JPH11501204A - 肝炎ウィルスワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 Ｃ型肝炎とＢ型肝炎が融合した不完全なウィルスのゲノムあるいは、Ｃ型肝炎ウィルスの不完全なウィルスのゲノム（これには特定の提供されたＤＮＡ配列が含まれている）からなる核酸分子が提供される。核酸分子を含む薬剤組成物も提供され、この組成物の核酸分子は、完全なＣ型肝炎コアタンパクとＢ型肝炎Ｓ遺伝子タンパクをコードする核酸配列を含むＣ型肝炎とＢ型肝炎の不完全なゲノムか、あるいは完全なＣ型肝炎コアタンパクをコードする核酸配列を含むＣ型肝炎ウィルスの不完全なウィルスのゲノムからなり、ヒトの細胞内で機能する調節要素と機能可能に連結されている。そのような薬剤組成物を投与する工程を含めた、Ｂ型肝炎ウィルスおよび／またはＣ型肝炎ウィルスによる影響を受けやすいかあるいは感染をしているヒトに対して免疫を施す方法も提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 肝炎ウィルスワクチン 発明の分野 本発明は、遺伝子免疫法において抗ーＣ型肝炎ウィルスワクチン成分として有 用である遺伝子構築物、ヒトをＣ型肝炎ウィルス感染から防御する方法、Ｃ型肝 炎ウィルスに感染したヒトの治療をする方法、遺伝子免疫法において抗ーＢ型肝 炎ウィルスおよび／または抗ーＣ型肝炎ウィルスワクチン成分として有用である 組換えキメラ遺伝子の構築、遺伝子構成ワクチン成分として有用である遺伝子構 築物、ヒトを抗ーＢ型肝炎ウィルスおよび／または抗ーＣ型肝炎ウィルス感染か ら防御する方法、そして抗ーＢ型肝炎ウィルスおよび／またはＣ型肝炎ウィルス に感染したヒトの治療をする方法に関する。本出願は、１９９４年１０月４日に 出願された米国特許出願第０８／３１８，２４８号および、１９９５年６月６日 に出願された米国特許出願第０８／４６７，８５９号に関連するもので、双方と も参考文献として本明細書中に援用される。 発明の背景 Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）は、輸血により感染する非Ａ型、非Ｂ型肝炎ウィ ルスの主要な病原体であるが、米国において年間新たに起こる１５万例の急性ウ ィルス性肝炎の原因である。グリーンバーガー（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｎ． Ｊ．）、１９８３、「Ｃ型肝炎に対する新しいアプローチ」、Ｃｏｎｔｅｍｐｏ ｒａｒｙ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｆｅｂ：６４。これらの感染 の約半数は慢性の感染に移行し、慢性の感染には肝硬変および／または肝細胞ガ ンがともなう可能性がある。（Ａｌｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９９２，２５８，１３５−１４０； ａｎｄ Ａｌｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．，１９９２，３２７，１８９９−１９０５）。加 えて、抗ーＨＣＶ抗体の行き渡ることによって示されているように、ＨＣＶ感染 は、肝細胞ガンの発生にとって、単独でも危険因子である。（Ｃｏｌｏｍｂｏ， ｅｔ ａｌ．， Ｌａｎｃｅｔ，１９８９，ｉｉ，１００６−１００８； Ｓａ ｉｔｏ，ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１ ９９０，８７，６５４７−６５４９； Ｓｉｍｏｎｅｔｔｉ，ｅｔ ａｌ．， Ａｎ．Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．，１９９２，１１６，９７−１０２； ａｎｄ Ｔｓｕ ｋｕｍａ，ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．，１９９３，３２８ ，１７９７−１８０１）。 ＨＣＶは、エンベロープを持ち、＋鎖ＲＮＡを持つウィルスで、全長約９５０ ０ヌクレオチドを持ち、近年、フラビウィルス科の中の単独の属として分類され た。（Ｈｅｉｎｚ，Ｆ．Ｘ．， Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．，（補遺），１９９２ ，４，１６３−１７１）。異なる単離株が多数のヌクレオチド配列の多様性を示 し、結果としてＨＣＶゲノムの下位区分は少なくとも８つの遺伝子型に分けられ る。（Ｓｉｍｍｏｎｄｓ，ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９ ３，７４，２３９１−２３９９）。すべての遺伝子型において、ウィルスゲノム は、一つの大きなオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み、そのＯＲＦ は３０１０から３０３３アミノ酸からなる分子量約３３０Ｋｄのポリプロテイン の前駆体をコードする。（Ｃｈｏｏ，ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９１，８８，２４５１−２４５５； Ｉｎｃｈａ ｕｓｐｅ，ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ， １９９１，８８，１０２９２−１０２９６； Ｋａｔｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏ ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９０，８７，９５２４−９５２ ８； Ｏｋａｍｏｔｏ，ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９１ ，７２，２６９７−２７０４； ａｎｄ Ｔａｋａｍｉｚａｗａ，ｅｔ ａｌ． ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９１，６５，１１０５−１１１３）。 個々のＨＣＶのポリペプチドは、前駆体ポリペプチドをタンパク分解処理する ことにより作り出され、コアタンパク（Ｃ），エンベロープタンパク（Ｅ１，Ｅ ２）、非構造タンパク（ＮＳ２−ＮＳ５）を作り出す。（Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌ ａｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９３，６７，３８ ３５−３８４４； Ｇｒａｋｏｕｉ，ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ ．，１９９３，６７，２８３２−２８４３； ａｎｄ Ｓｅｌｂｙ，ｅｔ ａｌ ．， Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９３，７４，１１０３−１１１３）。このタ ンパク分解は、細胞がコードするタンパク分解酵素とウィルスがコードするタン パク分解酵素との両者の組み合わせにより触媒される。 翻訳される領域に加えて、ＨＣＶのゲノムは５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）と ３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）の両方もまた含んでいる。５’ＵＴＲのうち３２ ４ー３４１番目のヌクレオチドは、現在までに報告されたすべてのＨＣＶ単離株 のあいだで最もよく保存されている配列に相当する。（Ｈａｎ，ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９１，８８，１７１１ −１７１５； ａｎｄ Ｂｕｋｈ，ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９２，８９，４９４２−４９４６）。この５’ＵＴ ＲにはＨＣＶのＲＮＡの複製および／または翻訳にとって重要な調節要素が含ま れていると推測されている。５’ＵＴＲにはまた、いくつかの小さなオープンリ ーディングフレーム（ＯＲＦ）が含まれているが、しかし現在のところこれらの ＯＲＦ配列が実際に翻訳されているということを示唆する証拠は何もない。 ＨＣＶのコア遺伝子は核酸を基礎とした抗ウィルスのアプローチのための重要 な標的となりうる。ＨＣＶのポリプロテイン前駆体の最初の１９１アミノ酸は、 ウィルスの核カプシドタンパクに相当すると考えられている。このタンパク質は 、塩基性のＲＮＡ結合性アミノ末端領域と、高度に疎水性のカルボキシル末端領 域を含む。（Ｂｕｋｈ，ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，１９９４，９１，８２３９−８２４３； ａｎｄ Ｓａｎｔｏｌｉ ｎｉ，ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９４，６８，３６３１−３６４ １）。成熟した２１ＫＤａのコアタンパクは、ポリプロテイン前駆体から細胞の シグナルペプチダーゼの働きにより切り出され、そしてＨＣＶの核カプシドタン パクは、小胞体膜の細胞質側の表面に安定に結合していることを示唆する証拠が ある。（Ｈｉｊｉｋａｔａ，ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９１，８８，５５４７−５５５１； ａｎｄ Ｓａｎｔｏ ｌｉｎｉ，ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９４，６８，３６３１−３ ６４１）。エンベロープの糖タンパクが、Ｅ２のアミノ末端領域に高度可変領域 を含んでいる（Ｗｅｉｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌ．，１９９１，１８ ０，８４２ −８４８； ａｎｄ Ｗｅｉｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９２，８９，３４６８−３４７２）のに対して， コアタンパクは異なる遺伝子型を持つＨＣＶのあいだでもよく保存されており、 宿主の免疫応答を引き起こす。（Ｂｕｋｈ，ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９４，９１，８２３９−８２４３； ａｎ ｄ Ｈｏｕｇｈｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．， Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，１９９１，１ ４，３８１−３８８）。かつての研究で示されたように、ＨＣＶ感染をしたヒト の大多数が、ＨＣＶのコアタンパクに対する抗体を感染経過の初期に合成してい る。（Ｃｈｉｂａ，ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ，１９９１，８８，４６４１−４６４５； Ｈｏｓｅｉｎ，ｅｔ ａｌ． ， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９１，８８，３６４ ７−３６５１； Ｈｓｕ，ｅｔ ａｌ．， Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，１９９３， １７，７６３−７７１； Ｋａｔａｙａｍａ，ｅｔ ａｌ．， Ｈｅｐａｔｏｌ ｏｇｙ，１９９２，１５，３９１−３９４； Ｎａｓｏｆｆ，ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９１，８８，５４６２− ５４６６； ａｎｄ Ｏｋａｍｏｔｏ，ｅｔ ａｌ．， Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ，１９９２，１５，１８０−１８６）。さらに、核カプシドタンパクは、ＨＣＶ に対する細胞性免疫応答の重要な標的である。（Ｂｏｔａｒｅｌｌｉ，ｅｔ ａ ｌ．， Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，１９９３，１０４，５８０−５８７； Ｋｏｚｉｅｌ，ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９３，６７，７５２ ２−７５３２； ａｎｄ Ｓｈｉｒａｉ，ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．， １９９３，６８，３３３４−３３４２）。最後に、最近の観察報告で、ＨＣＶの コアタンパクが、いくらかの遺伝子調節機能もまた持っている可能性があること を示唆するものがある。（Ｓｈｉｈ，ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９ ９３，６７，５８２３−５８３２）。ウィルスゲノムの高突然変異率はおそらく ウィルス複製のあいだに、そして免疫による選別のあいだに起こりうる。この現 象は、持続性のウィルス感染の成立と、その後に続いて起こる慢性的な疾患に関 連するのであろう。（Ｗｅｉｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９２，８９，３４６８−３４７２； Ｋａｔｏ，ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ ｍ．，１９９２，１８９，１１９−１２７； ａｎｄ Ａｌｔｅｒ，ｅｔ ａｌ ．， Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．，１９９２，３２７，１８９９−１９０５ ）。 ＨＣＶ感染の間の肝臓の傷害とウィルスの除去に関連する細胞性免疫の経過は 、まだほんの部分的にしか解明されていない。ＨＣＶが慢性的に感染した患者の 肝臓に浸潤したリンパ球が持つ、潜在的な病原性の役割を調べるという目的で、 コジール（Ｋｏｚｉｅｌ）らはこのような細胞（肝臓に浸潤したリンパ球）の細 胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）反応を調べ、ＨＬＡクラスＩ限定的ＣＤ８＋ＣＴ Ｌ反応があることを示し、そしてその反応がＨＣＶのポリペプチドの構造領域お よび非構造領域の両方に対していることを示した。（Ｋｏｚｉｅｌ，ｅｔ ａｌ ．， Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９３，６７，７５２２−７５３２； ａｎｄ Ｋ ｏｚｉｅｌ，ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９２，１４９，３３ ３９−３３４４）。他の研究者もまた、慢性的なＨＣＶ感染のあいだ、コアタン パクやその他のウィルス関連タンパク上のエピトープを認識する末梢血中単核球 集団の中に、ＣＴＬが存在することを示している。（Ｋｉｔａ，ｅｔ ａｌ．， Ｈｅｐａｔｏｌ．，１９９３，１８，１０３９−１０４４； ａｎｄ Ｃｅｒ ｎｙ，ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔｌ．Ｓｙｍｐ．Ｖｉｒａｌ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ．，１９９３，８３（要旨））。 ボタレッリ（Ｂｏｔａｒｅｌｌｉ）ら（Ｂｏｔａｒｅｌｌｉ，ｅｔ ａｌ．， Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，１９９３，１０４，５８０−５８７）、およ びフェラーリ（Ｆｅｒｒａｒｉ）ら（Ｆｅｒｒａｒｉ，ｅｔ ａｌ．， Ｈｅｐ ａｔｏｌ．，１９９４，１９，２８６−２９５）は、慢性的にＨＣＶ感染した患 者において、ＨＣＶの別々の領域由来のいくつかの組換えタンパクに対する、Ｈ ＬＡクラスＩＩ限定的ＣＤ４＋Ｔ細胞介在性の増殖応答を見いだした。注目すべ きことに、ＨＣＶのコアタンパクに対するＴ細胞の反応と、臨床的に良性の経過 をたどる肝臓の疾患との間に、それに引き続くウィルスの根絶との間にあるのと 同様に相関性があった。しかしながら、同様の研究において、ＨＣＶのコアタン パクに対する増殖応答は、肝臓疾患の重篤さに関しては良性の臨床経過を予言し ていない。（Ｓｃｈｕｐｐｅｒ，ｅｔ ａｌ．， Ｈｅｐａｔｏｌ．，１９９３ ，１８，１０５５−１０６０）。このように、活発な細胞性免疫とウィルス感染 の臨床経過との関連を、肝臓傷害のタイプおよびＨＣＶ感染者のＩＦＮ療法に対 する臨床反応という観点から明らかにすることは、重要なことである。この観点 から、組換えＧＳＴ−ＨＣＶコア融合タンパクに対する、末梢血単核球（ＰＢＭ Ｃ）反応に関連する研究が行われ、そのような細胞のＩＦＮ−γの産生能力の評 価が必要とされ、ＨＣＶ感染に対する個々の臨床的成果について相関性が検討さ れた。４６人の慢性肝臓疾患の患者のうち、２４人（５２％）から得られた単核 球が、コアタンパクに反応した。一方、無症候性のＨＣＶ保因者は、もっと低い 反応率しか（１５％、ｐ＜０．０５）示さなかった。さらに重要なことに、療法 がうまくいずに肝炎が進行中の人（３１％）と比べて、ＩＦＮ−α処置を受け、 また臨床的かつウィルス学的治療を受けた人は、ＨＣＶのコアタンパクに対する 反応が、より高い反応率（７５％、ｐ＜０．０５）を示す。単核球がＨＣＶのコ アタンパクに対して反応する２５人の患者のうち１８人で、１つかあるいはそれ よりも多くのペプチドに対して顕著な反応があった。そして１２人の患者で親水 性の配列を含んだペプチド混合物に対して反応した。コアタンパクの１４０ー１ ６０番アミノ酸が９人の患者で認識された。興味深いことに、ＨＬＡ ＤＲ４と ｗ５３ハプロタイプを持っている８人の患者のうち７人が１４１ー１６０番ペプ チド配列を認識した。このように、単核球反応は、一見するとＨＬＡ ＤＲ限定 的なものであるように見え、反応している細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞と同定された。 この研究は、ＨＣＶに関連した肝臓の疾患をもった患者において、ＨＣＶのコア タンパクの中に存在する、免疫顕性のＴ細胞に対するエピトープが、ＨＬＡ Ｄ Ｒ表現型と結合した状態で存在することを示している。 Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）は、主要な人の病原体であり、有効な療法は何も ない。世界中で３億人以上の人々が慢性的にこのウィルスに感染していると見積 もられている。ＨＢＶにさらされると、結果として急性または慢性の肝炎、肝硬 変、そして肝細胞ガンの発生という結果になる可能性がある。この重篤な感染の 臨床的な重要性は、特に発展途上地域に関してであり、その地域では、ＨＢＶ感 染が死亡原因の上位の一つを占めていて、また米国やヨーロッパにおいても同様 に急性および慢性肝臓疾患の主要な原因となっている。ＨＢＶは、密接に関連し たウィルスの一群であるヘパドナウィルス科の、原型となる構成ウィルスであり （Ｇａｎｅｍ，ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８ ７，５６，６５１−６９３）、特にアヒルＢ型肝炎ウィルス（ＤＨＢＶ）やウッ ドチャック肝炎ウィルス（ＷＨＶ）を含む。実験的に感染させたアヒルあるいは ウッドチャックは、急性や慢性の感染のような人の疾患の様態の多くを正確に再 現するし、また慢性的に感染したウッドチャックの場合には肝細胞ガンの発生が 再現される。（Ｓｃｈｏｄｅｌ，ｅｔ ａｌ．， 「トリＢ型肝炎ウィルスの生 物学」，Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｅｐａ ｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ，１９９１，Ｖｏｌ．３，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂ ｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，ｐｐ．５３−８０； Ｋｏｒｂａ，ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９８９，６３，１３６０−１３７０； ａｎｄ Ｋｏｒ ｂａ，ｅｔ ａｌ．， Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，１９８９，９，４６１−４７０ ）。ウィルスの複製の中間生成物は他の組織でも見つかったとはいえ、肝臓は標 的器官であり肝細胞の傷害は持続性のウィルス感染と関連している。ＨＢＶそれ 自体が細胞傷害的なウィルスではないように見える。それゆえに、ウィルス由来 のエピトープに対して引き起こされた宿主の免疫応答が肝臓の傷害を引き起こし 、そして肝臓でのウィルスの複製を低下させるように計画した処置方法は、有効 な臨床上の効果を示すことが出来うるように考えられる。 ＨＢＶのゲノムは４つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードし 、それは、１）フレーム内にプレＳ１、プレＳ２という２つのポリペプチドを含 んだエンベロープタンパクをコードするＳ遺伝子、２）まだ前ゲノム状態の３． ６ｋｂのＲＮＡをＤＮＡに逆転写するのに必要不可欠な、逆転写酵素をコードす るポリメラーゼＯＲＦ、３）ウィルスの核カプシドを完成させるために組み立て られるタンパクをコードするコア遺伝子、そして４）未知の機能のタンパク質を コードするＨＢｘのＯＲＦが含まれる。ｐｏｌ遺伝子はゲノムの８０％を占めて おり、他の３つのＯＲＦと重複している。コア遺伝子の前にはシグナルペプチド をコードするフレーム内の配列があり、続いて起こるタンパク分解性の切断によ り、ＨＢｅＡｇと呼ばれる抗原性をもつものとして認識されるタンパク質が生じ る。 ＨＢｘタンパクはインビトロではウィルスの生活環に必須なものではないことが わかっているが（Ｂｌｕｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９２，６６ ，１２３−１２７）、しかし、生体内で生産力のある感染が成立するためには必 要なものであると思われる。（Ｃｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．， １９９３，６７，１２１８−１２２６）。ＨＢｘは、様々な細胞の遺伝子やウィ ルスの遺伝子の転写に関するトランス型活性因子として機能している可能性があ り、ＨＣＣの形成に寄与できることを示唆している。（Ｓｃｈｅｋ，ｅｔ ａｌ ．， 「ヘパドナウィルスのＸタンパク質」，Ｉｎ ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏ ｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ，１９９１，Ｖ ｏｌ．９，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，ｐｐ．１８１ー １９２） ＤＮＡを動物に直接注射する方法は、免疫するために特定の抗原を導入するの に有望な方法である。（Ｂａｒｒｙ，ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑ ｕｅｓ，１９９４，１６，６１６−６１９； Ｄａｖｉｓ，ｅｔ ａｌ．， Ｈ ｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１９９３，１１，１８４７−１８５１； Ｔａｎ ｇ，ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ，１９９２，３５６，１５２−１５４； Ｗ ａｎｇ，ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９３，６７，３３３８−３３ ４４； ａｎｄ Ｗｏｌｆｆ，ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９０，２ ４７，１４６５−１４６８）。この方法は、マウスやニワトリにおいてインフル エンザウィルスに対する防御的な免疫を、マウスやウシにおいてウシ１型ヘルペ スウィルスに対する防御的な免疫を、そしてマウスにおいて狂犬病ウィルスに対 する防御的な免疫を形成するために、使用され成功している。