LT3808B - Combinations of hepatitis c virus (hcv) antigens for use in immunoassays for anti-hcv antibodies - Google Patents

Combinations of hepatitis c virus (hcv) antigens for use in immunoassays for anti-hcv antibodies Download PDF

Info

Publication number
LT3808B
LT3808B LTIP1747A LTIP1747A LT3808B LT 3808 B LT3808 B LT 3808B LT IP1747 A LTIP1747 A LT IP1747A LT IP1747 A LTIP1747 A LT IP1747A LT 3808 B LT3808 B LT 3808B
Authority
LT
Lithuania
Prior art keywords
hcv
domain
antigen
cvh
avh
Prior art date
Application number
LTIP1747A
Other languages
English (en)
Inventor
Michael Houghton
Qui-Lim Choo
George Kuo
Original Assignee
Chiron Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=24005897&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=LT3808(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Chiron Corp filed Critical Chiron Corp
Publication of LTIP1747A publication Critical patent/LTIP1747A/xx
Publication of LT3808B publication Critical patent/LT3808B/lt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
    • G01N33/5767—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis non-A, non-B hepatitis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
    • C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Thermistors And Varistors (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Šis išradimas priklauso imunologinių mėginių, skirtų HCV (vadinamų nei A, nei B hepatito virusais) sričiai. Tiksliau, išradimas yra apie HCV antigenų įgalinančius plataus spektro imunologiniuose mėginiuose aptikti anti-HCV antikūnus.
Manoma, kad liga, vadinama nei A, nei B hepatitu (NANBH), yra užkrečiama liga arba grupė ligų, sukeliamų virusais, kuri skiriasi nuo kitų virusinių kepenų ligų formų, tame tarpe sukeltų žinomais hepatito virusais, t.y. hepatito A viruso (HAV), hepatito B viruso (HBV) ir hepatito delta viruso (HDV), o taip pat hepatitų, sukeltų citomegaloviruso (CMV) ar Epstein-Barr viruso (EBV). Pirmą kartą NANBH buvo nustatytas individams po kraujo perpylimo. Užkrato pernešimas nuo žmogaus šimpanzei ir nuoseklus perskiepijimas šimpanzėms parodė, kad NANBH kilo dėl perneštojo užkrečiančio agento ar agentų. Iš epidemiologinių duomenų galima buvo spręsti apie tris NANBH tipus: epideminį per vandenį užkrečiamo, per kraują ar parenteraliai pernešamo, ir atsitiktinio (bendruomenėje įgyjamo) hepatito tipą. Dar visai neseniai pemešantis agentas nebuvo nustatomas, todėl klinikinė diagnozė ir NANBH nustatymas buvo atliekamas, visų pirma, išskiriant kitus virusinius markerius. Spėjamų NANBH antigenų ir antikūnų aptikimui buvo taikomi šie metodai: difuzijos agare-gelyje, imunoelektroforezės, imunofluorescencinės mikroskopijos, imuninės elektroninės mikroskopijos, radioimuninių ir kietafazė imunofermentinė analizė. Tačiau nė vienas šių analizės būdų nėra pakankamai jautrus, specifinis ir atsikartojantis, kad galėtų būti taikomas kaip NANBH diagnostinis testas.
1987 m. Chiron'o korporacijos (šios paraiškos savininkės) mokslininkai nustatė pirmąją nukleino rūgštį, tikrai susietą su per kraują pernešamu NANBH. Žr., pvz., EPO publikacijos Nr.318216; Houghton et ai., Science 244:359 (1989). Šiose publikacijose yra aprašytas naujos virusų klasės, hepatito C viruso (HCV), izoliato klonavimas. Ten aprašyto izoliato prototipas buvo pavadintas HCVl. HCV yra Flavi-tipo virusas, turintis RNR genomą.
JAV patento paraiškoje Nr. 456637 (Houghton et ai.), įtrauktoje čia cituojant, aprašytas įvairių rekombinantinių HCV polipeptidų gavimas HCV cDNR ekspresijos metu ir šių polipeptidų atranka pagal imuninį reaktyvumą pacientų su HCV serumui. Tokia ribota atranka parodė, kad stipriu imunogeniškumu pasižymi bent penki testuoti polipeptidai; būtent, identifikuoti kaip 5-1-1, C100, C33c, CA279a ir CA290a. Iš šių penkių polipeptidų 5-1-1 yra spėjamame NS4 domene, C100 jungia spėjamus NS3 ir NS4 domenus, C33c yra spėjamame NS3 domene, o CA279a ir CA290a esti spėjamame C domene. Atranka taip pat parodė, kad nei vienas atskirai testuotas polipeptidas nebuvo imunologiškai reaktyvus visiems serumams. Tuo būdu, būtų pageidautina turėti patobulintus testus, kuriu metu sąveika vyktų su visais arba daugeliu pavyzdžių, paimtų iš individų su teigiama HCV reakcija.
Pareiškėjai atliko papildomus serologinius tyrimus su HCV antigenais, kurie patvirtino, kad atskirai nė vienas iki šiol identifikuotas HCV polipeptidas nepasižymi imunologiniu reaktyvumu visiems serumams. Atskiro polipeptido reaktyvumo nebuvimas visiems individų su HCV serumams yra galimas, be kitų priežasčių, dėl kamienų skirtingumo HCV epitopuose, dėl humoralinio individų atsako skirtingumo ir/ar ligos stadija sąlygotos, skirtingos, serologinės reakcijos.
Šių papildomų tyrimų dėka taip pat buvo nustatytos HCV antigenų kombinacijos, kurios įgalino aptikti daugiau HCV antikūnų, negu tuo atveju, kai naudojamas vienas HCV polipeptidas.
Taigi, pagal vieną šio išradimo aspektą yra siūloma HCV antigenų kombinacija, kurią sudaro:
(a) pirmasis HCV antigenas iš C domeno; ir (b) bent vienas papildomas HCV antigenas, atrinktas iš grupės, kurioje yra (I) HCV antigenas iš NS3 domeno;
(II) HCV antigenas iš NS4 domeno;
(III) HCV antigenas iš S domeno;
ir (IV) HCV antigenas iš NS5 domeno.
Vienu atveju, HCV antigenų kombinacija turi sulydyto proteino, susidedančio iš antigenų, pavidalą. Kitu atveju, antigenų kombinacija esti atskirų antigenų, surištų bendroje kietoje matricoje, pavidalo. Dar vienu atveju, antigenų kombinaciją sudaro atskirų antigenų mišinys.
Pagal kitą išradimo aspektą yra siūlomas būdas HCV antikūnams aptikti žinduolių kūno komponente, įtarus jame esant minėtų antikūnų, apimantis minėto kūno komponento ir aukščiau aprašyto HCV antigenų kombinacijos sąveiką sąlygose, užtikrinančiose antikūno ir antigeno reakciją, ir susidariusio imuninio komplekso iš minėtų antikūnų ir minėtų antigenų aptikimą.
Pagal kitą išradimo aspektą yra siūlomas būdas HCV antikūnams aptikti žinduolių kūno komponente, įtarus jame esant minėtų antikūnų, apimantis minėto kūno komponento sąveiką, vienu metu ar paeiliui, su HCV antigenų rinkiniu, kurį sudaro (a) pirmasis HCV antigenas iš C domeno; ir (b) bent vienas papildomas HCV antigenas, atrinktas iš grupės, kurioje yra (I) HCV antigenas iš NS3 domeno;
(II) HCV antigenas iš NS4 domeno;
(III) HCV antigenas iš S domeno;
ir (IV) HCV antigenas iš NS5 domeno, esant sąlygoms, užtikrinančioms antikūno ir antigeno reakciją, ir susidariusio imuninio komplekso iš minėtų antikūnų ir minėtų antigenų nustatymą.
Pagal dar vieną išradimo aspektą yra siūlomas komplektas atlikimui mėginio, skirto HCV antikūnams aptikti žinduolių kūno komponente, įtarus jame esant minėtų antikūnų, ir kurį įpakuotoje formoje sudaro (a) minėtų HCV antigenų kombinacija;
(b) standartinės kontrolinės medžiagos; ir (c) analizės atlikimo instrukcija.
Trumpas figuru aprašymas
Fig.l parodyta HCV poliproteiną koduojanti nukleotidų seka cDNR matricinėje ir nematricinėje grandinėje bei aminorūgščių seka, koduojama matricinės grandinės.
Fig.2 yra aminorūgščių sekos, užrašytos Fig.l, schema, rodanti spėjamus HCV polipeptido domenus.
Apibrėžimai
HCV antigenu yra laikomas polipeptidas, turintis mažiausiai 5 aminorūgštis, dažniau - mažiausiai nuo 8 iki 10 aminorūgščių, kurios apibrėžia epitopą, randamą HCV izoliate. Dažniausia, HCV turi unikalų epitopą. Kai antigenas yra pažymėtas alfa-numeracijos kodu, epitopas prasideda nuo HCV domeno, pažymėtu alfa-numeracijos ženklu.
Sintetinis, kuomet vartojamas apibūdinti HCV antigeną, reiškia, kad HCV antigenas buvo išskirtas iš natūralių šaltinių arba dirbtinai gautas cheminės ar rekombinantinės sintezės metu.
Domenais yra laikomi tie Fig.2 parodyti HCV poliproteinų segmentai, kurie paprastai priklauso spėjamiems HCV struktūriniams ir nestruktūriniams proteinams. Žymint domenus yra laikomasi susitarimo, pagal kurį yra pažymimi Flavi-virusų proteinai. Fig.2 parodytos domenų vietos yra tik apytikslės. Pažymėjimai NS reiškia nestruktūrinius domenus, S reiškia apvalkalo domeną, o C reiškia nukleokapsidės ar nukleotido domeną.
Sulydytas polipeptidas reiškia polipeptidą, kuriame HCV antigenas(ai) yra atskiros vientisos aminorūgščių grandinės, neegzistuojančios gamtoje, dalis. HCV antigenai gali būti tiesiogiai vienas su kitu sujungti peptidinėmis jungtimis arba atskirti įsiterpusių aminorūgščių sekų. Sulydyti polipeptidai taip pat gali turėti egzogeninių HCV aminorūgščių sekų.
Bendra kieta matrica reiškia kietą kūną, su kuriuo kovalentiškai ar nekovalentiškai, pvz. hidrofobinės adsorbcijos būdu, yra susirišę atskiri HCV antigenai arba sulydyti polipeptidai, susidedantys iš HCV antigenų.
Žinduolio kūno komponentu yra laikomas individo, priklausančio žinduoliams (pvz., žmogaus) skystis ar audinys, turintys antikūnų, gaminamų to individo. Tokie, prieinami praktikoje be apribojimų komponentai, yra kraujas, plazma, serumas, stuburo smegenų skystis, limfa, kvėpavimo takų, žarnyno, lytinių ir šlapimo takų išskyros, seilės, pienas, baltieji kraujo kūneliai ir mielomos.
Imunologiškai reaktyvus reiškia, kad tiriamasis antigenas specifiškai reaguos su anti-HCV antikūnu, kuris paprastai sudaro didelę užkrėsto HCV individo serumo dalį.
Imuninis kompleksas reiškia junginį arba agregatą, kuris susidaro antikūnui susirišus su antigeno epitopu.
HCV antigenų kombinacijos
