BG61291B1 - Combinations of hepatitis c virus (hcv) antigens for use inimmunoassays for anti-hcv antibodies - Google Patents

Combinations of hepatitis c virus (hcv) antigens for use inimmunoassays for anti-hcv antibodies Download PDF

Info

Publication number
BG61291B1
BG61291B1 BG96943A BG9694392A BG61291B1 BG 61291 B1 BG61291 B1 BG 61291B1 BG 96943 A BG96943 A BG 96943A BG 9694392 A BG9694392 A BG 9694392A BG 61291 B1 BG61291 B1 BG 61291B1
Authority
BG
Bulgaria
Prior art keywords
hcv
domain
antigens
polypeptide
polypeptide epitope
Prior art date
Application number
BG96943A
Other languages
English (en)
Inventor
Michael Houghton
Qui-Lim Choo
George Kuo
Original Assignee
Chiron Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=24005897&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=BG61291(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Chiron Corp filed Critical Chiron Corp
Publication of BG61291B1 publication Critical patent/BG61291B1/bg

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
    • G01N33/5767—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis non-A, non-B hepatitis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
    • C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Thermistors And Varistors (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Настоящото изобретение се отнася до имуноизследване на хепатит-С вирус (HCV), (наричан по-рано нито-А, нито-В хепатитен 10 вирус). По-специално то се отнася до състави на HCV антигени, позволяващи широк обхват от имуноизследвания за анти-HCV антитела.
ПРЕДШЕСТВАЩО СЪСТОЯНИЕ НА 15 ТЕХНИКАТА
Заболяването, известно по-рано като хепатит нито-А, нито -В (NANBH) се разглежда като преносимо заболяване или фамилия 20 от заболявания, за които се приема, че се предизвикват от вирус и се различават от други форми на вирусни чернодробни заболявания, включително тези причинявани от известния хепатитен вирус, например вируса на хепатит 25 А (НAV), вируса на хепатит В (НВV) и вируса на делта хепатит (HDV), както и от хепатита, предизвикван от ситомегаловирус (CMV) или Епщайн-Бар вирус (EBV). NANBH е идентифициран най-напред при подлагани на тран- зо сфузия индивиди. От пренасянето на шимпанзе от човек и при серийните пасажи при шимпанзета се вижда, че NANBH се дължи на преносим инфекциозен агент или агенти. Епидемиологичните данни подсказват, че може би 35 има три типа на NANBH; пренасян с водата епидемичен тип, пренасян с кръвта или парентерално пренасян тип и спорадично явяващ се (придобиван от условията) тип. До скоро не беше идентифициран преносим агент, 40 предизвикващ NANBH, и клиническата диагноза и идентифицираше на NANBH се извършване главно чрез изключване на други вирусни маркери. Измежду методите, използвани за откриване на вероятни NANBH антиге- 45 ни и антитела са агар-гелната дифузия, имуноелектрофорезата с брояч, имунофлуоресцентната микроскопия, имунната електронна микроскопия, радиоимуноизследването и свързваното с ензим имуносорбентно изследване. Никое 50 от посочените изследвания не е достатъчно чувствително, специфично и възпроизводимо, за да бъде използвано като диагностичен тест за NANBH.
Идентифицирана е първата нуклеинова киселина, определено свързана с пораждания от кръв NANBH. /1 и 2/. Тези публикации описват клонирането на един изолат от нов вирусен клас, хепатит-С вирус (HCV), като прототипният изолат, описан там, е наречен “HCV1”. HCV е Флави-подобен вирус, с РНКов геном.
В US 456,637 се описва получаването на различни рекомбинантни HCV полипептидни чрез експресия на HCV сДНК и скрининг на тези полипептиди за имунологична реактивност със серуми от пациенти с HCV. Този ограничен скрининг показва, че най-малко пет от изпитаните полипептиди са силно имуногенни, особено тези идентифициран като 5-1-1, С100, СЗЗс, СА279а и СА290а. От тези пет полипептида 5-1-1 е разположен в предполагаемия NS4 домен; С100 заема предполагаемите NS3 и NS4 домени, СЗЗс е разположен в предполагаемия NS3 домен и СА279а и СА290а са разположени в предполагаемия С домен. Скринирането сочи също, че нито един изпитан единичен полипептид не е имунологично реактивен с всички серуми. Затова са желателни подобрени тестове, които да реагират с всички или с повечето проби от HCV положителни пациенти.
СЪЩНОСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО
Извършени са допълнителни серологични изследвания върху HCV антигени, които потвърждават, че нито един единичен HCV полипептид, идентифициран до днес, не е имунологично реактивен с всички серуми. Тази липса на единичен полипептид, който да е универсално реактивен с всички серуми от индивиди с HCV, може да се дължи на отклонение от щам до щам в HCV епитопите, различие в хуморалната реакция от индивид до индивид и/или отклонения в серологията според състоянието на болестта.
Тези допълнителни проучвания позволяват да се идентифицират комбинации от HCV антигени, които предлагат по-ефективно откриване на HCV антитела, отколкото на който и да е единичен HCV полипептид.
От една страна, настоящото изобретение се отнася до комбинация от HCV антигени, i
която се състои от:
(а) един пръв HCV антиген от С домена и (в) най-малкото един допълнителен HCV антиген, избран от групата, състояща се от:
(I) един HCV антиген от NS3 домена;
(II) един HCV антиген от NS4 домена;
(III) една HCV антиген от S домена и (IV) един HCV антиген от NS5 домена. При един вариант на изпълнение, комбинацията от HCV антигени е под формата на слят протеин, съставен от антигените. При друго изпълнение комбинацията от антигени е под формата на отделни антигени, свързани към общ твърд матрикс. При друг вариант комбинацията от антигени е под формата на смес от отделните антигени.
Друга страна на изобретението е метод за откриване на антитела на HCV в компонент на тялото на бозайник, за който се предполага, че съдържа посочените антитела, включващ контактуване на споменатия телесен компонент с описаната по-горе комбинация от антигени при условия, позволяващи реакция антитяло-антиген и откриване присъствието на имунни комплекси на антителата с антигените.
Друг аспект на изобретението е метод за откриване на антитела за HCV в компонент на тялото на бозайник, за който се предполага, че съдържа посочените антитела, включващ контакт на споменатия телесна компонент с група HCV антигени, едновременно или последователно, състояща се от:
(а) един първи HCV антиген от С домена и (в) най-малкото един допълнителен HCV антиген; и избран от групата, състояща се от:
(I) един HCV антиген от NS3 домена;
(II) един HV антиген от NS4 домена;
(III) един HCV антиген от S домена и (IV) един HCV антиген от NS5 домена при условия, които позволяват реакция антитяло-антиген и откриване наличността на имунни комплекси на споменатите антитела със споменатите антигени.
Друга страна на изобретението е комплект за извършване изследването за откриване на антитела за HCV в компонент на тяло на бозайник, за който се предполага, че съдържа посочените антитела, представляващ опакована комбинация, включваща:
(а) посочената комбинация от HCV антигени;
(в) стандартни контролни реактиви; и (с) инструкции за извършване на изследването.
Кратко описание на фигурите
Фигура 1 представлява нуклеотидната последователност на сДНК смислена и комплементарна верига за HCV полипротеин и аминокиселинна последователност, кодирана от смислената верига (послед.Ю N0:9 и послед. IDNO:10).
Фигура 2 - схематично представяне на аминокиселинната последователност от фигура 1 показваща предполагаемите домени на HCV полипептидите.
Дефиниции “HCV антиген” представлява един полипептид с най-малко пет аминокиселини, по обикновено най-малко около осем до десет аминокиселини, които определян един епитоп, установен в изолат на HCV. За предпочитане, епитопът е уникален за HCV. Когато един антиген се означава чрез азбучно номериран код, епитопът е от HCV домена, означен чрез буквен номер.
“Синтетичен” както се използва за охарактеризиране на HCV антиген, означава, че HCV антигенът или е изолиран от естествени източници или е изработен от човек чрез химическа или рекомбинантна синтеза.
“Домени” означават тези от HCV полипротеина, посочен на фигура 2, който общо отговарят на предполагаемите структурни и неструктурни протеини на HCV. Означенията на домените следват обикновено договореността за наименоване на флавивирусните протеини. Разположението на домените, посочено на фигура 2, е само приблизително. Означението “NS” означава неструктурни домени, “S” - домен на обвивката и “С” - домен на нуклеокапсида или сърцевината.
“Слят полипептид” означава полипептид, в който HCV антигенът (ите) е (са) част от единична непрекъсната верига на аминокиселини, която верига не се среща в природата. HCV антигенът може да бъде свързан директно към всеки друг чрез пептидни връзки или да бъде отделен чрез вмешателството на аминокиселинните последователности. Слетите полипептиди могат също да съдържат аминокиселинни последователности, екзогенни за HCV.
“Общ твърд матрикс” означава твърдо ν-Λ· «,,χ ‘ΑΛ'·?·· тяло, към което са свързани ковалентно или по нековалентен начин като например чрез хидрофобна адсорбция слетите полипептиди, съдържащи се от HCV антигените.
“Компонент на тяло на бозайник” означава течност или тъкан от бозайник (например човек), съдържащи обикновено антитела, продуцирани от индивида. Компоненти от този вид са известни и от нивото и включват, без ограничение, кръв, плазма, серум, спинална течност, лимфна течност, секреции от дихателния, чревния или генитално-уринарния тракт, сълзи, слюнка, мляко, бели кръвни телца и миеломи.
“Имунологично реактивен” означава, че антигенът, за който става въпрос, ще реагира специфично с анти-HCV антитяло, обикновено присъстващо в значителна степен в серумите от индивиди, инфектирани с HCV.
“Имунен комплекс” се отнася до комбинация или агрегат, образуван когато едно антитяло се свързва към един епитоп върху един антиген.
Комбинации на HCV антигени
На фигура 2 са показани предполагаемите домени на HCV полипротеина. Домените, от които произхождат използваните антигени в комбинациите, са: С, S (или Е), NS3, NS4 и NS5. За “С” домена се приема, че определя нуклеокапсидния протеин на HCV. Той се разпростира от N-края на полипротеина до приблизително аминокиселина 120 от фигура 1. За “S” домена се приема, че определя протеина на обвивката на вириона и може би матриксния (М) протеин и се приема, че се простира от приблизително аминокиселина 120 до аминокиселина 400 от фигура 1. NS3 доменът се простира приблизително от аминокиселина 1050 до аминокиселина 1640 и се приема, че съставлява вирусната протеаза. NS4 доменът се разпростира от края на NS3 до приблизително аминокиселина 2000. Функцията на този NS4 протеин не е известна засега. NS5 доменът се простира от около аминокиселина 2000 до края на полипротеина и се приема, че определя вирусната полимераза.
Последователността, посочена на фигура 1, е на НСVI изолат. Очаква се последователностите на други щамове от получени от кръв HCV да се различават от последователността във фигура 1, специално в домените на обвивката (S)h нуклеокапсида (С). Използването на HCV антигени, имащи такива различни последователности, са в обхвата на настоящото изобретение, при положение, че разликата не уврежда значимо имунологичната реактивност на антигена към серуми от лица, инфектирани с 5 HCV.