（Ｃｏｘ，ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９３，６７，５６６４−５６６７；Ｆｙｎａ ｎ，ｅｔ ａｌ．， ＤＮＡ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１９９３，１２ ，７８５−７８９； Ｕｌｍｅｒ，ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９３ ，２５９，１７４５−１７４９； ａｎｄ Ｘｉａｎｇ，ｅｔ ａｌ．， Ｖｉ ｒｏｌ．，１９９４，１９９，１３２−１４０）。ほとんどの場合に、強力な、 しかし変異性の高い抗体と細胞傷害性Ｔ細胞反応が感染の制御と関連している。 実際、肝臓を媒介しないで長期持続的な記憶ＣＴＬを形成する潜在能力のおかげ で、不活化ワクチンを必要とする方法に比べて、この方法は特に魅力的なもので あり、急性の感染から防御するだけでなく、持続性のウィルス感染を根絶するの に恩恵をもたらすことができるＣＴＬ反応を誘導する（Ｗｏｌｆｆ，ｅｔ ａｌ ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９０，２４７，１４６５−１４６８； Ｗｏｌｆｆ ，ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１９９２，１，３６３−３ ６９； Ｍａｎｔｈｏｒｐｅ，ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅ ｒａｐｙ，１９９３，４，４１９−４３１； Ｕｌｍｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃ ｉｅｎｃｅ，１９９３，２５９，１７４５−１７４９； Ｙａｎｋａｕｃｋａｓ ，ｅｔ ａｌ．， ＤＮＡ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１９９３，１２， ７７７−７８３； Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，ｅｔ ａｌ．， ＤＮＡ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１９９３，１２，７７７−７８３； Ｆｙｎａｎ，ｅｔ ａｌ．， ＤＮＡ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１９９３，１２，７８５ −７８９； Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，１９９３，９０，４１５６−４１６０； Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ． ， ＤＮＡ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１９９３，１２，７９９−８０５ ； Ｘｉａｎｇ，ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌ．，１９９４，１９９，１３２− １４０； ａｎｄ Ｄａｖｉｓ，ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ ．，１９９３，１１，１８４７−１８５１）。これらのうち、ＨＣＶとＨＢＶは 世界規模で重要視される、持続性の感染をともなう、重要なヒトの病気である。 現在のところ、世界的に見てＨＢＶおよび／またはＨＣＶの慢性的感染の特効 的な療法は存在しない。ＨＢＶおよび／またはＨＣＶに対するワクチン戦略を進 展させることの複雑性は、ＨＢＶおよびＨＣＶの単離株の間の顕著な不均一性に よるだけでなく、一種類の単離株の中に外来のゲノムが混合されていることによ るのである。（Ｍａｒｔｅｌｌ，ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９２ ，６６，３３２５）。加えて、これらのウィルスには特に可変なエンベロープの 領域が含まれる。 予防接種と免疫化は、一般的には、ヒトの免疫系が免疫反応を開始することが できる、毒性のない病原体を導入することを指しており、免疫反応を開始したと きには病原体の攻撃に対して防御できるようになる。免疫系は本来、通常は個体 の体内には存在しないタンパク質やその他の大きな分子を認識することで、”外 来の”物質や病原体の体内への侵入を認識する。外来性タンパクは、免疫応答が 引き起こされる標的の代表的なものである。 ＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９０／０１３４８号では、ＨＣＶのゲノムの複 数のクローンの配列情報、ＨＣＶウィルスタンパク質のアミノ酸配列、そしてこ れらから作り出されうるＨＣＶタンパクやペプチドを含む抗ーＨＣＶワクチンを 含めた組成物の製造方法および使用方法について開示している。 １９９３年１月２６日に出願された米国特許出願第０８／００８，３４２号、 １９９３年３月１１日に出願された米国特許出願第０８／０２９，３３６号、１ ９９３年９月２１日に出願された米国特許出願第０８／１２５，０１２号、１９ ９４年１月２６日に出願されたＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９４／００８９９ 号、そして１９９４年４月１日に出願された米国特許出願第０８／２２１，５７ ９号にはそれぞれ、遺伝子免疫法についての記載がある。それぞれにおいて、Ｈ ＣＶに対するワクチンが開示されている。 参考文献として本明細書中に援用されている、１９９４年１０月５日に出願さ れた米国特許出願第０８／３１８，２４８号では、ワクチンとして有用である、 ＨＣＶのコアタンパク質をコードする塩基配列からなる遺伝子構築物を開示して いる。ＨＣＶコアのＤＮＡを基盤とするワクチンは、インビトロにおいて高レベ ルの発現をしており、また生体内では強力な免疫応答を引き起こしている。 ヒトをＢ型肝炎ウィルスおよび／またはＣ型肝炎ウィルス感染から防御するの に有用なワクチンは相変わらず必要とされている。ヒトをＢ型肝炎ウィルスおよ び／またはＣ型肝炎ウィルス感染から防御する方法は相変わらず必要とされてい る。 発明の概要 本発明は、組換え核酸分子に関するもので、この核酸分子には融合タンパク質 をコードするヌクレオチドコード配列が含まれる。この融合タンパク質は、Ｃ型 肝炎ウィルスのコアタンパクの１ー６９番目のアミノ酸と連結した、Ｂ型肝炎ウ ィ ルスのＳ遺伝子産物からなる。 本発明は、薬剤組成物に関するものであり、融合タンパクをコードするヌクレ オチドコード配列を含む、組換え核酸分子からなる。この融合タンパク質は、Ｃ 型肝炎ウィルスのコアタンパクの１ー６９番目のアミノ酸と連結した、Ｂ型肝炎 ウィルスのＳ遺伝子産物を含む。融合タンパク質をコードするヌクレオチドコー ド配列は、ヒトの細胞内で機能する調節要素と機能的に連結している。薬剤組成 物にはさらに、医薬的に受容される担体あるいは希釈液が含まれる。 本発明は、Ｃ型肝炎ウィルスおよび／またはＢ型肝炎ウィルスに対して感染し やすいかあるいは感染しているヒトに免疫をする方法に関するものであり、それ は、融合タンパクをコードするヌクレオチドコード配列をもつ組換え核酸分子を 含んでいる薬剤組成物をヒトに投与する工程を含む。融合タンパク質は、Ｃ型肝 炎ウィルスのコアタンパクの１ー６９番目のアミノ酸と連結した、Ｂ型肝炎ウィ ルスのＳ遺伝子産物からなる。融合タンパクをコードするヌクレオチドコード配 列は、ヒトの細胞内で機能する調節要素と機能的に連結している。薬剤組成物に はさらに、医薬的に受容される担体あるいは希釈液が含まれる。ヒトにはＢ型肝 炎ウィルスおよび／またはＣ型肝炎ウィルス感染に対する防御的あるいは療法的 な免疫応答を引き起こすのに効果的な量が投与される。 本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４を含むＣ型肝炎ウィルスの不完全なゲノ ムを含んだ核酸分子に関する。 本発明は、ＨＣＶコアタンパクをコードするヌクレオチド配列と、５’非翻訳 領域の少なくとも最後の９ヌクレオチドとを含む、Ｃ型肝炎ウィルスの不完全な ゲノムを含んだ核酸分子に関する。 本発明は、薬剤組成物に関するものであり、この薬剤組成物にはＣ型肝炎ウィ ルスの不完全なゲノムと、ヒトの細胞内で機能する調節要素と機能的に連結して いる、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４の少なくともコード配列部分をもつ核酸分子と からなる。 本発明は、核酸分子を含む薬剤組成物に関するものであり、この核酸分子は、 ＨＣＶコアタンパクをコードするヌクレオチド配列を含むＣ型肝炎ウィルスの不 完全なゲノムと、ヒトの細胞内で機能する制御因子と機能的に連結した５’非翻 訳領域の少なくとも最後の９ヌクレオチドとを有している。 本発明は、Ｃ型肝炎ウィルスに対して感染しやすいかあるいは感染しているヒ トに免疫をする方法に関するものであり、この方法は、Ｃ型肝炎ウィルス感染に 対する防御的あるいは療法的な免疫応答を引き起こすのに効果的な、ある量のプ ラスミドｐＨＣＶ２−１あるいはプラスミドｐＨＣＶ４−２をヒトに投与する工 程を含む。 図面の簡単な説明 図１はＨＣＶコア遺伝子、ＨＢＶのＳ遺伝子、ＨＢＶプレＳ１遺伝子、および ＨＢＶプレＳ２遺伝子からなる複数の構造物の概略を示す。 図２は発現ベクターの模式図を示しており、ベクターにはＨＣＶ／ＨＢＶキメ ラ融合タンパクのコード配列を挿入することができ、あるいはプラスミドｐＨＣ Ｖ２−１あるいはプラスミドｐＨＣＶ４−２を作出するためにＨＣＶのコード配 列が挿入される。 図３はＨＣＶ／ＨＢＶ融合構造物を構成するための方法を示す。 発明の詳細な説明 本発明によれば、ＨＢＶおよび／またはＨＣＶの感染に対し、ヒトを予防措置 的におよび／または療法的に免疫する組成物と方法が提供される。ＨＢＶおよび ／またはＨＣＶの感染に対する免疫のために、ＨＣＶコアタンパクの１ー６９番 目のアミノ酸と連結したＨＢＶのＳ遺伝子産物を含んだ融合タンパクをコードす るヌクレオチドコード配列からなる組換え核酸分子をヒトに投与する。その遺伝 子構築物によりコードされる融合タンパクは、投与されたヒトの細胞によって産 生され、そして抗ーＨＢＶおよび／または抗ーＨＣＶの免疫応答を導き出す、免 疫原性をもった標的としての働きをもつ。ＨＣＶ感染に対する免疫のために、不 完全なＣ型肝炎ウィルスゲノムからなるが、ＨＣＶコアタンパクをコードする遺 伝子物質をヒトに投与する。その遺伝子構築物によりコードされるタンパクは、 投与されたヒトの細胞によって産生され、そして抗ーＨＣＶの免疫応答を導き出 す、免疫原性をもった標的として働く。結果として起こる免疫反応は幅の広い基 盤をもっている。つまり、体液性免疫応答に加えて、細胞性免疫応答の両方の導 き出される。本発明の方法は、予防措置的および療法的な免疫を導き出すのに有 用な方法である。このように、免疫の方法には、ＨＣＶおよび／またはＨＢＶに 感染したヒトの治療方法と同時に、ＨＣＶおよび／またはＨＢＶからの攻撃から ヒトを防御する方法の両方が含まれている。 ＤＮＡ免疫法により体液性免疫応答と細胞性免疫応答の両者を誘導することが 以前から知られている多くのタンパクは、もともと細胞表面のタンパクであるか あるいは分泌タンパクであるかのどちらかであり、例えばインフルエンザのＮＰ 、ＨＢｓＡｇ、そして狂犬病ウィルスの糖タンパクがある。ＨＣＶコアのＤＮＡ を基礎としたワクチンはインビトロにおいては高レベルのコア抗原を発現し、生 体内では免疫応答を誘起するが、ＨＣＶコアタンパクは細胞質内に固定されたま ま存在し、細胞の表面に発現されていたり、分泌されたりはしないようである。 それゆえ、タンパクを細胞表面に発現させおよび／または分泌させて供給するこ とにより免疫応答を増強することができる。それゆえに、本発明の一態様におい て、図１に示したように、ＨＣＶコアタンパクをコードするヌクレオチドコード 配列をＨＢＶ表面抗原をコードするヌクレオチドコード配列を含む領域に連結さ せた。それによって、キメラＨＢＶ／ＨＣＶ融合タンパクは、ＨＢＶおよび／ま たはＨＣＶに対する免疫反応を引き起こすことができる。 