２２と命名された。
形質転換された細胞により発現されたＣポリペプチドの分析を、Ｌｅｕ−プレー トから得た単一酵母コロニーから調製した全細胞溶解物および粗抽出物により行 った。細胞溶解物および粗抽出物をＳＤＳポリアクリアミドゲル電気泳動により 分析した。
Ｃポリペプチドは１２２個のアミノ酸を有すると予想され、ゲル分析の結果、発 現したポリペプチドは約１３．６ｋｄのＭ！、を有している。
５７　ＮＳ５ポリペプチドの合 このポリペプチドは、　ＮＳ５ドメインのＮ末端からの配列を含有し、詳しくは 図１のアミノ酸２０５４位から２４６４位を含む。ＮＳ５ポリペプチドをコード する発現ベクターの構築、およびその発現のためのプロトコールは、Ｃ３３ｃの 発現に用いたものと類似していた〈実施例１参照）。
＝　６：ＨＣＶに・　る　のラジオイムノア、セイ　ＲＩＡｌ（ＣＶ　（非Ａ、 非Ｂ）を有すると臨床的に診断された個体の血清中、および供給血液から採取し た血清中の！（ＣＶに対する抗体を検出する実施例１から５のＨＣｖ抗原の能力 を、ＲＩＡフォーマットで試験した。
ＲＩＡは、５ＥＬＥＣＴＥＤ　ＭＥＴＨＯＤＳ　ＩＮ　ＣＥＬＬＵＬＡＲＩＭＭ ＵＮＯＬＯＧＹ　ｆｆ、Ｈ。
Ｆｒｅｅｍａｎ　＆　Ｃｏ、）、　ｐｐＪ７３−３９１に記載のＴｓｕおよびＨ ｅｒｚｅｎｂｅｒｇ（１９ｇｏ）の手順に基づき行った。一般には、マイクロタ イタープレート（１ｍｍｕｌｏｎ　２．　Ｒｅｍｏｖａｗｅｌｌ　５ｔｒｉｐｓ ）を精製したＨＣＶ抗原で被覆した。被覆したプレートを血清試料または適切な 対照と共にインキュベートした。インキュベージコンの間、抗体は、もし存在す るなら、固相抗原に免疫学的に結合する。
結合しなかった物質を除去して、マイクロタイタープレートを洗浄後、ヒト抗体 −ＮＡＮＢＶ抗原の複合体は、１２５Ｉ標識ヒツジ抗ヒト免疫グロブリンと共に インキュベートすることにより検出される。結合していない標識抗体を吸引によ り除去して、プレートを洗浄する。個々のウェルの放射活性を測定する。
結合ヒト抗ＦＩＣＶ抗体の量はウェルの放射活性に比例する。
詳細には、０．１２５Ｍ　Ｎａホウ酸緩衝液、ｐ）１８．３．０．０７５Ｍ　Ｎ ａＣ１（ＢＢＳ）中ニ０．１からｏ、　ｓμｇの）ＩＣＶ抗原を含有する１００ μｌノ部分標本を、マイクロタイタープレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ　１ｍｍｕｌ ｏｎ　２　Ｒｅｍｏｖａｗｅｌｌ　５ｔｒｉｐｓ）の各ウェルに添加した。プレ ートを４℃にて一晩湿気のあるチャンバーでインキュベートした。その後、抗原 液を除去し、ウェルを０．０２％のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００（ＢＢＳＴ）を含 有するＢＢＳで３回洗浄した。非特異的結合を阻害するため、ＢＢＳ中の５ｍｇ ／ｍｌのＢＳＡ溶液を１００μｍ添加し、続いて室温で１時間インキュベートし て、このインキュベージコンの後ＢＳＡ溶液を除去することにより、ウェルをウ シ血清アルブミン（ＢＳＡ）で被覆した。Ｌｏｎｇ／ｍｌのＢＳＡを含有するＯ 、ＯＩＭ　リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，２，０，１５Ｍ　ＮａＣ１（ＰＢ Ｓ）で１：１００に希釈した血清試料を１００μｌ添加し、そして血清含有ウェ ルを３７℃で１時間インキュベートすることにより、被覆されたウェル中の抗原 を血清と反応させた。インキュベージコン後、血清試料を吸引により除去して、 ウェルをＢＢＳＴで５回洗浄した。抗原に結合した抗体を１２５Ｉ標識Ｆ’　（ ａｂ）２ヒツジ抗ヒトＩｇＧを被覆ウェルに結合することにより定量した。１０ ０μｌの標識プローブの部分標本（比放射能５−２０μＣｉ／μｇ）を各ウェル に添加し、プレートを１時間３７℃でインキュベートし、次いで過剰のプローブ を吸引により除去して、ＢＢＳＴで５回洗浄した。各ウェルに結合した放射活性 をガンマ放射線を検出するカウンターにより測定した。
下記の表１は、Ｉ’ｌＣＶを有すると診断された個体から採取した血清の試験結 果を示すものである。
Ｌ １生　■ ５２　Ｃ２２Ｃ１００Ｃ３３ｃ　Ｎ５５ＣＶＨＩＶＤＡ　Ｐ　Ｐ　Ｐ（＋４’− Ｉ　Ｐ　ＰＣＶＩ４ＩＶＤＡ　Ｐ　Ｐ　Ｐ（＋１　Ｐ　ＰＣＶＨＩＶＤＡ　Ｐ　 Ｐ　Ｐ（＋）　Ｐ　ＰＣＶＨＮＯ５Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ ＡＶＨＮＯ５Ｈ５Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ＡＶＨＮＯ５Ｈ５Ｐ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ＡＶＨＮＯ５Ｈ５Ｐ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ＡＶＨＮＯ５Ｈ５ＰＩＮ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　ＮＡｖＩ（ＰＴＶＩ（Ｎ　Ｎ　Ｎ　ＰＩ Ｎ　ＮΔＶ’ＨＮＯ５Ｎ５　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　ＮＡｖ）Ｉ　ＮＯ５Ｎ　Ｎ　Ｎ　 Ｎ　Ｐ ＡＶＨＰＴＶＨｔＪ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ＡＶＨＩＶＤＡ　Ｎ　ｒ’　Ｎ　Ｐ　ＰＡＶＨＰＴＶＨＰ　ＰＩＮ　Ｎ　Ｎ　Ｐ 入■　ＮＯ５Ｎ　Ｐ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ＡＶＩ（ＩＶＤＡ　ｆＪ　Ｐ　Ｎ　Ｐ　ＰＡＶＨＮＯ５Ｈ５ＰＩＮ　Ｎ　Ｎ　Ｎ 　ＮＡＶＨＰＴＶＨＮ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ＣｖＨｍＶＤＡ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ ＣＶ’ＨＩＶＤＡ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　１７　ＰＡＶＨＮＯ５）（Ｓ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ 　ＮＣＶ’ＨＰＴＶＨＰ　Ｐ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ＡＶＨＰＴｖＨＰ　Ｎ　Ｐ（＋）　Ｐ（＋＋＋）　ＮＣＶＨＰＴＶＨＮ　Ｐ　Ｐ 　Ｐ　Ｐ ＣＶ’ＨＮＯ５Ｈ５Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　ＮＣＶＨＮＯ５Ｎ　Ｐ　ＰＩＮ　Ｉ？　Ｐ （Ｊ、・奸痕色） ＣＶＨｒＶＤＡ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｐ　Ｎ ＡＶＨＩＶＤＡ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ ５ＡＶＨＩＶＤＡ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　ＰＣＶＨ工ＶＤＡ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ ＡＶ）（ＩＶＤＡ　ＰＩＮ　Ｐ　Ｎ　Ｐ　ＰＡＶＨＩＶＤＡ　Ｎ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　 Ｎ ＣＶＨＰＴＶ）ｌ　Ｐ　ＰＩＮ　Ｎ　Ｎ　Ｎ１０ＣＶＨＮＯ５Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　 Ｎ ＣＶＨＮＯ５Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ＣＶ）［ＩＶＤＡ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　ＰＡＶＨＩＶＤＡ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ ＣＶＨＰＴＶ）４　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ１５ＡＶＨＰＴＶ’Ｈ？　Ｎ　Ｐ　Ｐ　 Ｐ　ＰＡＶＨＩＶＤＡ　Ｎ　Ｐ　Ｎ　Ｐ　Ｎ Ａ￥ＨＮＯ５Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ＡＶＨＮＯ５Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ＣｖＨＮＯ５Ｎ　Ｐ　Ｎ　Ｎ　Ｐ ２０ＣＶＴ（ＮＯ５Ｐ　Ｐ　Ｎ　Ｎ　ＮＣ’／ＨＮＯ５Ｈ５Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ ＣＶＨＰＴＶＨＰ　Ｐ　Ｎ　Ｐ　Ｐ ＡＶＨｎｕｒｓｅ　Ｐ　Ｐ　Ｎ　Ｎ　ＮＡＶＨｒＶＤＡ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｎ ２５　ＡＶＨＩＶＤＡ　Ｎ　Ｐ　Ｐ（＋）　Ｐ（＋＋＋）　ＮＡＶＨｎｕｒｓｅ 　ＰＩＮ　Ｐ　Ｎ　Ｎ　ＮＡＶＨＰＴＶＨＰＩＮ　Ｐ　Ｐ　Ｎ　ＰＡＶＨＮＯ５ Ｎ　ＰＩＮ　Ｎ　Ｎ　Ｐ ＡＶＨＮＯ５Ｎ　Ｐ　Ｎ　Ｐ　Ｎ ３０ＡＶＨＰＴＶＨＰ　ＰＩＮ　Ｎ　Ｎ　ＮＡＶＨＰＴＶＨＮ　Ｐ　Ｎ　Ｐ　Ｐ ＡＶＨＰＴＶＨＰ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ ＡＶＨＰＴＶＨＮ　Ｐ　Ｎ　Ｎ　Ｐ Ｃｖ）ＩＰＴＶＩ（ＰＩＮ　Ｐ　Ｐ（ｆＪ　Ｐ（＋＋＋）　Ｎ３５　ＡＶＨＰＴ Ｖ’ＨＮ　ＰＩＮ　Ｐ（ｆＪ　Ｐ（＋＋＋ｌ　ＰＡｖＨＰＴＶ）ｌ　Ｐ　（？） 　Ｐ　Ｎ　ＰＣＶＨＰＴＶＨＮ　Ｐ　Ｎ　ｐ　ｐ ＣＶＨＰＴＶＨＮ　Ｐ　Ｐ　ｐ　ｐ ＣＶＨＰＴＶＨＮ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ＡＶＨＮＯ５Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ＡＶＨｎｕｒｓｅ　Ｐ　Ｐ　Ｎ　Ｎ　ＮＣＶＩ（ＰＴＶＨＮ　Ｐ　Ｎ　Ｎ　Ｐ ＡＶＨＩＶＤＡ　Ｎ　Ｐ　Ｎ　ＰＩＮ　ＮＣＶＨＰＴＶＨＰ　Ｐ　Ｐ（＋１　ｐ （＋＋＋）　ＰＡＶＨＮＯ５Ｐ　Ｐ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ＡＶＩ（ＮＯ５ＰＩＮ　Ｐ　Ｎ　Ｎ　ＰＡＶＨＰＴＶＨＰＩＮ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ ＡＶＨＮＯ５Ｎ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ／Ｎ Ａ■　ＩＶＤＡ　Ｎ　Ｐ　Ｎ　Ｎ　Ｐ へＶＨＮＯ５Ｎ　ＰＩＮ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ＡＶ’ＨＮＯ５Ｐ　Ｐ　Ｎ　Ｎ　Ｐ ＡＶＨＰＴＶＨＮ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ ｃ　ｒｙｐ　ｔ　ｏ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　ＰＣＶＨＮＯ５Ｎ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ ＣＶＭ　ＮＯ５Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ＡＶＨＰＴＶＭ　Ｎ　Ｐ　Ｐ（ｆＪ　Ｐ（１＋）　ＮＡＶＨＰＴｖＨＮ　ＰＩＮ 　Ｐ（＋）　Ｐ（＋＋Ｊ　ＰＡＶ）ＩＰＴＶＨＮ　ＰＩＮ　Ｐ（＋）　Ｐ（＋４ ）　ＰＣＶＨＩＶＤＡ　Ｆ’　Ｐ　Ｐ　Ｐ　ＰＣＶＨ工ｖＤＡ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ 　Ｐ ＣＶＨＩＶＤＡ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ ＣＶＨＩＶＤＡ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ ＡＶＨＮＯ５Ｎ　Ｐ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ＣＶＨＩＶＤＡ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ／ＮＡ￥ＨＩＶＤＡ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｎ ＡＶＴ（ＮＯ５Ｐ　Ｐ　Ｎ　Ｎ　Ｎ Ａ￥ＨＮＯ５Ｐ　Ｐ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ＣＶＨＰＴＶＨＰ　Ｐ　Ｎ　Ｎ　Ｐ／ＮＡＶＨＰＴＶＨＮ　Ｐ　Ｎ　Ｐ。
