KR20060057653A

KR20060057653A - Ｃ형 간염 바이러스의 비구조 단백질을 이용한 유전자면역법

Info

Publication number: KR20060057653A
Application number: KR1020067008960A
Authority: KR
Inventors: 잭 완즈; 옌스 엔케
Original assignee: 더 제너럴 하스피탈 코포레이션
Priority date: 1998-01-30
Filing date: 1999-01-28
Publication date: 2006-05-26
Also published as: AU2478699A; CN101126095A; JP2002501737A; EP1056762A1; WO1999038880A1; KR20010086226A; CN1289339A; IL137458A0; BR9908540A; CA2318744A1; KR100628411B1; CN100335637C; AU746258B2; EP1056762A4; CN101126094A

Abstract

본 발명은 특히 개시된 DNA 서열을 포함하는 C형 간염 바이러스 비구조 단백질을 포함하는 핵산 분자를 개시하고 있다. 본 발명은 사람 세포에서 기능을 하는 조절 인자에 작용 가능하게 연결된, NS3, NS4 또는및 NS5 또는 이들의 조합을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 이 서열을 포함하는 C형 간염 바이러스 비구조 단백질, 이 단백질을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 제약 조성물을 개시하고 있다. 본 발명은 상기의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, C형 간염 바이러스에 감염되기 쉽거나 감염된 개체를 면역화하는 방법을 개시하고 있다.

C형 간염 바이러스, 비구조 단백질, NS3, NS4, NS5, 제약 조성물, 유전자 면역법

Description

Ｃ형 간염 바이러스의 비구조 단백질을 이용한 유전자 면역법{Genetic Immunization with Nonstructural Proteins of Hepatitis C Virus}

도 1a는 HCV의 하나의 큰 ORF를 보여주는 개략도이며, 이 ORF는 화살표로 표시된 바와 같이, 숙주의 시그날 및 바이러스의 프로테아제에 의해 각각의 구조 및 비구조 단백질로 절단되는 약 3011 내지 3030 아미노산의 폴리프로테인의 전구체를 코딩한다. 도 1b는 HuH-7의 일시적 트랜스펙션 및 SP2/0 세포의 안정한 트랜스펙션 후의 비구조 단백질의 발현을 보여주는 방사선 자동 사진(autoradiography)이다. 레인 1, 3 및 5는 모의(mock) DNA로 트랜스펙션된 세포로 음성 대조군이다(Mock). 레인 2, 4 및 6은 NS3의 약 70 kD, NS4의 약 30 kD 및 NS5의 약 125 kD의 특정 밴드를 보여준다. 레인 7 내지 10은 NS3, NS4 및 NS5의 유전자를 각각 포함하는 핵산 구조물로 트랜스펙션된 SP2/0 세포를 나타낸다. 레인 7 및 9는 음성 대조군으로서 HCV-중핵 단백질을 안정하게 발현하는 세포(SP2-10)의 세포 용해액을 나타내며, 레인 8 및 10은 NS3 및 NS5의 특이적 발현을 나타낸다.

도 2a는 DNA계 면역법에 의해 생성되는 NS3, NS4 및 NS5에 대한 체액성 면역 반응을 나타내는 막대그래프로서, 혈청 항체 수준은 ELISA로 측정하였다(각 군 n=5). 도 2b는 특이적 또는 비특이적 재조합 단백질을 사용한 시험관 내(in vitro) 자극 3일 후에 측정한 T-세포 증식을 나타내는 막대 그래프이다. 도 2c, 2d 및 2e는 시험관 내 자극 48 시간 후에 측정된, 상등액으로 사이토카인의 분비, IFN-γ, IL-2 및 IL-4를 각각 나타내는 막대 그래프이다.

도 3a 및 3b는 이펙터(effector)와 표적 세포의 다른 비율(100:1, 30:1, 10:1, 3:1)에서 각각 NS3 및 NS5에 대한 세포 독성 T-세포(CTL) 반응을 보여주는 막대 그래프이다. 도 3c는 안정하게 트랜스펙션된 표적 세포주에 대해 크롬 방출 분석법을 보여주는 막대 그래프를 나타낸다.

도 4a는 CTL 활성을 측정하기 위한 종양 모델의 결과를 보여주는 표이다. 도 4b는 왼쪽에서부터 1) 모의 DNA로 면역화, SP2/NS5-21 세포 접종(challenge); 2) pApNS5로 면역화, SP2/NS5-21 세포 접종; 3) pApNS5로 면역화, SP2-19(HCV 중핵을 안정적으로 발현) 접종; 및 4) 재조합 NS5 단백질을 세차례 복강 내 투여로 면역화하고 SP2/NS5-21 세포로 접종된 동물을 보여주는 사진이다.

본 발명은 재조합 핵산 분자, 예를 들어 유전적 면역법에 있어서 항 C형 간염 바이러스 백신의 구성 성분으로 유용한, 상기 분자를 포함하는 제약 조성물, C형 간염 바이러스 감염에 대한 면역 반응을 유발하는 방법 및 C형 간염 바이러스에 감염된 개체의 치료 방법에 관한 것이다.

C형 간염 바이러스(HCV)는 수혈로 인해 감염되는 비-A형, 비-B형 간염의 주요 병인학적 인자로서 미국 내에서 매년 약 150,000건의 급성 바이러스성 간염의 원인이 되고 있다[Choo et al., Science, 1989, 244, 359-362]. 선진국에서 0.6 내지 2.0%, 일부 후진국에서는 15% 가량이 퍼져있다[Heintges, et al., Hepatology, 1997, 26, 521-526]. 이들 감염자의 절반 가량이 간경화 및(또는) 간세포암과 연관될 수 있는 만성 감염으로 진행된다[Alter, et al., Science, 1992, 258, 135-140; 및 Alter, et al., New Eng. J. Med., 1992, 327, 1899-1905]. 또한, 항-HCV 항체의 보급에서 보여진 바와 같이, HCV 감염은 간 세포암 발전에 독립적인 위험 인자가 되고 있다(Colombo, et al., Lancet, 1989, ii, 1006-1008; Saito, et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 1990, 87, 6547-6549; Simonetti, et al., An. Int. Med., 1992, 116, 97-102; 및 Tsukuma, et al., New Eng. J. Med., 1993, 328, 1797-1801).

HCV는 외피가 있는, 양성 가닥의 RNA 바이러스이며, 약 9,500 뉴클레오티드의 길이를 가지며 플라비바이러스 패밀리 내에서 별개의 속으로 분류되었다[Heinz, Arch. virol.(Suppl.), 1992, 4, 163-171]. 다른 단리체는 뉴클레오티드 서열의 큰 다양성을 보이며 이에 의해 HCV 게놈은 8가지 이상의 유전형으로 세분된다 [Simmonds, et al., J. Gen. Virol., 1993, 74, 2391-2399]. 모든 유전형에서, 바이러스 게놈은 약 330 Kd의 3010 내지 3033개 아미노산의 폴리프로테인 전구체를 코딩하는 큰 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함한다[Choo, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, 88, 2451-2455; Inchauspe, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, 88, 10292-10296; Kato, et al., Pro. Natl. Aca. Sci. USA, 1990, 87, 9524-9528; Okamoto, et al., J. Gen. Virol., 1991, 72, 2697-2704; 및 Takamizawa. et al., J. Gen. Virol., 1991, 65, 1105-1113]

각각의 HCV 폴리펩티드는 중핵(C), 외피(E1, E2) 및 비구조 단백질(NS2-NS5)을 생성시키는 전구체 폴리펩티드의 단백질 분해 과정에 의해 생성된다 [Bartenschlager, et al., J. Gen. Virol., 1993, 67, 3835-3844; Grakoui, et al., J. Gen. Virol., 1993, 67, 2823-2843; 및 Selby et al., J. Gen. Virol., 1993, 74, 1103-1113]. 이러한 단백질 분해는 세포 및 바이러스에 의해 코딩되는 프로테아제의 조합에 의해 촉매된다. NS3 유전자는 전사 후에 여러가지 작용기에서 바이러스 폴리프로테인 전구체를 절단하고 또한 바이러스 헬리카제로 작용하는 세린 프로테아제를 코딩한다. NS5 부위는 바이러스의 RNA 의존성 RNA 폴리머라제를 코딩한다.