本明細書中で使用する場合、「Ｃ型肝炎ウィルスの不完全なゲノム」という用 語は、ＨＣＶのウィルスゲノムによりコードされるＨＣＶのポリプロテインの完 全なコード配列は含まれない核酸分子を意味している。細胞にＨＣＶの不完全な ゲノムを導入することは、感染能力のあるウィルスを作るための十分な遺伝子的 情報を導入することを構成要素としない。 本明細書中で使用する場合、「ＨＣＶコアタンパク」という用語は、短縮され たＨＣＶコアタンパクを意味しており、例えば１５４アミノ酸からなるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１やＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２において示したアミノ酸配列を持つコ アタンパクや、あるいはある特定のＨＣＶ単離株のＨＣＶコアタンパクのアミノ 酸配列であるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４やＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５の中に表さ れているアミノ酸配列を持つ完全長のＨＣＶコアタンパクのようなものである。 完全長のＨＣＶコアタンパクは通常、１９１アミノ酸からなるが、しかし、短縮 されたＨＣＶコアタンパクに関する本発明の目的としては、Ｃ末端の３７アミノ 酸（１５５ー１９１番アミノ酸）を欠失することで、融合タンパクの分泌される 能力が高められている。完全長のＨＣＶコアタンパクのうちＣ末端側２０アミノ 酸は、小胞体に対する結合部位を含んでいると考えられており、結果としてコア タンパクを細胞の細胞質中に保持するのである。加えて、ＨＣＶコアタンパクと いう用語は、完全長であれあるいは短縮された合ものであれ、変異している可能 性のある別のＨＣＶ単離株から得られた対応するＨＣＶコアタンパクをも意味し ている。この学問分野の通常の技術をもつ当業者であれば、ＨＣＶコアタンパク は他のＨＣＶ単離株から容易に探し出すことができる。ＨＣＶコアタンパクに対 するヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、本明細書中に参考文献として援用 する、１９９４年１０月５日に出願された米国特許出願第０８／３１８，２４８ 号中に開示されている。コドン中の塩基置換は、同一のアミノ酸をコードしてい るときには許容されうると理解されるべきである。加えて同様に、塩基置換に由 来する結果として、その中でアミノ酸置換が保存的であるような塩基置換は許容 されうると理解されるべきである。 ＨＣＶコアタンパクには、これまで二つの別個な型が存在することが観察され ており、一つは固定化されたコアタンパクで、もう一つはビリオンのコアタンパ クである。ＨＣＶの翻訳のあいだに、前駆体ポリペプチドが翻訳され、それに続 いて細胞のタンパク分解酵素やウィルスのタンパク分解酵素により切断されて個 々のウィルスポリペプチドが産出される。細胞のシグナルペプチダーゼは、ポリ プロテインの中のコアタンパクになる部分を、エンベロープタンパクになる部分 から分断する部位で切断すると考えられており、それによって固定化されたコア タンパクがエンベロープタンパクから放出される。固定化されたコアタンパクは 、小胞体と結合しているのだが、さらに加工され、成熟したビリオンのコアとな る。固定化されたコアタンパクと成熟ウィルス粒子のコアとの相違は、固定化さ れたコアタンパクがＣ末端に１８アミノ酸を余計に含んでいるという点である。 実際にウィルス粒子の中には固定化されたコアは見られない。 本明細書中で使用する場合、「遺伝子構築物」という用語は組換え核酸分子を 意味しており、その組換え核酸分子は、ＨＣＶコアタンパクの少なくともＮ末端 側６９アミノ酸と完全なＨＢＶのＳ遺伝子産物からなる融合タンパク、あるいは 完全長のＨＣＶコアタンパクをコードする、ヌクレオチドコード配列、並びにワ クチン接種を受けたヒトの細胞の中で発現するように指示することが可能なプロ モーターやポリアデニル化シグナルといった調節要素と機能可能に連結された開 始および終止シグナルからなる。いくつかの態様のものにおいては、遺伝子構築 物の中にさらにエンハンサー、コザック配列（ＧＣＣＧＣＣＡＴＧ ＳＥＱ Ｉ Ｄ ＮＯ：１３）、およびＨＣＶの少なくとも５’ＵＴＲの断片が含まれている 。 本明細書中で使用する場合、「遺伝子ワクチン」という用語は、遺伝子構築物 を含んだ薬剤調製物を意味している。遺伝子ワクチンは、ＨＣＶおよび／または ＨＢＶに対する予防措置的および／または療法的な免疫応答を引き起こすのに有 用な薬剤調製物を含む。 本発明によれば、遺伝子構築物はヒトの細胞に取り込まれそこで発現が行われ 、その結果ＨＣＶコア／ＨＢＶ表面抗原の融合タンパクあるいは完全長のＨＣＶ コアタンパクが生成される。本発明中の遺伝子構築物の調節要素は、ヒトの細胞 中で発現されるように指示する能力を持つ。調節要素にはプロモーターやポリア デニル化シグナルが含まれる。加えてエンハンサー、コザック配列といったその ほかの要素も同様に遺伝子構築物の中に含むことができる。 細胞に取り込まれると、本発明の遺伝子構築物は、機能的な染色体外分子とし て細胞中に存在し続けるか、あるいは細胞の染色体ＤＮＡ中に溶原化（インテグ レート）することができる。ＤＮＡを細胞中でプラスミドという形態で別個の遺 伝子物質として存在し続けるように導入することができる。それに代わるものと して、染色体中に溶原化することができる線形のＤＮＡを細胞に取り込ませるこ ともできる。ＤＮＡを細胞に取り込ませるときに、染色体へのＤＮＡの溶原化を 促進する試薬を添加することができる。溶原化を促進するのに有用なＤＮＡ配列 もまた、ＤＮＡ分子の中に含めることができる。それに代わるものとして、ＲＮ Ａを細胞中に導入することができる。遺伝子構築物を、動原体、テロメア、およ び複製開始点を含んだ線形の小染色体として提供することも同様に、企図されて いる。 本発明の一態様において、遺伝子構築物は、融合タンパクをコードするヌクレ オチドコード配列を含んだ、組換え核酸分子からなり、この融合タンパクにはＨ ＣＶコアタンパク、好ましくは短縮されたＨＣＶコアタンパクに連結されたＨＢ ＶのＳ遺伝子産物が含まれている。 いくつかの好ましい態様において、組換え核酸分子は、ＨＣＶコアタンパクの １ー６９番アミノ酸と連結された完全なＨＢＶのＳ遺伝子を含んだ融合タンパク をコードするヌクレオチドコード配列からなる。ＨＢＶのＳ遺伝子産物のＣ末端 アミノ酸をコードするヌクレオチドは、短縮されたＨＣＶコアタンパクのＮ末端 アミノ酸をコードするヌクレオチドと連結している。 いくつかの好ましい態様において、組換え核酸分子は、融合タンパクをコード するヌクレオチドコード配列が含まれ、融合タンパクには短縮されたＨＣＶコア タンパクである、１ー７０番アミノ酸から１ー１５４番アミノ酸までの種々のア ミノ酸と連結された完全なＨＢＶのＳ遺伝子産物が含まれている。短縮されたＨ ＣＶコアタンパクには、１ー７０番、１ー７１番、１ー７２番、１ー７３番、１ ー７４番、・・・１ー１５０番、１ー１５１番、１ー１５２番、１ー１５３番、 あるいは１ー１５４番アミノ酸のどれかを含むことができる。本明細書中で使用 する場合、”１ー７０番から１ー１５４番”と”１ー７０番、１ー７１番、１ー ７２番、１ー７３番、１ー７４番、・・・１ー１５０番、１ー１５１番、１ー１ ５２番、１ー１５３番、あるいは１ー１５４番”は、互換性のある語として使用 されており、短縮されたＨＣＶコアタンパク断片の８３種類のアミノ酸配列のそ れぞれについて記述することを意味しており、短縮されたＨＣＶコアタンパクに は１ー６９番アミノ酸に対して追加的に加えられた１５４番アミノ酸までのＣ末 端側残基が含まれている。ＨＢＶのＳ遺伝子産物のＣ末端アミノ酸をコードする ヌクレオチドは、短縮されたＨＣＶコアタンパクのＮ末端アミノ酸をコードする ヌクレオチドと連結している。 いくつかの好ましい態様において、組換え核酸分子は融合タンパクをコードす るヌクレオチドコード配列からなり、この融合タンパクにはＨＢＶのプレＳ２遺 伝子産物が含まれていて、このプレＳ２遺伝子産物は短縮されたＨＣＶコアタン パクの１ー６９番アミノ酸と連結した完全なＨＢＶのＳ遺伝子産物と連結されて いる。このＨＢＶプレＳ２遺伝子産物の断片には、ＨＢＶプレＳ２遺伝子産物の Ｃ末端のアミノ酸、あるいはＣ末端の２アミノ酸、あるいはＣ末端の３アミノ酸 、あるいはＣ末端の４アミノ酸、・・・あるいは完全なＨＢＶプレＳ２遺伝子産 物のどれかを含むことができる。本明細書中で使用する場合、「ＨＢＶプレＳ２ 遺伝子産物の断片には、ＨＢＶプレＳ２遺伝子産物のＣ末端のアミノ酸、あるい はＣ末端の２アミノ酸、あるいはＣ末端の３アミノ酸、あるいはＣ末端の４アミ ノ酸、・・・あるいは完全なＨＢＶプレＳ２遺伝子産物のどれかを含むことがで きる」とは、Ｃ末端のアミノ酸残基のみを含む断片から始めて、Ｃ末端のアミノ 酸残基、つまりＣ末端最後のアミノ酸残基、Ｃ末端最後の２アミノ酸残基、Ｃ末 端最後の３アミノ酸残基などの直ぐアミノ末端側のアミノ酸残基をさらに含むＨ ＢＶプレＳ２遺伝子産物断片のアミノ酸配列について、完全なプレＳ２遺伝子産 物に至るまで記述することを意味している。ＨＢＶプレＳ２遺伝子産物のＣ末端 アミノ酸をコードするヌクレオチドは、ＨＢＶのＳ遺伝子産物のＮ末端アミノ酸 をコードするヌクレオチドと連結している。ＨＢＶのＳ遺伝子産物のＣ末端アミ ノ酸をコードするヌクレオチドは続いて短縮されたＨＣＶコアタンパクのＮ末端 アミノ酸をコードするヌクレオチドと結合している。 いくつかの好ましい態様において、組換え核酸分子には融合タンパクをコード するヌクレオチドコード配列が含まれ、この融合タンパクにはＨＢＶプレＳ２遺 伝子産物が含まれ、ＨＢＶプレＳ２遺伝子産物には、短く切断されたＨＣＶコア タンパクのうち１ー７０番アミノ酸のものから１ー１５４番アミノ酸のもののど れかが連結した状態の完全なＨＢＶのＳ遺伝子産物が連結している。ＨＢＶプレ Ｓ２遺伝子産物の断片には、Ｃ末端のアミノ酸、あるいはＣ末端の２アミノ酸、 あるいはＣ末端の３アミノ酸、あるいはＣ末端の４アミノ酸、・・・あるいは完 全なＨＢＶプレＳ２遺伝子産物のどれかを含むことができる。短縮されたＨＣＶ コアタンパクには、１ー７０番、１ー７１番、１ー７２番、１ー７３番、１ー７ ４番、・・・１ー１５０番、１ー１５１番、１ー１５２番、１ー１５３番、ある いは１ー１５４番アミノ酸のどれかを含むことができる。ＨＢＶプレＳ２遺伝子 産物のＣ末端アミノ酸をコードするヌクレオチドには、ＨＢＶのＳ遺伝子産物の Ｎ末端アミノ酸をコードするヌクレオチドが連結している。ＨＢＶのＳ遺伝子産 物のＣ末端アミノ酸をコードするヌクレオチドには、続いて短縮されたＨＣＶコ アタンパクのＮ末端アミノ酸をコードするヌクレオチドが連結している。 いくつかの好ましい態様において、組換え核酸分子には融合タンパクをコード するヌクレオチドコード配列が含まれ、この融合タンパクにはＨＢＶプレＳ１遺 伝子産物の断片が含まれ、ＨＢＶプレＳ１遺伝子産物の断片にはＨＢＶプレＳ２ 遺伝子産物の断片が連結し、ＨＢＶプレＳ２遺伝子産物の断片には、完全なＨＢ ＶのＳ遺伝子産物が連結し、さらに短縮されたＨＣＶコアタンパクのうち１ー６ ９番アミノ酸のものが連結している。ＨＢＶプレＳ１遺伝子産物の断片には、Ｈ ＢＶプレＳ１遺伝子産物のＣ末端のアミノ酸、あるいはＣ末端の２アミノ酸、あ るいはＣ末端の３アミノ酸、あるいはＣ末端の４アミノ酸、・・・あるいは完全 なＨＢＶプレＳ１遺伝子産物のどれかを含むことができる。本明細書中で使用す る場合、「ＨＢＶプレＳ１遺伝子産物の断片には、Ｃ末端のアミノ酸、あるいは Ｃ末端の２アミノ酸、あるいはＣ末端の３アミノ酸、あるいはＣ末端の４アミノ 酸、・・・あるいは完全なＨＢＶプレＳ１遺伝子産物のどれかを含むことができ る」とは、ＨＢＶプレＳ１の断片はＣ末端のアミノ酸残基のみを含む断片から始 めて、Ｃ末端のアミノ酸残基、つまりＣ末端最後のアミノ酸残基、Ｃ末端最後の ２アミノ酸残基、Ｃ末端最後の３アミノ酸残基などの、直ぐＮ末端側のアミノ酸 残基を含むＨＢＶプレＳ１断片アミノ酸配列について、完全なプレＳ１遺伝子産 物に至るまで記述することを意味している。