ＡＶＨＮＯ５Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ＡＶＨＮＯ５Ｎ　Ｐ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ＡＶＨＮＯ５Ｐ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ＣＶ）Ｉ　ＮＯ５Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ＡＶ’ＨＮＯ３Ｎ　ＰＩＮ　Ｎ　Ｎ　ＮＡＶＨＩＶＤＡ　Ｎ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ ｃｒｙｐｔｏ　Ｎ　Ｐ　Ｎ　Ｎ　Ｐ／Ｎｃｒｙｐｔｏ　Ｐ　Ｐ　ＰＩＮ　Ｐ　Ｐ ＡＶ）Ｉ　工’／ＤＡ　Ｎ　Ｎ　Ｐ　Ｐ　ＮＡＶＨｒＶＤＡ　Ｎ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　 Ｎ ＡＶＨＮＯ５Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ＡＶＨＮＯ５Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ＣＶＨＩＶＤＡ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ ＣＶＨＰＴＶＨＮ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ Ｃｖ）ＩＰＴＶＨＰ　Ｐ　ｐ（＋）ｐ（＋＋＋１　ｐＣＶＨＰＴＶＨＰ　Ｐ　ｐ （＋）　ｐ（＋＋＋）　ｐＣＶＨＮＯ５ＰＩＮ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ＣＶＭ　ＮＯ５Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ＣＶＨＰＴＶＨＰ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ ＣＶＭ　ＰＴＶＨＰ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ ＣＶ’ＨＰＴＶＨＰ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ ＡＶＩ（工ｖＤＡ　Ｎ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　ＰＣＶＨＮＯ５Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ＣＶＨＮＯ５Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ Ｃ’／ＨＰＴＶ’Ｍ　Ｐ’　Ｐ　Ｎ　Ｎ　ＰＣｖＨＮＯ５Ｎ　ＰＩＮ　Ｎ　Ｎ　 Ｎ ＡｖＨＮＯ５Ｎ　Ｐ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ＡＶＨＮＯ５Ｎ　Ｐ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ＣＶＩ（ＰＴＶＨＮ　Ｐ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ＡＶ）ＩＮＯ５Ｐ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ＣＶＨＮＯ５Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ＣＶＨＮＯ５Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ＣＶＨＩＶＤＡ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ ＣＶＨＩＶＤＡ　Ｐ／Ｎ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　ＰＣＶＨＩＶＤＡ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ ＣＶＨ工ＶＤＡ　Ｎ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ ＡＶＨＮＯ５Ｎ　Ｐ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ＣＶＨＩＶＤＡ　Ｎ　Ｐ　Ｎ　Ｎ　Ｐ ＣＶ’Ｈ工ＶＤＡ　Ｎ　Ｐ　Ｎ　Ｎ　ＰＡＶＴ（ＰＴＶ’ＨＰ　Ｐ　Ｎ　Ｐ　Ｐ ＡＶＩ（ＰＴＶＨＰ　Ｐ　Ｎ　Ｐ　Ｐ ＣＶＨＮＯ５Ｎ　Ｐ／Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｐ／ＮＣＶＨＮＯ５Ｎ　Ｐ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ＣＶＩ（ＮＯ５Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ＣＶ’ＨＰＴＶ’ＨＰ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　ＰＣＶＨＰＴＶＨＰ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ ＣＶ）Ｉ　ＰＴＶ’ＨＰ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　ＰＡＶＨＩＶＤＡ　Ｎ　Ｐ　Ｎ　Ｎ　Ｐ ＡＶＨ工ＶＤＡ　Ｎ　Ｐ　Ｐ（＋＋）　Ｐ（＋）　ＰＣＶＩ（ＰＴＶＨＰ　Ｐ　 Ｐ　Ｐ　Ｐ ＡＶＨＰＴＶ）（Ｎ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ ＣＶＨＰＴＶＨ？　Ｎ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　ＰＣＶＨＰＴＶＨ？　Ｐ／Ｎ　Ｐ　Ｐ　Ｐ 　ＰＣＶＨＮＯ５Ｎ５　Ｐ　Ｐ　Ｎ　Ｎ　ＮＣＶ’ＨＩＶＤＡ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ 　ＮＣＶＨＰＴ’／’ＨＮ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　ＰＣＶＨＰＴＶＨＰ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ ／ＮＣＶＨＮＯ５Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ ＣＶ）（ｒＶＤＡ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　ＰＣＶＨＰＴＶＨＰ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｎ ＣＶＨＰＴＶＴ（Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ 傅４オ　林α ５２　Ｃ２２Ｃ１００Ｃ３３ｃ　Ｎ５５ＣＶ’ＨＮＯＳ、Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｐ／ ＮＣＶＨＮＯ５Ｎ　Ｐ／Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｐ／ＮＣＶＭ　ＰＴＶＨＰ　Ｐ　Ｐ　ｐ　 Ｐ Ｃ−ｖ’ＨＮＯ５Ｎ　Ｐ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ＣＶＨＮＯ５Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ＣＶＨＮＯ５Ｐ　Ｐ　Ｎ　Ｎ　Ｐ／Ｎ ＣＶＨＮＯ５Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ＣＶ’ＨＮＯ５Ｈ５Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　ＰＣＶＨＮＯ５Ｎ５　Ｐ　Ｐ　Ｐ　ｐ　ｐ ＣＶＨＰＴＶＨＮ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ＡＶＨＰＴＶＨＮ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ ＡＶ’ＨＮ０５ ＣＶ’ＨＰＴｖ）ＩＮ　Ｐ　Ｐ／Ｎ　Ｐ（＋＋＋）　ＮＣｒｙｐセｏ　Ｐ　Ｐ　 Ｐ　Ｐ　Ｐ ｃｒｙｐｔｏ　ｐ　ｐ　ｐ　ｐ　ｐ ｅｒｙｐｔｏ　Ｎ　Ｐ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ｃ　ｒｙｐｔｏ　Ｎ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ ＣＶＨＰＴＶ）Ｉ　ｐ　ｐ　ｐ　ｐ　ｐｃ　ｒｙｐｔｏ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ｃｒｙｐｔｏ　Ｎ　Ｐ　Ｎ　Ｎ　Ｐ／Ｎｃｒｙｐｔｏ　Ｎ　Ｐ　Ｎ　Ｎ　Ｐ ｃｒｙｐｔｏ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ ｃｒｙｐｔｏ　Ｎ　Ｐ　Ｎ　Ｐ　Ｎ ＣＶ’ＨＮ０５ ＡｖＨ−工ＶＤＡ　Ｎ　Ｐ　Ｎ　Ｐ（＋Ｊ　ＰＡｖＨ−ＩＶＤＡ　Ｎ　Ｐ／Ｎ　 Ｎ　ｐ（＋ｇ　Ｎ（以ｌ珀） Ａ’／Ｈ＝急性ウィルス肝炎 ＣＶＨ・慢性ウィルス肝炎 ＰＴＶＩ（・輸血後のウィルス肝炎 ｌ　ＶＤＡ・静脈注射濫用者 ｃｒｙｐｔｏ　＝潜源性の肝炎 ＮＯ３・原因不明 Ｐ・陽性 Ｎ＝陰性 これらの結果によると、すべての血清と反応する単一抗原はない。Ｃ２２および Ｃ３３ｃが最も反応性が高く、ｓ２は、他の抗原とは反応しない、いくつかの推 定急性ＨＣ’／ケース由来のいくつかの血清と反応する。これらの結果に基づく と最も大きい検出の範囲を示す２つの抗原の組み合わせはＣ２２およびＣ３３ｃ である。急性感染を最大に検圧したいなら、ｓ２を組み合わせに含めるとよい。
表２は供給皇液の試験結果を示す。
星且 抗原 上２ユ　Ｃｌ０（）　Ｃ３３ｃ　戸ス　虹　尖徂ｌ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ２　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ３　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ ４　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ５　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ６　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ７　８　Ｎ　Ｎ　Ｎ　８ ８　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ 抗原 旦辷二　旦匹　皿匡　Ｃ２２巨　Ｎ５５９　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ １０　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ １１　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ １２　８　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ Ｄ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ １４　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ １５　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ １６　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ １７　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ １８　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ Ｉ３　Ｐ　Ｐ　Ｎ　Ｐ　Ｐ ２ＯＰ　Ｐ　Ｎ　Ｐ　Ｐ ２１　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ２２　Ｎ　Ｐ　Ｐ　Ｎ　Ｐ ２３　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ ２４　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ２５　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ２６　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ２７　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ２８　