JP2002501737A - Ｃ型肝炎ウイルスの非構造蛋白質による遺伝的免疫感作 - Google Patents

Ｃ型肝炎ウイルスの非構造蛋白質による遺伝的免疫感作

Info

Publication number
JP2002501737A
JP2002501737A JP2000529347A JP2000529347A JP2002501737A JP 2002501737 A JP2002501737 A JP 2002501737A JP 2000529347 A JP2000529347 A JP 2000529347A JP 2000529347 A JP2000529347 A JP 2000529347A JP 2002501737 A JP2002501737 A JP 2002501737A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
virus
hepatitis
nucleic acid
pharmaceutical composition
enhancer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
JP2000529347A
Other languages
English (en)
Inventor
ワンズ，ジャック
エンケ，ジェンス
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
General Hospital Corp
Original Assignee
General Hospital Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by General Hospital Corp filed Critical General Hospital Corp
Publication of JP2002501737A publication Critical patent/JP2002501737A/ja
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/29—Hepatitis virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
    • C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

(57)【要約】 具体的に開示されたＤＮＡ配列を含むＣ型肝炎ウイルス非構造蛋白質を含む核酸分子が開示される。ヒト細胞内で機能する制御因子と作動可能に連結されたＮＳ３、ＮＳ４、又はＮＳ５、又はその組み合わせをコードするヌクレオチド配列を含むＣ型肝炎非構造蛋白質を包含する核酸配列を含む医薬組成物が開示される。これら医薬組成物を投与することを含む、Ｃ型肝炎ウイルスに感受性又は感染した個体を免疫する方法が開示される。

Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】 発明の分野 本発明は組換え体核酸分子、及び該分子を含み、例えば遺伝的免疫感作プロト
コールに於ける抗Ｃ型肝炎ウイルスワクチン成分として有用な医薬組成物、Ｃ型
肝炎ウイルス感染に対する免疫応答を誘導する方法、及びＣ型肝炎ウイルス感染
患者の治療方法に関する。 発明の背景 輸血感染性非Ａ、非Ｂ型肝炎の主な病因因子であるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ
）は、米国内に於いて年間約１５０，０００例の新規急性肝炎の原因となってい
る。Ｃｈｏｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９，２４４，３５９−３６２。感染率
は西洋諸国では０．６ないし２．０％であるが、一部の開発途上国では１５％に
達する。Ｈｅｉｎｔｇｅｓら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，１９９７，２６，５２１
−５２６。これら感染例の約半数は肝硬変及び／又は肝細胞癌と関連する可能性
のある慢性感染症に進行する（Ａｌｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９２，２５
８、１３５−１４０；及びＡｌｔｅｒら、Ｎｅｗ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．，１９
９２，３２７，１８９９−１９０５）。更に、抗ＨＣＶ抗体の罹患率により示さ
れるように、ＨＣＶ感染は肝細胞癌の発生に関し独立したリスクファクターであ
る（Ｃｏｌｏｍｂｏら、Ｌａｎｃｅｔ，１９８９，ｉｉ，１００６−１００８；
Ｓａｉｔｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９０、８
７，６５４７−６５４９；Ｓｉｍｏｎｅｔｔｉら、Ａｎ．Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．，１
９９２．１１６，９７−１０２；及びＴｓｕｋｕｍａら、Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．
Ｍｅｄ．，１９９３，３２８，１７９７−１８０１）。 【０００２】 ＨＣＶは最近フラビウイルス（Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ）科内の独立した属に分
類された、エンベロープを持つ、正鎖のＲＮＡウイルスであり、約９，５００ヌ
クレオチド長を持つ。Ｈｅｉｎｚ，Ａｒｃｈ．Ｖｉｏｌ．（Ｓｕｐｐｌ．），１
９９２，４，１６３−１７１。異なる単離体は大きなヌクレオチド配列の多様性
を示し、その結果ＨＣＶゲノムの亜分類は少なくとも８つの遺伝子型に分けられ
る。Ｓｉｍｍｏｎｄｓら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ，１９９３，７４，２３９１
−２３９９。何れの遺伝子型でも、ウイルスゲノムはおよそ３３０Ｋｄの３０１
０ないし３０３３アミノ酸の前駆体ポリ蛋白質をコードする大きなオープンリー
ディングフレーム（ＯＲＦ）を１つ含んでいる。Ｃｈｏｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９１，８８，２４５１−２４５５；Ｉｎｃ
ｈａｓｐｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９１，８
８，１０２９２−１０２９６；Ｋａｔｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ，１９９０，８７，９５２４−９５２８；Ｏｋａｍｏｔｏら、Ｊ．
Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ，１９９１，７２，２６９７−２７０４；及びＴａｋａｍｉ
ｚａｗａら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９１，６５，１１０５−１１１３
。 【０００３】 個々のＨＣＶポリペプチドは前駆体ポリペプチドの蛋白質分解プロセッシング
により生成され、コア（Ｃ）、エンベロープ（Ｅ１，Ｅ２）及び非構造（ＮＳ２
−ＮＳ５）蛋白質を生ずる。Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｔｅｒら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖ
ｉｒｏｌ．，１９９３，６７，３８３５−３８４４；Ｇｒａｋｏｕｉら、Ｊ．Ｇ
ｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９３，６７，２８３２−２８４３；及びＳｅｌｂｙら
、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９３，７４，１１０３−１１１３。この蛋白
質分解は、細胞及びウイルスにコードされるプロテアーゼ両方の組み合わせによ
り触媒される。ＮＳ３遺伝子は、ウイルスのポリ蛋白質前駆体を転写後に複数の
機能体に切断すると同時にウイルスへリカーゼとしても機能するセリンプロテア
ーゼをコードしている。ＮＳ５領域はウイルスのＲＮＡ依存型ＲＮＡポリメラー
ゼをコードしている。 【０００４】 翻訳領域に加え、ＨＣＶゲノムは５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）及び３’非翻
訳領域（３’ＵＴＲ）も含む。３２４ないし３４１ヌクレオチドの５’ＵＴＲは
今日までに報告されている全てのＨＣＶ単離体の中で、最も高度に保存された配
列を表す。Ｈａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９
１，８８，１７１１−１７１５；及びＢｕｋｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９２，８９，４９４２−４９４６。この５’ＵＴＲは
ＨＣＶ ＲＮＡｓの複製及び／又は翻訳に関し重要な制御因子を含むと推測され
ている。５’ＵＴＲはまた複数の小さなオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ
）を含んでいるが、現在のところこれらＯＲＦ配列が実際に翻訳されていること
を示唆する証拠はない。 【０００５】 ＨＣＶ感染中の肝臓障害及びウイルス排除に関連した細胞免疫については部分
的にしか解明されていない。慢性ＨＣＶ感染患者に於ける肝臓浸潤リンパ細胞の
持つ潜在的な病因的役割を検証しようと、Ｋｏｚｉｅｌらは各細胞の細胞障害性
Ｔリンパ細胞（ＣＴＬ）応答を調べ、ＨＣＶポリペプチドの構造及び非構造領域
の両方に対するＨＬＡクラス１拘束ＣＤ８＋ＣＴＬ応答を示した。Ｋｏｚｉｅｌ
ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，１９９３，６７，７５２２−７５３２；及びＫｏｚｉｅｌ
ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９２，１４９，３３３９−３３４４。他の研究者
も慢性ＨＣＶ感染中にコア又はその他ウイルス関連蛋白質上のエピトープを認識
するＣＴＬが末梢血単核細胞集団に存在していることを記している。Ｋｉｔａら
、Ｈｅｐａｔｏｌ．，１９９３，１８，１０３９−１０４４；及びＣｅｒｎｙら
、Ｉｎｔｌ．Ｓｙｍｐ．Ｖｉｒａｌ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ
．，１９９３、８３（要旨）。Ｂｏｔａｒｅｌｌｉら（Ｂｏｔａｒｅｌｌｉら、
Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，１９９３，１０４，５８０−５８７）及びＦｅ
ｒｒａｒｉら、（Ｆｅｒｒａｒｉら、Ｈｅｐａｔｏｌ．，１９９４，１９，２８
６−２９５）は、慢性ＨＣＶ感染患者に於いて様々なＨＣＶ域に由来するいくつ
かの組換え体蛋白質に対する、ＨＬＡクラスII拘束ＣＤ４＋Ｔ細胞介在増殖性応
答を見いだした。 【０００６】 活動型ＨＣＶ感染では液性及び細胞性免疫応答はポリクローナル及び多特異的
であることが示されており、また持続的ＨＣＶ感染の間に生じた宿主免疫応答が
、一部肝臓の細胞障害の発生に関与していると考えられている。しかし、これら
免疫応答は慢性ＨＣＶ感染者に於けるウイルス排除を促進し、防御免疫を生起す
るには十分に広範囲かつ強力なものではない。Ｃｈｉｓａｒｉ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．
Ｉｎｖｅｓｔ．，１９９７，９９，１４７２−１４７７。最近、急性ＨＣＶ感染
から回復した例では、非構造蛋白質に由来するペプチドに対し強力に増殖するＣ
Ｄ４＋Ｔ細胞応答が生起することが示された。Ｍｉｓｓａｌｅら、Ｊ．Ｃｌｉｎ
．Ｉｎｖｅｓｔ．，１９９６，９８，７０６−７１４；及びＤｉｅｐｏｌｄｅｒ
ら、Ｌａｎｃｅｔ，１９９５，３４６，１００６−１００７。より重要なことに
、ＨＣＶ特異的ＣＴＬ活性の発生は、慢性肝炎患者に於けるウイルス複製のコン
トロールに関係する様に思われる。Ｒｅｈｅｒｍａｎｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎ
ｖｅｓｔ．，１９９６，９８，１４３２−１４４０；及びＮｅｌｓｏｎら、Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９７，１５８，１４７３−１４８１。 【０００７】 しかし、非構造蛋白質ＮＳ３、ＮＳ４及びＮＳ５がインビボに於いて広範囲か
つ強力なＣＴＬ応答を生起するに十分な免疫原性を持っているかは不明である。 現時点では、慢性ＨＣＶ感染に関する普遍的かつ高い有効性を持つ治療法はな
い。ＨＣＶに関するワクチン開発は、ＨＣＶ単離体間の異質性が大きいことや単
離体内にも異質的遺伝子が混合していることにより複雑化している。Ｍａｒｔｅ
ｌｌら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９２，６６，３２２５。更に、ウイルスは高度
可変エンベロープ領域を含む。効果的な治療はインターフェロンにのみ限定され
てきた。Ｃａｒｉｔｈｅｒｓら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，１９９７，２６，８３
Ｓ−８８Ｓ。事実、そのような薬剤で処置された患者の約８−１０％は肝臓由来
のＨＣＶに応答して定着させない。しかしながら、最近の研究は、急性ＨＣＶ感
染から回復した例では、持続性ＨＣＶ感染になった例に比べ本質的な非翻訳蛋白
質に対するＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖反応が起こることが示さした。Ｍｉｓｓａｌｅ
ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１９９６，９８，７０６−７１４；及びＤ
ｉｅｐｏｌｄｅｒら、Ｌａｎｃｅｔ，１９９５，３４６，００６−１００７。 【０００８】 動物へのＤＮＡの直接注射は、免疫に関する特異抗原供給の確実な方法である
。Ｂａｒｒｙら、Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１９９４，１６．６１６−６
１９；Ｄａｖｉｓら、Ｈｕｍ．Ｎｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１９９３，１１，１８４
７−１８５１；Ｔａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ，１９２，３５６，１５２−１５４；
Ｗａｎｇら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９３，６７，３３３８−３３４４；及びＷ
ｏｌｆｆら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９０，２４７，１４６５−１４６８。この方
法を用いて、マウス及びニワトリではインフルエンザウイルスに対する、マウス
とウシではウシヘルペスウイルス１に対する、そしてマウスではラビーウイルス
に対する防御免疫を作り出すことに成功している。Ｃｏｘら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．
，１９９３，６７，５６６４−５６６７；Ｆｙｎａｎら、ＤＮＡ ａｎｄ Ｃｅ
ｌｌ Ｂｉｏｌ．，１９９３，１２，７８５−７８９；Ｕｌｍｅｒら、Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ，１９９３，２５９，１７４５−１７４９；及びＸｉａｎｇら、Ｖｉｒｏ
ｌ．，１９９４，１９９，１３２−１４０。多くの場合、感染のコントロールに
は、強力ではあるがまだ高度に可変性の抗体及び細胞障害性Ｔ細胞応答が関連し
た。事実、肝臓ベクターを用いずに長期持続記憶ＣＴＬｓを生じさせる可能性が
、このアプローチを、不活性化ウイルスワクチンを含み、急性感染のみならず持
続ウイルス感染の根絶にも利益があるかもしれないＣＴＬ応答を生じさせるもの
に比べ、より魅力的にしている。Ｗｏｌｆｆら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９０，２
