JP2003512826A

JP2003512826A - Ｈｃｖ特異的ｔ細胞の活性化

Info

Publication number: JP2003512826A
Application number: JP2001533809A
Authority: JP
Inventors: ハビエルパリアード，; マイケルヒュートン，; マークセルビー，
Original assignee: カイロンコーポレイション
Priority date: 1999-10-27
Filing date: 2000-10-27
Publication date: 2003-04-08
Also published as: EP1232267B1; WO2001030812A2; AU1236801A; CA2389206C; CA2389206A1; US20030170274A1; US20090098153A1; ES2411096T3; EP1232267A2; US20040057960A1; WO2001030812A3; US20040191767A1; US20090130762A1; US6562346B1; WO2001030812A9; US7285539B2

Abstract

(57)【要約】本発明は、ＣＤ４⁺Ｔ細胞およびＣＤ８⁺Ｔ細胞を含む、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）特異的Ｔ細胞を活性化する方法を提供する。ＨＣＶ特異的Ｔ細胞は、ＨＣＶのＮＳ３ポリペプチド、ＮＳ４ポリペプチド、ＮＳ５ａポリペプチド、およびＮＳ５ｂポリペプチドからなる融合タンパク質、このような融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、またはこれらの融合物の個々の成分を含むポリヌクレオチド組成物を使用して活性化される。この方法は、モデル系において使用して、ＨＣＶ特異的免疫原性組成物を開発し得、ならびにＨＣＶに対して哺乳動物を免疫し得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の技術分野）本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）特異的Ｔ細胞の活性化に関する。より
特定には、本発明は、ＨＣＶ特異的Ｔ細胞を活性化するように細胞性（ｃｅｌｌ
−ｍｅｄｉａｔｅ）免疫応答を刺激する、多様なＶＣＶポリペプチドの単独でか
または融合物としての使用に関する。

【０００２】（発明の背景）Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染は、このウイルスに感染した世界の人口の約
１％についての重要な健康の問題である。急性感染した個体の７５％を超える数
は、ついには肝炎、肝不全、および肝細胞癌を生じ得る慢性の保有者状態に進行
する。Ａｌｔｅｒら（１９９２）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２７：１８９９
−１９０５；ＲｅｓｎｉｃｋおよびＫｏｆｆ．（１９９３）Ａｒｃｈ．Ｉｎｔｅ
ｍ．Ｍｅｄ．１５３：１６７２−１６７７；Ｓｅｅｆｆ（１９９５）Ｇａｓｔｒ
ｏｎｔｅｓｔ．Ｄｉｓ．６：２０−２７；Ｔｏｎｇら（１９９５）Ｎ．Ｅｎｇｌ
．Ｊ．Ｍｅｄ．３３２：１４６３−１４６６を参照のこと。

【０００３】ＨＩＶのような特定のウイルスに対する製薬の発達における拡張性な進歩にも
かかわらず、急性ＨＣＶ感染および慢性ＨＣＶ感染の制御は、成功が限定されて
きた（ＨｏｏｆｎａｇｌｅおよびＢｉｓｃｅｇｌｉｅ（１９９７）Ｎ．Ｅｎｇｌ
．Ｊ．Ｍｅｄ．３３６：３４７−３５６）。特に、強力な細胞傷害性Ｔリンパ球
（ＣＴＬ）応答の生成は、ＨＣＶ感染の制御および撲滅に関して重要であると考
えられる。従って、ＨＣＶに対する強力なＣＴＬ応答を誘導する効果的な方法に
関して、当該分野において必要性がある。

【０００４】（発明の要旨）本発明の目的は、ＨＣＶポリペプチドを特異的に認識するＴ細胞を活性化する
ための試薬および方法を提供することである。本発明のこの目的および他の目的
は、以下に記載される実施形態の１つ以上によって提供される。

【０００５】本発明は、ＨＣＶ特異的Ｔ細胞を活性化するために有用なＨＣＶタンパク質を
提供する。１つの実施形態は、ＮＳ３ポリペプチド、ＮＳ４ポリペプチド、およ
びＮＳ５ａポリペプチドから実質的になる融合タンパク質を提供する。

【０００６】別の実施形態は、ＨＣＶのＮＳ３ポリペプチド、ＮＳ４ポリペプチド、ＮＳ５
ａポリペプチド、およびＮＳ５ｂポリペプチドから実質的になる融合タンパク質
を提供する。

【０００７】本発明のさらに別の実施形態は、ＨＣＶのＮＳ３ポリペプチド、ＮＳ４ポリペ
プチド、ＮＳ５ａポリペプチド，および必要に応じてＮＳ５ｂポリペプチドを含
む融合タンパク質を提供する。ＨＣＶポリペプチドの１つは、他のポリペプチド
とは異なる株由来である。

【０００８】本発明はまた、これらの融合タンパク質のいずれかおよび薬学的に受容可能な
キャリアを含む組成物を提供する。

【０００９】別の実施形態は、ＮＳ３ポリペプチド、ＮＳ４ポリペプチド、およびＮＳ５ａ
ポリペプチドから実質的になる組成物、または個々のタンパク質をコードするポ
リヌクレオチドから実質的になる組成物を提供する。

【００１０】別の実施形態は、ＨＣＶのＮＳ３ポリペプチド、ＮＳ４ポリペプチド、ＮＳ５
ａポリペプチド、およびＮＳ５ｂポリペプチドから実質的になる組成物、または
個々のタンパク質をコードするポリヌクレオチドから実質的になる組成物を提供
する。ＨＣＶポリペプチドの１つは、他のポリペプチドとは異なる株由来である
。

【００１１】本発明のさらなる別の実施形態は、ＨＣＶのＮＳ３ポリペプチド、ＮＳ４ポリ
ペプチド、ＮＳ５ａポリペプチド、および必要に応じてＮＳ５ｂポリペプチドか
ら実質的になる組成物、または個々のタンパク質をコードするポリヌクレオチド
から実質的になる組成物を提供する。ＨＣＶポリペプチドまたはＨＣＶポリヌク
レオチドの１つは、他のポリペプチドとは異なる株由来である。

【００１２】本発明のなおさらなる別の実施形態は、ＨＣＶのＮＳ３ポリペプチド、ＮＳ４
ポリペプチド、およびＮＳ５ａポリペプチドから実質的になる融合タンパク質を
コードする、単離および精製されたポリヌクレオチド、または、ＨＣＶのＮＳ３
ポリペプチド、ＮＳ４ポリペプチド、ＮＳ５ａポリペプチド，およびＮＳ５ｂポ
リペプチドから実質的になる融合タンパク質を提供する。

【００１３】本発明のなお別の実施形態は、ＨＣＶのＮＳ３ポリペプチド、ＮＳ４ポリペプ
チド、およびＮＳ５ａポリペプチド、またはＨＣＶのＮＳ３ポリペプチド、ＮＳ
４ポリペプチド、ＮＳ５ａポリペプチド，およびＮＳ５ｂポリペプチドのいずれ
かから実質的になる融合タンパク質をコードする、単離および精製されたポリヌ
クレオチドを含む組成物を提供する。この組成物はまた、薬学的に受容可能なキ
ャリアを含む。

【００１４】本発明の別の実施形態は、ＨＣＶのＮＳ３ポリペプチド、ＮＳ４ポリペプチド
、およびＮＳ５ａポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする、単離および
精製されたポリヌクレオチドを提供し、ここで、ＮＳ３ポリペプチド、ＮＳ４ポ
リペプチド、およびＮＳ５ａポリペプチドの１つは、他の２つのポリペプチドと
は異なる株のＨＣＶ由来である。本発明はまた、このポリヌクレオチドおよび薬
学的に受容可能なキャリアを含む組成物を提供する。

【００１５】本発明のなお別の実施形態は、ＨＣＶのＮＳ３ポリペプチド、ＮＳ４ポリペプ
チド、ＮＳ５ａポリペプチド、およびＮＳ５ｂポリペプチドを含む融合タンパク
質をコードする、単離および精製されたポリヌクレオチドを提供する。これらの
ポリペプチドの１つは、他のポリペプチドとは異なる株のＨＣＶ由来である。本
発明はまた、このポリヌクレオチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む組
成物を提供する。

【００１６】本発明のなお別の実施形態は、ＨＣＶポリペプチドのエピトープを認識する、
Ｔ細胞を活性化する方法を提供する。Ｔ細胞は、ＨＣＶのＮＳ３ポリペプチド、
ＮＳ４ポリペプチド、およびＮＳ５ａポリペプチドを含む融合タンパク質と接触
させられる。活性化Ｔ細胞の集団は、ＮＳ３ポリペプチド、ＮＳ４ポリペプチド
、またはＮＳ５ａポリペプチドのエピトープを認識する。あるいは、Ｔ細胞は、
ＨＣＶのＮＳ３ポリペプチド、ＮＳ４ポリペプチド、ＮＳ５ａポリペプチド、Ｈ
ＣＶのＮＳ５ｂポリペプチドを含む融合タンパク質と接触させられる。活性化Ｔ
細胞の集団は、ＮＳ３ポリペプチド、ＮＳ４ポリペプチド、ＮＳ５ａポリペプチ
ド、またはＮ５ｂポリペプチドのエピトープを認識する。

【００１７】従って、本発明は、ＨＣＶポリペプチドのエピトープを認識する、Ｔ細胞を活
性化するための方法および試薬を提供する。これらの方法および試薬は、強力な
ＣＴＬ応答に関するＨＣＶポリペプチドのエピトープを同定するため、およびヒ
トを含む哺乳動物をＨＣＶに対して免疫するために特に有用である。

【００１８】（発明の詳細な説明）本発明の実施は、他で示されない限り、化学、生化学、組換えＤＮＡ技術およ
び免疫学の、当業者に慣用的方法を使用する。このような技術は、文献に完全に
説明される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎ
ｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（第２版）；Ｍｅｔｈｏｄｓｉ
ｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＮ．Ｋａｐｌａｎ編、
ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；ＤＮＡｃｌｏｎｉｎｇ，第Ｉ巻
および第ＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｗｅｒ編）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編）；ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＨ
ｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編）
；ＡｎｉｍａｌＣｅｌｌＣｕｌｔｕｔｅ（Ｒ．Ｋ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編）；
Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．、ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＧｕｉｄｅｔｏＭｏｌｅｃ
ｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇを参照のこと。

【００１９】本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」
、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、他で明確に口述されない限り、複数の参照を
含む。従って、例えば、「抗原（ａｎａｎｔｉｇｅｎ）」は、２以上の抗原の
混合物などを含む。

【００２０】（１．定義）本発明を記載するに際して、以下の用語が使用され、そして以下に示されるよ
うに定義されることが意図される。

【００２１】用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーをい
い、そして産物の最小限の長さに限定されない。従って、ペプチド、オリゴペプ
チド、ダイマー、マルチマーなどは、この定義内に含まれる。全長タンパク質お
よびそのフラグメントの両方は、この定義内に含まれる。これらの用語はまた、
例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化などの、ポリペプチドの発現後修
飾を含む。さらに、本発明の目的について、「ポリペプチド」は、このタンパク
質が所望の活性を維持する限り、ネイティブな配列に対する改変（例えば、欠失
、付加および置換（天然には一般に保存的））を含むタンパク質をいう。これら
の改変は、部位特異的変異誘発を介するように計画的であり得るか、またはこれ
らのタンパク質を産生する宿主の変異もしくはＰＣＲ増幅に起因するエラーのよ
うに、偶然であり得る。

【００２２】ＨＣＶポリペプチドは、上記のように、ＨＣＶポリタンパク質に由来するポリ
ペプチドである。このポリペプチドは、物理的にＨＣＶに由来する必要はないが
、合成的かまたは組換え的に作製され得る。さらに、このポリペプチドは、種々
のＨＣＶ株のいずれか（例えば、ＨＣＶ１株、２株、３株、または４株）由来で
あり得る。多くの保存領域および可変領域が、これらの株の間で公知であり、そ
して一般的に、これらの領域由来のエピトープのアミノ酸配列は、高度の配列相
同性（例えば、２つの配列を整列した場合、３０％より高い、好ましくは４０％
より高いアミノ酸配列相同性）を有する。従って、例えば、用語「ＮＳ４」ポリ
ペプチドは、種々のＨＣＶ株のいずれか由来のネイティブなＮＳ４、ならびに、
以下にさらに定義されるようなＮＳ４アナログ、ムテインおよび免疫原性フラグ
メントをいう。

【００２３】用語「アナログ」および「ムテイン」は、所望の活性（例えば、以下に定義さ
れるような、細胞性免疫応答を刺激する能力）を保持する、参照分子の生物学的
に活性な誘導体、またはこのような誘導体のフラグメントをいう。一般に、用語
「アナログ」は、ネイティブなポリペプチド配列、ならびにネイティブな分子に
対して１つ以上のアミノ酸付加、置換（天然には一般に保存的）および／または
欠失を（これらの改変が免疫原性活性を破壊しない限り）有する構造を有する化
合物をいう。用語「ムテイン」は、例えば、国際公開番号ＷＯ９１／０４２８２
に記載されるような、１つ以上のペプチド模倣物（「ペプトイド」）を有するペ
プチドをいう。好ましくは、アナログおよびムテインは、少なくともネイティブ
な分子と同一の免疫活性を有する。ペプチドアナログおよびムテインを作製する
方法は、当該分野において公知であり、以下にさらに記載される。

【００２４】特に好ましいアナログとしては、天然に保存的である置換（すなわち、側差に
関するアミノ酸のファミリーで置き換えられる置換）が挙げられる。特に、アミ
ノ酸は、一般に４つのファミリーに分けられる：（１）酸性−アスパラギン酸お
よびグルタミン酸；（２）塩基性−リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非
極性−アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニ
ン、メチオニン、トリプトファン；ならびに（４）非荷電極性−グリシン、アス
パラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン。フェニル
アラニン、トリプトファン、およびチロシンは、時折芳香族アミノ酸として分類
される。例えば、孤立した置換（ロイシンとイソロイシンまたはバリン、アスパ
ラギン酸とグルタミン酸、スレオニンとセリン、または同様のアミノ酸と構造的
に関連したアミノ酸との保存的置換）が生物学的活性に主要な効果を有さないこ
とは、合理的に予想可能である。例えば、目的のポリペプチドは、分子の所望の
機能がインタクトであり続ける限りは、約５〜１０までの保存的もしくは非保存
的アミノ酸置換、またはなお約１５〜２５までの保存的もしくは非保存的アミノ
酸置換、または５と２５との間の任意の整数を含み得る。当業者は、当該分野に
おいて周知のＨｏｐｐ／ＷｏｏｄｓおよびＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅプロッ
トに対する参照による変化に耐性であり得る、目的の分子の領域を容易に決定し
得る。

