JPH06141870A - 非ａ非ｂ型肝炎ウイルス抗原をコードするｄｎａ断片 - Google Patents
非ａ非ｂ型肝炎ウイルス抗原をコードするｄｎａ断片Info
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- JPH06141870A JPH06141870A JP4088140A JP8814092A JPH06141870A JP H06141870 A JPH06141870 A JP H06141870A JP 4088140 A JP4088140 A JP 4088140A JP 8814092 A JP8814092 A JP 8814092A JP H06141870 A JPH06141870 A JP H06141870A
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原をコードするＤＮ
Ａ断片及びその利用方法の提供。 【構成】非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原、特にコア，エン
ベロープ（ＥＮＶ／ＮＳ１），ＮＳ２抗原をコードする
ＤＮＡ断片、該ＤＮＡ断片の発現系、並びに該発現系の
発現による組換え（ポリ）ペプチドの製造方法。
Ａ断片及びその利用方法の提供。 【構成】非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原、特にコア，エン
ベロープ（ＥＮＶ／ＮＳ１），ＮＳ２抗原をコードする
ＤＮＡ断片、該ＤＮＡ断片の発現系、並びに該発現系の
発現による組換え（ポリ）ペプチドの製造方法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイル
ス抗原をコードするＤＮＡ断片に関する。さらに具体的
には、該ウイルスの構造蛋白質であるエンベロープ（Ｅ
ＮＶ、ＮＳ１）抗原及びその非構造蛋白質であるＮＳ２
抗原をコードするＤＮＡ断片に関する。本発明はまた、
これらのＤＮＡ断片の発現に関する。
ス抗原をコードするＤＮＡ断片に関する。さらに具体的
には、該ウイルスの構造蛋白質であるエンベロープ（Ｅ
ＮＶ、ＮＳ１）抗原及びその非構造蛋白質であるＮＳ２
抗原をコードするＤＮＡ断片に関する。本発明はまた、
これらのＤＮＡ断片の発現に関する。
【０００２】
【従来の技術】非Ａ非Ｂ型肝炎は伝染性の肝炎であり、
その病因体としてウイルスが示唆されている。特に、血
液関連型非Ａ非Ｂ型肝炎は、Ｂ型肝炎のスクリーニング
体制が確立された後の輸血後肝炎として医療上の大きな
問題点となっている。
その病因体としてウイルスが示唆されている。特に、血
液関連型非Ａ非Ｂ型肝炎は、Ｂ型肝炎のスクリーニング
体制が確立された後の輸血後肝炎として医療上の大きな
問題点となっている。
【０００３】病原ウイルスの生物学的な性質は、チンパ
ンジーを使用した感染実験によりクロロホルム感受性の
ＲＮＡウイルスであることなど一部明らかとなっている
が、ウイルス自体の同定には至っていない。１９８９年
に、米国カイロン（Chiron）社のＭ．Ｈｏｕｇｈｔｏｎ
ら（特表平２−５００８８０号公報）のグループによっ
て、非Ａ非Ｂ型肝炎に強く関連しているウイルス遺伝子
の一部がλｇｔ１１システムを利用したイムノスクリー
ニングによりクローニングされＣ型肝炎ウイルス（ＨＣ
Ｖ）と命名された。ほぼ同時期、本出願人（特願平３−
１８９２６８号）を含む多くの研究グループ（例えば、
Ｎ．Ｋａｔｏら、 Proc. Jpn. Acad.,65B , 219-223 (1
989)）により、ＨＣＶ遺伝子が数多くクローニングされ
その塩基配列及びその配列から予測されるアミノ酸配列
の解析からＨＣＶはフラビウイルス（日本脳炎ウイル
ス、黄熱病ウイルス等）あるいはペスチウイルス（ブタ
コレラウイルス等）に近縁のウイルスであろうと推定さ
れている（Ｑ−Ｌ．Ｃｈｏｏら、Science, 244, 359〜
362 (1989)）。
ンジーを使用した感染実験によりクロロホルム感受性の
ＲＮＡウイルスであることなど一部明らかとなっている
が、ウイルス自体の同定には至っていない。１９８９年
に、米国カイロン（Chiron）社のＭ．Ｈｏｕｇｈｔｏｎ
ら（特表平２−５００８８０号公報）のグループによっ
て、非Ａ非Ｂ型肝炎に強く関連しているウイルス遺伝子
の一部がλｇｔ１１システムを利用したイムノスクリー
ニングによりクローニングされＣ型肝炎ウイルス（ＨＣ
Ｖ）と命名された。ほぼ同時期、本出願人（特願平３−
１８９２６８号）を含む多くの研究グループ（例えば、
Ｎ．Ｋａｔｏら、 Proc. Jpn. Acad.,65B , 219-223 (1
989)）により、ＨＣＶ遺伝子が数多くクローニングされ
その塩基配列及びその配列から予測されるアミノ酸配列
の解析からＨＣＶはフラビウイルス（日本脳炎ウイル
ス、黄熱病ウイルス等）あるいはペスチウイルス（ブタ
コレラウイルス等）に近縁のウイルスであろうと推定さ
れている（Ｑ−Ｌ．Ｃｈｏｏら、Science, 244, 359〜
362 (1989)）。
【０００４】ＨＣＶはＨＩＶ等の他のＲＮＡウイルスと
同様極めて変異を起こし易く、特に外殻蛋白質の変異が
顕著である。その理由によってか、カイロン社が同定し
たＨＣＶ遺伝子と日本人由来のＨＣＶ遺伝子との間に
は、塩基配列及び推定アミノ酸配列レベルで１０数％の
変異があることが認められている（下遠野邦忠ら、蛋白
質核酸酵素、36（10），1679〜1691 (1991) ）。
同様極めて変異を起こし易く、特に外殻蛋白質の変異が
顕著である。その理由によってか、カイロン社が同定し
たＨＣＶ遺伝子と日本人由来のＨＣＶ遺伝子との間に
は、塩基配列及び推定アミノ酸配列レベルで１０数％の
変異があることが認められている（下遠野邦忠ら、蛋白
質核酸酵素、36（10），1679〜1691 (1991) ）。
【０００５】ジーンウォーキングにより推定されたＨＣ
Ｖの遺伝子構造によると、この構造中には、約3000アミ
ノ酸残基から成るポリプロテインの読み枠が存在し、そ
の５′端に約330 ヌクレオチドの非翻訳領域が存在して
いる（Ｎ．Ｋａｔｏら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
87, 9524-9528 (1990)）。このポリプロテインは、その
機能から５′側より構造蛋白質であるコア、エンベロー
プ、ＮＳ１と、非構造蛋白質であるＮＳ２、ＮＳ３、Ｎ
Ｓ４、ＮＳ５とに分けられる。これらの蛋白質は一本の
ポリプロテインとして合成された後に特異酵素により切
断され、それぞれの機能蛋白質が作られていくと考えら
れている。
Ｖの遺伝子構造によると、この構造中には、約3000アミ
ノ酸残基から成るポリプロテインの読み枠が存在し、そ
の５′端に約330 ヌクレオチドの非翻訳領域が存在して
いる（Ｎ．Ｋａｔｏら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
87, 9524-9528 (1990)）。このポリプロテインは、その
機能から５′側より構造蛋白質であるコア、エンベロー
プ、ＮＳ１と、非構造蛋白質であるＮＳ２、ＮＳ３、Ｎ
Ｓ４、ＮＳ５とに分けられる。これらの蛋白質は一本の
ポリプロテインとして合成された後に特異酵素により切
断され、それぞれの機能蛋白質が作られていくと考えら
れている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】現在、コア、ＮＳ３、
ＮＳ４の遺伝子領域を酵母や大腸菌等で発現させて得ら
れた蛋白質がＨＣＶ抗体診断薬の抗原として使用されて
いる。これらの領域の発現蛋白質は抗原性が強く、多く
の非Ａ非Ｂ型肝炎患者の血清中に抗体が認められるた
め、抗体スクリーング用の抗原としては最適のものであ
る。
ＮＳ４の遺伝子領域を酵母や大腸菌等で発現させて得ら
れた蛋白質がＨＣＶ抗体診断薬の抗原として使用されて
いる。これらの領域の発現蛋白質は抗原性が強く、多く
の非Ａ非Ｂ型肝炎患者の血清中に抗体が認められるた
め、抗体スクリーング用の抗原としては最適のものであ
る。
【０００７】このようにしてＨＣＶ抗体を測定する方法
はほぼ確立されてきているが、抗体を測定するだけでは
たとえ測定結果が陽性であってもその人が現在ウイルス
を持っているキャリアー（保因者）なのか、以前の感染
を反映しているメモリーなのかを判定することはできな
い。そのため、ＨＣＶ抗原そのものを測定する系の開発
が要望されている。免疫学的にウイルス粒子を検出する
ためには、ウイルス粒子表面を認識する抗体が必要とな
る。この目的を達成するためには、ＨＣＶ粒子を構成し
ている外被蛋白質を免疫して該抗体を作製することにな
るが、ＨＣＶは未だにイン・ビトロ培養系で増殖させる
ことができず、免疫原として使用可能なほど多量に得る
ことは困難な状況である。また、ＨＣＶ外被を構成して
いると考えられているエンベロープ及びＮＳ１領域の遺
伝子は変異が激しく、今までに報告されているＨＣＶ株
間で大きな違いが認められる。従って、全てのＨＣＶ粒
子を検出するためには、これら株間の変異に対応した抗
体が必要であり、抗体を作るための多くの種類の抗原が
必要となる。そのためには、ＨＣＶの多くの株の構造蛋
白質領域をコードする遺伝子が必要であろう。
はほぼ確立されてきているが、抗体を測定するだけでは
たとえ測定結果が陽性であってもその人が現在ウイルス
を持っているキャリアー（保因者）なのか、以前の感染
を反映しているメモリーなのかを判定することはできな
い。そのため、ＨＣＶ抗原そのものを測定する系の開発
が要望されている。免疫学的にウイルス粒子を検出する
ためには、ウイルス粒子表面を認識する抗体が必要とな
る。この目的を達成するためには、ＨＣＶ粒子を構成し
ている外被蛋白質を免疫して該抗体を作製することにな
るが、ＨＣＶは未だにイン・ビトロ培養系で増殖させる
ことができず、免疫原として使用可能なほど多量に得る
ことは困難な状況である。また、ＨＣＶ外被を構成して
いると考えられているエンベロープ及びＮＳ１領域の遺
伝子は変異が激しく、今までに報告されているＨＣＶ株
間で大きな違いが認められる。従って、全てのＨＣＶ粒
子を検出するためには、これら株間の変異に対応した抗
体が必要であり、抗体を作るための多くの種類の抗原が
必要となる。そのためには、ＨＣＶの多くの株の構造蛋
白質領域をコードする遺伝子が必要であろう。
【０００８】本発明者らは、ＨＣＶ構造蛋白質のように
天然には入手しにくい蛋白質を大量に作製するためにＤ
ＮＡ組換え技術を用いて、異なるＣ型肝炎患者からの構
造蛋白質コア、エンベロープ、ＮＳ１をコードする遺伝
子をクローニングし、その遺伝子の発現を行なった。
天然には入手しにくい蛋白質を大量に作製するためにＤ
ＮＡ組換え技術を用いて、異なるＣ型肝炎患者からの構
造蛋白質コア、エンベロープ、ＮＳ１をコードする遺伝
子をクローニングし、その遺伝子の発現を行なった。
【０００９】本発明の目的は、配列番号２又は３によっ
て示される、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原、特にＣＯＲ
Ｅ及び／又はＥＮＶ及び／又はＮＳ１及び／又はＮＳ２
抗原をコードするＤＮＡ断片を提供することである。
て示される、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原、特にＣＯＲ
Ｅ及び／又はＥＮＶ及び／又はＮＳ１及び／又はＮＳ２
抗原をコードするＤＮＡ断片を提供することである。
【００１０】本発明の別の目的は、上記ＤＮＡ断片の発
現系、即ち発現ベクター及び形質転換体を提供すること
である。
現系、即ち発現ベクター及び形質転換体を提供すること
である。
【００１１】本発明のさらに別の目的は、上記発現系を
使用する、配列番号２又は３によって示される非Ａ非Ｂ
型肝炎ウイルス抗原の全部又は部分的アミノ酸配列を含
む組換え（ポリ）ペプチドの製造方法を提供することで
ある。
使用する、配列番号２又は３によって示される非Ａ非Ｂ
型肝炎ウイルス抗原の全部又は部分的アミノ酸配列を含
む組換え（ポリ）ペプチドの製造方法を提供することで
ある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、異なるＣ
型肝炎患者の血漿中から、従来のものと異なり且つ互い
に異なる２種類のＨＣＶ遺伝子（＃４及び＃６）をクロ
ーニングすることに成功した。
型肝炎患者の血漿中から、従来のものと異なり且つ互い
に異なる２種類のＨＣＶ遺伝子（＃４及び＃６）をクロ
ーニングすることに成功した。
【００１３】図１には、ＨＣＶ（＃４）遺伝子の５′側
構造を、また図２には、ＨＣＶ（＃６）遺伝子の５′側
構造を、それらの制限酵素部位と共に示している。得ら
れたＨＣＶ（＃４）遺伝子は主として、５′末端に約３
１０塩基対の非翻訳領域（以下、ｃｏｒｅＩとも称す
る）、約５７０塩基対のコア（ＣＯＲＥ）領域、約５７
０塩基対のエンベロープ（ＥＮＶ）領域、約１２８０塩
基対のＮＳ１領域、約７２０塩基対のＮＳ２領域、及び
ＮＳ３領域の一部から構成されることが判明した。ま
た、ＨＣＶ（＃６）遺伝子もＨＣＶ（＃４）遺伝子と類
似の遺伝子構造を有していた。
構造を、また図２には、ＨＣＶ（＃６）遺伝子の５′側
構造を、それらの制限酵素部位と共に示している。得ら
れたＨＣＶ（＃４）遺伝子は主として、５′末端に約３
１０塩基対の非翻訳領域（以下、ｃｏｒｅＩとも称す
る）、約５７０塩基対のコア（ＣＯＲＥ）領域、約５７
０塩基対のエンベロープ（ＥＮＶ）領域、約１２８０塩
基対のＮＳ１領域、約７２０塩基対のＮＳ２領域、及び
ＮＳ３領域の一部から構成されることが判明した。ま
た、ＨＣＶ（＃６）遺伝子もＨＣＶ（＃４）遺伝子と類
似の遺伝子構造を有していた。
【００１４】これら２種類のＨＣＶ遺伝子の配列決定に
際しては、先ずＣ型肝炎患者血漿よりＲＮＡを取り出
し、これに逆転写酵素を作用させてｃＤＮＡを合成し、
２種類のプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ
ＣＲ）を行なってＨＣＶの増幅ＤＮＡ断片を得、常法に
従って該ＤＮＡ断片のクローニングを行ない、最後にＳ
ａｎｇｅｒ（Science, 214, 1205〜1210 (1981) ）のジ
デオキシ鎖終止法を用いて塩基配列を決定するという手
順を採用する。この手法により、５′非翻訳領域
（Ａ）、構造遺伝子コア領域（Ｂ）、構造遺伝子エンベ
ロープ領域（Ｃ）、及び非構造遺伝子ＮＳ１／ＮＳ２領
域（Ｄ）の４つの領域のＤＮＡ断片を得、それらの各塩
基配列を決定した。
際しては、先ずＣ型肝炎患者血漿よりＲＮＡを取り出
し、これに逆転写酵素を作用させてｃＤＮＡを合成し、
２種類のプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ
ＣＲ）を行なってＨＣＶの増幅ＤＮＡ断片を得、常法に
従って該ＤＮＡ断片のクローニングを行ない、最後にＳ
ａｎｇｅｒ（Science, 214, 1205〜1210 (1981) ）のジ
デオキシ鎖終止法を用いて塩基配列を決定するという手
順を採用する。この手法により、５′非翻訳領域
（Ａ）、構造遺伝子コア領域（Ｂ）、構造遺伝子エンベ
ロープ領域（Ｃ）、及び非構造遺伝子ＮＳ１／ＮＳ２領
域（Ｄ）の４つの領域のＤＮＡ断片を得、それらの各塩
基配列を決定した。
【００１５】決定された各ＤＮＡ断片の配列を基に、約
3500ヌクレオチドから成るＨＣＶ遺伝子（５′非翻訳領
域／ＣＯＲＥ／ＥＮＶ／ＮＳ１／ＮＳ２／ＮＳ３）の塩
基配列及び推定アミノ酸配列を決定し、ＨＣＶ（＃４）
遺伝子に関して決定された配列を配列番号２として、ま
たＨＣＶ（＃６）遺伝子に関して決定された配列を配列
番号３として後記配列表中にそれぞれ示した。
3500ヌクレオチドから成るＨＣＶ遺伝子（５′非翻訳領
域／ＣＯＲＥ／ＥＮＶ／ＮＳ１／ＮＳ２／ＮＳ３）の塩
基配列及び推定アミノ酸配列を決定し、ＨＣＶ（＃４）
遺伝子に関して決定された配列を配列番号２として、ま
たＨＣＶ（＃６）遺伝子に関して決定された配列を配列
番号３として後記配列表中にそれぞれ示した。
【００１６】＃４及び＃６のＨＣＶ遺伝子構造の特徴は
以下のとおりである。
以下のとおりである。
【００１７】（１）ＨＣＶ（＃４）遺伝子断片 ３４６１ヌクレオチドから成り、翻訳領域はヌクレオチ
ド番号３０７〜３４６１（１０５１アミノ酸）であり、
このうちＣＯＲＥ領域はヌクレオチド番号３０７〜８７
９（１９１アミノ酸）、ＥＮＶ（ＥＮＶ１とも称する）
領域はヌクレオチド番号８８０〜１４５５（１９２アミ
ノ酸）、ＮＳ１（ＥＮＶ２とも称する）領域はヌクレオ
チド番号１４５６〜２７３６（４２７アミノ酸）、ＮＳ
２領域及びＮＳ３領域はヌクレオチド番号２７３７〜３
４６１（２４１アミノ酸）に対応している。
ド番号３０７〜３４６１（１０５１アミノ酸）であり、
このうちＣＯＲＥ領域はヌクレオチド番号３０７〜８７
９（１９１アミノ酸）、ＥＮＶ（ＥＮＶ１とも称する）
領域はヌクレオチド番号８８０〜１４５５（１９２アミ
ノ酸）、ＮＳ１（ＥＮＶ２とも称する）領域はヌクレオ
チド番号１４５６〜２７３６（４２７アミノ酸）、ＮＳ
２領域及びＮＳ３領域はヌクレオチド番号２７３７〜３
４６１（２４１アミノ酸）に対応している。
【００１８】（２）ＨＣＶ（＃６）遺伝子断片 ３４０１ヌクレオチドから成り、翻訳領域はヌクレオチ
ド番号３０７〜３４０１（１０３１アミノ酸）であり、