Общо, HCV антигените обхващат целите или съкратените домени, като фрагментите от домените лесно могат да се скринират по антигенност от специалистите в тази област. Отделните HCV антигени, използвани в комбинацията, включват за предпочитане имунодоминатната част (т.е. частта отговорна предимно за имунологичната реактивност на полипептида) на определения домен. В случая с “С” домена се предпочита, антигена за С домена да включва по-голямата част от цялата последователност на домена. Антигенът, означен със С22 (виж пример 4, по-долу) се предпочита специално. Антигенът за S домена включва за предпочитане хидрофобен субдомен в N- края на домена. Този хидрофобен субдомен се разпростира от приблизително аминокиселина 199 до аминокиселина 328 от фигура 1. HCV антигенът, означен със С22 (виж пример 3 по-долу), се предпочита специално. Последователност в посока downstream от хидрофобния субдомен може да бъде включена в антигена на S домена, ако това се желае.
Един предпочитан антиген на NS3 домена е антигенът, означен със СЗЗс. Този антиген включва аминокиселини от 1192 до 1457 от фигура 1. Един предпочитан NS4 антиген е С100, който обхваща аминокиселини от 1569 до 1931 от фигура 1. Един предпочитан NS5 антиген обхваща аминокиселини 2054 до 2464 от фигура 1.
HCV антигенът може да е под формата на един полипептид, съставен изцяло от HCV аминокиселинна последователност или може да съдържа последователност, екзогенна за HCV (т.е. може да е под формата на слят протеин, който включва екзогенна последователност). В случая на рекомбинантно получен HCV антиген, продуциращ антигена като слят протеин като с SOD, алфа фактор или убихитин (виж /4/, /5/, и /6/, изводите от които са включени тук и които описват експресията на SOD, алфа фактор и убихитин слети протеини) това може да повиши степента на експресия и/или да повиши разтворимостта на антигена във вода. Слети протеини като сливане на алфа фактори или на убихитин, се осъществяват чрез експресията на гостоприемника за отстраняване на хетероложната последователност. Алфа факторът е секреторна система, докато слетият убихитин остава в цитоплазмата.
Освен това комбинацията от антигени може да бъде пордуцирана като слят протеин. Например, един непрекъснат фрагмент от ДНК кодираща С22 и СЗЗс може да бъде конструиран, клониран в един експресионен вектор и използван за експресия на слят протеин на С22 и СЗЗс. По подобен начин слетите протеини на С22 и С100, на С22 и S2, на С22 и на един NS 5 антиген, на С22, СЗЗс и S2, на С22, С100 и S2 и на С22, СЗЗс, С100 и S2 могат да бъдат получавани. Може да бъдат използвани също други фрагменти от посочените като пример домени.
Получаване на HCV антигени
HCV антигените от изобретението се получават за предпочитане рекомбинантно или чрез известна твърдо фазова химическа синтеза. Те могат обаче да бъдат изолирани от дисоцииран HCV или от HCV частици при използване на техниките на афинитетната хроматография, използвайки антитела за антигените.
Когато се получават чрез рекомбинантни техники, се използват стандартни методи за конструиране на ДНК кодираща антигена, клониране на тази ДНК в експресионни вектори, трансформация на клетки гостоприемници като бактерии, дрожди, насекоми или клетки от бозайник, и експресия на такава ДНК за продуциране на антигена. Както е посочено по-горе, може антигенът да се експресира като слят протеин за повишаване експресията и за улесняване на пречистването или за повишаване разтворимостта. Специфични процедури за получаване на представителни HCV антигени са описани в примерите по-долу, и в основното патентно описание регистров номер 456,637.
Форумлиране на антигени за използване в имуноизследавнето.
HCV антигените могат да бъдат комбинирани чрез получаването им под формата на слят протеин, съставен от два или повече антигена, чрез имобилизирането им индивидуално върху общ твърд матрикс, или чрез физичното им размесване. Слетите протеини на антигените могат също да бъдат имобилизирани (или свързани) върху твърд матрикс.
Методи и средства за ковалентно или нековалентно свързване на протеини към твърди матрикси, са известни от състоянието на техниката. Естеството на твърдата повърхност ще варира в зависимост от начина на изследването. За изследвания протичащи в микротитърни панички с ямки, твърдата повърхност ще е стената на ямката или блюдото. За изследване при използване на перли, твърдата повърхност ще бъде повърхността на перлата. При изследвания, използващи пробод, (например твърдо тяло, изработено от порьозен или влакнест материал като платно или хартия), повърхността ще бъде повърхността на материала, от който е изработен прободът. При аглутинационно изследване твърдата повърхност може да е повърхността на латексни или желатинови частици. Когато отделни антигени се свързват към матрикса, те може да бъдат разпределени хомогенно върху повърхността или да бъдат разпределени на проби като ивици, така че свързващите антигени да са различими.
Прости смеси на антигени представляват антигените във всеки подходящ разтворител или дисперсионна среда.
Начини на изследване при използване на комбинация от антигени
HCV антигените могат да бъдат използвани при всеки начин на изследване, използващо познат антиген за откриване на антитяло. Общ белег на всичките изследвания е, че антигените контактуват с телесния компонент, за който се предполага, че съдържа HCV антитела при условия, които позволяват антигенът да се свързва към всяко такова антитяло, налично в компонента. Такива условия са физиологичната температура, pH и йонната сила при използване на излишък от антиген. След инкубирането на антигена с пробата следва откриване на имунни комплекси съставени от антигена.
Формите на имуноизследването са много и са известни от нивото. Протоколите може например да използват твърди подложки или имунопреципитация. Повечето изследвания включват използването на белязано антитяло или полипептид; белязането може да е ензимно, флуорсцентно, химилуминесцентно, радиоактивно или чрез багрилни молекули. Изследвания, които усилват сигналите от имунния комплекс са също известни; примери, при които се използва за изследването биотин и авидин, и белязане с ензим и посредствани имуноизследвания, като ELISA са също известни.
Имуноизследването може да е без ограничения, в хетерогенна или в хомогенна форма, и от стандартен или компетитивен тип. При един хетерогенен начин, полипептидът е свързан типично към твърд матрикс или подложка за улесняване отделянето на пробата от полипептида след инкубиране. Примери за твърди подложки, които могат да бъдат използвани, са нитроцелулоза (например мембранна или под форма на микротитърна паничка с ямки), поливинилхлорид (например на листове или микротитърна поничка с ямки), полистиренов латекс (например като перла или микротитърни панички), поливинил флуорид (известен като “Имулон”©) , диазотирана хартия, найлонови мембрани, активирани перли и перли от протеин А. Например Dynatech, Имунолон®'или Имунолон©2 микротитърни панички или 0,63 cm полистиренови перли (прецизна пластмасова топка) могат да бъдат използвани при хетерогенния начин. Твърда подложка, съдържаща антигенните полипептиди, се промива типично след отделянето й от тест-пробата и преди откриването на свързаните антитела. От нивото са известни както стандартният така и компетитивният начин.
При един хомогенен начин, тест-пробата се инкубира с комбинацията от антигени в разтвор. Например, това може да е при условия, при които ще преципитират всички образувани комплекси антиген-антитяло.
От състоянието на техниката са известни както стандартният така и компетитивният начин.
При един стандартен начин, количеството HCV антитела, образуващи комплекса антитяло-антиген, директно се визуализира. Това може да се осъществи чрез определяне, дали белязани антиксеногени (т.е. античовешки) антитела, които разпознават един епитоп върху анти-HCV антитела, ще се свържат поради образуването на комплекс. При компетитивния начин количеството HCV антитела в пробата се извежда чрез следене на компетитивния ефект върху свързването на известно количество белязано антитяло (или друг компетитивен лиганд) в комплекса.
Образуваните комплекси, съдържащи анти HCV-антитяло (или в случая с компетитивно изследване, количество компетитивно ан20 титяло) се откриват чрез всяка от известните техники, в зависимост от начина. Например, небелязани HCV антитела в комплекса могат да бъдат откривани чрез използване на коню5 гат на антиксеногенен lg (имуноглобулин) в комплекс с белязане, например ензимно.
При изследване чрез имунопреципитация или алгутинация реакцията между HCV антигените и антитялото образува мрежа, коя10 то преципитира от разтвора или суспензията и образува видим слой или филм от преципитата. Ако не присъства никакво анти-HCV антитяло в тест-пробата, не се образува видим преципитат.
HCV антигените се опаковат във формата на комплект за използване при тези имуноизследвания. Обикновено комплектът съдържа в отделни съдове комбинацията от антигени (или вече свързани към твърд матрикс или разделени, с реактиви за свързването им към матрикса), препарати с контролно антитяло (позитивни и/или отрицателни), белязано антитяло, когато начинът на изследване изисква това и реактиви генериращи сигнал (например ензимен субстрат), ако белязването не генерира директно сигнал. Обикновено в комплекта са включени инструкции, например писмени, на лента, VCR, CD-ROM и т.н. за извършване на изследването.
Следващите примери илюстрират изобретението, без да го ограничават.
Пример 1. Синтез на HCV антиген СЗЗс. HCV антиген СЗЗс съдържа една последователност от NS3 домена. Специфично той включва аминокиселини от 1192 до 1457 от фиг.1. Този антиген се продуцира в бактерии като слят протеин с човешка супероксид дисмутаза (SOD) както следва. Векторът pSODcfl (виж./7/) се смила напълно с EcoRl и BamHl, а полученият EcoRl, BamHl фрагмент се лигира към следващия линкер за получаване на pcflEF:
GATC CTG GAA ТТС TGA ТАА (последователност 1DNO:1)
GAC СТТ AAG ACT АТТ ТТА А (последов. (IDNO:2)
Един сДНК клон, кодиращ аминокиселини 1192 - 1457 и имащ EcoRl краищата се инсерира в pcfEF за получаване на pcfEF/ СЗЗс. Тази експресионна конструкция се трансформира в D 1210 клетки на E.coli.
Трансформантите се използват за екс пресия на един слят протеин, съставен от SOD в N-края и вътрешна рамка СЗЗс HCV антиген в С-края. Експресията се извършва чрез инокулиране на 1500 ml бульон Luria, съдържащ ампицилин (100 pg/ml/) с 15 ml от една денонощна култура от трансформантите. Клетките се отглеждат до оптическа плътност O.D. от 0,3, добавя се IPTG за получаване на крайна концентрация 2 тМ, и култивирането продължава, докато клетките достигнат плътност от 10.D., в което време те се събират чрез центрофугиране при 3000 х g при 4°С за 20 min. Сбитите клетки могат да се съхраняват при -80°С в продължение на няколко месеца.
С оглед пречистване на SOD- СЗЗс полипептида, бактериалните клетки, в които е експресиран полипептидът, се подлагат на осмотичен шок и на механично разрушаване, неразтворимата фракция, съдържаща SOD-СЗЗс, се изолира и се подлага на диференциално екстрахиране с алкален разтвор на натриев хлорид, а слетият полипептид в екстракта се пречиства чрез хроматография върху колони със S-сефароза и Q-сефароза.