【００２５】「フラグメント」によって、インタクトな全長ポリペプチド配列および構造の
一部のみからなるポリペプチドが意図される。フラグメントは、ネイティブなポ
リペプチドのＣ末端欠失および／またはＮ末端欠失を含み得る。特定のＨＣＶタ
ンパク質の「免疫原性フラグメント」は、一般に、問題のフラグメントが本明細
書中に記載されるアッセイによって測定されるような免疫原性活性を残存する限
り、エピトープを規定する全長分子の少なくとも約５〜１０の連続するアミノ酸
残基、好ましくは全長分子の少なくとも約１５〜２５の連続するアミノ酸残基、
そしてもっとも好ましくは全長分子の少なくとも約２０〜５０以上の連続するア
ミノ酸残基、または５アミノ酸と全長配列との間の任意の整数を含む。種々のＨ
ＣＶエピトープの記載について、例えば、Ｃｈｉｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：１００１１−１００１５；Ｃｈｉ
ｅｎら、Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔ．Ｈｅｐａｔｏｌ．（１９９３）８：Ｓ３３−
３９；Ｃｈｉｅｎら、国際公開番号ＷＯ９３／００３６５；Ｃｈｉｅｎ，Ｄ．Ｙ
．、国際公開番号ＷＯ９４／０１７７８；共有に係り、認可される米国特許出願
番号０８／４０３，５９０および０８／４４４，８１８を参照のこと。

【００２６】本明細書中で使用される場合、用語「エピトープ」は、少なくとも約３〜５、
好ましくは約５〜１０もしくは１５、そして約１０００未満のアミノ酸（または
これらの間の任意の整数）の配列をいい、配列それ自身またはより大きな配列の
一部として規定される配列は、このような配列に応答して惹起される抗体に結合
する。タンパク質配列のほぼ全長、またはＨＣＶポリタンパク質由来の２以上の
エピトープを含む融合タンパク質を含み得るフラグメントの長さを限定する臨界
的上限は存在しない。本発明における使用のためのエピトープは、由来する親タ
ンパク質の一部の正確な配列を有するポリペプチドに限定されない。さらに、ウ
イルスゲノムは、定常流動の状態にあり、そして単離物の間の比較的高程度の変
数を示すいくつかの可変ドメインを含む。従って、用語「エピトープ」は、ネイ
ティブな配列に同一な配列、ならびにネイティブな配列に対する改変体（例えば
、欠失、付加および置換（天然には、一般に保存的）に同一な配列を含む。

【００２７】エピトープを含む所定のポリペプチドの領域は、当該分野において周知の、多
くのエピトープマッピング技術を使用して同定され得る。例えば、Ｅｐｉｔｏｐ
ｅＭａｐｐｉｎｇＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏ
ｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，第６６巻（ＧｌｅｎｎＥ．Ｍｏｒｒｉｓ編
、１９９６）ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ
を参照のこと。例えば、直線的な（ｌｉｎｅａｒ）エピトープは、例えば、固相
上に同時に合成される多数のペプチドによって決定され得、これらのペプチドは
、タンパク質分子の一部に対応し、かつ抗体と反応するが、これらのペプチドは
、支持体になお付着される。このような技術は、当該分野において公知であり、
例えば、米国特許第４，７０８，８７１号；Ｇｅｙｓｅｎら、（１９８４）Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：３９９８−４００２；Ｇｅ
ｙｓｅｎら、（１９８６）Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：７０９−７１５
に記載される。同様に、構造的（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ）エピトープは
、例えば、Ｘ線結晶構造解析および２次元核磁気共鳴による、アミノ酸の空間的
コンフォーメーションを決定することによって容易に同定される。例えば、Ｅｐ
ｉｔｏｐｅＭａｐｐｉｎｇＰｒｏｔｏｃｏｌｓ（前出）を参照のこと。タン
パク質の抗原性領域はまた、例えば、ＯｘｆｏｒｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｒ
ｏｕｐより利用可能なＯｍｉｇａｖｅｒｓｉｏｎ１．０ソフトウェアプログ
ラムを使用して計算されるもののような標準的な抗原性プロットおよび疎水性プ
ロットを使用して同定され得る。このコンピュータープログラムは、抗原性プロ
ファイルを決定するためのＨｏｐｐ／Ｗｏｏｄｓ法（Ｈｏｐｐら、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８１）７８：３８２４−３８２８）、
および疎水性プロットのためのＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ技術（Ｋｙｔｅら
、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８２）１５７：１０５−１３２）を使用する。

【００２８】本明細書中で使用される場合、用語「構造的エピトープ」は、全長タンパク質
、または全長の天然のタンパク質内のエピトープをコードするアミノ酸配列に対
してネイティブである構造的特性を有するそのアナログもしくはムテインの一部
をいう。ネイティブな構造的特性は、グリコシル化および３次元構造を含むがこ
れらに限定されない。好ましくは、構造的エピトープは、組換え的に産生され、
そしてその所望の構造的特性を保存する条件下で（例えば、エピトープの変性な
しに）抽出可能な細胞において発現される。このような細胞は、細菌細胞、酵母
細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む。ＨＣＶポリタンパク質由来の組換
え構造的エピトープの発現および単離は、例えば、国際公開番号ＷＯ９６／０４
３０１、ＷＯ９４／０１７７８、ＷＯ９５／３３０５３、ＷＯ９２／０８７３４
に記載される。

【００２９】ＨＣＶ抗原に対する「免疫学的応答」（ポリペプチドおよびインビボで発現さ
れるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの両方を含む）または組成物は
、目的の組成物中に存在する分子に対する体液性免疫応答および／または細胞性
免疫応答の被験体における発達である。本発明の目的のために、「体液性免疫応
答」は、抗体分子によって媒介される免疫応答をいうが、「細胞性応答」は、Ｔ
リンパ球および／または他の白血球細胞によって媒介される免疫応答をいう。細
胞性免疫の１つの重要な局面は、細胞傷害性Ｔ細胞（「ＣＴＬ」）による抗原特
異性応答を含む。ＣＴＬは、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）によってコードさ
れかつ細胞の表面上に発現されるタンパク質に関連して存在するペプチド抗原に
対する特異性を有する。ＣＴＬは、細胞内微生物の細胞内破壊、またはこのよう
な微生物で感染した細胞の溶解の、誘導および促進を援助する。細胞性免疫の別
の局面は、ヘルパーＴ細胞による抗原特異的応答を含む。ヘルパーＴ細胞は、Ｍ
ＨＣ分子に関連するペプチド抗原をその表面上に提示する細胞に対する非特異的
エフェクター細胞の機能の刺激、およびこのエフェクター細胞の活性の凝集を援
助するように作用する。「細胞性免疫応答」はまた、サイトカイン、ケモカイン
ならびに活性化Ｔ細胞および／または他の白血球細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣ
Ｄ８＋Ｔ細胞由来の白血球を含む）によって産生された他のこのような分子の産
生をいう。

【００３０】細胞性免疫応答を誘発する組成物またはワクチンは、細胞表面上でのＭＨＣ分
子関連抗原の提示によって脊椎動物被験体を感受性にするように働き得る。細胞
性免疫応答は、表面上に抗原を提示する細胞そのものまたはその近辺に指向され
る。さらに、抗原特異的Ｔリンパ球は、免疫された宿主のさらなる防御を可能に
するように生成され得る。

【００３１】特定の抗原の細胞性免疫応答を刺激する能力は、数多くのアッセイ（例えば、
リンパ球増殖アッセイ（リンパ球活性化アッセイ）、ＣＴＬ細胞傷害性細胞アッ
セイ、または感受性被験体での抗原に対して特異的なＴリンパ球ついてのアッセ
イ）によって決定され得る。このようなアッセイは、当該分野において周知であ
る。例えば、Ｅｒｉｃｋｓｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３）１５１：
４１８９−４１９９；Ｄｏｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）２
４：２３６９−２３７６；および以下の例示を参照のこと。

【００３２】従って、本明細書中で使用される場合、免疫学的応答は、ＣＴＬの産生、およ
び／またはヘルパーＴ細胞の産生もしくは活性化を刺激するものであり得る。目
的の抗原はまた、抗体媒介性免疫応答を誘発し得る。従って、免疫学的応答は、
１以上の以下の効果を含み得る：Ｂ細胞による抗体の産生；ならびに／または目
的の組成物もしくはワクチンに存在する抗原に特異的な抑制性Ｔ細胞および／も
しくはγδＴ細胞の活性化。これらの応答は、感染を中和するように働き得るか
、および／あるいは抗体相補性、または免疫した宿主に対して防御を提供するか
もしくは症状を軽減する抗体依存的細胞の細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を媒介するよ
うに働き得る。このような応答は、当該分野において周知の標準的免疫アッセイ
および中和アッセイを使用して決定され得る。

【００３３】「コード配列」または選択されたポリヌクレオチドを「コードする」配列は、
適切な調節配列の制御下におかれる場合、インビトロまたはインビボで（ＤＮＡ
の場合）転写される核酸分子であり、（ｍＲＮＡの場合）ポリペプチドに翻訳さ
れる核酸分子である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端での開始コドン
および３’（カルボキシ）末端での翻訳終止コドンによって決定される。翻訳終
止配列は、コード配列の３’側に位置され得る。

【００３４】「核酸」分子または「ポリヌクレオチド」は、二本鎖および一本鎖の配列の両
方を含み得、そしてウイルスｍＲＮＡ、原核生物ｍＲＮＡまたは真核生物ｍＲＮ
Ａ由来のｃＤＮＡ、ウイルス（例えば、ＤＮＡウイルスおよびレトロウイルス）
または原核生物ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、ならびに特に合成ＤＮＡ配列を
いうが、これらに限定されない。この用語はまた、ＤＮＡおよびＲＮＡの公知の
塩基アナログのいずれかを含む配列を捕捉する。

【００３５】「作動可能に連結された（される）」は、エレメントの整列をいい、ここで、
このように記載された成分は、所望の機能を実施するように配置される。従って
、コード配列に作動可能に連結された所定のプロモーターは、好ましい転写因子
などが存在する場合に、その発現を指向するように機能する限り、このコード配
列の発現を効果的に行い得る。プロモーターは、その発現を指向するように機能
する限り、コード配列と連続する必要はない。従って、例えば、転写されたイン
トロンとして、介在する未翻訳な転写された配列はプロモーター配列とコード配
列との間に存在し得る。そしてプロモーター配列はなおコード配列に「作動可能
に連結された」と認識され得る。

【００３６】核酸分子を記載して本明細書中で使用される場合、「組換え体」は、ゲノム起
源、ｃＤＮＡ起源、ウイルス起源、半合成起源、または合成起源のポリヌクレオ
チドを意味し、これは、この起源または操作の観点で、天然での関連ポリヌクレ
オチドの全体または一部に関連しない。タンパク質またはポリペプチドに関して
使用される場合、用語「組換え体」は、組換えポリヌクレオチドの発現によって
産生されるポリペプチドを意味する。一般に、目的の遺伝子はクローニングされ
、次いで、以下にさらに記載されるように、形質転換された生物において発現さ
れる。宿主生物は、発現条件下で外来遺伝子を発現して、タンパク質を産生する
。

【００３７】「制御エレメント」は、連結されるコード配列の発現を目的とするポリヌクレ
オチド配列をいう。この用語は、プロモーター、転写終止配列、上流調節ドメイ
ン、ポリアデニル化シグナル、非翻訳領域（５’−ＵＴＲおよび３’−ＵＴＲを
含む）、そして適切な場合、リーダー配列およびエンハンサーを含み、これらは
、宿主細胞におけるコード配列の転写および翻訳について選択的に提供される。

【００３８】本明細書中で使用される場合、「プロモーター」は、宿主細胞においてＲＮＡ
ポリメラーゼに結合し得、そしてこれに作動可能に連結された下流（３‘方向）
のコード配列の転写を開始し得るＤＮＡ調節領域である。本発明の目的のために
、プロモーター配列は、バックグラウンドより高い検出可能なレベルでの目的の
遺伝子の転写を開始するために必要な最小限の数の塩基またはエレメントを含む
。プロモーター配列内には、転写開始部位、ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合
に応答性のタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）がある。真核生物プロ
モーターは、しばしば（しかし常にではなく）「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「Ｃ
ＡＴ」ボックスを含む。

【００３９】ＲＮＡポリメラーゼがプロモーター配列に結合しそしてコード配列がｍＲＮＡ
に転写され、次いで、このコード配列によってコードされるポリペプチドへ翻訳
される場合に、制御配列は、細胞においてコード配列の「転写を指向する」。

【００４０】「発現カセット」または「発現構築物」は、目的の配列（単数または複数）ま
たは遺伝子（単数または複数）の発現を行い得るアセンブリをいう。この発現カ
セットは、上記のように、目的の配列（単数または複数）または遺伝子（単数ま
たは複数）（の転写を行うよう）に作動可能に連結されるプロモーターのような
制御エレメントを含み、そしてしばしば同様にポリアデニル化配列を含む。本発
明の特定の実施形態内で、本明細書に記載の発現カセットは、プラスミド構築物
内に含まれ得る。発現カセットの成分に加えて、このプラスミド構築物はまた、
１つ以上の選択マーカー、このプラスミド構築物を一本鎖ＤＮＡとして存在させ
るシグナル（例えば、Ｍ１３複製起点）、少なくとも１つの複数クローニング部
位、および複製の「哺乳動物」起点（例えば、複製のＳＶ４０またはアデノウイ
ルス起点）を含み得る。

【００４１】本明細書で用いる「形質転換」は、挿入のために用いられる方法にかかわらず
：例えば、直接取込みによる形質転換、トランスフェクション、インフェクショ
ンなど、宿主細胞中への外来ポリヌクレオチドの挿入をいう。トランスフェクシ
ョンの詳細な方法については、さらに以下を参照のこと。外来ポリヌクレオチド
は、非組込みベクター（例えば、エピソーム）として維持され得か、あるいは宿
主ゲノム中に組込まれ得る。