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ２９　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ３０　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ３１　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｎ　Ｐ ３２　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ３３　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ３４　七　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｆ ３５　Ｎ　Ｎ　Ｐ　Ｎ　Ｐ ３６　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ３７　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ３８　Ｎ’Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ３９　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ４０　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ４１　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｆ ４２　Ｎ、　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ 抗原 五ニーＬ　１００　Ｃ３３ｃ　Ｃ２２Ｓ　２　Ｎ５５４３　Ｎ　Ｎ　Ｎ　ＮＮ ４４　８　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ４５　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ４６　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ４７　Ｐ　Ｐ　Ｎ　、Ｎ　Ｐ ４８　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ４９　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ５０　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ５１　Ｎ　Ｐ　Ｐ　Ｎ　Ｐ ５２　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ５３　Ｎ　Ｐ　Ｐ　Ｎ　Ｐ ５４　ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｎ ５５　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ５６　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ５７　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ５８　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ５９　８　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ６０　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ６１　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ６２　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ６３　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ６４　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ６５　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ６６　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ６７　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ６８　Ｎ、　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ６９　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ７０　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ ７１　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ７２　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ７３　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｎ ７４　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ７５　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ７６　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｐ 抗原 ７８　８　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ７９　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ８０　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ８１　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ｉ１；ｉ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ８３　Ｐ　Ｐ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ８４　Ｎ　Ｎ　Ｐ　Ｎ　Ｎ ８５　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ８６　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｎ ８７　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ８８　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ８９　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ ２ＯＰ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｎ ９１Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｐ ９２　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｎ　Ｎ ９３　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ９４　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ９５　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ９６　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ９７　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ９８　Ｎ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ ９９　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ ｌｏｏ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ＬＯＬ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ ２Ｏ３腫　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ １０３　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ １０６　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ １０７　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ １０８　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ 抗原 ド’ｆ　−Ｃ１００Ｃ３３ｃ　Ｃ２２Ｓ２　Ｎ５５１１１　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｎ　、 ｐ １１２　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ １１３　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　ｐ １１４　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ １１５　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ １１６　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ １１７　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ １１８　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ １１９　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ １２０　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ １２１　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ １２２　Ｎ　Ｐ　Ｐ　Ｎ　Ｐ １２３　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ １２４　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ １２５　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ １２６　Ｐ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ １２７　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ １２８　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ １２９　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　８ １３０　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｎ １３１　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｐ １３２　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ １３３　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ １３４　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ １３５　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ １３６　８　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ １３７　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ １３８　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ １３９　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ １４０　Ｐ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ １４１　Ｐ　Ｎ　Ｐ　Ｐ　Ｐ １４２　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ １４３　８　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ １４４　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ 抗原 １４６　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ １４７　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ １４８　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ １４９　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ １５０　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ １５１　Ｆ！　