번역된 부위 외에, HCV 게놈은 5' 비번역 부위(5'UTR) 및 3' 비번역 부위(3'UTR)을 포함한다. 324 내지 341개의 뉴클레오티드의 5'UTR은 지금까지 보고된 전체 HCV 단리체 가운데서 가장 높은 보존 서열을 나타낸다[Han, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, 88, 1711-1715; 및 Bukh, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 4942-4946]. 이 5'UTR은 HCV RNA의 복제 및(또는) 번역에 중요한 조절 요소를 포함하는 것으로 추측되고 있다. 또한 5'UTR은 여러 개의 작은 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하고 있으나, 이들 ORF 서열이 실제 번역된다는 것을 제시하는 증거는 아직까지 없다.

간 손상 및 HCV 감염시 바이러스 제거와 관련된 세포 면역 체계는 단지 부분적으로만 확인되어 있다. 만성 HCV 감염 환자에서 간 침윤 림프구의 가능한 병리 학적 역할을 확인하기 위해서, Koziel 등은 상기 세포의 세포 독성 T 림프구(CTL) 반응을 조사하고 HCV 폴리펩티드의 구조 및 비구조 부위에 대한 HLA 클래스 I-제한된 CD8+ CTL 반응을 증명하였다[Koziel, et al., J. Virol., 1993, 67, 7522-7532; 및 Koziel, et al., J. Immunol., 1992, 149, 3339-3344]. 또한, 다른 연구자들은 만성 HCV 감염시 중핵 및 다른 바이러스 관련 단백질 상의 에피토프를 인지하는 말초혈액 단핵 세포군에 CTL이 존재한다는 것을 확인하였다[Kita, et al., Hepatol., 1993, 18, 1039-1044; 및 Cerny, et al., Intl. Symp. Viral Hepatitis Liver Dis., 1993, 83(abstr.)]. Botarelli 등[Botarelli, et al., Gastroenterol., 1993, 104, 580-587] 및 Ferrari 등[Ferrari, et al., Hepatol., 1994, 19, 286-295]은 만성 HCV 감염 환자의 HCV의 다른 부위에서 유래된 여러 재조합 단백질에 대한 HLA 클래스 II-제한된 CD4+ T 세포-매개된 증식 반응을 발견하였다.

활동성의 HCV 감염시, 체액성 및 세포성 면역 반응은 폴리클로날 및 다중 특이적인 것으로 밝혀졌고, 잠복성의 HCV 감염시 유발되는 숙주의 면역 반응이 간 세포 손상의 부분적인 원인이 되는 것으로 추측된다. 그러나, 이러한 면역 반응은 충분히 광범위하거나 바이러스 제거를 촉진할 정도로 활발하지 않으며 만성 HCV 감염자에게 방어적 면역성을 유발하지 못할 것으로 생각된다.[Chisari, J. Clin. Invest., 1997, 99, 1472-1477]. 최근 급성 HCV 감염으로부터 회복된 개체들에서 비구조 단백질에서 유도된 펩티드에 대해 강하게 증식하는 CD4+ T 세포 반응이 발생한다는 것이 최근 밝혀졌다[Missale, et al., J. Clin. Invest., 1996, 98,706-714; 및 Diepolder, et al., Lancet, 1995, 346, 1006-1007]. 더욱 중요한 것은, HCV 특이적 CTL 활성의 발생은 만성 간염 개체의 바이러스 복제 조절과 관련이 있는 것으로 생각된다 [Rehermann, et al., J. Clin. Invest., 1996, 98, 1432-1440; 및 Nelson, et al., J. Immunol., 1997, 158, 1473-1481].

그러나, 비구조 단백질 NS3, NS4 및 NS5가 생체 내에서 광범위하고 활발한 CTL-반응을 유발할 정도의 충분한 면역원성을 갖는 지는 밝혀지지 않았다.

현재, 만성 HCV 감염에 대해 일반적이고 매우 효과적인 치료법은 없다. HCV 단리체 사이의 큰 이종성 및 단리체 내에서의 이종 게놈의 혼합으로 인해 HCV에 대한 백신 개발은 매우 복잡하다[Martell, et al., J. Virol., 1992, 66, 3225]. 또한, 바이러스는 매우 다양한 외피 부위를 포함한다. 효과적인 치료법은 인터페론의 사용만으로 한정되고 있다[Carithers, et al., Hepatology, 1997, 26, 83S-88S]. 실제로, 상기 작용제로 치료 받은 개체의 약 8 내지 10%가 HCV에 반응하여 간으로부터 HCV를 제거하였다. 그러나, 최근 연구는 급성 HCV 감염에서 회복된 개체가 잠복성 HCV에 감염된 개체에 비해 비구조 단백질에 대해 큰 CD4+ T-세포 증식 반응을 나타낸다는 것을 밝혔다[Missale, et al., J. Clin. Invest., 1996, 98, 706-714; 및 Diepolder, et al., Lancet, 1995, 346, 006-1007].

동물에 DNA를 직접 주사하는 것은 면역화를 위한 특이적 항원을 전달하기 위한 유망한 방법이다[Barry, et al., Bio Techniques, 1994, 16, 616-619; Davis, et al., Hum. Mol. Genet., 1993, 11, 1847-1851; Tang, et al., Nature, 1992, 356, 152-154; Wang, et al., J. Virol., 1993, 67, 3338-3344; 및 Wolff, et. al., Science, 1990, 247, 1465-1468]. 이 방법은 마우스 및 닭에서 인플루엔자 바이러스, 마우스 및 소에서 소 헤르페스 바이러스 1 및 마우스에서 광견병 바이러스에 대한 방어적 면역성을 유발하는 데 성공적으로 이용되었다[Cox, et al., J. Virol., 1993, 67, 5664-5667; Fynan, et al., DNA and Cell Biol., 1993, 12, 785-789; Ulmer, et al., Science, 1993, 259, 1745-1749; 및 Xiang, et al., Virol., 1994, 199, 132-140]. 대부분의 경우, 강하나 매우 다양한, 항체 및 세포 독성 T-세포 반응은 감염 조절과 연관되어 있다. 실제로, 사멸 바이러스 백신이 관련되어 급성 감염을 방어하고 잠복성 바이러스 감염을 제거하는 데 유리한 CTL 반응을 유발시키는 방법과 비교해 볼 때, 이 방법은 간 벡터를 이용하지 않고서도 장기간 지속되는 기억 CTL을 유발시킬 효능이 있기 때문에 특히 관심의 대상이 되었다[Wolff, et al., Science, 1990, 247, 1465-1468; Wolff, et al., Hum. Mol. Genet., 1992, 1, 363-369; Manthorpe, et al., Human Gene Therapy, 1993, 4, 419-431; Ulmer, et al., Science, 1993, 259, 1745-1749; Yankauckas, et al., DNA and Cell Biol., 1993, 12, 7997-783; Montgomery, et al., DNA and Cell Biol., 1993, 12, 777-783; Fynan, et al., DNA and Cell Biol., 1993, 12, 785-789; Wang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90, 4156-4160; Wang, et al., DNA and Cell Biol., 1993, 12, 799-805; Xiang, et al., Virol., 1994, 199, 132-140; Davis et al., Hum. Mol. Genet., 1993, 11, 1847-1851; Donelly, et al., Nat. Med., 1995, 1, 583-587; Boyer, et al., Nat. Med., 1997, 3, 526-532; Tascon, et al., Nat. Med., 1996, 2, 888-892; 및 Huygen, et al., Nat. Med., 1996, 2, 893-898]. 가용성 재조합 단백질 또는 펩티드를 이용한 면역법을 비교해 볼 때, 바이러스 단백질이 펩티드로 세포 내에서 처리된 후 트랜스펙션된 세포에서 MHC 클래스 I 분자에 로딩되기 때문에, 이 방법은 세포독성의 T 세포 활성뿐 아니라 강한 염증성 CD4+ T 세포 반응을 유발할 수 있고 항원 제시 세포와 제한된 상호작용을 보인다는 잇점을 갖는다. 반면, 가용성 단백질을 이용한 면역법은 MHC 클래스 II 경로를 통해 처리되기 때문에 주로 체액성 면역 반응을 유발한다. 합성 펩티드를 이용한 면역화는 숙주 면역 반응 자극에 이용 가능한 에피토프의 수가 제한되기 때문에 여러 단점을 갖는다. 반면, 목적하는 DNA 구조물에 의해 각 단백질으로 코딩되는 모든 천연 B 및 T 세포 에피토프는 T 세포 수용체에 의해 인지되기 위해 보존된 것으로 추정되고, 따라서 매우 광범위한 체액성 및 세포성 면역 반응을 유발할 것이다[McDonnell, et al., N. Eng. J. Med., 1996, 334, 42-45].