Суровият екстракт, получен от осмотичния шок и механично разрушаване, подготвя чрез следващата процедура. 1 g сбити клетки се суспендира в 10 ml разтвор, съдържащ 0,02 М Tris-HCl, pH 7,5, 10 тМ ЕДТА, 20% захароза и се инкубират 10 min върху лед. Тогава клетките се утаяват чрез центрофугиране при 4 000 х g за 15 min при 4°С. След отделянето на супернатантата, утаените клетки се суспендират повторно в 10 ml буфер Al (0,01 М TrisHCl, pH 7,5, 1 тМ ЕДТА, 14 тМ бета-меркаптоетанол (ВМЕ) и се инкубират върху лед за 10 min. Клетките се утаяват отново 4 000 х g за 15 min при 4°С. След отстраняване на бистрата супернатанта (периплазматична фракция 1), утаените клетки се суспендират отново в буфер А1, инкубират се върху лед за 10 min и се центрофугират при 4000 х g за 15 min при 4°С. Бистрата супернатанта периплазматична фракция II) се отстранява и утаените клетки се суспендират повторно в 5 ml буфер А2 (0,02 Tris НС1, pH 7,5, 15 тМ ВМЕ, 1 тМ EDTA, 1 тМ PMSF). С оглед разрушаване на клетките, суспензията (5 ml) и 7,5 ml Dyno-mill без олово, с промити киселина стъклени перли (0,10-0,15 mm диаметър) (получени от Glen-Mills, Inc.) се поставят в епруветка на фалкон и се разбъркват на Vortex при най-високата скорост за най малко 2 min, последвано от охлаждане върху лед за най-малко 2 min; процедурата разбъркване-охлаждане се повтаря четирикратно. След разбъркването на Vortex, суспензията се филтрира през сцинтерована стъклена фуния при използване на слабо смукане. Стъклените перли се промиват два пъти с буфер А2 и филтратите и промивните течности се обединяват.
Неразтворимата фракция на суровия екстракт се събира чрез центрофугиране при 20 000 х g за 15 min при 4°С, промива се два пъти с 10 ml буфер А2, и се суспендира отново в 5 ml от MILLI-Q вода.
Една фракция, съдържаща SOD-СЗЗс, е изолирана от неразтворимия материал чрез добавяне към суспензията на натриева основа (2М) и натриев хлорид (2 М) до получаване на крайна концентрация от 20 тМ всяка, сместа се разбърква на Vortex 1 min, центрофугира се при 20 000 х g за 20 min при 4°С и се запазва супернатантата.
С оглед пречистването на SOD СЗЗс върху S- сефароза, супернатантата се довежда до крайна концентрация от 6 М уреа, 0,5 М Tris НС1, pH 7,5, 14 тМ ВМЕ, 1 тМ ЕДТА. След това тази фракция се поставя в колона със Sсефароза, течаща бързо (1,5 х 10 cm) която е уравновесена с буфер В (0,05 М Tris солна киселина, pH 7,5, 14 тМ ВМЕ, 1 тМ ЕДТА). След прилагането, колоната се промива с два обема на колоната буфер В. Преминаващата и промивната фракция се обединяват. Скоростта на протичане и промиване е 1 ml/min, а събраните фракции са 1 ml. С оглед инедтифициране на фракциите, съдържащи SOD - СЗЗс, аликвотни части от фракциите се анализират чрез електрофореза върху 10% полиакриламидни гелове, съдържащи SDS последвано от оцветяване с Coomassie blue. Фракциите се анилизират също чрез Western блотинг при използване на антитяло, насочено срещу SOD. Фракциите, съдържащи SOD -СЗЗс, се обединяват.
Следващото пречистване на SOD-СЗЗс се осъществява върху колона (1,5 х 5 cm с Q Сефароза, която се уравновесява с буфер В. Събраните на едно място фракции, съдържащи SOD-СЗЗс, получени от хроматография върху S-Сефароза, се полагат върху колоната. Тогава колоната се промива с буфер В и се елюира с 60 ml градиент 0,0 до 0,4 М натриев хлорид в буфер В. Скоростта на протичане за прилагане, промиване и елюиране е 1 ml/min;
-Μ· 61291 събираните фракции са по 1 ml. Всичките фракции от колоната i Q-Сефароза се анилизират, както е описано за колоната със S-Сефароза. Пикът на елюиран SOD-СЗЗс от колоната е около 0,2 М натриев хлорид.
SOD -СЗЗс, получен от колоната с QСефароза е с чистота над около 90%, както се преценява чрез анализ върху полиакриламидни SDS гелове и имуноблотинг, при използване на моноклонално антитяло, насочено срещу човешки SOD.
Пример 2. Синтез на HCV антиген С100.
HCV антиген С100 съдържа последователности от NS3 и NS4 домените. Специфично, той включва аминокиселини 1569-1931 от фигура 1. Този антиген се продуцира в дрожди. Приготвя се един сДНК фрагмент от 1270 Ьр кодиращ горните аминокиселини и имащ EcoRI краища.
Конструирането на дрождевия експресионен вектор в който този фрагмент се слива директно към ADH2/GAP, промотора на S.cerevisiae се осъществява по схема, която включва амплифициране на С100 последователността при използване на PCR метода, последвано от лигиране на амплифицираната последователност в клониращ вектор. След клониране, CI00 последователността се изразява и чрез последователност, която съдържа ADH2/GAP промотора, се лигира към голям фрагмент на дрождев вектор, за получаване на дрождев експресионен вектор.
PCR амплификацията на С100 се извършва при използване като матрица на вектора pS3-56C100m., който е линеаризиран чрез смилане със Sali. pS3-56, който е pBR322 производно, съдържа експресионна касета, която е съставена от ADH2/GAPDH хибриден дрождев промотор в посока upstream от гена на човешка супероксид дисмутаза и в посока downstream от алфа фактор за край на транскрипция.
Олигонуклеотидните праймери, използвани за амплификацията, са създадени за улесняване клонирането в ексресионния вектор и за въвеждане на кодона за край на транслация. Специфично, нови 5'-HindIII и 3’SalI сайтове се генерират с PCR олигонуклеотиди. Олигонуклеотидът съдържащ Sall сайта, също кодира двойните терминаторни кодони ТАА и TGA. Олигонуклеотидът, съдържащ Hindlll сайта, също съдържа една нетранслирана водеща последователност, произхождаща от pgap63 гена, разположен непосредствено в посока upstream от AUG кодона. pEco63GAPDH генът е описан от Holland (1980) и от Kniskern и сътр. (1986). PCR праймерните последователности 5 използвани за директна експресия на С100 т, са:
5’GAG TGC ТСА AGC ТТС AAA АСА AAA TGG СТС
ACT ТТС TAT ССС AGA CAA AGC 10 AGC GT 3' (последователност ID N0:3) и
5' GAG TGC TCG TCG ACT CAT TAG GGG GAA
ACA TGG ТТС CCC CGG GAG GCG 15 AA 3' (последователност ID N0:4)
Амплификацията на PCR, използвайки праймерите и матрица става с един cetusPerkin-Elmer PCR комплект и се извършва съг20 ласно указанията на производителя. Условията за PCR са: 29 цикъла при 94°С за 1 min, 37°С за 2 min, 72°С за 3 min и крайно инкубиране при 72°С за 10 min. ДНК може да бъде съхранявана при 4°С или при -20°С едно денонощие.
След амплификацията PCR продуктите се смилат с Hindlll и Sall. Главният продукт от 1,1 kb се пречиства чрез гелелектрофореза, а елюираният пречистен продукт се лигира с един голям Sall-Hindlll фрагмент на PBR322. С оглед изолиране на правилни рекомбинанти, компонентни НВ101 клетки, се трансформират с рекомбинантните вектори и след клониране желаните рекомбинанти се идентифицират въз основа на предсказаната големина на Hindlll-Sall фрагментите, изрязани от клоновете. Един от клоновете, който съдържа Hindlll-Sall фрагмента с правилната големина, се нарича pBR322/C100 d. Потвърждаването, че този клон съдържа ампилифициран С100, става чрез директен анализ за последователността на Kindlll-Sall фрагмента.
Експресионният вектор, съдържащ С100, се конструира чрез лигиране на Hindlll-Sall фрагмента от pBR322/C100 d към един 13,1 kb BamHI-Sall фрагмент на pBS24.1, и един 1369 bp Bam-Hl-HindIII фрагмент, съдържащ ADH2/GAP промотор. (Последният фрагмент е описан в ЕР 164,556). pBS24.1 векторът е описан в литературен източник /8/. ADH2/ GAP промоторният фрагмент се получава чрез смилане на вектора pPGAP/AG/Hind III с Hindlll и BamHI, последвано от пречистване на 1369 bp фрагмент върху гел.
Компоненти НВ101 клетки се трансформират с рекомбинантни вектори, а правилните рекомбинанти се идентифицират чрез генериране на 2464 Ьр фрагмент и един 13.1 kb фрагмент, генериран чрез смилане с BamHI и Sall на клонираните вектори. Един от клонираните правилни рекомбинантни вектори е наречен рСЮО'd № 3.
С оглед да се експресира С100, компетентни клетки от Saccharomyces cerevisiae щам АВ122 (МАТа leu игаЗ- 53 prb cir-0 1-1122 рер4-3 prcl-407-[cir -0] се трансформират с екпресионния вектор рСЮО d №3. Клетките се посяват върху среда с URA-сорбитол и единичните трансформанти се посяват на щрих върху Leu’ петрита.
Отделни клонове се култивират в Leu*, ига среда с 2% глюкоза при 30°С за 24 до 36 h. 1 1 от дрождев екстракт пептонна среда (УЕР), съдържаща 2% глюкоза, се инокулира с 10 ml денонощна култура, а получената култура се култивира при 30°С при скорост на разбъркване от 400 об./min и при степен на аерация от 1 /1 въздух 1 среда/ min (т.е. lvm) за 48 h. pH на средата не се контролира. Културата се култивира в BioFlo 11 ферментатор, изработен от New Brunswick Scince Corp. След ферментацията, клетки се изолират и се анализират за експресия на С100.
Анализът за експресия на С100 полипептид от трансформираните клетки се извършва върху цялостни клетъчни лизати и сурови екстракти, получени от единични дрождеви колонии, получени върху Leu петрита. Клетъчните лизати и суровите екстракти се анализират чрез електрофореза върху SDS полиакриламидни гелове, и чрез Western блотинг. Western хибридизацията използва за проба поликлонални антитела, насочени срещу SODС100 полипептида, експесиран в дрожди. Очакваната големина на С100 полипептида е 364 аминокиселини. Чрез гел - анализ се установява, че експресираният полипептид има MWr от 39,9 К.
И двата аналитични метода сочат, че експресираният полипептид С100 присъства в цялостните клетъчни лизати, но липсва в суровия екстракт. Тези резултати подсказват, че експресираният С100 полипептид може да е неразтворим.
Пример 3. Експресия на HCV антиген S2.
HCV антиген S2 съдържа една последователност от хидрофобния N-край на S домена. Той включва аминокиселините 199 - 328 от фигура 1.
Схемата за конструиране на експресионния вектор, кодиращ S2 полипептида, и за неговата експресия в дрожди е аналогична на тази, използвана за екпресията на С100 полипептида, описана в пример 2. Матрицата за PCR реакцията е векторът pBR322/Pil4a, който е линеаризиран чрез смилане с Hind III. Pil4a е сДНК клон, кодиращ аминокиселини 199-328.
Използваните като праймери олигоиуклеотиди за амплификация;чрез PCR на S2 кодиращата последователност са следващите за 5'-областта на S2 последователността:
5' GAG TGC ТСА AGC ТТС ААА АСА AAA TGG GGG ТСТ
ACC ACG ТСА CCA ATG ATT GCC СТА АС 3' (последователност ID N0:5) за 3' областта на S2 последователността: 5' GAG TGC TCG TCG ACT CAT TAA GGG GAC CAG TTC
ATC ACT ATA TCC CAT GCC AT 3' (последователност ID N0:6).
Праймерът за 5'-областта въвежда един Hindlll сайт и един ATG стартов кодон в амплифицирания продукт. Праймерът за 3' областта въвежда кодони за край на трнслация Sall сайт в амплифицирания продукт.
PCR условията са 29 цикъла при 94°С за 1 min, 37°С за 2 min, 72°С за 3 min и крайно инкубиране при 72°С за 10 min.
Главният продукт на PCR реакцията е един 413 Ьр фрагмент, който се пречиства през гел. Пречистеният фрагмент се лигира към големия фрагмент, получен от рВР322, смлян с Hindlll и Sall фрагмент даващ плазмида pBR322/S2d.
Лигирането на 413 bp HindIII-SalIS2 фрагмент с 1,36 kb BamHI-Hindlll фрагмента, съдържащ ADH2/GAP промотора и с големия BamHI-Sall фрагмент на дрождевия вектор pBS24.1 дава рекомбинантните вектори, които се клонират. Правилни рекомбинантни вектори се идентифицират по наличността на един 1.77 КЬ фрагмент след смилане с BamHI и със Sall. Един експресионен вектор, конструиран от амплифицираната последователност и съ9
държащ последователността кодираща S2, директно слят към ADH2/GAP промотора, се идентифицира като р S2d №9.
Пример 4. Синтеза на HCV С антиген
HCV антиген С22 е от С домена. Той съдържа аминокиселини 1 - 122 от фигура 1.
Протоколът за конструиране на експресионния вектор, кодиращ С полипептида и неговата експресия в дрожди има аналогия с този използван за експресия на С100 полипептида, описан по-горе, с изключение на следващото:
Матрицата за PCR реакцията е pBR322/ Ag30a, който е линеаризиран с Hindlll. Ag30 е сДНК клон, кодиращ аминокиселини 1-122. Олигонуклеотидите, използвани като праймери за амплификация чрез PCR на С кодиращата последователност са следните:
За 5' областта на С последователността: 5' GAG TGC AGC ТТС AAA АСА AAA TGA GCA CGA
ATC CTA AAC CTC AAA AAA AAA AC 3' (последователност ID N0:7) за 3' областта на C последователността: 5' GAG TGC TCG TCG ACT CAT TAA CCC AAA TTG CGC