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ １５２　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ １５３　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ １５４　Ｐ　Ｐ　Ｐ　ｐ　ｐ １５５　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ １５６　Ｎ　Ｎ　Ｎ　８　Ｎ １５７　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ １５８　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ １５９　８　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ １６０　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ １６１　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ １６２　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ １６３　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ １６４　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｎ　Ｐ ２Ｓ５　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ ｌ６６　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｎ　Ｐ １６７　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ １６８　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ １６９　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ １７０　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ １７１　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ １７２　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ １７３　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ １７４　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ １７５　８　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ １７６　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ １７７　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｐ １７８　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ 抗原 −旦四　皿と　二　鉦　工 １７９　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ １８０　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ １［１１Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ １８２　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ １１１：ｌ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ ２Ｓ５　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ Ｌ８５　８　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ １８６　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ １８７　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ １８８Ｎ　Ｐ　Ｐ　Ｎ　Ｎ １８９　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ １９０　８　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ １９１　８　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ １９２　８　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ １９３　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ １９４　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ １９５　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　８ １９６　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ １９７　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｐ １９８　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｎ　Ｎ １９９　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｐ ２Ｏ０Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｎ 供給血液による結果は一般に感染した個体の血清（こよる結果を確認したものと なっている。
（以下余白） 伊７　：　）ＩＣＶ　の組み合わせを　いた）１ｃ’／Ａ　ノＥＬＩＳＡｆｉｌ Ｃ２２およびＣ３３ｃ抗原の組み合わせで被覆したプレートを以下のように調製 した。被覆緩衝液（５ｈＭのホウ酸ナトリウム、ｐＨ９，０）　、２１ｍ＋１／ プレート、ＢＳＡ　（２５μｇ／ｍｌ）　、Ｃ２２およびＣ３３ｃ（各２．５０ 　ｕ　ｇ／ｍｌ）含有溶液をＲｅｍｏｖｅａｖｅｌｌ　ｌ＋ｉｍｕｌｏｎ　＋プ レート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ社）に添加する直前に調製する。５分間混合した後、 ０．２ｍｌ／ウェルの溶液をプレートに添加して、被覆し、３７℃で２時間イン キュベートして、その後溶液を吸引により除去する。ウェルを１回４００μｌの 洗浄緩衝液（１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７，４，１４０ｍＭ塩化ナトリ ウム、０．１％（Ｍ／Ｖ）カゼイン、１％（ｆ／Ｖ）Ｔｒｆｎｔｏｎ　Ｘ−１０ ０，０，０１％（Ｗ／Ｖ）チメロサール）で洗浄する。洗浄溶液を除去後、Ｚｏ ｏμｌ／ウェルのＰｏ５ｔｃｏａｔ溶液（１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７， ２，１５０＋ｏＭ塩化ナトリウム、０．１％（マ／Ｖ）カゼイン、３％のスクロ ースおよび２μＭのフェニルメチルスルフォニルフルオライド（ＰＭＳＦ））を 添加して、蒸発を防ぐためプレートを緩く被覆して、室温に３０分間放置した。
次にウェルを吸引して溶液を除去して、たなを加熱することなく一晩凍結乾燥さ せる。調製したプレートは乾燥剤（３ｇ　５ｏｒｂ−ｉｔ　ｐａｃｋｓ）と共に アルミニウムの袋に密閉して２〜８°Ｃで保存され得る。
ＥＬＩＳＡ測定を行うために、２０μｌの血清試料または対照試料を、２００μ ｍの試料希釈液（１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＦｉ７．４．５００ｍＭ塩化 ナトリウム、１ｍＭ　ＥＤＴＡＳｏ、１％（Ｗ／Ｖ）カゼイン、０．０１％（Ｗ ／Ｖ）ｆメロサール、１％（Ｗ／Ｖ）　ト’）　トンＸ−１００，１００μｇ／ ｍｌ酵母抽出物）を含むウェルに添加する。プレートを密閉して３７℃で２時間 インキュベートし、次に溶液を吸引により除去して、ウェルを３回４００ｕ　１ の洗浄緩衝液（０，０５％Ｔｗｅｅｎ　２０を含有するリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ ））で洗浄する。洗浄したウニ）しを、０ｒｔｈｏ　（結合）希釈液（ｉｏ＋ｎ Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ１７，２，１５Ｑｄ塩化ナトリウム、５０％（■／ｖ ）ウシ胎児血清、１％（’／／Ｖ）熱処理したウマ血清、ＬｍＭ　Ｋ３Ｆｅ（Ｃ Ｎ）ａ、０．０５％（Ｗ／Ｖ）　Ｔｗｅｅｎ　ＺＯｌｏ、０２％（Ｗ／Ｖ）チメ ロサール）ニ含まれた、２００μｌツマウス抗ヒトＩｇＧ−ホースラディツシュ ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合物で処理する。処理は１時間３７℃で行い、溶 液は吸引により除去して、ウェルを３回４０ｈｌの洗浄緩衝液で洗浄して、この 緩衝液もまた吸引により除去する。結合した酵素結合物を測定するために、２０ ０μｌの基質溶液（５＋＋１の現像液当り１０ｍｇの〇−フェニレンジアミンジ ヒドロ塩化物）を添加する。現像液はリン酸でｐＨ５，１に調整した５０ｄのク エン酸ナトリウム、および０．６μｌ／ｍｌの３０％■２０２を含有する。基質 溶液を含、有するプレートを暗所で３０分間室温でインキュベートする。反応を ５０μｍ７ｍ１の４Ｎ硫酸を添加して中止し、ＯＤを測定する。
同様に、Ｃ２２およびＣ３３ｃ；　Ｃ２２、Ｃ３３ｃ、およびＮ２の融合タンパ ク質、並びにＣ２２およびＣ１００；　Ｃ２２およびＮ２．Ｃ２２およびＮＳ５ 抗原；　０２２、Ｃ３３ｃ、およびＮ２：並びＧ：Ｃ２２、Ｃ１００，および５ ２（Ｆ）組み合わせを用いて、ＥＬＩＳＡを行い得る。
上述の実施態様を改変して本発明を実行することは、分子生物学、免疫学、およ び関連分野の当業者に公知であり、それらも本発明の請求項の範囲に包含される 。
宜」γ１ いかなる単一）ＩＣＶ抗原よりも広範囲な免疫学的反応性を有するＨＣ’／抗原 の組合せ。この組合せは、ＨＣＶポリタンパク質のＣドメインからの抗原と、Ｎ Ｓ３ドメイン、ＮＳ４ドメイン、Ｓドメイン、またはＮＳ５ドメインからの少な くとも１つの別のＨＣＶ抗原とからなり、融合タンパク質、単純な物理的混合物 、または固体マトリックスに共に結合した個々の抗原の形態である。
補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）