일반적으로 백신처리 및 면역화는 개체의 면역계가 면역 반응을 개시하여 병원균의 침입을 방어하도록 할 수 있는 무독성제의 도입을 말한다. 면역계는 주로 개체에 정상적으로 존재하지 않는 단백질 및 그 밖의 거대 분자를 인식함으로써 침입하는 외부 조성물 및 작용제를 인식한다. 외부 단백질은 면역 반응을 유도하는 표적을 제시한다.

PCT 특허 출원 제 PCT/US90/01348호는 HCV 게놈 클론의 서열 정보, HCV 바이러스 단백질의 아미노산 서열, HCV 단백질 및 이들로부터 유래된 펩티드를 포함하는, 항-HCV 백신을 함유하는 조성물의 제조 및 이용 방법을 개시하고 있다.

본원에서 참고자료로 인용되는 미국 특허 제 5,830,876호, 5,593,972호, 5,739,118호 및 1994. 1.26에 출원된 PCT 특허 출원 제 PCT/US94/00899호는 각각 유전자 면역법을 개시하고 있다. HCV에 대한 백신도 각각 개시되어 있다.

C형 간염 바이러스 감염으로부터 개체를 보호하기에 유용한 백신이 요구되고 있으며, C형 간염 바이러스 감염에 대해 개체를 보호하기 위한 방법이 요구되고 있다.

<발명의 요약>

본 발명은 C형 간염 바이러스 비구조 단백질, 예를 들어 NS3, NS4 또는 NS5 또는 이들의 조합을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자에 관한 것이다.

본 발명은 C형 간염 바이러스 비구조 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다. C형 간염 바이러스 비구조 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 코딩 서열은 사람 세포에서 기능하는 조절 인자에 작용 가능하게 연결된다. 제약 조성물은 추가적으로 제약적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제 및 임의로 촉진제, 예를 들어 부피비카인을 포함한다.

본 발명은 C형 간염 바이러스에 감염되기 쉬운 개체에게 C형 간염 바이러스 비구조 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 코딩 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자를 포함하는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체를 면역화시키는 방법에 관한 것이다. C형 간염 바이러스 비구조 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 코딩 서열은 사람 세포에서 기능하는 조절 인자와 작용 가능하게 연결되어 있다. 제약 조성물은 제약적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 더 포함한다. 개체에게 C형 간염 바이러스 감염에 대해 방어적 면역 반응을 유도할 수 있는 유효량을 투여한다.

본 발명은 C형 간염 바이러스를 보유하는 개체에게 C형 간염 바이러스 비구조 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 코딩 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자를 포함하는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기의 개체의 치료 방법에 관한 것이다. C형 간염 바이러스 비구조 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 코딩 서열은 사람 세포에서 기능하는 조절 인자와 작용 가능하게 연결되어 있다. 제약 조성물은 제약적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 더 포함한다. 개체에게 C형 간염 바이러스 감염에 대해 치료적 면역 반응을 유도할 수 있는 유효량을 투여한다.

본 발명은 예방적으로 및(또는) 치료적으로 HCV 감염으로부터 개체를 면역화 또는 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. HCV의 비구조 단백질, 예를 들어 NS3, NS4 또는 NS5 또는 이들의 조합을 코딩하는 뉴클레오티드 코딩 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자를 개체에 투여한다. 재조합 핵산 유전자 구조물에 의해 코딩되는 단백질은 개체의 세포에서 발현되고, 항-HCV 면역 반응을 유발하는 면역원성의 표적으로 작용한다. 유발되는 면역 반응은 광범위하고, 체액성 면역 반응 뿐 아니라 세포성 면역 반응도 유발된다. 본 발명의 방법은 예방 및 치료 면역성을 부여하기에 유용하다. 또한, 본 발명은 사람 외에 생의학적 연구를 위한 포유동물에도 실시될 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 HCV 감염된 개체를 치료하는 데 뿐 아니라 HCV 침입으로부터 개체를 면역시키는 데 이용될 수 있다.

본원에서 사용된, "HCV 비구조 단백질"은 HCV 비구조 단백질 NS3, NS4 및 NS5 및 그의 동등물을 의미한다. 동등한 단백질은 본원에서 개시한 바와 같은 생활성을 보유하는 NS3, NS4 및 NS5의 펩티드 단편을 포함한다. 또한, HCV 비구조 단백질이란 용어는 서열이 상이할 수 있는 다른 HCV 단리체의 대응하는 HCV 비구조 단백질을 의미한다. 당업자는 다른 HCV 단리체에서 HCV 비구조 단백질을 용이하게 동정할 수 있다. 코돈의 뉴클레오티드 치환은 동일한 아미노산을 코딩할 때 허용가능하다. 또한, 뉴클레오티드 치환의 결과가 보존적인 아미노산 치환(들)인 경우에도 뉴클레오티드 변경이 가능한 것으로 이해된다. 또한, "HCV 비구조 단백질"은 비구조 단백질과 치료적으로 또는 예방적으로 활성인 그의 단편을 포함하는 융합 단백질을 포함한다.

본원에서 사용된 "유전자 구조물"은 백신처리된 개체의 세포 내에서 발현을 지시할 수 있는 프로모터 및 폴리아데닐화 시그날을 포함하는 조절 인자에 작용 가능하게 연결된 개시 및 종료 시그날 및 HCV 비구조 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 코딩 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자를 의미한다. 일부 실시태양에서, 유전자 구조물은 또한 인핸서, 코작(Kozak)서열(GCCGCCATG; 서열 1) 및 HCV 5'UTR의 한 가지 이상의 단편을 포함한다.

본원에서 사용되는 "유전자 백신"은 유전자 구조물을 포함하는 제약적 제제를 의미한다. 유전자 백신은 HCV에 대해 예방적 및(또는) 치료적 면역 반응을 유발시키는 데 유용한 제약 제제를 포함한다.

본원에서 사용되는 "핵산"은 DNA, RNA 또는 이들의 키메라 형태를 의미한다.

본 발명에 따르면, 유전자 구조물은 발현될 개체의 세포에 도입되어 한 가지 이상의 HCV 비구조 단백질을 생산한다. 바람직하게는, 본 발명의 유전자 구조물의 조절 인자는 포유동물, 바람직하게는 사람 세포에서 발현을 지시할 수 있다. 조절인자는 프로모터 및 폴리아데닐화 시그날을 포함한다. 또한, 다른 요소, 예를 들어 인핸서 및 코작 서열도 유전자 구조물에 포함될 수 있다.

본 발명의 유전자 구조물은 세포 내에서 염색체 외에서 기능을 하는 분자로서 존재하거나 세포의 염색체 DNA 내에 도입될 수 있다. 핵산, 예를 들어 DNA는 세포에 도입되어 플라스미드 형태로 별개의 유전 물질로서 존재할 수 있다. 별법으로, 선형의 핵산은 세포에 도입되어 염색체 내에 도입될 수 있다. 핵산을 세포로 도입시킬 때, 염색체 내로 핵산이 도입되는 것을 촉진하는 시약이 첨가될 수 있다. 또한, 상기 도입을 촉진하는 데 유용한 DNA 서열이 DNA 분자에 포함될 수 있다. 별법으로, RNA가 세포 내에 투여될 수도 있다. 유전자 구조물을 중심체, 말단소립체 또는 복제 개시점(origin)을 포함하는 선형의 미니 염색체로 제공하는 것이 고려되고 있다.

본 발명의 유전자 구조물은 HCV 비구조 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 코딩 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자를 포함한다. 일부 바람직한 실시태양에서, 재조합 핵산 분자는 NS3을 코딩하는 뉴클레오티드 코딩 서열을 포함한다. 다른 바람직한 실시 태양에서, 재조합 핵산 분자는 NS4를 포함하는 HCV 비구조 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 코딩 서열을 포함한다. 다른 바람직한 실시 태양에서, 재 조합 핵산 분자는 NS5를 포함하는 HCV 비구조 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 코딩 서열을 포함한다. 다른 바람직한 실시 태양에서, 재조합 핵산 분자는 NS3, NS4 및 NS5를 포함하는 HCV 비구조 단백질의 모든 조합물을 코딩하는 뉴클레오티드 코딩 서열을 포함한다.