【００４２】「宿主細胞」は、外来ＤＮＡ配列によって形質転換されたか、または形質転換
し得る細胞である。

【００４３】「単離された」は、ポリペプチドについていうとき、この分子が自然状態で見
出さる全体組織から分離および別個であるか、または同じタイプのその他の生物
学的高分子の実質的に不在下で存在することを意味する。ポリヌクレオチドにつ
いて用語「単離された」は、自然状態でそれと通常会合する複数の配列の全部ま
たは一部がない核酸分子であるか；または、それは自然状態で存在するが、それ
と会合する異種配列を有するような配列であるか；または染色体から解離した分
子である。

【００４４】本明細書で用いる用語「精製された」は、好ましくは、少なくとも７５重量％
、より好ましくは少なくとも約８５重量％、なおより好ましくは少なくとも約９
５重量％、そして最も好ましくは少なくとも約９８％の同じタイプの生物学的高
分子が存在することを意味する。

【００４５】「相同性」は、２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド部分の間の
同一性％をいう。２つのＤＮＡまたは２つのポリペプチド配列は、これら配列が
これら分子の規定された長さに亘って、少なくとも約５０％、好ましくは少なく
とも約７５％、より好ましくは少なくとも約８０％−８５％、好ましくは少なく
とも約９０％、そして最も好ましくは少なくとも約９５−９８％、またはそれよ
り多い配列同一性を示すとき、互いに「実質的に相同」である。本明細書で用い
るとき、実質的に相同はまた、特定のＤＮＡまたはポリペプチド配列に対し完全
同一性を示す配列をもいう。

【００４６】一般に、「同一性」は、２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列
のそれぞれ正確なヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸対応性
をいう。同一性％は、配列をアラインすること、２つのアラインされた配列間の
正確なマッチの数をカウントすること、より短い配列の長さで除すること、およ
び結果に１００を乗じることによる、２つの分子間の配列情報の直接比較によっ
て決定され得る。容易に利用可能なコンピュータープログラムを用いて、この分
析を補助し得る。このようなプログラムには、ＡＬＩＧＮ、Ｄａｙｈｏｆｆ、Ｍ
．Ｏ．ＡｌｔｌａｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅａｎｄＳｔ
ｒｕｃｔｕｒｅＭ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ編、５Ｓｕｐｐｌ．３：３５３−３
５８、ＮａｔｉｏｎａｌｂｉｏｍｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＦｏｕｎ
ｄａｔｉｏｎ、Ｗａｈｉｎｇｔｏｎ、ＤＣにあるＡＬＩＧＮ、Ｄａｙｈｏｆｆ、
Ｍ．Ｏ．があり、これは、ペプチド分析のためのＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍ
ａｎＡｄｖａｎｃｅＡｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２−４８９、１９８１の
局所相同性アルゴリズムを適合したものである。ヌクレオチド配列同一性を決定
するためのプログラムは、ＷｉｓｃｏｎｓｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅＡｎａｌｙ
ｓｉｓＰａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ８（ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔ
ｅｒＧｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩから入手可能）において、例えば、Ｂ
ＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＧＡＰプログラムを利用可能であり、これらも
また、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎアルゴリズムによる。これらのプログ
ラムは、製造業者によって推奨され、そして上記のＷｉｓｃｏｎｓｉｎＳｅｑ
ｕｅｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓＰａｃｋａｇｅ中に記載のデフォールトパラメ
ーターとともに容易に利用される。例えば、参照配列に対する特定のヌクレオチ
ド配列の同一性％は、デフォールトスコアリングテーブルおよび６つのヌクレオ
チド位置のギャップペナルティとともにＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの相
同性アルゴリズムを用いて決定され得る。

【００４７】本発明の文脈で同一性％を確立する別の方法は、Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ大学が著
作権をもつ、ＪｏｈｎＦ．ＣｏｌｌｉｎｓおよびＳｈａｎｅＳ．Ｓｔｒｕｒ
ｒｏｋにより開発され、そしてＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｍ
ｏｕｎｔａｉｎＶｉｅｗ、ＣＡ）により頒布されるプログラムのＭＰＳＲＣＨ
パッケージを用いることである。このパッケージスーツから、上記Ｓｍｉｔｈ−
Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムが採用され得、そこでは、デフォールトパラメー
ターがスコアリングテーブルのために用いられる（例えば、１２のギャップオー
プンペナルティ、１のギャップ伸長ペナルティ、および６のギャップ）。生成さ
れたデータから「マッチ」値は「配列同一性」を反映する。配列間の同一性％ま
たは類似性％を算出するためのその他の適切なプログラムは、一般に、当該分野
で公知であり、例えば、その他のアラインメントプログラムは、ブォールトパラ
メーターとともに用いられるＢＬＡＳＴである。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢ
ＬＡＳＴＰを以下のフォールトパラメーターを用いて用い得る：遺伝子コード＝
標準；フィルター＝なし；ストランド＝両方；カットオフ＝６０；予測＝１０；
マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；デスクリプション＝５０配列；＝ＨＩＧＨ
ＳＣＯＲＥによるソート；データベース＝非冗長、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋
ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋＣＤＳ翻訳＋Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔｅｉｎ
＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらプログラムの詳細は、以下のインターネッ
トアドレスに見出され得る：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｇｏｖ
／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ。

【００４８】あるいは、相同性は、相同的領域間で安定な二本鎖を形成する条件下のポリヌ
クレオチドのハイブリダイゼーション、次いで一本鎖特異的ヌクレアーゼ（単数
または複数）を用いた消化、および消化したフラグメントのサイズ測定により決
定され得る。実質的に相同性であるＤＮＡ配列は、その詳細な系について規定さ
れるようなストリンジェントな条件下のサザンハイブリダイゼーション実験で同
定され得る。適切なハイブリダイゼーション条件を規定することは当該技術分野
内にある。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前述；ＤＮＡクローニング、前述；Ｎ
ｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、前述。

【００４９】「核酸免疫化」は、抗原（単数または複数）のインビボ発現のための、宿主細
胞中への１つ以上の選択された抗原をコードする核酸分子の導入を意味する。こ
の核酸分子は、注射、吸入、経口、鼻内および粘膜投与などによるようにレシピ
エント被験体中に直接導入され得るか、または宿主から取り出された細胞中にエ
キソビボで導入され得る。後者の場合、形質転換された細胞は、被験体中に再導
入され、そこで、免疫応答が、核酸分子によってコードされる抗原に対して高ま
る。

【００５０】本明細書で用いるとき、「処置」は、（ｉ）伝統的ワクチンにおけるような感
染または再感染の予防、（ｉｉ）徴候を減少またはなくすこと、および（ｉｉｉ
）問題の病原体の実質的または完全除去のいずれかをいう。処置は、予防的（感
染前）または治療的（感染後）に行われ得る。

【００５１】「脊椎動物被験体」は、制限されないで、ヒトおよびチンパンジーおよびその
他のエイプおよびサルのような非ヒト霊長類を含むその他の霊長類；ウシ、ヒツ
ジ、ブタ、ヤギおよびウマのような家畜；イヌおよびネコのような家畜；マウス
、ラットおよびモルモットのようなげっ歯類を含む実験動物；ニワトリ、七面鳥
およびその他のキジ類のトリ、アヒル、ギースなどのような、家畜、野生および
狩猟鳥を含む、心臓亜門の任意のメンバーを意味する。この用語は、特定の年齢
を示さない。従って、成体および新生個体の両方が含まれることを意図する。本
明細書に記載の発明は、上記の脊椎動物種のいずれにおける使用にも意図される
。なぜなら、これら脊椎動物のすべての免疫系は同様に稼動するからである。

【００５２】（ＩＩ．発明を実施する様式）本発明を詳細に記載する前に、本発明が、特定の処方物またはプロセスパラメ
ーターに制限されず、それ故、勿論変わり得ることが理解されるべきである。本
明細書で用いられる用語が本発明の特定の実施形態を記載する目的のために過ぎ
ず、そして限定していることを意図していないこともまた理解されるべきである
。

【００５３】本明細書に記載の方法に類似または等価な多くの方法が本発明の実施で用いら
れ得るが、好適な材料および方法が本明細書に記載されている。

【００５４】ＨＣＶウイルスのＮＳ３、ＮＳ４、およびＮＳ５ａポリペプチドまたはＮＳ３
、ＮＳ４、ＮＳ５ａ、およびＮＳ５ｂポリペプチドを含む、融合タンパク質、こ
れら融合物の個々の成分の組合せ、およびこれらをコードするポリヌクレオチド
が，ＨＣＶ特異的Ｔ細胞（すなわち、これらポリペプチドのエピトープを認識す
るＴ細胞）を活性化するために用いられ得るということが本発明の発見である。
このような融合ポリペプチドおよびタンパク質、またはこれら融合物を構成する
個々のポリペプチドの組合せによるＨＣＶ特異的Ｔ細胞の活性化は、ＨＣＶワク
チン開発のため、特に応答に関連するＨＣＶポリペプチドエピトープを同定する
ためのインビトロおよびインビボ両方のモデル系を提供する。これら融合タンパ
ク質、または個々のタンパク質の組合せはまた、哺乳動物中でＨＣＶに対する免
疫応答、特に治療目的または予防目的のいずれかのためのＣＴＬ応答を生成する
ために用いられ得る。

【００５５】（ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａおよびＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａＮＳ５ｂ融合タンパク質
）ＨＣＶ株のゲノムは、ポリプロテインに転写される約９，０００〜１２，００
０ヌクレオチドの単一のオープンリーディングフレームを含む。ＨＣＶポリプロ
テインは切断されて、ＮＨ₂−コア−Ｅ１−Ｅ２−ｐ７−ＮＳ２−ＮＳ３−ＮＳ
４ａ−ＮＳ４ｂ−ＮＳ５ａ−ＮＳ５ｂ−ＣＯＯＨの順にある少なくとも１０の別
個の産物を生成する。本発明の融合タンパク質（ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａ融合タン
パク質、本明細書では「ＮＳ３４５ａ」ともいう）は、ＨＣＶＮＳ３、ＮＳ４
（ＮＳ４ａおよびＮＳ４ｂ）、およびＮＳ５ａポリペプチドを含むか、またはＨ
ＣＶＮＳ３、ＮＳ４（ＮＳ４ａおよびＮＳ４ｂ）、ＮＳ５ａ、およびＮＳ５ｂ
ポリペプチド（ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａＮＳ５ｂ融合タンパク質、本明細書では「
ＮＳ３４５ａｂ」ともいう）を含む。実施例中に記載のその他の融合物は、融合
体、ＨＣＶＮＳ３およびＮＳ４（ＮＳ４ａおよびＮＳ４ｂ、「ＮＳ３４」およ
び「ＮＳ３４ａｂ」ともいう）およびＨＣＶＮＳ３およびＮＳ４ａ（「ＮＳ３
４ａ」ともいう）を含む。

【００５６】ＨＣＶＮＳ３タンパク質は、プロテアーゼおよびヘリカーゼとして機能し、
そして（ＨＣＶ−１に対して番号付けされる）ポリプロテインのほぼアミノ酸１
０２７〜アミノ酸１６５７にある。Ｃｈｏｏら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：２４５１−２４５５を参照のこと。ＨＣＶ
ＮＳ４は、（ＨＣＶ−１に対して番号付けされる）ポリプロテインの、ほぼア
ミノ酸１６５８〜アミノ酸１９７２にあり、ＮＳ５ａは、ほぼアミノ酸１９７３
〜アミノ酸２４２０にあり、そしてＨＣＶＮＳ５ｂは、ほぼアミノ酸２４２１
〜アミノ酸３０１１にある（Ｃｈｏｏら、１９９１）。

【００５７】上記の種々の融合体中に存在するＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５ａ、およびＮＳ５ｂ
ポリペプチドは、ＮＳ３、ＮＳ４（ＮＳ４ａおよびＮＳ４ｂ）、ＮＳ５ａ、およ
びＮＳ５ｂポリペプチドの完全長ポリペプチドまたはその部分のいずれかであり
得る。融合タンパク質を構成するＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５ａ、およびＮＳ５ｂポ
リペプチドの部分は、少なくとも１つのエピトープを含み、これは、２１５２−
ＨＥＹＰＶＧＳＱＬ−２１６０（配列番号１）および２２２４−ＡＥＬＩＥＡＮ
ＬＬＷＲＱＥＭＧ−２２３８（配列番号２）のような、活性化Ｔ細胞上のＴ細胞
レセプターにより認識される。ＮＳ３、ＮＳ４（ＮＳ４ａおよびＮＳ４ｂ）、Ｎ
Ｓ５ａ、ＮＳ５ｂ、ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａ、およびＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａＮＳ５
ｂのエピトープは、いくつかの方法によって同定され得る。例えば、ＮＳ３、Ｎ
Ｓ４、ＮＳ５ａ、ＮＳ５ｂポリペプチドまたは上記の任意の組合せを含む融合タ
ンパク質は、例えば、これらポリペプチドまたはタンパク質に対するモノクロー
ナル抗体を用いる免疫アフィニティー精製によって単離され得る。次いで、単離
されたタンパク質配列は、精製タンパク質のタンパク質分解切断により、一緒に
なって完全長タンパク質配列に亘る一連の短ペプチドを調製することによってス
クリーニングされ得る。例えば、１００マーポリペプチドで開始することにより
、各ポリペプチドを、ＨＣＶ活性化Ｔ細胞上のＴ細胞レセプターによって認識さ
れるエピトープの存在について試験し得、次いで、次第により小さく、そして重
複するフラグメントを、同定された１００マーから目的のエピトープをマップす
るために試験し得る。

【００５８】ＨＣＶ活性化Ｔ細胞上のＴ細胞レセプターにより認識されるエピトープは、例
えば、⁵¹Ｃｒ放出アッセイ（実施例２を参照のこと）によるか、またはリンパ球
増殖アッセイ（実施例４を参照のこと）により同定され得る。⁵¹Ｃｒ放出アッセ
イにおいて、エピトープをコードするポリヌクレオチドを発現ベクター中にクロ
ーニングすること、およびこの発現ベクターを標的細胞中に形質転換することに
よって、目的のエピトープを提示する標的細胞が構築され得る。ＨＣＶ特異的Ｃ
Ｄ８⁺Ｔ細胞は、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５ａ、ＮＳ５ｂ、ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａ
、またはＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａＮＳ５ｂエピトープを提示する標的細胞を溶解し
、そしてこのようなエピトープを提示しない細胞を溶解しない。リンパ球増殖ア
ッセイにおいて、ＨＣＶ活性化ＣＤ４⁺Ｔ細胞は、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５ａ、
ＮＳ５ｂ、ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａ、またはＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａＮＳ５ｂエピト
ープペプチドとともに培養したとき増殖するが、ＨＣＶエピトープペプチドの非
存在下では増殖しない。