Claims (16)

    【特許請求の範囲】
  1. １．合成Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）抗原の組合せであって、（ａ）Ｃドメイン からの第１ＨＣＶ抗原、および（ｂ）以下からなる群から選択される少なくとも １つの別のＨＣＶ抗原、 （ｉ）ＮＳ３ドメインからのＨＣＶ抗原、（ｉｉ）ＮＳ４ドメインからのＨＣＶ 抗原、（ｉｉｉ）ＳドメインからのＨＣＶ抗原、および（ｉｖ）ＮＳ５ドメイン からのＨＣＶ抗原を含む、組合わせ。
  2. ２．合成Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）抗原の組合せであって、（ａ）実質的にＣ ドメインからなる第１ＨＣＶ抗原、および（ｂ）ＮＳ３ドメインからの第２ＨＣ Ｖ抗原を含む、組合わせ。
  3. ３．前記第１ＨＣＶ抗原がＣ２２であり、前記ＨＣＶ抗原がＣ３３ｃである、請 求項２に記載の組合せ。
  4. ４．（ｃ）Ｓドメインからの第３ＨＣＶ抗原を含む、請求項２に記載の組合せ。
  5. ５．（ｃ）ＨＣＶ抗原Ｓ２を含む、請求項３に記載の組合せ。
  6. ６．合成ＨＣＶ抗原の組合せであって、（ａ）実質的にＣドメインからなる第１ ＨＣＶ抗原、および（ｂ）ＮＳ４ドメインからの第２ＨＣＶ抗原、を含む、組合 せ。
  7. ７．前記第１ＨＣＶ抗原がＣ２２であり、前記第２ＨＣＶ抗原がＣ１００である 、請求項６に記載の組合せ。
  8. ８．（ｃ）Ｓドメインからの第３ＨＣＶ抗原を含む、請求項６に記載の組合せ。
  9. ９．（ｃ）ＨＣＶ抗原Ｓ２を含む、請求項７に記載の組合せ。
  10. １０．前記組合せが、融合ポリペプチドの形態である、請求項１、２、３、４、 ５、６、７、８または９に記載の組合せ。
  11. １１．前記組合せが、前記第１ＨＣＶ抗原、および前記別の抗原のそれぞれが共 通の固体マトリックスに結合した形態である、請求項１、２、３、４、５、６、 ７、８または９に記載の組合せ。
  12. １２．前記固体マトリックスが、マイクロタイタープレートゥエル、ビーズまた はディップスティックの表面である、請求項１１に記載の組合せ。
  13. １３．前記組合せが、前記第１ＨＣＶ抗原および前記１つのまたは複数の別のＨ ＣＶ抗原との混合物の形態である、請求項１、２、３、４、５、６、７、８また は９に記載の組合せ。
  14. １４．Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に対する抗体を含むと思われる哺乳類体成分 において、該抗体を検出する方法であって、抗原抗体反応を起こさせる条件下で 、該哺乳類体成分を請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、 １２または１３に記載の合成ＨＣＶ抗原の組合せに接触させる工程；および 該抗体および該抗原の免疫複合体の存在を検出する工程、を包含する方法。
  15. １５．Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に対する抗体を含むと思われる哺乳類体成分 において、該抗体を検出する方法であって、 抗原抗体反応を起こさせる条件下で、該哺乳類体成分を、以下の（ａ）および（ ｂ）を含む合成ＨＣＶ抗原のパネルに接触させる工程； （ａ）Ｃドメインからの第１ＨＣＶ抗原、および（ｂ）以下からなる群から選択 される少なくとも１つの付加ＨＣＶ抗原、 （ｉ）ＮＳ３ドメインからのＨＣＶ抗原、（ｉｉ）ＮＳ４ドメインからのＨＣＶ 抗原、（ｉｉｉ）ＳドメインからのＨＣＶ抗原、および（ｉｖ）ＮＳ５ドメイン からのＨＣＶ抗原、ならびに該抗体と該抗原との免疫複合体の存在を検出する工 程を包含する方法。
  16. １６．Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に対する抗体を含むと思われる哺乳類体成分 において、該抗体を検出するアッセイを実施するためのキットであって、パッケ ージされた状態で、（ａ）合成ＨＣＶ抗原の組合せ、 （ｂ）標準コントロール試薬、および （ｃ）該アッセイを実施するための指導書、を組合せて含む、キット。
JP3507636A 1990-04-04 1991-03-29 抗ｈｃｖ抗体の免疫アッセイに使用するｃ型肝炎ウイルス（ｈｃｖ）抗原の組合せ Expired - Lifetime JP2733138B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US50435290A 1990-04-04 1990-04-04
US504,352 1990-04-04