일부 바람직한 실시태양에서, 재조합 핵산 분자는 HCV NS3, NS4 또는 NS5 단백질의 단편 또는 이들의 조합물을 포함하는 HCV 비구조 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 코딩 서열을 포함한다. 단편은 대응하는 비구조 단백질의 10, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 950 또는 1000 개의 아미노산을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 단편은 단백질의 카르복시 말단, 아미노 말단 부분 또는 이들 사이 부분을 포함할 수 있다. 당업자는 HCV 비구조 단백질의 면역원성 단편 또는 비구조 단백질의 모든 조합의 면역원성 단편을 포함하는 융합 단백질을 충분히 제조할 수 있다. 따라서, HCV 비구조 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 코딩 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자는 백신의 효능에 큰 변화없이 전체 HCV 비구조 유전자 산물보다 작은 부분을 포함할 수 있다. 한 개 이상의 뉴클레오티드가 단백질의 아미노산 서열에 영향을 주지 않으면서 뉴클레오티드 코딩 서열을 치환될 수 있다. 또한, 다중 치환 및 한 개 이상의 보존 아미노산 치환이 HCV 비구조 단백질의 면역원 활성의 큰 감소 없이 단백질 전체에 걸쳐 만들어질 수 있다.

본 발명의 일부 실시 태양에서, 재조합 핵산 분자는 HCV 5'UTR의 마지막 9개 뉴클레오티드, HCV 5'UTR의 마지막 25개 뉴클레오티드, HCV 5'UTR의 마지막 50개 뉴클레오티드, HCV 5'UTR의 마지막 75개 뉴클레오티드, HCV 5'UTR의 마지막 100개 뉴클레오티드, HCV 5'UTR의 마지막 150개 뉴클레오티드, HCV 5'UTR의 마지막 200개 뉴클레오티드, HCV 5'UTR의 마지막 250개 뉴클레오티드 또는 HCV 5'UTR의 마지막 300개 뉴클레오티드를 포함하는 5'UTR의 단편을 포함한다. 일부 바람직한 실시 태양에서, 유전자 구조물은 전체 HCV 5'UTR을 포함한다. 일부 바람직한 실시 태양에서는, 유전자 구조물은 HCV 5'UTR의 9개의 3'뉴클레오티드를 포함한다. 바람직한 실시 태양에서 전체 HCV 5'UTR은 GCCAGCCCCCGATTGGGGGCGACACTCCACCATAGATC ACTCCCCTGTGAGGAACTACTGTCTTCACGCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTATGAGTGTCGTGCAGCCTCCAGGACCCCCCCTCCCGGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACACCGGAATTGCCAGGACGACCGGGTCCTTTCTTGGATCAACCCGCTCAATGCCTGGAGATTTGGGCGTGCCCCCGCGAGACTGCTAGCCGAGTAGTGTTGGGTCGCGAAAGGCCTTGTGGTACTGCCTGATAGGGTGCTTGCGAGTGCCCCGGGAGGTCTCGTAGACCGTGCACC(서열 2)이다.

DNA 분자의 유전자 발현에 필요한 조절 인자에는 프로모터, 개시 코돈, 종료 코돈 및 폴리아데닐화 시그날이 포함된다. 또한, 유전자 발현에 인핸서가 요구되는 경우도 있다. 이들 인자는 HCV 비구조 단백질을 코딩하는 서열에 작용 가능하게 연결되야 하며, 조절 인자는 투여될 개체에서 작용 가능해야 한다. 개시 코돈 및 종료 코돈은 일반적으로 HCV 비구조 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 일부로 간주된다.

이용되는 프로모터와 폴리아데닐화 시그날은 개체의 세포 내에서 기능적이어야한다. 단백질 생산을 최대화하기 위해서, 구조물이 투여될 세포 내에서 유전자 발현에 적합한 조절 서열을 선택해야 한다. 또한, 세포 내에서 가장 효율적으로 전사될 수 있는 코돈이 선택되어야 한다. 당업자라면 포유동물, 바람직하게는 사람 세포 내에서 기능을 하는 DNA 구조물을 제조할 수 있다.

본 발명을 실시하는 데, 특히 사람의 유전자 백신을 제조하는 데 유용한 프로모터에는, 이로 한정되는 것은 아니나, 시미안 바이러스 40(SV40), 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, 사람 면역 결핍 바이러스(HIV), 예를 들어 HIV 말단 반복 배열(LTR) 프로모터, 몰로니 바이러스, ALV, 사이토메갈로바이러스(CMV), 예를 들어 CMV 초기 매개 프로모터, 엡스타인 바 바이러스(EBV), 라우스 육종 바이러스(RSV) 및 사람 액틴, 사람 미오신, 사람 헤모글로빈, 사람 근육 크레아틴 및 사람 메탈로티오네인과 같은 사람 유전자의 프로모터를 예로 들 수 있다.

본발명의 실시, 특히 사람의 유전자 백신을 제조하는 데 있어서 유용한 폴리아데닐화 시그날에는, 이에 한정되는 것은 아니나, SV40 폴리아데닐화 시그날 및 LTR 폴리아데닐화 시그날을 예로 들 수 있다. 특히, SV40 폴리아데닐화 시그날은 pCEP4 플라스미드(Invitrogen, 미국 캘리포니아주 샌디애고 소재)내에 존재하는 SV40 폴리아데닐화 시그날을 사용하였다.

유전자 발현에 필요한 조절 인자 외에, 다른 인자가 유전자 구조물에 포함될 수 있다. 이같은 추가 인자에는 인핸서가 포함된다. 인핸서는 이로 한정되는 것은 아니나, 사람 액틴, 사람 미오신, 사람 헤모글로빈, 사람 근육 크레아틴 및 CMV, RSV 및 EBV에서 유래된 바이러스 인핸서를 포함하는 군에서 선택될 수 있다.

유전자 구조물을 염색체 외에 유지하고 세포 내에서 구조물의 다중 카피를 생산하기 위해서 유전자 구조물에 포유동물의 복제 개시점을 제공할 수 있다. 인비트로젠에서 구입한 플라스미드 pCEP4 및 pREP4는 엡스타인 바 바이러스 복제 개시점 및 염색체 내에 도입되지 않고 높은 카피수의 에피솜 복제를 하는 핵 항원 EBNA-1 코딩 부위를 포함하고 있다.

이에 한정되는 것은 아니나, 근육내, 복강내, 피내, 피하, 정맥내, 동맥내, 안내 및 구강 및 경피, 또는 흡입 또는 좌약식으로 투여될 수 있다. 바람직한 투여 경로는 근육내, 복강내, 피내 및 피하 주사이다. HCV 비구조 단백질을 코딩하는 유전자 구조물의 전달은 구조물이 점막 면역 관련 조직에 제시되는 투여 방식으로 면역화될 개체에게 점막 면역을 제공한다. 따라서, 일부 예에서 유전자 구조물은 개체의 구강 내 협강내 투여로 전달된다.

유전자 구조물은, 이에 한정되는 것은 아니나, 전통적인 주사, 무바늘(needless) 주사 기구 또는 "미세주사 충격 유전자 주입기"를 포함하는 방법으로 투여될 수 있다. 별법으로, 여러가지 방법으로 유전자 백신은 개체로부터 분리된 세포에 도입될 수 있다. 이들 방법에는, 예를 들어 생체 외(ex vivo) 트랜스펙션, 일렉트로포레이숀, 미세주입법 및 미세주사 충격법이 포함된다. 유전자 구조물이 세포에 도입된 후, 개체에게 이식된다. 백신 투여된 세포가 원래 다른 개체로부터 유래되었다 하더라도, 유전자 구조물이 도입된 비면역원성 세포는 개체에게 이식될 수 있다.

본 발명의 일부 실시 태양에서는, 무바늘 주사 기구를 이용하여 유전자 구조물을 개체에게 투여한다. 본 발명의 일부 실시 태양에서는 무바늘 주사 기구를 이 용하여 피내, 피하 및 근육내로 유전자 구조물을 동시에 투여한다. 무바늘 주사 기구는 잘 알려져 있으며 널리 이용가능하다. 당업자는 본원의 지시에 따라 개체의 세포에 유전자 물질을 전달하기 위해 무바늘 주사 기구를 사용할 수 있다. 무바늘 주사 기구는 유전 물질을 모든 조직에 전달하기에 적합하다. 특히 유전 물질을 피부 및 근육 세포에 전달하기에 유용하다. 일부 실시 태양에서, 무바늘 주사 기구는 개체의 피부 표면에 DNA 분자를 포함하는 액체를 주입하는 데 유용하다. 액체는 충분한 속도로 주입되어 피부와 닿을 때 피부 표면을 통과하고 피부 및 피하의 근육 조직으로 스며든다. 따라서, 유전 물질은 피내, 피하 및 근내로 동시 투여된다. 일부 실시 태양에서, 무바늘 주사 기구는 다른 기관의 세포에 핵산 분자를 도입시키기 위해서 그 기관의 조직에 유전자 물질을 전달하는 데 사용될 수 있다.