GAC CTA CGG GGG TCT, GT 3' (последователност ID N0:8)
Праймерът за 5' областта въвежда един Hindlll сайт в амплифицирания продукт, а праймерът за 3' областта въвежда кодон за край на трансланция и един SaLI сайт. PCR се осъществява в 29 цикъла при 94°С за 1 min, 37°С за 2 min, 72°С за 1 min и крайното инкубиране е при 72°С pd 10 min.
Главният продукт на PCR амплификацията е 381 Ьр полинуклеотид. Лигирането на този фрагмент със Sall-Hindlll големия SallHindlll фрагмент дава плазмида pBR322/C2.
Лигирането на 381 bp Hindlll-Sall С кодиращ фрагмент, изрзязан от pBR322/C2 с 1.36 kb BamHI-Hindlll фрагмент, съдържащ ADH2/ GAP промотора и с големия BamHI-Sall фрагмент на дрождевия вектор pBS24.1 дава рекомбинантни вектори, които се клонират. Правилни рекомбинантни вектори се идентифицират по присъствието на един 1.74 kb фрагмент след смилането с BamHI и Sall. Един експресионен вектор, конструиран от амплифицирана последователност и съдържащ последователността кодираща директно слят С към
ADH2/GAP промотора, се идентифицира като рС22.
Анализ за експресиран С полипептид чрез трансформирани клетки се извършва вър5 ху цялостни клетъчни лизати и сурови екстракти, получени от единични дрождеви колони, получавани от Leu- блюда. Клетъчните лизати и суровите екстракти се анализират чрез електрофореза върху SDS полиакриламидни 10 гелове. С полипептидът се очаква да има 122 аминокиселини и чрез гелен анализ експресирания полипептид има MW от приблизително 13.6 kb.
Пример 5. Синтез на NS5 полипептид
Този полипептид съдържа последователност от N-края на NS5 домена. Специфично той включва аминокиселини от 2054 до 2464 от фигура 1. Протоколът за конструиране на експресионния вектор, кодиращ NS5 полипеп20 тида и за неговата експресия са аналогични с използваните за експресия на СЗЗс (виж пример 1).
Пример 6. Радиоимуноизследване (RIA на антитела за HCV.
HCV антигените от примери 1 до 5 се изпитват по RIA за тяхната пригодност за откриване на антитела за HCV в серум на индивиди, клинично диагностицирани като имащи HCV (Нито-А, Нито-В) и в серум от кръв, получена от кръводарители.
RIA се базира на процедурата, описана в /9/. Обикновено микротитърни панички (Имулон 2, Ремовауел ленти) се покриват с пречистен HCV антиген. Покритите панички се инкубират със серумни проби или с подходящи контроли. По време на инкубирането, антитялото, ако присъства, се свързва имунологично към антигена от твърдата фаза. След отстраняване на несвързания материал и промиване на микротитърните панички, се откриват комплекси от човешки антитяло-NANBV антиген чрез инкубиране с белязан със 12ίΙ овчи античовешки имуноглобулин. Несвързаното белязано антитяло се отстранява чрез аспириране и паничките се промиват. Радиоактивността в отделните ямки се определя, количеството свързано човешко анти-HCV антитяло е пропорционално на радиоактивността в ямката.
Специфично, 100 μ! аликвотни части, съдържащи 0,1 до 0,5 pg HCV антиген в 0,125 М натриевоборатен буфер, pH 8.3, 0.075 М нат10 риев хлорид (BBS) се добавят във всяка ямка на микротитърната паничка (Dynatech Immulon 2 Removawell Strips). Петрито се инкубира при 4°С за една нощ във влажна камера, след което антигенният разтвор се отстранява и ямките се промиват с BBS, съдържащ 0.02% Triton Х-100 (BBST). За предотвратяване на неспецифично свързване, ямките се покриват с говежди серумен албумин (BSA) чрез добавяне на 10 μΐ от 5 mg/ml разтвор на BSA в BBS, последвано от инкубиране при стайна температура за 1 h, след това инкубиране, BSA разтворът се отстранява. Антигените в покритите ямки реагират със серум чрез добавяне на проби от 100 μΐ серум, разредени 1:100 в 0,01М натриево фосфатен буфер, pH 7,2, 0,15 М натриев хлорид (PBS), съдържащ 10 mg/ml BSA и инкубиране на серума, съдържащ се в ямките за 1 h при
37°С. След инкубирането серумните проби се отстраняват чрез аспириране и ямките се промиват пет пъти с BBST. Определя се антитялото, свързано към антигена чрез свързването на бе5 лязан с l2iIF’(ab)2 овчи античовешки имуноглобулин G към покритите ямки. Добавят се аликвотни части от по 100 μΐ от белязаната проба (специфична активност 5-20 pCu/pg) към всяко кладенче и петритата се инкубират при 10 37°С за 1 h, последвано от отстраняване на излишния материал чрез аспириране и петкратно промиване с BBST. Количеството радиоактивност, свързана към всяка ямка, се определя чрез изброяване в брояч, който открива γ-ра15 диация.
Таблица 1 по-долу представя резултатите от тестовете със серум от лица, диагностицирани като имащи HCV.
Таблица 1
Индивид S2 C22 Антиген C100 C33c NS5
CVH IVDA P P P(+++) P P
CVH IVDA P P P( + ) P P
CVH IVDA P P P(+) P P
CVH NOS P P P P P
AVH NOS HS N N N N N
AVH NOS HS P N N N N
AVH NOS HS P N N N N
AVH NOS HS P/N N N N N
AVH PTVH N N N P/N N
AVH NOS HS N N N N N
AVH NOS N N N N P
AVH PTVH N N N N N
AVH IVDA N P N P P
AVH PTVH P P/N N N P
AVH NOS N P N N N
AVH IVDA N P N P P
AVH NOS HS P/N N N N N
AVH PTVH N N N N N
CVH IVDA P ' P P P P
CVH IVDA P P P P P
AVH NOS HS N N N N N
CVH PTVH P P N N N
AVH PTVH P N P( + ) P(+++ ) N
CVH PTVH N P P P P
CVH NOS HS P P P P N
CVH NOS N P P/N P P
Таблица 1 (продължение)
Индивид Антиген
S2 C22 C100 C33c NS5
CVH IVDA N N N P N
AVH IVDA P P P P P
AVH IVDA P P P P P
CVH IVDA P P P P P
AVH IVDA P/N P N P P
AVH IVDA N P P P N
CVH PTVH P P/N N N N
CVH NOS N N N N N
CVH NOS N N N N N
CVH IVDA P P P P P
AVH IVDA P P P P P
CVH PTVH P P P P P
AVH PTVH? N P P P P
AVH IVDA N P N P N
AVH NOS N N N N N
AVH NOS N N N N N
CVH NOS N P N N P
CVH NOS P P N N N
CVH NOS HS P P P P P
CVH PTVH P P N P P
AVH nurse P P N N N
AVH IVDA P P P P N
AVH IVDA N P P( + ) p(+++) N
AVH nurse P/N P N N N
AVH PTVH P/N P P N P ·
AVH NOS N P/N N N P
AVH NOS N P N P N
AVH PTVH P P/N N N N
AVH PTVH N · P N P P
AVH PTVH P P P P P
AVH PTVH N P N N P
CVH PTVH P/N P P( + ) P(+++) N
AVH PTVH N P/N P(+) P(+++) P
Таблица 1 (продължение)
Индивид Антиген
S2 C22 C100 C33c NS5
AVH PTVH P (?) P N P
CVH PTVH N P N P P
CVH PTVH N P P P P
CVH PTVH N N N N N
AVH NOS N N N N N
AVH nurse P P N N N
CVH PTVH N P N N P
AVH IVDA N P N P/N N
CVH PTVH P P P(+) p(+++) P
AVH NOS P P N N N
AVH NOS P/N P N N P
AVH PTVH P/N P P P P
AVH NOS N P P P P/N
AVH IVDA N P N N P
AVH NOS N P/N N N N
AVH NOS P P N N P
AVH PTVH N P P P P
crypto P P P P P
CVH NOS N P P P P
CVH NOS N N N N N
AVH PTVH N P P( + ) P(++) N
AVH PTVH N P/N P( + ) P(++) P
AVH PTVH N P/N P( + ) P(++) P
CVH IVDA P P P P P
CVH IVDA P P P P P
CVH IVDA P P P P P
CVH IVDA P P P P P
AVH NOS N P N N N
CVH IVDA P ’ P P P P/N
AVH IVDA P P P P N
AVH NOS P P N N N
AVH NOS P P N N N
CVH PTVH P P N N P/N
I
Таблица 1 (продължение)
Индивид Антиген
S2 C22 C100 C33c NS5
AVH PTVH N P N P P
AVH NOS N N N N N
AVH NOS N P N N N
AVH NOS P N N N N
CVH NOS N N N N N
AVH NOS N P/N N N N
AVH IVDA N P P P P
crypto N P N N P/N
crypto P P P/N P P
AVH IVDA N N P P N
AVH IVDA N P P P N
AVH NOS N N N N N
AVH NOS N N N N N
CVH IVDA P P P P P
CVH PTVH N N N N N
CVH PTVH P P P( + ) P(+++) P
CVH PTVH P P P( + ) P(+++) P
CVH NOS P/N N N N N
CVH NOS N N N N N
CVH PTVH P P P P P
CVH PTVH P P P P P
CVH PTVH P P P P P
AVH IVDA N P P P P
CVH NOS N N N N N
CVH NOS N N N N N
CVH PTVH P P P P P
AVH NOS P P N N P/N
AVH NOS N P/N N N N
CVH PTVH P ‘ P N N P
CVH NOS N P/N N N N
AVH NOS N P N N N
AVH NOS N P N N N
CVH PTVH N P N N N
Таблица 1 (продължение)
Индивид Антиген
S2 C22 C100 C33c NS5
AVH IVDA N P N P P
AVH NOS P N N N N
CVH NOS N N N N N
CVH NOS N N N N N
CVH IVDA P P P P P
CVH IVDA P/N P P P P
CVH IVDA P P P P P
CVH IVDA N P P P P
AVH NOS N P N N N
CVH IVDA N P N N P
CVH IVDA N P N N P
AVH PTVH P P N P P
AVH PTVH P P N P P
CVH NOS N P/N N N P/N
CVH NOS N P N N N
CVH NOS N N N N N
CVH PTVH P P P P P
CVH PTVH P P P P P
CVH PTVH P P P P P
AVH IVDA N P N N P
AVH IVDA N P P(++) P( + ) P
CVH PTVH P P P P P
AVH PTVH N P P P P
CVH PTVH? N P P P P
CVH PTVH? P/N P P P P
CVH NOS HS P P N N N
CVH IVDA P P P P N
CVH PTVH N P P P P
CVH PTVH P ’ P P P P/N
CVH NOS P P P P P
CVH IVDA P P P P P
CVH PTVH P P P P N
CVH PTVH P P P P P
Таблица 1 (продължение)
Индивид Антиген
S2 C22 C100 СЗЗс NS5
CVH NOS N N N N P/N
CVH NOS N P/N N N P/N
CVH PTVH P P P P P
CVH NOS N P N N N
CVH NOS N N N N N
CVH NOS P P N N P/N
CVH NOS N N N N N
CVH NOS HS P P P P P
CVH NOS HS P P P P P
CVH PTVH N N N N N
AVH PTVH N P P P P
AVH NOS - -
CVH PTVH N P P/N p(+++) N
crypto P P P P P
crypto P P P P P
crypto N P N N N
crypto N P P P P
CVH PTVH P P P P P
crypto N N N N N
crypto N P N N P/N
crypto N P N N P
crypto P P P P P
crypto N P N P N
crypto - -
crypto - -
CVH NOS - -
AVH-IVDA N P N P( + ) P
AVH-IVpA N P/N N P(*O N
AVH = остър вирусен хепатит
CVH = хроничен вирусен хепатит
PTVH = следтрансфузионен вирусен хепатит
IVDA “ ползвател на интравенозни лекарства cripto = криптогенен хепатит
NOS = неясен източник
Р = положителен
N “ отрицателен
За тези резултати нито един единичен антиген не реагира с всички серуми. С22 и СЗЗс са най-реактивните, a S2 реагира с някои серуми от някои предполагаеми остри случаи на HCV, с които не реагира никой друг 5 антиген. Въз основа на тези резултати, комбинацията на два антигена, която би дала найголям обхват откриваемост, са С22 и СЗЗс. Ако се желае да се откриват максимум остри инфекции, S2 се включва в комбинациите.
Таблица 2 по-долу представя резултатите от изпитването при платени кръводарители.
Таблица 2
Донор Антигени
С100 СЗЗс С22 S2 NS5
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 2 1 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 N N Р N N N N N N N N N N N N N N Р Р Р N N Р N N N N N N N Р N N № N N N N N N N N N N Р N N N N N N N N N N N N N N Р Р Р N Р Р N N N N N N N Р N N N N N N N N N N N N N Р N N N N N N N N N N N N N N Р N N N Р Р N N N N N N N Р N N N Р N N N N N N N N N Р N N N N N N N N N N N N N N Р Р Р N N Р N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N Р N N N N N N N N N N N N N N Р Р Р N Р Р N N N л N N N Р N N Р Р N N N N N Р N
Таблица 2 (продължение)
Донор Антигени
С100 СЗЗс С22 S2 NS5
43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 N N N N Р N N N N N N Р N N N N N N N N N N N N N N- N Р N N Р N N N N N N N Р N N N Р N Р Р N N N N N N N N N N N N N N N Р N N Р N N N N N N N N N N N Р N Р Р N N N N N N N N N N N N N N N Р N N Р N N N N N N N N N N N N N N Р N N N N N N N N N N N N N N N Р N N Р N N N N N N N Р N N N Р N Р N N N N N N N N N N N N N N N N Р N N N N N Р
Таблица 2 (продължение)
Донор Антигени
С100 СЗЗс С22 S2 NS5
77 N N N N N
78 N N N N N
79 N N N N N
80 N N N N N
81 N N N N N
82 N N N N N
83 Р Р N N N
84 N N Р N N
85 N N N N N
86 Р Р Р Р N
87 N N N N N
88 N N N N N
89 Р Р Р Р Р
90 Р Р Р Р N
91 N N N N Р
92 Р Р Р N N
93 N N N N N
94 N N N N N
95 N N N N N
96 N N N N N
97 N N N N N
98 N Р Р Р Р
99 Р Р Р Р Р
100 N N N N N
101 Р Р Р Р Р
102 № N N N N
103 N N N N N
104 N N N N
105 Р Р Р Р N
106 N N N N N
107 N N N N N
108 N N N N N
109 Р Р Р Р Р
110 Р Р Р N Р
Таблица 2 (продължение)
Донор Антигени
сюо СЗЗс С22 S2 NS5
111 Р Р Р N Р
112 N N N N N
113 Р Р Р Р Р
114 N N N N N
115 N N N N N
116 Р Р Р Р Р
117 N N N N N
118 N N N N N
119 N N N N N
120 Р Р Р Р Р
121 N N N N N
122 N Р Р N Р
123 N N N N N
124 N N N N N
125 N N N N N
126 Р N N N N
127 N N N N N
128 N N N N N
129 N N N N N
130 Р Р Р Р N
131 N N N N Р
132 N N N N N
133 N N N N N
134 N N N N N
135 N N N N N
136 W N N N N
137 N N N N N
138 N N N N N
139 N N N N N
140 Р N N N N
141 Р N Р Р Р
142 N N N N N
143 N N N N N
144 N N N N N
Таблица 2 (продължение)
Донор Антигени
С100 СЗЗс С22 S2 NS5
145 N N N N N
146 N N N N N
147 N N N N N
148 N N N N N
149 N N N N N
150 N N N N N
151 N N N N N
152 N N N N N
153 N N N N N
154 Р Р Р Р Р
155 N N N N N
156 N N N N N
157 N N N N N