【００５９】ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５ａ、およびＮＳ５ｂポリペプチドは、融合タンパク質
において任意の順で存在し得る。所望であれば、１つ以上のこれらポリペプチド
の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０またはそれ以上が融合
タンパク質中に存在し得る。複数のＨＣＶウイルス株が存在し、そしてこれら株
の任意のＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５ａ、およびＮＳ５ｂポリペプチドが融合タンパ
ク質中に用いられ得る。

【００６０】ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５ａ、ＮＳ５ｂ遺伝子およびポリペプチドの核酸配列お
よびアミノ酸配列を含む、多くのＨＣＶ株および単離物の核酸配列およびアミノ
酸配列が決定されている。例えば、単離物ＨＣＶＪ１．１が、Ｋｕｂｏら（１
９８９）Ｊａｐａｎ．Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１７：１０３６７−１０
３７２；Ｔａｋｅｕｃｈｉら（１９９０）Ｇｅｎｅ９１：２８７−２９１；Ｔ
ａｋｅｕｃｈｉら（１９９０）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７１：３０２７−３０
３３；およびＴａｋｅｕｃｈｉら（１９９０）Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．
１８：４６２６に記載されている。２つの独立した単離物ＨＣＶ−ＪおよびＢＫ
の完全コード配列が、Ｋａｔｏら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：９５２４−９５２８およびＴａｋａｍｉｚａｗａら（１
９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：１１０５−１１１３にそれぞれ記載されている
。

【００６１】ＨＣＶ−１単離物を記載する刊行物は、Ｃｈｏｏら（１９９０）Ｂｒｉｔ．Ｍ
ｅｄ．Ｂｕｌｌ．４６：４２３−４４１；Ｃｈｏｏら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：２４５１−２４５５およびＨａｎら
（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：１７１１
−１７１５を含む。ＨＣＶ単離物ＨＣ−Ｊ１およびＨＣ−Ｊ４が、Ｏｋａｍａｏ
ｔら（１９９１）ＪａｐａｎＪ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．６０：１６７−１７７に記
載されている。ＨＣＶ単離物ＨＣＴ１８〜、ＨＣＴ２３、Ｔｈ、ＨＣＴ２７、Ｅ
Ｃ１およびＥＣ１０が、Ｗｅｉｎｅｒら（１９９１）Ｖｉｒｏｌ．１８０：８４
２−８４８に記載されている。ＨＣＶ単離物Ｐｔ−１、ＨＣＶ−Ｋ１およびＨＣ
Ｖ−Ｋ２が、Ｅｎｏｍｏｔｏら（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．
Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７０：１０２１−１０２５中に記載されている。ＨＣ
Ｖ単離物Ａ、Ｃ、Ｄ＆Ｅが、Ｔｓｕｋｉｙａｍａ−Ｋｏｈａｒａら（１９９１）
ＶｉｒｕｓＧｅｎｅｓ５：２４３−２５４に記載されている。

【００６２】融合タンパク質のＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５ａ、およびＮＳ５ｂ成分は、同じＨ
ＣＶ株もしくは単離物からか、または異なるＨＣＶ株もしくは単離物から得られ
得る。ＨＣＶポリペプチドを含む融合タンパク質は、例えば、ＮＳ３ポリペプチ
ドがＨＣＶの第１の株由来であり得、そしてＮＳ４、およびＮＳ５ａポリペプチ
ドがＨＣＶの第２の株由来であり得る。あるいは、ＮＳ４ポリペプチドがＨＣＶ
の第１の株由来であり得、そしてＮＳ３およびＮＳ５ａポリペプチドがＨＣＶの
第２の株由来であり得る。必要に応じて、ＮＳ５ａポリペプチドがＨＣＶの第１
の株由来であり得、そしてＮＳ３およびＮＳ４ポリペプチドがＨＣＶの第２の株
由来であり得る。各々が異なるＨＣＶ株由来である、ＮＳ３、ＮＳ４およびＮＳ
５ａポリペプチドもまた、ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａ融合タンパク質で用いられ得る
。同様に、ＮＳ５ｂを含む融合タンパク質では、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５ａ、お
よびＮＳ５ｂポリペプチドの少なくとも１つが、その他のポリペプチドとは異な
るＨＣＶ株に由来し得る。必要に応じて、各々が異なるＨＣＶ株由来であるＮＳ
３、ＮＳ４、ＮＳ５ａ、およびＮＳ５ｂポリペプチドもまた、ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ
５ａＮＳ５ｂ融合タンパク質で用いられ得る。

【００６３】ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａおよびＮＳ５ｂに加えて、融合タンパ
ク質は、ＨＣＶポリプロテイン由来のその他のポリペプチドを含み得る。例えば
、それは、ＨＣＶポリプロテインのコア領域由来のポリペプチドを含むことが所
望され得る。この領域は、ＨＣＶ−１に対して番号付けられた、ＨＣＶポリプロ
テインのアミノ酸位置１−１９１にある。完全長タンパク質または完全長タンパ
ク質のエピトープのいずれかを、主題の融合体中で用い得る。例えば、これらの
エピトープは、アミノ酸１０−５３、アミノ酸１０−４５、アミノ酸６７−８８
、アミノ酸１２０−１３０の間、または以下で同定されたコアエピトープのいず
れかに見出され得る。例えば、Ｈｏｕｇｈｔｏｎら、米国特許第５，３５０，６
７１号；Ｃｈｉｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９
９２）８９：１００１１−１００１５；Ｃｈｉｅｎら、Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔ
．Ｈｅｐａｔｏｌ．（１９９３）８：Ｓ３３−３９；Ｃｈｉｅｎら、国際公開番
号Ｎｏ．ＷＯ９３／００３６５；Ｃｈｉｅｎ，Ｄ．Ｙ．、国際公開番号ＷＯ９４
／０１７７８；およびともに所有される許可された米国特許出願第０８／４０３
，５９０号および０８／４４４，８１８号。

【００６４】好ましくは、上記に記載の融合タンパク質、およびこれらタンパク質の個々の
成分は組換えによって産生され得る。これらタンパク質をコードするポリヌクレ
オチドは、適切な発現系で発現され得る発現ベクター中に導入され得る。種々の
細菌、酵母、哺乳動物および昆虫発現系が当該分野で利用可能であり、そしてこ
のような発現系のいずれをも用い得る。必要に応じて、これらタンパク質をコー
ドするポリヌクレオチドは、無細胞翻訳系で翻訳され得る。このような方法は当
該分野で周知である。これらタンパク質はまた、固相タンパク質合成により構築
され得る。

【００６５】所望であれば、これら融合タンパク質、またはこれらタンパク質の個々の成分
はまた、アミノ酸リンカーまたはシグナル配列のようなその他のアミノ酸配列、
およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼおよびスタフィロコッカスプロテ
インＡのようなタンパク質精製で有用なリガンドを含み得る。

【００６６】（ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａおよびＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａＮＳ５ｂポリヌクレオチ
ド）ポリヌクレオチドは、完全ＨＣＶゲノムより少ないものを含み、そしてＲＮＡ
または一本鎖または二本鎖ＤＮＡであり得る。好ましくは、ポリヌクレオチドは
、タンパク質および脂質のような、その他の成分を含まずに単離される。ＮＳ３
ＮＳ４ＮＳ５ａポリヌクレオチドは、上記のＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａ融合タンパク
質をコードし、そしてそれ故、ＮＳ３、ＮＳ４、およびＮＳ５ａポリペプチドの
コード配列を含む。ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａＮＳ５ｂポリヌクレオチドは、上記の
ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａＮＳ５ｂ融合タンパク質をコードし、そしてそれ故、ＮＳ
３、ＮＳ４、ＮＳ５ａ、およびＮＳ５ｂポリペプチドのコード配列を含む。同様
に、ＮＳ３ＮＳ４およびＮＳ３ＮＳ４ａのようなその他の融合をコードするポリ
ヌクレオチドは、個々のＨＣＶポリペプチドの配列を含む。本発明のポリヌクレ
オチドはまた、リンカー、シグナル配列、またはグルタチオン−Ｓ−トランスフ
ェラーゼおよびスタフィロコッカスプロテインＡのようなタンパク質精製で有用
なリガンドをコードする配列のような、その他のヌクレオチド配列を含み得る。

【００６７】ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５ａおよび／またはＮＳ５ｂをコードするポリヌクレオ
チドは、例えば、ＨＣＶ感染個体の血漿、血清、または肝臓ホモゲネート中に存
在する核酸配列由来のゲノムライブラリーから単離され得るか、または、例えば
、自動合成器を用いて実験室中で合成され得る。ＰＣＲのような増幅方法を用い
て、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５ａ、またはＮＳ５ｂをコードするＨＣＶゲノムＤＮ
ＡまたはｃＤＮＡのいずれかからポリヌクレオチドを増幅し得る。

【００６８】ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５ａ、またはＮＳ５ｂポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチドは、天然に存在するこれらポリペプチドのコード配列を含み得るか、
または自然には存在しない人工配列であり得る。これらのポリヌクレオチドは、
標準的な分子生物学技法を用いて、融合タンパク質のコード配列を形成するため
に連結され得る。所望であれば、ポリヌクレオチドは、発現ベクター中にクロー
ン化され、そして、例えば、細菌、酵母、昆虫、または哺乳動物細胞中に形質転
換され得、その結果、本発明の融合タンパク質が細胞培養中で発現され得、そし
てそこから単離され得る。

【００６９】所望の融合構築物、またはこれら融合の個々の成分を含む個々の発現構築物を
含む本発明の発現構築物は、標準的な遺伝子送達プロトコールを用いて、核酸免
疫化のために用いることができ、ＨＣＶ特異的Ｔ細胞を活性化する。遺伝子送達
の方法は当該分野で公知である。例えば、米国特許第５，３９９，３４６号、第
５，５８０，８５９号、第５，５８９，４６６号を参照のこと。遺伝子は、脊椎
動物被験体に直接、または、それに代わって、被験体由来の細胞にエキソビボで
送達され、そしてこれら細胞は、被験体中に再移植され得る。例えば、構築物は
、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ、またはＣｏｌＥ１のようなプラスミド内に保
持されるプラスミドＤＮＡとして送達され得る。

【００７０】さらに、発現構築物は、細胞への送達の前にリポソーム中にパッケージされ得
る。一般に、脂質カプセル化は、核酸に安定に結合し得るか、またはそれを捕捉
し得るリポソームを用いて達成される。脂質調製物に対する濃縮ＤＮＡの比は変
動し得るが、ほぼ１：１程度（ｍｇＤＮＡ：マイクロモル脂質）であるか、また
は脂質がより多い。核酸の送達のためのキャリアとしてのリポソームの使用の総
説として、ＨｕｇおよびＳｌｅｉｇｈｔ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａ
ｃｔａ．（１９９１）１０９７：１−１７；Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒら、ｉｎ
ＭｅｔｈｏｄｓｏｆＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８３）、１０１巻、５１２
−５２７頁を参照のこと。

【００７１】本発明との使用のためのリポソーム調製物は、カチオン性（正に荷電）、アニ
オン性（負に荷電）および中性調製物を含み、カチオン性リポソームが特に好適
である。カチオン性リポソームは容易に調製可能である。例えば、Ｎ［１−２，
３−ジオレイル）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム（ＤＯＴＭ
Ａ）リポソームは、ＧＩＢＣＯＢＲＬ、ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ、ＮＹから
商標Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎの下で入手可能である。（Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８７）８４：７４１３−７４１
６もまた参照のこと）。その他の市販の脂質は、トランスフェクタス（ＤＤＡＢ
／ＤＯＰＥ）およびＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ）を含む。そ
の他のカチオン性リポソームは、当該分野で周知の技法を用いて容易に利用可能
な材料から調製され得る。例えば、Ｓｚｏｋａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７８）７５：４１９４−４１９８；ＤＯＴＡＰ（１，
２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン）リポ
ソームの合成の記載についてＰＣＴ公開番号ＷＯ９０／１１０９２を参照のこと
。種々のリポソーム−核酸複合体は、当該分野で周知の方法を用いて調製される
。例えば、Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒら、ｉｎＭＥＴＨＯＤＳＯＦＩＭＭＵ
ＮＯＬＯＧＹ（１９８３）、１０１巻、５１２−５２７頁；Ｓｚｏｋａら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７８）７５：４１９４−４１
９８；Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．
Ａｃｔａ（１９７５）３９４：４８３；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ（１９７９）
１７：７７）；ＤｅａｍｅｒおよびＢａｎｇｈａｍ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９７６）４４３：６２９；Ｏｓｔｒｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ
．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９７７）７６：８３６；Ｆｒａ
ｌｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７９）７６：
３３４８；ＥｎｏｃｈおよびＳｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７９）７６：１４５）；Ｆｒａｌｅｙら、Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８０）２５５：１０４３１；ＳｚｏｋａおよびＰａ
ｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
（１９７８）７５：１４５；およびＳｃｈａｅｆｅｒ−Ｒｉｄｄｅｒら、Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ（１９８２）２１５：１６６．ＤＮＡはまた、Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．（１９７５）３９４：４８３−４９１により記載されるも
のに類似の蝸牛殻状脂質組成物中で送達され得る。米国特許第４，６６３，１６
１号および第４，８７１，４８８号もまた参照のこと。

【００７２】多くのウイルスを基礎にした系が哺乳動物細胞中への遺伝子移入のために開発
されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達系のための便利なプラット
ホームを提供し、例えば、マウス肉腫ウイルス、マウス乳腺癌ウイルス、モロニ
ーマウス白血病ウイルス、およびラウス肉腫ウイルスがある。選択された遺伝子
は、当該分野で公知の技法を用いて、ベクター中に挿入され、そしてレトロウイ
ルス粒子中にパッケージされ得る。次いで、この組換えウイルスは、単離され、
そしてインビボまたはエキソビボのいずれかで被験体の細胞に送達され得る。多
くのレトロウイルス系が記載されている（米国特許第５，２１９，７４０号；Ｍ
ｉｌｌｅｒおよびＲｏｓｍａｎ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８９）７：
９８０−９９０；Ｍｉｌｌｅｒ、Ａ．Ｄ．、ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａ
ｐｙ（１９９０）１：５−１４：Ｓｃａｒｐａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９１
）１８０：８４９−８５２；Ｂｕｒｎｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ（１９９３）９０：８０３３−８０３７；およびＢｏｒｉｓ−Ｌａ
ｗｒｉｅおよびＴｅｍｉｎ、Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．
（１９９３）３：１０２−１０９）。簡単に述べれば、本発明のレトロウイルス
遺伝子送達ビヒクルは、例えば、Ｂ、Ｃ、およびＤ型レトロウイルス、およびＦ
ＩＶ、ＨＩＶ、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２およびＳＩＶのようなスプマウイルスお
よびレンチウイルスを含む広範な種類のレトロウイルスから容易に構築され得る
（ＲＮＡ腫瘍ウイルス、第２版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８５を参照のこと）。このようなレトロウイルスは、ア
メリカンタイプカルチャーコレクション（「ＡＴＣＣ」；１０８０１Ｕｎｉｖ
ｅｒｓｉｔｙＢｌｖｄ．、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ２０１１０−２２０９）の
ような寄託物またはコレクションから得られ得るか、または従来利用可能な技法
を用いて既知の供給源から単離され得る。