このうちＣＯＲＥ領域はヌクレオチド番号３０７〜８７
９（１９１アミノ酸）、ＥＮＶ（ＥＮＶ１とも称する）
領域はヌクレオチド番号８８０〜１４５５（１９２アミ
ノ酸）、ＮＳ１（ＥＮＶ２とも称する）領域はヌクレオ
チド番号１４５６〜２７３６（４２７アミノ酸）、ＮＳ
２領域及びＮＳ３領域はヌクレオチド番号２７３７〜３
４０１（２２１アミノ酸）に対応している。
ド番号３０７〜３４０１（１０３１アミノ酸）であり、
このうちＣＯＲＥ領域はヌクレオチド番号３０７〜８７
９（１９１アミノ酸）、ＥＮＶ（ＥＮＶ１とも称する）
領域はヌクレオチド番号８８０〜１４５５（１９２アミ
ノ酸）、ＮＳ１（ＥＮＶ２とも称する）領域はヌクレオ
チド番号１４５６〜２７３６（４２７アミノ酸）、ＮＳ
２領域及びＮＳ３領域はヌクレオチド番号２７３７〜３
４０１（２２１アミノ酸）に対応している。
【００１９】さらに、ＨＣＶ（＃４）及びＨＣＶ（＃
６）遺伝子断片を、すでに公表されたカイロン社（ＷＯ
９０／１１０８９）、岡山ら（J. Virol., 65, 1105-1
113 (1991)）又は下遠野ら（Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA, 87, 9524-9528 (1990)）の配列（ＣＯＲＥ〜ＮＳ
２）とヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の相同性を比
較した結果を下記表１に示す。
６）遺伝子断片を、すでに公表されたカイロン社（ＷＯ
９０／１１０８９）、岡山ら（J. Virol., 65, 1105-1
113 (1991)）又は下遠野ら（Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA, 87, 9524-9528 (1990)）の配列（ＣＯＲＥ〜ＮＳ
２）とヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の相同性を比
較した結果を下記表１に示す。
【００２０】 表 １ 相 同 性 （％） ＨＣＶ遺伝子 全ヌクレオチド配列 全アミノ酸配列 ＃４／ カイロン社 ７７．８ ８０．９ 岡山ら ８９．１ ８８．０ 下遠野ら ９０．８ ９１．５ ＃６／ カイロン社 ７８．４ ８２．０ 岡山ら ９０．４ ９０．０ 下遠野ら ９１．２ ９１．６ 表１の相同性比較から、本発明のＨＣＶ遺伝子断片は、
公表された遺伝子断片との間に、ヌクレオチド配列レベ
ルで約１０〜２５％、アミノ酸配列レベルで約１０〜２
０％の違いがあることが分かる。
公表された遺伝子断片との間に、ヌクレオチド配列レベ
ルで約１０〜２５％、アミノ酸配列レベルで約１０〜２
０％の違いがあることが分かる。
【００２１】従って、本発明は、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイル
ス由来の配列番号２又は３によって示されるアミノ酸配
列の全部又は一部をコードするヌクレオチド配列を含む
ＤＮＡ断片を提供する。なお、該ヌクレオチド配列は、
遺伝暗号の縮重に基づく全ての配列を包含するものとす
る。
ス由来の配列番号２又は３によって示されるアミノ酸配
列の全部又は一部をコードするヌクレオチド配列を含む
ＤＮＡ断片を提供する。なお、該ヌクレオチド配列は、
遺伝暗号の縮重に基づく全ての配列を包含するものとす
る。
【００２２】本発明はまた、配列番号２又は３によって
示されるＥＮＶ、ＮＳ１及びＮＳ２抗原の全部又は一部
をコードするＤＮＡ断片を提供する。これらＥＮＶ、Ｎ
Ｓ１及びＮＳ２の各領域についてはすでに前記したとお
りである。
示されるＥＮＶ、ＮＳ１及びＮＳ２抗原の全部又は一部
をコードするＤＮＡ断片を提供する。これらＥＮＶ、Ｎ
Ｓ１及びＮＳ２の各領域についてはすでに前記したとお
りである。
【００２３】本発明はさらに、配列番号２又は３によっ
て示される全ヌクレオチドから成るＤＮＡ断片を提供す
る。
て示される全ヌクレオチドから成るＤＮＡ断片を提供す
る。
【００２４】本発明のＤＮＡ断片はそれを含む適当な発
現ベクターを作製するために、予め任意のプラスミド又
はファージに組み込み、大腸菌等の微生物細胞中に移入
してクローニングすることにより該ＤＮＡ断片の多数の
コピーが調製される。
現ベクターを作製するために、予め任意のプラスミド又
はファージに組み込み、大腸菌等の微生物細胞中に移入
してクローニングすることにより該ＤＮＡ断片の多数の
コピーが調製される。
【００２５】５′非翻訳領域から非構造蛋白質ＮＳ２領
域までの各クローン化ＤＮＡの継ぎ込みは、決定された
塩基配列から予想される制限酵素部位を用いて実施する
ことができる。これによって、５′非翻訳領域（Ａ）と
構造蛋白質コア領域（Ｂ）の継ぎ込み、非翻訳領域
（Ａ）から構造蛋白質ＮＳ１（Ｃ）までの継ぎ込み、
５′非翻訳領域（Ａ）から非構造蛋白質ＮＳ１／ＮＳ２
（Ｄ）までの継ぎ込みが可能となり、対応するＤＮＡ断
片を保有するクローンＡＢ，ＡＢＣ，ＡＢＣＤを調製す
ることができる。この具体的な手法については、下記実
施例３で詳述する。このうち、クローンＡＢＣＤ（ＣＰ
−４）からの約３．５kb ＤＮＡ断片はプラスミドに組
み込んだ後、大腸菌ＪＭ１０７株に移入し、形質転換体
（E.coli JM107／CP-4）として微工研菌寄第１２７８６
号として平成４年２月２４日付で寄託されている。
域までの各クローン化ＤＮＡの継ぎ込みは、決定された
塩基配列から予想される制限酵素部位を用いて実施する
ことができる。これによって、５′非翻訳領域（Ａ）と
構造蛋白質コア領域（Ｂ）の継ぎ込み、非翻訳領域
（Ａ）から構造蛋白質ＮＳ１（Ｃ）までの継ぎ込み、
５′非翻訳領域（Ａ）から非構造蛋白質ＮＳ１／ＮＳ２
（Ｄ）までの継ぎ込みが可能となり、対応するＤＮＡ断
片を保有するクローンＡＢ，ＡＢＣ，ＡＢＣＤを調製す
ることができる。この具体的な手法については、下記実
施例３で詳述する。このうち、クローンＡＢＣＤ（ＣＰ
−４）からの約３．５kb ＤＮＡ断片はプラスミドに組
み込んだ後、大腸菌ＪＭ１０７株に移入し、形質転換体
（E.coli JM107／CP-4）として微工研菌寄第１２７８６
号として平成４年２月２４日付で寄託されている。
【００２６】本発明はまた、上記ＤＮＡ断片をプロモー
ターの下流に存在するベクター内のクローニング部位に
導入して得られる発現ベクターを提供する。
ターの下流に存在するベクター内のクローニング部位に
導入して得られる発現ベクターを提供する。
【００２７】ベクターとしては、プラスミド，ファージ
等の慣用のベクターの他に、ウイルスが使用され、特に
ウイルスが好ましく、その中でワクシニアウイルス、バ
キュロウイルス等が好適である。ＤＮＡ発現により得ら
れる組換え（ポリ）ペプチドが糖鎖構造をもつようにす
るか否かによって、使用し得るプロモーター及び宿主の
種類が決まる。すなわち、組換え（ポリ）ペプチドが糖
鎖構造を含まない場合には、宿主として例えば大腸菌，
枯草菌，ファージ等の原核生物を用いることができ、ま
た、プロモーターとして例えばトリプトファン合成酵素
オペロン（ｔｒｐ），ラクトースオペロン（ｌａｃ），
ラムダファージＰL ，ＰR 等を用いることができる。一
方、組換え（ポリ）ペプチドが糖鎖構造を含む場合に
は、宿主として例えば酵母，植物細胞，昆虫細胞，動物
細胞等の真核生物が挙げられ、またプロモーターとして
酵母等に慣用のプロモーター例えば３−ホスホグリセレ
ートキナーゼ，エノラーゼ等の解糖系酵素に対するプロ
モーターやアルコールデヒドロゲナーゼに対するプロモ
ーター、哺乳動物細胞で使用され得るウイルスプロモー
ター例えばポリオーマウイルス，アデノウイルス，サル
ウイルスＳＶ４０，ワクシニアウイルス，サイトメガロ
ウイルス等由来のプロモーターが挙げられる。
等の慣用のベクターの他に、ウイルスが使用され、特に
ウイルスが好ましく、その中でワクシニアウイルス、バ
キュロウイルス等が好適である。ＤＮＡ発現により得ら
れる組換え（ポリ）ペプチドが糖鎖構造をもつようにす
るか否かによって、使用し得るプロモーター及び宿主の
種類が決まる。すなわち、組換え（ポリ）ペプチドが糖
鎖構造を含まない場合には、宿主として例えば大腸菌，
枯草菌，ファージ等の原核生物を用いることができ、ま
た、プロモーターとして例えばトリプトファン合成酵素
オペロン（ｔｒｐ），ラクトースオペロン（ｌａｃ），
ラムダファージＰL ，ＰR 等を用いることができる。一
方、組換え（ポリ）ペプチドが糖鎖構造を含む場合に
は、宿主として例えば酵母，植物細胞，昆虫細胞，動物
細胞等の真核生物が挙げられ、またプロモーターとして
酵母等に慣用のプロモーター例えば３−ホスホグリセレ
ートキナーゼ，エノラーゼ等の解糖系酵素に対するプロ
モーターやアルコールデヒドロゲナーゼに対するプロモ
ーター、哺乳動物細胞で使用され得るウイルスプロモー
ター例えばポリオーマウイルス，アデノウイルス，サル
ウイルスＳＶ４０，ワクシニアウイルス，サイトメガロ
ウイルス等由来のプロモーターが挙げられる。
【００２８】ベクターはさらに、形質転換された細胞の
表現型選択を可能にするマーカー配列（例えばアンピシ
リン，テトラサイクリン耐性遺伝子等）、複製開始点、
ターミネーター、リボソーム結合部位等を適宜含み得
る。
表現型選択を可能にするマーカー配列（例えばアンピシ
リン，テトラサイクリン耐性遺伝子等）、複製開始点、
ターミネーター、リボソーム結合部位等を適宜含み得
る。
【００２９】本発明においては、ＨＣＶ外被を構成して
いるエンベロープ及びＮＳ１構造蛋白質が糖鎖を保持し
ているために、ベクターとしてウイルス好ましくはワク
シニアウイルスやバキュロウイルス、また、宿主として
動物細胞好ましくは哺乳類細胞（例えばウサギ腎継代細
胞ＲＫ−１３）が使用される。
いるエンベロープ及びＮＳ１構造蛋白質が糖鎖を保持し
ているために、ベクターとしてウイルス好ましくはワク
シニアウイルスやバキュロウイルス、また、宿主として
動物細胞好ましくは哺乳類細胞（例えばウサギ腎継代細
胞ＲＫ−１３）が使用される。
【００３０】本発明のＤＮＡ発現用組換えワクシニアウ
イルスの調製は、本出願人により出願された特願平３−
２０４０３０号に記載の方法を使用し得る。すなわち、
この方法に従って、先ず、ＨＣＶ抗原をコードする遺伝
子と、これを発現させ得るウイルスプロモーター（例え
ばワクシニアウイルス由来のＡＴＩプロモーター，ｐ
７．５Ｋプロモーター）と、及びワクシニアウイルスの
増殖のために必須でないワクシニアウイルス遺伝子とを
含有する組換えプラスミドを作製し、該プラスミドを制
限的に線状化し、ワクシニアウイルスが感染している動
物細胞にトランスフェクションして相同性組換えを行
い、ＨＣＶ抗原をコードする遺伝子が挿入されている組
換えウイルスをスクリーニングし、回収する。ワクシニ
アウイルスとしては、ワクシニアウイルス・リスター株
及びＷＲ株が好適に使用される。バキュロウイルスにつ
いても同様に組換え体を調製し得る（実施例３）。
イルスの調製は、本出願人により出願された特願平３−
２０４０３０号に記載の方法を使用し得る。すなわち、
この方法に従って、先ず、ＨＣＶ抗原をコードする遺伝
子と、これを発現させ得るウイルスプロモーター（例え
ばワクシニアウイルス由来のＡＴＩプロモーター，ｐ
７．５Ｋプロモーター）と、及びワクシニアウイルスの
増殖のために必須でないワクシニアウイルス遺伝子とを
含有する組換えプラスミドを作製し、該プラスミドを制
限的に線状化し、ワクシニアウイルスが感染している動
物細胞にトランスフェクションして相同性組換えを行
い、ＨＣＶ抗原をコードする遺伝子が挿入されている組
換えウイルスをスクリーニングし、回収する。ワクシニ
アウイルスとしては、ワクシニアウイルス・リスター株
及びＷＲ株が好適に使用される。バキュロウイルスにつ
いても同様に組換え体を調製し得る（実施例３）。
【００３１】本発明はさらに、配列番号２又は３によっ
て示される非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原のアミノ酸配列
の全部又は一部を含む組換え（ポリ）ペプチドの製造方
法を提供する。この方法は、本発明のＤＮＡ断片を適当
な宿主細胞内で発現させ得る複製可能な発現ベクターを
構築する工程、該発現ベクターを宿主細胞内に導入して
形質転換体を得る工程、ＤＮＡ断片を発現させ得る条件
下で該形質転換体を培養して該組換え（ポリ）ペプチド
を発現させる工程、及び該組換え（ポリ）ペプチドを回
収する工程を包含する。
て示される非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原のアミノ酸配列
の全部又は一部を含む組換え（ポリ）ペプチドの製造方
法を提供する。この方法は、本発明のＤＮＡ断片を適当
な宿主細胞内で発現させ得る複製可能な発現ベクターを
構築する工程、該発現ベクターを宿主細胞内に導入して
形質転換体を得る工程、ＤＮＡ断片を発現させ得る条件
下で該形質転換体を培養して該組換え（ポリ）ペプチド
を発現させる工程、及び該組換え（ポリ）ペプチドを回
収する工程を包含する。
【００３２】形質転換体の培養条件は、使用する宿主細
胞に依存して決定され、増殖可能な培地、培養温度、培
養時間等が適宜選択される。また、培養物からの組換え
（ポリ）ペプチドの生成は、慣用の技術例えば細胞の超
音波破砕、可溶化抽出、硫安分画、各種クロマトグラフ
ィー等により行うことができる。発現産物は、非Ａ非Ｂ
型肝炎患者血清との交叉反応性を調べることにより明ら
かな交叉性を示したことから、非Ａ非Ｂ型肝炎の診断及
び非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスの検出に使用可能である（図
３及び図５）。
胞に依存して決定され、増殖可能な培地、培養温度、培
養時間等が適宜選択される。また、培養物からの組換え
（ポリ）ペプチドの生成は、慣用の技術例えば細胞の超
音波破砕、可溶化抽出、硫安分画、各種クロマトグラフ
ィー等により行うことができる。発現産物は、非Ａ非Ｂ
型肝炎患者血清との交叉反応性を調べることにより明ら
かな交叉性を示したことから、非Ａ非Ｂ型肝炎の診断及
び非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスの検出に使用可能である（図
３及び図５）。
【００３３】
【実施例】以下の実施例により、本発明を更に詳細に説
明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【００３４】実施例１ ５′非翻訳領域（ｃｏｒｅＩ）のクローニング （ａ）非Ａ非Ｂ型肝炎患者血漿からのｃＤＮＡライブラ
リーの調製 慢性期にある日本人非Ａ非Ｂ型肝炎患者の血漿１ｌを等
量の50mM Tris-HCl(pH8.0) 、1mM EDTAで希釈後、細胞
破砕物等を３５００ｇで２０分間遠心することにより除
去する。この上清をさらに4500 rpm（約100000ｇ）、４
℃で４時間遠心することによりペレットを得た。このペ
レットを常法に従い蛋白変性剤である６Ｍグアニジウム
チオシアネートを用いて溶解後、セシウムトリフルオロ
アセテート液の上に重層し、ベックマンＳＷ５０ロータ
ーで 33000 rpm、２０℃で１８時間遠心してペレットを
得た。このペレットを10mM Tris-HCl (pH 7.5)、1mM ED
TA溶液に溶かし、フェノール：クロロホルム（１：１）
混合液で２回の抽出操作の後、上清をとり５Ｍ ＮａＣ
ｌを１０分の１量およびエタノールを２．５倍量加えて
−２０℃に２時間放置した。２時間放置後１５０００ｇ
で２０分間遠心し得られたペレットをジエチルピロカー
ボネート処理水に溶解し、ＲＮＡ試料とした。
リーの調製 慢性期にある日本人非Ａ非Ｂ型肝炎患者の血漿１ｌを等
量の50mM Tris-HCl(pH8.0) 、1mM EDTAで希釈後、細胞
破砕物等を３５００ｇで２０分間遠心することにより除
去する。この上清をさらに4500 rpm（約100000ｇ）、４
℃で４時間遠心することによりペレットを得た。このペ
レットを常法に従い蛋白変性剤である６Ｍグアニジウム
チオシアネートを用いて溶解後、セシウムトリフルオロ
アセテート液の上に重層し、ベックマンＳＷ５０ロータ
ーで 33000 rpm、２０℃で１８時間遠心してペレットを
得た。このペレットを10mM Tris-HCl (pH 7.5)、1mM ED
TA溶液に溶かし、フェノール：クロロホルム（１：１）
混合液で２回の抽出操作の後、上清をとり５Ｍ ＮａＣ
ｌを１０分の１量およびエタノールを２．５倍量加えて
−２０℃に２時間放置した。２時間放置後１５０００ｇ
で２０分間遠心し得られたペレットをジエチルピロカー
ボネート処理水に溶解し、ＲＮＡ試料とした。
【００３５】得られたＲＮＡ試料を用いて、Gubler & H
offmanの方法に従い、市販キット（Amersham社あるいは
ＢＲＬ社）を用いランダムプライマー法によりｃＤＮＡ
を合成した。合成されたｃＤＮＡをＥｃｏＲＩメチラー
ゼで処理した後にＥｃｏＲＩリンカーあるいはＥｃｏＲ
Ｉアダプターを連結し、λｇｔ１１ファージのＥｃｏＲ
Ｉ部位にクローニングした。作製したｃＤＮＡライブラ
リーは、平均１０6 〜１０7 ＰＦＵの組み換え体ファー
ジを含んでいた。
offmanの方法に従い、市販キット（Amersham社あるいは
ＢＲＬ社）を用いランダムプライマー法によりｃＤＮＡ