158 N N N N N
159 N N N N N
160 N N N N N
161 Р Р Р Р Р
162 N N N N N
163 N N N N N
164 Р Р Р N Р
165 N N N N N
166 Р Р Р N Р
167 N N N N N
168 N N N N N
169 N N N N N
170 N· N N N N
171 N N N N N
172 N N N N N
173 N N N N N
174 N N N N N
175 N N N N N
176 N N N N N
177 N N N N Р
178 N N N N N
j
Таблица 2 (продължение)
Донор Антигени
С100 СЗЗс С22 S2 NS5
179 N N N N N
180 N N N N N
181 N N N N N
182 N N N N N
183 Р Р Р Р Р
184 N N N N N
185 N N N N N
186 N N N N N
187 N N N N N
188 N Р Р N N
189 N N N N N
190 N N N N N
191 N N N N N
192 N N N N N
193 N N N N N
194 N N N N N
195 N N N N N
196 N N N N N
197 N N N N Р
198 Р Р Р N N
199 N N N N Р
200 Р Р Р Р N
Резултатите от платените донори обикновено потвърждават резултатите от серумите от инфектирани индивиди.
Пример 7. ELISA определяне на HCV антитела при използване на комбинация от HCV антигени
Петрита, покрити с комбинация от С22 с и СЗЗ антигени, се приготвят както следва. Приготвя се разтвор, съдържащ покриващ буфер (50 тМ натриев борат, pH 9,0), 21 ml/ петри, BSA (25pg/ml грама), С22 и СЗЗс (2,50 pg/ml от всеки), точно преди добавянето към Removewell Имунолон I петрита (Dynatec h. Inc.). След размесване за 5 min се добавят 0,2 ml/ямка от разтвора към петритата, те се покриват и се инкубират за 2 h при 37°С, след което разтворът се отстранява чрез аспириране. Ямките се промиват един път с 400 μΐ промивен буфер (100 тМ натриев фосфат, pH 7.4, 140 тМ натриев хлорид, 0,1% (тегло/ обем)казеин, 1% (тегло/обем) Triton х-100, 0,01% (тегло/обем) Тимерозал). След отстраняване на промивания разтвор, се добавят 200 Ц1/ямка следпокривен (Postcoat) разтвор (10 тМ натриев фосфат, pH 7,2, 150 тМ натриев хлорид, 0,1% (тегло/обем) казеин, 3% захароза и 2 тМ фенилметилсулфонилфлуорид PMSF), пертитата се покриват хлабаво за пре дотвратяване на изпаряване и престояват на стайна температура 30 min. Тогава ямките се аспирират за отстраняване на разтвора и се лиофилизират едно денонощие до сухо през загряване на тавата. Пригвотените пертита могат да се съхраняват при 2 до 8°С в запоени алуминиеви торбички с изсушител ( 3 g Sopb it© опаковки).
С оглед извършване на ELISA определянето, 20 μΐ от серумна проба или контролна проба се добавят към ямките, съдържащи 200 μΐ от разредител за пробите (100 тМ натриев фосфат, pH 7,4 500 тМ натриев хлорид, 1 тМ ЕДТА, 0,01% (тегло/обем) Тимерозал, 0,1% (тегло/обем) Тритон Х-100, 100 μ/ml дрождев екстракт). Петритата се запечатват и се инкубират при 37°С за 2 h, след което разтворът се отстранява чрез аспириране, а ямките се промиват три пъти със 100 μΐ промивен буфер (буфериран с фосфат физиологичен разтвор (PBS), съдържащ 0,05% Tween 20). Промитите ямки се третират с 200 μΐ миши античовешки IgG- G пероксидаза от хрян HRP конюгат съдържащ се в разтвор на ортоконюгатен разредител (10 тМ натриев фосфат, pH 7.2, 150 тМ натриев хлорид, 50% (обем/ обем) говежди-ембрионален серум, 1 % обем/ обем) обработен с топлина конски серум, 1 тМ KjFe(CN)6, 0,05% (тегло/обем) Tween 20, 0,02% (тегло/обем) Тимерозал). Третирането е за 1 h при 37°С, разтворът се отстранява чрез аспириране, а ямките се промиват три пъти с 400 ml промивен буфер, който също се отстранява чрез аспириране. За определяне количеството свързан ензимен конюгат, 200 μΐ от разтвора на субстрата (10 mg/ 0 фенилен диамин дихидрохлорид на 5 ml проявяващ разтвор) се добавят. Проявяващият разтвор съдържа 50 ml натриев цитрат, доведен до pH 5.1 с фосфорна киселина и 0,6 μΙ/ml 30% Н202. Петритата, съдържащи субстратния разтвор, се инкубират на тъмно за 30 min при стайна температура, реакциите се спират чрез добавяне на 50 μΐ/ml 4 N сярна киселина и се определя OD. (оптическа плътност).
По същия начин се извършват изследвания ELISA при използване слят протеин от С22 и СЗЗс и С22, СЗЗс и S2 и комбинации от С22 и С100, С22 и S2, С22 и NS 5 антиген, С22, СЗЗс, и S2, иС22, С100 и S2.
Модификации на описания по-горе начин за осъществяване на изобретението, които са явни за специалистите в областта на молекулярната биология, имунология и други сродни области, се включват в обхвата на следващите претенции.
Списък на последователностите (1) Обща информация:
(1) предложител: HOUGHTON, MICHAEL .CHOO, QUI-HM .KUO, GEORGE (II) Заглавие на изобретението: Състави от антигени на вируса на хепатит (HCV) за използване при имуноизследването за антиHCV антитела (III) Брой на последователностите: 10 (IV) Съответен адрес:
. Адрес Morrison & Foerster . Улица 545 Middlefield Road, Suite 200 . Щат Menlo Park СА . Страна USA
ZIP; 94025 (V) разчитана c компютър форма
A. Средна лента: Флопи диск
B. Компютър: IBM PC съвместим
C. Операционна система: PC-DOS/MSDOS
D. Софтуер: Патентно разрешение № 1,0 версия № 1,25 (VI) данни за приложение:
A. Номер на заявката (САЩ РСТ US 91/02225
B. Дата на подаване: 29 март 1991
C. Класификация:
(VIII) Информация за патентния представител
A. Име: CIOTTI, THOMAS Е.
B. Регистрационен номер (С) За контакт номер: 2300-0101.44 (IX) Телекомуникационна информация:
A. Телефон: (415) 327-7250
B. Телефакс: (415) 327-2952
C. Телекс: 706141 (2) Информация за последователност ID N0:1:
(1) Характеристика на последователност:
(A) Дължина: 19 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верига: единична (D) Топология: линейна (XI) Описание на последователност: послед. ID N0:1:
GATCCTGGAA TTCTGATAA (2) Информация за SEQ ID N0:2 (1) Характеристики на последователност:
(A) дължина: 19 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верига: единична (D) Топология: линейна (XI) Описание на последователност: послед.Ю N0: 2:
ААТТТТАТСА GAATTCCAG (2) Трансформация за послед. ID N0:3:
(1) Характеристики на последователност:
(A) Дължина: 56 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верига: единична (D) Топология: линейна (XI) Описание на последователност: послед. ID N0:3:
GAGTGCTCAA GCTTCAAAAC
AAAATGGCTC АСТТТСТАТС CCAGACAAAG CAGAGT (2) Информация за послед. ID N0:4:
(1) Характеристика на последователност:
(A) Дължина: 50 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верига: единична (D) Топология: линейна (XI) Описание на последователност: послед. ID N0:4:
GAGTGCTCGT CGACTCATTA GGGGAAACA TGGTTCCCCC GGGAGGCGAA (2) Информация за последв. ID N0:5:
(1) Характеристики на последователност:
(A) Дължина: 59 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верига: единична (D) Топология: линейна (XI) Описание на последователност: послед. ID N0:5
GAGTGCTCAA GCCTTCAAAAC AAAATGGGGC TCTACCACGT CACCAATGAT TGCCCTAAC (2) Описание на последв. ID N0:6:
(I) Характеристики на последователност:
(A) Дължина: 53 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верига: единична (D) Типология: линейна (XI) Описание на последователност: последов. 1D N0:6:
GAGTGCTCGT CGACTCATTA AGGGGACCAG ТТСАТСАТСА TATCCCATGC CAT (2) Информация за послед. ID N0:7:
(1) Характеристики на последователност:
(A) Дължина: 53 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верига: единична (D) Топология: линейна (XI) Описание на последователност: последов. ID N0:7:
GAGTGCAGCT ТСААААСААА
ATGAGCACGA АТССТАААСС ТСАААААААА ААС (2) Описание на последов. ID N0:8:
(1) Характеристики на последователност:
(A) Дължина: 53 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верига: единична (D) Топология: линейна (XI) Описание на последователност: последов. ID N0:8:
GAGTGCTCGT CGACTCATTA
ACCCAAATTG CGCGACCTAC GCCGGGGGTC TGT (2) Характеристики на последователност: последов.Ю N0:8 (A) Дължина: 9401 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верига: неизвестна (D) Топология: неизвестно (1) Молекулен тип: ДНК (геномна) (XI) Описание на последователност: последов. ID N0:9:
(виж фиг.1) (2) Информация за послед. ID N0:10:
(I) Характеристика на последователност:
(A) Дължина: 3011 базови киселини (B) Тип: Аминокиселина (C) Верига: неизвестна ( D) Топология: неизвестна (II) Молекулен тип: протеин (IX) Характерен белег:
(A) Име/ключ: модифициран сайт (B) Разположение: 9 (D) Друга информация: /белег -Arg или Lys /забележка - Аминокиселината 8 може да бъде Arg или Lys (IX) Характерен белег:
(A) Име/ключ: модифициран сайт (B) Разположение: 11 (D) Друга информация /забележка “Тази аминокиселина може да бъде или Asn или Thr/.
(IX) Характерен белег:
(А) Име/ключ: модифициран сайт •ί (В) Разположение: 176 (D) Друга информация: /забележка Тази аминокиселина може да бъде или Trh или Пе (IX) Характерен белег:
(A) Име/ключ:Модифициран сайт (B) Разположение: 334 (D) Друга информация: забележка “Тази аминокиселина може да бъде или Vai или Met” (IX) Характерен белег:
(A) име/ключ: модифициран сайт (B) Разположение: 603 (D) Друга информация/ забележка “Тази аминокиселина може да бъде или Пе или Leu”.
(IX) Характерен белег:
(A) име/ключ: модифициран сайт (B) Разположение: 848 (D) Друга информация: /забележка. “Тази аминокиселина може да бъде или Asn или Туг” (IX) Характерен белег:
(A) Име/ключ: модифициран сайт (B) Разположение: 1114 (D) Друга информация: /забележка “Тази аминокиселина може да бъде Pro или Ser” (IX) Характерен белег:
(A) Име/ключ: модифициран сайт (B) Разположение: 1117 (D) Друга информация: /забележка “Тази аминокиселина може да бъде или Ser или Thr” (IX) Характерен белег:
(A) Име/ключ: модифициран сайт (B) Разположение: 1276 (D) Друга информация: /забележка “Тази аминокиселина може да бъде или Leu или Pro”.
(IX) Характерен белег:
(A) Име/ключ: модифициран сайт (B) Разположение: 1328 (D) Друга информация: /Забележка “Тази аминокиселина може да бъде или Gly или Vai”, (IX) Характерен белег:
(A) Име/ключ: модифициран сайт (B) Разположение: 1454 (D) Друга информация: /забележка “Тази аминокиселина може да е или Туг или Cys”.
(IX) Характерен белег:
(A) Име/ключ: модифициран сайт (B) Разположение: 1471 (D) Друга информация: /забележка “Тази аминокиселина може да бъде или Ser или Thr”.
(IX) Характерен белег:
(A) Име/ключ: модифициран сайт (B) Разположение: 1877 (D) Друга информация: /забележка “Тази аминокиселина може да бъде или Glu или Gly”. (IX) Характерен белег:
(A) Име/ключ: модифициран сайт (B) Разположение: 1948 (D) Друга информация: /забележка “Тази аминокиселина може да бъде или His или Leu”. (IX) Характерен белег:
(A) Име/ключ: модифициран сайт (B) Разположение: 1949 (D) Друга информация: /забележка “Тази аминокиселина може да бъде или Cys или Ser”. (IX) Характерен белег:
(A) Име/ключ: модифициран сайт (B) Разположение: 2021 (D) Друга информация: /забележка “Тази аминокиселина може да бъде или Gly или Vai”. (IX) Характерен белег (A) Име/ключ: модифициран сайт (B) Разположение: 2349 (D) Друга информация: /забележка “Тази аминокиселина може да бъде или Thr или Ser”. (IX) Характерен белег:
(A) Име/ключ: модифициран сайт (B) Разположение: 2385 (D) Друга информация: /забележка “Тази аминокиселина може да бъде или Phe или Туг”. (IX) Характерен белег:
(A) Име/ключ: Модифициран сайт (B) Разположение: 2386 (D) Друга информация: /забележка “Тази аминокиселина може да бъде или Ser или Ala”. (IX) Характерен белег:
(A) Име/ключ: модифициран сайт (B) Разположение: 2502 (D) Друга информация: /забележка “Тази аминокиселина може да бъде или Leu или Phe”. (IX) Характерен белег:
(A) Име/ключ: модифициран сайт (B) Разположение: 2690 (D) Друга информация: /забележка “Тази аминокиселина може да бъде или Gly или Arg”. (IX) Характерен белег:
(A) Име/ключ: модифициран сайт (B) Разположение: 2921 (D) Друга информация:/забележка “Тази аминокиселина може да бъде или Gly или Arg”. (IX) Характерен белег:
(A) Име/ключ: модифициран сайт (B) Разположение: 2996 (D) Друга информация: забележка “Тази аминокиселина може да бъде или Leu или Pro”.
(XI) Описание на последователност: ID
N0:10:
(Виж фиг. 2)