【００７３】２型および５型アデノウイルスベクターのような、多くのアデノウイルスベク
ターもまた記載されている。宿主ゲノム中に組み込まれるレトロウイルスのよう
にではなく、アデノウイルスは、染色体外に持続し、それ故、挿入変異誘発に関
連するリスクを最小にする（Ｈａｊ−ＡｈｍａｄおよびＧｒａｈａｍ、Ｊ．Ｖｉ
ｒｏｌ．（１９８６）５７：２６７−２７４；Ｂｅｔｔら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（
１９９３）６７：５９１１−５９２１；Ｍｉｔｔｅｒｅｄｅｒら、Ｈｕｍａｎ
ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ（１９９４）５：７１７−７２９；Ｓｅｔｈら、Ｊ．
Ｖｉｒｏｌ．（１９９４）６８：９３３−９４０；Ｂａｒｒら、ＧｅｎｅＴｈ
ｅｒａｐｙ（１９９４）１：５１−５８；Ｂｅｒｋｎｅｒ、Ｋ．Ｌ．ＢｉｏＴｅ
ｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８８）６：６１６−６２９；およびＲｉｃｈら、Ｈｕａ
ｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ（１９９３）４：４６１−４７６）。

【００７４】Ｍｉｃｈａｅｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９３）２６８：６８６６
−６８６９およびＷａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ（１９９２）８９：６０９９−６１０３に記載のアデノウイルスキメラベク
ターのような分子複合体ベクターもまた、遺伝子送達に用いられ得る。

【００７５】限定されずに、シンドビスおよびセムリキ森林ウイルス、ＶＥＥ由来のベクタ
ーのようなαウイルス属のメンバーもまた、目的の遺伝子を送達するためのウイ
ルスベクターとしての使用を見出す。現在の方法の実施のために有用なシンドビ
スウイルス由来のベクターの記載については、Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、Ｊ．Ｖｉｒ
ｏｌ．（１９９６）７０：５０８−５１９；および国際公開番号ＷＯ９５／０７
９９５およびＷＯ９６／１７０７２を参照のこと。

【００７６】用いられ得るその他のベクターは、制限されずにシミアンウイルス４０、サイ
トメガロウイルスを含む。サルモネラｓｓｐ、Ｙｅｒｓｉｎｉａｅｎｔｅｒｏ
ｃｏｌｉｔｉｃａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａｓｐｐ．、Ｖｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒ
ａｅ、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍＢＣＧ株、およびＬｉｓｔｅｒｉａｍｏ
ｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓのような細菌ベクターももた用いられ得る。ＭＣおよび
ＭＣ１のようなミニ染色体、細菌ファージ、コスミド（λファージｃｏｓ部位が
挿入されたプラスミド）およびレプリコン（細胞中でそれら自身の制御下で複製
し得る遺伝子エレメント）もまた用いられ得る。

【００７７】発現構築物はまた、粒子状キャリアにカプセル化されるか、それに吸着される
か、または会合される。このようなキャリアは、免疫系に複数コピーの選択され
た分子を提示し、そして局所リンパ節における分子の捕捉および保持を促進する
。これら粒子は、マクロファージによって貧食され得、そしてサイトカイン放出
により抗原提示を増大し得る。粒子状キャリアの例は、ポリメチルメタクリレー
トポリマー、およびＰＬＧとして知られるポリ（ラクチド）およびポリ（ラクチ
ド−コ−グリコリド）（例えば、Ｊｅｆｆｅｒｙら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（１
９９３）１０：３６２−３６８；およびＭｃＧｅｅら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｅｎｃａ
ｐ．（１９９６）を参照のこと）由来のものを含む。

【００７８】広範な種類のその他の方法を用いて、細胞に発現構築物を送達し得る。このよ
うな方法は、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウ
ム沈殿、ポリリジン−またはポリオルニチン−媒介トランスフェクション、また
はリン酸ストロンチウム、ベントナイトおよびカオリンを含むケイ酸アルミニウ
ム、酸化クロム、ケイ酸マグネシウム、タルクなどを含むその他の不溶性無機塩
を用いる沈殿を含む。その他の有用なトランスフェクション方法は、エレクトロ
ポレーション、ソノポレーション、プロトプラスト融合、リポソーム、ペプトイ
ド送達、またはマイクロインジェクションを含む。例えば、目的の細胞を形質転
換するための技法の論議についてはＳａｍｂｒｏｏｋら、前述；および遺伝子移
入に有用な送達系の総説についてはＦｅｌｇｎｅｒ、Ｐ．Ｌ．、Ａｄｖａｎｃｅ
ｄＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙＲｅｖｉｅｗｓ（１９９０）５：１６３−１
８７を参照のこと。エレクトロポレーションを用いてＤＮＡを送達する１つの特
に効果的な方法が国際公開番号ＷＯ／００４５８２３に記載されている。

【００７９】さらに、金およびタングステンのような粒子状キャリアを採用する弾道（ｂｉ
ｏｌｉｓｔｉｃ）送達系は、本発明の発現構築物を送達するために特に有用であ
る。これら粒子は、送達されるべき構築物でコートされ、そして一般に減圧雰囲
気下で「遺伝子銃」から放出される銃粉末を用いて高速度に加速される。このよ
うな技法およびそれに有用な装置の記載については、例えば、米国特許第４，９
４５，０５０号；第５，０３６，００６号；第５，１００，７９２号；第５，１
７９，０２２号；第５，３７１，０１５号；および第５，４７８，７４４号を参
照のこと。

【００８０】（融合タンパク質またはポリヌクレオチドを含む組成物）本発明はまた、上記融合タンパク質またはポリヌクレオドを含む組成物、これ
ら融合タンパク質またはポリヌクレオチドの個々の成分を含む組成物を提供する
。好ましくは、本発明の組成物は、薬学的に受容可能なキャリアを含む。このキ
ャリアは、それ自身が宿主に有害な抗体の産生を誘導すべきではない。薬学的に
受容可能なキャリアは当該分野で周知である。このようなキャリアは、制限され
ないで、大きな、ゆっくり代謝される、タンパク質；ラテックス官能化セファロ
ース、アガロース、セルロース、セルロースビーズなどのような多糖類；ポリ乳
酸；ポリグリコール酸；ポリグルタミン酸、ポリリジンなどのようなポリマーア
ミノ酸；アミノ酸コポリマー；および不活性化ウイルス粒子のような高分子を含
む。

【００８１】薬学的に受容可能な塩、例えば、塩化水素、臭化水素，リン酸塩、または硫酸
塩のような無機塩、および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、またベンゾエ
ートのような有機酸の塩もまた、本発明の組成物に用いられ得る。特に有用なタ
ンパク質基質は、血清アルブミン、キーホールリムペットヘモシアニン、免疫グ
ロブリン分子、チログロブリン、オバルブミン、破傷風トキソイド、および当業
者に周知のその他のタンパク質である。本発明の組成物はまた、水、生理食塩水
、グリセロール、デキストロース、エタノールなどを単独または組み合わせて、
および湿潤剤、乳化剤、またはｐＨ緩衝化剤のような物質のような、液体または
賦形剤を含み得る。リポソームもまた、本発明の組成物にキャリアとして用いら
れ得る。このようなリポソームは上記に記載されている。

【００８２】所望であれば、Ｂ７−１またはＢ７−２、またはＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、お
よびＩＬ−１２のようなサイトカインなどのリンパ球に対す免疫原提示を改善す
る同時刺激分子が本発明の組成物中に含まれる得る。必要に応じて、アジュバン
トもまた組成物中に含まれ得る。用いられ得るアジュバントは、制限されずに以
下を含む：（１）水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム
などのアルミニウム塩（ミョウバン）；（２）（ムラミルペプチド（以下を参照
のこと）または細菌壁成分のようなその他の特定の免疫刺激剤ありまたはなしの
）水中油型乳化処方物、例えば、（ａ）ＭＦ５９（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９０／１
４８３７）、５％スクァレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０、および０．５％Ｓｐａ
ｎ８５を含み（必要に応じて種々の量のＭＴＰ−ＰＥを含む）、Ｍｏｄｅｌ１１
０Ｙマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、Ｎｅｗｔｏｎ、Ｍ
Ａ）のようなマイクロフルイダイザーを用いてサブミクロン粒子に処方されてい
る、（ｂ）ＳＡＦ、１０％スクァレン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０、５％プルロニ
ック−ブロック化ポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰ（以下を参照のこと
）いずれもサブミクロンエマルジョンに微小流動化されているか、または大きな
粒子サイズエマルジョンを生成するためにボルテックスにかけられている、およ
び（ｃ）Ｒｉｂｉ^TMアジュバント系（ＲＡＳ）、（ＲｉｂｉＩｍｍｕｎｏｃｈ
ｅｍ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）２％スクァレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、お
よびモノホスホリリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、
および細胞壁スケルトン（ＣＷＳ）、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ^TM ）からなる群からの１つ以上の細菌壁成分を含む；（３）サポニンアジュバント
、例えば、Ｓｔｉｍｕｌｏｎ^TM（ＣａｍｂｒｉｄｇｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、
Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、ＭＡ）が用いられ得るか、またはそれから生成されるＩＳ
ＣＯＭ（免疫刺激性複合体）のような粒子；（４）完全フロインドアジュバント
（ＣＦＡ）および不完全フロインドアジュバンド（ＩＦＡ）；（５）インターロ
イキン類（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ
−７、ＩＬ−１２など）、インターフェロン類（例えば、γインターフェロン）
、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）な
どのようなサイトカイン類；（６）コレラトキシン（ＣＴ）、百日咳菌トキシン
（ＰＴ）、またはＥ．ｃｏｌｉ非耐熱性トキシン（ＬＴ）、特にＬＴ−Ｋ６３、
ＬＴ−Ｒ７２、ＣＴ−Ｓ１０９、ＰＴ−Ｋ９／Ｇ１２９のような細菌ＡＤＰリボ
シル化トキシンの弱毒化変異体；例えば、ＷＯ９３／１３３０２およびＷＯ９２
／１９２６５を参照のこと；（７）本発明の組成物の有効性を増大するために免
疫刺激剤として作用するその他の物質；および（８）同時係属中の米国特許第０
９／２８５，８５５号（１９９９年４月２日出願）および国際特許出願ＰＣＴ／
ＵＳ９９／１７３０８号（１９９９年７月２９日出願）に記載されるような、高
分子吸着させた微粒子（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ）。ミョウバンおよびＭＦ
５９が好適である。

【００８３】上記のように、ムラミルペプチドは、制限されないで、Ｎ−アセチル−ムラミ
ル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、−アセチル−ノ
ルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ１１６３７、ノル−Ｍ
ＤＰと称される）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニ
ル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−
ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ１９８３５Ａ、ＭＴＰ−
ＰＥと称される）など。

【００８４】（ＨＣＶ特異的抗体を産生する方法）ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａおよびＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａＮＳ５ｂ融合タンパク質の
ようなＨＣＶ融合タンパク質を用いて、ＨＣＶ特異的ポリクローナルおよびモノ
クローナル抗体を産生し得る。ＨＣＶ特異的ポリクローナルおよびモノクローナ
ル抗体はＨＣＶ抗原に特異的に結合する。

【００８５】ポリクローナル抗体は、この融合タンパク質を、マウス、ウサギ、ヤギ、また
はウマのような哺乳動物に投与することにより産生され得る。免疫化した動物か
らの血清を集め、そして抗体を、例えば、硫酸アンモニウムによる沈殿、次いで
クロマトグラフィー、好ましくはアフィニティークロマトグラフィーによるなど
によって血漿から精製する。ポリクローナル抗血清を生成およびプロセッシング
する技法は当該分野で公知である。

【００８６】融合タンパク質中に存在するＨＣＶ特異的エピトープに対して惹起されたモノ
クローナル抗体もまた容易に生成され得る。例えば、ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａおよ
びＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａＮＳ５ｂ融合タンパク質で免疫化されたマウスのような
哺乳動物からの正常Ｂ細胞を、例えば、ＨＡＴ感受性マウスミエローマ細胞と融
合し、ハイブリドーマを生成し得る。ＨＣＶ特異的抗体を産生するハイブリドー
マは、ＲＩＡおよびＥＬＩＳＡを用いて同定し得、そして半固形寒天中のクロー
ニングによるか、または制限希釈により単離され得る。ＨＣＶ特異的抗体を産生
するクローンは、別のラウンドのスクリーニングにより単離される。

【００８７】ＨＣＶエピトープに対して惹起された、モノクローナルおよびポリクローナル
いずれかの抗体は、ＨＣＶ感染ヒトからの血清試料のような試料中のＨＣＶまた
はＨＣＶ抗原の存在を検出するために特に有用である。ＨＣＶ抗原に対する免疫
アッセイは、１つの抗体またはいくつかの抗体を利用し得る。ＨＣＶ抗原に対す
る免疫アッセイは、例えば、１つのＨＣＶエピトープに対して惹起されたモノク
ローナル抗体、１つのＨＣＶポリペプチドの複数エピトープに対して惹起された
複数モノクローナル抗体の組み合わせ、異なるＨＣＶポリペプチドのエピトープ
に対して惹起された複数モノクローナル抗体、同じＨＣＶ抗原に対して惹起され
たポリクローナル抗体、異なるＨＣＶ抗原に対して惹起されたポリクローナル抗
体、またはモノクローナル抗体とポリクローナル抗体の組み合わせを用い得る。
免疫アッセイプロトコールは、例えば標識された抗体を用いる、競争、直接反応
、またはサンドイッチ型アッセイなどを基礎にし得る。標識は、例えば、蛍光、
化学発光、または放射活性であり得る。