Fig.2 yra parodyti spėjami HCV poliproteinų domenai. Domenai, nulemiantys antigenus, naudojamus kombinacijose, yra šie: C, S (ar E), NS3, NS4 ir NS5. Manoma, kad C domenas nulemia HCV nukleokapsidės proteiną. Jis tęsiasi nuo poliproteino N-terminalinio galo iki maždaug 120 aminorūgšties (Fig.l). Manoma, kad S domenas apibrėžia viriono apvalkalo proteiną ir, galbūt, matrikso (M) proteiną, ir kad jis tęsiasi nuo maždaug 120 aminorūgšties iki 400 (Fig.l). NS3 domenas tęsiasi nuo maždaug 1050 aminorūgšties iki 1640 ir turėtų sudaryti virusinę proteazę. NS4 domenas tęsiasi nuo NS3 terminalinio galo iki maždaug 2000 aminorūgšties. Iki šiol nėra žinoma NS4 proteino funkcija. Pagaliau, NS5 domenas tęsiasi maždaug nuo 2000 aminorūgšties iki proteino galo ir manoma, kad jis apibrėžia virusinę polimerazę.
Fig.l yra parodyta HCV1 izoliato seka. Galvojama, kad ir kitų, iš kraujo kilusių, HCV grandinių sekos gali skirtis nuo sekų, pavaizduotų Fig.l, ypatingai apvalkalo (S) ir nukleokapsidės (C) domenuose. Tokių HCV antigenų su besiskiriančiomis sekomis panaudojimas ir būtų šio išradimo tikslas, pastebint, beje, kad dėl skirtingumo neturėtų žymiai pakisti antigeno imunologinis reaktyvumas serumui asmenų, užkrėstų HCV.
Apskritai, HCV antigenus sudaro ištisiniai ar apkarpyti domenai; domenų fragmentai pagal reakciją į antigeną yra lengvai atrenkami įgudusių šioje srityje darbuotojų. Geriau, kad atskiri HCV antigenai, naudojami kombinacijoje, apimtų imunodominantinę pasirinktojo domeno dalį (t.y. dalį, kuri pirmiausia sąlygoja polipeptido imunologinį reaktyvumą). C domeno atveju geriau, kad C domeno antigenas apimtų domeno didžiąją ištisos sekos dalį. Ypač tiktų antigenas, pažymėtas C22 (žr. 4 pavyzdžio aprašymą). Geriau, kai S domenas apima hidrofobinį subdomeną N-terminaliniame domeno gale. Šis hidrofobinis subdomenas esti maždaug nuo 199 aminorūgšties iki 328 (Fig.l). Ypač tinkamas HCV antigenas, pažymėtas S2 (3 pavyzdžio aprašymas). Jei norima, į S domeno antigeną gali būti įjungta seka, einanti žemyn po hidrofobinio subdomeno.
Labiau tinkamas NS3 domeno antigenui yra C33c antigenas. Šis antigenas apima aminorūgštis nuo 1192 iki 1457 (Fig.l). Geresnis NS4 domeno antigenas yra C100, kuris apima aminorūgštis nuo 1569 iki 1931 (Fig.l). Geresnis NS5 domeno antigenas apima aminorūgštis nuo 2054 iki 2464 (Fig.l).
HCV antigenas gali būti polipeptidas, sudarytas tik iš HCV aminorūgščių sekos arba iš egzogenines HCV-ui sekos (t.y. jis gali būti sulydytas proteinas, turintis egzogeninę seką). Gaminant HCV antigeną rekombinantiškai, antigenas, būdamas sulydyto proteino pavidalu, pvz., su SOD, alfa-faktoriumi ar ubikvitinu (žr. JAV patentus Nr. Nr. 4751180, 4870008 ir 1989 m. rugpjūčio 7-os
d. JAV patentinę paraišką Nr. 390599, kurių dalys, aprašančios SOD, alfafaktoriaus ir ubikvitino ekspresiją, čia yra pateikiamos), gali padidinti ekspresijos lygį ir/ar padidinti antigeno tirpumą vandenyje. Sulydytų proteinų, tokių kaip alfafaktoriaus ir ubikvitino, sulydymas yra vykdomas ekspresijos šeimininko, siekiant
Ί pašalinti heterologines sekas. Alfa-faktorius yra sekretuojanti sistema, o sulydyti su ubikvitinu kompleksai lieka citoplazmoje.
Toliau, antigenų kombinacija gali būti gauta kaip sulydytas proteinas. Kaip antai, vientisas DNR fragmentas, koduojantis C22 ir C33c gali būti sukonstruotas, klonuotas į ekspresijos vektorių ir panaudotas C22 ir C33c sulydyto proteino ekspresijai. Panašiu būdu gali būti gauti C22 ir C100; C22 ir S2; C22 ir NS5 antigeno; C22, C33c ir S2; C22, C100 ir S2 bei C22, C33c, C100 ir S2 sulydyti proteinai. Taip pat gali būti panaudoti ir alternatyvūs fragmentai iš aprašytų pavyzdžiuose domenų.
HCV antigenų gavimas
HCV antigenai, minimi išradime, dažniausiai yra gaminami rekombinantinių ar žinomu cheminės sintezės kietoje fazėje būdais. Tačiau juos taip pat galima izoliuoti iš disocijavusių HCV ar HCV dalelių, panaudojus afininės chromatografijos metodiką, leidžiančią sujungti antikūnus su antigenais.
Kai gaminama rekombinantinės technikos pagalba, gali būti taikomos standartinės antigeną koduojančios DNR konstravimo, tokios DNR klonavimo ekspresijos vektoriuose, ląstelių-šeimininkių, kaip antai, bakterijų, mielių, vabzdžių ar žinduolių ląstelių transformavimo, ir antigeno gamybos, sukeliant DNR ekspresiją, procedūros. Kaip pažymėta aukščiau, siekiant padidinti ekspresiją, palengvinti valymą ar padidinti tirpumą, gali būti naudinga ekspresuoti antigeną sulydyto proteino pavidalu. Specifinės parodomųjų HCV antigenų gavimo procedūros yra aprašytos pavyzdžiuose, o taipgi pirminėje paraiškoje Nr. 456637.
Antigenu kompozicijos panaudojimui imunologinėje analizėje
HCV antigenai gali būti sujungti gaminant juos sulydyto proteino pavidalu, sudaryto iš dviejų ar daugiau antigenų, imobilizuojant juos atskirai ant bendros kietos matricos, arba fiziškai juos sumaišant. Antigeno sulydytieji proteinai taip pat gali būti imobilizuoti (surišti) ant kietos matricos. Kovalentinio ar nekovalentinio proteinų surišimo matricoje metodai ir metodikos yra žinomi šioje tyrimų srityje. Kietojo paviršiaus savybės kinta priklausomai nuo analizės pobūdžio. Kietuoju paviršiumi analizėje, atliekamoje mikrotitravimo duobutėse, yra duobutės ar indelio sienelė. Analizei vartojant rutuliukus, kietuoju paviršiumi esti rutuliuko paviršius. Analizei naudojant giliamačio lazdelę (t.y. kietą daiktą, padarytą iš porėtos arba pluoštinės medžiagos, tokios kaip audinys ar popierius) kietuoju paviršiumi bus medžiagos, iš kurios padaryta lazdelė, paviršius. Analizėje, pagrįstoje agliutinacija, kietuoju paviršiumi gali būti latekso ar želatinos dalelių paviršius. Kai atskiri antigenai yra surišami matricoje, jie pasiskirsto paviršiuje tolygiai arba pasiskirsto jame pagal šabloną, pavyzdžiui ruožais, taip kad tas antigenų surišimo šablonas galėtų būti atpažintas.
Paprasti antigenų mišiniai yra sudaryti iš antigenų, esančių bet kuriame tinkamame tirpiklyje ar dispersinėje terpėje.
Analizių, naudojančiu antigenu kombinacijas, tipai
HCV antigenai gali būti taikomi iš esmės bet kurio tipo analitinėse sistemose, kuriose siekiama žinomu antigenu aptikti antikūnus. Bendras šių analitinių sistemų bruožas yra tas, kad antigenas kontaktuoja su kūno komponentu, įtarus esant HCV antikūnų, sąlygose, kuriose antigenas gali susirišti su tokiu, komponente esančiu antikūnu. Tokios sąlygos yra fiziologinė temperatūra, pH ir joninė tirpalo jėga, kai naudojamas antigenų perteklius. Po antigeno inkubacijos su tiriamuoju pavyzdžiu nustatomi imuniniai kompleksai, turintys antigenų.
Imuninės analizės atlikimo tvarka gali stipriai skirtis, ir šioje srityje yra žinoma daug jų tipų. Darbo eigoje, pavyzdžiui, galima naudoti kietus padėklus arba vykdyti imuninę precipitacijos reakciją. Daugelyje analizės būdų yra naudojama žymėtieji antikūnai ar polipeptidai; žymėmis gali būti, pavyzdžiui, fermentų, florescuojančios, chemiliuminescuojančios, radioaktyvios ar dažų molekulės. Taip pat žinomi analizės būdai, kuriuose yra sustiprinami imuninio komplekso signalai; jų pavyzdžiais yra analitinės sistemos, kuriose naudojama biotinas ir avidinas, ir imuninė analizė su žymėtaisiais fermentais bei fermentams atliekant tarpininko vaidmenį, kaip antai, ELISA sistemose.
Apskritai, imuninė analitinė sistema gali būti heterogeninio ar homogeninio tipo, standartinė ar konkurentinė. Heterogeninio tipo analitinėje sistemoje polipeptidas yra dažniausiai surišamas kietoje matricoje ar padėkle, tuo palengvinant pavyzdžio atskyrimą nuo polipeptido po inkubacijos. Vartojamais kietųjų padėklų pavyzdžiais gali būti nitroceliuliozė (pvz., membranos ar mikrotitravimo plokštelės pavidalo), polivinilo chloridas (pvz., plokštelių ar mikrotitravimo plokštelės pavidalo), polistireno lateksas (pvz., rutuliukų ar mikrotitravimo plokštelės pavidalo), polivinilidino fluoridas (žinomas kaip
ImmulonTM), diazotintas popierius, neilono membranos, aktyvuoti rutuliukai ir A-proteino rutuliukai. Pavyzdžiui, heterogeninio tipo analitinėje sistemoje galima naudoti Dynatech Immulon1 1 1 ar Immulon1 1 2 mikrotitravimo plokšteles arba 0,25 colių rutuliukus (Precision Plastic Bali). Antigeninių polipeptidų turintis pagrindas paprastai yra praplaunamas atskyrus jį nuo testuojamojo pavyzdžio ir prieš nustatant surištus antikūnus. Naudojama standartinė ir konkurentinė analizė.
Homogeninio tipo analizėje testuojamasis pavyzdys inkubuojamas su antigenų kombinacija tirpale. Pavyzdžiui, sąlygose, kai iškrenta į nuosėdas bet kurie susidarę antigeno ir antikūno kompleksai. Homogeninėse analitinėse sistemose taikomi abu, standartinis ir konkurentinis, tipai.
Standartinio tipo analizėje antikūno ir antigeno kompleksą sudarantis HCV antikūnų kiekis yra tiesiogiai reguliuojamas. Tai gali būti atlikta įvertinus, ar žymėtieji antiksenogeniniai (pvz., ne-žmogaus) antikūnai, kurie atpažįsta antiHCV antikūnus, yra surišti susidarius kompleksui. Konkurentinio tipo mėginiuose HCV antikūnų kiekis pavyzdyje yra sumažinamas reguliuojant konkurentinį žinomo kiekio žymėtų antikūnų (arba kitų konkuruojančių ligandų) surišimo komplekse efektą.
Priklausomai nuo tipo susidarę kompleksai, turintys anti-HCV antikūnus (ar konkurentinių mėginių atveju tam tikrą konkuruojančio antikūno kiekį), yra nustatomi kuria nors iš žinomų metodikų. Pavyzdžiui, komplekso nežymėti HCV antikūnai gali būti nustatyti naudojant antiksenogenetinį lg konjugatą, surištą su žyme (pvz., fermentine žyme).
Imunoprecipitatinio ar sukibimo tipo analizėje reakcijos metu tarp HCV antigenų ir antikūnų susidaro struktūra, kuri iš tirpalo ar suspensijos iškrenta į nuosėdas, suformuodama matomą nuosėdų sluoksnį ar plėvelę. Jei testuojamajame pavyzdyje nėra anti-HCV antikūno, tuomet matomos nuosėdos nesusidaro.