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH05508219A true JPH05508219A (ja) 1993-11-18
JP2733138B2 JP2733138B2 (ja) 1998-03-30

Family

ID=24005897

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP3507636A Expired - Lifetime JP2733138B2 (ja) 1990-04-04 1991-03-29 抗ｈｃｖ抗体の免疫アッセイに使用するｃ型肝炎ウイルス（ｈｃｖ）抗原の組合せ

Country Status (25)

Country Link
EP (2) EP0450931B1 (ja)
JP (1) JP2733138B2 (ja)
KR (1) KR100206150B1 (ja)
AT (2) ATE182684T1 (ja)
BG (1) BG61291B1 (ja)
BR (1) BR9106309A (ja)
CY (1) CY1881A (ja)
DE (2) DE69120138T2 (ja)
DK (2) DK0450931T3 (ja)
ES (2) ES2088465T3 (ja)
FI (1) FI106317B (ja)
GB (1) GB2257784B (ja)
GR (2) GR3020964T3 (ja)
HU (1) HU217025B (ja)
IE (1) IE911105A1 (ja)
IL (2) IL170719A (ja)
LT (1) LT3808B (ja)
LV (2) LV10344B (ja)
MY (1) MY107499A (ja)
NO (1) NO310241B1 (ja)
PL (1) PL172133B1 (ja)
RO (1) RO109916B1 (ja)
RU (1) RU2130969C1 (ja)
UA (1) UA41266C2 (ja)
WO (1) WO1991015771A1 (ja)

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996006355A1 (fr) * 1994-08-19 1996-02-29 Dainabot Co., Ltd. Reactif pour le dosage d'un anticorps dirige contre un antigene reduit et procede de dosage
JPH0873497A (ja) * 1994-08-31 1996-03-19 Tonen Corp Ｃ型肝炎ウイルス感染又はグループ判定のためのエピトープキメラ抗原ペプチド、その製法、及びそれを使用する感染又はグループ判定法
JPH08127592A (ja) * 1994-08-12 1996-05-21 Boehringer Mannheim Gmbh Ｃ型肝炎ウイルスのｎｓ３領域からの組換え抗原
JPH11512606A (ja) * 1995-09-15 1999-11-02 カイロン コーポレイション ヘルカーゼ活性および改善された溶解性を有するｈｃｖ ｎｓ３タンパク質フラグメント
JP2001517797A (ja) * 1997-09-22 2001-10-09 カイロン コーポレイション サンプル中の抗体を検出する方法
US6379886B1 (en) 1996-05-07 2002-04-30 Toa Medical Electronics Co., Ltd. Diagnostic regeant for hepatitis C virus infection
JP2004510133A (ja) * 2000-06-15 2004-04-02 カイロン　コーポレイション 抗ｈｃｖ抗体についてのイムノアッセイ
JP2005257700A (ja) * 2005-05-25 2005-09-22 Sysmex Corp 抗ｈｃｖ抗体の検出方法
JP2005274584A (ja) * 2005-05-25 2005-10-06 Sysmex Corp Ｃ型肝炎ウイルス感染症診断薬の製造方法
EP1978365A1 (en) 2007-03-16 2008-10-08 Sysmex Corporation Reagent kit and method for measuring HCV antibody
JP2017534056A (ja) * 2014-10-29 2017-11-16 アボット・ラボラトリーズＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｎｓ３捕捉ペプチドを使用して対象の抗ｈｃｖ抗体を検出するアッセイ
JP2018124277A (ja) * 2017-02-02 2018-08-09 三洋化成工業株式会社 粒子含有組成物、免疫測定用試薬、免疫測定方法及び粒子の保存方法