４７，１４６５−１４６８；Ｗｏｌｆｆら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１
９９２，１，３６３−３６９；Ｍａｎｔｈｏｒｐｅら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒａｐｙ，１９９３，４，４１９−４３１；Ｕｌｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，１９９３，２５９，１７４５−１７４９；Ｙａｎｋａｕｃｋａｓら、ＤＮＡ
ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１９９３，１２，７７７−７８３；Ｍｏｎｔ
ｇｏｍｅｒｙら、ＤＮＡ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１９９３，１２，７
７７−７８３；Ｆｙｎａｎら、ＤＮＡ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１９９
３，１２，７８５−７８９；Ｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ，１９９３，９０，４１５６−４１６０；Ｗａｎｇら、ＤＮＡ ａｎ
ｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１９９３，１２，７９９−８０５；Ｘｉａｎｇら、
Ｖｉｒｏｌ．，１９９４，１９９，１３２−１４０；Ｄａｖｉｓら、Ｈｕｍ．Ｍ
ｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１９９３，１１，１８４７−１８５１；Ｄｏｎｎｅｌｌｙ
ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１９９５，１，５８３−５８７；Ｂｏｙｅｒら、Ｎａｔ
．Ｍｅｄ．，１９９７，３，５２６−５３２；Ｔａｓｃｏｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ
．，１９９６，２，８８８−８９２；及びＨｕｙｇｅｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，
１９９６，２，８９３−８９８。可溶性組換え体蛋白質又はペプチドによる免疫
に比べたこの方法の優位点は、強い炎症性ＣＤ４＋Ｔ細胞応答並びに細胞傷害性
Ｔ細胞活性を誘導する能力であるが、おそらくウイルス蛋白質の細胞内のペプチ
ドへのプロセッシングおよび続く感染細胞中のＭＨＣクラス１分子上への負荷、
そしてやがては規定される抗原提示細胞との相互作用のためらしい。対照的に、
可溶性蛋白質による免疫感作は、ＭＨＣクラスII経路を介したプロセッシングに
より主に液性免疫応答を導く。合成ペプチドによる免疫は、宿主の免疫応答の刺
激に利用できるエピトープ数が限られることによる幾つかの欠点を持つ。対照的
に、関心のＤＮＡ構築体により各蛋白質についてコードされた天然に産するＢ及
びＴ細胞のエピトープの全ては、おそらくＴ細胞レセプターによる認識に関し保
存されており、従って極めて広範囲の液性及び細胞性免疫応答を生起することに
なる。ＭｃＤｏｎｎｅｌｌら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，１９９６，３３４
，４２−４５。 【０００９】 一般にワクチン接種及び免疫感作は、個々の免疫系がそれに対し免疫応答を開
始でき、そして病原菌からの攻撃の防御に有効であることになる無毒性因子の導
入を意味する。免疫系は主に個体内に通常存在しない蛋白質及びその他高分子を
特定することで侵入する”外来”成分や菌を同定する。外来蛋白質は免疫応答が
形成される標的を表す。 【００１０】 ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９０／０１３４８は、ＨＣＶゲノムのクローン、
ＨＣＶウイルス蛋白質のアミノ酸配列、及びＨＣＶ蛋白質ならびにそれに由来す
るペプチドを含む抗ＨＣＶワクチンを含むこれら成分の作製方法及び利用法を開
示している。 【００１１】 米国特許第５，８３０，８７６号、第５，５９３，９７２号、第５，７３９，
１１８号及び１９９４年１月２６日出願のＰＣＴ特許出願連続番号ＰＣＴ／ＵＳ
９４／００８９９の開示内容はその全てがここに参照され取り込まれているが、
それぞれは遺伝的免疫感作プロトコールの記載を含んでいる。ＨＣＶに対するワ
クチンがそれぞれに開示されている。 【００１２】 Ｃ型肝炎ウイルス感染よりヒトを防御するのに有用なワクチンは未だに必要と
されている。Ｃ型肝炎ウイルス感染よりヒトを防御する方法も求められている。 発明の概要 本発明は、例えばＮＳ３、ＮＳ４又はＮＳ５、あるいはその組み合わせの様な
Ｃ型肝炎ウイルス非構造蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む組換え体核
酸分子に関する。 【００１３】 本発明はＣ型肝炎ウイルス非翻訳蛋白質をコードする核酸配列を含む組換え体
核酸分子を含む医薬組成物組成物に関する。Ｃ型肝炎ウイルス非構造蛋白質をコ
ードする配列をコードするヌクレオチドは、ヒト細胞内に於いて機能する制御要
素に作動可能に連結される。医薬組成物には更に医薬として受容可能な担体又は
希釈体を含み、又任意に例えばブビバカインの様な促進体を含む。 【００１４】 本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスに感受性な個体にＣ型肝炎ウイルス非構造蛋白質
をコードする配列をコードするヌクレオチドを含む組換え体核酸分子を含む医薬
組成物を登用することを包含する、Ｃ型肝炎ウイルスに感受性な個体を免疫する
方法に関する。Ｃ型肝炎ウイルス非構造蛋白質をコードする配列をコードするヌ
クレオチドは、ヒト細胞内で機能する制御要素に作動可能に連結される。医薬組
成物は更に医薬として受容可能な担体又は希釈体を含む。個体は、Ｃ型肝炎ウイ
ルス感染に対する防御免疫応答を誘導するに十分な量投与される。 【００１５】 本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスを持つ個体に、Ｃ型肝炎非構造蛋白質をコードす
る配列をコードしているヌクレオチドを含む組換え体核酸分子を含む医薬組成物
を投与することを包含するＣ型肝炎ウイルスを持つ個体を治療する方法に関する
。Ｃ型肝炎ウイルス非構造蛋白質をコードする配列をコードしているヌクレオチ
ドは、ヒト細胞に於いて機能する制御要素に作動可能に連結される。医薬組成物
は更に医薬として受容可能な担体又は希釈体を含む。個体にはＣ型肝炎ウイルス
感染に対する治療的免疫応答を誘導する有効量が投与される。 発明の好適実施態様の説明 本発明によれば、ＨＣＶ感染より個体を予防的、及び／又は治療的に免疫感作
し、又は治療する組成物及び方法が提供される。例えばＮＳ３、ＮＳ４又はＮＳ
５、又はその組み合わせの様なＨＣＶ非構造蛋白質をコードする配列をコードし
ているヌクレオチドを含む組換え体核酸分子が個体に投与される。組換え体核酸
遺伝的構築体によりコードされた蛋白質は個々の細胞により発現され、抗ＨＣＶ
免疫応答を惹起され免疫的標的として機能する。生じた免疫応答は広範囲である
；液性免疫応答に加え、細胞性免疫応答も惹起される。本発明の方法は予防的及
び治療的免疫を付与するのに有用である。本発明の方法は、生物医学研究の為に
ヒト以外の哺乳動物にも適用できる。即ち、本発明の方法はＨＣＶ投与により個
体を免疫するとともに、ＨＣＶ感染を起こした個体の治療にも利用できる。 【００１６】 本明細書に用いる”ＨＣＶ非構造蛋白質”とは、ＨＣＶ非構造蛋白質であるＮ
Ｓ３、ＮＳ４及びＮＳ５及びその均等物を意味する。均等蛋白質には、本明細書
記載の生物活性を保持しているＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５の断片が含まれる。更に
、ＨＣＶ非構造蛋白質という用語は、その配列が変化した別のＨＣＶ単離体から
の各ＨＣＶ非構造蛋白質を意味する。当業者は別のＨＣＶ単離体からのＨＣＶ非
構造蛋白質を容易に同定できる。同一のアミノ酸がコードされる場合には、コド
ン内でのヌクレオチド置換は許容されてよいと理解されるべきである。更に、ヌ
クレオチド置換が保存的アミノ酸置換をもたらす場合には、ヌクレオチドの交換
が許容されてよいことも理解されるべきである。”ＨＣＶ非構造蛋白質”という
語には、非構造蛋白質を含む融合蛋白質、並びに治療的又は予防的に活性なその
断片も含まれると理解されるべきである。 【００１７】 本明細書に用いる”遺伝的構築体”という語は、ＨＣＶ非構造蛋白質をコード
する配列をコードしているヌクレオチド、並びにワクチン接種した個体の細胞内
で発現可能にするプロモーター及びポリアデニレーションシグナルを含む制御要
素に作動可能に連結された開始及び終止シグナルを含む組換え体核酸分子を指す
。いくつかの実施態様では、遺伝的構築体は更にエンハンサー、コザック配列（
ＧＣＣＧＣＣＡＴＧ；配列番号１）、及び少なくともＨＣＶ５’ＵＴＲの断片も
含む。 【００１８】 本明細書に用いる”遺伝子ワクチン”なる句は、遺伝的構築体を含む医薬調製
物を意味する。遺伝子ワクチンには、ＨＣＶに対する予防的及び／又は治療的免
疫応答を惹起するのに有用な医薬調製物が含まれる。 【００１９】 本明細書に用いる”核酸”とはＤＮＡ、ＲＮＡ又はそれらより形成されるキメ
ラである。 本発明によれば、遺伝的構築体はそれが発現される個体の細胞内に導入され、
それにより少なくとも１種類のＨＣＶ非構造蛋白質が生成される。好ましくは、
発明の遺伝的構築体の制御要素は、哺乳動物、特ににヒトの細胞内での発現を可
能にするものである。制御要素には、プロモーター、ポリアデニレーションシグ
ナルが含まれる。更に、エンハンサー及びコザック配列の様なその他の要素も遺
伝的構築体に含まれるだろう。 【００２０】 細胞に取り込まれると、本発明の遺伝的構築体は細胞内に機能性の染色体外分
子として留まるか、又は細胞の染色体ＤＮＡ内に組み込まれる。ＤＮＡの様な核
酸を、該核酸がプラスミドの形状として独立した遺伝物質として留まる細胞の中
に導入する。あるいは、染色体内に組み込むことができる直鎖状核酸が細胞内に
導入される。核酸を細胞内に導入する場合、核酸の染色体内への組み込みを促進
する因子が加えられるだろう。組み込み促進に有用なＤＮＡ配列もＤＮＡ分子内
に含めることができるだろう。あるいは、ＲＮＡが細胞に投与される。更に、セ
ントロメア、テロメア及び複製起源を含む直鎖状ミニクロモソームとして遺伝的
構築体が提供される。 【００２１】 本発明によれば、遺伝的構築体はＨＣＶ非構造蛋白質をコードする配列をコー
ドしているヌクレオチドを含む組換え体核酸分子を含む。いくつかの好適実施態
様では、組換え体核酸分子はＮＳ３をコードする配列をコードしているヌクレオ
チドを含む。別の好適実施態様では、組換え体核酸分子はＮＳ４を含むＨＣＶ非
構造蛋白質をコードする配列をコードしているヌクレオチドを含む。別の好適実
施態様では、組換え体核酸分子はＮＳ５を含むＨＣＶ非構造蛋白質をコードする
配列をコードしているヌクレオチドを含む。別の好適実施態様では、組換え体核
酸分子はＮＳ３、ＮＳ４及びＮＳ５を含むＨＣＶ非構造蛋白質のいずれかの組み
合わせをコードする配列をコードしているヌクレオチドを含む。 【００２２】 いくつかの好適実施態様では、組換え体核酸分子は、ＨＣＶ ＮＳ３、ＮＳ４
又はＮＳ５蛋白質の断片、又はその組み合わせを含むＨＣＶ非構造蛋白質をコー
ドする配列をコードしているヌクレオチドを含む。断片は、該当する非構造蛋白
質の１０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５
０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８０
０、８５０、９００、９５０又は１０００アミノ酸を含む断片を包含するが、こ
れに限定されるものではない。更に、断片は蛋白質のカルボキシル末端部分、ア
ミノ末端部分、又はその間のいずれかの部分を含むことができる。当業者は、Ｈ
ＣＶ非構造蛋白質の免疫性断片、または該非構造蛋白質のいずれかの組み合わせ
の免疫性断片を含む融合蛋白質を容易に製造できる。即ち、ＨＣＶ非構造蛋白質
をコードする配列をコードしているヌクレオチドを含む組換え体核酸分子は、ワ
クチンの有効性を変えることなく全ＨＣＶ非構造遺伝子産物より小さい産物を含
むことを意図している。更に蛋白質のアミノ酸配列に影響することなくヌクレオ
チドがコードする配列内に少なくとも１ヌクレオチド及び複数ヌクレオチドの置
換も意図される。更に、ＨＣＶ非構造蛋白質の免疫原活性を実質上減じることな
く、蛋白質全体に１の保存的アミノ酸置換又は複数の置換も意図される。 【００２３】 発明の実施態様のいくつかでは、組換え体核酸分子はＨＣＶ５’ＵＴＲの最後
の９ヌクレオチド、ＨＣＶ５’ＵＴＲの最後の２５ヌクレオチド、ＨＣＶ５’Ｕ
ＴＲの最後の５０ヌクレオチド、ＨＣＶ５’ＵＴＲの最後の７５ヌクレオチド、
ＨＣＶ５’ＵＴＲの最後の１００ヌクレオチド、ＨＣＶ５’ＵＴＲの最後の１５
０ヌクレオチド、ＨＣＶ５’ＵＴＲの最後の２００ヌクレオチド、ＨＣＶ５’Ｕ
ＴＲの最後の２５０ヌクレオチド、又はＨＣＶ５’ＵＴＲの最後の３００ヌクレ
オチドを含む。好適実施態様のいくつかでは、遺伝的構築体は全ＨＣＶ５’ＵＴ
Ｒを含む。好適実施態様のいくつかでは、井出に構築体はＨＣＶ５’ＵＴＲの最
も３’側ヌクレオチド９個を含む。好適実施態様の完全ＨＣＶ５’ＵＴＲはＧＣ
ＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＴＴＧＧＧＧＧＣＧＡＣＡＣＴＣＣＡＣＣＡＴＡＧＡＴＣ
ＡＣＴＣＣＣＣＴＧＴＧＡＧＧＡＡＣＴＡＣＴＧＴＣＴＴＣＡＣＧＣＡＧＡＡＡ
ＧＣＧＴＣＴＡＧＣＣＡＴＧＧＣＧＴＴＡＧＴＡＴＧＡＧＴＧＴＣＧＴＧＣＡＧ
ＣＣＴＣＣＡＧＧＡＣＣＣＣＣＣＣＴＣＣＣＧＧＧＡＧＡＧＣＣＡＴＡＧＴＧＧ
ＴＣＴＧＣＧＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＧＴＡＣＡＣＣＧＧＡＡＴＴＧＣＣＡＧＧＡ
ＣＧＡＣＣＧＧＧＴＣＣＴＴＴＣＴＴＧＧＡＴＣＡＡＣＣＣＧＣＴＣＡＡＴＧＣ
ＣＴＧＧＡＧＡＴＴＴＧＧＧＣＧＴＧＣＣＣＣＣＧＣＧＡＧＡＣＴＧＣＴＡＧＣ
ＣＧＡＧＴＡＧＴＧＴＴＧＧＧＴＣＧＣＧＡＡＡＧＧＣＣＴＴＧＴＧＧＴＡＣＴ
ＧＣＣＴＧＡＴＡＧＧＧＴＧＣＴＴＧＣＧＡＧＴＧＣＣＣＣＧＧＧＡＧＧＴＣＴ
ＣＧＴＡＧＡＣＣＧＴＧＣＡＣＣ（配列番号２）である。 【００２４】 ＤＮＡ分子の遺伝子発現に必要な制御要素には：プロモーター、開始コドン、
停止コドン、ポリアデニレーションシグナルが含まれる。更に、遺伝子発現には
しばしばエンハンサーが必要とされる。これら要素はＨＣＶ非構造蛋白質をコー
ドする配列と作動可能に連結し、制御要素が投与された個体内で作動可能である
ことが必要である。開始コドン及び停止コドンは一般にはＨＣＶ非構造蛋白質を
コードするヌクレオチド配列の一部と考えられる。 【００２５】 使用するプロモーター及びポリアデニレーションシグナルは個体の細胞内で機
能的でなければならない。蛋白質の産生を最大にするには、制御配列は構築体が
投与される細胞内での遺伝子発現に好適なものが選択される。さらに、コドンは
細胞内に於いても最も効率的に転写されるものが選択される。当業者は哺乳動物
細胞、特にヒト細胞に於いて機能するＤＮＡ構築体を作ることできる。 【００２６】 本発明の実施、特にヒト用遺伝子ワクチンの産生に有用なプロモーターの例に
はシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プ
ロモーター、ＨＩＶロングターミナルリピート（ＬＴＲ）プロモーターの様なヒ
ト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、モレニーウイルス、ＡＬＶ、ＣＭＶ初期プロモ
ーターの様なサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタインバーウイルス（Ｅ
ＢＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、及びヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒ
トヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン及びヒトメタロチオネインの様なヒト遺伝
子由来のヒトプロモーターが含まれるが、限定されない。 【００２７】 本発明の実施、特にヒト用遺伝子ワクチンの産生に有用なポリアデニレーショ
ンシグナルの例には、ＳＶ４０ポリアデニレーションシグナル及びＬＴＲポリア
デニレーションシグナルが含まれるが、限定されない。特にｐＣＥＰ４プラスミ
ド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）内にあるＳＶ４０ポリ
アデニレーションシグナルは、ＳＶ４０ポリアデニレーションシグナルと称され
、利用される。 【００２８】 遺伝子発現に必要な制御要素の他に、別の要素も遺伝的構築体内に含まれる。
この様な追加要素にはエンハンサーが含まれる。エンハンサーは以下のグループ
より選択されるが、限定されない：ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロ
ビン、ヒト筋肉クレアチン及びＣＭＶ、ＲＳＶ及びＥＢＶに由来するエンハンサ
ーの様なウイルスエンハンサー。 【００２９】 遺伝的構築体は、染色体外に構築体を維持し細胞内で構築体の複数のコピーを
生成するために、複製の哺乳動物起源と共に提供できる。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
社（ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）のプラスミドｐＣＥＰ４及びｐＲＥＰ４は複製の
エプスタインバーウイルス起源及び核抗原ＥＢＮＡ−１コーディング領域を含み
、これが組み込み無しに多数のコピーのエピゾーム複製を生む。 【００３０】 投与経路には、筋肉内、腹腔内、皮内、皮下、静脈内、動脈内、眼内、及び経
口、並びに経皮的投与、又は吸入剤あるいは座薬が含まれるが、限定されない。
好ましい投与経路には筋肉内、腹腔内、皮内及び皮下注射がある。ＨＣＶ非構造
蛋白質をコードする遺伝的構築体の供与は、該材料が粘膜免疫と関連した組織に
存在する投与様式にて免疫された個体に粘膜免疫を付与できる。即ち、一部の例
では遺伝的構築体は個体口腔内にある口腔前提内に投与し供与される。 【００３１】 遺伝的構築体は、伝統的な注射器、無針注入装置、又は”マイクロプロジェク
タイル照射遺伝子ガン”を含む方法により投与されるが、限定されない。あるい
は、遺伝子ワクチンは各種方法により個体より取り出された細胞内に導入される
。その様な方法には、例えばエクスビボトランスフェクション、エレクトロポレ
ーション、マイクロインジェクション、マイクロプロジェクタイル照射法が含ま
れる。遺伝的構築体が細胞に取り込まれた後に、それらは再度個体内に移植され
る。ワクチン化した細胞を別の個体より得た場合でも、その内部に遺伝的構築体
を取り込んだその他の非免疫源性細胞を個体内に移植することが意図される。 【００３２】 本発明のいくつかの実施態様によれば、遺伝的構築体は無針注入装置を用いて
個体内に投与される。本発明のいくつかの実施態様では、遺伝的構築体は無針注
入装置を用い皮内、皮下及び筋肉内に同時に投与される。無針注入装置は良く知
られており、また広く利用されている。当業者は本明細書の教示に従うことで、
無針注入装置を使い個体の細胞に遺伝物質を供与することができる。無針注射装
置は、あらゆる組織への遺伝物質供与に適している。これらは特に皮膚及び筋肉
細胞への遺伝物質供与に有用である。いくつかの実施態様では、無針注入装置は
ＤＮＡ分子を含む液体を個体の皮膚表面に向け発射するのに利用される。液体は
皮膚に衝撃を与え、液が皮膚表面を貫通し、皮膚やその下の筋肉組織に浸透する
のに十分な速度で発射される。即ち、遺伝物質は経皮的、皮下的、及び筋肉内的
に同時に投与される。いくつかの実施態様では、無針注入装置は、核酸分子のそ
の他器官の細胞への導入を目的とするそれら器官組織への遺伝物質の供与に利用
される。 【００３３】 本発明による遺伝子ワクチンは約１ナノグラムないし約１００マイクログラム
の核酸、好ましくはＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施態様では、ワクチン
は約０．１ないし約５００マイクログラムの核酸を含む。いくつかの好ましい実
施例では、ワクチンは約１ないし約３５０マイクログラムの核酸を含む。いくつ
かの好ましい実施態様では、ワクチンは約１００マイクログラムの核酸を含む。
当業者は容易に所望量の核酸を含むワクチンを処方できる。 【００３４】 本発明による遺伝子ワクチンは、使用する投与形態に従い処方される。当業者
は遺伝的構築体を含む医薬組成物を容易に処方できる。本発明の医薬組成物はＮ
Ｓ３、ＮＳ４又はＮＳ５、あるいはそのいずれかの組み合わせをコードする単一
の遺伝的構築体を含む。あるいは、本発明の医薬組成物は、ＮＳ３、ＮＳ４、又
はＮＳ５、あるいはそのいずれかの組み合わせをコードする複数の遺伝的構築体
を含む。更に、本発明の医薬組成物は、ＮＳ３、ＮＳ４、又はＮＳ５の断片、あ
るいはそのいずれかの組み合わせをコードする単一、又は複数の遺伝的構築体を
含む。更に本発明の医薬組成物は、ＮＳ３、ＮＳ４、又はＮＳ５蛋白質全て又は
その断片の融合蛋白質をコードする単一の遺伝的構築体を含む。いくつかの例で
は、等張性の調合が用いられる。一般に等張性のための添加物には、塩化ナトリ
ウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール及びラクトースが含むこと
ができる。いくつかの例では、リン酸で緩衝化された生理食塩水の様な等張液が
好まれる。安定化剤にはゼラチン及びアルブミンが含まれる。いくつかの実施態
様では、血管収縮剤が調剤に加えられる。本発明の医薬調製物は、滅菌及び無発
熱物質状態で提供される。 【００３５】 本発明の遺伝子構築体は、該物質無しに同一ワクチンを投与した場合の細胞に
よる遺伝子構築体の取り込み、及び／又は発現に比べ、細胞による遺伝子構築体
の取り込み、及び／又は発現を増加させる、本明細書に於いて”促進体”と称さ
れる作用物質と組み合わせて処方され、又は投与される。この様な作用物質及び
それらを遺伝子構築体と組み合わせて投与するプロトコールは、米国特許第５，
８３０，８７６号、５，５９３，９７２号、５，７３９，１１８号及び１９９４
年１月２６日出願のＰＣＴ特許出願連続番号ＰＣＴ／ＵＳ９４／００８９９に記
載されている。この様な作用物質には、ＣａＰＯ4、ＤＥＡＥデキストラン、陰 イオン性脂質；細胞外マトリックス活性酵素；サポニン；レクチン；エストロゲ
ン様化合物；ステロイドホルモン；ヒドロキシル化低級アルキル；ジメチルスル
ホキシド（ＤＭＳＯ）；尿素；及び安息抗酸エステルアニリド、アミジン、ウレ
タン、及び局所麻酔薬ファミリーの塩酸塩の様なそれらの塩酸塩。更に、遺伝子
構築体は脂質／ポリ陽イオン複合体内にカプセル化し、又はと組み合わせて投与
される。好ましい促進体はブピバカインである。組成物は投与単位の形状に好都
合に投与でき、例えば、その全部がここに参照され取り込まれているＲｅｍｉｎ
ｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｍａｃｋ Ｐ ｕｂ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９８０）記載の様な医薬分野公知のいず
れかの方法により製造できる。 【００３６】 以下に示す実施例では、３つの異なるＨＣＶの非構造蛋白質をコードするプラ
スミドによるＤＮＡベースワクチン接種が、両方の免疫システムに於いて強力な
抗原特異的免疫応答を惹起することを示している。３回の免疫感作後、全ての動
物が検出可能な抗体応答を生じた。この点について、構造的ＨＣＶコア構造蛋白
質を用いた従来の研究に比べ、これら非構造蛋白質はより良好に液性免疫応答を
刺激する。Ｔｏｋｕｓｈｉｇｅら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，１９９６，２４，１
４−２０；及びＧｅｉｓｓｌｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９７，１５８
，１２３１−１２３７。好ましい実施例では、非構造蛋白質に対する液性免疫応
答は、抗原提示細胞を活性化する化合物、例えばＩＬ−２及びＧＭ−ＣＳＦの様
なサイトカインを発現しているプラスミドを添加することで増強される。Ｇｅｉ
ｓｓｌｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９７，１５８，１２３１−１２３７
；及びＸｉａｎｇ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１９９５，２，１２９−１３５。ＮＳ３
、ＮＳ４及びＮＳ５をコードしている３種類全てのプラスミドについて、優性な
ＴH１表現形を持った炎症性ＣＤ４＋Ｔ細胞応答の発生が示された。更に、特に ＮＳ３及びＮＳ５に関しては、動物モデル系に於いて各種病原菌に対する防御を
誘導することが既に示されている溶解価の産生を伴う強力かつ特異的なＣＤ８＋
ＣＴＬ応答が生じた。Ｔａｓｃｏｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１９９６，２，８８
８−８９２；及びＨｕｙｇｅｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１９９６，２，８９３−
８９８。更に、ＤＮＡをベースとする変異により作られたＣＴＬ応答は、ＮＳ５
蛋白質をコードするｃＤＮＡを安定にトランスフェクトされた同系ＳＰ２／０腫
瘍細胞を利用した腫瘍形成から動物を保護することが判明した。約６０％のマウ
スが腫瘍形成から保護されたことから、本免疫法によりインビボで高いレベルの
ＣＴＬ活性が作られることが示唆される。更に、腫瘍を生じた動物でも模擬ＤＮ
Ａ又は組換え体ＮＳ５蛋白質で免疫された動物に比べると、その腫瘍重量は有意
に減少した。このモデルは、腫瘍増殖の阻害を計測する動物モデルに於いて、フ
ラビウイルスの非構造蛋白質に対し高いレベルの細胞性免疫応答を評価する可能
性も示す。 【００３７】 本明細書に開示した結果は、本明細書に記載した如く、ＨＣＶ非構造蛋白質を
コードする遺伝子構築体によるＤＮＡベースの免疫化は、ＨＣＶを持つ個体の治
療処置並びにＨＣＶに対する予防ワクチンに関し有用であることを教示する。 【００３８】 本発明は、本発明を説明することを目的とする以下の実施例により更に例示さ
れる。これら実施例は、開示の範囲を限定するものではなく、またそう解釈され
るものでもない。 実施例 実施例１：ＨＣＶ発現ベクターの設計と構築 各非構造蛋白質をコードする遺伝子を、人工の開始及び停止コドンと共に、Ｃ