HCV antigenai paprastai bus pakuojami į komplektą, skirtą minėtai imuninei analizei. Komplektas paprastai talpina atskirose talpose antigenų kombinaciją (arba jau surištą su kietu pagrindu, arba atskirą, su reagentu, rišančiu juos prie pagrindo), kontrolinius antikūnų preparatus (teigiamus ir/ar neigiamus), žymėtą antikūną, kai šio tipo mėginiui reikia tokių pačių ir signalą skleidžiančių reagentų (pvz., fermentinių substratų, jei žymė tiesiogiai neskleidžia signalo). Paprastai komplekte bus pridėtos instrukcijos (pvz., ant popieriaus, magnetofono juostoje, VCR, CD-ROM ir pan.).
Toliau pateikti pavyzdžiai iliustruoja išradimą ir jokiu būdu jo nesiaurina.
pavyzdys: HCV antigeno C33c sintezė
HCV antigenas C33c turi NS3 domeno seką. Konkrečiai, ją sudaro aminorūgštys 1192-1457 (Fig. 1). Sis antigenas buvo gaminamas bakterijose, kaip sulydytas proteinas kartu su žmogaus superoksido dismutaze (SOD), žemiau aprašyta tvarka. Kad būtų gautas pcflEF, vektorius pSODcfl (Steiner et ai. (1986), J.Virol. 58:9) buvo pilnai suskaidytas su EcoRI bei BamHI ir, gautasis EcoRI, BamHI fragmentas buvo prijungtas prie šio linkerio:
GATC CTG GAA TTC TGA TAA
GAC CTT AAG ACT ATT TTA A.
Kad būtų sudarytas pcflEF/C33c, cDNR klonas, koduojantis aminorūgštis 1192-1457 ir turintis EcoRI galus, buvo įterptas į pcflEF. Ši ekspresinė konstrukcija buvo transformuota į D1210 E.coli ląstelėse.
Transformantai buvo naudojami ekspresijai sulydyto proteino, sudaryto iš SOD N-terminaliniame gale ir rėmelio C33c HCV antigeno Cterminaliniame gale. Ekspresija buvo užbaigta užkrėtus 1500 ml Luria buljono, turinčio ampicilino (100 mikrogramų/ml), su 15 ml iš vakaro užsėtų transformantų. Ląstelės buvo auginamos iki jų optinis tankis bus 0,3, po to įdėta IPTG, kad būtų gauta galutinė 2 mM koncentracija, vėliau, ląstelėms užaugus iki optinio tankio 1, jos buvo 20 min. centrifuguojamos, esant 3.000 x g, 4°C temperatūroje. Taip supakuotas ląsteles galima laikyti keletą mėnesių -80°C temperatūroje.
Norint išvalyti SOD-C33c polipeptidą, bakterinės ląstelės, kuriose šis polipeptidas buvo ekspresuotas yra paveikiamos osmotiniu šoku ir mechaniniu skaldymu, tada netirpi dalis, kurioje yra SOD-C33c, atskiriama ir veikiama išskiriamąja ekstrakcija, naudojant bazės-NaCl tirpalą. Siame ekstrakte esantis sulydytas polipeptidas išvalomas chromatografijos būdu, kolonėlėse su S-Sefaroze ir Q-Sefaroze.
Nevalytas ekstraktas, gautas po osmotinio šoko ir mechaninio skaldymo, toliau buvo ruošiamas taip. Vienas gramas supakuotų ląstelių buvo suspenduota 10 ml tirpalo, kurio sudėtyje yra 0,02 M Tris HC1 , pH 7,5, 10 mM
EDTA, 20% sacharozės, ir laikoma 10 min. ant ledo. Po to, ląstelės buvo nusodintos, 15 min. centrifuguojant 4.000 x g, 4°C temperatūroje. Pašalinus supernatantą, ląstelių nuosėdos perdėtos į 10 ml Al buferį (0,01 M Tris HC1, pH 7,5, 1 mM EDTA, 14 mM beta-merkaptoetanolio [BME]) ir 10 min. laikoma, pridėjus ledo. Ląstelės vėl buvo nusodinamos 15 min. centrifuguojant 4.000 x g,
4°C temperatūroje. Pašalinus skaidrų supemantą (periplazminę frakciją I), ląstelių nuosėdos buvo resuspenduotos Al buferyje , 10 min. laikoma lede, ir vėl 15 min.
centrifuguojama 4.000 x g, 4°C temperatūroje. Skaidrus supernatantas (periplazminė frakcija II) pašalintas, ląstelių nuosėdos resuspenduotos 5 ml buferio A2 (0,02 M Tris HC1, pH 7,5, 14 mM BME, lmM EDTA, lmM PMSF). Kad būtų suardytos ląstelės, suspensija (5 ml) ir 7,5 ml Dyno-mill stiklo rutuliukų (0,10- 0,15 mm diametro), praplautų rūgštimi be švino (gauta iš GlenMills, Ine.), buvo patalpinta į Falcon'o vamzdelį ir sukama didžiausiu greičiu 2 min., po to mažiausiai 2 min. šaldoma ant ledo; ši sukimo-šaldymo procedūra kartojama 4 kartus. Po sukimo, skysta masė buvo perfiltruota pro smulkaus stiklo filtrą, esant silpnam siurbimui; stiklo rutuliukai du kartus plaunami buferiu A2, sujungiant filtratą ir praplovimo skystį.
Neištirpusi nevalyto ekstrakto dalis buvo surinkta ir centrifuguota 15 min. 20.000xg, 4°C temperatūroje, du kartus praplauta 10 ml buferiu A2 ir resuspenduota 5 ml MILLI-Q vandens.
Frakcija, kurioje buvo SOD-C33c, atskirta nuo netirpių medžiagų tokiu būdu: į suspensiją įdėta NaOH (2M) ir NaCl (2M) iki galutinės 20 mM koncentracijos, tada mišinys 1 min. buvo kratomas, 20 min. centrifuguojamas 20.000xg, 4°C temperatūroje. Taip gautas reikalingas supemantas.
Norint švariai išgryninti SOD-C33c S-Sefarozėje, į supemanto frakciją įdėta (iki galutinių koncentracijų) 6M karbamido, 0,05 M Tris HC1, pH 7,5, 14 mM BME, lmM EDTA. Tada ši frakcija supilta į kolonėlę, kuri buvo užpildyta SSefaroze Fast Flow (1,5x10 cm) ir išbalansuota buferiu B (0,05M Tris HC1, pH
7,5, 14 mM BME, lmM EDTA). Supylus tiriamą tirpalą į kolonėlę, ji buvo praplauta buferiu B, kurio tūris lygus dviejų kolonėlių tūriui. Buvo surinktos pratekėjusio skysčio ir išplautos frakcijos. Tiriamo tirpalo ir praplovimo srovės tekėjimo greitis buvo 1 ml/min.; frakcijos surinktos po 1 ml. Frakcijos iš eilės patikrintos, ieškant SOD-C33c. Frakcijų mėginiai buvo analizuojami elektroforezės būdu 10% poliakrilamidiniame gelyje, kuriame buvo SDS, po to dažant Coomassie mėliu. Frakcijas galima analizuoti ir Western blot, naudojant antikūną, veikiantį prieš SOD. Buvo atrinktos frakcijos, turinčios SOD-C33c.
Toliau, SOD-C33c buvo gryninamos Q-Sefarozės kolonėlėje (1,5x5 cm), išbalansuotoje buferiu B. Atrinktos frakcijos su SOD-C33c, gautos po chromatografijos S-Sefarozėje, buvo supiltos į kolonėlę. Po to kolonėlė buvo praplauta buferiu B, ir išplauta eliuentu, pilant 60 ml buferio B, su NaCl gradientu nuo 0,0 iki 0,4 M. Tiriamo tirpalo, praplovimo ir eliuento pratekėjimo greitis buvo 1 ml/min.; frakcijos surinktos po 1 ml. Visos frakcijos gautos po chromatografijos Q-Sefarozės kolonėlėje, buvo analizuojamos taip pat, kaip ir chromatografijos SSefarozės kolonėje atveju. Didžiausia SOD-C33c koncentracija rasta frakcijoje, gautoje po išplovimo su 0,2 M NaCl.
Išanalizavus poliakrilamidiniame SDS gelyje ir imuno-blot būdu, naudojant monokloninį antikūną, kuris veikia prieš žmogaus SOD, buvo nustatyta, kad SOD-C33c, gauto po chromatografijos per Q-Sefarozės kolonėlę, grynumas yra didesnis nei 90%.
pavyzdys; HCV antigeno C100 sintezė
HCV antigenas C100 apima sekas iš NS3 ir NS4 domenų. Konkrerčiai, jo sudėtyje yra aminorūgštys 1569-1931 (Fig.l). Sis antigenas pagamintas mielėse. Buvo paruoštas cDNR 1270 bp fragmentas, koduojantis anksčiau minėtas aminorūgštys ir turintis EcoRI galus.
Mielių ekspresijos vektorius, kuriame minėtas cDNR fragmentas tiesiai sulydytas su C.cerevisiae ADH2/GAP promotoriumi, gautas pagal protokolą, numatantį, kad vyktų C100 sekos dauginimas pagal PCR metodą, o padaugintos sekos būtų įjungiamos į klonuojamą vektorių. Po klonavimo C100 seka iškirpta ir kartu su seka, kurioje buvo ADH2/GAP promotorius, prijungta prie didelio mielių vektoriaus fragmento. Tokiu būdu gautas ekspresijos vektorius.
C100 dauginimas PCR būdu vyko, naudojant matrica vektorių pS356cioom’ kuris buvo ištiesintas suskaidant Salį pagalba. pS3-56 yra išvestas iš pBR322 ir turi ekspresijos kasetę, kurios sudėtyje yra hibridinių mielių ADH2/GAPDH promotorius, esantis sekoje prieš žmogaus superoksido dismutazės geną ir po alfa-faktoriaus transkripcijos terminatoriaus.
Oligonukleotidų praimeriai, naudojami dauginime, buvo skirti palengvinti klonavimą ir įjungti transliacijos terminacinį kodoną. Konkrečiai, kartu su PCR oligonukleotidais buvo generuojami nauji 5'-HindIII ir 3'-SalI saitai. Oligonukleotide, kuriame buvo Salį saitas, buvo užkoduoti dvigubos terminacijos kodonai TAA ir TGA. Oligonukleotide, kuriame buvo HindlII saitas, taipgi buvo netransliuojama lyderinė seka, nuskaityta nuo pgap63 geno, esanti iškart prieš AUG kodoną. Genas pEco63GAPDH aprašytas Holland ir Holland (1980) ir Kniskern et ai. (1986). PCR praimerio, naudojamo ClOOm ekspresijai, sekos:
5' GAG TGC TCA AGC TTC AAA ACA AAA TGG CTC
ACT TTC TAT CCC AGA CAA AGC AGA GT 3' ir
5' GAG TGC TCG TCG ACT CAT TAG GGG GAA
ACA TGG TTC CCC CGG GAG GCG AA 3'.
Dauginimas PCR būdu, naudojant praimerius ir matricas, buvo atliekamas su Cetus-Perkin-Elmer PCR komplektu, pagal visus gamintojo reikalavimus. PCR metodo sąlygos tokios·. 29 ciklai 94°C temperatūroje 1 minutę, 37°C temperatūroje 2 min., 72°C temperatūroje 3 min. ir galutinė inkubacija
72°C temperatūroje 10 min. DNR gali būti laikoma per naktį 4°C ar -20°C temperatūroje.
Padauginus, PCR produktai suskaidyti su HindlII ir Salį. Pagrindinis
1,1 kb produktas valytas elektroforezės ant gelio būdu, o po eliucijos išvalytas produktas buvo prijugtas prie didelio pBR322 Sall-HindlII fragmento. Norint atskirti teisingus rekombinantus, sveikos HB101 ląstelės buvo transformuotos rekombinantiniais vektoriais, ir po klonavimo ieškomi rekombinantai buvo identifikuoti remiantis HindlII-SalI fragmentų, iškirptų iš klonų, dydžiu. Vienas iš klonų, kuriame buvo tinkamo dydžio HindlII-SalI fragmentas, pavadintas pBR322/C100d. Išanalizavus HindlII-SalI fragmento seką, pasitvirtino, kad šiame klone yra pasidauginusio C100.
Ekspresijos vektorius, kuriame yra C100, buvo sukonstruotas, surišus
HindlII-SalI fragmentą iš pBR322/C100 d su 13,1 kb BamHI-Sall fragmentu iš pBS24.1, ir 1369 bm BamHI-Sall fragmentu, kuriame yra ADH2/GAP promotorius. (Pastarasis fragmentas aprašytas EPO Nr. 164556). pBS24.1 vektorius yra aprašytas U.S.S.N. 382805, 1989 birželio 19. ADH2/GAP promotoriaus fragmentas buvo aptiktas suliejus vektorių pPGAP/AG/HindlII su HindlII ir BamHI, vėliau 1369 bp fragmentas buvo išgrynintas gelio pagalba.
Sveikos HB101 ląstelės buvo transformuotos rekombinantinių vektorių, o teisingi rekombinantai buvo identifikuoti pagal gaunamą 2464 fragmentą ir 13.1 kb fragmentą, gautą suliejus klonuotų vektorių BamHI ir Salį. Vienas iš klonuotų teisingų rekombinantinių vektorių buvo pavadintas pcl00d#3.
Kad vyktų C100 ekspresija, sveikos genties Saccharomyces cerevisiae