본 발명의 유전자 백신은 약 1 나노그램 내지 약 1000 마이크로그램의 핵산, 바람직하게는 DNA를 포함한다. 일부 바람직한 실시 태양에서, 백신은 약 10 나노그램 내지 약 800 마이크로그램의 핵산을 포함한다. 일부 바람직한 실시 태양에서, 백신은 약 0.1 내지 약 500 마이크로그램의 핵산을 포함한다. 일부 바람직한 실시 태양에서, 백신은 약 1 내지 약 350 마이크로그램의 핵산을 포함한다. 일부 바람직한 실시 태양에서, 백신은 약 25 내지 약 250 마이크로그램의 핵산을 포함한다. 일부 바람직한 실시 태양에서, 백신은 약 100 마이크로그램의 핵산을 포함한다. 당업자는 원하는 양의 핵산을 포함하는 백신을 용이하게 제조할 수 있다.

본 발명의 유전자 백신은 사용될 투여 형태에 따라 제제화된다. 당업자는 유전자 구조물을 포함하는 제약 조성물을 용이하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 제약 조성물은 NS3, NS4 또는 NS5 또는 이들의 조합을 코딩하는 단일 유전자 구조물을 포함한다. 별법으로, 본 발명의 제약 조성물은 NS3, NS4 또는 NS5 또는 이들의 조합을 코딩하는 다수의 유전자 구조물을 포함한다. 또한, 본 발명의 제약 조성물은 NS3, NS4 또는 NS5의 단편 또는 이들의 조합을 코딩하는 단일 또는 다수의 유전자 구조물을 포함한다. 또한, 본 발명의 제약 조성물은 NS3, NS4 또는 NS5 단백질의 전체 또는 단편의 융합 단백질을 코딩하는 단일 유전자 구조물을 포함한다. 일부 경우에는, 등장 제제가 사용된다. 일반적으로, 등장성을 위한 첨가물에는 염화나트륨, 덱스트로오스, 만니톨, 소르비톨 및 락토오스를 포함할 수 있다. 경우에 따라 인산 완충 식염수와 같은 등장 용액이 바람직하다. 안정화제에는 젤라틴 및 알부민이 포함된다. 일부 실시 태양에서, 혈관 수축제가 제제에 첨가된다. 본 발명의 제약 제제는 멸균 상태 및 무발열원 상태로 제공된다.

본 발명의 유전자 구조물은 "촉진제"라는, 동일한 유전자 백신을 투여시에 사용하지 않을 경우보다 이를 사용시에 세포에 의한 유전자 구조물의 수용 및(또는) 발현을 증가시키는 물질과 함께 제제화되거나 투여될 수 있다. 유전자 구조물와 함께 투여되는 상기의 물질 및 그의 투여 방법이 미국 특허 제 5,830,876호, 제 5,593,972호, 제 5,739,118호 및 1994.1.26자로 출원된 PCT 특허 출원 제 PCT/US94/00899호에 개시되어 있다. 상기 제제에는 CaPO₄, DEAE 덱스트란, 음이온 지질, 세포외 기질-활성 효소, 사포닌, 렉틴, 에스트로겐 화합물 및 스테로이드 호 르몬, 히드록실화된 저급 알킬, 디메틸 설폭시드(DMSO), 우레아 및 벤조산 에스테르 아닐리드, 아미딘, 우레탄 및 이들의 염산염, 예를 들어 국부 마취제의 염산염이 있다. 또한 유전자 구조물은 지질/다가 양이온 복합체 내에 캡슐화되어 함께 투여된다. 바람직한 촉진제는 부피비카인이다. 조성물은 단위 투여 형태로 편리하게 투여될 수 있으며 제약계에 공지된 예를 들어 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Pub. Co., Easton, PA, 1980)]에 개시된 방법으로 제조될 수 있다.

하기에서 제시될 실시예에서, HCV의 3가지 다른 비구조 단백질을 코딩하는 플라스미드를 이용한 DNA계 백신 처리는 두가지 면역계에서 강한 항원 특이적 면역 반응을 유발시킨다. 세차례의 면역처리 후에 모든 동물에서 검출 가능한 항체 반응을 발생하였다. 이와 관련하여, HCV의 중핵 구조 단백질을 이용한 선행 연구와 비교해 볼 때 이들 비구조 단백질은 훨씬 우수한 항원이다[Tokushige, et al., Hepatology, 1996, 24, 14-20; 및 Geissler, et al., J. Immunol., 1997, 158, 1231-1237]. 바람직한 실시 태양에서, 비구조 단백질에 대한 체액성 면역 반응은 항원 제시 세포를 활성화 시키는 화합물, 예를 들어 IL-2 및 GM-CSF와 같은 사이토카인 발현 플라스미드의 첨가로 상승될 수 있다[Geissler, et al., J. Immunol., 1997, 158, 1231-1237; 및 Xiang, Immunity, 1995, 2, 129-135]. NS3, NS4 및 NS5를 코딩하는 세가지 플라스미드는 모두 우성의 T_H1 표현형의 CD4+ T-세포 염증 반응을 유발하였음이 증명되었다. 또한, 강한 특이적 CD8+ CTL 반응은 이전에 동 물 모델 시스템에서 여러가지 병원균에 대해 방어를 유도한다고 밝혀진 용해 값을 생성시키는 NS3 및 NS5 경우에 특히 유발되었다[Tascon, et al., Na. Med., 1996, 2, 888-892; 및 Huygen, et al., Nat. Med., 1996, 2, 893-898]. 또한, DNA계 돌연변이에 의해서 유도되는 CTL 반응이 NS5 단백질을 코딩하는 cDNA로 안정하게 트랜스펙션된 동계의 SP2/0 종양 세포를 이용하여 동물의 종양 형성을 방어하는 지를 조사하였다. 약 60% 마우스에서 종양 형성이 방지되었으며 이것은 이 면역 처리법에 의해서 생체 내에서 높은 수준의 CTL 활성이 유도되었음을 나타낸다. 또한, 모의 DNA 또는 재조합 NS5 단백질로 면역화된 경우에 비해, 종양이 발생한 동물의 종양 중량이 크게 감소되었다. 또한, 이 모델은 종양 성장의 억제가 측정된 동물 모델에서 플라비바이러스 비구조 단백질에 대한 고수준의 세포 면역 반응을 측정할 수 있음을 증명한다.

본원에 개시된 결과는 본원에서 기재된 바와 같이 HCV 비구조 단백질을 코딩하는 유전자 구조물을 이용한 DNA계 면역법이 HCV 보유 개체의 치료 및 HCV 예방 백신에 유용하다는 것을 보여준다.

또한, 본 발명을 증명하기 위해 다음 실시예를 통해 본 발명이 예시될 것이다. 이들 실시예는 의도된 것이 아니며 개시의 범주에 한정되도록 해석되지 않을 것이다.

실시예 1 : HCV 발현 벡터의 고안 및 제작

CMV-프로모터 및 RSV 인핸서에 의해 유도되는 발현 플라스미드(pApO31)에 개시 및 종료 코돈을 도입하여 각각의 비구조 단백질을 코딩하는 유전자를 클로닝하 였다. 또한, 선택 마커를 포함하는 발현 벡터(pcDNA3)를 사용하여 안정하게 트랜스펙션된 SP2/0 세포주(도 1a)를 제조하였다.

바이러스 유전자 공급원으로서, HCV의 전장 ORF를 포함하는 pBRTM/HCV1로 명명된 플라스미드를 사용하여 본 발명의 발현 벡터에 클로닝하였다.[Grakoui, et al., J. Virol., 1993, 67, 1385-1395]. 별법으로, HCV를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 젠뱅크 승인 번호 X61596 및 D16435에서 얻을 수 있다. 개시 및 종료 코돈 및 다음 프라이머를 이용한 제한 효소 부위를 삽입한 후, 구조물 pApO31-NS3, pApO31-NS4 및 pApO31-NS5를 PCR 클로닝하였다; NS3 경우: 5'-GGTCTAGATTGATGGCGC CCATCACGGC-3'(XbaI)(서열 3), 5'-CACACGCGTTCACGTGACGACCTCCAGGT-3'(Mlu I) (서열 4), NS 4 경우: 5'-GGTCTAGATGAGCACCTGGGTGCTC-3'(XbaI)(서열 5),5'-CCAGGATCCTC AGCATGGAGTGGTACA-3-(BamHI)(서열 6), 및 NS5 경우: 5'-TCAGTCTAGAATGTCCGGCTCCG GCTCCTGGCTAAGGGA-3'(XbaI)(서열 7), 5'-AGCTACGCGTTCACCGGTTGGGGAGGAGGT-3'(Mlu I)(서열 8). 높은 신뢰도의 PCR 시스템(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)을 이용하여 PCR 증폭시킨 후, cDNA 단편을 RSV 인핸서 인자를 포함하며 CMV 프로모터에 의해 유도되는 플라스미드 발현 벡터 pApO3(Apollon, Malvern, PA)에 삽입하였다. 구조물을 DH5α에서 배양하고 2 × 염화 세슘 원심분리 또는 엔도프리 완충액 시스템을 이용하는 Qiagen Giga Kit(Santa Clara, CA)를 이용하여 플라스미드 DNA를 정제하였다. 표준 방법을 이용한 서열 분석법으로 비구조 유전자 삽입체를 확인하였다.