を合成した。合成されたｃＤＮＡをＥｃｏＲＩメチラー
ゼで処理した後にＥｃｏＲＩリンカーあるいはＥｃｏＲ
Ｉアダプターを連結し、λｇｔ１１ファージのＥｃｏＲ
Ｉ部位にクローニングした。作製したｃＤＮＡライブラ
リーは、平均１０6 〜１０7 ＰＦＵの組み換え体ファー
ジを含んでいた。
【００３６】（ｂ）Ｃ型肝炎ウイルス特異的ｃＤＮＡの
単離 Ｃ型肝炎ウイルス構造遺伝子として得られたクローンＣ
１１−Ｃ２１（特願平２−４１３８４４号）を、ランダ
ムプライマーラベリング法で32Ｐ標識し、プローブとし
て使用し、ハイブリダイゼーションアッセイにより上記
のｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行った。
単離 Ｃ型肝炎ウイルス構造遺伝子として得られたクローンＣ
１１−Ｃ２１（特願平２−４１３８４４号）を、ランダ
ムプライマーラベリング法で32Ｐ標識し、プローブとし
て使用し、ハイブリダイゼーションアッセイにより上記
のｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行った。
【００３７】スクリーニングは、大腸菌Ｙ１０９０株に
５×１０4 ＰＦＵの組換え体ファージを３７℃、１５分
間で感染させ、１５０mmＬＢ寒天プレート（１％トリプ
トン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、１．５
％寒天）にまく。３７℃で一晩培養し、プラークが出現
したら４℃に１時間放置する。このプレートの寒天にHy
bond−Ｎフィルター（アマシャム社）をかぶせて３０秒
間放置する。次に、変性溶液（0.5M NaOH 、1.5M NaCl
）で湿らせた濾紙の上にこのフィルターをのせ、２分
間放置後、中和溶液（0.5M Tris-HCl pH 7.0、1.5M NaC
l ）に５分間浸し、更に２×ＳＳＣ（0.3M NaCl 、0.03
M クエン酸ナトリウム）中で洗浄した後、風乾させる。
乾燥したフイルターは、３０４nmＵＶを２分間照射し、
ＵＶ−クロスリンキングした。
５×１０4 ＰＦＵの組換え体ファージを３７℃、１５分
間で感染させ、１５０mmＬＢ寒天プレート（１％トリプ
トン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、１．５
％寒天）にまく。３７℃で一晩培養し、プラークが出現
したら４℃に１時間放置する。このプレートの寒天にHy
bond−Ｎフィルター（アマシャム社）をかぶせて３０秒
間放置する。次に、変性溶液（0.5M NaOH 、1.5M NaCl
）で湿らせた濾紙の上にこのフィルターをのせ、２分
間放置後、中和溶液（0.5M Tris-HCl pH 7.0、1.5M NaC
l ）に５分間浸し、更に２×ＳＳＣ（0.3M NaCl 、0.03
M クエン酸ナトリウム）中で洗浄した後、風乾させる。
乾燥したフイルターは、３０４nmＵＶを２分間照射し、
ＵＶ−クロスリンキングした。
【００３８】このフイルターをＣ１１−Ｃ２１クローン
の32Ｐ標識ＤＮＡプローブとハイブリダイゼーション液
［６×ＳＳＣ，５×デンハート液（０．１％ウシ血清ア
ルブミン、０．１％フィコール、０．１％ポリビニルピ
ロリドン）、０．５％ＳＤＳ、５０μｇ／ml変性サケ精
子ＤＮＡ］中で、５５℃、一晩インキュベートし反応さ
せる。その後、バックグラウンドをおとすため、１×Ｓ
ＳＣ５５℃で１０分間ずつ２回洗浄する。このフィルタ
ーを−７０℃でオートラジオグラフィーを行い、陽性プ
ラークを検出する。このスクリーニングにより陽性クロ
ーンが１つ得られた。
の32Ｐ標識ＤＮＡプローブとハイブリダイゼーション液
［６×ＳＳＣ，５×デンハート液（０．１％ウシ血清ア
ルブミン、０．１％フィコール、０．１％ポリビニルピ
ロリドン）、０．５％ＳＤＳ、５０μｇ／ml変性サケ精
子ＤＮＡ］中で、５５℃、一晩インキュベートし反応さ
せる。その後、バックグラウンドをおとすため、１×Ｓ
ＳＣ５５℃で１０分間ずつ２回洗浄する。このフィルタ
ーを−７０℃でオートラジオグラフィーを行い、陽性プ
ラークを検出する。このスクリーニングにより陽性クロ
ーンが１つ得られた。
【００３９】（ｃ）Ｃ型肝炎ウイルス特異的ｃＤＮＡの
配列決定 得られたλｇｔ１１クローンのファージを大腸菌に感染
させ、大量のファージを回収する。このファージから常
法（Maniatisら、Molecular Cloning: A Laboratory Ma
nual, 1982）に従いＤＮＡを抽出する。このＤＮＡを制
限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、アガロースゲル電気泳動に
より約４４０ｂの断片を精製した。一方シークエンス用
ベクターであるＭ１３ファージのｍｐ１９（Messing,
J., Hethod in Enzymology, 101, 20〜78）をＥｃｏＲ
Ｉで消化し、線状化した。前記のｃＤＮＡ断片とベクタ
ーＤＮＡを、反応液（66mM Tris-HCl pH 7.6、6.6mM Mg
Cl2、１０mMジチオスレイトール、１mMＡＴＰ）中でＴ
４リガーゼにより連結し、この反応物を用い、大腸菌Ｊ
Ｍ107 株に形質導入した。挿入断片を含むＭ１３ファー
ジをジデオキシ法（Sanger, F. Nioklen, S および Cor
lson, A. R. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 74, 5463〜
5467, 1977）によって、塩基配列を決定した。決定され
た塩基配列及びそれから推定されるアミノ酸配列を配列
番号１として示した。
配列決定 得られたλｇｔ１１クローンのファージを大腸菌に感染
させ、大量のファージを回収する。このファージから常
法（Maniatisら、Molecular Cloning: A Laboratory Ma
nual, 1982）に従いＤＮＡを抽出する。このＤＮＡを制
限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、アガロースゲル電気泳動に
より約４４０ｂの断片を精製した。一方シークエンス用
ベクターであるＭ１３ファージのｍｐ１９（Messing,
J., Hethod in Enzymology, 101, 20〜78）をＥｃｏＲ
Ｉで消化し、線状化した。前記のｃＤＮＡ断片とベクタ
ーＤＮＡを、反応液（66mM Tris-HCl pH 7.6、6.6mM Mg
Cl2、１０mMジチオスレイトール、１mMＡＴＰ）中でＴ
４リガーゼにより連結し、この反応物を用い、大腸菌Ｊ
Ｍ107 株に形質導入した。挿入断片を含むＭ１３ファー
ジをジデオキシ法（Sanger, F. Nioklen, S および Cor
lson, A. R. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 74, 5463〜
5467, 1977）によって、塩基配列を決定した。決定され
た塩基配列及びそれから推定されるアミノ酸配列を配列
番号１として示した。
【００４０】実施例２ ＲＴ−ＰＣＲによるＨＣＶ（＃４）遺伝子の検出 Ｃ型肝炎患者の血漿中からＨＣＶ遺伝子をクローニング
する方法として少量の血清から迅速にクローニングが可
能なＲＴ−ＰＣＲ法を用いた。
する方法として少量の血清から迅速にクローニングが可
能なＲＴ−ＰＣＲ法を用いた。
【００４１】先ず、Ｃ型肝炎患者血漿５０μｌに６Ｍの
ＧＴＣ液（６Ｍグアニジンチオシアネート、３７．５mM
クエン酸ナトリウム、０．７５％ザルコシル、０．２Ｍ
メルカプトエタノール）２００μｌと酵母のｔＲＮＡ
（１０mg／ml）１μｌを加え撹拌する。さらに３Ｍ酢酸
ナトリウム（ｐＨ５．２）２０μｌ、ＴＥ飽和フェノー
ル（ｐＨ７．５〜８．０）３００μｌ、クロロホルム／
イソアミルアルコール（４９：１）７０μｌとすばやく
混ぜ、１０秒間撹拌した後、氷中に１５分静置する。遠
心機で 15000 rpm、２０分間４℃で遠心する。水溶液層
をとりイソプロピルアルコールを等量加え、−２０℃に
１時間以上置く。これを 15000 rpm、２０分間４℃で遠
心し、沈殿させる。沈殿物を４Ｍ ＧＴＣ（６Ｍ ＧＴ
Ｃを滅菌水で希釈したもの）１００μｌで溶解し、等量
のイソプロパノールと混合し−２０℃に１時間以上静置
する。15000 rpm 、２０分間、４℃で遠心し沈殿物を得
る。７０％エタノール１mlで洗浄後、室温で風乾し、１
０μｌの滅菌水に溶解しＲＮＡとして使用した。
ＧＴＣ液（６Ｍグアニジンチオシアネート、３７．５mM
クエン酸ナトリウム、０．７５％ザルコシル、０．２Ｍ
メルカプトエタノール）２００μｌと酵母のｔＲＮＡ
（１０mg／ml）１μｌを加え撹拌する。さらに３Ｍ酢酸
ナトリウム（ｐＨ５．２）２０μｌ、ＴＥ飽和フェノー
ル（ｐＨ７．５〜８．０）３００μｌ、クロロホルム／
イソアミルアルコール（４９：１）７０μｌとすばやく
混ぜ、１０秒間撹拌した後、氷中に１５分静置する。遠
心機で 15000 rpm、２０分間４℃で遠心する。水溶液層
をとりイソプロピルアルコールを等量加え、−２０℃に
１時間以上置く。これを 15000 rpm、２０分間４℃で遠
心し、沈殿させる。沈殿物を４Ｍ ＧＴＣ（６Ｍ ＧＴ
Ｃを滅菌水で希釈したもの）１００μｌで溶解し、等量
のイソプロパノールと混合し−２０℃に１時間以上静置
する。15000 rpm 、２０分間、４℃で遠心し沈殿物を得
る。７０％エタノール１mlで洗浄後、室温で風乾し、１
０μｌの滅菌水に溶解しＲＮＡとして使用した。
【００４２】ｃＤＮＡ合成はＲＮＡ１０μｌをシリコン
処理チューブ（０．６ml）に分注した後、７０℃３分間
加熱し、氷上で急冷する。次にＲＮａｓｅインヒビター
（宝酒造）１μｌ（５０単位／μｌ）、ｄＮＴＰ（各２
０mM）２μｌ、１０×ＰＣＲバッファー（0.1M Tris-HC
l 、pH 8.3、0.5M KCl）２μｌ、０．１Ｍ ＭｇＣｌ2
０．５μｌ、４０mM ＤＴＴ（ジチオスレイトール）
０．５μｌ、アンチセンスプライマー（オリゴｄＡプラ
イマー）７５ｐ mole 、逆転写酵素（生化学工業）０．
２μｌ（２７単位／μｌ）を加え、滅菌水で計２０μｌ
に合わせる。４２℃で２時間反応を行い、９４℃で５分
間加熱し、酵素を失活させた。このｃＤＮＡを用いてＰ
ＣＲを行った。ＰＣＲはバンドを検出するための感度と
特異性を上げるために、２ステップ法を用いた。すなわ
ち、２種のプライマーで１回目のＰＣＲをかける（1st
step PCR）。次にそのＰＣＲ産物の内側に存在するプラ
イマー２種を用い２回目のＰＣＲをかける（2nd step P
CR）方法である。
処理チューブ（０．６ml）に分注した後、７０℃３分間
加熱し、氷上で急冷する。次にＲＮａｓｅインヒビター
（宝酒造）１μｌ（５０単位／μｌ）、ｄＮＴＰ（各２
０mM）２μｌ、１０×ＰＣＲバッファー（0.1M Tris-HC
l 、pH 8.3、0.5M KCl）２μｌ、０．１Ｍ ＭｇＣｌ2
０．５μｌ、４０mM ＤＴＴ（ジチオスレイトール）
０．５μｌ、アンチセンスプライマー（オリゴｄＡプラ
イマー）７５ｐ mole 、逆転写酵素（生化学工業）０．
２μｌ（２７単位／μｌ）を加え、滅菌水で計２０μｌ
に合わせる。４２℃で２時間反応を行い、９４℃で５分
間加熱し、酵素を失活させた。このｃＤＮＡを用いてＰ
ＣＲを行った。ＰＣＲはバンドを検出するための感度と
特異性を上げるために、２ステップ法を用いた。すなわ
ち、２種のプライマーで１回目のＰＣＲをかける（1st
step PCR）。次にそのＰＣＲ産物の内側に存在するプラ
イマー２種を用い２回目のＰＣＲをかける（2nd step P
CR）方法である。
【００４３】５′非翻訳領域（Ａ）、構造遺伝子コア領
域（Ｂ）、構造遺伝子エンベロープ領域（Ｃ）、非構造
遺伝子ＮＳ１／ＮＳ２領域（Ｄ）の４つの領域について
プライマーを合成し、ＰＣＲに使用した。以下に２ステ
ップ法で使用したＰＣＲプライマーを記述する。
域（Ｂ）、構造遺伝子エンベロープ領域（Ｃ）、非構造
遺伝子ＮＳ１／ＮＳ２領域（Ｄ）の４つの領域について
プライマーを合成し、ＰＣＲに使用した。以下に２ステ
ップ法で使用したＰＣＲプライマーを記述する。
【００４４】５′非翻訳領域（Ａ）はｃｏｒｅＩ（後述
の実施例２参照）の塩基配列を参考とした。１st ＰＣ
Ｒはｋｋ３０：５′−ＡＴＣＡＣＴＣＣＣＣＴＧＴＧＡ
ＧＧＡＡＣ−３′とｋｋ２９：５′−ＣＣＴＣＣＡＣＣ
ＡＡＣＧＡＴＣＴＧＡＣＣ−３′を使用し、２nd ＰＣ
Ｒはｋｋ３０とｋｋ３１：５′−ＣＣＧＧＡＡＡＣＴＴ
ＡＡＣＧＴＣＴＴＧＴ−３′を用いた。
の実施例２参照）の塩基配列を参考とした。１st ＰＣ
Ｒはｋｋ３０：５′−ＡＴＣＡＣＴＣＣＣＣＴＧＴＧＡ
ＧＧＡＡＣ−３′とｋｋ２９：５′−ＣＣＴＣＣＡＣＣ
ＡＡＣＧＡＴＣＴＧＡＣＣ−３′を使用し、２nd ＰＣ
Ｒはｋｋ３０とｋｋ３１：５′−ＣＣＧＧＡＡＡＣＴＴ
ＡＡＣＧＴＣＴＴＧＴ−３′を用いた。
【００４５】構造遺伝子コア領域（Ｂ）はｃｏｒｅＩと
ＥＮ２（特願平２−４１３８４４号のクローンＣ１０−
Ｅ１２）の塩基配列を参考とした。１st ＰＣＲはｋｋ
３４：５′−ＴＧＡＴＡＧＧＧＴＧＣＴＴＧＣＧＡＧＴ
Ｇ−３′とＡ２：５′−ＧＣＴＧＣＣＴＣＡＴＡＣＡＣ
ＡＡＴＡＣＴ−３′を用い、２nd ＰＣＲはｋｋ３６：
５′−ＡＧＡＣＣＧＴＧＣＡＣＣＡＴＧＡＧＣＡＣ−
３′とＡ１：５′−ＣＡＧＴＣＧＴＴＣＧＴＧＡＣＡＴ
ＧＧＴＡ−３′を使用した。
ＥＮ２（特願平２−４１３８４４号のクローンＣ１０−
Ｅ１２）の塩基配列を参考とした。１st ＰＣＲはｋｋ
３４：５′−ＴＧＡＴＡＧＧＧＴＧＣＴＴＧＣＧＡＧＴ
Ｇ−３′とＡ２：５′−ＧＣＴＧＣＣＴＣＡＴＡＣＡＣ
ＡＡＴＡＣＴ−３′を用い、２nd ＰＣＲはｋｋ３６：
５′−ＡＧＡＣＣＧＴＧＣＡＣＣＡＴＧＡＧＣＡＣ−
３′とＡ１：５′−ＣＡＧＴＣＧＴＴＣＧＴＧＡＣＡＴ
ＧＧＴＡ−３′を使用した。
【００４６】構造遺伝子エンベロープ領域（Ｃ）はＥＮ
２と今回得られた非構造遺伝子ＮＳ１／ＮＳ２領域を含
むクローンＤの塩基配列を参考とした。１st ＰＣＲで
はＳ１：５′−ＧＴＧＡＡＣＴＡＴＧＣＡＡＣＡＧＧＧ
ＡＡ−３′とＡ１１：５′−ＧＴＣＴＣＡＴＴＣＴＣＴ
ＣＣＣＣＡＴＴＴ−３′を、２nd ＰＣＲはＳ２：５′
−ＧＴＴＧＣＴＣＴＴＴＣＴＣＴＡＴＣＴＴＣ−３′と
Ａ１０：５′−ＡＡＧＣＡＡＴＡＣＡＣＴＧＧＡＣＣＡ
ＣＡ−３′を使用した。
２と今回得られた非構造遺伝子ＮＳ１／ＮＳ２領域を含
むクローンＤの塩基配列を参考とした。１st ＰＣＲで
はＳ１：５′−ＧＴＧＡＡＣＴＡＴＧＣＡＡＣＡＧＧＧ
ＡＡ−３′とＡ１１：５′−ＧＴＣＴＣＡＴＴＣＴＣＴ
ＣＣＣＣＡＴＴＴ−３′を、２nd ＰＣＲはＳ２：５′
−ＧＴＴＧＣＴＣＴＴＴＣＴＣＴＡＴＣＴＴＣ−３′と
Ａ１０：５′−ＡＡＧＣＡＡＴＡＣＡＣＴＧＧＡＣＣＡ
ＣＡ−３′を使用した。
【００４７】非構造遺伝子ＮＳ１／ＮＳ２領域（Ｄ）
は、ＥＮ３（特願平２−４１３８４４号のクローンＣ１
０−Ｅ１３）と３ＮＢ１（特願平２−３３９５８９号の
クローンＣ１０−２１）を参考とした。１st ＰＣＲは
ｋｋ６１：５′−ＣＡＡＴＧＧＣＡＧＣＴＧＧＣＡＣＡ
ＴＣＡ−３′とｋｋ４９：５′−ＡＣＣＡＣＣＴＧＡＡ
ＣＣＴＣＣＣＣＣＴＣ−３′を２nd ＰＣＲは、ｋｋ６
２：５′−ＧＡＧＣＧＣＡＴＧＧＣＣＡＧＣＴＧＣＣＧ
−３′とｋｋ５０：５′−ＴＴＧＴＣＧＣＧＧＣＣＣＧ
ＴＴＡＧＧＣＴ−３′を使用した。
は、ＥＮ３（特願平２−４１３８４４号のクローンＣ１
０−Ｅ１３）と３ＮＢ１（特願平２−３３９５８９号の
クローンＣ１０−２１）を参考とした。１st ＰＣＲは
ｋｋ６１：５′−ＣＡＡＴＧＧＣＡＧＣＴＧＧＣＡＣＡ
ＴＣＡ−３′とｋｋ４９：５′−ＡＣＣＡＣＣＴＧＡＡ
ＣＣＴＣＣＣＣＣＴＣ−３′を２nd ＰＣＲは、ｋｋ６
２：５′−ＧＡＧＣＧＣＡＴＧＧＣＣＡＧＣＴＧＣＣＧ
−３′とｋｋ５０：５′−ＴＴＧＴＣＧＣＧＧＣＣＣＧ
ＴＴＡＧＧＣＴ−３′を使用した。
【００４８】ＰＣＲの条件はｃＤＮＡ合成反応液２０μ
ｌに１０×ＰＣＲバッファー８μｌ、１st step プライ
マー２種（各７５p mole）、２mM dNTP ８μｌを加え、
滅菌水で１００μｌにする。９４℃で１０分間加熱し、
Ampli Taq（パーキンエルマ・シータス）を１μｌ（５
単位／μｌ）加え混合した後、ミネラルオイルを２滴重
層する。ＰＣＲ反応は、変性９４℃１分間、アニーリン
グ５５℃１分間、伸長７２℃２分間の条件で３０サイク
ル行った。次に１st ＰＣＲ反応液１０μｌに１０×Ｐ
ＣＲバッファー９μｌ、２nd step プライマー２種（各
７５pmole ）、２mM dNTP ９μｌを加え、滅菌水で１０
０μｌにする。９４℃で１０分間加熱し、Ampli Taq を
１μｌ加え、ミネラルオイルを入れて、先の条件で２nd
ＰＣＲを行う。反応後、反応液１０μｌをアガロース
電気泳動を行い、４つの領域に特異的なＤＮＡ断片を検
出した。
ｌに１０×ＰＣＲバッファー８μｌ、１st step プライ
マー２種（各７５p mole）、２mM dNTP ８μｌを加え、
滅菌水で１００μｌにする。９４℃で１０分間加熱し、
Ampli Taq（パーキンエルマ・シータス）を１μｌ（５
単位／μｌ）加え混合した後、ミネラルオイルを２滴重
層する。ＰＣＲ反応は、変性９４℃１分間、アニーリン
グ５５℃１分間、伸長７２℃２分間の条件で３０サイク
ル行った。次に１st ＰＣＲ反応液１０μｌに１０×Ｐ