AB122 štamo (MATa leu2 ura3-53 prb 1-1122 pep4-3 prcl-407[cir-0]) ląstelės buvo transformuotos pernešimo vektorių pC100d#3. Transformuotos ląstelės buvo patalpintos ant plokštelių su URA-sorbitolio, o po to atskirais transformantais padengtos Leu plokštelės.
Atskiri klonai buvo auginami Leu, ura terpėje, į kurią įdėta 2% gliukozės, 24-36 vai. 30°C temperatūroje. Vienas litras Mielių Ekstrakto Peptono Terpėje (YEP), kuriame yra 2% gliukozės, buvo sumaišytas su 10 ml kultūros, pastovėjusios pernakt. Taip gauta kultūra buvo auginama 48 vai. 30°C temperatūroje, maišant 400 aps/min greičiu ir vėdinant (1L oro pučiamas pro 1L tirpalo/min., t.y., lvvm) greičiu. Tirpalo pH nebuvo reguliuojamas. Kultūra buvo auginama BioFlo II fermentatoriuje, pagaminto New Brunswick Science Corp. Po fermentacijos ląstelės buvo atskirtos ir analizuojamos pagal C100 pasireiškimą.
Transformuotų ląstelių analizė, tiriant C100 polipeptidą, buvo atlikta bendruose ląstelių lizatuose ir nevalytuose ekstraktuose, paruoštuose iš vienintelės mielių kolonijos, išaugusios Leu plokštelėse. Ląstelių lizatai ir tiriami ekstraktai buvo analizuojami elektroforezės SDS poliakrilamidiniame gelyje būdu, ir Westem bloto būdu. Westem blotu buvo tirta su triušių polikloniniais antikūnais, nukreiptais prieš SOD-C100 polipeptidą, ekspresuotą mielėse. Manoma, kad C100 polipeptidas turi 364 aminorūgštis. Po gelio analizės paaiškėjo, kad tiriamojo polipeptido MWf yra 399,9K.
Abu analizės metodai parodė, kad tiriamas C100 polipeptidas buvo bendruose ląstelių lizatuose, bet jo nebuvo nevalytuose ekstraktuose. Šie rezultatai leidžia teigti, kad ekspresuotas C100 polipeptidas gali būti netirpus.
pavyzdys: HCV antigeno S2 ekspresija
HCV antigeno S2 seka priklauso S domeno hidrofobiniam Nterminaliniam galui. Sekoje yra aminorūgštys 199-328 (Fig 1.).
Ekspresijos vektoriaus, koduojančio S2 polipeptidą, konstravimo tvarka ir vektoriaus ekspresija mielėse buvo analogiška aprašytajai Pvz.2, C100 polipeptido atveju.
Matrica PCR reakcijoms buvo pBR322/Pil4a vektorius, kuris buvo ištiesintas jį suskaidžius su Hindlll. Pil4a yra cDNR klonas, kuris koduoja aminorūgštis 199-328.
Oligonukleotidų, naudojamų kaip praimerių dauginant PCR būdu S2 koduojamas sekas, sekos yra tokios.
S2 sekos 5'-sričiai:
5' GAG TGC TCA AGC TTC AAA ACA AAA TGG GGC TCT
ACC ACG TCA CCA ATG ATT GCC CTA AC 3';
ir
S2 sekos 3'-sričiai:
5' GAG TGC TCG TCG ACT CAT TAA GGG GAC CAG TTC
ATC ATC ATA TCC CAT GCC AT 3'.
Praimeris 5'-srityje įterpia Hindlll saitą ir ATG start- kodoną į dauginamą produktą. Praimeris 3'-srityje įterpia transliacijos stop-kodonus ir Salį saitą į dauginamą produktą.
PCR metodo sąlygos tokios: 29 ciklai per minutę 94°C temperatūroje, 2 minutes 37°C temperatūroje, 3 min. 72°C temperatūroje, ir pabaigoje inkubacija truko 10 min. 72°C temperatūroje.
PCR reakcijos pagrindinis produktas buvo 413 bp fragmentas, kuris išvalytas gelyje. Išvalytas fragmentas buvo prijungtas prie didelio fragmento, gauto paveikus pBR322 su Hindlll ir Salį fragmentu, ir taip gauta pBR322/S2d plazmidė.
Sulipinus 413 bp HindlII-SalI S2 fragmentą su 1.36 kb BamHI-HindlII fragmentu, kuriame yra ADH2/GAR promotorius, ir su dideliu mielių vektoriaus pBS24,l BamHI-Sall fragmentu, gauti rekombinantiniai vektoriai, kurie buvo klonuojami. Teisingi rekombinantiniai vektoriai buvo identifikuoti pagal 1.77 kb fragmentą, po suliejimo su BamHI ir Salį. Ekspresijos vektorius, sukonstruotas iš dauginamos sekos, ir turintis koduojančią S2 seką, prisijungtą tiesiogiai prie
ADH2/GAP promotoriaus, buvo identifikuotas kaip pS2d#9.
pavyzdys: HCV C antigeno sintezė
HCV antigenas C22 priklauso C domenui. Jis turi aminorūgštis 1-122, (Fig.l).
Ekspresijos vektoriaus, koduojančio C polipeptidą, konstravimo tvarka ir vektoriaus ekspresija mielėse vyko analogiškai C100 polipeptido ekspresijos atvejui ir yra aprašyta, išskyrus tai, kas nurodoma toliau.
Matrica PCR reakcijoms buvo pBR322/Ag30a, kuris buvo ištiesintas su Hindlll. Ag30 yra cDNR klonas, koduojantis aminorūgštis 1-122. Oligonukleotidų, kurie buvo praimeriai dauginant C koduojančias sekas PCR būdu, sekos buvo tokios.
C sekos 5'-sričiai:
5’ GAG TGC AGC TTC AAA ACA AAA TGA GCA CGA ATC CTA AAC CTC AAA AAA AAA AC 3' ir
C sekos 3'-sričiai:
5' GAG TGC TCG TCG ACT CAT TAA CCC AAA TTG CGC GAC CTA CGC CGG GGG TCT GT 3'.
Praimeris 5'-sričiai įterpia Hindlll saitą į dauginamą produktą, o praimeris 3'-sričiai įterpia transliacijos stop-kodonus ir Salį saitą. PCR reakcija vyko taip: 29 ciklai per minutę 94°C temperatūroje, 2 min. 37°C temperatūroje, 3 min. 72°C temperatūroje, ir pabaigoje inkubacija truko 10 min. 72°C temperatūroje.
Pagrindinis PCR gamybos produktas yra 381 bp polinukleotidas.
Sulipinus šį fragmentą su pBR322 dideliu Sall-HindlII fragmentu, gavosi plazmidė pBR322/C2.
Surišus 381 bp HindlII-SalI C koduojantį fragmentą, iškirptą iš pBR322/C2 su 1.36 kb BamHI-HindlII fragmentu, kuriame yra ADH2/GAP promotorius, ir su dideliu mielių vektoriaus pbS24.1 fragmentu BamHI-Sall, gauti rekombinantiniai vektoriai, kurie buvo klonuojami. Teisingi rekombinantiniai vektoriai buvo identifikuoti pagal 1.74 kb fragmentą po to kai buvo suskaldyti su BamHI ir Salį. Iš dauginamos sekos sukonstruotas ekspresijos vektorius, kurio seka koduoja C, prijungtą tiesiogiai prie ADH2/GAP promotoriaus, buvo identifikuotas kaip pC22.
Transformuotų ląstelių analizė, tiriant C polipeptido pasireiškimą buvo atlikta visų ląstelių lizatuose ir nevalytuose ekstraktuose, gautuose iš vienintelės mielių kolonijos, išaugintos Leu plokštelėse. Ląstelių lizatai ir nevalyti ekstraktai buvo analizuojami, atliekant elekroforezę SDS poliakrilamidiniame gelyje. C polipeptidas, manoma, turi 122 aminorūgštis, o atlikus gelio analizę paaiškėjo, kad ekspresuoto polipeptido MWf yra maždaug 13.6 Kd.
pavyzdys: NS5 polipeptido sintezė
Šis polipeptidas turi N-terminalinio galo seką NS5 domene. Konkrečiai jo sudėtyje yra aminorūgštys nuo 2054 iki 2464 (Fig. L). Ekspresijos vektoriaus, kuriame užkoduotas NS5 polipeptidas, konstravimo ir vektoriaus ekspresijos tvarka yra panaši į tą kurios laikomasi C33c ekspresijos atveju (žr. Pvz.l).
pavyzdys : Antikūnu prieš HCV radioimunologinė analizė (RIA)
HCV antigenai (pavyzdžiai 1-5) buvo patikrinti RIA metodu, norint įvertinti jų gebėjimą aptikti antikūnus prieš HCV serume individų, kurie pagal klinikines diagnozes, turėjo HCV (nei-A, nei-B), arba serume, gautame iš apmokamų donorų kraujo.
RIA metodo pagrindas yra procedūra, aprašyta Tsu ir Herzenberg (1980), SELECTED METHODS IN CELLULAR IMMUNOLOGY (W.H. Freeman & Co.), pp. 373-391. Apskritai, mikrotitravimo plokštelės (Immulon 2, Removavvell juostelės) yra padengtos švariu HCV antigenu. Padengtosios plokštelės yra inkubuojamos kartu su serumo pavyzdžiais arba su atitinkamais kontroliniais pavyzdžiais. Inkubacijos metu, antikūnas, jei yra, imunologiškai susiriša su kietoje fazėje esančiu antigenu. Pašalinus neprisijungusias medžiagas ir praplovus mikrotitravimo plokšteles, žmogaus antikūnų-NANBV ir antigenų
125 kompleksai yra nustatomi inkubuojant su I-pažymėtu avies antikūnu prieš žmogaus imunoglobulinus. Neprisijungęs pažymėtas antikūnas pašalinamas išsiurbiant, o plokštelės išplaunamos. Išmatuojamas individualių duobučių radioaktyvumas; prisijungusių žmogaus anti-HCV antikūnų kiekis yra proporcingas radioaktyvumui duobutėje.
Konkrečiai, į kiekvieną mikrotitravimo plokštelės duobutę (Dynatech Immulon 2 Removawell Strips) pridėta šimtas mikrolitrų tirpalo, kurio sudėtyje yra 0,1-0,5 mikrogramų HCV antigenų, ištirpintų 0,125 M Na borato buferyje, pH 8,3, ir 0,075 M NaCl (BBC). Plokštelė buvo laikoma per naktį drėgnoje patalpoje
4°C temperatūroje, po to antigenų tirpalas buvo pašalintas, o duobutės praplautos BBS, kurio sudėtyje yra 0,02% Triton Χ-100 (BBST), tirpalu 3 kartus. Norint išvengti nespecifinių ryšių susidarymo duobutės buvo padengtos jaučio serumo albuminu (BSA), pridedant 100 mikrolitrų B S A, ištirpinto BBS, tirpalo (5 mg/ml); po to inkubuojam 1 vai. kambario temperatūroje; po inkubacijos BSA tirpalas buvo pašalintas. Padengtose duobutėse antigenai reagavo su serumu, pridėjus 100 mikrolitrų tūrio serumo pavyzdžius, praskiestus santykiu 1:100 su 0,01 M Na fosfato buferiu, pH 7,2, 0,15 M NaCl (PBS), į kurio sudėtį įeina 10 mg/ml BSA, ir inkubavus duobutes su serumu 1 vai. 37°C temperatūroje. Po inkubacijos serumo pavyzdžiai buvo pašalinti išsiurbiant, o duobutės 5 kartus buvo praplautos su
125
BBST. Antikūno susijungimas su antigenu buvo nustatomas pagal I-pažymėtą
F'(ab)2 avies antikūniu prieš žmogaus IgG prisijungimą prie padengtųjų duobučių.
Į kiekvieną duobutę buvo pridėta po 100 mikrolitrų žymėtųjų zondų (specifinis aktyvumas 5-20 mikrokiuri/mikrogramą), tada plokštelės laikytos 1 vai. 37°C temperatūroje, po to zondų perteklius buvo pašalintas išsiurbiant, o plokštelės 5 kartus praplautos su BBST. Liekamasis radioaktyvumas kiekvienoje duobutėje buvo nustatytas gama spindulių skaitikliu.
Lentelėje 1 parodyti rezultatai, gauti testuojant serumą individų, kuriems diagnozuotas HCV.
Lentelė 1
INDIVIDAS ANTIGENAS
S2 C22 C100 C33c NS5
CVHIVDA P P P(+++) P P
CVH IVDA P P P(+) P P
CVH IVDA P P P(+) P P
CVHNOS P P P P P
AVHNOSHS N N N N N
AVH NOS HS P N N N N
AVH NOS HS P N N N N
AVH NOS HS P/N N N N N
AVH PTVH N N N P/N N
AVH NOS HS N N N N N
AVH NOS N N N N P
AVH PTVH N N N N N
AVH IVDA N P N P P
AVH PTVH P P/N N N P
AVH NOS N P N N N
AVH IVDA N P N P P
AVH NOS HS P/N N N N N
AVH PTVH N N N N N
CVH IVDA P P P P P
CVH IVDA P P P P P
AVH NOS HS N N N N N
CVH PTVH P P N N N
AVH PTVH P N P(+) P(+++) N
CVH PTVH N P P P P
CVH NOS HS P P P P N
AVH NOS N P P/N P P
CVH IVDA N N N P N
AVH IVDA P P P P P
INDIVIDAS ANTIGENAS
S2 C22 C100 c 33c NS5