ＭＶ−プロモーター及びＲＳＶエンハンサー（ｐＡｐＯ３１）により作動する発
現ベクター内にクローン化した。選択マーカーを含む発現ベクター（ｐｃＤＮＡ
３）は安定型ＳＰ２／０をトランスフェクトした細胞株の作製にも使用した（図
１Ａ参照）。 【００３９】 ウイルス遺伝子源として、ＨＣＶの完全長ＯＲＦをカバーするｐＢＲＴＭ／Ｈ
ＣＶ１と称されるプラスミドを用いて、本発明の発現ベクター内にクローン化し
た。Ｇｒａｋｏｕｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９３，６７，１３８５−１３９
５、その全体が参照されここに取り込まれている。あるいは、ＨＣＶをコードす
るヌクレオチド配列は、その全体が参照されここに取り込まれている開示情報、
ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ６１５９６及びＤ１６４３５より得た。構築体ｐＡｐ
Ｏ３１−ＮＳ３、ｐＡｐＯ３１−ＮＳ４及びｐＡｐＯ３１−ＮＳ５は、人工の開
始及び停止コドンならびに制限酵素部位を挿入した後、以下のプライマーを用い
ＰＣＲにてクローン化した：ＮＳ３の場合；５’−ＧＧＴＣＴＡＧＡＴＴＧＡＴ
ＧＧＣＧＣＣＣＡＴＣＡＣＧＧＣ−３’（ＸｂａＩ）（配列番号３）、５’−Ｃ
ＡＣＡＣＧＣＧＴＴＣＡＣＧＴＧＡＣＧＡＣＣＴＣＣＡＧＧＴ−３’（ＭｌｕＩ
）（配列番号４）、ＮＳ４に関しては：５’−ＧＧＴＣＴＡＧＡＴＧＡＧＣＡＣ
ＣＴＧＧＧＴＧＣＴＣ−３’（ＸｂａＩ）（配列番号５）、５’−ＣＣＡＧＧＡ
ＴＣＣＴＣＡＧＣＡＴＧＧＡＧＴＧＧＴＡＣＡ−３’（ＢａｍＨＩ）（配列番号
６）及びＮＳ５に関しては：５’−ＴＣＡＧＴＣＴＡＧＡＡＴＧＴＣＣＧＧＣＴ
ＣＣＧＧＣＴＣＣＴＧＧＣＴＡＡＧＧＧＡ−３’（ＸｂａＩ）（配列番号７）、
５’−ＡＧＣＴＡＣＧＣＧＴＴＣＡＣＣＧＧＴＴＧＧＧＧＡＧＧＡＧＧＴ−３’
（ＭｌｕＩ）（配列番号８）。高適合度ＰＣＲシステム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を利用したＰＣＲ増幅
の後、ＤＮＡ断片をＲＳＶエンハンサーエレメントを含み、ＣＭＶプロモーター
（Ａｐｏｌｌｏｎ，Ｍａｌｖｅｒｎ ＰＡ）により作動するプラスミド発現ベク
ターｐＡｐＯ３１内に挿入した。構築体をＤＨ５α細胞内で増殖し、続いてプラ
スミドＤＮＡを、２×塩化セシウム遠心分離又はエンドフリー緩衝システムを利
用したＱｉａｇｅｎ Ｇｉｇａキット（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）により
精製した。非構造遺伝子インサートの証明は、通常の方法を利用した配列解析に
より行った。 【００４０】 ＣＴＬ−アッセイの標的細胞となる安定したＮＳ３、ＮＳ４、及びＮＳ５発現
細胞株を確立するために、非構造蛋白質をコードする遺伝子断片をネオマイシン
選択マーカーを用いて、ｐｃＤＮＡ３及びｐｃＤＮＡ３．１Ｚｅｏ（−）発現ベ
クター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）内にクローン化した。ま
ず、ＮＳ３及びＮＳ５のＸｂａＩ及びＭｌｕＩ断片をＬｉｔｍｕｓ−３８ベクタ
ー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，ＭＡ）のＮｈｅＩ／ＭｌｕＩ部
位内にサブクローニングし、続いてＥｃｏＲＩとＳａｌＩで切断、それぞれをｐ
ｃＤＮＡ３及びｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（−）のＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩマルチ
プルクローニングサイトに再接続した。ＮＳ４を含むＸｂａＩ及びＢａｍＨＩ断
片をＬｉｍｕｓ−２０（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，ＭＡ）内に
再接続し、ＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＩで再度切断し、続いてｐｃＤＮＡ３ベクター
に連結した。プラスミドはｐｃＤＮＡ３−ＮＳ３、ｐｃＤＮＡ３−ＮＳ４、及び
ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（１）−ＮＳ５と命名した。 【００４１】 ＨＣＶ非構造蛋白質のいずれかをコードするＤＮＡ配列を持つ当業者は、本発
明の遺伝子構築体のいずれかを製造するためのプライマーを設計できる。更に、
プライマーの結合に影響することなくヌクレオチド塩基を置換できるだろう。更
に同業者公知の如くに、プライマーはクローニング及び結合を目的とするエンド
ヌクレアーゼ制限部位を持たせ製造できるだろう。即ち、同業者は適当なプライ
マーを設計し、ＰＣＲ増幅を実施することで本発明の遺伝子構築体を製造できる
。ＰＣＲ産物は発現ベクターに結合される。 【００４２】 上記ＨＣＶ非構造蛋白質の配列をコードするヌクレオチドを含むプラスミドは
、それぞれＣＭＶプロモーター及びＲＳＶエンハンサーエレメントの転写制御下
に置かれたＨＣＶ非構造蛋白質に関するヌクレオチドコーディング領域を含む。 実施例２：インビトロ発現 プラスミド産物は遺伝子挿入体をまたいで配列決定し、一過性にトランスフェ
クションしたＨｕＨ−７細胞及び安定にトランスフェクションしたＳＰ２／０標
的細胞それぞれに於いて蛋白質の発現を証明した。ＮＳ３に関する約７０、ＮＳ
４に関する３０及びＮＳ５に関する１２５ｋＤの蛋白質バンドが細胞内に発現さ
れていたが、培地中には分泌されていなかったことが判明した（図１Ｂ）。 【００４３】 ＨＣＶ非構造蛋白質の発現レベルを調べるために、カルシウムリン酸法により
ＨｕＨ−７ヒト肝癌細胞株を各種構築体を用いて一過性にトランスフェクトした
。簡単に述べると、35Ｓメチオニン及びシステインで４時間代謝標識した後、細
胞溶解物を改良ＲＩＰＡ緩衝液（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、５０
ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．５％ＤＯＣ及び１％ＳＤＳ）中に調製した。細胞溶解物を
ウマ血清を用いて前清浄化し、次に一晩ポリクローナル抗血清ＷＵ１１０（ＮＳ
３）、Ｗ１４８／１５１（ＮＳ４）及びＷＵ１１５（ＮＳ５）とプレインキュベ
ーションしてセファロースＡに結合した。その全体が参照され、ここに取り込ま
れているＧｒａｋｏｕｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９３，６７，１３８５−１
３９５。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより蛋白質を分離した後、ゲルを乾燥してからオー
トラジオグラフィーにかけた。ＮＳ５蛋白質発現はウエスタンブロット及びマウ
スＡｂ（Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ， Ｓａｎｄｏｗｎ，ＮＨ）を用いた免疫蛍光分
析によっても調べた。ＮＳ３、ＮＳ４及びＮＳ５を発現する安定したトランスフ
ェクト細胞株を作るため、エレクトロポレーションを用いて同系ＢＡＬＢ／ｃマ
ウス骨髄腫由来細胞株ＳＰ２／０に所望のウイルス遺伝子挿入体を含むｐｃＤＮ
Ａ３プラスミドをトランスフェクトした。Ｇ４１８選択下に増殖させた細胞を限
界希釈法（０．３細胞／ウエル）でクローン化し、下記方法にてスクリーニング
した。 【００４４】 ネオマイシン又はゼオマイシン耐性遺伝子を含むｐｃＤ３及びｐｃＤ３．１プ
ラスミドそれぞれを用いてＨＣＶ非構造遺伝子をクローニングし、安定した同系
標的細胞株を作製した。これら構築体でＨｕＨ−７細胞をトランスフェクトしベ
ータガラクトシダーゼアッセイにてトランスフェクション効率をコントロールし
、細胞をメチオニン及びシステイン欠損培地中に３０分間置いて飢餓状態とした
後、４時間35Ｓ−メチオニン及びシステインで標識した。細胞溶解物を非構造蛋
白質特異的ポリクローナルウサギ血清により免疫沈降し、セファローズＡビーズ
で捕捉し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後オートラジオグラフィーにかけ分析した。レーン
１，３及び５は模擬ＤＮＡをトランスフェクトした細胞であり、陰性コントロー
ル（Ｍｏｃｋ）とした。レーン２，４及び６はＮＳ３に関する約７０，ＮＳ４に
関する約３０，ＮＳ５に関する１２５ｋＤの特異バンドを示した。（レーン７−
１０）：ＳＰ２／０細胞はＮＳ３、ＮＳ４及びＮＳ５に関する遺伝子を含むｐｃ
Ｄ３をベースとする構築体でトランスフェクトされた。抗生物質による選別の後
、細胞を限界希釈（０．３細胞／ウエル）でクローン化した後、上記の如く拡大
し、放射性標識及びＮＳ３免疫沈降、又はＮＳ５に関するウエスタンブロットに
より分析した。レーン７及び９は陰性コントロール（ＳＰ２−１９）である安定
してＨＣＶコア蛋白質を発現している細胞の細胞溶解物を示し、レーン８及び１
０はＮＳ３及びＮＳ５の特異的発現を示す。これら細胞はインビトロ刺激及びＣ
ＴＬアッセイに於ける標的細胞として用いられた。 実施例３：免疫プロトコール メスのＢＡＬＢ／ｃ（ｈ−２ｄ）マウスはマサチューセッツ総合病院の動物施
設内に於いて標準的な無菌条件下に飼育された。マウスはＣｈａｒｉｅｓ Ｒｉ
ｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）より得て、
インビボ試験では６ないし２０週齢の時点で使用した。マウスの大腿四頭筋内５
ヶ所に、合計１００μｇのプラスミドＤＮＡを含む１００μｌの０．９％ＮａＣ
ｌを２及び３回注射した。１４日ごとに反対側の脚にブースターを注射した。何
れの免疫試験についても、陽性コントロールとして５μｇの組換え体ＮＳ３、Ｎ
Ｓ４及びＮＳ５非構造蛋白質（Ｍｉｋｒｏｇｅｎ、Ｍｕｎｉｃｈ）を０日目にＣ
ＦＡにｉ．ｐ．注射し、４及び８週後に同量の蛋白質を含む０．０５％ＳＤＳで
ブースターをかけた。これら実験の陰性コントロールとして、空のプラスミドベ
クター及び組換え体Ｂ型肝炎表面抗原（ＨｂｓＡｇ）（Ｅｎｅｒｇｉｘ，Ｓｍｉ
ｔｈ Ｋｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）を用いた。マ
ウスは全例最終免疫１０日後に屠殺された。 実施例４：液性免疫応答の測定 抗ＮＳ３、ＮＳ４及びＮＳ５抗体のレベルは、確立されたＥＬＩＳＡ法を用い
各免疫動物の血清中に決定された。簡単に述べると、マイクロタイタープレート
（Ｆａｌｃｏｎ、マイクロテストIIIＭフレキシブルアッセイプレート）を上記 組換え体蛋白質で一晩４℃コーティングした（０．５μｇ／ウエル）。胎児ウシ
血清（ＦＢＳ）で２時間、２０℃にてブロッキングした後、１：５０に希釈され
たマウス血清をプレートに加え、２０℃にてさらに１時間インキュベーションし
た。０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にて４
回洗浄した後、西洋ワサビパーオキシダーゼ標識抗マウス抗体（Ａｍｅｒｓｈａ
ｍ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）を１：２０００希釈して加え
た。１時間インキュベーション後、プレートを洗浄し、希釈を加え発色させ、自
動読みとり装置で測定した。 【００４５】 ３回の免疫の後、酵素結合免疫吸収アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により免疫された
全動物に関し３つ全ての非構造蛋白質に対する特異抗体応答が認められた。模擬
ＤＮＡで免疫されたマウスでは抗原特異的免疫応答は検出されなかった（図２Ａ
）。陽性コントロールとして、マウスにはＮＳ３、ＮＳ４及びＮＳ５非構造蛋白
質を完全フレンドアジュバント（ＣＦＡ）と組み合わせ３回腹腔内（ｉ．ｐ）ワ
クチン接種したところ、期待通り強い液性免疫応答が示された（データ未提示）
。 【００４６】 図２Ａは、ＤＮＡをベースとした免疫で作られたＮＳ３、ＮＳ４及びＮＳ５に
対する液性免疫応答を示す。血清抗体レベルはＥＬＩＳＡにより測定された（各
群：ｎ＝５）。コントロールはＢＳＡでコートされたウエル及び模擬で免疫され
たマウス由来の血清を含んだ。陽性コントロールとして、マウスは組換え体蛋白
質によりｉ．ｐ．免疫された（データ未提示）。図２Ｂは特異的又は非特異的組
換え体蛋白質によるインビトロ刺激３日後に測定したＴ細胞増殖を示す。細胞を
Ｈ3−チミジンと１８時間インキュベーションし、集めた。△ｃｐｍはバックグ ランド活性（例えば、抗原なしのインキュベーション）を減じて決定した。細胞
と１μｇの組換え体ＮＳ３蛋白質とのインキュベーションは有毒害であり、その
為増殖は認められなかった。組換え体蛋白質とＣＦＡとの組み合わせで免疫され
たマウスは５ないし１０倍高い応答を示した（データ未提示）。 実施例５：リンパ細胞増殖及びサイトカイン放出アッセイ マウスはイソフルラン（Ａｅｒｒａｎｅ、Ａｎａｑｕｅｓｔ，ＮＪ）で麻酔さ
れ、脾臓細胞が集められた。０．８３％ＮＨ4Ｃｌ／０．１７ＭＴｒｉｓ ｐＨ ７．４にて５分間、２５℃でインキュベーションして赤血球を除いた。脾臓細胞
は２回洗浄され、９６ウエル丸底プレートを用い、１０％ＦＢＳ及び２−メルカ
プトエタノールを含む完全ＤＭＥＭ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏ
ｎ，ＤＣ）２００μｌ中５×１０5細胞／ウエルで３重培養された。細胞は様々 な濃度（０、０．０１、０．１及び１μｇ／ｍｌ）の組換え体非構造蛋白質（Ｎ
Ｓ３、ＮＳ４及びＮＳ５）（Ｍｉｋｒｏｇｅｎ、Ｍｕｎｉｃｈ）で刺激された。
陰性コントロールとして、エフェクター細胞は同濃度の組換え体ＨＣＶ−コア又
はＨｂｓＡｇ蛋白質（Ｅｎｅｒｇｉｘ）により刺激された。３日間の刺激後、3 Ｈ−チミジンが加えられた（１μＣｉ／ウエル）。細胞はさらに１８時間培養さ
れ、収集後ＤＮＡ中への3Ｈ−チミジンの取り込みが測定された。放射活性の取 り込みはバックグランド活性（△ｃｐｍ）で補正された。サイトカイン放出の測
定に関しては、エフェクター細胞を上記同様に培養し、培養上清中のＩＬ２、Ｉ
Ｌ−４及びインターフェロンガンマ値をメーカー（Ｅｎｄｏｇｅｎ、Ｂｏｓｔｏ
ｎ，ＭＡ）の指示に従い市販キットを使用し測定した。 【００４７】 非構造蛋白質に対する細胞介在免疫応答を調べるために、脾臓細胞を集め、組
換え体抗原、又は安定したトランスフェクト細胞株によりインビトロで発現され
た抗原のいずれかを用い刺激した。［3Ｈ］チミジン取り込みにより測定したと ころ、各種抗原濃度に於いて全ての非構造蛋白質により本質的なリンパ細胞の増
殖が誘導された（図２Ｂ）参照。最大刺激を生む方法である、組換え体蛋白質に
よるｉ．ｐ．免疫では、３種類全ての蛋白質について５−１０倍高いリンパ細胞
増殖速度を得た（データ未提示）。ＤＮＡベースの免疫を行った後に測定された
サイトカインプロフィールは、細胞培地中に高レベルのＩＦＮ−γ（図２Ｃ）及
びＩＬ−２（図２Ｄ）を放出する典型的はＴ１応答を示した。逆に、ＨＣＶ非構
造蛋白質をコードする遺伝子で遺伝子的に免疫した後のＩＬ−４産生は極めて少
なかった（図２Ｅ）。 【００４８】 図２Ｃ、２Ｄ及び２Ｅは、インビトロ刺激４８時間後に測定された、上清中に
分泌されたサイトカインを示している。ＮＳ３、ＮＳ４及びＮＳ５蛋白質をコー
ドする全てのＤＮＡ構築体は、ＴH１型のサイトカインプロフィールを誘導した 。比較の為、組換え体蛋白質（ｎ＝４）で３回ｉ．ｐ．免疫したマウスの結果を
示す。陰性コントロールとして、マウスは組換えＨｂｓＡｇで免疫された。 実施例６：細胞傷害性Ｔリンパ細胞活性 免疫したマウス由来の脾臓細胞を１０％ＦＣＳ及び２−メルカプトエタノール
（５×１０-5Ｍ）入り完全ＤＭＥＭに懸濁し、インビトロ刺激５日後に細胞傷害
活性を解析した。組換え体マウスＩＬ−２を１回５Ｕ／ｍｌの濃度で加え、応答
細胞（４×１０7）を完全長のＮＳ３又はＮＳ５蛋白質を安定して発現している ２×１０6個の放射線照射済み（１０，０００ｒａｄ）同系ＳＰ２／０細胞（Ｓ Ｐ２／ＮＳ３−３、ＳＰ２／ＮＳ５−２１）と共培養した。５日後、細胞傷害性
応答細胞集団を集め、９６ウエル丸底型プレート内にて51Ｃｒ−標識したＳＰ２
／ＮＳ３−３又はＳＰ２／ＮＳ５−２１を用いた４時間の51Ｃｒ放出アッセイを
行った。ＨＣＶコア蛋白質を発現する親ＳＰ２／０又はＳＰ２−１９を、溶解活
性及びバックグランド活性の抗原特異性に関するコントロールとして用いた。Ｃ
ＴＬ活性に関するアッセイを、リンパ細胞エフェクター対標的細胞（Ｅ：Ｔ）比
、１００：１、３０：１、１０：１及び３：１それぞれについて実施した。エフ
ェクター細胞をハイブリドーマ上清ＧＫ１．５（抗ＣＤ４、ラット）；３．１５
５（抗ＣＤ８、ラット）を含む抗ＣＤ４＋又はＣＤ８＋ｍＡｂと３０分間、４℃
にてインキュベーションし、洗浄、その後３７℃にて補体（低傷害性ウサギ補体
の１：５希釈体（Ｇｅｄａｒｌａｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｏｎｔａｒ
ｉｏ、Ｃａｎａｄａ））とインキュベートし、Ｔ細胞欠失実験を行った。 【００４９】 ＣＴＬ応答は感染細胞からのウイルス排除に必須であることから、安定にトラ
ンスフェクトされＮＳ３及びＭＳ５蛋白質を発現している同系ＳＰ２／０マウス
骨髄腫標的細胞を溶解する免疫マウス由来の脾臓細胞の能力を、51Ｃｒ放出アッ
セイを用いて調べた。ＮＳ３及びＮＳ５で免疫したマウスは、インビトロ刺激５
日後に、強力かつ特異的な細胞傷害性Ｔ細胞応答を阻害したが、標的細胞特異性
に関するコントロールに用いたＳＰ２／０又はＳＰ２−１９（安定にＨＣＶコア
蛋白質を発現している）細胞に対しては弱い活性が観察された（素３Ａ及び３Ｂ
）。特異的溶解を生じた細胞の表現形を示すために、脾臓細胞を補体存在下にＣ
Ｄ８＋又はＣＤ４＋応答性モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）とインキュベートし
た。細胞傷害活性はＣＤ８＋細胞により伝達された（図３Ｃ）。 我々はＮＳ４ 蛋白質を安定して発現するＳＰ２／０細胞を樹立できなかったため、このＨＣＶ
非構造蛋白質に対するＣＴＬ活性は測定されなかった。 【００５０】 図３は、各種エフェクター対標的細胞比（１００：１、３０：１、１０：１，
３：１）に於けるＮＳ３（Ａ）及びＮＳ５（Ｂ）に対する細胞傷害性Ｔ細胞（Ｃ
ＴＬ）応答を示す。脾臓細胞を放射線照射された安定型ＮＳ３及びＮＳ５発現マ
ウス骨髄細胞とインビトロにて５日間インキュベーションさせた（ｎ＝５）。続
いて、４時間の安定型トランスフェクト標的細胞株に対するＣｒ５１放出アッセ
イにてＣＴＬ活性を測定した。ＳＰ２／０又はＳＰ２−１９（ＨＣＶコアを発現
する）に対するバックグランド活性を差し引き特異的溶解値を得た。図３Ｃは、
細胞を３０分間氷上にて抗ＣＤ８＋又はＣＤ４＋ｍＡｂとインキュベートし、更
に３０分間３７℃にて補体とインキュベートしたＴ細胞欠乏実験（ｎ＝３）を示
す。コントロール細胞は補体及び抗ＣＤ８＋又は抗ＣＤ４＋ｍＡｂｓ無しにイン
キュベートした。バックグランド活性は、ＨＣＶコア発現構築体が安定にトラン
スフェクトされた無関係の陰性コントロールとしてＳＰ２−１９に対し決定され
た。 実施例７：インビボに於ける細胞傷害性Ｔリンパ細胞活性の評価 現在に至るもＣＴＬ活性の利用できる非構造蛋白質を発現する安定した細胞株
が樹立されていないことから、ＣＴＬ実験を行うことは極めて困難であった。マ
ウスを筋肉内（ｉ．ｍ．）に３回模擬ＤＮＡまたはｐＡｐＮＳ５で免疫した。い
くつかの動物については、さらに組換え体ＮＳ５蛋白質又は両方の組み合わせに
よりｉ．ｐ．免疫した。組換え体蛋白質（５μｇｉ．ｐ．）はＨＣＶ−ＮＳ５ａ
及びＨＣＶ ＮＳ５ｂ領域の一部（完全長ＮＳ５の約５０％）をカバーする大腸
菌発現蛋白質ＮＳ５−４（ａａ２６２２−２８６８）及びＮＳ５−１２（ａａ２
００７−２２６８）の混合体（Ｍｉｋｒｏｇｅｎ、Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎ
ｙ）として投与され。各種プラスミド構築体または組換え体蛋白質による最終免
疫から１週間後に安定してＮＳ５を発現している２×１０6個の同系ＳＰ２／０ 由来細胞を洗浄し、２００μｌのＰＢＳに再懸濁してから右脇腹に皮下接種した
。ＳＰ２／０細胞はＨＣＶ ＮＳ５（ＳＰ２／ＮＳ５−２１）又はＨＣＶコア蛋
白質ＳＰ２／１９）のいずれかを発現していた。この動物モデルでは、接種１５
日後に腫瘍の形成が調べられ、腫瘍を持つ動物の数と腫瘍重量が決定された。 【００５１】 模擬ＤＮＡで免疫され、ＮＳ５発現マウス骨髄細胞株（ＳＰ２／ＮＳ５−１２
）を投与されたマウスでは、１５日後に腫瘍を発生したのは４０％のみであった
。更に、模擬ＤＮＡまたは組換え体ＮＳ５蛋白質で免疫されたマウス、又はコン
トロールである別種のＨＣＶ構造蛋白質（ＨＣＶコア）を発現している同一の同
系ＳＰ２／０細胞株で免疫されたマウスに比べ、腫瘍重量の測定により決定され
た腫瘍の大きさは小さかった（図４Ａ及び４Ｂ）。さらに、模擬ＤＮＡで免疫さ
れたマウス、又はＳＰ２−１９細胞を投与されたマウスの９０−１００％が腫瘍
形成を示し、従ってこの小動物腫瘍モデルに於けるＣＴＬ活性の特異性が示され
た。ＣＦＡに於いて組換えＮＳ５蛋白質による免疫が腫瘍形成から動物を保護し
なかったことは重要である。ＤＮＡベース免疫と組換え蛋白質ワクチン接種の組
み合わせの効果を確かめるため、１動物群を両者で免疫した。腫瘍形成に対する
部分的保護は認められたが、本方法はＮＳ蛋白質をコードするＤＮＡによる３回
免疫程効果はなかった（図４Ａ）。 【００５２】 図４ＡはＣＴＬ活性を調べるための腫瘍動物モデルから得た結果を例示してい
る。マウスはｐＡｐＮＳ５又は模擬ＤＮＡ（１００μｇ）のｉ，ｍ．又は組換え
体ＮＳ５蛋白質のｉ．ｐ．（５μｇ）のいずれかにより３回免疫された。最後の
グループにはＤＮＡ免疫と組換え体蛋白質の組み合わせが投与された。ＳＰ２Ｎ
Ｓ５−２１またはＳＰ２−１０細胞による腫瘍接種１５日後、腫瘍を発生したマ
ウスの数を決定し、腫瘍重量を測定した。図４Ｂは左から右に模擬ＤＮＡで免疫
し、ＳＰ２／ＮＳ５−２１細胞を接種された動物；ｐＡｐＮＳ５で免疫されＳＰ
２／ＮＳ５−２１細胞を接種された動物；ｐＡｐＮＳ５で免疫されＳＰ２−１９
（ＨＣＶコアを安定して発現する）細胞を接種された動物；及び組換え体ＮＳ５
蛋白質の３回のｉ．ｐ．で免疫されＳＰ２／ＮＳ５−２１細胞を接種された動物
を示す。第１、第３及び第４動物には右脇腹に大きな腫瘍が形成したが、ｐＡｐ
ＮＳ５で免疫されＮＳ５を安定に発現しているマウス肉芽腫細胞株であるｐＡｐ
ＮＳ５を接種された第２動物では発生しなかった。 【配列表】 【図面の簡単な説明】 【図１】 図１Ａは、矢印で示す様に各種構造及び非構造蛋白質に宿主のシグ
ナル及びウイルスプロテアーゼにより分断される、約３０１１−３０３０ａａの
ポリ蛋白質をコードするＨＣＶの単一な大きなＯＲＦを図示している。図１Ｂは
、ＨｕＨ−７の一過性トランスフェクションとＳＰ２／０細胞の安定トランスフ
ェクション後の非構造蛋白質の発現のオートラジオグラフィーの例示を示す。レ
ーン１，３及び５は模擬ＤＮＡトランスフェクト細胞であり、陰性コントロール
に用いた（Ｍｏｃｋ）；レーン２、４及び６はＮＳ３の約７０ｋＤのバンド、Ｎ
Ｓ４の約３０ｋＤのバンド、ＮＳ５の１２５ｋＤの特異バンドを示す。レーン７
及び９は陰性コントロールとして用いた安定してＨＣＶコア蛋白質発現する細胞
に由来する細胞溶解物（ＳＰ２−１０）を、レーン８及び１０はＮＳ３及びＮＳ
５の特異発現を示す。 【図２】 図２ＡはＤＮＡをベースとする免疫により生じたＮＳ３、ＮＳ４及
びＮＳ５に対する液製免疫応答例を表す棒を示す；血清抗体レベルはＥＬＩＳＡ
により測定した（各群：ｎ＝５）。図２Ｂは、特異的又は非特異的組換え体蛋白
質によりインビトロで刺激した３日後に測定されたＴ細胞増殖例を表す棒グラフ
である。図２Ｃ、２Ｄ及び２Ｅはそれぞれ、インビトロ刺激４８時間後に測定さ
れた上清中に分泌されたＩＦＮ−γ、ＩＬ−２及びＩＬ−４を表す棒グラフであ
る。 【図３】 図３Ａ及び３Ｂは、それぞれ様々なエフェクター細胞対標的細胞（
１００：１、３０：１、１０：１、３：１）比に於けるＮＳ３及びＮＳ５に対す
る細胞傷害性Ｔ細胞の例を示す棒グラフである。図３Ｃは、安定したトランスフ
ェクト標的細胞株に対するクロム放出アッセイの例を示す棒グラフである。 【図４】 図４ＡはＣＴＬ活性を調べる腫瘍モデルの結果例を示す表である。
図４Ｂは、左から右に１）模擬ＤＮＡで免疫されＳＰ２／ＮＳ５−２１細胞投与
を受けた動物；２）ｐＡｐＮＳ５で免疫されＳＰ２／ＮＳ５−２１細胞投与を受
けた動物；３）ｐＡｐＮＳ５で免疫されＳＰ２−１９（ＨＣＶコアを安定に発現
している）投与を受けた動物；及び４）組換え体ＮＳ５蛋白質を３回ｉ．ｐ．投
与し免疫し、ＳＰ２／ＮＳ５−２１細胞を投与した動物を示す。
【手続補正書】 【提出日】平成１３年３月１２日（２００１．３．１２） 【手続補正１】 【補正対象書類名】図面 【補正対象項目名】図１ 【補正方法】変更 【補正内容】 【図１】 【手続補正２】 【補正対象書類名】図面 【補正対象項目名】図３ 【補正方法】変更 【補正内容】 【図３】 【手続補正３】 【補正対象書類名】図面 【補正対象項目名】図４ 【補正方法】変更 【補正内容】 【図４】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 31/12 Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 15/00 ＺＮＡＡ 1/21 Ａ６１Ｋ 37/02 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ， ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，Ｌ Ｔ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ， ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，Ｕ Ａ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 エンケ，ジェンス アメリカ合衆国マサチューセッツ州02114， ボストン，ジョイ・ストリート・ナンバー ３，41 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA03 DA01 DA02 DA05 DA11 EA04 GA11 HA01 4B065 AA01X AA57X AA87X AA96Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA45 4C084 AA02 AA07 AA13 BA35 CA53 NA01 NA14 ZB022 ZB261 ZB331 4C085 AA03 BA51 CC08