Families Citing this family (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7166287B1 (en) 1989-12-18 2007-01-23 Glaxo Wellcome Inc. Viral agent
IE65172B1 (en) 1989-12-18 1995-10-04 Wellcome Found Viral agent
KR940000755B1 (ko) * 1990-02-16 1994-01-29 유나이티드 바이오메디칼 인코오포레이티드 Hcv에 대한 항체 검출, hcv 감염의 진단 및 백신으로서의 그 예방에 특히 적합한 합성 펩티드
DK0527815T3 (da) * 1990-04-06 2000-11-06 Genelabs Tech Inc Hepatitis C-virus-epitop
CA2049679C (en) * 1990-08-24 2005-06-21 Sushil G. Devare Hepatitis c assay utilizing recombinant antigens
US6274148B1 (en) 1990-11-08 2001-08-14 Chiron Corporation Hepatitis C virus asialoglycoproteins
SK286106B6 (sk) * 1990-11-08 2008-03-05 Novartis Vaccines & Diagnostics, Inc. Spôsob vykonávania imunodiagnostickej skúšky na detekciu protilátky proti vírusu hepatitídy C
DE69030124T2 (de) * 1990-12-14 1997-09-18 Innogenetics Nv Synthetische Antigene zum Nachweis von Antikörpern gegen Hepatitis C-Virus
US5910404A (en) 1990-12-14 1999-06-08 Innogenetics N.V. Synthetic antigens for the detection of antibodies to hepatitis C virus
US6007982A (en) * 1990-12-14 1999-12-28 Innogenetics N.V. Synthetic antigens for the detection of antibodies to hepatitis C virus
DE4041304A1 (de) * 1990-12-21 1992-06-25 Mikrogen Molekularbiol Entw Von strukturproteinen des hepatitis c-virus abgeleitete polypeptide, testkits, die diese polypeptide enthalten und impfstoffe gegen infektionen von hepatitis c-viren
US5574132A (en) * 1991-04-05 1996-11-12 Biochem Immunosystems Inc. Peptides and mixtures thereof for detecting antibodies to hepatitis C virus (HCV)
WO1993009253A1 (en) * 1991-11-07 1993-05-13 Baxter Diagnostics Inc. Epitope mapping ot the c33c region of hcv
JP3688290B2 (ja) * 1991-11-21 2005-08-24 コモン サーヴィシス エージェンシー Ｃ型肝炎ウイルス検査
AU3610293A (en) * 1992-02-04 1993-09-01 Chiron Viagene, Inc. Hepatitis therapeutics
GB9203803D0 (en) * 1992-02-21 1992-04-08 Wellcome Found A recombinant polypeptide
UA39944C2 (uk) * 1992-07-07 2001-07-16 Чірон Корпорейшн Спосіб визначення ранньої сероконверсії у ссавця-хазяїна до вірусу гепатиту с і набір для використання в способі
JP2778886B2 (ja) * 1992-10-16 1998-07-23 エバーニュー バイオテック インコーポレイティド Ｃ型肝炎ウィルスのコア抗原タンパク質及びそれを用いての診断方法及びキット
EP0593291A3 (en) * 1992-10-16 1995-03-15 Evernew Biotech Inc Non-structural protein of the hepatitis C virus, as well as diagnostic procedure and test kit.
US6153378A (en) * 1992-10-16 2000-11-28 Bionova Corporation Diagnosis of, and vaccination against, a positive stranded RNA virus using an isolated, unprocessed polypeptide encoded by a substantially complete genome of such virus
WO1994013164A1 (en) 1992-12-10 1994-06-23 Nike International Ltd. Bonding of rubber to plastic in footwear
UA46707C2 (uk) 1993-05-10 2002-06-17 Чірон Корпорейшн Спосіб типування вірусу гепатиту с (варіанти), набір поліпептидів (варіанти), реагент, що включає комбінацію поліпептидів, які містять типоспецифічні епітопи гепатиту с (варіанти)
CA2172305A1 (en) * 1995-03-30 1996-10-01 Muneo Aoyama Multiple antigenic peptide comprising at least two hepatitis c virus-associated peptides
AU5924396A (en) * 1995-05-22 1996-12-11 Bionova Corporation Compositions and methods for the diagnosis of, and vaccinati on against, hepatitis c virus (hcv)
FR2734639B1 (fr) * 1995-05-26 1997-10-03 Parteurop Methode de pronostic de l'evolution d'une infection par le virus de l'hepatite c, et necessaire pour sa mise en oeuvre
FR2737209B1 (fr) 1995-07-25 1997-09-19 Bio Merieux Peptide capable d'etre reconnu par des anticorps reconnaissant l'antigene c33 du virus de l'hepatite c
US6127116A (en) * 1995-08-29 2000-10-03 Washington University Functional DNA clone for hepatitis C virus (HCV) and uses thereof
US7338759B1 (en) 1997-03-04 2008-03-04 Washington University HCV variants
US7049428B1 (en) 1998-03-04 2006-05-23 Washington University HCV variants
JP2003512598A (ja) * 1999-07-15 2003-04-02 デパートマント、アヴ、ヘルス、アンド、ヒューマン、サーヴィセズ Ｃ型肝炎に続く肝不全の予測
US6562346B1 (en) 1999-10-27 2003-05-13 Chiron Corporation Activation of HCV-specific T cells
AU2574601A (en) * 1999-11-24 2001-06-04 Chiron Corporation Novel hcv non-structural polypeptide
US6986892B1 (en) * 1999-11-24 2006-01-17 Chiron Corporation Immunogenic Hepatitis C virus non-structural polypeptides
US7491808B2 (en) 2000-06-15 2009-02-17 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. HCV non-structural protein mutants and uses thereof
US6680059B2 (en) 2000-08-29 2004-01-20 Tripep Ab Vaccines containing ribavirin and methods of use thereof
US6858590B2 (en) 2000-08-17 2005-02-22 Tripep Ab Vaccines containing ribavirin and methods of use thereof
US7022830B2 (en) 2000-08-17 2006-04-04 Tripep Ab Hepatitis C virus codon optimized non-structural NS3/4A fusion gene
ATE375804T1 (de) 2000-08-17 2007-11-15 Tripep Ab Ribavirin-enthaltende vakzine
FR2839722A1 (fr) 2002-05-17 2003-11-21 Bio Merieux Nouvelles compositions peptidiques et leur utilisation notamment dans la preparation de compositions pharmaceutiques actives contre le virus de l'hepatite c
CA2498228C (en) 2002-09-09 2011-03-22 Chiron Corporation Hcv assay
EA013385B1 (ru) 2004-06-09 2010-04-30 Пэтоджен Римувал Энд Дайэгностик Текнолоджиз Инк. Устройство для удаления целевых агентов из образца и способ
WO2007031867A2 (en) 2005-05-25 2007-03-22 Tripep Ab A hepatitis c virus non-stru tural ns3/4a fusion gene
EP1993603B1 (en) 2006-03-09 2012-05-02 Transgene SA Hepatitis c virus non structural fusion protein
WO2009022236A2 (en) 2007-08-16 2009-02-19 Tripep Ab Immunogen platform
WO2009130588A2 (en) 2008-04-22 2009-10-29 Tripep Ab Immunogen platform
FR2984328B1 (fr) 2011-12-20 2016-12-30 Bio-Rad Innovations Procede de detection d'une infection par le virus de l'hepatite c

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US390599A (en) 1888-10-02 Tool for weaver s use
US456637A (en) 1891-07-28 Fence
SE7804231L (sv) 1978-04-14 1979-10-15 Haessle Ab Magsyrasekretionsmedel
US4870008A (en) * 1983-08-12 1989-09-26 Chiron Corporation Secretory expression in eukaryotes
CA1341423C (en) † 1984-10-31 2003-03-04 Paul A. Luciw Recombinant proteins of viruses associated with lymphadenopathy syndrome and/or acquired immune deficiency syndrome
US4751180A (en) * 1985-03-28 1988-06-14 Chiron Corporation Expression using fused genes providing for protein product
ES2012739T5 (es) * 1987-11-18 2001-12-01 Chiron Corp Diagnosticos para nanbv.
HU225068B1 (en) † 1989-03-17 2006-05-29 Chiron Corp Process for producing diagnostics and vaccine of nanbh
IE65172B1 (en) * 1989-12-18 1995-10-04 Wellcome Found Viral agent
CA2032907C (en) † 1989-12-22 2002-05-14 Richard R. Lesniewski Hepatitis c assay