Claims (14)

  1. Патентни претенции
    1. Състав включващ комбинация от синтетични хепатит С вирусни (HCV) антигени, характеризиращ се с това, че една първа полипептидна епитопна последователност на Сдомена на HCV полипротеина и най-малкото 10 една допълнителна полипептидна епитопна последователност от друг домен на HCV полипротеина, избрана от групата състояща се от (I) NS3 домена на HCV полипротеина;
    (II) S домена на HCV полипротеина; 15 (III) NS4 домена на HCV полипротеина;
    и (IV) NS5 домена на HCV полипротеина.
  2. 2. Състав включващ комбинация от синтетични хепатит С вирусни (HCV) антигени, 20 характеризиращ се с това, че представлява една първа полипептидна епитопна последователност, състояща се главно от С домена на HCV полипротетина и една втора полипептидна епитопна последователност от NS3 домена 25 на HCV полипротеина.
  3. 3. Състав съгласно претенция 2, характеризиращ се с това, че първата полипептидна епитопна последователност е С22, а втората полипептидна епитопна последователност е СЗЗс. 30
  4. 4. Състав, представляващ комбинация от синтетични хепатит С вирусни (HCV) антигени, характеризиращ се с това, че съдържа една първа полипептидна епитопна последователност, съдържаща главно С домена на HCV 35 полипептида и една втора полипептидна епитопна последователност от NS4 домена на HCV полипротеина.
  5. 5. Състав, съгласно претенция 4, характеризиращ се с това, че първата полипептидна 40 последователност е С22, а втората полипептидна епитопна последователност е С100.
  6. 6. Състав, представляващ комбинация от синтетични хепатит С вирусни (HCV) антигени, характеризиращ се с това, че съдържа 45 една първа полипептидна епитопна последователност, състояща се главно от С домена на HCV полипротеин и една втора полипептидна епитопна последователност от NS5 домена на HCV полипротеина. 50
  7. 7. Състав, съгласно претенция 4 или 6, характеризиращ се с това, че включва една тре та полипептидна епитопна последователност от NS3 домена.
  8. 8. Състав, съгласно коя да е претенция от 1 до 7, характеризиращ се с това, че съставът е под формата на слят полипептид.
  9. 9. Състав, съгласно коя да е претенция от 1 - 7 характеризиращ се с това, че съставът е под формата на първата полипептидна епитопна последователност, а посочените допълнителни епитопни последователност (и) са индивидуално свързани към общ твърд матрикс.
  10. 10. Състав съгласно претенция 9, характеризиращ се с това, че твърдият матрикс е повърхността на микротитърно Петри с ямки, перла или леплива смес.
  11. 11. Състав съгласно коя да е претенция от 1 до 7, характеризиращ се с това, че съставът е във форма на смес на първата полипептидна епитопна последователност и допълнителните полипептидни епитопни последователности.
  12. 12. Метод за откриване на антитела за хепатит С вирус (HCV) в компонент на тялото на бозайник, за което се предполага, че съдържа антитела, характеризиращ се с това, че се поставя телесният компонент в контакт със състав от HCV антигени от коя да е претенция от 1 до 10 при условия, които позволяват реакцията антитяло-антиген и откриване наличието на имунни комплекси от посочените антитела и полипептидните епитопни последователности.
  13. 13. Метод за откриване на антитела за хепатит С вирус (HCV) в компонент на тялото на бозайник, за което се предполага, че съдържа споменатите антитела, характеризиращ се с това, че телесният се поставя в контакт с редица синтетични HCV антигени, представляващи една първа полипептидна епитопна последователност от С домена на HCV полипротеина и най-малко една допълнителна полипептидна епитопна последователност от друг домен на HCV полипротеина, избрана от групата, състояща се от (I) NS3 домена на HCV полипротеина, (II) S домена на HCV полипротеина, (III) NS4 домена на HCV полипротеина, и (IV) NS5 домена на HCV полипротеина при условия, позволяващи реакцията антигенантитяло и откриване присъствието на имунни комплекси в антителата и полипептидните •д
    I
    4 епитопни последователности.
  14. 14. Един комплект за извършване на изj следване за откриване на антитела за хепатит i С антиген (HCV) в компонент на тялото на
    I бозайник, за който се предполага, че съдържа посочените антитела, представени като опакован състав, характеризиращ се с това, че включва комбинацията на синтетични HCV антигени съгласно претенция 1, стандартни контролни реактиви, и инструкции за извършване на изследването.
BG96943A 1990-04-04 1992-10-02 Combinations of hepatitis c virus (hcv) antigens for use inimmunoassays for anti-hcv antibodies BG61291B1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US50435290A 1990-04-04 1990-04-04
PCT/US1991/002225 WO1991015771A1 (en) 1990-04-04 1991-03-29 Combinations of hepatitis c virus (hcv) antigens for use in immunoassays for anti-hcv antibodies