ＣＲバッファー９μｌ、２nd step プライマー２種（各
７５pmole ）、２mM dNTP ９μｌを加え、滅菌水で１０
０μｌにする。９４℃で１０分間加熱し、Ampli Taq を
１μｌ加え、ミネラルオイルを入れて、先の条件で２nd
ＰＣＲを行う。反応後、反応液１０μｌをアガロース
電気泳動を行い、４つの領域に特異的なＤＮＡ断片を検
出した。
【００４９】ＰＣＲ産物（ＨＣＶ＃４のＤＮＡ断片）の
クローニングと塩基配列の決定 ＨＣＶ（＃４）のＤＮＡ断片が検出されたＰＣＲ反応液
（９０μｌ）にKlenowfragment （宝酒造）１μｌ（２
単位／μｌ）を加え３７℃で１時間反応する。低融点ア
ガロース電気泳動により、ＤＮＡ断片を単離し、ＴＥ飽
和フェノールで２回抽出操作を行い、ＤＮＡ断片が溶解
している水層をエタノール沈殿した。
クローニングと塩基配列の決定 ＨＣＶ（＃４）のＤＮＡ断片が検出されたＰＣＲ反応液
（９０μｌ）にKlenowfragment （宝酒造）１μｌ（２
単位／μｌ）を加え３７℃で１時間反応する。低融点ア
ガロース電気泳動により、ＤＮＡ断片を単離し、ＴＥ飽
和フェノールで２回抽出操作を行い、ＤＮＡ断片が溶解
している水層をエタノール沈殿した。
【００５０】沈殿物に１０×キナーゼバッファー（0.5M
Tris-HCl pH 7.6、 0.1M MgCl2 、50mM DTT、１mMスペ
ルミジン、１mM EDTA pH 8.0）２μｌ、10mM ATP 1μ
ｌ、Ｔ4 キナーゼ（宝酒造）１μｌ（１０単位／μｌ）
を加え滅菌水で２０μｌとし、３７℃１時間反応し、
５′末端のリン酸化を行う。６８℃１０分間加熱し、キ
ナーゼを失活させた後 pUC119 ［Vieira, J.とMessing,
J., Methods in Enzymology, 153, 3-11(1987) ］との
連結反応を行う。 pUC119 （１μｇ）は制限酵素反応液
２０μｌ（10mM Tris-HCl pH 8.0、7mM MgCl2 、20mM K
Cl、10単位のSmaI酵素（宝酒造））中で３７℃１時間反
応し、６８℃１０分間加熱した後、滅菌水８０μｌを加
え、ＳｍａＩクローニングベクターとする。リン酸化さ
れたＤＮＡ断片１０μｌとＳｍａＩベクター２μｌを１
０×バッファー（0.66M Tris-HCl pH7.6 、 50mM MgCl
2 、50mM DTT）２μｌ、10mM ATT 1μｌ、Ｔ4 リガーゼ
（宝酒造）１μｌ（350 単位／μｌ）、滅菌水４μｌを
加え、２０μｌとし、１６℃で一晩連結反応を行った。
Tris-HCl pH 7.6、 0.1M MgCl2 、50mM DTT、１mMスペ
ルミジン、１mM EDTA pH 8.0）２μｌ、10mM ATP 1μ
ｌ、Ｔ4 キナーゼ（宝酒造）１μｌ（１０単位／μｌ）
を加え滅菌水で２０μｌとし、３７℃１時間反応し、
５′末端のリン酸化を行う。６８℃１０分間加熱し、キ
ナーゼを失活させた後 pUC119 ［Vieira, J.とMessing,
J., Methods in Enzymology, 153, 3-11(1987) ］との
連結反応を行う。 pUC119 （１μｇ）は制限酵素反応液
２０μｌ（10mM Tris-HCl pH 8.0、7mM MgCl2 、20mM K
Cl、10単位のSmaI酵素（宝酒造））中で３７℃１時間反
応し、６８℃１０分間加熱した後、滅菌水８０μｌを加
え、ＳｍａＩクローニングベクターとする。リン酸化さ
れたＤＮＡ断片１０μｌとＳｍａＩベクター２μｌを１
０×バッファー（0.66M Tris-HCl pH7.6 、 50mM MgCl
2 、50mM DTT）２μｌ、10mM ATT 1μｌ、Ｔ4 リガーゼ
（宝酒造）１μｌ（350 単位／μｌ）、滅菌水４μｌを
加え、２０μｌとし、１６℃で一晩連結反応を行った。
【００５１】この反応液の１０μｌを用いて大腸菌ＪＭ
109 株を形質転換した。形質転換に用いる感受性大腸菌
株は、塩化カルシウム法［Mandel, M.とHiga, A., J. M
ol.Biol. 53, 159-162 (1970)］により作られる。
109 株を形質転換した。形質転換に用いる感受性大腸菌
株は、塩化カルシウム法［Mandel, M.とHiga, A., J. M
ol.Biol. 53, 159-162 (1970)］により作られる。
【００５２】形質転換大腸菌を２％ Ｘ−Ｇａｌ（５−
ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラク
トピラノシド）５０μｌと100mM IPTG（イソプロピル−
β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）が塗布されたＬＢ−
Ａｍｐプレート［１％トリプシン、０．５％酵母エキ
ス、０．５％ＮａＣｌ、１．５％寒天、アンピシリン
（２５μｇ／ml）］上で３７℃一晩培養した。プレート
上に生じたコロニーの中で白色を呈するコロニーを一白
金耳取り、２５μｇ／mlアンピシリンを含むＬＢ培地
（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ Ｎ
ａＣｌ）に移し、一晩３７℃で振盪培養した。１．５ml
の菌培養液を遠心して集菌し、プラスミドＤＮＡのミニ
プレパレーションをアルカリ法（Maniatisら、Molecula
r Cloning ：ALaboratory Manual, 1982 ）により行っ
た。得られたプラスミドＤＮＡ１μｇを反応液３０μｌ
（100mM Tris-HCl pH 7.5 、50mM NaCl 、7mM MgCl2 、
10単位のEcoRI （宝酒造）およびHind III（宝酒造）酵
素）中で３７℃１時間消化し、アガロース電気泳動を行
って挿入ＤＮＡ断片の大きさを計算する。４つの領域の
ＤＮＡ断片の大きさは５′非翻訳領域（Ａ）では約４０
０ｂ、構造遺伝子のコア（Ｂ）は約６００ｂ、エンベロ
ープ（Ｃ）は約１ｋｂ、非構造遺伝子ＮＳ１／ＮＳ２
（Ｄ）では約１．８ｋｂが確認された。
ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラク
トピラノシド）５０μｌと100mM IPTG（イソプロピル−
β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）が塗布されたＬＢ−
Ａｍｐプレート［１％トリプシン、０．５％酵母エキ
ス、０．５％ＮａＣｌ、１．５％寒天、アンピシリン
（２５μｇ／ml）］上で３７℃一晩培養した。プレート
上に生じたコロニーの中で白色を呈するコロニーを一白
金耳取り、２５μｇ／mlアンピシリンを含むＬＢ培地
（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ Ｎ
ａＣｌ）に移し、一晩３７℃で振盪培養した。１．５ml
の菌培養液を遠心して集菌し、プラスミドＤＮＡのミニ
プレパレーションをアルカリ法（Maniatisら、Molecula
r Cloning ：ALaboratory Manual, 1982 ）により行っ
た。得られたプラスミドＤＮＡ１μｇを反応液３０μｌ
（100mM Tris-HCl pH 7.5 、50mM NaCl 、7mM MgCl2 、
10単位のEcoRI （宝酒造）およびHind III（宝酒造）酵
素）中で３７℃１時間消化し、アガロース電気泳動を行
って挿入ＤＮＡ断片の大きさを計算する。４つの領域の
ＤＮＡ断片の大きさは５′非翻訳領域（Ａ）では約４０
０ｂ、構造遺伝子のコア（Ｂ）は約６００ｂ、エンベロ
ープ（Ｃ）は約１ｋｂ、非構造遺伝子ＮＳ１／ＮＳ２
（Ｄ）では約１．８ｋｂが確認された。
【００５３】次に得られた４種類の挿入ＤＮＡ断片を、
シークエンス用ベクターであるＭ１３ファージのｍｐ１
８およびｍｐ１９［Messing, J., Methods in Enzymolo
gy,101, 20-78(1983) ］あるいは pUC118 および pUC11
9 ［Vieira, J.とMessing,J., Methods in Enzymology,
153, 3-11(1987)］にクローニングし、Sangerらのジ
デオキシ鎖終止法［Sanger, F. Science, 214, 1205-1
210(1981) ］を用い塩基配列を決定した。
シークエンス用ベクターであるＭ１３ファージのｍｐ１
８およびｍｐ１９［Messing, J., Methods in Enzymolo
gy,101, 20-78(1983) ］あるいは pUC118 および pUC11
9 ［Vieira, J.とMessing,J., Methods in Enzymology,
153, 3-11(1987)］にクローニングし、Sangerらのジ
デオキシ鎖終止法［Sanger, F. Science, 214, 1205-1
210(1981) ］を用い塩基配列を決定した。
【００５４】クローン化ＤＮＡの継ぎ込み 決定された塩基配列から予想される制限酵素部位を用い
て５′非翻訳領域（Ａ）から非構造蛋白ＮＳ１／ＮＳ２
領域（Ｄ）までを継ぎ込んだクローン（ＡＢＣＤ）を構
築した。
て５′非翻訳領域（Ａ）から非構造蛋白ＮＳ１／ＮＳ２
領域（Ｄ）までを継ぎ込んだクローン（ＡＢＣＤ）を構
築した。
【００５５】ｉ）５′非翻訳領域（Ａ）と構造蛋白質コ
ア領域（Ｂ）の継ぎ込み クローンＡとクローンＢの重複する領域に存在するＡａ
ｔII部位を利用する。クローンＡの１μｇＤＮＡを、反
応液３０μｌ［10mM Tris-HCl pH 7.5、7mMMgCl2 、6
0mM KCl、10単位のEcoRＩ（宝酒造）と５単位のＡａｔI
I（TOYOBO）酵素］中で、３７℃１時間消化し、低融点
アガロース電気泳動により約４００ｂのＤＮＡ断片を精
製する。クローンＢの１μｇＤＮＡもEcoRＩをHind III
（宝酒造）に変えた同様の反応組成で３７℃１時間消化
し、電気泳動により約６００ｂのＤＮＡ断片を精製す
る。 pUC119 １μｇを反応液２０μｌ［100mM Tris-HCl
pH7.5 、 50mM NaCl、7mM MgCl2 、10単位のEcoRＩとH
ind III）中で３７℃１時間反応し、６８℃１０分間熱
処理した後、滅菌水８０μｌを加え、EcoRＩ， HindIII
クローニングベクターとする。
ア領域（Ｂ）の継ぎ込み クローンＡとクローンＢの重複する領域に存在するＡａ
ｔII部位を利用する。クローンＡの１μｇＤＮＡを、反
応液３０μｌ［10mM Tris-HCl pH 7.5、7mMMgCl2 、6
0mM KCl、10単位のEcoRＩ（宝酒造）と５単位のＡａｔI
I（TOYOBO）酵素］中で、３７℃１時間消化し、低融点
アガロース電気泳動により約４００ｂのＤＮＡ断片を精
製する。クローンＢの１μｇＤＮＡもEcoRＩをHind III
（宝酒造）に変えた同様の反応組成で３７℃１時間消化
し、電気泳動により約６００ｂのＤＮＡ断片を精製す
る。 pUC119 １μｇを反応液２０μｌ［100mM Tris-HCl
pH7.5 、 50mM NaCl、7mM MgCl2 、10単位のEcoRＩとH
ind III）中で３７℃１時間反応し、６８℃１０分間熱
処理した後、滅菌水８０μｌを加え、EcoRＩ， HindIII
クローニングベクターとする。
【００５６】それぞれ精製された断片と、EcoRＩ−Hind
IIIベクター２μｌを１０×バッファー（0.66M Tris-H
Cl pH 7.6 、 50mM MgCl2 、50mM DTT）２μｌ、10mM A
TP 1μｌ、Ｔ4 リガーゼ１μｌ、滅菌水を加えて２０μ
ｌとし、１６℃で一晩連結反応を行った。この反応液１
０μｌで大腸菌ＪＭ109 株を形質転換した。ＸＧａｌプ
レート上で白色を示す形質転換体を２５μｇ／mlアンピ
シリンを含むＬＢ培地で一晩３７℃で振盪培養した。常
法に従いミニプレパレーションを行い得られたプラスミ
ドＤＮＡをEcoRＩとHind IIIで二重消化し、挿入ＤＮＡ
断片が約１ｋｂの組換えプラスミド（クローンＡＢ）を
得た。
IIIベクター２μｌを１０×バッファー（0.66M Tris-H
Cl pH 7.6 、 50mM MgCl2 、50mM DTT）２μｌ、10mM A
TP 1μｌ、Ｔ4 リガーゼ１μｌ、滅菌水を加えて２０μ
ｌとし、１６℃で一晩連結反応を行った。この反応液１
０μｌで大腸菌ＪＭ109 株を形質転換した。ＸＧａｌプ
レート上で白色を示す形質転換体を２５μｇ／mlアンピ
シリンを含むＬＢ培地で一晩３７℃で振盪培養した。常
法に従いミニプレパレーションを行い得られたプラスミ
ドＤＮＡをEcoRＩとHind IIIで二重消化し、挿入ＤＮＡ
断片が約１ｋｂの組換えプラスミド（クローンＡＢ）を
得た。
【００５７】ii）非翻訳領域（Ａ）から構造蛋白質エン
ベロープ領域（Ｃ）の継ぎ込み クローンＡＢとクローンＣの重複領域に存在するＦｓｐ
Ｉ部位を利用する。
ベロープ領域（Ｃ）の継ぎ込み クローンＡＢとクローンＣの重複領域に存在するＦｓｐ
Ｉ部位を利用する。
【００５８】クローンＡＢ１μｇを反応液２０μｌ［50
mM酢酸カリウム、20mM Tris-acetate pH 7.9、 10mM 酢
酸マグネシウム、５単位のＦｓｐＩ（ＮＥＢ）酵素］で
３７℃１時間反応後、１０×EcoRＩバッファー（1M Tri
s-HCl pH 7.5、500mM NaCl、70mM MgCl2 ）を２μｌ添
加し、EcoRＩ酵素１μｌを加えさらに３７℃で１時間反
応する。低融点アガロース電気泳動で約１ｋｂのＤＮＡ
断片を精製する。クローンＣも同様にＦｓｐＩ消化後、
EcoRＩの代りにHind IIIを使用して消化反応を行い、約
９００ｂのＤＮＡ断片を精製する。それぞれの断片と、
EcoRＩ-HindIIIベクター２μｌを用い上述の連結反応を
行い、ＪＭ109 株を形質転換した。形質転換体を培養
し、プラスミドＤＮＡを精製し、EcoRＩとHind IIIで消
化反応した後、電気泳動で１．９ｋｂ断片を含むクロー
ンＡＢＣ組換えプラスミドを得た。
mM酢酸カリウム、20mM Tris-acetate pH 7.9、 10mM 酢
酸マグネシウム、５単位のＦｓｐＩ（ＮＥＢ）酵素］で
３７℃１時間反応後、１０×EcoRＩバッファー（1M Tri
s-HCl pH 7.5、500mM NaCl、70mM MgCl2 ）を２μｌ添
加し、EcoRＩ酵素１μｌを加えさらに３７℃で１時間反
応する。低融点アガロース電気泳動で約１ｋｂのＤＮＡ
断片を精製する。クローンＣも同様にＦｓｐＩ消化後、
EcoRＩの代りにHind IIIを使用して消化反応を行い、約
９００ｂのＤＮＡ断片を精製する。それぞれの断片と、
EcoRＩ-HindIIIベクター２μｌを用い上述の連結反応を
行い、ＪＭ109 株を形質転換した。形質転換体を培養
し、プラスミドＤＮＡを精製し、EcoRＩとHind IIIで消
化反応した後、電気泳動で１．９ｋｂ断片を含むクロー
ンＡＢＣ組換えプラスミドを得た。
【００５９】iii ）非翻訳領域（Ａ）から構造蛋白質Ｎ
Ｓ１の継ぎ込み クローンＡＢＣとクローンＤの重なり合う領域の中でＳ
ｔｕＩ部位を利用し、クローンＤの内部にあるＳａｃＩ
部位と併用する。
Ｓ１の継ぎ込み クローンＡＢＣとクローンＤの重なり合う領域の中でＳ
ｔｕＩ部位を利用し、クローンＤの内部にあるＳａｃＩ
部位と併用する。
【００６０】クローンＡＢＣ１μｇは、ＥｃｏＲＩとＳ
ｔｕＩ（宝酒造）を用い１×ＥｃｏＲＩバッファー中で
消化反応し、電気泳動により約１．８kb ＤＮＡ断片を
精製する。一方、クローンＤ１μｇは、ＳｔｕＩとＳａ
ｃＩ（宝酒造）を１×ＥｃｏＲＩバッファー中で同様に
反応し、約５００ｂのＤＮＡ断片を精製する。ｐＵＣ11
9 １μｇも１×ＥｃｏＲＩバッファー中でＥｃｏＲＩと
ＳａｃＩを３７℃１時間反応した後、６８℃１０分間熱
処理し、滅菌水８０μｌを加えＥｃｏＲＩ−ＳａｃＩク
ローニングベクターとする。精製断片とクローニングベ
クターを上述の方法で連結反応を行い形質転換体からプ
ラスミドＤＮＡを調製する。ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄ III
で消化反応を行い、約２．３ｋｂの挿入ＤＮＡが検出さ
れるクローンを得た。
ｔｕＩ（宝酒造）を用い１×ＥｃｏＲＩバッファー中で
消化反応し、電気泳動により約１．８kb ＤＮＡ断片を
精製する。一方、クローンＤ１μｇは、ＳｔｕＩとＳａ
ｃＩ（宝酒造）を１×ＥｃｏＲＩバッファー中で同様に
反応し、約５００ｂのＤＮＡ断片を精製する。ｐＵＣ11
9 １μｇも１×ＥｃｏＲＩバッファー中でＥｃｏＲＩと
ＳａｃＩを３７℃１時間反応した後、６８℃１０分間熱
処理し、滅菌水８０μｌを加えＥｃｏＲＩ−ＳａｃＩク
ローニングベクターとする。精製断片とクローニングベ
クターを上述の方法で連結反応を行い形質転換体からプ
ラスミドＤＮＡを調製する。ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄ III
で消化反応を行い、約２．３ｋｂの挿入ＤＮＡが検出さ
れるクローンを得た。
【００６１】iv）５′非翻訳領域（Ａ）から非構造蛋白
質ＮＳ１／ＮＳ２（Ｄ）までの継ぎ込み iii) で得られたクローンをＳａｃＩとＨｉｎｄIII で
二重消化し、大きい方のＤＮＡ断片を精製する。クロー
ンＤをＳａｃＩとＨｉｎｄ IIIで二重消化し、約１．２
ｋｂのＤＮＡ断片を精製する。それぞれの精製された断