CTL-분석법의 표적 세포로서 안정한 NS3, NS4 및 NS5 발현 세포주를 확립하 기 위해, 비구조 단백질 코딩 유전자 단편을 네오마이신 선택 마커를 갖는 pcDNA3 및 pcDNA3.1/Zeo(-) 발현 벡터(Invitrogen, San Diego)에 클로닝하였다. 우선, NS3 및 NS5의 XbaI 및 MluI 단편을 리트머스-38 벡터(New England Biolabs, MA)의 NheI/MluI 부위에 서브클로닝하고 EcoRI 및 SalI로 절단하여 각각 pcDNA3 및 pcDNA3.1/Zeo(-)의 EcoRI/XhoI 다중 클로닝 부위에 다시 라이게이션시켰다. NS4를 포함하는 XbaI 및 BamHI 단편을 리트머스-20(New England Biolabs)에 다시 라이게이션시켜 KpnI 및 EcoRI으로 절단하고, 이어서 pcDNA3 벡터에 라이게이션시켰다. 플라스미드를 pcDNA3-NS3, pcDNA3-NS4 및 pcDNA3.1/Zeo(1)-NS5로 명명하였다.

HCV 비구조 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 보유하는 당업자라면 본 발명의 유전자 구조물을 제조하기 위한 프라이머를 고안할 수 있다. 또한, 뉴클레오티드 염기 치환은 프라이머의 결합에 영향을 주지 않도록 제작될 수 있다. 또한, 당업자에게 공지된 바와 같이, 프라이머는 클로닝 및 라이게이션을 위한 엔도뉴클리아제 제한 부위를 이용하여 프라이머를 제조할 수 있다. 따라서, 당업자는 알맞은 프라이머를 고안하고 PCR 증폭을 수행하여 본 발명의 모든 유전자 구조물을 제조할 수 있다. PCR 생성물은 발현 벡터에 라이게이션될 수 있다.

상기에서 기재된 HCV 비구조 단백질의 뉴클레오티드 코딩 서열을 포함하는 플라스미드는 각각 CMV 프로모터 및 RSV 인핸서 인자의 전사 조절 하에 위치한 HCV 비구조 단백질의 뉴클레오티드 코딩 부위를 포함한다.

실시예 2: 시험관 내 발현

플라스미드 구조물의 유전자 삽입체의 염기서열을 분석하였고, 일시적 트랜 스펙션 후에는 HuH-7 세포 및 안정하게 트랜스펙션시킨 후에는 SP2/0 표적 세포에서 각각 단백질 발현을 시험관 내에서 확인하였다. NS3의 약 70 kD, NS4의 약 30 kD 및 NS5의 125 kD의 단백질 밴드가 세포내에서 발현되었으나 배양액으로 분비되지 않았음이 확인되었다(도 1b).

HCV 비구조 단백질의 발현 수준을 측정하기 위해 인산 칼슘 방법을 이용하여 여러가지 구조물로 HuH-7 사람 간암 세포주를 일시적으로 트랜스펙션시켰다. 간략히, ³⁵S-메티오닌 및 시스테인으로 4 시간 동안 대사 표지시킨 후 세포 용해액을 변형된 RIPA 완충액(0.15 M NaCl, 1% NP-40, 50 mM Tris, 0.5% DOC 및 1% SDS)에 제조하였다. 세포 용해액을 말 혈청으로 전처리하고 폴리클로날 항혈청 WU 110(NS3), W 148/151(NS4) 및 WU 115(NS5)로 밤새 예비인큐베이션시켜 세파로스 A에 결합하도록 하였다[Grakoui, et al., J. Virol., 1993, 67, 1385-1395]. SDS-PAGE로 단백질을 분리시킨 후, 겔을 건조시켜 방사선 촬영하였다. 또한 NS5 단백질 발현은 쥐의 mAb(Biogenesis, Sandown, NH)를 이용하여 웨스턴 블롯 및 면역형광분석법을 이용하여 확인하였다. NS3, NS4 및 NS5를 발현하는 안정적으로 트랜스펙션된 세포주를 얻기 위해서, 동종의 BALB/c 마우스 골수종 유도된 세포주 SP2/0을 목적하는 바이러스 유전자 삽입체를 포함하는 pcDNA3 플라스미드로 일렉트로포레이션에 의해 트랜스펙션시켰다 G418 선택 조건 하에서 성장하는 세포를 제한 희석(0.3 세포/웰)하여 클로닝하고, 상기에 기술한 방법으로 스크리닝하였다.

네오마이신 또는 제오마이신 내성 유전자를 각각 포함하는 pcD3 및 pcD3.1 플라스미드를 HCV 비구조 유전자 클로닝 및 안정한 동종의 표적 세포주 생산에 이용하였다. 이들 구조물로 HuH-7 세포를 일시적으로 트랜스펙션시키고 베타-갈락토시다제 측정법으로 트랜스펙션 효율을 조절한 후, 세포를 메티오닌 및 시스테인 무첨가 배지에서 30분간 영양 결핍시킨 후 ³⁵S-메티오닌 및 시스테인으로 4시간 동안 표지하였다. 세포 용해액을 비구조 단백질에 특이적인 폴리클로날 토끼 혈청으로 면역 침전시켜 세파로스 A 비드로 분리하고 SDS-PAGE로 분석하여 방사선 촬영하였다. 레인 1, 3 및 5는 모의 DNA로 트랜스펙션된 세포이며 음성 대조군이다(Mock). 레인 2, 4 및 6은 NS3의 약 70 kD, NS4의 약 30 kD 및 NS5의 125 kD의 특정 밴드를 보여준다. (레인 7-10): SP2/0 세포는 NS3, NS4 및 NS5의 유전자를 포함하는 pcD3계 구조물로 트랜스펙션되었다. 항생제로 선별한 후, 세포를 제한 희석(0.3 세포/웰)에 의해 클로닝하여 배양한 후, 상기에 기술한 바와 같이 NS3의 경우 방사능 표지법 및 면역침전법 또는 NS5의 경우 웨스턴 블롯으로 분석하였다. 레인 7 및 9는 음성 대조군(SP2-19)으로서 HCV-중핵 단백질을 안정하게 발현하는 세포의 세포 용해액을 나타내며, 레인 8 및 10은 NS3 및 NS5의 특이적 발현을 나타낸다. 이들 세포를 시험관 내 자극 및 CTL 분석법의 표적 세포로 사용하였다.

실시예 3: 면역화 방법

암컷 BALB/c(h-2d) 마우스를 매사추세츠주 종합병원의 동물 시설의 표준 무병원균 조건 하에 보관하였다. 마우스는 Charles River Laboratories(Wilmington, MA)로부터 구입하였으며 생체 내 연구에 20주령의 마우스를 사용하였다. 0.9% NaCl 100 ㎕ 내의 플라스미드 DNA 총 100 ㎍을 마우스의 대퇴 근육에 5 개의 다른 부위에 2회 및 3회 주사하였다. 부스터 주사를 매 14일 간격으로 반대 다리에 주사하였다. 모든 면역학 실험에서 양성 대조군으로 CFA 내의 재조합 NS3, NS4 및 NS5 비구조 단백질(Mikrogen, Munich) 5 ㎍을 제 0일에 복강내 주사 하고 4 주 및 8 주 후에 0.05% SDS 내의 동일량의 단백질로 부스팅하였다. 이 실험에서 음성 대조군으로 삽입되지 않은 플라스미드 벡터 및 재조합 B형 간염 표면 항원 (HbsAg) (Energix, Smith Kline Beecham, Philadelphia)을 이용하였다. 모든 마우스는 마지막 면역처리 10일 후에 희생시켰다.