AVH IVDA P P P P P
CVHIVDA P P P P P
AVHIVDA P/N P N P P
AVH IVDA N P P P N
CVH PTVH P P/N N N N
CVH NOS N N N N N
CVH NOS N N N N N
CVH IVDA P P P P P
AVHIVDA P P P P P
CVH PTVH P P P P P
AVH PTVH? N P P P P
AVH IVDA N P N P N
AVH NOS N N N N N
AVH NOS N N N N N
CVH NOS N P N N P
CVH NOS P P N N N
CVH NOS HS P P P P P
CVH PTVH P P N P P
AVH nurse P P N N N
AVH IVDA P P P P N
AVH IVDA N P P(+) P(+++) N
AVH nurse P/N P N N N
AVH PTVH P/N P P N P
AVH NOS N P/N N N P
AVH NOS N P N P N
AVH PTVH P P/N N N N
AVH PTVH N P N P P
AVH PTVH P P P P P
AVH PTVH N P N N P
CVH PTVH P/N P P(+) P(+++) N
AVH PTVH N P/N P(+) P(+++) P
AVH PTVH P (?) P N P
CVH PTVH N P N P P
CVH PTVH N P P P P
CVH PTVH N N N N N
AVH NOS N N N N N
AVH nurse P P N N N
CVH PTVH N P N N P
AVHIVDA N P N P/N N
CVH PTVH P P P(+) P(+++) P
AVH NOS P P N N N
AVH NOS P/N P N N P
AVH PTVH P/N P P P P
AVH NOS N P P P P/N
AVH IVDA N P N N P
AVH NOS N P/N N N N
AVH NOS P P N N P
AVH PTVH N P P P P
crypto P P P P P
CVH NOS N P P P P
CVH NOS N N N N N
AVH PTVH N P P(+) P(++) N
AVH PTVH N P/N P(+) P(++) P
AVH PTVH N P/N P(+) P(++) P
CVH IVDA P P P P P
CVHIVDA P P P P P
CVH IVDA P P P P P
INDIVIDAS ANTIGENAS
S2 C22 C100 C33c NS5
CVH IVDA P P P P P
AVH NOS N P N N N
CVH IVDA P P P P P/N
AVH IVDA P P P P N
AVH NOS P P N N N
AVH NOS P P N N N
CVH PTVH P P N N P/N
AVH PTVH N P N P P
AVH NOS N N N N N
AVHNOS N P N N N
AVH NOS P N N N N
CVH NOS N N N N N
AVH NOS N P/N N N N
AVH IVDA N P P P P
crypto N P N N P/N
crypto P P P/N I P P
AVHIVDA N N P P N
AVH IVDA N P P P N
AVH NOS N N N N N
AVH NOS N N N N N
CVH IVDA P P P P P
CVH PTVH N N N N N
CVH PTVH P P P(+) P(+++) P
CVH PTVH P P P(+) P(+++) P
CVH NOS P/N N N N N
CVH NOS N N N N N
CVH PTVH P P P P P
CVH PTVH P P P P P
CVH PTVH P P P P P
AVH IVDA N P P P P
CVH NOS N N N N N
CVH NOS N N N N N
CVH PTVH P P P P P
AVH NOS P P N N P/N
AVHNOS N P/N N N N
CVH PTVH P P N N P
CVH NOS N P/N N N N
AVH NOS N P N N N
AVH NOS N P N N N
CVH PTVH N P N N N
AVHIVDA N P N P P
AVHNOS P N N N N
CVHNOS N N N N N
CVHNOS N N N N N
CVHIVDA P P P P P
CVHIVDA P/N P P P P
CVH IVDA P P P P P
CVH IVDA N P P P P
AVH NOS N P N N N
CVHIVDA N P N N P
CVHIVDA N P N N P
AVH PTVH P P N P P
AVH PTVH P P N P P
CVHNOS N P/N N N P/N
CVH NOS N P N N N
CVH NOS N N N N N
CVH PTVH P P P P P
CVH PTVH P P P P P
INDIVIDAS ANTIGENAS
S2 C22 C100 C33c NS5
CVH PTVH P P P P P
AVH IVDA N P N N P
AVH IVDA N P P(++) P(+) P
CVH PTVH P P P P P
AVH PTVH N P P P P
CVH PTVH? N P P P P
CVH PTVH? P/N P P P P
CVHNOS HS P P N N N
CVH IVDA P P P P N
CVH PTVH N P P P P
CVH PTVH P P P P P/N
CVH NOS P P P P P
CVH IVDA P P P P P
CVH PTVH P P P P N
CVH PTVH P P P P P
CVH NOS N N N N P/N
CVH NOS N P/N N N P/b
CVH PTVH P P P P P
CVH NOS N P N N N
CVH NOS N N N N N
CVH NOS P P N N P/N
CVH NOS N N N N N
CVH NOS HS P P P P P
CVH NOS HS P P P P P
CVH PTVH N N N N N
AVH PTVH N P P P P
AVH NOS - -
CVH PTVH N P P/N P(+++) 1
crypto P P P P P
crypto P P P P P
crypto N P N N N
crypto N P P P P
CVH PTVH P P P P P
crypto N N N N N
crypto N P N N P/N
crypto N P N N P
crypto P P P P P
crypto N P N P N
crypto - -
crypto - -
CVH NOS - -
AVH-IVDA N P N P(+) P
AVH-IVDA N P/N N P(++) >
AVH - ūmus virusinis hepatitas,
CVH - lėtinis virusinis hepatitas,
PTVH - virusinis hepatitas, įgytas po kraujo perpylimo,
IVDA - virusinis hepatitas, įgytas švirkščiant vaistus į veną, crypto - latentinis hepatitas,
NOS - šaltinis nenustatytas,
P - teigiamas;
N - neigiamas.
Iš šių duomenų aišku, kad nei vienas antigenas nereagavo su visais serumais. C22 ir C33c buvo labiausiai reaktyvūs, o S2 reagavo su keliais serumais tų individų, kuriems buvo diagnozuoti ūmūs HCV, ir su kurių serumais nereagavo joks kitas antigenas. Remiantis pateiktais duomenimis, didžiausiu nustatymo intervalu pasižymi dviejų antigenų, C22 ir C33c, kombinacija. Jei norima aptikti didžiausią skaičių ūmių infekcijų, reikia į junginį įtraukti ir S2.
Žemiau, Lentelėje 2 pateikti rezultatai, gauti testuojant apmokamų donorų kraują.
Lentelė 2
Antigenas S2
C100 C33c C22
N N N N N
N N N N N
P P P P P
N N N N N
N N N N N
N N N N N
N N N N N
N N N N N
N N N N N
N N N N N
N N N N N
N N N N N
N N N N N
N N N N N
N N N N N
N N N N N
N N N N N
P P P P P
P P N P P
P P N P P
N N N N N
N P P N P
P P P P P
N N N N N
N N N N N
N N N N N
N N N N N
N N N N N
N N N N N
N N N N N
P P P N P
NS5
N N N N N
N N N N N
N N N N P
N N P N P
N N N N N
N N N N N
N N N N N
N N N N N
N N N N N
N N N N P
N N N N N
N N N N N
N N N N N
N N N N N
N N N N N
P P N N P
N N N N N
N N N N N
N N N N N
N P P N P
N N N N N
Antigenas
C100 C33c C22 S2
N P P N P
P P P P N
N N N N N
N N N N N
N N N N N
N N N N N
N N N N N
N N N N N
N N N N N
N N N N N
N N N N N
NS5
N N N N N
N N N N N
N N N N N
N N N N N
N N N N N
N N N N N
P P P P P
N N N N N
N N N N N
P P P P N
N N N N N
N N N N N
N N N N P
N N N N N
N N N N N
N N N N N
N N N N N
N N N N N
N N N N N
P P N N N
N N P N N
N N N N N
P P P P N
N N N N N
N N N N N
P P P P P
P P P P N
N N N N P
P P P N N
N N N N N
N N N N N
N N N N N
N N N N N
N N N N N
N P P P P
P P P P P
N N N N N
P P P P P
N N N N N
N N N N N
N N N N
P P P P N
N N N N N
N N N N N
N N N N N
P P P P P
P P P N P
Antigenas
C100 C33c C22 S2
P P P N P
N N N N N
P P P P P
N N N N N
N N N N N
P P P P P
N N N N N
N N N N N
N N N N N
P P P P P
N N N N N
N P P N P
N N N N N
N N N N N
N N N N N
P N N N N
N N N N N
N N N N N
N N N N N
NS5
P N N N N P N N N N P N N N N P N N N N N P N N N
N N N N N
N N N N N
N N N N N
N N N N N
N N N N N
P N N N N
P N P P P
N N N N N
N N N N N
N N N N N
N N N N N
N N N N N
N N N N N
N N N N N
N N N N N
N N N N N
N N N N N
N N N N N
N N N N N
P P P P P
N N N N N
N N N N N
N N N N N
N N N N N
N N N N N
N N N N N
P P P P P
N N N N N
N N N N N
P P P N P
N N N N N
P P P N P
N N N N N
N N N N N
Antigenas
C100 C33c C22 S2
N N N N N
N N N N N
N N N N N
N N N N N
N N N N N
N N N N N
N N N N N
N N N N N
N N N N P
N N N N N
N N N N N
N N N N N
N N N N N
N N N N N
P P P P P
N N N N N
N N N N N
N N N N N
N N N N N
N P P N N
N N N N N
N N N N N
N N N N N
N N N N N
N N N N N
N N N N N
N N N N N
NS5
196 N N N N N
197 N N N N P
198 P P P N N
199 N N N N P
200 P P P P N
Iš esmės duomenys, gauti tiriant apmokamus donorus, sutampa su duomenimis, gautais tiriant užsikrėtusių individų serumą.
pavyzdys: HCV antikūnu nustatymas ELISA metodu, naudojant HCV antigenu kombinaciją
Plokštelės, padengtos kombinacijos iš C22 ir C33c antigenų yra paruošiamos taip. Tirpalas, sudarytas iš padengimo buferio (50 mM natrio borato, pH 9,0), 21 ml/plokštelei, BSA (25 mikrogramai/ml), C22 ir C33c (kiekvieno po
2,5 mikrogramus/ml), yra ruošiamas prieš pat pridedant į Removeawell Immulon 1 plokšteles (Dynatech Corp.). Pamaišius 5 min., į plokštelę pridedama po 0,2 ml/duobutei, plokštelės uždengiamos ir laikomos 2 vai. 37°C temperatūroje, po to skystis pašalinamas ištraukiant. Plokštelės vieną kartą praplaunamos 400 mikrolitrų plovimo buferiu (100 mM natrio fosfato, pH 7,4, 140 mM natrio chlorido, 0,1 % (tūris/svoris) kazeino, 1 % (tūris/svoris) Triton Χ-100, 0,01% (tūris/svoris) Thimerosal). Pašalinus praplovimo tirpalą, yra pridedama po 200 mikrolitrų/duobutei, tirpalo, vartojamo po padengimo (10 mM natrio fosfato, pH 7,2, 150 mM natrio chlorido, 0,1 % (tūris/svoris) kazeino, 3 % sacharozės ir 2 mM fenilmetilsulfonilfluorido (PMSF)), plokštelės nesandariai pridengiamos, kad negaruotų ir paliekamos kambario temperatūroje 30 min. Iš duobučių ištraukiamas skystis, sausai liofilizuojama pernakt, nekaitinant stovo. Taip paruoštos plokštelės saugomos 2-8°C temperatūroje užrištuose aliuminio maišeliuose su desikantais (3 g Sorb-i0M paketėliai).
Kad įvertinimas būtų atliktas pagal ELISA metodiką, reikia 20 mikrolitrų serumo pavyzdžio ar kontrolinio pavyzdžio pridėti į duobutę, kurioje esama 200 mikrolitrų pavyzdžio skiediklio (100 mM natrio fosfato, pH 7,4, 500 mM natrio chlorido, 1 mM EDTA, 0,1 % (tūris/svoris) kazeino, 1 % (tūris/svoris)
Triton Χ-100, 0,01% (tūris/svoris) Thimerosal, 100 mikrogramų/ml mielių ekstrakto). Plokštelės yra sandariai užspaudžiamos ir 2 vai. laikoma 37°C temperatūroje, po to tirpalas išsiurbiamas ir plokštelės tris kartus praplaunamos 400 mikrolitrų plaunančiojo buferio tirpalu (fosfatinio buferio druska (PBS), turinti 0,05 % Tween 20). Praplautos duobutės yra paveikiamos 200 mikrolitrų pelių antikūnų prieš žmogaus IgG-krienų peroksidazės (HRP) konjugato, ištirpinto Ortho konjugato skiediklyje (10 mM natrio fosfato, pH 7,2, 150 mM natrio chlorido, 50 % (tūris/svoris) fetalinio jaučio serumo, 1 % (tūris/svoris) termiškai apdoroto arklio serumo, 1 mM KnFe(CN)^, 0,05 % (tūris/svoris) Tween 20, 0,02 % (tūris/ svoris) Thimerosal). Veikiama 1 vai. 37°C, tirpalas išsiurbiamas, duobutės tris kartus praplaunamos 400 ml plaunančiojo buferio, kuris taip pat pašalinamas išsiurbiant. Nustatant surišto fermentinio konjugato kiekį, pridedama 200 mikrolitrų substrato tirpalo (10 mg O-fenilenediamino dihidrochlorido 5 ml tiriančiojo tirpalo. Šį tirpalą sudaro 50 mM natrio citrato, pH 5,1 (pH koreguojamas fosforo rūgštimi) ir 0,6 mikrolitrai/ml 30 % EL^C^. Plokštelės su substrato tirpalu laikomos tamsoje 30 min. kambario temperatūroje, reakcijos sustabdomos pridėjus 50 mikrolitrų/ml 4N sieros rūgšties, ir nustatomi optiniai tankiai.
Panašiai ELISA metodika taikoma sulydytų proteinų C22 ir C33c, ir C22, C33c, ir S2 ir junginių, sudarytų iš C22 ir C100, C22 ir S2, C22 bei NS5 antigeno, C22, C33c, ir S2, ir C22, C100, ir S2, atvejais.
Aukščiau aprašyti procedūrų, kurių pagalba realizuojamas išradimas, pakeitimai yra akivaizdūs patyrusiems molekulinės biologijos, imunologijos ir gretimų sričių specialistams, ir yra įtraukti išradimo apibrėžtyje.