【００８８】ポリクローナルまたはモノクローナル抗体はさらに、免疫アフィニティーカラ
ムによってＨＣＶ粒子または抗原を単離するために用いられ得る。これら抗体は
、例えば、吸着によるか、または共有結合により固体支持体に固定され得、その
結果、これら抗体は、それらの免疫選択性活性を保持する。必要に応じて、スペ
ーサー基が含められてもよく、その結果、抗体の抗原結合部位を接近可能にして
いる。次いで、固定化抗体を用い、血液または血漿のような生物学的試料からの
ＨＣＶ粒子または抗原を結合し得る。結合したＨＣＶ粒子または抗原は、例えば
、ｐＨの変化によりカラムマトリックスから回収される。

【００８９】（ＨＣＶ特異的Ｔ細胞）インビボまたはインビトロで発現された、ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａ融合タンパク
質またはＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａＮＳ５ｂ融合タンパク質を含む上記の融合体、ま
たはこれら融合体の個々の成分の組み合わせにより活性化されるＨＣＶ特異的Ｔ
細胞は、好ましくは、ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａ融合タンパク質またはＮＳ３ＮＳ４
ＮＳ５ａＮＳ５ｂ融合タンパク質のエピトープを含むＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５ａ
、ＮＳ５ｂポリペプチドのようなＨＣＶポリペプチドのエピトープを認識する。
ＨＣＶ特異的Ｔ細胞は、ＣＤ８⁺またはＣＤ４⁺であり得る。

【００９０】ＨＣＶ特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞は、好ましくは、ＭＨＣクラスＩ分子と複合体化
したＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５ａ、ＮＳ５ｂエピトープを提示するＨＣＶ感染細胞
を殺傷し得る、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）である。ＨＣＶ特異的ＣＤ８⁺
Ｔ細胞はまた、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）を発現し得る。ＨＣＶ特異的Ｃ
Ｄ８⁺Ｔ細胞は、例えば、⁵¹Ｃｒ放出アッセイ（実施例２を参照のこと）により
検出され得る。⁵¹Ｃｒ放出アッセイは、ＨＣＶ特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞の、ＮＳ３
、ＮＳ４、ＮＳ５ａ、ＮＳ５ｂ、ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａ、またはＮＳ３ＮＳ４Ｎ
Ｓ５ａＮＳ５ｂエピトープを提示する標的細胞を溶解する能力を測定する。ＩＦ
Ｎγを発現するＨＣＶ特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞はまた、好ましくは、ＮＳ３、ＮＳ
４、ＮＳ５ａ、ＮＳ５ｂポリペプチドを用いたインビトロ刺激後のＩＦＮγに対
する細胞内染色（実施例３を参照のこと）により検出され得る。

【００９１】インビボまたはインビトロで発現された、ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａ融合タンパク
質またはＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａＮＳ５ｂ融合タンパク質のような上記の融合体、
およびこれらタンパク質の個々の成分の組み合わせにより活性化されるＨＣＶ特
異的ＣＤ４⁺細胞は、好ましくは、ＨＣＶ感染細胞上のＭＨＣクラスＩＩ分子に
結合している、ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａ融合タンパク質またはＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５
ａＮＳ５ｂ融合タンパク質のエピトープを含むＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５ａ、ＮＳ
５ｂポリペプチドのエピトープを認識し、そして刺激性ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａま
たはＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａＮＳ５ｂペプチドに応答して増殖する。

【００９２】ＨＣＶ特異的ＣＤ４⁺細胞は、リンパ球増殖アッセイ（実施例４を参照のこと
）により検出され得る。リンパ球増殖アッセイは、ＨＣＶ特異的ＣＤ４⁺細胞の
、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５ａ、またはＮＳ５ｂエピトープに応答して増殖する能
力を測定する。

【００９３】（ＨＣＶ特異的Ｔ細胞を活性化する方法）ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａ融合タンパク質もしくはポリヌクレオチド、およびＮＳ
３ＮＳ４ＮＳ５ａＮＳ５ｂ融合タンパク質もしくはポリヌクレオチド、またはこ
れらタンパク質およびポリヌクレオチドの個々の成分の組み合わせを用いて、イ
ンビトロまたはインビボいずれかでＨＣＶ特異的Ｔ細胞を活性化し得る。ＨＣＶ
特異的Ｔ細胞の活性化は、それ自身、ＨＣＶに対するＣＴＬ応答を最適化するた
めのモデル系を提供し、そして、ＨＣＶ感染に対する予防処置または治療処置を
提供する。インビトロ活性化には、好ましくは、タンパク質は、上記のようなア
デノウイルスベクターのようなプラスミドまたはウイルスベクターによりＴ細胞
に提供される。

【００９４】Ｔ細胞のポリクローナル集団は、ＨＣＶで感染された哺乳動物の、血液由来、
および好ましくは、リンパ節、脾臓、または胸腺のような末梢リンパ器官由来で
あり得る。好適な哺乳動物は、マウス、チンパンジー、ヒヒ、およびヒトを含む
。ＨＣＶは、哺乳動物において活性化されたＨＣＶ特異的Ｔ細胞の数を増加する
ことに供される。次いで、この哺乳動物由来のＨＣＶ特異的Ｔ細胞は、ＮＳ３Ｎ
Ｓ４ＮＳ５ａまたはＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａＮＳ５ｂエピトープペプチドをこのＴ
細胞に添加することによってインビトロで再刺激され得る。次いで、ＨＣＶ特異
的Ｔ細胞は、それ自身、インビトロで、増殖、ＩＦＮγの産生、およびＮＳ３Ｎ
Ｓ４ＮＳ５ａまたはＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａＮＳ５ｂエピトープを提示する標的細
胞を溶解するその能力について試験され得る。

【００９５】リンパ球増殖アッセイ（実施例４を参照のこと）において、ＨＣＶ活性化ＣＤ
４⁺Ｔ細胞は、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５ａ、ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａ、またはＮＳ
３ＮＳ４ＮＳ５ａＮＳ５ｂエピトープペプチドとともに培養されるとき増殖する
が、エピトープペプチドの不在下では増殖しない。従って、ＨＣＶ特異的ＣＤ４ ^- Ｔ細胞により認識される特定のＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５ａ、ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ
５ａ、またはＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａＮＳ５ｂエピトープペプチドは、リンパ球増
殖アッセイを用いて同定され得る。

【００９６】同様に、上記の融合タンパク質、またはこれらタンパク質の個々の成分を用い
たインビトロ刺激後のＨＣＶ特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞におけるＩＦＮγの検出は、
ＩＦＮγを産生するためにＣＤ８⁺Ｔ細胞を刺激する際に特に有効であるＮＳ３
、ＮＳ４、ＮＳ５ａ、ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａ、およびＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａＮＳ
５ｂエピトープを同定するために用いられ得る（実施例３を参照のこと）。

【００９７】さらに、⁵¹Ｃｒ放出アッセイは、ＨＣＶに対するＣＴＬ応答のレベルを決定す
るために有用である。Ｃｏｏｐｅｒら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ１０：４３９−４４
９を参照のこと。例えば、ＨＣＶ特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞は、ＨＣＶ感染哺乳動物
の肝臓由来であり得る。これらＴ細胞は、例えば、ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａＮＳ
３ＮＳ４ＮＳ５ａＮＳ５ｂエピトープを提示する標的細胞に対する⁵¹Ｃｒ放出ア
ッセイで試験され得る。異なるＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａＮ
Ｓ５ｂエピトープを発現するいくつかの標的細胞集団を構築し得、その結果、各
標的細胞集団は、ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａまたはＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａＮＳ５ｂの
異なるエピトープを提示する。ＨＣＶ特異的ＣＤ８⁺細胞は、これら標的細胞集
団の各々に対してアッセイされ得る。⁵¹Ｃｒ放出アッセイの結果を用いて、ＮＳ
３ＮＳ４ＮＳ５ａまたはＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａＮＳ５ｂのいずれが、ＨＣＶに対
して最も強いＣＴＬ応答に関連するかを決定し得る。最も強いＣＴＬ応答に関係
するエピトープを含むＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａ融合タンパク質またはＮＳ３ＮＳ４
ＮＳ５ａＮＳ５ｂ融合タンパク質は、次いで、この⁵¹Ｃｒアッセイ由来の情報を
用いて構築され得る。

【００９８】ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａ融合タンパク質もしくはＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａＮＳ５ｂ
融合タンパク質またはこのような融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド
、およびこれら融合タンパク質もしくはポリヌクレオチドの個々の成分は、マウ
ス、ヒヒ、チンパンジー、またはヒトのような哺乳動物に投与され、インビボで
ＨＣＶ特異的Ｔ細胞を活性化し得る。投与は、当該分野で公知の任意の手段によ
ってであり得、これには、非経口、鼻内、筋肉内または皮下注入を含み、上記の
ような生物学的弾道銃（「遺伝子銃」）を用いることを含む。

【００９９】好ましくは、ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａまたはＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａＮＳ５ｂポリ
ヌクレオチド、またはこの融合ポリヌクレオチドの個々の成分の組み合わせを含
む組成物の注入が、Ｔ細胞を活性化するために用いられる。構築および改変の単
純さの実践的利点に加えて、ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａまたはＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａ
ＮＳ５ｂポリヌクレオチドは、それぞれ、宿主におけるＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａ融
合タンパク質またはＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａＮＳ５ｂ融合タンパク質の合成を生じ
る。同様に、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５ａをコードする個々のポリヌクレオチドか
ら本質的になる組成物またはＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５ａおよびＮＳ５ｂをコード
する個々のポリヌクレオチドから本質的になる組成物中のような、これらポリヌ
クレオチドの個々の成分の投与は、宿主における個々のタンパク質の発現を生じ
る。従って、これらの免疫原は、宿主の免疫系に、ネイティブな翻訳後改変、構
造、およびコンホメーションで提示される。好ましくは、これらポリヌクレオチ
ドは、ヒトのような大きな哺乳動物に、０．５、０．７５、１．０、１．５、２
．０、２．５、５または１０ｍｇ／ｋｇの用量で筋肉内に注入される。

【０１００】ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａ融合タンパク質もしくはポリヌクレオチド、ＮＳ３ＮＳ
４ＮＳ５ａＮＳ５ｂ融合タンパク質もしくはポリヌクレオチド、これら融合体の
組合わせ、またはそれらの個々の成分の組合わせを含む本発明の組成物は、用い
られる特定の組成物と適合する様式で、かつ、それ自身⁵¹Ｃｒ放出アッセイ、リ
ンパ球増殖アッセイによるか、またはＩＦＮγの細胞内染色によって測定される
とき、ＨＣＶ特異的Ｔ細胞を活性化するに有効である量で投与される。これらタ
ンパク質および／またはポリヌクレオチドは、ＨＣＶに感染していない哺乳動物
に投与され得るか、またはＨＣＶ感染哺乳動物に投与され得る。組成物中のこれ
らポリヌクレオチドまたは融合タンパク質の特定の用量は、限定されないで、こ
の組成物が投与される哺乳動物の種、年齢、および一般状態、およびこの組成物
の投与の様式を含む多くの因子に依存する。本発明の組成物の有効量は、慣用的
な実験だけを用いて容易に決定され得る。上記のインビトロおよびインビボモデ
ルを採用して適切な用量を同定し得る。以下に記載の実施例で用いられるＮＳ３
ＮＳ４ＮＳ５ａポリヌクレオチドの量は、インビボまたはインビトロのいずれか
でＨＣＶ特異的Ｔ細胞の活性化を最適化するために用いられ得る一般的指針を提
供する。一般に、ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａ融合タンパク質もしくはＮＳ３ＮＳ４Ｎ
Ｓ５ａＮＳ５ｂ融合タンパク質またはポリヌクレオチド、または個々の成分の各
々の０．５、０．７５、１．０、１．５、２．０、２．５、５または１０ｍｇが
、ヒヒ、チンパンジー、またはヒトのような大型哺乳動物に投与される。所望で
あれば、同時刺激性分子またはアジュバントもまた、これら組成物の前、後また
は同時に提供され得る。

【０１０１】ＨＣＶ特異的Ｔ細胞の活性化を含む、本発明の組成物の送達により生成される
哺乳動物の免疫応答は、投与の用量、経路、またはブースト養生法を変えること
により増大され得る。本発明の組成物は、単回用量スケジュールであるか、また
は好ましくは複数回用量スケジュールで投与され、そこでは、ワクチン接種の主
要な経過は、１−１０の別の用量、次に免疫応答を維持および／または再増強す
るために必要な連続する時間間隔で与えられるその他の用量（例えば、第２番目
の用量として１−４月）、そして必要であれば、数ヶ月後の次の用量（単回また
は複数回）である。

【０１０２】（ＩＩＩ．実験）以下は、本発明を実施するための特定の実施形態の例である。この実施例は、
例示目的でのみ提供され、本発明の範囲をいかようにも限定することを意図され
ない。当業者は、本発明が、本開示の教示を考慮して種々の様式で実施され得る
ことを容易に認識する。

【０１０３】使用される数（例えば、量、温度など）に関して正確性を確実にするよう、努
力を試みたが、いくつかの実験の誤差および偏差が、もちろん許容されるべきで
ある。

【０１０４】（実施例１）（ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａポリヌクレオチドの産生）ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａ（ＨＣＶ−１に対して番号付けた、およそアミノ酸１０
２７〜２３９９）（本明細書中で、「ＮＳ３４５ａ」とも呼ばれる）またはＮＳ
５ａ（ＨＣＶ−１に対して番号付けた、およそアミノ酸１９７３〜２３９９）を
コードするポリヌクレオチドを、ＨＣＶから単離した。メチオニン残基をコード
するポリヌクレオチドを、これらのポリヌクレオチドの５’末端に連結し、この
ポリヌクレオチドを、プラスミドベクター、ワクシニアウイルスベクターおよび
アデノウイルスベクターにクローニングした。

【０１０５】免疫プロトコル。１つの免疫プロトコルにおいて、マウスを、ＮＳ５ａをコー
ドするかまたはＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａ融合タンパク質をコードする、いずれかの
５０μｇのプラスミドＤＮＡで、前脛骨筋（ｔｉｂｉａｌｉｓａｎｔｅｒｉｏ
ｒ）への筋内注射によって免疫した。１０⁷ｐｆｕのワクシニアウイルス（ＶＶ
）−ＮＳ５ａ（腹腔内）または５０μｇのプラスミドコントロール（筋内）のブ
ースター注射を、６週後に提供した。