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 【請求項１】 Ｃ型肝炎ウイルス非構造蛋白質をコードするヌクレオチド配列
    を含む組換え体核酸分子 【請求項２】 非構造蛋白質がＮＳ３、ＮＳ４及びＮＳ５を含むグループより
    選択される請求項１の組換え体核酸分子。 【請求項３】 ヌクレオチド配列が、ＮＳ３、ＮＳ４又はＮＳ５をコードして
    いる融合蛋白質、又はそのいずれかの組み合わせをコードする請求項１の組換え
    体核酸分子。 【請求項４】 ヌクレオチド配列が、ＮＳ３、ＮＳ４及びＮＳ５を含むグルー
    プより選択される非構造蛋白質の少なくとも５０アミノ酸の断片をコードしてい
    る請求項１の組換え体核酸分子。 【請求項５】 ヌクレオチド配列がヒト細胞内で機能する制御要素と作動可能
    に連結している請求項２の組換え体核酸分子。 【請求項６】 ヌクレオチド配列が、プロモーター、エンハンサー、ポリアデ
    ニレーション配列及び任意にＣ型肝炎ウイルスの５’ＵＴＲと作動可能に連結さ
    れた請求項５の組換え体核酸分子。 【請求項７】 プロモーターがサイトメガロウイルスプロモーターであり、エ
    ンハンサーがサル肉腫ウイルスエンハンサーである請求項６の組換え体核酸分子
    。 【請求項８】 請求項１の核酸分子を含む組換え体宿主細胞。 【請求項９】 ａ）ヌクレオチド配列が作動可能にヒト細胞内で機能する制御
    要素と連結している請求項１の組換え体核酸分子；及び ｂ）医薬として受容可能な担体又は希釈体；を含む医薬組成物。 【請求項１０】 ヌクレオチド配列がＮＳ３、ＮＳ４及びＮＳ５を含むグルー
    プより選択される非構造蛋白質をコードする請求項９の医薬組成物。 【請求項１１】 ヌクレオチド配列が、ＮＳ３、ＮＳ４又はＮＳ５をコードす
    る融合蛋白質又はそのいずれかの組み合わせをコードする請求項９の医薬組成物
    。 【請求項１２】 ヌクレオチド配列が、ＮＳ３、ＮＳ４及びＮＳ５を含むグル
    ープより選択される非構造蛋白質の少なくとも５０アミノ酸の断片をコードして
    いる請求項９の医薬組成物。 【請求項１３】 ヒト細胞内で機能する制御要素がプロモーター、エンハンサ
    ー、ポリアデニレーション配列及び任意にＣ型肝炎ウイルスの５’ＵＴＲを含む
    、請求項１０の医薬組成物。 【請求項１４】 プロモーターがサイトメガロウイルスプロモーターであり、
    エンハンサーがサル肉腫ウイルスエンハンサーである請求項１３の医薬組成物。 【請求項１５】 更に促進体を含む請求項９の医薬組成物。 【請求項１６】 促進体がブビバカインである請求項１５の医薬組成物。 【請求項１８】 Ｃ型肝炎ウイルス未感染者に、Ｃ型肝炎ウイルスに対する免
    疫応答誘導に効果的な量の請求項１の組換え体核酸分子を少なくとも１種類投与
    することを含む、未感染者にＣ型肝炎ウイルスに対する免疫応答を誘導する方法
    。 【請求項１９】 非構造蛋白質がＮＳ３、ＮＳ４及びＮＳ５を含むグループよ
    り選択される請求項１８の方法。 【請求項２０】 ヌクレオチド配列がＮＳ３、ＮＳ４又はＮＳ５をコードする
    融合蛋白質、またはそのいずれかの組み合わせをコードする請求項１８の方法。 【請求項２１】 ヌクレオチド配列が、ＮＳ３、ＮＳ４及びＮＳ５を含むグル
    ープより選択される非構造蛋白質の少なくとも５０アミノ酸の断片をコードして
    いる請求項１８の方法。 【請求項２２】 ヌクレオチド配列がヒト細胞内で機能する制御要素に作動可
    能に連結されている請求項１９の方法。 【請求項２３】 ヌクレオチド配列が作動可能にプロモーター、エンハンサー
    、ポリアデニレーション配列及び任意にＣ型肝炎ウイルスの５’ＵＴＲに連結さ
    れた請求項２２の方法。 【請求項２４】 プロモーターがサイトメガロウイルスプロモーターであり、
    エンハンサーがサル肉腫ウイルスエンハンサーである請求項２３の方法。 【請求項２５】 免疫応答が細胞応答を含む請求項１８の方法。 【請求項２６】 免疫応答が液性応答を含む請求項１８の方法。 【請求項２７】 組換え体核酸分子が医薬品として受容可能な担体又は希釈体
    を含む医薬組成物である請求項１８の方法。 【請求項２８】 医薬組成物が更に促進体を含む請求項２７の方法。 【請求項２９】 促進体がブピバカインである請求項２８の方法。 【請求項３０】 Ｃ型肝炎ウイルスに感受性であるヒトに免疫応答誘導有効量
    の請求項９の医薬組成物の量を投与することを含む、Ｃ型肝炎ウイルスに感受性
    なヒトを免疫する方法。 【請求項３１】 ヒトに対し、ブピバカインが医薬組成物投与部位に投与され
    る請求項３０の方法。 【請求項３２】 Ｃ型肝炎ウイルスに感受性であるヒトに、免疫応答誘導有効
    量の請求項１の組換え体核酸分子の量を投与することを含む、Ｃ型肝炎ウイルス
    に感受性なヒトを免疫する方法。 【請求項３３】 Ｃ型肝炎ウイルスに感染したヒトにＣ型肝炎ウイルスに対す
    る治療的免疫応答を誘導するのに効果的な量の請求項９の医薬組成物の投与する
    ことを含む、Ｃ型肝炎感染者を治療する方法。 【請求項３４】 ヒトに対し、医薬組成物投与部位にブピバカインが投与され
    る請求項３３の方法。
JP2000529347A 1998-01-30 1999-01-28 Ｃ型肝炎ウイルスの非構造蛋白質による遺伝的免疫感作 Withdrawn JP2002501737A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US7315698P 1998-01-30 1998-01-30
US60/073,156 1998-01-30
PCT/US1999/001823 WO1999038880A1 (en) 1998-01-30 1999-01-28 Genetic immunization with nonstructural proteins of hepatitis c virus