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BG61291B1 true BG61291B1 (en) 1997-04-30

Family

ID=24005897

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BG96943A BG61291B1 (en) 1990-04-04 1992-10-02 Combinations of hepatitis c virus (hcv) antigens for use inimmunoassays for anti-hcv antibodies

Country Status (25)

Country Link
EP (2) EP0693687B2 (bg)
JP (1) JP2733138B2 (bg)
KR (1) KR100206150B1 (bg)
AT (2) ATE182684T1 (bg)
BG (1) BG61291B1 (bg)
BR (1) BR9106309A (bg)
CY (1) CY1881A (bg)
DE (2) DE69131488T2 (bg)
DK (2) DK0450931T3 (bg)
ES (2) ES2134388T5 (bg)
FI (1) FI106317B (bg)
GB (1) GB2257784B (bg)
GR (2) GR3020964T3 (bg)
HU (1) HU217025B (bg)
IE (1) IE911105A1 (bg)
IL (2) IL97741A0 (bg)
LT (1) LT3808B (bg)
LV (2) LV10344B (bg)
MY (1) MY107499A (bg)
NO (1) NO310241B1 (bg)
PL (1) PL172133B1 (bg)
RO (1) RO109916B1 (bg)
RU (1) RU2130969C1 (bg)
UA (1) UA41266C2 (bg)
WO (1) WO1991015771A1 (bg)