【０１０６】別の免疫プロトコルにおいて、マウスに、ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａ融合タンパク
質をコードする１０¹⁰のアデノウイルス粒子を、前脛骨筋に筋内注射した。１０ ⁷ ｐｆｕのＶＶ−ＮＳ５ａの腹腔内ブースター注射またはＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａ
をコードする１０¹⁰のアデノウイルス粒子の筋内ブースター注射を、６週後に提
供した。

【０１０７】（実施例２）（ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａ融合タンパク質をコードするＤＮＡでの免疫はＨＣＶ
特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞を活性化する） ⁵¹Ｃｒ放出アッセイ。⁵¹Ｃｒ放出アッセイを使用して、ＨＣＶ特異的Ｔ細胞が
ＮＳ５ａエピトープを提示する標的細胞を溶解する能力を測定した。脾臓細胞を
、これらの免疫した動物からプールした。これらの細胞を、ＩＬ−２の存在下で
、ＨＣＶ−ＮＳ５ａ由来のＣＴＬエピトープペプチドｐ２１４Ｋ９（２１５２−
ＨＥＹＰＶＧＳＱＬ−２１６０；配列番号１）で、６日間インビトロで再刺激し
た。次いで、これらの脾臓細胞を、Ｗｅｉｓｓ（１９８０）ＪＢｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２５５：９９１２−９９１７に記載のように、クラスＩＭＨＣ分子を発
現するがクラスＩＩＭＨＣ分子を発現しないペプチド感作化標的細胞（Ｌ９２
９）に対する標準的な⁵¹Ｃｒ放出アッセイにおいて、細胞傷害性をアッセイした
。６０：１、２０：１および７：１の比のエフェクター（Ｔ細胞）：標的（Ｂ細
胞）を試験した。特異的溶解パーセントを、各エフェクター：標的比について計
算した。

【０１０８】これらのアッセイの結果を、表１および表２に示す。表１は、ＮＳ３ＮＳ４Ｎ
Ｓ５ａ融合タンパク質をコードするプラスミドＤＮＡでの免疫が、ＮＳ５ａエピ
トープを提示する標的細胞を認識および溶解する、ＣＤ８⁺Ｔ細胞を活性化する
ことを実証する。驚くことに、ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａ融合タンパク質のＮＳ５ａ
ポリペプチドは、このＮＳ５ａポリペプチドが融合タンパク質中に存在したとし
ても、Ｔ細胞を活性化し得た。

【０１０９】同様に、表２は、アデノウイルスベクターによるマウスへのＮＳ３ＮＳ４ＮＳ
５ａ融合タンパク質の送達もまた、ＨＣＶＮＳ５ａエピトープを提示する標的
細胞を認識および溶解する、ＣＤ８⁺Ｔ細胞を活性化することを実証する。従っ
て、ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａ融合タンパク質をコードする「裸の」（プラスミド）
ＤＮＡまたはアデノウイルスベクターにコードされた融合タンパク質のいずれか
での免疫を使用して、ＨＣＶ特異的Ｔ細胞を活性化し得る。

【０１１０】（実施例３）（ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａ融合タンパク質をコードするＤＮＡでの免疫はＩＦＮ
−γを発現するＨＣＶ特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞を活性化する）インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）についての細胞内染色。ＩＦＮ−γにつ
いての細胞内染色を使用して、ＮＳ５ａエピトープｐ２１４Ｋ９でのインビトロ
刺激後にＩＦＮ−γを分泌するＣＤ８⁺Ｔ細胞を同定した。個々の免疫したマウ
スの脾臓細胞を、ＩＬ−２およびモネシンの存在下で６〜１２時間、ｐ２１４Ｋ
９または非特異的ペプチドのいずれかで、インビトロで再刺激した。次いで、細
胞を、表面ＣＤ８および細胞内ＩＦＮ−γについて染色し、フローサイトメトリ
ーによって分析した。次いで、ＩＦＮ−γについてもまた陽性であったＣＤ８⁺
Ｔ細胞のパーセントを計算した。これらのアッセイの結果を、表１および２に示
す。表１は、ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａ融合タンパク質をコードするプラスミドＤＮ
Ａでの免疫に応答して活性化されたＣＤ８⁺Ｔ細胞がまた、ＩＦＮ−γを発現す
ることを実証する。アデノウイルス中にコードされたＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａ融合
タンパク質での免疫もまた、プラスミドにコードされたＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａ融
合タンパク質での免疫より少ない程度であるが、ＩＦＮ−γを発現するＣＤ８⁺
ＨＣＶ特異的Ｔ細胞を生じる（表２）。

【０１１１】

【表１】

【０１１２】

【表２】（実施例４）（ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａ融合タンパク質をコードするＤＮＡでの免疫はＨＣＶ
特異的ＣＤ４⁺Ｔ細胞の増殖を刺激する）リンパ球増殖アッセイ。プールした免疫マウス由来の脾臓細胞を、磁気ビーズ
を使用してＣＤ８⁺Ｔ細胞を枯渇させ、そしてｐ２２２Ｄ（ＨＣＶ−ＮＳ５ａ由
来のＮＳ５ａエピトープペプチド（２２２４−ＡＥＬＩＥＡＮＬＬＷＲＱＥＭＧ
−２２３８；配列番号２））と共に、または培地単独中で、のいずれかで、３連
で培養した。７２時間後、細胞に、１μＣｉ／ウェルの³Ｈ−チミジンをパルス
し、そして６〜８時間後に回収した。放射活性の取り込みを、回収後に測定した
。平均ｃｐｍを計算した。

【０１１３】表３に示されるように、プラスミドにコードされるＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａ融合
タンパク質での免疫は、ＣＤ４⁺ＨＣＶ特異的Ｔ細胞の増殖を刺激する。この融
合タンパク質をコードするアデノウイルスベクターでの免疫もまた、ＣＤ４⁺Ｈ
ＣＶ特異的Ｔ細胞の増殖の刺激を生じた（表４）。

【０１１４】

【表３】

【０１１５】

【表４】（実施例５）（ＮＳ３４５ａをコードするＤＮＡワクチン処方物がマウスにおいてＣＴＬを
プライムする効率）マウスを、実施例１に記載のように、ＮＳ３４５ａ融合タンパク質をコードす
る１０〜１００μｇのプラスミドＤＮＡでか、以下に記載のように、ＮＳ３４５
ａをコードするＰＬＧ連結ＤＮＡでか、またはＮＳ３４５ａをコードするＤＮＡ
（これは、エレクトロポレーションによって送達される）（この送達技術につい
ては、例えば、国際公開番号ＷＯ／００４５８２３を参照のこと）での、いずれ
かで免疫した。免疫後、６週間後に、ＮＳ５ａをコードする１×１０⁷ｐｆｕの
ワクシニアウイルス、ＮＳ３４５ａをコードするプラスミドＤＮＡまたはＮＳ５
ａをコードするプラスミドＤＮＡを（各々、実施例１に記載されるように）ブー
スター注射した。

【０１１６】ＰＬＧ送達ＤＮＡ。ポリラクチド−コ−グリコリド（ＰＬＧ）ポリマーを、Ｂ
ｏｅｈｒｉｎｇｅｒＩｎｇｅｌｈｅｉｍ，Ｕ．Ｓ．Ａ．から得た。本研究で使
用したＰＬＧポリマーは、ＲＧ５０５であり、これは、５０／５０の比のコポリ
マーであり、６５ｋＤａの分子量を有する（製造者データ）。吸着されたＤＮＡ
を有するカチオン性微粒子を、本質的には、Ｓｉｎｇｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２０００）９７：８１１−８１６に記載されるよ
うな、改変型の溶媒エバポレーションプロセスを使用して調製した。手短には、
微粒子を、塩化メチレン中の５％ｗ／ｖのポリマー溶液１０ｍｌを、１ｍｌの
ＰＢＳと共に、ＩＫＡホモジナイザーを使用して乳化することによって調製した
。次いで、この一次エマルジョンを、セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ
）を含有する（０．５％ｗ／ｖ）５０ｍｌの滅菌水に添加した。これは、ｗ／
ｏ／ｗエマルジョンの処方物を生じ、この処方物を、室温で１２時間、６００
０ｒｐｍで攪拌し、塩化メチレンを蒸発させた。得られた微粒子を、滅菌水で２
回、１０，０００ｇの遠心分離によって洗浄し、そして凍結乾燥させた。調製、
洗浄および収集後、１００ｍｇのカチオン性微粒子を、１ｍｇ／ｍｌのＤＮＡの
溶液中、４℃で６時間インキュベートすることによって、ＤＮＡを、この微粒子
上に吸着させた。次いで、この微粒子を、遠心分離によって分離し、ペレットを
、ＴＥ緩衝液で洗浄し、そして微粒子を、凍結乾燥させた。

【０１１７】ＣＴＬ活性およびＩＦＮ−γ発現を、⁵¹Ｃｒ放出アッセイまたは細胞内染色（
それぞれ、実施例２および３に記載されるように）によって測定した。これらの
結果を、表５に示す。

【０１１８】結果は、マウスをプライムするためのＮＳ３４５ａをコードするプラスミドＤ
ＮＡを使用する免疫が、ＣＤ８＋ＨＣＶ特異的Ｔ細胞の活性化を生じることを実
証する。

【０１１９】

【表５】（実施例６）（免疫経路およびＮＳ３４５ａをコードするレプリコン粒子ＳＩＮＣＲ（ＤＣ
＋））アルファウイルスレプリコン粒子（例えば、ＳＩＮＣＲ（ＤＣ＋））を、Ｐｏ
ｌｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９９）９６：４
５９８−４６０３に記載のように調製した。マウスに、ＮＳ３４５ａをコードす
る５×１０⁶ＩＵのＳＩＮＣＲ（ＤＣ＋）レプリコン粒子を、腹腔内（ＩＭ）（
実施例１に記載のように）に、または尾（ＢｏＴ）および足の裏（ＦＰ）で皮下
（Ｓ／Ｃ）に注射するか、あるいは２／３のＤＮＡをＩＭ投与で、そして１／３
のＤＮＡをＢｏＴ経路で、組み合わせて送達した。免疫後、実施例１に記載のよ
うに、ＮＳ５ａをコードするワクシニアウイルスをブースター注射した。

【０１２０】ＩＮＦ−γ発現を、実施例３に記載のように、細胞内染色によって測定した。
結果を、表６に示す。これらの結果は、種々の経路によるＮＳ３４５ａをコード
するＳＩＮＣＲ（ＤＣ＋）レプリコン粒子を介する免疫が、ＩＮＦ−γを発現す
るＣＤ８＋ＨＣＶ特異的Ｔ細胞を生じることを実証する。

【０１２１】

【表６】（実施例７）（ＮＳ３４５ａをコードするＳＩＮＣＲ（ＤＣ＋）レプリコン粒子対ＳＩ
ＮＣＲ（ＬＰ）レプリコン粒子）アルファウイルスレプリコン粒子（例えば、ＳＩＮＣＲ（ＤＣ＋）およびＳＩ
ＮＤＣ（ＬＰ））を、Ｐｏｌｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ（１９９９）９６：４５９８−４６０３に記載のように調製した。マウスを
、ＮＳ３４５ａをコードする１×１０³〜１×１０⁷ＩＵのＳＩＮＣＲ（ＤＣ＋）
レプリコン粒子またはＳＩＮＣＲ（ＬＰ）レプリコン粒子で、前脛骨筋への筋内
注射によって免疫し、その後、６週目に、ＮＳ５ａをコードする１０⁷ｐｆｕの
ワクシニアウイルスをブースター注射した。

【０１２２】ＩＮＦ−γ発現を、実施例３に記載のように、細胞内染色によって測定した。
ＮＳ３４５ａをコードする漸増数のＳＩＮＣＲ（ＤＣ＋）レプリコン粒子の投与
は、ＩＦＮ−γを発現するＣＤ８＋Ｔ細胞の％の増加を生じた。

【０１２３】（実施例８）（アルファウイルスレプリコンプライミングおよびその後の種々のブースター
レジメン）アルファウイルスレプリコン粒子（例えば、ＳＩＮＣＲ（ＤＣ＋））を、Ｐｏ
ｌｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９９）９６：４
５９８−４６０３に記載のように調製した。マウスを、ＳＩＮＣＲ（ＤＣ＋）（
ＮＳ３４５ａをコードする１．５×１０⁶ＩＵのレプリコン粒子）で、前脛骨筋
への筋内注射によってプライムし、その後、６週目に、ＮＳ５ａをコードする１
０〜１００μｇのプラスミドＤＮＡ、ＮＳ３４５ａをコードする１０¹⁰のアデノ
ウイルス粒子、ＮＳ３４５ａをコードする１．５×１０⁶ＩＵのＳＩＮＣＲ（Ｄ
Ｃ＋）レプリコン粒子、またはＮＳ５ａをコードする１０⁷ｐｆｕのワクシニア
ウイルスのいずれかを、ブースター注射した。

【０１２４】ＩＮＦ−γ発現を、実施例３に記載のように、細胞内染色によって測定した。
結果を、表７に示す。これらの結果は、ＮＳ５ａＤＮＡをコードするワクシニ
アウイルスでのブーストが、ＩＦＮ−γを発現するＣＤ８＋ＨＣＶ特異的Ｔ細胞
の強力な生成を生じることを実証する。ＮＳ５ａＤＮＡをコードするプラスミ
ドでのブーストもまた、良好な応答を生じるが、アデノウイルスＮＳ３４５ａま
たはＳＩＮＣＲＤＣ＋でブースとした動物では、それほど応答が見られない。

【０１２５】

【表７】（実施例９）（ＮＳ３４５ａを発現するアルファウイルス）アルファウイルスレプリコン粒子（例えば、ＳＩＮＣＲ（ＤＣ＋）およびＳＩ
ＮＣＲ（ＬＰ））を、Ｐｏｌｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ（１９９９）９６：４５９８−４６０３に記載のように調製した。マウスを
、ＮＳ３４５ａをコードする１×１０²〜１×１０⁶ＩＵのＳＩＮＣＲ（ＤＣ＋）
レプリコンで、組み合わせの送達経路（２／３をＩＭそして１／３をＳ／Ｃ）を
介して、およびＳ／Ｃ単独によって免疫するか、またはＮＳ３４５ａをコードす
る１×１０²〜１×１０⁶ＩＵのＳＩＮＣＲ（ＬＰ）レプリコンで、組み合わせの
送達経路（２／３をＩＭそして１／３をＳ／Ｃ）を介して、およびＳ／Ｃ単独に
よって免疫した。免疫後、６週目に、ＮＳ５ａをコードする１０⁷ｐｆｕのワク
シニアウイルスをブースター注射した。