片を上述の連結反応を行い、ＪＭ109 株に形質転換す
る。形質転換体を培養し、常法によりプラスミドＤＮＡ
を調製し、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄ IIIを用いて二重消化
した後、約３．５ｋｂのＤＮＡ断片を生じるクローンＡ
ＢＣＤ（ＣＰ−４）を得た。
質ＮＳ１／ＮＳ２（Ｄ）までの継ぎ込み iii) で得られたクローンをＳａｃＩとＨｉｎｄIII で
二重消化し、大きい方のＤＮＡ断片を精製する。クロー
ンＤをＳａｃＩとＨｉｎｄ IIIで二重消化し、約１．２
ｋｂのＤＮＡ断片を精製する。それぞれの精製された断
片を上述の連結反応を行い、ＪＭ109 株に形質転換す
る。形質転換体を培養し、常法によりプラスミドＤＮＡ
を調製し、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄ IIIを用いて二重消化
した後、約３．５ｋｂのＤＮＡ断片を生じるクローンＡ
ＢＣＤ（ＣＰ−４）を得た。
【００６２】このプラスミドは大腸菌ＪＭ107 株に移入
され、形質転換体として微工研菌寄第１２７８６号とし
て平成４年２月２４日付で寄託されている。
され、形質転換体として微工研菌寄第１２７８６号とし
て平成４年２月２４日付で寄託されている。
【００６３】ワクシニアウイルス用の組換えプラスミド
の構築 ＨＣＶ（＃４）のＮＳ１領域の遺伝子をワクシニアウイ
ルスのヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子内に組み込むため
に用いる組換えプラスミドを以下の方法で作製した。
の構築 ＨＣＶ（＃４）のＮＳ１領域の遺伝子をワクシニアウイ
ルスのヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子内に組み込むため
に用いる組換えプラスミドを以下の方法で作製した。
【００６４】得られたクローンＣＰ−４のＤＮＡを利用
し、プライマー５′−ＡＧＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡＴＣＣ
ＣＡＣＡＡＧＣＣ−３′と５′−ＣＴＡＴＴＡＣＡＴＧ
ＧＣＧＴＡＴＧＣＴＣＧ−３′を用いて、上述の条件で
ＰＣＲを行いＮＳ１領域の遺伝子約１．４ｋｂのＤＮＡ
断片を増幅する。高温濃度緩衝液（50mM Tris-HCl pH7.
9 、 10mM MgCl2 、100mM NaCl）中でＰｓｔＩにて消化
し、アガロース電気泳動により単離し１．４ｋｂのＤＮ
Ａ断片を精製した。クローニングベクターｐＵＣ119 を
反応液２０μｌ（10mM Tris-HCl pH 7.5、 10mM MgC
l2 、20mM KCl）中でＳｍａＩ消化し、１Ｍ ＫＣｌを
２μｌとＰｓｔＩを加えてさらに二重消化する。電気泳
動を行い、３．１ｋｂのベクター断片を精製した。両方
のＤＮＡ断片を連結する反応を行い、ｐＵＣ−ＮＳ１を
得た。
し、プライマー５′−ＡＧＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡＴＣＣ
ＣＡＣＡＡＧＣＣ−３′と５′−ＣＴＡＴＴＡＣＡＴＧ
ＧＣＧＴＡＴＧＣＴＣＧ−３′を用いて、上述の条件で
ＰＣＲを行いＮＳ１領域の遺伝子約１．４ｋｂのＤＮＡ
断片を増幅する。高温濃度緩衝液（50mM Tris-HCl pH7.
9 、 10mM MgCl2 、100mM NaCl）中でＰｓｔＩにて消化
し、アガロース電気泳動により単離し１．４ｋｂのＤＮ
Ａ断片を精製した。クローニングベクターｐＵＣ119 を
反応液２０μｌ（10mM Tris-HCl pH 7.5、 10mM MgC
l2 、20mM KCl）中でＳｍａＩ消化し、１Ｍ ＫＣｌを
２μｌとＰｓｔＩを加えてさらに二重消化する。電気泳
動を行い、３．１ｋｂのベクター断片を精製した。両方
のＤＮＡ断片を連結する反応を行い、ｐＵＣ−ＮＳ１を
得た。
【００６５】ｐＵＣ−ＮＳ１を、反応液２０μｌ（17.5
mM Tris-HCl pH 7.5、 17.5mM MgCl2 、50mM NaCl ）中
でＨｉｎｄ III消化し、６８℃で１０分間熱処理し、酵
素を不活化後、滅菌水２８μｌと１ｍＭ ｄＮＴＰ（各
１ｍＭ ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ）１
μｌとＫｌｅｎｏｗ断片酵素を反応させ、末端を平滑に
した。６８℃１０分間の熱処理の後、1M Tris-HCl(pH
7.5) を５μｌと、ＥｃｏＲＩをそれぞれ加え３７℃で
消化反応を行った。アガロース電気泳動により１．４ｋ
ｂのＤＮＡ断片を精製した。また組換え用プラスミドｐ
ＳＦＢ４（S. Funahashiら、J. Virology, 65(10), 55
84〜5588(1991)）を反応液（10mM Tris-HCl pH 7.5、 1
0mM MgCl2 、20mM KCl）中でＥｃｏＲＩとＳｍａＩの二
重消化を行い、ベクター断片を精製した。両者をＴ４リ
ガーゼにより連結し、大腸菌ＪＭ107 に形質転換した
後、形質転換体からアルカリ法によりプラスミドを回収
した。制限酵素による分析を行い、ＮＳ１領域が挿入さ
れているプラスミドを確認しこれをｐＳＦ・ＮＳ１と命
名した。
mM Tris-HCl pH 7.5、 17.5mM MgCl2 、50mM NaCl ）中
でＨｉｎｄ III消化し、６８℃で１０分間熱処理し、酵
素を不活化後、滅菌水２８μｌと１ｍＭ ｄＮＴＰ（各
１ｍＭ ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ）１
μｌとＫｌｅｎｏｗ断片酵素を反応させ、末端を平滑に
した。６８℃１０分間の熱処理の後、1M Tris-HCl(pH
7.5) を５μｌと、ＥｃｏＲＩをそれぞれ加え３７℃で
消化反応を行った。アガロース電気泳動により１．４ｋ
ｂのＤＮＡ断片を精製した。また組換え用プラスミドｐ
ＳＦＢ４（S. Funahashiら、J. Virology, 65(10), 55
84〜5588(1991)）を反応液（10mM Tris-HCl pH 7.5、 1
0mM MgCl2 、20mM KCl）中でＥｃｏＲＩとＳｍａＩの二
重消化を行い、ベクター断片を精製した。両者をＴ４リ
ガーゼにより連結し、大腸菌ＪＭ107 に形質転換した
後、形質転換体からアルカリ法によりプラスミドを回収
した。制限酵素による分析を行い、ＮＳ１領域が挿入さ
れているプラスミドを確認しこれをｐＳＦ・ＮＳ１と命
名した。
【００６６】組換えワクシニアウイルスの作製 （ａ）トランスフェクションに用いるＤＮＡの調製 ＤＩＡＧＥＮプラスミドキット（ＤＩＡＧＥＮ社製）を
用いて、２００mlの培養液で培養した大腸菌から１５０
μｇのプラスミドｐＳＦ・ＮＳ１を抽出した。このプラ
スミドをＣｓＣｌ密度勾配遠心法により精製した。すな
わち、プラスミドをｐ＝１．４７ｇ／mlのＣｓＣｌ液
（ＥｔＢｒ含有）に溶解し、クイックシールチューブ
（ベックマン社製、ウルトラクリアー、１３×５１mm）
に充填したものを、１０℃、55,000 rpmで１５時間遠心
した。（ＶＴ１ 65.2 ローター、ベックマン超遠心
機）。遠心後、closed circular プラスミドＤＮＡのバ
ンドを回収し、イソプロパノール抽出を３回行ないＥｔ
Ｂｒを除去した。続いて、エタノール沈殿により、精製
プラスミドを得た。
用いて、２００mlの培養液で培養した大腸菌から１５０
μｇのプラスミドｐＳＦ・ＮＳ１を抽出した。このプラ
スミドをＣｓＣｌ密度勾配遠心法により精製した。すな
わち、プラスミドをｐ＝１．４７ｇ／mlのＣｓＣｌ液
（ＥｔＢｒ含有）に溶解し、クイックシールチューブ
（ベックマン社製、ウルトラクリアー、１３×５１mm）
に充填したものを、１０℃、55,000 rpmで１５時間遠心
した。（ＶＴ１ 65.2 ローター、ベックマン超遠心
機）。遠心後、closed circular プラスミドＤＮＡのバ
ンドを回収し、イソプロパノール抽出を３回行ないＥｔ
Ｂｒを除去した。続いて、エタノール沈殿により、精製
プラスミドを得た。
【００６７】中塩濃度緩衝液中で上記の精製したｐＳＦ
・ＮＳ１をＨｉｎｄ IIIにより開裂した。この線状化し
た組換えベクターをトランスフェクション用に２５μｇ
用意した。
・ＮＳ１をＨｉｎｄ IIIにより開裂した。この線状化し
た組換えベクターをトランスフェクション用に２５μｇ
用意した。
【００６８】（ｂ）トランスフェクション 遺伝子の導入はＰｅｒｋｕｓらのエレクトロポレーショ
ン法［Marion E. Perkus、Keith Limbach 及び Enzo Pa
oletti、J. Virol, 63、3829−3836 (1988) ］に準じて
行った。すなわち、１７５cm2 のカルチャーボトルに単
層培養したウサギ腎臓由来細胞株ＲＫ１３細胞にワクシ
ニアウイルス・リスター株をm.o.i.5 で感染させ、３７
℃、５％ＣＯ2 下で１時間吸着させた後、トリプシンを
用いて感染細胞を回収した。回収した細胞をＨｅＢＳバ
ッファー（pH 7.05 ）で２回洗浄し、（ａ）でトランス
フェクション用に調製したＤＮＡ２５μｇと共に０．８
mlのＨｅＢＳバッファーに懸濁した。パルサーキュベッ
ト（バイオラッド社製）に細胞懸濁液を移し、この状態
で１０分間、氷上にて冷却した。この後、バイオラッド
ジーンパルサーで２００Ｖ（Capacitance 、９８０μ
Ｆ）のパルスを１回かけた。再度、氷上にて１０分間冷
却し、細胞を２０mlの１０％ ＦＣＳ−ＭＥＭに懸濁
し、１７５cm2 のカルチャーボトルで３７℃、５％ＣＯ
2 存在下にて培養した。２４時間後、この培養物の凍結
融解を３回繰り返し、ウイルスを回収した。
ン法［Marion E. Perkus、Keith Limbach 及び Enzo Pa
oletti、J. Virol, 63、3829−3836 (1988) ］に準じて
行った。すなわち、１７５cm2 のカルチャーボトルに単
層培養したウサギ腎臓由来細胞株ＲＫ１３細胞にワクシ
ニアウイルス・リスター株をm.o.i.5 で感染させ、３７
℃、５％ＣＯ2 下で１時間吸着させた後、トリプシンを
用いて感染細胞を回収した。回収した細胞をＨｅＢＳバ
ッファー（pH 7.05 ）で２回洗浄し、（ａ）でトランス
フェクション用に調製したＤＮＡ２５μｇと共に０．８
mlのＨｅＢＳバッファーに懸濁した。パルサーキュベッ
ト（バイオラッド社製）に細胞懸濁液を移し、この状態
で１０分間、氷上にて冷却した。この後、バイオラッド
ジーンパルサーで２００Ｖ（Capacitance 、９８０μ
Ｆ）のパルスを１回かけた。再度、氷上にて１０分間冷
却し、細胞を２０mlの１０％ ＦＣＳ−ＭＥＭに懸濁
し、１７５cm2 のカルチャーボトルで３７℃、５％ＣＯ
2 存在下にて培養した。２４時間後、この培養物の凍結
融解を３回繰り返し、ウイルスを回収した。
【００６９】回収したウイルスから組換えウイルスを赤
血球吸着試験（ＨＡ試験）によって選択した。試験の方
法は以下のとおりである。９cmシャーレに単層培養した
ＲＫ１３細胞に６００プラーク／シャーレになるように
ウイルスを接種し、２日間培養してプラークを形成させ
た。培養上清を除き、０．５％のニワトリ赤血球を添加
した。３７℃で１０分間インキュベートした後、プラー
クを観察し、赤血球を吸着しないプラーク（組換えウイ
ルス候補株）を得た。
血球吸着試験（ＨＡ試験）によって選択した。試験の方
法は以下のとおりである。９cmシャーレに単層培養した
ＲＫ１３細胞に６００プラーク／シャーレになるように
ウイルスを接種し、２日間培養してプラークを形成させ
た。培養上清を除き、０．５％のニワトリ赤血球を添加
した。３７℃で１０分間インキュベートした後、プラー
クを観察し、赤血球を吸着しないプラーク（組換えウイ
ルス候補株）を得た。
【００７０】次に、Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ１領域の遺
伝子をプローブとして、先に得られた組換えウイルス候
補株３４クローンのうち１０クローンのプラークハイブ
リダイゼーションを行い、候補株から、さらに遺伝子が
組込まれた組換えウイルスを選択した。まず、３cmシャ
ーレに単層培養したＲＫ−１３細胞に組換えウイルス候
補株を２０〜５０プラーク／シャーレになるように接種
し、２日間培養してプラークを形成させた。形成したプ
ラークの上にナイロンメンブラン（ハイボンドＮ、アマ
シャム社製）をのせてプラークをメンブラン上に移し、
０．５Ｎ ＮａＯＨにより５分間処理してＤＮＡを変性
させた後、1M Tris-HCl(pH 7.4) で中和し、さらに 1.5
M NaCl, 0.5M Tris-HCl(pH 7.4) で処理してＤＮＡをメ
ンブランに吸着させ、メンブランを風乾したのち、３０
５nmの紫外線を５分間照射してＤＮＡをメンブランに固
定した。ハイブリダイゼーションバッファーにこのメン
ブランを浸し、６５℃で１時間インキュベートした。さ
らに、ランダムプライムラベリング法を用いて32Ｐで標
識したＣ型肝炎ウイルスＮＳ１領域の遺伝子を加えたハ
イブリダイゼーションバッファーにメンブランを移し、
６５℃で一晩反応させ、プローブＤＮＡと組換えウイル
スＤＮＡをハイブリダイズさせた。１×ＳＳＣ、０．１
％ＳＤＳ、６５℃で１０分間ずつ２回洗浄し、−７０℃
でオートラジオグラフィーを行ない、陽性クローンを検
出した。
伝子をプローブとして、先に得られた組換えウイルス候
補株３４クローンのうち１０クローンのプラークハイブ
リダイゼーションを行い、候補株から、さらに遺伝子が
組込まれた組換えウイルスを選択した。まず、３cmシャ
ーレに単層培養したＲＫ−１３細胞に組換えウイルス候
補株を２０〜５０プラーク／シャーレになるように接種
し、２日間培養してプラークを形成させた。形成したプ
ラークの上にナイロンメンブラン（ハイボンドＮ、アマ
シャム社製）をのせてプラークをメンブラン上に移し、
０．５Ｎ ＮａＯＨにより５分間処理してＤＮＡを変性
させた後、1M Tris-HCl(pH 7.4) で中和し、さらに 1.5
M NaCl, 0.5M Tris-HCl(pH 7.4) で処理してＤＮＡをメ
ンブランに吸着させ、メンブランを風乾したのち、３０
５nmの紫外線を５分間照射してＤＮＡをメンブランに固
定した。ハイブリダイゼーションバッファーにこのメン
ブランを浸し、６５℃で１時間インキュベートした。さ
らに、ランダムプライムラベリング法を用いて32Ｐで標
識したＣ型肝炎ウイルスＮＳ１領域の遺伝子を加えたハ
イブリダイゼーションバッファーにメンブランを移し、
６５℃で一晩反応させ、プローブＤＮＡと組換えウイル
スＤＮＡをハイブリダイズさせた。１×ＳＳＣ、０．１
％ＳＤＳ、６５℃で１０分間ずつ２回洗浄し、−７０℃
でオートラジオグラフィーを行ない、陽性クローンを検
出した。
【００７１】この結果、８クローンが陽性であり、それ
ぞれクローンをｐＳＦ・ＮＳ１／ＲＬＶ，＃１，２，
３，５，６，７，９，１０と命名した。
ぞれクローンをｐＳＦ・ＮＳ１／ＲＬＶ，＃１，２，
３，５，６，７，９，１０と命名した。
【００７２】間接蛍光抗体法による発現の確認 単層培養したＲＫ−１３細胞を０．０５％トリプシン，
０．１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液で処理し単細胞にしたのちに
ＭＥＭ培養液（５％仔牛血清、０．２２％炭酸水素ナト
リウム）に５万個／mlになるように分散する。この細胞
溶液にワクシニア親株のリスター株及びｐＳＦ・ＮＳ１
／ＲＬＶをm.o.i.＝0.1 になるように別々に接種する。
ウイルスが接種された細胞を２０μｌ／穴で１２穴スラ
イドグラスにのせ３７℃、５％ＣＯ2 下で１晩培養す
る。培養したスライドグラスを蒸留水で１回洗浄し風乾
した後、−２０℃の５％アセトン、５０％メタノール混
液に１５分間漬けて固定化する。固定後風乾し、ＰＢＳ
（−）で５０倍に希釈した非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清を２
０μｌ／穴ずつのせて３７℃で４０分間反応させる。４
０分間の反応後ＰＢＳ（−）で３回洗浄し、２５０倍に
ＰＢＳ（−）で希釈した抗ヒトＩｇＧ・ＦＩＴＣ標識
（ヤギ）を２０μｌ／穴ずつのせてさらに３７℃で３０
分間反応させる。反応終了後ＰＢＳ（−）で３回洗浄し
蛍光顕微鏡で観察したところリスター株を感染させた細
胞には蛍光が認められなかったがｐＳＦ・ＮＳ１／ＲＬ
Ｖを感染させた細胞には強い特異蛍光が認められた（図
３）。
０．１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液で処理し単細胞にしたのちに
ＭＥＭ培養液（５％仔牛血清、０．２２％炭酸水素ナト
リウム）に５万個／mlになるように分散する。この細胞
溶液にワクシニア親株のリスター株及びｐＳＦ・ＮＳ１
／ＲＬＶをm.o.i.＝0.1 になるように別々に接種する。
ウイルスが接種された細胞を２０μｌ／穴で１２穴スラ
イドグラスにのせ３７℃、５％ＣＯ2 下で１晩培養す
る。培養したスライドグラスを蒸留水で１回洗浄し風乾
した後、−２０℃の５％アセトン、５０％メタノール混
液に１５分間漬けて固定化する。固定後風乾し、ＰＢＳ
（−）で５０倍に希釈した非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清を２