Families Citing this family (58)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7166287B1 (en) 1989-12-18 2007-01-23 Glaxo Wellcome Inc. Viral agent
LU87861A1 (fr) 1989-12-18 1991-10-08 Wellcome Found Agent viral
KR940000755B1 (ko) * 1990-02-16 1994-01-29 유나이티드 바이오메디칼 인코오포레이티드 Hcv에 대한 항체 검출, hcv 감염의 진단 및 백신으로서의 그 예방에 특히 적합한 합성 펩티드
US6194140B1 (en) * 1990-04-04 2001-02-27 Chiron Corporation HCV NS3 protein fragments having helicase activity and improved solubility
DE69132332T2 (de) * 1990-04-06 2000-11-30 Genelabs Tech Inc Hepatitis c-virus-epitope
CA2049679C (en) * 1990-08-24 2005-06-21 Sushil G. Devare Hepatitis c assay utilizing recombinant antigens
US6274148B1 (en) * 1990-11-08 2001-08-14 Chiron Corporation Hepatitis C virus asialoglycoproteins
RO115446B1 (ro) * 1990-11-08 2000-02-28 Chiron Corp Procedeu de obtinere a asialoglicoproteinelor purificate provenind de la virusul hepatitei c
US6007982A (en) * 1990-12-14 1999-12-28 Innogenetics N.V. Synthetic antigens for the detection of antibodies to hepatitis C virus
DK0644202T3 (da) * 1990-12-14 1997-09-15 Innogenetics Nv Syntetiske antigener til påvisning af antistoffer imod hepatitis C virus
US5910404A (en) 1990-12-14 1999-06-08 Innogenetics N.V. Synthetic antigens for the detection of antibodies to hepatitis C virus
DE4041304A1 (de) * 1990-12-21 1992-06-25 Mikrogen Molekularbiol Entw Von strukturproteinen des hepatitis c-virus abgeleitete polypeptide, testkits, die diese polypeptide enthalten und impfstoffe gegen infektionen von hepatitis c-viren
US5574132A (en) * 1991-04-05 1996-11-12 Biochem Immunosystems Inc. Peptides and mixtures thereof for detecting antibodies to hepatitis C virus (HCV)
CA2099883A1 (en) * 1991-11-07 1993-05-08 John A. Kink Epitope mapping of the c33c region of hcv
WO1993010239A2 (en) * 1991-11-21 1993-05-27 Common Services Agency Hepatitis-c virus testing
WO1993015207A2 (en) * 1992-02-04 1993-08-05 Viagene, Inc. Hepatitis therapeutics
GB9203803D0 (en) * 1992-02-21 1992-04-08 Wellcome Found A recombinant polypeptide
UA39944C2 (uk) * 1992-07-07 2001-07-16 Чірон Корпорейшн Спосіб визначення ранньої сероконверсії у ссавця-хазяїна до вірусу гепатиту с і набір для використання в способі
US6153378A (en) * 1992-10-16 2000-11-28 Bionova Corporation Diagnosis of, and vaccination against, a positive stranded RNA virus using an isolated, unprocessed polypeptide encoded by a substantially complete genome of such virus
EP0593291A3 (en) * 1992-10-16 1995-03-15 Evernew Biotech Inc Non-structural protein of the hepatitis C virus, as well as diagnostic procedure and test kit.
JP2778886B2 (ja) * 1992-10-16 1998-07-23 エバーニュー バイオテック インコーポレイティド Ｃ型肝炎ウィルスのコア抗原タンパク質及びそれを用いての診断方法及びキット
WO1994013164A1 (en) 1992-12-10 1994-06-23 Nike International Ltd. Bonding of rubber to plastic in footwear
UA46707C2 (uk) 1993-05-10 2002-06-17 Чірон Корпорейшн Спосіб типування вірусу гепатиту с (варіанти), набір поліпептидів (варіанти), реагент, що включає комбінацію поліпептидів, які містять типоспецифічні епітопи гепатиту с (варіанти)
DE4428705A1 (de) * 1994-08-12 1996-02-15 Boehringer Mannheim Gmbh Rekombinantes Antigen aus der NS3-Region des Hepatitis C Virus
JPH0862219A (ja) * 1994-08-19 1996-03-08 Dainabotsuto Kk 還元型抗原に対する抗体アッセイ試薬及びそれを使用した測定方法
JP3665371B2 (ja) * 1994-08-31 2005-06-29 株式会社先端生命科学研究所 Ｃ型肝炎ウイルス感染又はグループ判定のためのエピトープキメラ抗原ペプチド、その製法、及びそれを使用する感染又はグループ判定法
CA2172305A1 (en) * 1995-03-30 1996-10-01 Muneo Aoyama Multiple antigenic peptide comprising at least two hepatitis c virus-associated peptides
WO1996037606A1 (en) * 1995-05-22 1996-11-28 Bionova Corporation Compositions and methods for the diagnosis of, and vaccination against, hepatitis c virus (hcv)
FR2734639B1 (fr) * 1995-05-26 1997-10-03 Parteurop Methode de pronostic de l'evolution d'une infection par le virus de l'hepatite c, et necessaire pour sa mise en oeuvre
FR2737209B1 (fr) 1995-07-25 1997-09-19 Bio Merieux Peptide capable d'etre reconnu par des anticorps reconnaissant l'antigene c33 du virus de l'hepatite c
US6127116A (en) 1995-08-29 2000-10-03 Washington University Functional DNA clone for hepatitis C virus (HCV) and uses thereof
JP3715027B2 (ja) 1996-05-07 2005-11-09 シスメックス株式会社 Ｃ型肝炎ウイルス感染症診断薬
US7338759B1 (en) 1997-03-04 2008-03-04 Washington University HCV variants
US7049428B1 (en) 1998-03-04 2006-05-23 Washington University HCV variants
PT1021719E (pt) * 1997-09-22 2007-03-30 Novartis Vaccines & Diagnostic Método para detecção de anticorpos numa amostra
AU6098900A (en) * 1999-07-15 2001-02-05 Bayer Corporation The use of specific antibody titers to predict hepatic failure in people infected with hepatitis c virus
WO2001030812A2 (en) * 1999-10-27 2001-05-03 Chiron Corporation Activation of hcv-specific t cells
CA2390082C (en) * 1999-11-24 2010-06-29 Chiron Corporation Novel hcv non-structural polypeptide
US6986892B1 (en) 1999-11-24 2006-01-17 Chiron Corporation Immunogenic Hepatitis C virus non-structural polypeptides
ATE368221T1 (de) 2000-06-15 2007-08-15 Novartis Vaccines & Diagnostic Immunoassays für anti-hcv-antikörper
US7491808B2 (en) 2000-06-15 2009-02-17 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. HCV non-structural protein mutants and uses thereof
US6680059B2 (en) 2000-08-29 2004-01-20 Tripep Ab Vaccines containing ribavirin and methods of use thereof
AU9215101A (en) 2000-08-17 2002-02-25 Tripep Ab Vaccines containing ribavirin and methods of use thereof
US7022830B2 (en) 2000-08-17 2006-04-04 Tripep Ab Hepatitis C virus codon optimized non-structural NS3/4A fusion gene
US6858590B2 (en) 2000-08-17 2005-02-22 Tripep Ab Vaccines containing ribavirin and methods of use thereof
FR2839722A1 (fr) 2002-05-17 2003-11-21 Bio Merieux Nouvelles compositions peptidiques et leur utilisation notamment dans la preparation de compositions pharmaceutiques actives contre le virus de l'hepatite c
JP4585314B2 (ja) 2002-09-09 2010-11-24 ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス，インコーポレーテッド Ｈｃｖアッセイ
JP4864891B2 (ja) 2004-06-09 2012-02-01 パサジャン リムーヴァル アンド ダイアグナスティック テクノロジーズ インコーポレイテッド サンプルから標的因子を除去するためのデバイス及び方法
JP2005274584A (ja) * 2005-05-25 2005-10-06 Sysmex Corp Ｃ型肝炎ウイルス感染症診断薬の製造方法
JP4005093B2 (ja) * 2005-05-25 2007-11-07 シスメックス株式会社 Ｃ型肝炎ウイルス感染症診断薬および抗ｈｃｖ抗体検出方法
US7968697B2 (en) 2005-05-25 2011-06-28 Chrontech Pharma Ab Hepatitis C virus non-structural NS3/4A fusion gene
JP5188400B2 (ja) * 2006-03-09 2013-04-24 トランスジーン エス．エー． Ｃ型肝炎ウイルスの非構造融合タンパク質
US20080227111A1 (en) 2007-03-16 2008-09-18 Sysmex Corporation Reagent kit and method for measuring hcv antibody
WO2009022236A2 (en) 2007-08-16 2009-02-19 Tripep Ab Immunogen platform
US20090214593A1 (en) 2007-08-16 2009-08-27 Tripep Ab Immunogen platform
FR2984328B1 (fr) 2011-12-20 2016-12-30 Bio-Rad Innovations Procede de detection d'une infection par le virus de l'hepatite c
WO2016069762A2 (en) * 2014-10-29 2016-05-06 Abbott Laboratories Subject anti-hcv antibody detection assays employing ns3 capture peptides
JP2018124277A (ja) * 2017-02-02 2018-08-09 三洋化成工業株式会社 粒子含有組成物、免疫測定用試薬、免疫測定方法及び粒子の保存方法

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US456637A (en) 1891-07-28 Fence
US390599A (en) 1888-10-02 Tool for weaver s use
SE7804231L (sv) 1978-04-14 1979-10-15 Haessle Ab Magsyrasekretionsmedel
US4870008A (en) * 1983-08-12 1989-09-26 Chiron Corporation Secretory expression in eukaryotes
CA1341482C (en) † 1984-10-31 2005-05-10 Paul A. Luciw Process for preparing fragments of aids-associated retroviruses
US4751180A (en) * 1985-03-28 1988-06-14 Chiron Corporation Expression using fused genes providing for protein product
JPH02500880A (ja) * 1987-11-18 1990-03-29 カイロン　コーポレイション Ｎａｎｂｖの診断用薬およびワクチン
JP2656995B2 (ja) † 1989-03-17 1997-09-24 カイロン コーポレイション Ｎａｎｂｖの診断用薬
LU87861A1 (fr) * 1989-12-18 1991-10-08 Wellcome Found Agent viral
AU638304B2 (en) † 1989-12-22 1993-06-24 Abbott Laboratories Hepatitis c assay

Also Published As

Publication number Publication date
BR9106309A (pt) 1993-04-20
NO923839L (no) 1992-11-19
HU217025B (hu) 1999-11-29
DK0693687T3 (da) 1999-11-29
NO310241B1 (no) 2001-06-11
LT3808B (en) 1996-03-25
ES2134388T3 (es) 1999-10-01
ES2134388T5 (es) 2008-12-01
AU639560B2 (en) 1993-07-29
UA41266C2 (uk) 2001-09-17
MY107499A (en) 1995-12-30
KR100206150B1 (ko) 1999-07-01
DK0450931T3 (da) 1996-07-01
LTIP1747A (en) 1995-07-25
LV10344B (en) 1996-02-20
DK0693687T4 (da) 2008-09-22
DE69131488T2 (de) 1999-11-18
ES2088465T3 (es) 1996-08-16
PL172133B1 (pl) 1997-08-29
ATE139343T1 (de) 1996-06-15
IL170719A (en) 2011-04-28
DE69120138T2 (de) 1996-11-14
FI924349A (fi) 1992-09-28
FI924349A0 (fi) 1992-09-28
EP0450931B1 (en) 1996-06-12
IE911105A1 (en) 1991-10-09
EP0693687A1 (en) 1996-01-24
NO923839D0 (no) 1992-10-01
DE69120138D1 (de) 1996-07-18
DE69131488D1 (de) 1999-09-02
ATE182684T1 (de) 1999-08-15
GR3020964T3 (en) 1996-12-31
EP0693687B1 (en) 1999-07-28
RU2130969C1 (ru) 1999-05-27
IL97741A0 (en) 1992-06-21
RO109916B1 (ro) 1995-07-28
EP0693687B2 (en) 2008-06-04
EP0450931A1 (en) 1991-10-09
GR3031361T3 (en) 2000-01-31
AU7651091A (en) 1991-10-30
LV10344A (en) 1994-10-20
CY1881A (en) 1996-04-05
FI106317B (fi) 2001-01-15
GB2257784A (en) 1993-01-20
WO1991015771A1 (en) 1991-10-17
GB2257784B (en) 1995-01-04
HUT62706A (en) 1993-05-28
HU9203146D0 (en) 1992-12-28
GB9220480D0 (en) 1992-11-25
JPH05508219A (ja) 1993-11-18
JP2733138B2 (ja) 1998-03-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
BG61291B1 (en) Combinations of hepatitis c virus (hcv) antigens for use inimmunoassays for anti-hcv antibodies
US5683864A (en) Combinations of hepatitis C virus (HCV) antigens for use in immunoassays for anti-HCV antibodies
US6312889B1 (en) Combinations of hepatitis c virus (HCV) antigens for use in immunoassays for anti-HCV antibodies
US6596476B1 (en) Hepatitis C assay
US7198892B2 (en) Hepatitis-C virus type 4, 5 and 6
EP0585398B1 (en) Hcv genomic sequences for diagnostics and therapeutics
JP3439209B2 (ja) Ｈｃｖ蛋白のための哺乳動物発現システム
JP2007127671A (ja) 複数エピトープ融合タンパク質
JPH04253998A (ja) Ｃ型肝炎アッセイ
EP0741787B1 (en) Mammalian expression systems for hepatitis c virus envelope genes
EP0642666B1 (en) Hepatitis c assay
JPH06510191A (ja) Ｎｓ１に対する組換え抗原を利用したｃ型肝炎アッセイ
AU639560C (en) Combinations of hepatitis C virus (HCV) antigens for use in immunoassays for anti-HCV antibodies
PT97247B (pt) Processo de preparacao de combinacoes de antigenios do virus da hepapite c (hcv) para uso em imunoensaios para anticorpos anti-hcv