【０１２６】ＩＮＦ−γ発現を、実施例３に記載のように、細胞内染色によって測定した。
結果を、図１に示す。結果は、ＣＤ８＋ＨＣＶ特異的Ｔ細胞の活性化を示す。

【０１２７】（実施例１０）（ＮＳ５ａをコードするＤＮＡワクチン処方物がマウスにおいてＣＴＬをプラ
イムする効率）マウスを、実施例１に記載のように、ＮＳ５ａ融合タンパク質をコードする１
０〜１００μｇのプラスミドＤＮＡで、または実施例５に記載のように、ＮＳ５
ａをコードするＰＬＧ連結ＤＮＡでの、いずれかで免疫した。免疫後、６週目に
、ＮＳ５ａをコードする１０〜１００μｇのプラスミドＤＮＡ、ＮＳ３４５ａを
コードする１０¹⁰のアデノウイルス粒子、ＮＳ３４５ａをコードする１．５×１
０⁶ＩＵのＳＩＮＣＲ（ＤＣ＋）レプリコン粒子、またはＮＳ５ａをコードする
１０⁷ｐｆｕのワクシニアウイルスのいずれかを、ブースター注射した。

【０１２８】ＣＴＬ活性およびＩＦＮ−γ発現を、実施例２および実施例３に記載の方法に
よって測定した。

【０１２９】結果を、表８に示す。これらの結果は、ＮＳ５ａをコードするプラスミドＤＮ
ＡまたはＮＳ５ａをコードするＰＬＧ連結ＤＮＡでのプライミングが、ＣＤ８＋
ＨＣＶ特異的Ｔ細胞の活性化を生じることを実証する。

【０１３０】

【表８】（実施例１１）（ＮＳ３４５ｂをコードするＤＮＡワクチン処方物がマウスにおいてＣＴＬを
プライムする効率）マウスを、前脛骨筋への筋内注射によって、ＮＳ３４ｂをコードする１０〜１
００μｇのプラスミドＤＮＡで、または実施例５に記載のように、ＮＳ５ａをコ
ードするＰＬＧ連結ＤＮＡで、免疫した。免疫後、実施例１に記載のように、Ｎ
Ｓ５ａをコードするプラスミドＤＮＡをブースター注射した。

【０１３１】ＣＴＬ活性およびＩＦＮ−γ発現を、実施例２および実施例３に記載の方法に
よって測定した。

【０１３２】結果を、表９に示す。これらの結果は、ＮＳ３４５ｂをコードするプラスミド
ＤＮＡまたはＰＬＧ連結ＮＳ３４５ｂでのプライミングが、ＣＤ８＋ＨＣＶ特異
的Ｔ細胞の活性化を生じることを実証する。

【０１３３】

【表９】（実施例１２）（別々のプラスミドを介するＤＮＡの投与）マウスを、ＮＳ３４５ａをコードする１００μｇのプラスミドＤＮＡで、また
はＮＳ３４５ａをコードする１００μｇのＰＬＧ連結ＤＮＡで免疫した。さらに
、ＮＳ５ａ、ＮＳ３４ａおよびＮＳ４ａｂをコードする、別々のＤＮＡプラスミ
ド（各３３．３μｇ）を、別の群のマウスに同時に投与した。最後に、ＮＳ５ａ
、ＮＳ３４ａおよびＮＳ４ａｂをコードするＰＬＧ連結ＤＮＡ（各３３．３μｇ
）を、別の群のマウスに同時に投与した。免疫後、最初の免疫後６週間で、ＮＳ
５ａをコードする１×１０⁷ｐｆｕのワクシニアウイルスをブースター注射した
。

【０１３４】ＩＮＦ−γ発現を、実施例３に記載の方法によって測定した。これらの結果を
、図２に示す。これらの結果は、ＤＮＡがより小さいサブユニットに分けられか
つＰＬＧに連結されている場合の、ＣＤ８＋ＨＣＶ特異的Ｔ細胞の活性化におけ
る特に強力な応答を実証する。

【０１３５】従って、ＨＣＶポリペプチド（単独または融合体としてのいずれか）が、細胞
媒介性免疫応答を刺激することを開示する。本発明の好ましい実施形態を、幾分
詳細に説明してきたが、明らかな変更が、添付の特許請求の範囲によって規定さ
れる本発明の精神および範囲を逸脱することなくなされ得ることが理解される。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａをコードするαウイルス構築物の送達に応じて
動物において作製されるＩＦＮ−γ発現の平行比較を示す。

【図２】図２は、ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａをコードするプラスミドＤＮＡ（「裸の」）、
ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａをコードするＰＫＧ連結ＤＮＡ（「ＰＬＧ」）、ＮＳ５ａ
、ＮＳ３４ａ、およびＮＳ４ａｂをコードする別々のＤＮＡプラスミド（「裸の
」）、ＮＳ５ａ、ＮＳ３４ａ、およびＮＳ４ａｂをコードするＰＫＧ連結ＤＮＡ
（「ＰＬＧ」）の送達に応じて動物において作製されるＩＦＮ−γ発現を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 43/00 １０７Ｃ０７Ｋ 14/005 Ｃ０７Ｋ 14/005 19/00 19/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｎ 5/06 5/00 Ｅ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ヒュートン，マイケルアメリカ合衆国カリフォルニア 94608，エミリービル，アール−440，ホートンストリート 4560，カイロンコーポレイション (72)発明者セルビー，マークアメリカ合衆国カリフォルニア 94608，エミリービル，アール−440，ホートンストリート 4560，カイロンコーポレイションＦターム(参考） 4B024 AA01 BA33 CA07 4B065 AA90X AA96Y BB19 CA44 4C085 AA03 AA04 BA92 BB11 CC08 DD62 FF24 4H045 AA10 BA41 CA02 DA86 EA29 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のＮＳ３ポリペプチド、ＮＳ４
ポリペプチド、およびＮＳ５ａポリペプチドから実質的になる、融合タンパク質
。
【請求項２】Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のＮＳ３ポリペプチド、ＮＳ４
ポリペプチド、ＮＳ５ａポリペプチド、およびＮＳ５ｂポリペプチドから実質的
になる、融合タンパク質。
【請求項３】請求項１または２のいずれかに記載の融合タンパク質であっ
て、ここで、前記ＨＣＶポリペプチドの１つが、他のＨＣＶポリペプチドとは異
なる株のＨＣＶ由来である、融合タンパク質。
【請求項４】請求項３に記載の融合タンパク質であって、該ＨＣＶポリペ
プチドが互いに異なる株のＨＣＶ由来である、融合タンパク質。
【請求項５】（ａ）請求項１または２のいずれかに記載の融合タンパク質
；および（ｂ）薬学的に受容可能な賦形剤、を含む、組成物。
【請求項６】（ａ）請求項４に記載の融合タンパク質；および（ｂ）薬学的に受容可能な賦形剤、を含む、組成物。
【請求項７】（ａ）単離および精製されたＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の
ＮＳ３ポリペプチド；（ｂ）単離および精製されたＨＣＶのＮＳ４ポリペプチド；（ｃ）単離および精製されたＨＣＶのＮＳ５ａポリペプチド；ならびに（ｄ）薬学的に受容可能な賦形剤および必要ならばアジュバント、から実質的になる、組成物。
【請求項８】（ａ）単離および精製されたＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の
ＮＳ３ポリペプチド；（ｂ）単離および精製されたＨＣＶのＮＳ４ポリペプチド；（ｃ）単離および精製されたＨＣＶのＮＳ５ａポリペプチド；（ｄ）単離および精製されたＨＣＶのＮＳ５ｂポリペプチド；ならびに（ｅ）薬学的に受容可能な賦形剤および必要ならばアジュバント、から実質的になる、組成物。
【請求項９】請求項１または２のいずれかに記載の融合タンパク質をコー
ドする、単離および精製されたポリヌクレオチド。
【請求項１０】請求項４に記載の融合タンパク質をコードする、単離およ
び精製されたポリヌクレオチド。
【請求項１１】（ａ）請求項９に記載の単離および精製されたポリヌクレ
オチド；ならびに（ｂ）薬学的に受容可能な賦形剤、を含む、組成物。
【請求項１２】前記ポリヌクレオチドがＤＮＡである、請求項１１に記載
の組成物。
【請求項１３】前記ポリヌクレオチドがプラスミドにある、請求項１２に
記載の組成物。
【請求項１４】（ａ）請求項１０に記載の単離および精製されたポリヌク
レオチド；ならびに（ｂ）薬学的に受容可能な賦形剤、を含む、組成物。
【請求項１５】前記ポリヌクレオチドがＤＮＡである、請求項１４に記載
の組成物。
【請求項１６】前記ポリヌクレオチドがプラスミドにある、請求項１５に
記載の組成物。
【請求項１７】（ａ）Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のＮＳ３ポリペプチド
をコードする、単離および精製されたポリヌクレオチド；（ｂ）ＨＣＶのＮＳ４ポリペプチドをコードする、単離および精製されたポリヌ
クレオチド；（ｃ）ＨＣＶのＮＳ５ａポリペプチドをコードする、単離および精製されたポリ
ヌクレオチド；ならびに（ｄ）薬学的に受容可能な賦形剤および必要ならばアジュバント、から実質的になる、組成物。
【請求項１８】前記ポリヌクレオチドがＤＮＡである、請求項１７に記載
の組成物。
【請求項１９】前記ポリヌクレオチドがプラスミドにある、請求項１８に
記載の組成物。
【請求項２０】（ａ）Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のＮＳ３ポリペプチド
をコードする、単離および精製されたポリヌクレオチド；（ｂ）ＨＣＶのＮＳ４ポリペプチドをコードする、単離および精製されたポリヌ
クレオチド；（ｃ）ＨＣＶのＮＳ５ａポリペプチドをコードする、単離および精製されたポリ
ヌクレオチド；ならびに（ｄ）ＨＣＶのＮＳ５ｂポリペプチドをコードする、単離および精製されたポリ
ヌクレオチド；ならびに（ｅ）薬学的に受容可能な賦形剤および必要ならばアジュバント、から実質的になる、組成物。
【請求項２１】前記ポリヌクレオチドがＤＮＡである、請求項２０に記載
の組成物。
【請求項２２】前記ポリヌクレオチドがプラスミドにある、請求項２１に
記載の組成物。
【請求項２３】ＨＣＶポリペプチドのエピトープを認識するＴ細胞を活性
化する方法であって、該方法は以下の工程：Ｔ細胞を請求項１または２のいずれかに記載の融合タンパク質と接触させて、
これにより活性化したＴ細胞の集団がＮＳ３ポリペプチド、ＮＳ４ポリペプチド
、ＮＳ５ａポリペプチド、またはＮＳ５ｂポリペプチドのエピトープを認識する
工程、を包含する、方法。
【請求項２４】請求項２３に記載の方法であって、ここで、前記Ｔ細胞が
、マウス、ヒヒ、チンパンジー、およびヒトからなる群より選択される哺乳動物
より得られる、方法。
【請求項２５】前記哺乳動物がＨＣＶで感染される、請求項２４に記載の
方法。
【請求項２６】前記哺乳動物がＨＣＶで感染されない、請求項２４に記載
の方法。
【請求項２７】前記Ｔ細胞の集団がＣＤ４⁺Ｔ細胞を含む、請求項２３に
記載の方法。
【請求項２８】前記Ｔ細胞の集団がＣＤ８⁺Ｔ細胞を含む、請求項２３に
記載の方法。
【請求項２９】前記ＣＤ８⁺Ｔ細胞がインターフェロンγを発現する、請
求項２８に記載の方法。
【請求項３０】前記ＣＤ８⁺Ｔ細胞が、ＮＳ５ａポリペプチドのエピトー
プを特異的に認識する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】請求項３０に記載の方法であって、ここで、前記エピトー
プが配列番号１および配列番号２に示されるエピトープからなる群より選択され
る、方法。
【請求項３２】前記Ｔ細胞がＣＤ８⁺Ｔ細胞およびＣＤ４⁺Ｔ細胞を含む、
請求項２３に記載の方法。
【請求項３３】前記接触工程が、Ｔ細胞をアジュバントに接触させること
をさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３４】前記融合タンパク質が該融合タンパク質をコードするポリ
ヌクレオチドによって提供される、請求項２３に記載の方法。
【請求項３５】前記ポリヌクレオチドがＤＮＡである、請求項３４に記載
の方法。
【請求項３６】前記ポリヌクレオチドがＲＮＡである、請求項３４に記載
の方法。
【請求項３７】前記Ｔ細胞が哺乳動物である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３８】前記哺乳動物が、マウス、ヒヒ、チンパンジー、およびヒ
トからなる群より選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】前記哺乳動物がＨＣＶで感染される、請求項３７に記載の
方法。
【請求項４０】前記哺乳動物がＨＣＶで感染されない、請求項３７に記載
の方法。
【請求項４１】ＨＣＶポリペプチドのエピトープを認識するＴ細胞を活性
化する方法であって、該方法は以下の工程：Ｔ細胞を請求項７、８、１７または２０のいずれかに記載の組成物と接触させ
て、これにより活性化したＴ細胞の集団がＮＳ３ポリペプチド、ＮＳ４ポリペプ
チド、ＮＳ５ａポリペプチド、またはＮＳ５ｂポリペプチドのエピトープを認識
する工程、を包含する、方法。
【請求項４２】ＨＣＶポリペプチドのエピトープを認識するＴ細胞を活性
化するための組成物の製造における、請求項１または２のいずれかに記載の融合
タンパク質の使用であって、ここで、該活性化されたＴ細胞は、ＮＳ３ポリペプ
チド、ＮＳ４ポリペプチド、ＮＳ５ａポリペプチド、またはＮＳ５ｂポリペプチ
ドのエピトープを認識する、使用。
【請求項４３】ＨＣＶポリペプチドのエピトープを認識するＴ細胞を活性
化するための組成物の製造における、請求項７、８、１７または２０のいずれか
に記載の組成物の使用であって、ここで、該活性化されたＴ細胞は、ＮＳ３ポリ
ペプチド、ＮＳ４ポリペプチド、ＮＳ５ａポリペプチド、またはＮＳ５ｂポリペ
プチドのエピトープを認識する、使用。