실시예 4: 체액성 면역 반응 측정

확립된 ELISA 법을 이용하여 면역화된 각각의 동물의 혈청에서 항-NS3, NS4 및 NS5 항체의 수준을 측정하였다. 간단하게, 마이크로타이터 플레이트 (Falcon, Micro-test IIIM Flexible Assay Plate)를 상기에 기술한 재조합 단백질로 4℃에서 밤새 코팅하였다(0.5 ㎍/웰). 소 태아 혈장(FBS)으로 20℃에서 2시간 동안 블로킹시킨 후, 마우스 혈청의 1:50 희석액을 플레이트에 첨가하고 20℃에서 1시간 동안 추가로 인큐베이션하였다. 0.05% Tween-20을 포함하는 인산 완충 식염수로 4회 세척한 후에 호스래디쉬 퍼옥시다제 표지된 항-마우스 항체(Amersham, Arlington Heights, IL)를 1:2000 희석도로 가하였다. 1시간 동안 인큐베이션한 후 플레이트를 세척하고 발색 기질을 첨가하고 자동 판독기로 판독하였다.

세 번의 면역처리 후에 결합 효소면역흡착검사법(ELISA)을 이용하여 면역화된 모든 동물에서 3가지 비구조 단백질에 대한 특이적 항체 반응을 확인하였다. 모의 DNA로 면역화된 마우스에서는 항원 특이 면역 반응이 발견되지 않았다(도 2a). 양성 대조군으로 재조합 NS3, NS4 및 NS5 비구조 단백질을 프로인드 완전 보조액과 혼합하여 마우스의 복강내로 세차례 접종하였고, 예상한 바와 같이 강한 체액성 면역 반응이 증명되었다(자료 미제시).

도 2a는 DNA계 면역법에 의해 생성된 NS3, NS4 및 NS5에 대한 체액성 면역 반응을 보여준다. 혈청 항체 수준을 ELISA(각 군: n=5)로 측정하였다. BSA로 코팅된 웰 및 모의 DNA로 면역화된 마우스의 혈청을 대조군으로 이용하였다. 양성 대조군 마우스를 재조합 단백질의 복강내 투여로 면역화시켰다(자료 미제시). 도 2b는 특이적 또는 비특이적 재조합 단백질을 사용한 시험관 내 자극 3일 후에 측정된 T-세포 증식을 보여준다. H³-티민과 함께 18시간 동안 인큐베이션한 후 세포를 회수하였다. △cpm은 기본 활성(예를 들어, 항원 없이 인큐베이션한 경우)를 빼서 결정하였다. 재조합 NS3 단백질 1 ㎍과 함께 실시한 인큐베이션은 유독하여, 증식이 확인되지 않았다. CFA와 함께 재조합 단백질로 면역화된 마우스는 5 내지 10 배 더 높은 반응을 보였다(자료 미제시).

실시예 5: 림프증식 및 사이토카인 분비 분석법

마우스를 이소플루란(Aerrane, Anaquest, NJ)로 마취하고 비장 세포를 회수하였다. 0.83% NH₄Cl/0.17 M Tris(pH 7.4)내에서 25℃에서 5분간 인큐베이션하여 적혈구를 제거하였다. 비장 세포를 2회 세척하고 10% FBS 및 2-머캅토에탄올을 포함하는 완전 DMEM(Mediatech, Washington, DC) 200 ㎕ 내에 5×10⁵ 세포/웰의 농도 로 각 시료 당 세 개씩 96 웰 플레이트를 이용하여 배양하였다. 다른 농도(0, 0.01 및 1 ㎍/㎖)의 재조합 비구조 단백질(NS3, NS4 및 NS5)(Mikrogen, Munich)로 세포를 자극하였다. 음성 대조군으로, 같은 농도의 재조합 HCV-중핵 또는 HbsAg 단백질(Energix)로 이펙터 세포를 자극하였다. 3일간 자극한 후에 ³H-티민(1 μCi/웰)을 첨가하였다. 세포를 18시간 동안 추가로 인큐베이션하고 나서 회수하여 DNA에 결합된 ³H-티민을 정량하였다. 기본 활성(△cpm)에 의한 방사능의 결합을 수정하였다. 사이토카인 분비를 측정하기 위해서, 이펙터 세포를 상기에 기술한 바와 같이 배양하여 배양 상등액에서 상업적 키트(Endogen, Boston, MA)를 이용하여 제조자의 지시에 따라 Il-2, IL-4 및 인터페론-γ 수준을 측정하였다.

비구조 단백질에 대한 세포-매개 면역 반응을 조사하기 위해서, 비장 세포를 회수하여 재조합 항원 또는 시험관 내에서 안정하게 트랜스펙션된 세포주에 의해 발현되는 항원으로 재자극하였다. [³H] 티민 결합에 의해 측정된 바와 같이 상당한 림프구 증식이 다른 항원 농도의 모든 비구조 단백질에 의해 유도되었다(도 2b). 최대 자극을 발생시키는 방법으로서 재조합 단백질의 복강내 면역처리는 세가지 단백질에 대해 5 내지 10 배 높은 림프구 증식율을 보였다(자료 미제시). DNA계 면역처리 후의 사이토카인의 측정 결과는 세포 배양액으로 분비된 높은 수준의 IFN-y(도 2c) 및 IL-2(도 2d)로 고전의 T1 반응을 증명해준다. 반면, HCV 비구조 단백질을 코딩하는 유전자를 이용한 유전자 면역처리 후에는 IL-4의 생성이 확인되지 않았다(도 2e).

도 2c, 2d 및 2e는 시험관 내 자극하고 48시간 후에 측정된 상등액으로 분비된 사이토카인을 나타낸다. NS3, NS4 및 NS5를 코딩하는 모든 DNA 구조물은 T_H1-타입의 사이토카인 분비 형태를 유도하였다. 비교를 위해 재조합 단백질로 마우스를 세차례 복강내 면역화(n=4)한 결과를 보였다. 음성 대조군으로 마우스를 재조합 HbsAg로 면역처리하였다.

실시예 6: 세포독성 T-림프구 활성

10% FCS 및 2-메캅토에탄올(5×10^-5M)을 포함하는 완전 DMEM 내에 면역화된 마우스의 비장 세포를 부유시키고 시험관 내 자극 5일 후에 세포 독성 활성을 분석하였다. 재조합 쥐 IL-2를 5 U/㎖ 농도로 한번 첨가하고, 전장의 NS3 또는 NS5 단백질을 안정하게 발현하는, 조사된(10,000rad) 동계의 2×10⁶ SP2/0 세포(SP2/NS3-3, SP2/NS5-21)와 함께 반응 세포(4×10⁷)를 배양하였다. 5일 후에 세포 독성의 이펙터 림프구군을 회수하고 4시간 ⁵¹Cr-표지된 Sp2/NS3-3 또는 SP2/NS5-21을 이용하여 96웰 플레이트에서 4시간 ⁵¹Cr-방출 분석법을 실시하였다. HCV 중핵 단백질을 발현하는 부모 SP2/0 또는 SP2-19를 용해 및 기본 활성의 항원 특이성을 위한 대조군으로 이용하였다. 각각 100:1, 30:1, 10:1 및 3:1의 림프구 이펙터와 표적(E:T)비로 CTL 활성 분석법을 실시하였다. 항-CD4+ 또는 CD+8 mAb를 포함하는 하이브리도마 상등액 GK 1.5(항-CD4, 랫트); 3.155(항-CD8, 랫트)와 이펙터 세포를 4℃에서 30분간 인큐베이션하고, 세척한 후 37℃에서 보체(낮은 독성의 토끼 보체 (Cedarlane Laboratories, Ontario, Canada)1:5 희석)와 인큐베이션시켜 T 세포 고갈 실험하였다.

감염된 세포에서 바이러스 제거에 CTL 반응이 필수적이기 때문에, 안정하게 트랜스펙션되어 NS3 및 NS5 단백질을 발현하는 동계의 SP2/0 쥐의 골수종 표적 세포에 대한 면역화된 마우스의 비장세포의 용해능을 ⁵¹Cr-방출 분석법으로 분석하였다. NS3 및 NS5로 면역화된 마우스는 시험관 내 자극 5일 후에 강한 특이적 세포 독성 T-세포 반응을 보인 반면, 표적 세포 특이성을 위한 대조군으로 이용된 SP2/0 또는 SP2-19에 대해 낮은 활성이 관찰되었다(도 3a 및 3b). 특이적 용해를 보이는 세포의 표현형을 증명하기 위해 비장 세포를 보체 존재 하에서 CD8+ 또는 CD4+ 반응의 모노클로날 항체(mAbs)와 인큐베이션하였다. 세포 독성 활성은 CD8+ 세포에 의해 매개되었다(도3c). 본 발명자는 NS4 단백질을 안정적으로 발현하는 SP2/0 세포주를 확립시킬 수 없었기 때문에 HCV 비구조 단백질에 대한 CTL 활성을 측정할 수 없었다.