Claims (10)

  1. IŠRADIMO APIBRĖŽTIS
    1. Hepatito C viruso (HCV) epitopo sekų kombinacija viename ar daugiau polipeptidų, gautame cheminės sintezės arba rekombinantinės ekspresijos būdu, imobilizuotame kietos matricos, tinkamos HCV nustatymui imunoanalizės metodu, paviršiuje, besiskirianti tuo, kad susideda iš:
    a) pirmos epitopo sekos iš HCV poliproteino C domeno;
    b) antros epitopo sekos iš HCV poliproteino antro domeno, kuris yra:
    (i) HCV poliproteino NS3 domenas;
    (ii) HCV poliproteino NS4 domenas; arba (iii) HCV poliproteino NS5 domenas; ir
    c) trečios epitopo sekos iš HCV poliproteino trečio domeno, kuris yra:
    (i) HCV poliproteino NS3 domenas;
    (ii) HCV poliproteino NS4 domenas; arba (iii) HCV poliproteino NS5 domenas, kurioje trečias domenas yra skirtingas nuo antro domeno.
  2. 2. Kombinacija pagal 1 punktą, besiskirianti tuo, kad antras domenas yra NS3.
  3. 3. Kombinacija pagal 1 punktą, besiskirianti tuo, kad antras domenas yra NS4.
  4. 4. Kombinacija pagal 1 punktą, besiskirianti tuo, kad susideda iš:
    (a) pirmos epitopo sekos iš HCV poliproteino C domeno;
    (b) antros epitopo sekos iš HCV poliproteino NS3 domeno;
    (c) trečios epitopo sekos iš HCV poliproteino NS4 domeno.
  5. 5. Kombinacija pagal bet kurį iš 1-4 punktų, besiskirianti tuo, kad kieta matrica yra mikrotitravimo plokštelės duobutės, lazdelės arba rutuliuko paviršius.
  6. 6. Kombinacija pagal bet kurį iš 1-5 punktų, besiskirianti tuo, kad pirma, antra ir trečia epitopo seka yra atitinkamai pirmame, antrame ir trečiame polipeptide, atskirai prijungtuose prie kietos matricos,
  7. 7. Kombinacija pagal 6 punktą, besiskirianti tuo, kad kieta matrica yra lazdelė, o polipeptidai yra atskirai pasiskirstę tokiu būdu, kad gali būti įmanomas prisijungimas prie pirmo, antro ir trečio polipeptido.
  8. 8. Kombinacija pagal bet kurį iš 1-5 punktų, besiskirianti tuo, kad ji yra sulydyto polipeptido pavidale.
  9. 9. Antikūnų hepatito C virusui (HCV) nustatymo žinduolių kūno komponente, įtarus jų buvimą, būdas, besiskiriantis tuo, kad minėtas kūno komponentas sąveikauja su kombinacija pagal bet kurį iš 1-8 punktų sąlygose, užtikrinančiose antlkūno-antigeno reakciją ir imuninio komplekso iš minėto antikūno ir minėtų epitopų sekas turinčio polipeptido, nustatymą.
  10. 10. Komplektas analizei atlikti, skirtas antikūnų hepatito C virusui žinduolių kūno komponente, įtarus jame esant minėtus antikūnus, nustatymui, besiskiriantis tuo, kad jis susideda iš įpakuoto rinkinio
    a) HCV epitopų sekų kombinacijos pagal vieną iš 1-9 punktų;
    b) standartinių kontrolinių reagentų;
    c) analizės atlikimo instrukcijos.
LTIP1747A 1990-04-04 1993-12-30 Combinations of hepatitis c virus (hcv) antigens for use in immunoassays for anti-hcv antibodies LT3808B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US50435290A 1990-04-04 1990-04-04