０μｌ／穴ずつのせて３７℃で４０分間反応させる。４
０分間の反応後ＰＢＳ（−）で３回洗浄し、２５０倍に
ＰＢＳ（−）で希釈した抗ヒトＩｇＧ・ＦＩＴＣ標識
（ヤギ）を２０μｌ／穴ずつのせてさらに３７℃で３０
分間反応させる。反応終了後ＰＢＳ（−）で３回洗浄し
蛍光顕微鏡で観察したところリスター株を感染させた細
胞には蛍光が認められなかったがｐＳＦ・ＮＳ１／ＲＬ
Ｖを感染させた細胞には強い特異蛍光が認められた（図
３）。
【００７３】実施例３ バキュロウイルスを用いたＨＣＶ（＃４）由来ＮＳ１遺
伝子の発現 （ａ）組換えウイルスの作製 ベクターの作製 トランスファーベクターｐＡｃＹＭ１（Matsuura, Y
ら、J. Gen. Virol.,68:1233〜1250, 1987）を反応液
（50mM Tris-HCl pH 7.5, 100mM NaCl, 7mM MgCl2）中
でＢａｍＨＩで完全消化し、等量のフェノール：クロロ
ホルムで抽出後、水溶液層をとり、エタノールを２倍量
加えて−８０℃で１時間置く。ｐＵＣ ＮＳ１を反応液
（100mM Tris-HCl pH 7.5, 50mM NaCl, 7mM MgCl2 ）で
ＰｓｔＩとＥｃｏＲＩで完全消化し、同様にフェノー
ル：クロロホルム抽出後エタノール沈殿した。15000 rp
m 、10分間、４℃で遠心し沈殿物を得る。それぞれの沈
殿物にＴ４ポリメラーゼを用いたブランティングキット
（宝酒造）のマニュアルに従ってＤＮＡ末端の平滑化を
行った。アガロース電気泳動により、ｐＡｃＹＭ１ベク
ターとＮＳ１遺伝子を精製し、連結反応を１６℃で一晩
行った。組み換えプラスミドの中でポリヘドリンプロモ
ーターを同方向へ挿入されたクローンｐＢａｃ・ＮＳ１
を得た。
伝子の発現 （ａ）組換えウイルスの作製 ベクターの作製 トランスファーベクターｐＡｃＹＭ１（Matsuura, Y
ら、J. Gen. Virol.,68:1233〜1250, 1987）を反応液
（50mM Tris-HCl pH 7.5, 100mM NaCl, 7mM MgCl2）中
でＢａｍＨＩで完全消化し、等量のフェノール：クロロ
ホルムで抽出後、水溶液層をとり、エタノールを２倍量
加えて−８０℃で１時間置く。ｐＵＣ ＮＳ１を反応液
（100mM Tris-HCl pH 7.5, 50mM NaCl, 7mM MgCl2 ）で
ＰｓｔＩとＥｃｏＲＩで完全消化し、同様にフェノー
ル：クロロホルム抽出後エタノール沈殿した。15000 rp
m 、10分間、４℃で遠心し沈殿物を得る。それぞれの沈
殿物にＴ４ポリメラーゼを用いたブランティングキット
（宝酒造）のマニュアルに従ってＤＮＡ末端の平滑化を
行った。アガロース電気泳動により、ｐＡｃＹＭ１ベク
ターとＮＳ１遺伝子を精製し、連結反応を１６℃で一晩
行った。組み換えプラスミドの中でポリヘドリンプロモ
ーターを同方向へ挿入されたクローンｐＢａｃ・ＮＳ１
を得た。
【００７４】トランスフェクション トランスフェクション緩衝液（20mMＨＥＰＥＳ，１mM
Ｎａ2 ＨＰＯ4 ，５mMＫＣｌ，１４０mM ＮａＣｌ，
１０mMグルコース，ｐＨ7.05）５７０μｌおよびバキュ
ロウイルスＤＮＡ１μｇを２．０mlのマイクロチューブ
に分注し、それにベクターｐＢａｃ・ＮＳ１ １２μｇ
を加え、最終的に蒸留水で９５０μｌにする。２．５Ｍ
ＣａＣｌ2 ５０μｌをチューブに軽く撹拌しながら少
しずつ滴下し、室温で３０分静置すると、ＤＮＡの沈殿
が生じる。この沈殿をマイクロピペットで軽くほぐし、
１×１０6 個の夜盗蛾由来の細胞（S.f.細胞）へ接種す
る。室温で１時間静置後、ＤＮＡ液を捨て、２．０mlの
メディウム（１０％ＦＣＳ添加 Grace′s medium, GIB
CO社）を加え、２７℃で３日間培養すると、感染した細
胞の核内にポリヘドリンが顕微鏡下で観察できる。
Ｎａ2 ＨＰＯ4 ，５mMＫＣｌ，１４０mM ＮａＣｌ，
１０mMグルコース，ｐＨ7.05）５７０μｌおよびバキュ
ロウイルスＤＮＡ１μｇを２．０mlのマイクロチューブ
に分注し、それにベクターｐＢａｃ・ＮＳ１ １２μｇ
を加え、最終的に蒸留水で９５０μｌにする。２．５Ｍ
ＣａＣｌ2 ５０μｌをチューブに軽く撹拌しながら少
しずつ滴下し、室温で３０分静置すると、ＤＮＡの沈殿
が生じる。この沈殿をマイクロピペットで軽くほぐし、
１×１０6 個の夜盗蛾由来の細胞（S.f.細胞）へ接種す
る。室温で１時間静置後、ＤＮＡ液を捨て、２．０mlの
メディウム（１０％ＦＣＳ添加 Grace′s medium, GIB
CO社）を加え、２７℃で３日間培養すると、感染した細
胞の核内にポリヘドリンが顕微鏡下で観察できる。
【００７５】組換えウイルスの分離 トランスフェクション後の培養上清から、プラークアッ
セイにより組換えウイルスを選択する。通常、トランス
フェクションして３日目の上清には、１０5 〜１０6 ｐ
ｆｕ／mlのウイルスが存在するので、デッシュ（３５m
m）あたり１００個のプラークが出るように希釈して接
種する。１〜1.5 ×１０6 個の細胞を３５mmのデッシュ
に用意し、適当に希釈したウイルス液を接種する。１時
間後、ウイルス液を捨て、重層寒天培地を２ml加える。
この寒天培地は、あらかじめ蒸留水で３％に溶かし滅菌
した低融点寒天をメディウムで１％に希釈したものであ
る。重層した培地が固まった後、１mlのメディウムをさ
らに重層する。２７℃で３〜４日間培養し、 neutral r
edを加えて染色し、プラークを判別する。親株は、白色
のプラークを形成するが、組換えウイルスは透明なプラ
ークを作る。多角体非産生の組換えウイルスと思われる
プラークをさらにプラークアッセイを繰り返して、純化
したクローンを得る。
セイにより組換えウイルスを選択する。通常、トランス
フェクションして３日目の上清には、１０5 〜１０6 ｐ
ｆｕ／mlのウイルスが存在するので、デッシュ（３５m
m）あたり１００個のプラークが出るように希釈して接
種する。１〜1.5 ×１０6 個の細胞を３５mmのデッシュ
に用意し、適当に希釈したウイルス液を接種する。１時
間後、ウイルス液を捨て、重層寒天培地を２ml加える。
この寒天培地は、あらかじめ蒸留水で３％に溶かし滅菌
した低融点寒天をメディウムで１％に希釈したものであ
る。重層した培地が固まった後、１mlのメディウムをさ
らに重層する。２７℃で３〜４日間培養し、 neutral r
edを加えて染色し、プラークを判別する。親株は、白色
のプラークを形成するが、組換えウイルスは透明なプラ
ークを作る。多角体非産生の組換えウイルスと思われる
プラークをさらにプラークアッセイを繰り返して、純化
したクローンを得る。
【００７６】（ｂ）組換えウイルスによるＮＳ１の発現 純化したウイルスをS.f.細胞に５ pfu／細胞となるよう
に感染させ２７℃で２４時間培養した。２０μＣｉの35
Ｓ−メチオニンを添加して４時間培養を行いＣ型肝炎患
者血清を用いた免疫沈降法で特異抗原蛋白質を沈降さ
せ、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ）で分析した。その結果、組換えウイルス
感染細胞をＣ型肝炎患者血清で免疫沈降したものだけに
ｇｐ５８の特異的なバンドが認められＮＳ１が発現され
ていることが確認された（図５）。
に感染させ２７℃で２４時間培養した。２０μＣｉの35
Ｓ−メチオニンを添加して４時間培養を行いＣ型肝炎患
者血清を用いた免疫沈降法で特異抗原蛋白質を沈降さ
せ、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ）で分析した。その結果、組換えウイルス
感染細胞をＣ型肝炎患者血清で免疫沈降したものだけに
ｇｐ５８の特異的なバンドが認められＮＳ１が発現され
ていることが確認された（図５）。
【００７７】実施例４ ＨＣＶ（＃６）遺伝子のクローニングと配列決定 Ｃ型肝炎患者（＃６）からの血清を用いて、実施例２で
示した方法によりＰＣＲを行い４種類のＰＣＲ産物を得
る。＃４の塩基配列を参考にしてＰＣＲ用プライマーを
合成した。５′非翻訳領域（Ａ）では、１stＰＣＲはｋ
ｋ３０とｋｋ２９−４：５′−ＡＣＴＣＣＡＣＣＡＡＣ
ＧＡＴＣＴＧＡＣＣ−３′を使用し、２ndＰＣＲはｋｋ
３０とｋｋ３１−４：５′−ＣＣＧＧＧＡＡＣＴＴＧＡ
ＣＧＴＣＣＴＧＴ−３′を用いた。構造遺伝子コア領域
（Ｂ）では、１stＰＣＲはｋｋ３４とＡ２を用い、２nd
ＰＣＲは、ｋｋ３６−４：５′−ＡＧＡＣＣＧＴＧＣＡ
ＴＣＡＴＧＡＧＣＡＣ−３′とＡｌ−４：５′−ＣＡＧ
ＴＣＧＴＴＴＧＴＧＡＣＡＴＧＧＴＡ−３′を使用し
た。構造遺伝子エンベロープ領域（Ｃ）では１stＰＣＲ
はＳ１−４：５′−ＧＴＧＡＡＴＴＡＣＧＣＡＡＣＡＧ
ＧＧＡＡ−３′とＡ１１を、また２ndＰＣＲはＳ２とＡ
１０を使用した。非構造遺伝子ＮＳ１，ＮＳ２領域
（Ｄ）では、１stＰＣＲは、ｋｋ６１−４：５′−ＴＡ
ＡＣＧＧＣＡＧＣＴＧＧＣＡＣＡＴＣＡ−３′とｋｋ５
０を、また２ndＰＣＲはｋｋ６２とＡ１２：５′ＴＡＧ
ＧＣＣＧＴＧＡＴＡＧＧＣＧＣＡＡＧ−３′を使用し
た。ＰＣＲ終了後、アガロース電気泳動を行い、４つの
領域に特異的なＤＮＡ断片を検出した。クローニングベ
クターであるＳｍａＩ消化されたｐＵＣ119 にそれぞれ
のＤＮＡ断片を連結反応によりクローニングし、Ｓａｎ
ｇｅｒらのジデオキシ鎖終止法を用いて塩基配列を決定
した。ＨＣＶ（＃６）遺伝子の塩基配列及び推定アミノ
酸配列を配列番号３として示した。
示した方法によりＰＣＲを行い４種類のＰＣＲ産物を得
る。＃４の塩基配列を参考にしてＰＣＲ用プライマーを
合成した。５′非翻訳領域（Ａ）では、１stＰＣＲはｋ
ｋ３０とｋｋ２９−４：５′−ＡＣＴＣＣＡＣＣＡＡＣ
ＧＡＴＣＴＧＡＣＣ−３′を使用し、２ndＰＣＲはｋｋ
３０とｋｋ３１−４：５′−ＣＣＧＧＧＡＡＣＴＴＧＡ
ＣＧＴＣＣＴＧＴ−３′を用いた。構造遺伝子コア領域
（Ｂ）では、１stＰＣＲはｋｋ３４とＡ２を用い、２nd
ＰＣＲは、ｋｋ３６−４：５′−ＡＧＡＣＣＧＴＧＣＡ
ＴＣＡＴＧＡＧＣＡＣ−３′とＡｌ−４：５′−ＣＡＧ
ＴＣＧＴＴＴＧＴＧＡＣＡＴＧＧＴＡ−３′を使用し
た。構造遺伝子エンベロープ領域（Ｃ）では１stＰＣＲ
はＳ１−４：５′−ＧＴＧＡＡＴＴＡＣＧＣＡＡＣＡＧ
ＧＧＡＡ−３′とＡ１１を、また２ndＰＣＲはＳ２とＡ
１０を使用した。非構造遺伝子ＮＳ１，ＮＳ２領域
（Ｄ）では、１stＰＣＲは、ｋｋ６１−４：５′−ＴＡ
ＡＣＧＧＣＡＧＣＴＧＧＣＡＣＡＴＣＡ−３′とｋｋ５
０を、また２ndＰＣＲはｋｋ６２とＡ１２：５′ＴＡＧ
ＧＣＣＧＴＧＡＴＡＧＧＣＧＣＡＡＧ−３′を使用し
た。ＰＣＲ終了後、アガロース電気泳動を行い、４つの
領域に特異的なＤＮＡ断片を検出した。クローニングベ
クターであるＳｍａＩ消化されたｐＵＣ119 にそれぞれ
のＤＮＡ断片を連結反応によりクローニングし、Ｓａｎ
ｇｅｒらのジデオキシ鎖終止法を用いて塩基配列を決定
した。ＨＣＶ（＃６）遺伝子の塩基配列及び推定アミノ
酸配列を配列番号３として示した。
【００７８】
【発明の効果】本発明により、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス
（ＨＣＶ）のコア、エンベロープ及びＮＳ１から成る構
造蛋白質並びに非構造蛋白質ＮＳ２をコードするＤＮＡ
配列が決定された。特に、エンベロープ及びＮＳ１領域
はＨＣＶの外被を構成する糖蛋白質であるため、これを
抗原として利用することによって血清中の微量ＨＣＶの
存在を高い確度で判定することができるだろう。ＨＣＶ
をｉｎ ｖｉｔｒｏ培養することは極めて困難である現
状において、本発明のＤＮＡ断片を発現させることによ
り、ＨＣＶの外被蛋白質を効率的に且つ多量に製造でき
ることは、上記のＨＣＶ検出のみならず、非Ａ非Ｂ型肝
炎の診断やＨＣＶワクチンの開発に大いに寄与し得ると
いえる。
（ＨＣＶ）のコア、エンベロープ及びＮＳ１から成る構
造蛋白質並びに非構造蛋白質ＮＳ２をコードするＤＮＡ
配列が決定された。特に、エンベロープ及びＮＳ１領域
はＨＣＶの外被を構成する糖蛋白質であるため、これを
抗原として利用することによって血清中の微量ＨＣＶの
存在を高い確度で判定することができるだろう。ＨＣＶ
をｉｎ ｖｉｔｒｏ培養することは極めて困難である現
状において、本発明のＤＮＡ断片を発現させることによ
り、ＨＣＶの外被蛋白質を効率的に且つ多量に製造でき
ることは、上記のＨＣＶ検出のみならず、非Ａ非Ｂ型肝
炎の診断やＨＣＶワクチンの開発に大いに寄与し得ると
いえる。
【００７９】
配列番号：１ 配列の長さ：436 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to genomic RNA 配列： GAATTCGCGG CCGCGAATCA CTCCCCTGTG AGGAACTACT GTCTTCACGC AGAAAGCGTC 60 TAGCCATGGC GTTAGTATGA GTGTCGTACA GCCTCCAGGC CCCCCCCTCC CGGGAGAGCC 120 ATAGTGGTCT GCGGAACCGG TGAGTACACC GGAATTGCCG GGAAGACTGG GTCCTTTCTT 180 GGATAAACCC ACTCTATGCC CGGCCATTTG GGCGTGCCCC CGCAAGACTG CTAGCCGAGT 240 AGCGTTGGGT TGCGAAAGGC CTTGTGGTAC TGCCTGATAG GGTGCTTGCG AGTGCCCCGG 300 GAGGTCTCGT AGACCGTGCA CC ATG AGC ACA GAT CCT AAA CCT CAA AGA AAA 352 Met Ser Thr Asp Pro Lys Pro Gln Arg Lys 1 5 ACC AAA AGA AAC ACT AAC CGT CGC CCA CAA GAC GTT AAG TTT CCG GGC 400 Thr Lys Arg Asn Thr Asn Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly 10 15 20 GGC GGT CAG ATC GTT GGT GGA GGC GGC CGC GAA TTC 436 Gly Gly Gln Ile Val Gly Gly Gly Gly Arg Glu Phe 25 30 配列番号：２ 配列の長さ：3461 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to genomic RNA フラグメント型：N 末端フラグメント 配列： ATCACTCCCC TGTGAGGAAC TACTGTCTTC ACGCAGAAAG CGTCTAGCCA TGGCGTTAGT 60 ATGAGTGTCG TGCAGCCTCC AGGACCCCCC CTCCCGGGAG AGCCATAGTG GTCTGCGGAA 120 CCGGTGAGTA CACCGGAATT GCCAGGACGA CCGGGTCCTT TCTTGGATTA ACCCGCTCAA 180 TGCCTGGAGA TTTGGGCGTG CCCCCGCGAG ACTGCTAGCC GAGTAGTGTT GGGTCGCGAA 240 AGGCCTTGTG GTACTGCCTG ATAGGGTGCT TGCGAGTGCC CCGGGAGGTC TCGTAGACCG 300 TGCATC ATG AGC ACA AAT CCT AAA CCT CAA AGA AAA ACC AAA CGT AAC 348 Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn 1 5 10 ACC AAC CGC CGC CCA CAG GAC GTC AAG TTC CCG GGC GGT GGT CAG ATC 396 Thr Asn Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile 15 20 25 30 GTT GGT GGA GTT TAC CTG TTG CCG CGC AGG GGC CCC AGG TTG GGT GTG 444 Val Gly Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val 35 40 45 CGC GCG ACT AGG AAG ACT TCC GAG CGG TCG CAA CCT CGT GGA AGG CGA 492 Arg Ala Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg 50 55 60 CAA CCT ATC CCC AAG GCT CGC CGG CCC GAG GGC AGG GCC TGG GCT CAG 540 Gln Pro Ile Pro Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Ala Trp Ala Gln 65 70 75 CCC GGG TAC CCT TGG CCC CTC TAT GGT AAC GAG GGC CTG GGG TGG GCA 588 Pro Gly Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Leu Gly Trp Ala 80 85 90 GGA TGG CTC CTG TCA CCC CGC GGC TCC CGG CCT AGT TGG GGC