ＨＢＶプレＳ２遺伝子産物の断片に は、Ｃ末端のアミノ酸、あるいはＣ末端の２アミノ酸、あるいはＣ末端の３アミ ノ酸、あるいはＣ末端の４アミノ酸、・・・あるいは完全なＨＢＶプレＳ２遺伝 子産物のどれかを含むことができる。ＨＢＶプレＳ１遺伝子産物のＣ末端アミノ 酸をコードするヌクレオチドは、ＨＢＶプレＳ２遺伝子産物のＮ末端アミノ酸を コードするヌクレオチドと連結している。ＨＢＶプレＳ２遺伝子産物のＣ末端ア ミノ酸をコードするヌクレオチドは、続いてＨＢＶのＳ遺伝子産物のＮ末端アミ ノ酸をコードするヌクレオチドと連結している。ＨＢＶのＳ遺伝子産物のＣ末端 アミノ酸をコードするヌクレオチドは、続いて短縮されたＨＣＶコアタンパクの Ｎ末端アミノ酸をコードするヌクレオチドと連結している。 いくつかの好ましい態様において、組換え核酸分子は融合タンパクをコードす るヌクレオチドコード配列からなり、この融合タンパクにはＨＢＶプレＳ１遺伝 子産物の断片が含まれ、ＨＢＶプレＳ１遺伝子産物の断片にはＨＢＶプレＳ２遺 伝子産物の断片が連結し、ＨＢＶプレＳ２遺伝子産物の断片にはＨＢＶのＳ遺伝 子産物が連結し、さらに短縮されたＨＣＶコアタンパクのうち１ー７０番アミノ 酸のものから１ー１５４番アミノ酸のものが連結している。短縮されたＨＣＶコ アタンパクには、１ー７０番、１ー７１番、１ー７２番、１ー７３番、１ー７４ 番、・・・１ー１５０番、１ー１５１番、１ー１５２番、１ー１５３番、あるい は１ー１５４番アミノ酸のどれかを含むことができる。ＨＢＶプレＳ１遺伝子産 物の断片には、Ｃ末端のアミノ酸、あるいはＣ末端の２アミノ酸、あるいはＣ末 端の３アミノ酸、あるいはＣ末端の４アミノ酸、・・・あるいは完全なＨＢＶプ レＳ１遺伝子産物のどれかを含むことができる。ＨＢＶプレＳ２遺伝子産物の断 片には、Ｃ末端のアミノ酸、あるいはＣ末端の２アミノ酸、あるいはＣ末端の３ アミノ酸、あるいはＣ末端の４アミノ酸、・・・あるいは完全なＨＢＶプレＳ２ 遺伝子産物のどれかを含むことができる。ＨＢＶプレＳ１遺伝子産物のＣ末端ア ミノ酸をコードするヌクレオチドは、ＨＢＶプレＳ２遺伝子産物のＮ末端アミノ 酸をコードするヌクレオチドと連結している。ＨＢＶプレＳ２遺伝子産物のＣ末 端アミノ酸をコードするヌクレオチドは、続いてＨＢＶのＳ遺伝子産物のＮ末端 アミノ酸をコードするヌクレオチドと連結している。ＨＢＶのＳ遺伝子産物のＣ 末端アミノ酸をコードするヌクレオチドは、続いて短縮されたＨＣＶコアタンパ クのＮ末端アミノ酸をコードするヌクレオチドと連結している。 各ヌクレオチドコード配列はヌクレオチドスペーサーまたはリンカーの存在下 あるいは非存在下においてお互いに連結され、その際、下流のヌクレオチドコー ド配列はフレーム内のままであることが意図されている。このようにヌクレオチ ドコード配列は直接に、つまりはどんなヌクレオチドスペーサーも存在せずに連 結できる。これに代わる方法として、約３から約６０ヌクレオチドからなるスペ ーサーを隣接するヌクレオチドコード配列同士のあいだに挿入することができる 。例えば、ヌクレオチドスペーサーは、ＨＢＶのＳ遺伝子のヌクレオチドコード 配列と短縮されたＨＣＶのコアタンパク遺伝子とのあいだに、ＨＢＶプレＳ２遺 伝 子とＨＢＶのＳ遺伝子とのあいだに、そしてＨＢＶプレＳ１遺伝子とＨＢＶプレ Ｓ２遺伝子とのあいだに挿入されうる。スペーサーまたはリンカーはクローニン グの目的のために、エンドヌクレアーゼの制限酵素切断部位を含んでよい。 同様に意図されていることは、完全なＳ遺伝子産物より小さな遺伝子断片を含 みうる融合タンパクをコードするヌクレオチドコード配列を含む組換え核酸分子 が、本質的にワクチンの効率を変化させることなく、短縮されたＨＣＶコアタン パクの１ー６９アミノ酸と連結されるようにすることである。また同様に意図さ れていることは、融合タンパクのアミノ酸配列に変化を与えることなく、ヌクレ オチドコード配列の全範囲において塩基置換が引き起こされることである。また 同様に意図されていることは、融合タンパクの免疫原性活性を低下させることな く、融合タンパクの全犯意において保存的なアミノ酸置換が引き起こされうるこ とである。 いくつかの好ましい態様において、遺伝子構築物には少なくともＨＣＶの５’ ＵＴＲの最後の９ヌクレオチドを含めた５’ＵＴＲの断片が含まれている。本明 細書中で使用する場合、「ＨＣＶの５’ＵＴＲの最後の９ヌクレオチド」という 用語は、５’ＵＴＲの最も３’側の９ヌクレオチドを意味している。つまりコー ド配列のすぐ前に存在する５’ＵＴＲの９ヌクレオチドのことである。好ましい 態様のＨＣＶの５’ＵＴＲの最後の９ヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３ として示されている。 いくつかの態様において、ＨＣＶの５’ＵＴＲの最後の９ヌクレオチドを含ん だ５’ＵＴＲの断片には、ＨＣＶの５’ＵＴＲの最後の２５ヌクレオチドが含ま れる。いくつかの態様において、ＨＣＶの５’ＵＴＲの最後の９ヌクレオチドを 含んだ５’ＵＴＲの断片には、ＨＣＶの５’ＵＴＲの最後の５０ヌクレオチドが 含まれる。いくつかの態様において、ＨＣＶの５’ＵＴＲの最後の９ヌクレオチ ドを含んだ５’ＵＴＲの断片には、ＨＣＶの５’ＵＴＲの最後の７５ヌクレオチ ドが含まれる。いくつかの態様において、ＨＣＶの５’ＵＴＲの最後の９ヌクレ オチドを含んだ５’ＵＴＲの断片には、ＨＣＶの５’ＵＴＲの最後の１００ヌク レオチドが含まれる。いくつかの態様において、ＨＣＶの５’ＵＴＲの最後の９ ヌクレオチドを含んだ５’ＵＴＲの断片には、ＨＣＶの５’ＵＴＲの最後の１５ ０ヌクレオチドが含まれる。いくつかの態様において、ＨＣＶの５’ＵＴＲの最 後の９ヌクレオチドを含んだ５’ＵＴＲの断片には、ＨＣＶの５’ＵＴＲの最後 の２００ヌクレオチドが含まれる。いくつかの態様において、ＨＣＶの５’ＵＴ Ｒの最後の９ヌクレオチドを含んだ５’ＵＴＲの断片には、ＨＣＶの５’ＵＴＲ の最後の２５０ヌクレオチドが含まれる。いくつかの態様において、ＨＣＶの５ ’ＵＴＲの最後の９ヌクレオチドを含んだ５’ＵＴＲの断片には、ＨＣＶの５’ ＵＴＲの最後の３００ヌクレオチドが含まれる。 いくつかの好ましい態様において、遺伝子構築物には完全なＨＣＶの５’ＵＴ Ｒが含まれる。いくつかの好ましい態様において、遺伝子構築物にはＨＣＶの５ ’ＵＴＲの最も３’側の９ヌクレオチドが含まれる。好ましい態様における完全 なＨＣＶの５’ＵＴＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４として示されている。 発明の別の観点によれば、遺伝子構築物は完全長のＨＣＶコアタンパクをコー ドするコード配列を含む。いくつかの好ましい態様において、遺伝子構築物は固 定化された型の完全長のＨＣＶコアタンパクをコードする。固定化されたコアタ ンパクは、次のような理由のためいくつかの態様において好ましい。まず第一に 、コアタンパクが本来の感染した細胞の中で最初に見られる場所である小胞体に 、コアタンパクを正確に区画することは望ましいことだと考えられる。もしタン パク質が不正確に区画されたら、分解あるいは細胞に対する毒性のために、その ようなタンパク質の全発現が低下するという危険性がある。さらに、細胞のタン パク分解酵素により固定化されたコアが切り出されてビリオンコアになると考え られているため、固定化された型を発現している細胞の中には、（固定化された コアと切り出されたビリオンコアの）両方のタンパク種が存在しうる。もし二つ のタンパク種のあいだで免疫原性として違いが存在すれば、固定化された型の完 全長のコアタンパクを発現させることにより、コアに対する幅の広い免疫応答が 引き起こされる可能性がある。さらに固定化されたコアの中の余分な１８アミノ 酸は、抗体のエピトープかあるいは細胞傷害性Ｔ細胞のエピトープのどちらか、 あるいはその両方を含むことができる。固定化された型を発現することにより、 コアタンパクに対する免疫応答を幅広くすることができるこれらの領域が存在す ることが提供される。 いくつかの好ましい態様において、遺伝子構築物はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４ およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５のアミノ酸配列からなる、完全長のＨＣＶコア タンパクをコードする。いくつかの好ましい態様において、遺伝子構築物にはＳ ＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４内にあるコード配列が含まれる。 いくつかの好ましい態様において、遺伝子構築物にはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１ ４が含まれる。 いくつかの好ましい態様において、使用されたベクターは、図２に記載したベ クターから選択された。いくつかの態様において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４の ３４２ー９２３番ヌクレオチドがバックボーンＡの中に挿入され、プラスミドｐ ＨＣＶ２ー１が形成された。いくつかの態様において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１ ４がバックボーンＡの中に挿入され、プラスミドｐＨＣＶ４ー２が形成された。 プラスミドｐＨＣＶ２ー１とｐＨＣＶ４ー２において、完全長のＨＣＶコアタ ンパクをコードするコード配列は、ＣＭＶ即時性初期プロモーターとＳＶ４０の マイナーポリアデニル化シグナルにより調節的に制御されている。構造には追加 的にＳＶ４０の複製開始点を含むことができる。 ＤＮＡ分子の遺伝子発現に必要な調節要素は、以下のものを含む：プロモータ ー、開始コドン、終止コドン、そしてポリアデニル化シグナルである。加えて、 エンハンサーがしばしば遺伝子発現のために必要とされる。これらの因子は、融 合タンパクをコードする配列、あるいは完全長のＨＣＶコアタンパクと、機能可 能に連結されていることが必要であり、そして調節要素は、投与されたヒトの体 内で機能できるものであることが必要とされる。 開始コドンと終止コドンは通常は、融合タンパクをコードする配列、あるいは 完全長のＨＣＶコアタンパクをコードするヌクレオチド配列の一部として考えら れている。 使用されているプロモーターとポリアデニル化シグナルは、ヒトの体内の細胞 中で機能するものでなくてはならない。タンパク質の生産量を最大にするために 、遺伝子構築物が投与される細胞の中で遺伝子発現に最も適した調節配列が選択 されるべきである。さらにコドンは細胞内で最も効率よく転写されるものが選択 されるべきである。この学問分野の通常の技術をもつ当業者は、細胞内で機能す る ＤＮＡ構造物を作出することができる。 本発明を実践するために、特にヒトに対する遺伝子ワクチンを作ることにおい て、有用なプロモーターの例には、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロ ビン、ヒト筋肉クレアチン、ヒトメタロチオネインなどのヒトの遺伝子由来のプ ロモーターだけでなく、サルウィルス４０（ＳＶ４０）、マウス乳腺腫瘍ウィル ス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶロングターミナルリピート（ＬＴＲ）プロ モーターといったヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）、モロニーウィルス、ＡＬＶ 、ＣＭＶ即時性初期プロモーターといったサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）、エ プスタインバーウィルス（ＥＢＶ）、ラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）のプロモー ターが含まれるが、これらだけに限られるものではない。 本発明を実施するために、特にヒトに対する遺伝子ワクチンを作ることにおい て、有用なポリアデニル化シグナルの例には、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル やＬＴＲポリアデニル化シグナルが含まれるが、これらだけに限られるものでは ない。