Publications (2)

Publication Number Publication Date
LTIP1747A LTIP1747A (en) 1995-07-25
LT3808B true LT3808B (en) 1996-03-25

Family

ID=24005897

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
LTIP1747A LT3808B (en) 1990-04-04 1993-12-30 Combinations of hepatitis c virus (hcv) antigens for use in immunoassays for anti-hcv antibodies

Country Status (25)

Country Link
EP (2) EP0693687B2 (lt)
JP (1) JP2733138B2 (lt)
KR (1) KR100206150B1 (lt)
AT (2) ATE182684T1 (lt)
BG (1) BG61291B1 (lt)
BR (1) BR9106309A (lt)
CY (1) CY1881A (lt)
DE (2) DE69131488T2 (lt)
DK (2) DK0450931T3 (lt)
ES (2) ES2134388T5 (lt)
FI (1) FI106317B (lt)
GB (1) GB2257784B (lt)
GR (2) GR3020964T3 (lt)
HU (1) HU217025B (lt)
IE (1) IE911105A1 (lt)
IL (2) IL97741A0 (lt)
LT (1) LT3808B (lt)
LV (2) LV10344B (lt)
MY (1) MY107499A (lt)
NO (1) NO310241B1 (lt)
PL (1) PL172133B1 (lt)
RO (1) RO109916B1 (lt)
RU (1) RU2130969C1 (lt)
UA (1) UA41266C2 (lt)
WO (1) WO1991015771A1 (lt)