CCC ACG 636 Gly Trp Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr 95 100 105 110 GAC CCC CGG CGT AGG TCG CGT AAT TTG GGT AAG GTC ATC GAT ACC CTC 684 Asp Pro Arg Arg Arg Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu 115 120 125 ACA TGC GGC TTC GCC GAC CTC ATG GGG TAC ATT CCG CTC GTC GGC GCC 732 Thr Cys Gly Phe Ala Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala 130 135 140 CCC CTA GGA GGC GTT GCC AGG GCC CTG GCG CAT GGC GTC CGG GTT CTG 780 Pro Leu Gly Gly Val Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu 145 150 155 GAA GAC GGC GTG AAT TAC GCA ACA GGG AAT CTG CCC GGT TGC TCT TTC 828 Glu Asp Gly Val Asn Tyr Ala Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe 160 165 170 TCT ATC TTC CTC TTG GCT TTG CTG TCC TGT CTG ACC ATC CCA GCT TCC 876 Ser Ile Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Leu Thr Ile Pro Ala Ser 175 180 185 190 GCT TAT GAA GTG CGC AAC GTG TCC GGG GTG TAC CAT GTC ACA AAC GAC 924 Ala Tyr Glu Val Arg Asn Val Ser Gly Val Tyr His Val Thr Asn Asp 195 200 205 TGC TCC AAC TCA AGT ATT GTG TAT GAG GCA GCG GAC GTG ATC ATG CAC 972 Cys Ser Asn Ser Ser Ile Val Tyr Glu Ala Ala Asp Val Ile Met His 210 215 220 ACC CCC GGG TGC GTG CCC TGC GTT CGG GAG AGC AAT TTC TCC CGC TGC 1020 Thr Pro Gly Cys Val Pro Cys Val Arg Glu Ser Asn Phe Ser Arg Cys 225 230 235 TGG GTA GCG CTC ACT CCC ACG CTC GCG GCC AGA AAC AGC AGC ATC CCC 1068 Trp Val Ala Leu Thr Pro Thr Leu Ala Ala Arg Asn Ser Ser Ile Pro 240 245 250 ACT ACG ACA ATA CGA CGC CAT GTC GAT TTG CTC GTT GGG GCA GCT GCT 1116 Thr Thr Thr Ile Arg Arg His Val Asp Leu Leu Val Gly Ala Ala Ala 255 260 265 270 CTC TGC TCC GCC ATG TAC GTG GGG GAT CTC TGC GGA TCT GTC TTC CTC 1164 Leu Cys Ser Ala Met Tyr Val Gly Asp Leu Cys Gly Ser Val Phe Leu 275 280 285 GTC TCC CAG CTG TTC ACC TTC TCA CCT CGC CGG TAT GAG ACG GTA CAG 1212 Val Ser Gln Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg Arg Tyr Glu Thr Val Gln 290 295 300 GAC TGC AAC TGC TCA ATC TAT CCC GGC CAC GTG TCA GGT CAC CGC ATG 1260 Asp Cys Asn Cys Ser Ile Tyr Pro Gly His Val Ser Gly His Arg Met 305 310 315 GCT TGG GAT ATG ATG ATG AAC TGG TCG CCT ACA ACA GCC CTG GTG GTA 1308 Ala Trp Asp Met Met Met Asn Trp Ser Pro Thr Thr Ala Leu Val Val 320 325 330 TCG CAG TTA CTC CGG ATC CCA CAA GCC ATC GTG GAC ATG GTG GCA GGG 1356 Ser Gln Leu Leu Arg Ile Pro Gln Ala Ile Val Asp Met Val Ala Gly 335 340 345 350 GCC CAC TGG GGA GTC CTG GCG GGC CTT GCC TAC TAT TCC ATG GTG GGG 1404 Ala His Trp Gly Val Leu Ala Gly Leu Ala Tyr Tyr Ser Met Val Gly 355 360 365 AAC TGG GCT AAG GTC TTG ATT GTG ATG CTA CTC TTT GCT GGC GTT GAT 1452 Asn Trp Ala Lys Val Leu Ile Val Met Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp 370 375 380 GGG GGT ACC CAC GTG TCG GGG GGG AGC GCG GCC CAA ACC ACC AGC GGG 1500 Gly Gly Thr His Val Ser Gly Gly Ser Ala Ala Gln Thr Thr Ser Gly 385 390 395 CTT GCG TCC CTC TTT ACA TCC GGG TCG GCC CAG AAC ATC CAA CTT GTA 1548 Leu Ala Ser Leu Phe Thr Ser Gly Ser Ala Gln Asn Ile Gln Leu Val 400 405 410 AAC ACT AAC GGC AGC TGG CAC ATC AAC AGA ACT GCT CTG AAT TGC AAT 1596 Asn Thr Asn Gly Ser Trp His Ile Asn Arg Thr Ala Leu Asn Cys Asn 415 420 425 430 GAC TCC CTC AAG ACT GGG TTC CTT GCC GCG CTG TTC TAC ACG CGC AAG 1644 Asp Ser Leu Lys Thr Gly Phe Leu Ala Ala Leu Phe Tyr Thr Arg Lys 435 440 445 TTC AAC TCG TCC GGA TGC CCA GAG CGC ATG GCC AGC TGC CGC CCC ATT 1692 Phe Asn Ser Ser Gly Cys Pro Glu Arg Met Ala Ser Cys Arg Pro Ile 450 455 460 GAC AAG TTC GCT CAG GGG TGG GGT CCC ATT ACT CAT GTT GAG CCT CAC 1740 Asp Lys Phe Ala Gln Gly Trp Gly Pro Ile Thr His Val Glu Pro His 465 470 475 ATT TCA GAC CAG AGG CCT TAT TGC TGG CAC TAC GCG CCT CGG CCG TGC 1788 Ile Ser Asp Gln Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Ala Pro Arg Pro Cys 480 485 490 GGT ATC GTA CCC GCG TCG CAG GTG TGT GGT CCA GTG TAT TGC TTC ACC 1836 Gly Ile Val Pro Ala Ser Gln Val Cys Gly Pro Val Tyr Cys Phe Thr 495 500 505 510 CCG AGC CCT GTT GTG GTG GGA ACG ACC GAC CGC TTC GGT GTC CCC ACG 1884 Pro Ser Pro Val Val Val Gly Thr Thr Asp Arg Phe Gly Val Pro Thr 515 520 525 TAC AAA TGG GGA GAG AAT GAG ACG GAC GTG CTA CTC CTC AAC AAC ACG 1932 Tyr Lys Trp Gly Glu Asn Glu Thr Asp Val Leu Leu Leu Asn Asn Thr 530 535 540 CGG CCG CCG CAA GGC AAC TGG TTC AGC TGC ACA TGG ATG AAC AGC ACC 1980 Arg Pro Pro Gln Gly Asn Trp Phe Ser Cys Thr Trp Met Asn Ser Thr 545 550 555 GGG TTC ACC AGG ACG TGC GGG GGC CCC CCG TGT AAC ATC GGG GGG ACC 2028 Gly Phe Thr Arg Thr Cys Gly Gly Pro Pro Cys Asn Ile Gly Gly Thr 560 565 570 GGC AAC GAC ACC TTG ACC TGC CCT ACG GAT TGC TTC CGT AAG CAC CCC 2076 Gly Asn Asp Thr Leu Thr Cys Pro Thr Asp Cys Phe Arg Lys His Pro 575 580 585 590 GAG GCC ACT TAC GCC AAA TGC GGC TCG GGG CCT TGG TTG ACA CCT AGG 2124 Glu Ala Thr Tyr Ala Lys Cys Gly Ser Gly Pro Trp Leu Thr Pro Arg 595 600 605 TGC TTA GTT GAC TAC CCA TAC AGA CTT TGG CAC TGC CCC TGC ACT GTC 2172 Cys Leu Val Asp Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His Cys Pro Cys Thr Val 610 615 620 AAT TTT ACC ATC TTC AAG GTC AGG ATG TAC GTG GGG GGT GTG GAG CAC 2220 Asn Phe Thr Ile Phe Lys Val Arg Met Tyr Val Gly Gly Val Glu His 625 630 635 AGG CTC GAC GCC GCG TGC AAT TGG ACT CGA GGA GAG CGC TGT GAT TTG 2268 Arg Leu Asp Ala Ala Cys Asn Trp Thr Arg Gly Glu Arg Cys Asp Leu 640 645 650 GAG GAC AGG GAT AGA TCA GAG CTC AGT CCG CTG CTA CTG TCT ACT ACA 2316 Glu Asp Arg Asp Arg Ser Glu Leu Ser Pro Leu Leu Leu Ser Thr Thr 655 660 665 670 GAG TGG CAG ATA CTG CCT TGC TCC TTC ACC ACC CTA CCG GCT CTG TCC 2364 Glu Trp Gln Ile Leu Pro Cys Ser Phe Thr Thr Leu Pro Ala Leu Ser 675 680 685 ACC GGG TTG ATC CAC CTC CAT CAG AAC ATC GCG GAC GTG CAA TAC CTG 2412 Thr Gly Leu Ile His Leu His Gln Asn Ile Ala Asp Val Gln Tyr Leu 690 695 700 TAC GGT GTA GGG TCA GCG TTC GTC TCC GTC GTA GTC AGA TGG GAG TAC 2460 Tyr Gly Val Gly Ser Ala Phe Val Ser Val Val Val Arg Trp Glu Tyr 705 710 715 GTC CTG CTG CTC TTC CTT CTC CTG GCG GAC GCG CAT GTC TGC GCT TGC 2508 Val Leu Leu Leu Phe Leu Leu Leu Ala Asp Ala His Val Cys Ala Cys 720 725 730 CTC TGG ATG ATG CTG CTG ATA GCC CAG GCT GAG GCC GCC TTA GAG AAC 2556 Leu Trp Met Met Leu Leu Ile Ala Gln Ala Glu Ala Ala Leu Glu Asn 735 740 745 750 CTG GTG ATC CTC AAC GCG GCG TCC GTG GCT GGA GCG CAT GGC ATT CTC 2604 Leu Val Ile Leu Asn Ala Ala Ser Val Ala Gly Ala His Gly Ile Leu 755 760 765 TCC TTC CTT GTG TTC TTC TGC GCT GCC TGG TAC ATC AAG GGC AAG CTG 2652 Ser Phe Leu Val Phe Phe Cys Ala Ala Trp Tyr Ile Lys Gly Lys Leu 770 775 780 GTG CCC GGG GCG GCA TAT GCT TTT TAT GGC GTA TGG CCG CTG CTC CTG 2700 Val Pro Gly Ala Ala Tyr Ala Phe Tyr Gly Val Trp Pro Leu Leu Leu 785 790 795 CTC CTG CTG GCG TTA CCA CCA CGA GCA TAC GCC ATG GAC CGG GAG ATG 2748 Leu Leu Leu Ala Leu Pro Pro Arg Ala Tyr Ala Met Asp Arg Glu Met 800 805 810 GCC GCA TCG TGC GAA GGC GCG GTT TTC ATA GGT CTG GCA CTC TTG ACT 2796 Ala Ala Ser Cys Glu Gly Ala Val Phe Ile Gly Leu Ala Leu Leu Thr 815 820 825 830 TTG TCA CCA CAC TAC AAA GTG TTC CTC GCT AAG CTC ATA TGG TGG TTG 2844 Leu Ser Pro His Tyr Lys Val Phe Leu Ala Lys Leu Ile Trp Trp Leu 835 840 845 CAA TAT TTT ATC ACC AGG GCC GAG GCG TGC TTG CAA GTG TGG GTT CCC 2892 Gln Tyr Phe Ile Thr Arg Ala Glu Ala Cys Leu Gln Val Trp Val Pro 850 855 860 CCT CTC ATC GTT CGG GGG GGC CGC GAT GCC ATC ATC CTC CTC ACA TGC 2940 Pro Leu Ile Val Arg Gly Gly Arg Asp Ala Ile Ile Leu Leu Thr Cys 865 870 875 ATG GTC CAC CCA GAG CTA ATT TTT GAA ATC ACC AAA ATC TTG CTC GCC 2988 Met Val His Pro Glu Leu Ile Phe Glu Ile Thr Lys Ile Leu Leu Ala 880 885 890 ATA CTC GGT CCG CTC ATG GTG CTC CAG GCT GGC CTA ACT AGA GTG CCG 3036 Ile Leu Gly Pro Leu Met Val Leu Gln Ala Gly Leu Thr Arg Val Pro 895 900 905 910 TAC TTC GTG CGC GCT CAA GGG CTC ATT CGT GTG TGC ATG TTG GTG CGG 3084 Tyr Phe Val Arg Ala Gln Gly Leu Ile Arg Val Cys Met Leu Val Arg 915 