特に、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルとして言及されている、ｐＣＥＰ ４プラスミド中にあるＳＶ４０のポリアデニル化シグナル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ ｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）が使用される。 遺伝子発現に必要な調節要素に加えて、その他の因子も同様に遺伝子構築物に 含めてもよい。そのような追加的な因子にはエンハンサーが含まれる。エンハン サーとしては以下のようなものが選択されるべきだが、これらだけに限られるも のではない：ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレア チンそしてＣＭＶ、ＲＳＶやＥＢＶから得られたもののようなウィルス性のエン ハンサーである。 遺伝子構築物は細胞内においてその構造物が染色体外に維持され、且つまた複 数の構造物の複製を作るように、哺乳類の複製開始点が備えられていることがで きる。インビトロジェン（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）から購入可能なプラスミ ドｐＣＥＰ４とｐＲＥＰ４には、エプスタイン・バーウィルスの複製開始点と、 溶原化せずにエピソームの複製をたくさん作る核抗原ＥＢＮＡ−１のコード領域 が含まれている。 いくつかの好ましい態様において、使用した遺伝子構築物は図２に記載したベ クターから選択される。いくつかの態様において、融合タンパクをコードするヌ クレオチドコード配列は、バックボーンＡの中に挿入されている。 本発明の発現ベクターにおいて、融合タンパクをコードするコード配列は、Ｃ ＭＶ即時性初期プロモーターとＳＶ４０のマイナーポリアデニル化シグナルによ り調節的に制御されている。構造物には所望によりＳＶ４０の複製開始点を含む ことができる。 投与の経路には、筋肉内投与、腹膜内投与、皮内投与、皮下投与、静脈内投与 、動脈内投与、眼内投与、経口投与並びに経皮投与、あるいは吸入または坐薬に よる投与が含まれるが、これらだけに限られるものではない。好ましい投与経路 には、筋肉内注射、腹膜内注射、皮内注射、皮下注射が含まれる。ＨＢＶ／ＨＣ Ｖキメラタンパクまたは完全長のＨＣＶコアタンパクをコードする免疫物質が粘 膜性の免疫に関連する組織に提示されるような投与法によって免疫されたヒトの 体内においては、遺伝子構築物の放出が粘膜性の免疫を誘導する。したがって、 いくつかの実施例において、ヒトの口の中の頬面窩洞の中に投与することで、遺 伝子構築物を放出させている。 遺伝子構築物は、伝統的なシリンジ、針のない注入装置、あるいは「微少発射 型衝撃遺伝子銃」を含んだ方法で投与されるが、これらだけに限られるものでは ない。それに代わるものとして、遺伝子ワクチンを、ヒトから取り出した細胞中 に様々な方法で導入してもよい。そのような方法には例えば、体外（ｅｘ ｖｉ ｖｏ）感染、エレクトロポレーション、微少注入法、そして微少発射型砲撃（遺 伝子銃）が含まれる。細胞に遺伝子構築物を取り込ませた後に、それらの細胞を ヒトの体内に再び移植する。このような方法を採らなければ免疫原性のなかった 、遺伝子構築物をその中にとりこんだ細胞を、たとえそのワクチン化した細胞が 起源的には別のヒトから採取した細胞であれ、ヒトの体内に移植することができ ることを企図している。 本発明のいくつかの態様によれば、針のない注入装置を用いて遺伝子構築物を ヒトの体内に投与している。本発明のいくつかの態様によれば、同時的に皮内、 皮下、そして筋肉内に針のない注入装置を用いて遺伝子構築物を投与している。 針のない注入装置はよく知られ、そして広く使用されている。この学問分野の通 常の技術をもつ当業者は、本明細書の教えにしたがい、ヒトの細胞に遺伝子物質 を導入するために針のない注入装置を使用することができる。針のない注入装置 は、すべての組織に対して遺伝子物質を導入するのによく適している。その方法 は特に、皮膚や筋肉の細胞に遺伝子物質を導入するのに有効な方法である。いく つかの態様において、針のない注入装置を、ＤＮＡ分子を含む液体をヒトの皮膚 の表面に向かって推進するために使うことができる。液体は、十分な速度で推進 され、それにより皮膚に対する衝撃の時に、皮膚の表面に突入し、皮膚およびそ の直下にある筋肉組織に浸透する。このようにして遺伝子物質は同時的に皮内、 皮下、そして筋肉内に投与される。いくつかの態様において、針のない注入装置 を、その他の器官の組織に対して、その器官の細胞に核酸分子を持ち込む目的で 、遺伝子物質を導入する際に利用することができる。本発明による遺伝子ワクチ ンには約１ナノグラムから約１０００マイクログラムのＤＮＡが含まれる。いく つかの好ましい態様において、ワクチンには約１０ナノグラムから約８００マイ クログラムのＤＮＡが含まれる。いくつかの好ましい態様において、ワクチンに は約０．１から約５００マイクログラムのＤＮＡが含まれる。いくつかの好まし い態様において、ワクチンには約１から約３５０マイクログラムのＤＮＡが含ま れる。いくつかの好ましい態様において、ワクチンには約２５から約２５０マイ クログラムのＤＮＡが含まれる。いくつかの好ましい態様において、ワクチンに は約１００マイクログラムのＤＮＡが含まれる。 本発明による遺伝子ワクチンは、使用される投与形態に従った処方がなされる 。この学問分野の通常の技術をもつ当業者は、容易に遺伝子構築物を含む薬剤組 成物を処方することができる。いくつかの実施例では、等張液を使用した処方が 使用されている。一般的には、等張性を保つための添加剤には、塩化ナトリウム 、ブドウ糖、マンニトール、ソルビトール、そして乳糖が含まれうる。いくつか の実施例では、リン酸緩衝液のような等張溶液が好まれる。安定剤としてゼラチ ンとアルブミンが含まれる。いくつかの態様において、血管収縮薬が処方に追加 される。本発明による薬剤調整品は、滅菌された状態で、発熱物質のない状態で 提供される。 本発明の遺伝子構築物は、薬品とともに、つまりそのような薬品が存在しない 状態で同一の遺伝子ワクチンを投与したときに起こる細胞による遺伝子構築物の 取り込みおよび／または発現と比較して、細胞による遺伝子構築物の取り込みお よび／または発現を増加させるような薬品とともに、処方あるいは投与すること もできる。そのような薬品とそれらを遺伝子構築物とともに投与する方法は、１ ９９３年１月２６日に出願された米国特許出願第０８／００８，３４２号、１９ ９３年３月１１日に出願された米国特許出願第０８／０２９，３３６号、１９９ ３年９月２１日に出願された米国特許出願第０８／１２５，０１２号、１９９４ 年１月２６日に出願されたＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９４／００８９９号、 および１９９４年４月１日に出願された米国特許出願第０８／２２１，５７９号 に記載されており、それらは本明細書中に参考文献として援用されている。その ような薬品の実例としては以下のものが含まれる：ＣａＰＯ₄、ＤＥＡＥデキス トラン、アニオン性脂質、細胞外基質ー活性化酵素、サポニン、レクチン、エス トロゲン様化合物やステロイドホルモン、水酸化低級アルキル、ジメチルスルフ ォキシド（ＤＭＳＯ）、尿素、そして局所麻酔薬のファミリーをなしているよう な、安息香酸エステルアニリド、アミジン、ウレタン、そしてそれらの塩酸塩で ある。さらに、遺伝子構築物は脂質／ポリカチオン複合体のカプセルに包まれ／ または該複合体と共に投与される。 実施例 実施例１：ＨＢＶ／ＨＣＶ発現プラスミドの設計と構築 完全なプレＳ１、プレＳ２、そしてＳ配列（ａｄｒ−１）を含んでいる、ラー ジＳ ＨＢクローンが確立された。プレＳ１／プレＳ２／Ｓ遺伝子のヌクレオチ ド配列およびアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に記載されている。簡単に 言うと、ＨＢＶに関連した慢性肝炎の患者から得た１００μｌの血清を、７０℃ で３時間、プロテイネースＫ（１００μｇ／ｍｌ）、０．５％ ＳＤＳ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０の混合液中で保温する。 溶液はフェノール・クロロフォルムで抽出され、そしてＤＮＡはエタノールで沈 殿させる。ＰＣＲ反応は、１０μｌの血清ＤＮＡサンプル、２．５ＵのＴａｑポ リメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ， Ｎｏｒｗａｌｋ， Ｃ Ｔ）、５０μＭずつのｄＮＴＰ、そして０．４μＭのプライマーＨＢｓ−３ ５ ’ーＧＧＧＴＣＡＣＣＡＴＡＴＴＣＴＴＧＧＧＡＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ：６）とＨＢｓ−１ ５’ーＧＣＡＧＣＡＡＡＧＣＣＣＡＡＡＡＧＡＣＣＣ−３ ’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）とを含んだ、１００μｌの混合液の中で行われた 。反応混合物は３５サイクルさせた。増幅されたＤＮＡは、ｐＣＲ^TMベクターに ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いることでクローン化さ れた。ＨＣＶクローン（ＴＨ、ジェノタイプＩＩ）は、ワキタら（Ｊ．Ｂｉｏｌ ．Ｃｈｅｍ．，１９９４，２６９，１４０５−１４１０）、この論文は本明細書 中で参考文献として開示されているが、により記載されているように、慢性Ｃ型 肝炎感染症の患者から同様にして確立された。 図３には、ＨＣＶ／ＨＢＶ融合構造物を調製するのに好ましい方法を記してい る。最初の段階では、短縮されたＨＣＶコア遺伝子のＰＣＲ増幅をする必要があ る。簡単に言うと、１０μｇのＴＨ−ＤＮＡを、ＲＰＣＲＰ−１プライマー ５ ’ーＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＧＣＡＣＧＡＡＴＣＣＴＡＡＡＣＣ−３’（ＳＥ Ｑ ＩＤ ＮＯ：８）と２Ｃ１５４ＸＢＡ−Ｒ ５’ーＴＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡ ＣＴＡＧＣＣＡＴＧＣＧＣＣＡＡＧＧＣＣＣＴＧＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ：９）プライマーで増幅する。ＰＣＲ産物は、ＢａｍＨＩとＸｂａＩで酵素消化 し、ｐｃＤＮＡ３ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）につないだ。短縮されたＨ ＣＶコアタンパクの最後の２０アミノ酸は小胞体膜にしっかりと結合している。 この情報を考慮して、融合タンパクの分泌に関しては、完全長のＨＣＶコアタン パクの最後の３７アミノ酸（１５５ー１９１番アミノ酸）を削除した。短縮され たＨＣＶコアの１ー１５４番アミノ酸を含む融合タンパクは、長すぎて分泌でき ない可能性を考慮して、短くなったあるいは短縮されたＨＣＶコア遺伝子（ＨＣ Ｖコアの１ー６９番アミノ酸）をコードする他のプラスミドも作られた。短くな ったあるいは短縮されたＨＣＶコア構造を作るために、増幅されたＤＮＡはＢａ ｍＨＩとＮａｅＩにより酵素消化され、そしてｐｃＤＮＡ３ベクターのＢａｍＨ Ｉ部位ーＥｃｏＲＩ部位につながれた。 最後に、ＨＢｓ産物のＰＣＲは、ＨＢｓストップＢａｍＨＩプライマー５’ー ＣＡＴＧＧＡＴＣＣＡＡＴＧＴＡＴＡＣＣＣＡＡＡＧＡＣＡ−３’（ＳＥＱ Ｉ Ｄ ＮＯ：１０）とＨｉｎｄ ｐＳ１プライマー５’ーＡＧＡＣＡＣＡＡＧＣＴ ＴＡＴＧＧＧＡＧＧＴＴＧＧＴＣＴＴＣＣＡＡＡＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ：１１）あるいは、Ｋｚ Ｈｉｎｄ ｐＳ２プライマー５’ーＡＧＡＣＡＣＡＡ ＧＣＴＴＧＣＣＧＣＣＡＴＧＣＡＧＴＧＧＡＡＣＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ：１２）とのあいだで行われた。