도 3은 이펙터 대 표적 세포 다른 비에서 NS3(A) 및 NS5(B)에 대한 세포 독성 T-세포(CTL) 반응을 보여준다. 안정하게 NS3 및 NS5를 발현하는, 조사된 마우스 골수종 세포(n=5)를 비장세포와 5일 동안 시험관 내에서 인큐베이션하였다. 이어서, 안정하게 트랜스펙션된 표적 세포주에 대해서 4시간 Cr⁵¹ 방출 분석법으로 CTL 활성을 측정하였다. 비용해 값을 알기 위해 SP2/0 또는 SP2-19(HCV 중핵 발현)의 기본 활성을 빼주었다. 도 3c는 T-세포 고갈 실험에서 세포를 항-CD8+ 또는 항-CD4+ mAb와 얼음에서 30분간 인큐베이션시키고 보체와 37℃에서 30분간 인큐베이션시킨 것을 보여준다. 대조군 세포는 항-CD8+ 또는 항-CD4+ mAb 없이 인큐베이션하였다. HCV 중핵 발현 구조물로 안정하게 트랜스펙션된, 무관한 음성 대조 세포주인 SP2-19에 대해 기본 활성을 측정하였다.

실시예 7: 세포내 세포독성의 T-림프구 활성의 측정

지금까지 아무도 CTL 활성에 사용되는 비구조 단백질을 발현하는 안정한 세포주를 확립시킬수 없었기 때문에 CTL 실험을 하기가 매우 어려웠다. 마우스를 모의 DNA 또는 pApNS5 벡터로 세차례 근육내로 면역화하였다. 일부 동물은 재조합 NS5 또는 둘의 조합으로 복강내로 면역화하였다. 재조합 단백질(5 ㎍ 복강내)로 HCV-NS5a 및 HCV-NS5b 부위(NS5 전체 길이의 약 50%)를 포함하는 NS5-4(aa 2622-2868) 및 NS5-12(aa 2007-2268) 이. 콜라이 발현 단백질(Mikrogen, Munich, Germany)의 혼합물을 이용하였다. 여러가지 플라스미드 구조물 또는 재조합 단백질로 마지막 면역 1주일 후에, NS5를 안정하게 발현하는 2 × 10⁶ 동계의 SP2/0 유래 세포를 세척하고 200 ㎕ PBS에 부유시켜 오른쪽 옆구리에 피하주사하였다. SP2/0 세포는 HCV NS5(SP/NS5-21) 또는 HCV 중핵 단백질 SP2/19를 발현하였다. 이 동물 모델에서, 접종 15일 후에 종양 형성을 측정하였고 종양이 형성된 동물의 수 및 종양 중량을 측정하였다.

모의 DNA로 면역화되고 NS5 발현하는 쥐 골수종 세포주(SP2/Ns5-21)로 처리된 마우스의 40% 만이 15일 후에 종양을 형성하였다. 또한, 모의 DNA 또는 재조합 NS5 단백질로 면역화된 마우스 또는 대조군으로서 다른 HCV 구조 단백질(HCV 중핵)을 발현하는 동일한 동계의 SP2/0 세포주로 면역화된 마우스와 비교해 볼 때, 측정된 종양의 중량으로 측정된 종양 크기는 작았다(도 4a 및 4b). 실제로, 모의 DNA로 면역화된 또는 SP2-19 세포로 처리된 마우스의 90 내지 100%는 종양 형성을 보였으며 이는 이 작은 동물 종양 모델에서 CTL 활성의 특이성을 증명하는 것이다. CFA 내의 재조합 NS5 단백질을 이용한 면역법은 동물의 종양 형성을 방지하지 못한다는 사실이 강조된다. DNA계 면역법 및 재조합 단백질을 이용한 백신 투여의 동시 효과를 측정하기 위해서, 한 군의 동물을 두가지 모두로 면역화하였다. 종양 형성이 부분적으로 방지되었으나, 이 방법은 NS5 단백질을 코딩하는 DNA로 세차례 면역화된 동물에서 만큼 효과적이지는 않았다(도 4a).

도 4a는 CTL 활성을 측정하기 위한 종양 모델에서 얻어진 결과를 보여준다. 마우스는 pApNS5 또는 모의 DNA(100 ㎍)로 근육내 또는 재조합 NS5 단백질(5 ㎍)로 복강내로 세차례 면역화하였다. 마지막 군은 DNA-면역법 및 재조합 단백질을 동시에 처리 받았다. SP2NS5-21 또는 SP2-10 세포로 종양을 처리하고 15일 후에 종양이 발전된 마우스의 수를 세고 종양 중량을 측정하였다. 도 4b는 왼쪽에서부터 모의 DNA로 면역화하고 SP2/NS5-21 세포를 처리한 동물, pApNS5로 면역화하고 SP2-19 세포(HCV 중핵을 안정하게 발현)를 처리한 동물, 재조합 NS5 단백질로 세차례 복강내 면역화하고 SP2/NS5-21 세포를 처리한 동물이다. pApNS5로 면역화하고 NS5를 안정하게 발현하는 쥐 골수종 세포주로 처리한 두번째를 제외한, 첫번째, 세번째 및 네번째 동물은 오른쪽 옆구리에 큰 종양을 형성하였다.

본 발명은 특히 개시된 DNA 서열을 포함하는 C형 간염 바이러스 비구조 단백질을 포함하는 핵산 분자를 개시하고 있다. 재조합 핵산 유전자 구조물에 의해 코딩되는 단백질은 개체의 세포에서 발현되고, 항-HCV 면역 반응을 유발하는 면역원성의 표적으로 작용한다. 유발되는 면역 반응은 광범위하고, 체액성 면역 반응 뿐 아니라 세포성 면역 반응도 유발된다.

SEQUENCE LISTING <110> Wands, Jack R. Encke, Jens <120> GENETIC IMMUNIZATION WITH NONSTRUCTURAL PROTEINS OF HEPATITIS C VIRUS <130> mgh-0002 <140> Not Yet Assigned <141> 1999-01-28 <150> 60/073,156 <151> 1998-01-30 <160> 8 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic sequence <400> 1 gccgccatg 9 <210> 2 <211> 341 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic sequence <400> 2 gccagccccc gattgggggc gacactccac catagatcac tcccctgtga ggaactactg 60 tcttcacgca gaaagcgtct agccatggcg ttagtatgag tgtcgtgcag cctccaggac 120 cccccctccc gggagagcca tagtggtctg cggaaccggt gagtacaccg gaattgccag 180 gacgaccggg tcctttcttg gatcaacccg ctcaatgcct ggagatttgg gcgtgccccc 240 gcgagactgc tagccgagta gtgttgggtc gcgaaaggcc ttgtggtact gcctgatagg 300 gtgcttgcga gtgccccggg aggtctcgta gaccgtgcac c 341 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic sequence <400> 3 ggtctagatt gatggcgccc atcacggc 28 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic sequence <400> 4 cacacgcgtt cacgtgacga cctccaggt 29 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic sequence <400> 5 ggtctagatg agcacctggg tgctc 25 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic sequence <400> 6 ccaggatcct cagcatggag tggtaca 27 <210> 7 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic sequence <400> 7 tcagtctaga atgtccggct ccggctcctg gctaaggga 39 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic sequence <400> 8 agctacgcgt tcaccggttg gggaggaggt 30

Claims

프로모터, 인핸서, 폴리아데닐화 서열 및 5' 비번역 영역 (5'UTR)을 포함하는 조절 인자에 작용 가능하게 연결된, C형 간염 바이러스 비구조 단백질 NS3, NS4 및 NS5를 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 재조합 핵산 분자.
제1항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열이 NS3, NS4 또는 NS5 또는 이들의 조합을 코딩하는 융합 단백질을 코딩하는 재조합 핵산 분자.
제1항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열이 사람 세포에서 기능하는 조절 인자에 작용 가능하게 연결된 것인 재조합 핵산 분자.
제1항에 있어서, 상기 프로모터가 사이토메갈로 바이러스 프로모터이고 인핸서가 라우스 육종 바이러스 인핸서인 재조합 핵산 분자.
제1항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 숙주 세포.