Families Citing this family (58)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7166287B1 (en) 1989-12-18 2007-01-23 Glaxo Wellcome Inc. Viral agent
LU87861A1 (fr) 1989-12-18 1991-10-08 Wellcome Found Agent viral
KR940000755B1 (ko) * 1990-02-16 1994-01-29 유나이티드 바이오메디칼 인코오포레이티드 Hcv에 대한 항체 검출, hcv 감염의 진단 및 백신으로서의 그 예방에 특히 적합한 합성 펩티드
US6194140B1 (en) * 1990-04-04 2001-02-27 Chiron Corporation HCV NS3 protein fragments having helicase activity and improved solubility
DE69132332T2 (de) * 1990-04-06 2000-11-30 Genelabs Tech Inc Hepatitis c-virus-epitope
CA2049679C (en) * 1990-08-24 2005-06-21 Sushil G. Devare Hepatitis c assay utilizing recombinant antigens
US6274148B1 (en) * 1990-11-08 2001-08-14 Chiron Corporation Hepatitis C virus asialoglycoproteins
RO115446B1 (ro) * 1990-11-08 2000-02-28 Chiron Corp Procedeu de obtinere a asialoglicoproteinelor purificate provenind de la virusul hepatitei c
US6007982A (en) * 1990-12-14 1999-12-28 Innogenetics N.V. Synthetic antigens for the detection of antibodies to hepatitis C virus
DK0644202T3 (da) * 1990-12-14 1997-09-15 Innogenetics Nv Syntetiske antigener til påvisning af antistoffer imod hepatitis C virus
US5910404A (en) 1990-12-14 1999-06-08 Innogenetics N.V. Synthetic antigens for the detection of antibodies to hepatitis C virus
DE4041304A1 (de) * 1990-12-21 1992-06-25 Mikrogen Molekularbiol Entw Von strukturproteinen des hepatitis c-virus abgeleitete polypeptide, testkits, die diese polypeptide enthalten und impfstoffe gegen infektionen von hepatitis c-viren
US5574132A (en) * 1991-04-05 1996-11-12 Biochem Immunosystems Inc. Peptides and mixtures thereof for detecting antibodies to hepatitis C virus (HCV)
CA2099883A1 (en) * 1991-11-07 1993-05-08 John A. Kink Epitope mapping of the c33c region of hcv
WO1993010239A2 (en) * 1991-11-21 1993-05-27 Common Services Agency Hepatitis-c virus testing
WO1993015207A2 (en) * 1992-02-04 1993-08-05 Viagene, Inc. Hepatitis therapeutics
GB9203803D0 (en) * 1992-02-21 1992-04-08 Wellcome Found A recombinant polypeptide
UA39944C2 (uk) * 1992-07-07 2001-07-16 Чірон Корпорейшн Спосіб визначення ранньої сероконверсії у ссавця-хазяїна до вірусу гепатиту с і набір для використання в способі
US6153378A (en) * 1992-10-16 2000-11-28 Bionova Corporation Diagnosis of, and vaccination against, a positive stranded RNA virus using an isolated, unprocessed polypeptide encoded by a substantially complete genome of such virus
EP0593291A3 (en) * 1992-10-16 1995-03-15 Evernew Biotech Inc Non-structural protein of the hepatitis C virus, as well as diagnostic procedure and test kit.
JP2778886B2 (ja) * 1992-10-16 1998-07-23 エバーニュー バイオテック インコーポレイティド Ｃ型肝炎ウィルスのコア抗原タンパク質及びそれを用いての診断方法及びキット
WO1994013164A1 (en) 1992-12-10 1994-06-23 Nike International Ltd. Bonding of rubber to plastic in footwear
UA46707C2 (uk) 1993-05-10 2002-06-17 Чірон Корпорейшн Спосіб типування вірусу гепатиту с (варіанти), набір поліпептидів (варіанти), реагент, що включає комбінацію поліпептидів, які містять типоспецифічні епітопи гепатиту с (варіанти)
DE4428705A1 (de) * 1994-08-12 1996-02-15 Boehringer Mannheim Gmbh Rekombinantes Antigen aus der NS3-Region des Hepatitis C Virus
JPH0862219A (ja) * 1994-08-19 1996-03-08 Dainabotsuto Kk 還元型抗原に対する抗体アッセイ試薬及びそれを使用した測定方法
JP3665371B2 (ja) * 1994-08-31 2005-06-29 株式会社先端生命科学研究所 Ｃ型肝炎ウイルス感染又はグループ判定のためのエピトープキメラ抗原ペプチド、その製法、及びそれを使用する感染又はグループ判定法
CA2172305A1 (en) * 1995-03-30 1996-10-01 Muneo Aoyama Multiple antigenic peptide comprising at least two hepatitis c virus-associated peptides
WO1996037606A1 (en) * 1995-05-22 1996-11-28 Bionova Corporation Compositions and methods for the diagnosis of, and vaccination against, hepatitis c virus (hcv)
FR2734639B1 (fr) * 1995-05-26 1997-10-03 Parteurop Methode de pronostic de l'evolution d'une infection par le virus de l'hepatite c, et necessaire pour sa mise en oeuvre
FR2737209B1 (fr) 1995-07-25 1997-09-19 Bio Merieux Peptide capable d'etre reconnu par des anticorps reconnaissant l'antigene c33 du virus de l'hepatite c
US6127116A (en) 1995-08-29 2000-10-03 Washington University Functional DNA clone for hepatitis C virus (HCV) and uses thereof
JP3715027B2 (ja) 1996-05-07 2005-11-09 シスメックス株式会社 Ｃ型肝炎ウイルス感染症診断薬
US7338759B1 (en) 1997-03-04 2008-03-04 Washington University HCV variants
US7049428B1 (en) 1998-03-04 2006-05-23 Washington University HCV variants
PT1021719E (pt) * 1997-09-22 2007-03-30 Novartis Vaccines & Diagnostic Método para detecção de anticorpos numa amostra
AU6098900A (en) * 1999-07-15 2001-02-05 Bayer Corporation The use of specific antibody titers to predict hepatic failure in people infected with hepatitis c virus
WO2001030812A2 (en) * 1999-10-27 2001-05-03 Chiron Corporation Activation of hcv-specific t cells
CA2390082C (en) * 1999-11-24 2010-06-29 Chiron Corporation Novel hcv non-structural polypeptide
US6986892B1 (en) 1999-11-24 2006-01-17 Chiron Corporation Immunogenic Hepatitis C virus non-structural polypeptides
ATE368221T1 (de) 2000-06-15 2007-08-15 Novartis Vaccines & Diagnostic Immunoassays für anti-hcv-antikörper
US7491808B2 (en) 2000-06-15 2009-02-17 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. HCV non-structural protein mutants and uses thereof
US6680059B2 (en) 2000-08-29 2004-01-20 Tripep Ab Vaccines containing ribavirin and methods of use thereof
AU9215101A (en) 2000-08-17 2002-02-25 Tripep Ab Vaccines containing ribavirin and methods of use thereof
US7022830B2 (en) 2000-08-17 2006-04-04 Tripep Ab Hepatitis C virus codon optimized non-structural NS3/4A fusion gene
US6858590B2 (en) 2000-08-17 2005-02-22 Tripep Ab Vaccines containing ribavirin and methods of use thereof
FR2839722A1 (fr) 2002-05-17 2003-11-21 Bio Merieux Nouvelles compositions peptidiques et leur utilisation notamment dans la preparation de compositions pharmaceutiques actives contre le virus de l'hepatite c
JP4585314B2 (ja) 2002-09-09 2010-11-24 ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス，インコーポレーテッド Ｈｃｖアッセイ
JP4864891B2 (ja) 2004-06-09 2012-02-01 パサジャン リムーヴァル アンド ダイアグナスティック テクノロジーズ インコーポレイテッド サンプルから標的因子を除去するためのデバイス及び方法
JP2005274584A (ja) * 2005-05-25 2005-10-06 Sysmex Corp Ｃ型肝炎ウイルス感染症診断薬の製造方法
JP4005093B2 (ja) * 2005-05-25 2007-11-07 シスメックス株式会社 Ｃ型肝炎ウイルス感染症診断薬および抗ｈｃｖ抗体検出方法
US7968697B2 (en) 2005-05-25 2011-06-28 Chrontech Pharma Ab Hepatitis C virus non-structural NS3/4A fusion gene
JP5188400B2 (ja) * 2006-03-09 2013-04-24 トランスジーン エス．エー． Ｃ型肝炎ウイルスの非構造融合タンパク質
US20080227111A1 (en) 2007-03-16 2008-09-18 Sysmex Corporation Reagent kit and method for measuring hcv antibody
WO2009022236A2 (en) 2007-08-16 2009-02-19 Tripep Ab Immunogen platform
US20090214593A1 (en) 2007-08-16 2009-08-27 Tripep Ab Immunogen platform
FR2984328B1 (fr) 2011-12-20 2016-12-30 Bio-Rad Innovations Procede de detection d'une infection par le virus de l'hepatite c
WO2016069762A2 (en) * 2014-10-29 2016-05-06 Abbott Laboratories Subject anti-hcv antibody detection assays employing ns3 capture peptides
JP2018124277A (ja) * 2017-02-02 2018-08-09 三洋化成工業株式会社 粒子含有組成物、免疫測定用試薬、免疫測定方法及び粒子の保存方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US390599A (en) 1888-10-02 Tool for weaver s use
US456637A (en) 1891-07-28 Fence
US4255431A (en) 1978-04-14 1981-03-10 Aktiebolaget Hassle Gastric acid secretion inhibiting substituted 2-(2-benzimidazolyl)-pyridines, pharmaceutical preparations containing same, and method for inhibiting gastric acid secretion
US4751180A (en) 1985-03-28 1988-06-14 Chiron Corporation Expression using fused genes providing for protein product
EP0318216A1 (en) 1987-11-18 1989-05-31 Chiron Corporation NANBV diagnostics and vaccines
US4870008A (en) 1983-08-12 1989-09-26 Chiron Corporation Secretory expression in eukaryotes

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1341482C (en) † 1984-10-31 2005-05-10 Paul A. Luciw Process for preparing fragments of aids-associated retroviruses
JP2656995B2 (ja) † 1989-03-17 1997-09-24 カイロン コーポレイション Ｎａｎｂｖの診断用薬
LU87861A1 (fr) * 1989-12-18 1991-10-08 Wellcome Found Agent viral
AU638304B2 (en) † 1989-12-22 1993-06-24 Abbott Laboratories Hepatitis c assay

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US390599A (en) 1888-10-02 Tool for weaver s use
US456637A (en) 1891-07-28 Fence
US4255431A (en) 1978-04-14 1981-03-10 Aktiebolaget Hassle Gastric acid secretion inhibiting substituted 2-(2-benzimidazolyl)-pyridines, pharmaceutical preparations containing same, and method for inhibiting gastric acid secretion
US4870008A (en) 1983-08-12 1989-09-26 Chiron Corporation Secretory expression in eukaryotes
US4751180A (en) 1985-03-28 1988-06-14 Chiron Corporation Expression using fused genes providing for protein product
EP0318216A1 (en) 1987-11-18 1989-05-31 Chiron Corporation NANBV diagnostics and vaccines

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HOUGHTON M ET AL.: "Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome", SCIENCE, 1989, pages 359 - 362, XP000051654, DOI: doi:10.1126/science.2523562

Also Published As

Publication number Publication date
BR9106309A (pt) 1993-04-20
NO923839L (no) 1992-11-19
HU217025B (hu) 1999-11-29
DK0693687T3 (da) 1999-11-29
NO310241B1 (no) 2001-06-11
ES2134388T3 (es) 1999-10-01
ES2134388T5 (es) 2008-12-01
AU639560B2 (en) 1993-07-29
UA41266C2 (uk) 2001-09-17
MY107499A (en) 1995-12-30
KR100206150B1 (ko) 1999-07-01
DK0450931T3 (da) 1996-07-01
LTIP1747A (en) 1995-07-25
LV10344B (en) 1996-02-20
DK0693687T4 (da) 2008-09-22
DE69131488T2 (de) 1999-11-18
BG61291B1 (en) 1997-04-30
ES2088465T3 (es) 1996-08-16
PL172133B1 (pl) 1997-08-29
ATE139343T1 (de) 1996-06-15
IL170719A (en) 2011-04-28
DE69120138T2 (de) 1996-11-14
FI924349A (fi) 1992-09-28
FI924349A0 (fi) 1992-09-28
EP0450931B1 (en) 1996-06-12
IE911105A1 (en) 1991-10-09
EP0693687A1 (en) 1996-01-24
NO923839D0 (no) 1992-10-01
DE69120138D1 (de) 1996-07-18
DE69131488D1 (de) 1999-09-02
ATE182684T1 (de) 1999-08-15
GR3020964T3 (en) 1996-12-31
EP0693687B1 (en) 1999-07-28
RU2130969C1 (ru) 1999-05-27
IL97741A0 (en) 1992-06-21
RO109916B1 (ro) 1995-07-28
EP0693687B2 (en) 2008-06-04
EP0450931A1 (en) 1991-10-09
GR3031361T3 (en) 2000-01-31
AU7651091A (en) 1991-10-30
LV10344A (en) 1994-10-20
CY1881A (en) 1996-04-05
FI106317B (fi) 2001-01-15
GB2257784A (en) 1993-01-20
WO1991015771A1 (en) 1991-10-17
GB2257784B (en) 1995-01-04
HUT62706A (en) 1993-05-28
HU9203146D0 (en) 1992-12-28
GB9220480D0 (en) 1992-11-25
JPH05508219A (ja) 1993-11-18
JP2733138B2 (ja) 1998-03-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
LT3808B (en) Combinations of hepatitis c virus (hcv) antigens for use in immunoassays for anti-hcv antibodies
US6312889B1 (en) Combinations of hepatitis c virus (HCV) antigens for use in immunoassays for anti-HCV antibodies
US5683864A (en) Combinations of hepatitis C virus (HCV) antigens for use in immunoassays for anti-HCV antibodies
US6596476B1 (en) Hepatitis C assay
JP3188717B2 (ja) Ｃ型肝炎アッセイ
US7056658B2 (en) Multiple epitope fusion protein
EP0649537B1 (en) Immunoassays for anti-hcv antibodies using antigens with conformational epitopes
JP3354579B2 (ja) 組換え抗原を用いるｃ型肝炎アッセイ
EP0642666B1 (en) Hepatitis c assay
EP0744467A2 (en) Multiple antigenic peptide comprising at least two hepatitis C virus-associated peptides
AU639560C (en) Combinations of hepatitis C virus (HCV) antigens for use in immunoassays for anti-HCV antibodies
PT97247B (pt) Processo de preparacao de combinacoes de antigenios do virus da hepapite c (hcv) para uso em imunoensaios para anticorpos anti-hcv
WO1996041196A1 (en) Method for detection of antibody to hepatitis c virus second envelope glycoprotein

Legal Events

Date Code Title Description
PD9A Change of patent owner

Owner name: NOVARTIS VACCINES & DIAGNOSTICS, INC, US

Effective date: 20071228

MK9A Expiry of a patent

Effective date: 20131230