増幅されたＤＮＡはＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩ Ｉで酵素消化され、ＨＣＶコア遺伝子を含んだｐｃＤＮＡ３ベクターのＢａｍＨ Ｉ部位ーＨｉｎｄＩＩＩ部位に連結された。スモールＳをコードする遺伝子は、 ミドルＳ（プレＳ２−Ｓ）ＰＣＲ産物からＸｈｏ−Ｉにより消化し、次にクレノ ー処理することで作られた。プレーＳ２−Ｓ−ＨＣＶ融合構造物の上流側配列に は、コザック配列（ＧＣＣＧＣＣＡＴＧ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）がＫｚ Ｈｉｎｄ ｐＳ２プライマーの中に含まれるが、これがプレーＳ２−Ｓ−ＨＣＶ 構造に追加されたのは、コザック配列のないプレーＳ２−Ｓ−ＨＣＶ構造はしば しばプレＳ２遺伝子のＡＴＧコドンからではなくＨＢｓ遺伝子（スモールＳ）の ＡＴＧコドンから翻訳されてしまうからである。図１に示したように、６つの融 合タンパクを準備した。すべての構造物の完全な配列解析を行い、その結果ＰＣ Ｒにより引き起こされた突然変異は一つも見られなかった。最終的にこれらの６ つのＨＢ−ＨＣＶ挿入部位は、ワクチン発現ベクターのＰｖｕ−ＩＩ部位に連結 された。 この学問分野における技術をもつ当業者は、短縮された合コアタンパク、プレ Ｓ１タンパク、プレＳ２タンパク、そしてＳタンパクをコードするＤＮＡ配列を 手にすれば、本発明中の任意のキメラ遺伝子構築物を調製するための、プライマ ーを設計することができる。加えてヌクレオチドの塩基置換はプライマーの結合 に影響されることなく引き起こされる可能性がある。さらにプライマーを、この 学問分野における技術として知られているように、クローニングおよび連結の目 的のためにエンドヌクレアーゼ切断部位をもつように作成することもできる。こ のようにしてこの学問分野における技術をもつ当業者は、適切なプライマーを設 計することとＰＣＲ増幅を行うことで、本発明におけるあらゆる遺伝子構築物を 作成することができる。ＰＣＲ産物は、発現ベクターに連結される。 上に示したＨＢＶ／ＨＣＶ融合タンパクに対するヌクレオチドコード配列を含 むプラスミドそれぞれには、ＣＭＶプロモーターとＲＳＶエンハンサー因子の転 写制御下におかれた融合タンパクに対するヌクレオチドコード領域が含まれてい る。 プラスミドのバックボーンＡは、長さにして３９６９塩基対ある。そこには大 腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）内で複製するのに必要な、ＰＢＲの複製開始点が含まれる 。それにはカナマイシン耐性遺伝子もまた含まれ、それにより大腸菌（Ｅ．Ｃｏ ｌｉ）の中でプラスミドを選択することができる。短縮された合あるいは完全長 のＨＣＶコア遺伝子のような挿入物は、ポリリンカー領域の中にクローン化され るが、このポリリンカー領域は、挿入物をプロモーターとポリアデニル化シグナ ルとのあいだに配置し、且つ機能可能なようにそれらに連結させる。クローン化 された挿入物の転写は、ＣＭＶプロモーターとＲＳＶエンハンサー要素の制御下 におかれる。ポリアデニル化シグナルは、クローニング部位のちょうど３’側に 位置するＳＶ４０のポリＡシグナルの存在により、提供されている。 実施例２：完全長のＨＣＶ発現プラスミドの設計と構築 プラスミドｐＨＣＶ２−１およびｐＨＣＶ４−２はともに、ＨＣＶの固定化さ れたコアタンパクを発現するように設計された。固定化されたコアは、ビリオン のコアに対する細胞質中の前駆体だが、疎水性のＣ末端によって膜に結合された ままで存在する。 それぞれのプラスミドの構造物には完全長のＨＣＶコアのコード領域が含まれ ており、ＣＭＶプロモーターとＲＳＶエンハンサー要素の転写制御下に配置され ている。プラスミドｐＨＣＶ２−１には、ＨＣＶの５’ＵＴＲの最も３’側に位 置する９ヌクレオチドからなる、ＨＣＶの５’ＵＴＲの９ヌクレオチド断片を含 んでいる。プラスミドｐＨＣＶ４−２がプラスミドｐＨＣＶ２−１と異なるのは 、ｐＨＣＶ４−２がＨＣＶの５’ＵＴＲの全体を含んでいることである。 ＨＣＶ特異的配列は、鋳型としてｐＵＣ−Ｔ７−ＨＣＶＴＨ（ＨＣＶ Ｔｙｐ ｅ ２）を、そしてＰＣＲプライマーとして次のような配列、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ Ｏ：１６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、そしてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８からな るオリゴヌクレオチドを用いることで、ポリメラーゼチェインリアクション（Ｐ ＣＲ）により増幅した。 ５’ＰＣＲプライマーであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ：１８には、ＮａｔＩ切断部位が、３’ＰＣＲプライマーであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７にはＳａｌＩ切断部位が存在する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７には３ つの停止コドンが組み込まれている。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７はＰＣＲ産物を生成するためのプライマーとして使用され、その生 成物はＨＣＶゲノム上の位置１から位置８１０に位置しており、ＨＣＶの完全な ５’ＵＴＲとコアのコード領域を含んでいる。 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７をプライマーとして使 用することで、結果としてＨＣＶゲノム上の位置３３３から位置８１０に位置し ているＰＣＲ産物が得られた。この産物はＨＣＶの５’ＵＴＲの最後の９ヌクレ オチドおよび完全なコアのコード配列を含んでいる。 両方のＰＣＲ産物は、ＮａｔＩとＳａｌＩ（ＮＥＤ）で酵素消化され、ゲルに より精製され、そして図２において示されたプラスミドのバックボーンＡにある ＮａｔＩ−ＳａｌＩ部位に連結され、ｐＨＣＶ４−２およびｐＨＣＶ２−１を生 成した。 プラスミドのバックボーンＡは、長さにして３９６９塩基対ある。そこには大 腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）内で複製するのに必要な、ＰＢＲの複製開始点が含まれる 。それにはカナマイシン耐性遺伝子もまた含まれ、それにより大腸菌（Ｅ．Ｃｏ ｌｉ）の中でプラスミドを選択することができる。完全長のＨＣＶコア遺伝子の ような挿入物は、ポリリンカー領域の中にクローン化されるが、このポリリンカ ー領域は、挿入物をプロモーターとポリアデニル化シグナルとのあいだに配置し 、且つ機能可能にそれらに連結させる。クローン化された挿入物の転写は、ＣＭ ＶプロモーターとＲＳＶエンハンサー要素の制御下におかれる。ポリアデニル化 シグナルは、クローニング部位のちょうど３’側に位置するＳＶ４０のポリＡシ グナルの存在により、提供されている。 実施例３：インビトロでの発現の解析 ｐＨＣＶ２−１およびｐＨＣＶ４−２からの完全長のＨＣＶコアの発現は、イ ンビトロにおいて横紋筋肉腫（ＲＤ）細胞系列を使用してアッセイを行った。細 胞には、ｐＨＣＶ２−１とβーガラクトシダーゼのリポータープラスミドである ｐＣＭＶＢ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）；ｐＨＣＶ４−２とｐＣＭＶＢ；ベクタープ ラスミドとｐＣＭＶＢ；をそれぞれ共感染させるか、または偽のプラスミドを感 染させた。すべての解析は感染後４８時間の時点で行った。感染効率は細胞の溶 解物中のβーガラクトシダーゼの特異的活性を測定することで測定された。 感染させた細胞は、一次抗体として抗ーコア単クローン抗体あるいはプールし たＨＣＶ患者の血清を使用し、間接蛍光抗体法により解析された。二次抗体とし ては、ＦＩＴＣ標識抗ーマウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）とＦＩＴＣ標識抗ーヒトＩ ｇＧ（Ｓｉｇｍａ）がそれぞれの場合に使用された。ｐＨＣＶ２−１あるいはｐ ＨＣＶ４−２のどちらかに感染した細胞では抗体による染色像が見られたが、ベ クタープラスミドか、または偽のプラスミドを感染させた細胞では抗体による染 色像が見られなかった。固定された細胞における免疫蛍光は、単クローン抗体あ るいは保存されている患者の血清のどちらかを一時抗体として使用したときには 、小さい斑点のような染色像として現れ、細胞質に局在していた。一見すると、 ｐＨＣＶ２−１が感染した細胞とｐＨＣＶ４−２が感染した細胞とのあいだに、 染色の程度あるいは染色の型の相違は何もなかった。固定していない細胞では染 色像は何も見られなかったことから、発現されたコアタンパクはたぶん細胞表面 の膜には結合していないであろう。 感染させた細胞の溶解物はまた、ウェスタンブロット法および免疫沈降法を用 いても解析された。ｐＨＣＶ２−１とｐＨＣＶ４−２が、検定をした細胞系列に おいて等量のコアを発現したことから、ＨＣＶコアの５’ＵＴＲの有無は、コア の発現にはほとんど影響がないように思われた。 実施例４：ＤＮＡの接種 ６匹のマウスからなるグループにおいて、１００μｇのｐＨＣＶ４−２と０． ２５％のブピバカインとを筋肉内に単回接種したあと、体液性免疫が測定された 。すべてのマウスにおいて、ＤＮＡ接種後２１日に血清変換（ワクチンとして投 与した抗原に応答して抗体が出現すること）が起こっていることが示された。体 液 性の応答は数カ月にわたって持続した。複数回接種の効果は、目下評価の最中で ある。 このＨＣＶコアのＤＮＡを基礎にしたワクチンは、インビトロで高水準にコア 抗原を発現し、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）では強力な免疫応答を引き起こす。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:92） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 パチュク，キャサリン・ジェイ アメリカ合衆国ペンシルバニア州19050, ランズダウン，スコットデイル・ロード 223，ビー−511 (72)発明者 ウォンズ，ジャック アメリカ合衆国マサチューセッツ州02168, ウォバン，ベイリック・ロード 210 (72)発明者 脇田 隆字 東京都板橋区成増３−37，１−302 (72)発明者 ズロウスキー，ビンセント・アール，ジュ ニアー アメリカ合衆国ペンシルバニア州19393, ウエストタウン，ノースゲート・ロード 728 (72)発明者 コニー，レスリー・アール アメリカ合衆国ペンシルバニア州19010, ローズモント，コネストガ・ロード 1000，エイ−201 (72)発明者 徳重 克年 アメリカ合衆国マサチューセッツ州02114, ボストン，テン・エマーソン・プレイス （番地なし），６ディー