Cited By (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004004075A (ja) * 1994-08-12 2004-01-08 Roche Diagnostics Gmbh Ｃ型肝炎ウイルスのｎｓ３領域からの組換え抗原
JPH08127592A (ja) * 1994-08-12 1996-05-21 Boehringer Mannheim Gmbh Ｃ型肝炎ウイルスのｎｓ３領域からの組換え抗原
WO1996006355A1 (fr) * 1994-08-19 1996-02-29 Dainabot Co., Ltd. Reactif pour le dosage d'un anticorps dirige contre un antigene reduit et procede de dosage
JPH0873497A (ja) * 1994-08-31 1996-03-19 Tonen Corp Ｃ型肝炎ウイルス感染又はグループ判定のためのエピトープキメラ抗原ペプチド、その製法、及びそれを使用する感染又はグループ判定法
JPH11512606A (ja) * 1995-09-15 1999-11-02 カイロン コーポレイション ヘルカーゼ活性および改善された溶解性を有するｈｃｖ ｎｓ３タンパク質フラグメント
US6379886B1 (en) 1996-05-07 2002-04-30 Toa Medical Electronics Co., Ltd. Diagnostic regeant for hepatitis C virus infection
US7255864B2 (en) 1996-05-07 2007-08-14 Sysmex Corporation Diagnostic reagent for hepatitis C virus infection
JP2001517797A (ja) * 1997-09-22 2001-10-09 カイロン コーポレイション サンプル中の抗体を検出する方法
JP2004510133A (ja) * 2000-06-15 2004-04-02 カイロン　コーポレイション 抗ｈｃｖ抗体についてのイムノアッセイ
JP2005257700A (ja) * 2005-05-25 2005-09-22 Sysmex Corp 抗ｈｃｖ抗体の検出方法
JP2005274584A (ja) * 2005-05-25 2005-10-06 Sysmex Corp Ｃ型肝炎ウイルス感染症診断薬の製造方法
EP1978365A1 (en) 2007-03-16 2008-10-08 Sysmex Corporation Reagent kit and method for measuring HCV antibody
JP2017534056A (ja) * 2014-10-29 2017-11-16 アボット・ラボラトリーズＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｎｓ３捕捉ペプチドを使用して対象の抗ｈｃｖ抗体を検出するアッセイ
JP2018124277A (ja) * 2017-02-02 2018-08-09 三洋化成工業株式会社 粒子含有組成物、免疫測定用試薬、免疫測定方法及び粒子の保存方法

Also Published As

Publication number Publication date
DK0450931T3 (da) 1996-07-01
GB2257784A (en) 1993-01-20
DE69131488D1 (de) 1999-09-02
AU639560B2 (en) 1993-07-29
DK0693687T3 (da) 1999-11-29
NO923839D0 (no) 1992-10-01
GR3020964T3 (en) 1996-12-31
JP2733138B2 (ja) 1998-03-30
EP0450931A1 (en) 1991-10-09
DK0693687T4 (da) 2008-09-22
ES2088465T3 (es) 1996-08-16
ES2134388T5 (es) 2008-12-01
EP0450931B1 (en) 1996-06-12
GB2257784B (en) 1995-01-04
LV10344A (en) 1994-10-20
FI924349A0 (fi) 1992-09-28
NO923839L (no) 1992-11-19
WO1991015771A1 (en) 1991-10-17
KR100206150B1 (ko) 1999-07-01
RU2130969C1 (ru) 1999-05-27
BR9106309A (pt) 1993-04-20
NO310241B1 (no) 2001-06-11
FI106317B (fi) 2001-01-15
DE69120138T2 (de) 1996-11-14
IL170719A (en) 2011-04-28
LTIP1747A (en) 1995-07-25
EP0693687B1 (en) 1999-07-28
UA41266C2 (uk) 2001-09-17
LT3808B (en) 1996-03-25
FI924349A (fi) 1992-09-28
BG61291B1 (en) 1997-04-30
RO109916B1 (ro) 1995-07-28
PL172133B1 (pl) 1997-08-29
ATE182684T1 (de) 1999-08-15
GB9220480D0 (en) 1992-11-25
HU217025B (hu) 1999-11-29
HU9203146D0 (en) 1992-12-28
IL97741A0 (en) 1992-06-21
ES2134388T3 (es) 1999-10-01
HUT62706A (en) 1993-05-28
IE911105A1 (en) 1991-10-09
CY1881A (en) 1996-04-05
EP0693687B2 (en) 2008-06-04
AU7651091A (en) 1991-10-30
DE69131488T2 (de) 1999-11-18
DE69120138D1 (de) 1996-07-18
LV10344B (en) 1996-02-20
ATE139343T1 (de) 1996-06-15
GR3031361T3 (en) 2000-01-31
EP0693687A1 (en) 1996-01-24
MY107499A (en) 1995-12-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JPH05508219A (ja) 抗ｈｃｖ抗体の免疫アッセイに使用するｃ型肝炎ウイルス（ｈｃｖ）抗原の組合せ
US5683864A (en) Combinations of hepatitis C virus (HCV) antigens for use in immunoassays for anti-HCV antibodies
US6312889B1 (en) Combinations of hepatitis c virus (HCV) antigens for use in immunoassays for anti-HCV antibodies
JP3945822B2 (ja) 複数エピトープ融合タンパク質
US7056658B2 (en) Multiple epitope fusion protein
AU652851B2 (en) Hepatitis C virus from C-100-3 and env/core regions
JPH06510192A (ja) 推定上のｈｃｖ　ｅ２／ｎｓ１蛋白に対するモノクローナル抗体およびその使用方法
JP4458556B2 (ja) Ｃ型肝炎のｅ２短縮型ポリペプチドの細胞内生成
JPH07503614A (ja) Ｈｃｖ蛋白のための哺乳動物発現システム
EP2397566A1 (en) Methods for the simultaneous detection of HCV antigens and HCV antibodies
JPH04253998A (ja) Ｃ型肝炎アッセイ
EP1412538B1 (en) Methods for the simultaneous detection of hcv antigens and hcv antibodies
US5625034A (en) Core antigen protein of hepatitis C virus, and diagnostic method and kit using the same
JPH09509052A (ja) 肝炎ｃ型ウイルスエンベロープ遺伝子用の哺乳動物発現系
AU655112B2 (en) HCV peptide antigens and method of determining HCV
WO1992009634A1 (en) Non-a non-b hepatitis virus antigen protein
JPH06510191A (ja) Ｎｓ１に対する組換え抗原を利用したｃ型肝炎アッセイ
AU639560C (en) Combinations of hepatitis C virus (HCV) antigens for use in immunoassays for anti-HCV antibodies
JPH11124398A (ja) Ｃ型肝炎ウイルス由来の抗原ペプチドとそれを用いる抗体検査薬
JPH06510188A (ja) 推定ｈｃｖ　ｎｓ５タンパクに対するモノクローナル抗体およびそれを使用する方法
JPH0797398A (ja) Ｃ型肝炎用検査薬およびｃ型肝炎ウイルス抗原ペプチド
PT97247B (pt) Processo de preparacao de combinacoes de antigenios do virus da hepapite c (hcv) para uso em imunoensaios para anticorpos anti-hcv
Bosman Maertens et al.(43) Pub. Date: Nov. 23, 2006

Legal Events

Date Code Title Description
R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

RVTR Cancellation due to determination of trial for invalidation