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2002501737A true JP2002501737A (ja) 2002-01-22

Family

ID=22112053

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2000529347A Withdrawn JP2002501737A (ja) 1998-01-30 1999-01-28 Ｃ型肝炎ウイルスの非構造蛋白質による遺伝的免疫感作

Country Status (9)

Country Link
EP (1) EP1056762A4 (ja)
JP (1) JP2002501737A (ja)
KR (2) KR20060057653A (ja)
CN (3) CN101126095A (ja)
AU (1) AU746258B2 (ja)
BR (1) BR9908540A (ja)
CA (1) CA2318744A1 (ja)
IL (1) IL137458A0 (ja)
WO (1) WO1999038880A1 (ja)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6562346B1 (en) * 1999-10-27 2003-05-13 Chiron Corporation Activation of HCV-specific T cells
CA2390082C (en) * 1999-11-24 2010-06-29 Chiron Corporation Novel hcv non-structural polypeptide
US6986892B1 (en) 1999-11-24 2006-01-17 Chiron Corporation Immunogenic Hepatitis C virus non-structural polypeptides
DK1436397T3 (da) 2001-10-11 2010-08-09 Merck Sharp & Dohme Hepatitis C virus vaccine
FR2855758B1 (fr) 2003-06-05 2005-07-22 Biomerieux Sa Composition comprenant la polyproteine ns3/ns4 et le polypeptide ns5b du vhc, vecteurs d'expression incluant les sequences nucleiques correspondantes et leur utilisation en therapeutique
KR101913674B1 (ko) * 2011-10-24 2018-10-31 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 개선된 hcv 백신 및 이것을 사용하는 방법

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE433460T1 (de) * 1990-04-04 2009-06-15 Novartis Vaccines & Diagnostic Protease von hepatitis c virus
US5593972A (en) * 1993-01-26 1997-01-14 The Wistar Institute Genetic immunization
NZ262582A (en) * 1993-01-26 1997-10-24 David B Weiner Compositions and methods for delivery of genetic material
AU5924396A (en) * 1995-05-22 1996-12-11 Bionova Corporation Compositions and methods for the diagnosis of, and vaccinati on against, hepatitis c virus (hcv)
ATE311463T1 (de) * 1996-05-24 2005-12-15 Chiron Corp Fusionsprotein mit multiplen epitopen
EP1009763A4 (en) * 1996-06-11 2002-08-07 Merck & Co Inc SYNTHETIC GENES OF HEPATITIS C
WO1999029843A1 (en) * 1997-12-11 1999-06-17 Smithkline Beecham Corporation Hepatitis c virus ns5b truncated protein and methods thereof to identify antiviral compounds

Also Published As

Publication number Publication date
CN101126095A (zh) 2008-02-20
CN1289339A (zh) 2001-03-28
KR20060057653A (ko) 2006-05-26
EP1056762A1 (en) 2000-12-06
CA2318744A1 (en) 1999-08-05
WO1999038880A1 (en) 1999-08-05
IL137458A0 (en) 2001-07-24
CN101126094A (zh) 2008-02-20
EP1056762A4 (en) 2003-07-23
AU2478699A (en) 1999-08-16
CN100335637C (zh) 2007-09-05
KR20010086226A (ko) 2001-09-10
KR100628411B1 (ko) 2006-09-28
BR9908540A (pt) 2000-11-28
AU746258B2 (en) 2002-04-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Encke et al. Genetic immunization generates cellular and humoral immune responses against the nonstructural proteins of the hepatitis C virus in a murine model
Wu et al. Protection against lethal enterovirus 71 infection in newborn mice by passive immunization with subunit VP1 vaccines and inactivated virus
AU746965B2 (en) Cloned genomes of infectious hepatitis C viruses and uses thereof
Saito et al. Plasmid DNA-based immunization for hepatitis C virus structural proteins: immune responses in mice
CN115948467A (zh) 针对乙型肝炎病毒的疫苗
Wedemeyer et al. Oral immunization with HCV-NS3—transformed Salmonella: Induction of HCV-specific CTL in a transgenic mouse model
Matsui et al. Enhanced induction of hepatitis C virus-specific cytotoxic T lymphocytes and protective efficacy in mice by DNA vaccination followed by adenovirus boosting in combination with the interleukin-12 expression plasmid
Ma et al. DNA-based vaccination against hepatitis C virus (HCV): effect of expressing different forms of HCV E2 protein and use of CpG-optimized vectors in mice
Arichi et al. Prophylactic DNA vaccine for hepatitis C virus (HCV) infection: HCV-specific cytotoxic T lymphocyte induction and protection from HCV-recombinant vaccinia infection in an HLA-A2. 1 transgenic mouse model
US20050277192A1 (en) Hepatitis C virus nonstructural protein 4A (NS4A) is an enhancer element
JP2002501737A (ja) Ｃ型肝炎ウイルスの非構造蛋白質による遺伝的免疫感作
US20070032444A1 (en) Genetic immunization with nonstructural proteins of hepatitis C virus
EP1448223B1 (en) Thymosin augmentation of genetic immunization
JPH11501204A (ja) 肝炎ウィルスワクチン
AU2002360315B2 (en) Thymosin augmentation of genetic immunization
US20160215023A1 (en) Simple vaccines from dna launched suicidal flaviviruses
JP2007532091A (ja) Ｃ型肝炎ウイルス非構造タンパク質４ａ（ｎｓ４ａ）はエンハンサーエレメントである
AU2002360315A1 (en) Thymosin augmentation of genetic immunization
AU2298602A (en) Hepatitis virus vaccines
JP2008508890A6 (ja) 組換え生鶏痘ウィルスベクター及びｃ型肝炎ウィルスに対する薬剤組成物中でのそれらの使用
JP2008508890A (ja) 組換え生鶏痘ウィルスベクター及びｃ型肝炎ウィルスに対する薬剤組成物中でのそれらの使用

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20060126

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20060126

A761 Written withdrawal of application

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761

Effective date: 20080604

A072 Dismissal of procedure [no reply to invitation to correct request for examination]

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A073

Effective date: 20080929

A072 Dismissal of procedure [no reply to invitation to correct request for examination]

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A072

Effective date: 20090202

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20090414

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20090915