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．Ｃ型肝炎ウィルスのコアタンパクのうちの１ー６９番のアミノ酸と連結され た、Ｂ型肝炎ウィルスのＳ遺伝子産物を含む融合タンパクをコードするヌクレオ チドコード配列を含む組換え核酸分子。 ２．ヌクレオチドコード配列が機能可能にサイトメガロウィルスのプロモーター 、ラウス肉腫ウィルスのエンハンサー、ポリアデニル化配列、そして場合により Ｃ型肝炎ウィルスの５’ＵＴＲと連結している、請求項１の組換え核酸分子。 ３．融合タンパクがＣ型肝炎ウィルスのコアタンパクのうち１ー７０番のアミノ 酸から１ー１５４番のアミノ酸と結合したＢ型肝炎ウィルスのＳ遺伝子産物から なる、請求項１の組換え核酸分子。 ４．ヌクレオチドコード配列が機能可能にサイトメガロウィルスのプロモーター 、ラウス肉腫ウィルスのエンハンサー、ポリアデニル化配列、そして場合により Ｃ型肝炎ウィルスの５’ＵＴＲと連結している、請求項３の組換え核酸分子。 ５．融合タンパクがＢ型肝炎ウィルスのプレＳ２遺伝子産物の断片を含み、この 遺伝子産物の断片は、Ｃ型肝炎ウィルスのコアタンパクのうち１ー６９番のアミ ノ酸と連結したＢ型肝炎ウィルスのＳ遺伝子産物と連結している、請求項１の組 換え核酸分子。 ６．ヌクレオチドコード配列が機能可能にサイトメガロウィルスのプロモーター 、ラウス肉腫ウィルスのエンハンサー、ポリアデニル化配列、そして場合により Ｃ型肝炎ウィルスの５’ＵＴＲと連結されている、請求項５の組換え核酸分子。 ７．融合タンパクがＢ型肝炎ウィルスのプレＳ２遺伝子産物の断片を含み、この 遺伝子産物の断片は、Ｃ型肝炎ウィルスのコアタンパクのうち１ー７０番のアミ ノ酸から１ー１５４番のアミノ酸と連結したＢ型肝炎ウィルスのＳ遺伝子産物と 連結している、請求項１の組換え核酸分子。 ８．ヌクレオチドコード配列が機能可能にサイトメガロウィルスのプロモーター 、ラウス肉腫ウィルスのエンハンサー、ポリアデニル化配列、そして場合により Ｃ型肝炎ウィルスの５’ＵＴＲと連結されている、請求項７の組換え核酸分子。 ９．融合タンパクがＢ型肝炎ウィルスのプレＳ１遺伝子産物の断片を含み、この 遺伝子産物の断片はＢ型肝炎ウィルスのプレＳ２遺伝子産物の断片に連結され、 後者はさらにＣ型肝炎ウィルスのコアタンパクのうち１ー６９番のアミノ酸と連 結したＢ型肝炎ウィルスのＳ遺伝子産物と連結している、請求項１の組換え核酸 分子。 １０．ヌクレオチドコード配列が機能可能にサイトメガロウィルスのプロモータ ー、ラウス肉腫ウィルスのエンハンサー、ポリアデニル化配列、そして場合によ りＣ型肝炎ウィルスの５’ＵＴＲと連結されている、請求項９の組換え核酸分子 。 １１．融合タンパクがＢ型肝炎ウィルスのプレＳ１遺伝子産物の断片を含み、こ の遺伝子産物の断片はＢ型肝炎ウィルスのプレＳ２遺伝子産物の断片に連結され 、後者はさらにＣ型肝炎ウィルスのコアタンパクのうち１ー７０番のアミノ酸か ら１ー１５４番のアミノ酸と連結したＢ型肝炎ウィルスのＳ遺伝子産物と連結し ている、請求項１の組換え核酸分子。 １２．ヌクレオチドコード配列が機能可能にサイトメガロウィルスのプロモータ ー、ラウス肉腫ウィルスのエンハンサー、ポリアデニル化配列、そして場合によ りＣ型肝炎ウィルスの５’ＵＴＲと連結されている、請求項１１の組換え核酸分 子。 １３．下記の成分からなる薬剤組成物： ａ）Ｃ型肝炎ウィルスのコアタンパクのうち１ー６９番のアミノ酸と連結し たＢ型肝炎ウィルスのＳ遺伝子産物を含む融合タンパクをコードするヌクレオチ ドコード配列を、ヒトの細胞内で機能する調節要素と機能可能に連結して含む組 換え核酸分子；および ｂ）医薬的に許容される担体あるいは希釈液。 １４．ヒトの細胞内で機能する調節要素に、サイトメガロウィルスのプロモータ ー、ラウス肉腫ウィルスのエンハンサー、ポリアデニル化配列、そして場合によ りＣ型肝炎ウィルスの５’ＵＴＲが含まれる、請求項１３の薬剤組成物。 １５．融合タンパクがＣ型肝炎ウィルスのコアタンパクのうち１ー７０番のアミ ノ酸から１ー１５４番のアミノ酸と結合したＢ型肝炎ウィルスのＳ遺伝子産物か らなる、請求項１３の薬剤組成物。 １６．ヒトの細胞内で機能する調節要素に、サイトメガロウィルスのプロモータ ー、ラウス肉腫ウィルスのエンハンサー、ポリアデニル化配列、そして場合によ りＣ型肝炎ウィルスの５’ＵＴＲが含まれる、請求項１５の薬剤組成物。 １７．融合タンパクがＢ型肝炎ウィルスのプレＳ２遺伝子産物の断片を含み、こ の遺伝子産物の断片は、Ｃ型肝炎ウィルスのコアタンパクのうち１ー６９番のア ミノ酸と連結したＢ型肝炎ウィルスのＳ遺伝子産物と連結している、請求項１３ の薬剤組成物。 １８．ヒトの細胞内で機能する調節要素に、サイトメガロウィルスのプロモータ ー、ラウス肉腫ウィルスのエンハンサー、ポリアデニル化配列、そして場合によ りＣ型肝炎ウィルスの５’ＵＴＲが含まれる、請求項１７の薬剤組成物。 １９．融合タンパクがＢ型肝炎ウィルスのプレＳ２遺伝子産物の断片を含み、こ の遺伝子産物の断片は、Ｃ型肝炎ウィルスのコアタンパクのうち１ー７０番のア ミノ酸から１ー１５４番のアミノ酸と連結したＢ型肝炎ウィルスのＳ遺伝子産物 と連結している、請求項１３の薬剤組成物。 ２０．ヒトの細胞内で機能する調節要素に、サイトメガロウィルスのプロモータ ー、ラウス肉腫ウィルスのエンハンサー、ポリアデニル化配列、そして場合によ りＣ型肝炎ウィルスの５’ＵＴＲが含まれる、請求項１９の薬剤組成物。 ２１．融合タンパクがＢ型肝炎ウィルスのプレＳ１遺伝子産物の断片を含み、こ の遺伝子産物の断片はＢ型肝炎ウィルスのプレＳ２遺伝子産物の断片に連結され 、後者はさらにＣ型肝炎ウィルスのコアタンパクのうち１ー６９番のアミノ酸と 連結したＢ型肝炎ウィルスのＳ遺伝子産物と連結している、請求項１３の薬剤組 成物。 ２２．ヒトの細胞内で機能する調節要素に、サイトメガロウィルスのプロモータ ー、ラウス肉腫ウィルスのエンハンサー、ポリアデニル化配列、そして場合によ りＣ型肝炎ウィルスの５’ＵＴＲが含まれる、請求項２１の薬剤組成物。 ２３．融合タンパクがＢ型肝炎ウィルスのプレＳ１遺伝子産物の断片を含み、こ の遺伝子産物の断片はＢ型肝炎ウィルスのプレＳ２遺伝子産物の断片に連結され 、後者はさらにＣ型肝炎ウィルスのコアタンパクのうち１ー７０番のアミノ酸か ら１ー１５４番のアミノ酸と連結したＢ型肝炎ウィルスのＳ遺伝子産物と連結し ている、請求項１３の薬剤組成物。 ２４．ヒトの細胞内で機能する調節要素に、サイトメガロウィルスのプロモータ ー、ラウス肉腫ウィルスのエンハンサー、ポリアデニル化配列、そして場合によ りＣ型肝炎ウィルスの５’ＵＴＲが含まれる、請求項２３の薬剤組成物。 ２５．Ｃ型肝炎ウィルスのコアタンパクのうち１ー６９番のアミノ酸と連結した Ｂ型肝炎ウィルスのＳ遺伝子産物を含む融合タンパクをコードしており、ヒトの 細胞内で機能する調節要素と機能可能に連結したヌクレオチドコード配列からな る組換え核酸分子、および医薬的に許容される担体あるいは希釈剤とからなる薬 剤組成物を、Ｂ型肝炎ウィルスおよび／またはＣ型肝炎ウィルスに対する防御的 あるいは予防措置的な免疫応答を引き起こすのに効果的な量で、個体に投与する ことからなる、 Ｃ型肝炎ウィルスおよび／またはＢ型肝炎ウィルスによる影響を受けやすいか あるいは感染をしている個体に対して免疫を施す方法。 ２６．融合タンパクがＣ型肝炎ウィルスのコアタンパクのうち１ー７０番のアミ ノ酸から１ー１５４番のアミノ酸と結合したＢ型肝炎ウィルスのＳ遺伝子産物か らなる、請求項２５の方法。 ２７．融合タンパクがＢ型肝炎ウィルスのプレＳ２遺伝子産物の断片を含み、こ の遺伝子産物の断片は、Ｃ型肝炎ウィルスのコアタンパクのうち１ー６９番のア ミノ酸と連結したＢ型肝炎ウィルスのＳ遺伝子産物と連結している、請求項２５ の方法。 ２８．融合タンパクがＢ型肝炎ウィルスのプレＳ２遺伝子産物の断片を含み、こ の遺伝子産物の断片は、Ｃ型肝炎ウィルスのコアタンパクのうち１ー７０番のア ミノ酸から１ー１５４番のアミノ酸と連結したＢ型肝炎ウィルスのＳ遺伝子産物 と連結している、請求項２５の方法。 ２９．融合タンパクがＢ型肝炎ウィルスのプレＳ１遺伝子産物の断片を含み、こ の遺伝子産物の断片はＢ型肝炎ウィルスのプレＳ２遺伝子産物の断片に連結され 、後者はさらにＣ型肝炎ウィルスのコアタンパクのうち１ー６９番のアミノ酸と 連結したＢ型肝炎ウィルスのＳ遺伝子産物と連結している請求項２５の方法。 ３０．融合タンパクがＢ型肝炎ウィルスのプレＳ１遺伝子産物の断片を含み、こ の遺伝子産物の断片はＢ型肝炎ウィルスのプレＳ２遺伝子産物の断片に連結され 、 後者はさらにＣ型肝炎ウィルスのコアタンパクのうち１ー７０番のアミノ酸から １ー１５４番のアミノ酸と連結したＢ型肝炎ウィルスのＳ遺伝子産物と連結して いる、請求項２５の方法。 ３１．薬剤組成物投与個体の投与場所にブピバカインを投与する、請求項２５の 方法。 ３２．薬剤組成物投与個体の投与場所にブピバカインを投与する、請求項２６の 方法。 ３３．薬剤組成物投与個体の投与場所にブピバカインを投与する、請求項２７の 方法。 ３４．薬剤組成物投与個体の投与場所にブピバカインを投与する、請求項２８の 方法。 ３５．薬剤組成物投与個体の投与場所にブピバカインを投与する、請求項２９の 方法。 ３６．薬剤組成物投与個体の投与場所にブピバカインを投与する、請求項３０の 方法。 ３７．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５のアミノ酸配列をもつタンパクをコードする、 不完全なＣ型肝炎ウィルスのゲノムからなる核酸分子。 ３８．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４の配列を含む、請求項３７の核酸分子。 ３９．プロモーターとポリアデニル化配列がさらに含まれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ：１５のアミノ酸配列をもつタンパクをコードしているコード配列が、機能可能 に上記プロモーターおよびポリアデニル化配列に連結されている、請求項３７の 核酸分子。 ４０．核酸分子がプラスミドｐＨＣＶ２−１とプラスミドｐＨＣＶ４−２からな る群から選択される、請求項３７の核酸分子。 ４１．核酸分子がプラスミドｐＨＣＶ２−１である、請求項３７の核酸分子。 ４２．核酸分子がプラスミドｐＨＣＶ４−２である、請求項３７の核酸分子。 ４３．下記の成分からなる薬剤組成物： ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５のアミノ酸を含む完全なＣ型肝炎ウィルスコ アタンパクをコードするヌクレオチドコード配列を含んでおり、完全なＣ型肝炎 ウィルスコアタンパクにヒトの細胞内で機能する調節要素と機能可能に連結され ている、不完全なＣ型肝炎ウィルスのゲノムからなる核酸分子；および ｂ）医薬的に許容される担体あるいは希釈液。 ４４．完全なＣ型肝炎ウィルスコアタンパクをコードするヌクレオチドコード配 列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４のコード配列である、請求項４３の薬剤組成物 。 ４５．完全なＣ型肝炎ウィルスコアタンパクをコードするヌクレオチドコード配 列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４のコード配列であり、さらに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４中の３３２ー３４１番ヌクレオチドをも含んでいる、請求項４３の薬 剤組成物。 ４６．核酸分子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４のコード配列を含む、請求項４３ の薬剤組成物。 ４７．核酸分子がプラスミドｐＨＣＶ２−１とｐＨＣＶ４−２からなる群から選 択される、請求項４３の薬剤組成物。 ４８．核酸分子がプラスミドｐＨＣＶ２−１である請求項４３の薬剤組成物。 ４９．核酸分子がプラスミドｐＨＣＶ４−２である請求項４３の薬剤組成物。 ５０．下記の成分からなる薬剤組成物： ａ）Ｃ型肝炎ウィルスの５’非翻訳領域の断片の少なくとも最後の９ヌクレ オチドおよび完全なＣ型肝炎ウィルスコアタンパクをコードするヌクレオチド配 列が含まれ、それらがヒトの細胞内で機能する調節要素と機能可能に連結されて いる、不完全なＣ型肝炎ウィルスのゲノムからなる核酸分子；および ｂ）医薬的に許容される担体あるいは希釈剤。 ５１．核酸分子に完全なＣ型肝炎ウィルスの５’非翻訳領域が含まれる、請求項 ５０の薬剤組成物。 ５２．Ｃ型肝炎ウィルスに対する防御的あるいは予防措置的な免疫応答を引き起 こすのに効果的な量の、プラスミドｐＨＣＶ２−１あるいはプラスミドｐＨＣＶ ４−２を投与することからなる、Ｃ型肝炎ウィルスによる影響を受けやすいかあ るいは感染をしている個体に対して免疫を施す方法。 ５３．プラスミドｐＨＣＶ２−１が個体に投与される、請求項５２の方法。 ５４．プラスミドｐＨＣＶ４−２がヒトに投与される、請求項５２の方法。 ５５．個体のプラスミドｐＨＣＶ２−１あるいはプラスミドｐＨＣＶ４−２の投 与場所にブピバカインを投与する、請求項５２の方法。 ５６．１００μｇのプラスミドｐＨＣＶ２−１あるいはプラスミドｐＨＣＶ４− ２を個体に投与する、請求項５２の方法。 ５７．プラスミドｐＨＣＶ２−１あるいはプラスミドｐＨＣＶ４−２が、針のな い注入装置を用いてヒトの筋肉内、皮下、そして皮内に投与される、請求項５２ の方法。