920 925 AAA GCC GCT GGG GGT CAT TAT GTC CAA ATG GCC CTC GTG AAG CTG GCC 3132 Lys Ala Ala Gly Gly His Tyr Val Gln Met Ala Leu Val Lys Leu Ala 930 935 940 GCA TTG ACG GGT ACG TAC GTA TAC AAC CAT CTT ACT CCA CTG CGA GAC 3180 Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Val Tyr Asn His Leu Thr Pro Leu Arg Asp 945 950 955 TGG GCC CAT GCA GGC CTG CGC GAC CTT GTG GTG GCA GTT GAG CCT GTC 3228 Trp Ala His Ala Gly Leu Arg Asp Leu Val Val Ala Val Glu Pro Val 960 965 970 ATC TTC TCT GAC ATG GAG ACC AAG ATC ATC ACC TGG GGG GCA GAC ACC 3276 Ile Phe Ser Asp Met Glu Thr Lys Ile Ile Thr Trp Gly Ala Asp Thr 975 980 985 990 GCA GCG TGC GGG GAC ATC ATC TCG GGT CTA CCC GTC TCC GCC CGA AGG 3324 Ala Ala Cys Gly Asp Ile Ile Ser Gly Leu Pro Val Ser Ala Arg Arg 995 1000 1005 GGG AGG GAG ATA CTT CTG GGA CCT GCC GAC AGC TTT AGG GAG CAG GGG 3372 Gly Arg Glu Ile Leu Leu Gly Pro Ala Asp Ser Phe Arg Glu Gln Gly 1010 1015 1020 TGG CGA CTC CTT GCG CCT ATC ACG GCC TAT TCC CAA CAG ACG CGG GGC 3420 Trp Arg Leu Leu Ala Pro Ile Thr Ala Tyr Ser Gln Gln Thr Arg Gly 1025 1030 1035 CTA ATT GGC TGC ATC ATC ACC AGC CTA ACT GTC CGG GAC AA 3461 Leu Ile Gly Cys Ile Ile Thr Ser Leu Thr Val Arg Asp 1040 1045 1050 配列番号：３ 配列の長さ：3401 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to genomic RNA 配列： ATCACTCCCC TGTGAGGAAC TACTGTCTTC ACGCAGAAAG CGTCTAGCCA TGGCGTTAGT 60 ATGAGTGTCG TGCAGCCTCC AGGACCCCCC CTCCCGGGAG AGCCATAGTG GTCTGCGGAA 120 CCGGTGAGTA CACCGGAATT GCCAGGACGA CCGGGTCCTT TCTTGGATCA ACCCGCTCAA 180 TGCCTGGAGA TTTGGGCGTG CCCCCGCGAG ACTGCTAGCC GAGTAGTGTT GGGTCGCGAA 240 AGGCCTTGTG GTACTGCCTG ATAGGGTGCT TGCGAGTGCC CCGGGAGGTC TCGTAGACCG 300 TGCATC ATG AGC ACA AAT CCC AAA CCC CAA AGA AAA ACC AAA CGT AAC 348 Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn 1 5 10 ACC AAC CGT CGC CCA CAG GAC GTC AAG TTC CCG GGT GGT GGT CAG ATC 396 Thr Asn Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile 15 20 25 30 GTT GGT GGA GTT TAC CTG TTG CCG CGC AGG GGC CCC AGG TTG GGT GTG 444 Val Gly Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val 35 40 45 CGC GCG ACT AGG AAG ACT TCC GAG CGG TCA CAA CCT CGT GGA AGG CGA 492 Arg Ala Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg 50 55 60 CAA CCT ATC CCC AAG GCT CGC CAG CCC GAG GGC AGG GCC TGG GCT CAG 540 Gln Pro Ile Pro Lys Ala Arg Gln Pro Glu Gly Arg Ala Trp Ala Gln 65 70 75 CCC GGG TAC CCT TGG CCC CTC TAT GGC AAC GAG GGC ATG GGG TGG GCA 588 Pro Gly Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Met Gly Trp Ala 80 85 90 GGA TGG CTC CTG TCA CCC CGC GGC TCC CGG CCT AGT TGG GGC CCC ACG 636 Gly Trp Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr 95 100 105 110 GAC CCC CGG CGT AGG TCG CGT AAT TTG GGT AAG GTC ATC GAT ACC CTC 684 Asp Pro Arg Arg Arg Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu 115 120 125 ACA TGC GGC TTC GCC GAC CTC ATG GGG TAC ATT CCG CTC GTC GGC GCC 732 Thr Cys Gly Phe Ala Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala 130 135 140 CCC CTA GGG GGC GTT GCC AGG GCC CTG GCA CAT GGT GTC CGG GTT GTG 780 Pro Leu Gly Gly Val Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Val 145 150 155 GAG GAC GGC GTG AAC TAT GCA ACA GGG AAT TTG CCC GGT TGC TCT TTC 828 Glu Asp Gly Val Asn Tyr Ala Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe 160 165 170 TCT ATC TTC CTC TTG GCT CTG CTG TCC TGT TTG ACC ATC CCA GCT TCC 876 Ser Ile Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Leu Thr Ile Pro Ala Ser 175 180 185 190 GCT TAT GAG GTG CGC AAC GTA TCC GGG ATA TAC CAT GTC ACG AAC GAC 924 Ala Tyr Glu Val Arg Asn Val Ser Gly Ile Tyr His Val Thr Asn Asp 195 200 205 TGC TCC AAC TCA AGT ATT GTG TAT GAG GCA GCG GAC ATG ATC ATG CAT 972 Cys Ser Asn Ser Ser Ile Val Tyr Glu Ala Ala Asp Met Ile Met His 210 215 220 ACC CCC GGG TGC GTG CCC TGC GTT CGG GAG GGC AAC TCC TCC CGT TGC 1020 Thr Pro Gly Cys Val Pro Cys Val Arg Glu Gly Asn Ser Ser Arg Cys 225 230 235 TGG GTG GCA CTT ACT CCC ACG CTA GCG GCC AGG AAT GCC AGC GTC CCC 1068 Trp Val Ala Leu Thr Pro Thr Leu Ala Ala Arg Asn Ala Ser Val Pro 240 245 250 ACT ACG GCA ATA CGA CGC CAT GTC GAT TTG CTC GTT GGG GCG GCT GCT 1116 Thr Thr Ala Ile Arg Arg His Val Asp Leu Leu Val Gly Ala Ala Ala 255 260 265 270 TTC TGC TCC GCT ATG TAT GTG GGA GAT CTC TGC GGA TCT GTT TTC CTT 1164 Phe Cys Ser Ala Met Tyr Val Gly Asp Leu Cys Gly Ser Val Phe Leu 275 280 285 GTC TCC CAG CTG TTC ACC TTC TCG CCC CGC CGG CAT GAG ACA ATA CAG 1212 Val Ser Gln Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg Arg His Glu Thr Ile Gln 290 295 300 GAC TGC AAT TGC TCA ATC TAT CCC GGC CAC GTG TCA GGT CAC CGC ATG 1260 Asp Cys Asn Cys Ser Ile Tyr Pro Gly His Val Ser Gly His Arg Met 305 310 315 GCT TGG GAC ATG ATG ATG AAC TGG TCG CCT ACA ACG GCC CTG GTG GTG 1308 Ala Trp Asp Met Met Met Asn Trp Ser Pro Thr Thr Ala Leu Val Val 320 325 330 TCG CAG TTA CTC CGG ATC CCA CAA GCT ATC GTG GAC ATG GTG GCG GGG 1356 Ser Gln Leu Leu Arg Ile Pro Gln Ala Ile Val Asp Met Val Ala Gly 335 340 345 350 GCT CAC TGG GGT GTC CTA GCG GGC CTT GCC TAC TAT TCC ATG GTG GGG 1404 Ala His Trp Gly Val Leu Ala Gly Leu Ala Tyr Tyr Ser Met Val Gly 355 360 365 AAC TGG GCT AAG GTA TTG ATT GTG ATG CTA CTT TTT GCC GGC GTC GAC 1452 Asn Trp Ala Lys Val Leu Ile Val Met Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp 370 375 380 GGG GAG ACC CGT GTG ACA GGG GGG CAG ATA GCC AGA AAT GCC TAC TCG 1500 Gly Glu Thr Arg Val Thr Gly Gly Gln Ile Ala Arg Asn Ala Tyr Ser 385 390 395 CTC ACG ACC CTC TTT TCA TCT GGG TCG GCT CAG AAC ATC CAG CTC ATA 1548 Leu Thr Thr Leu Phe Ser Ser Gly Ser Ala Gln Asn Ile Gln Leu Ile 400 405 410 AAC ACC AAC GGT AGC TGG CAC ATC AAC AGG ACT GCC CTG AAC TGC AAT 1596 Asn Thr Asn Gly Ser Trp His Ile Asn Arg Thr Ala Leu Asn Cys Asn 415 420 425 430 GAC TCC CTC AAC ACC GGG TTT CTT GCC GCG CTG TTC TAC ACG CAC AAG 1644 Asp Ser Leu Asn Thr Gly Phe Leu Ala Ala Leu Phe Tyr Thr His Lys 435 440 445 TTC AAC GCG TCC GGA TGT CCA GAG CGC TTG GCC AGC TGC CGC CCC ATT 1692 Phe Asn Ala Ser Gly Cys Pro Glu Arg Leu Ala Ser Cys Arg Pro Ile 450 455 460 GAC AAG TTC GAT CAG GGG TGG GGT CCC ATC ACT TAT GCT GAG CAG GGC 1740 Asp Lys Phe Asp Gln Gly Trp Gly Pro Ile Thr Tyr Ala Glu Gln Gly 465 470 475 GGC CAG GAC CAG AGG CCT TAT TGC TGG CAC TAC GCA CCT AAA CCA TGT 1788 Gly Gln Asp Gln Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Ala Pro Lys Pro Cys 480 485 490 GGT ATT GTA TCC GCG TCG AAG GTG TGT GGT CCA GTG TAT TGT TTC ACC 1836 Gly Ile Val Ser Ala Ser Lys Val Cys Gly Pro Val Tyr Cys Phe Thr 495 500 505 510 CCA AGC CCA GTT GTA GTG GGG ACG ACC GAT CGG TTC GGT GTC CCT ACG 1884 Pro Ser Pro Val Val Val Gly Thr Thr Asp Arg Phe Gly Val Pro Thr 515 520 525 TAT AGC TGG GGG GAG AAT GAG ACA GAC GTG CTG CTC CTT AAC AAC ACG 1932 Tyr Ser Trp Gly Glu Asn Glu Thr Asp Val Leu Leu Leu Asn Asn Thr 530 535 540 CGG CCG CCG CAA GGC AAC TGG TTC GGC TGT ACG TGG ATG AAC GGC ACT 1980 Arg Pro Pro Gln Gly Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp Met Asn Gly Thr 545 550 555 GGG TTC ACC AAG ACA TGC GGG GGC CCC CCG TGT AAC ATC GGG GGG GGC 2028 Gly Phe Thr Lys Thr Cys Gly Gly Pro Pro Cys Asn Ile Gly Gly Gly 560 565 570 GGC AAT AAC ACC TTG ACC TGC CCT ACG GAC TGT TTC CGG AAG CAC CCC 2076 Gly Asn Asn Thr Leu Thr Cys Pro Thr Asp Cys Phe Arg Lys His Pro 575 580 585 590 GCG GCC ACT TAC ACA AAA TGT GGT TCG GGA CCT TGG CTG ACA CCC AGG 2124 Ala Ala Thr Tyr Thr Lys Cys Gly Ser Gly Pro Trp Leu Thr Pro Arg 595 600 605 TGC TTG GTA GAC TAC CCA TAC AGG CTC TGG CAC TAC CCC TGC ACT GCC 2172 Cys Leu Val Asp Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro Cys Thr Ala 610 615 620 AAC TTT ACC ATC TTC AAG GTT AGG ATG TAT GTA GGG GGC GTG GAG CAC 2220 Asn Phe Thr Ile Phe Lys Val Arg Met Tyr Val Gly Gly Val Glu His 625 630 635 AGG CTC GAT GCT GCA TGC AAT TGG ACC CGA GGG GAA CGT TGC AAC TTG 2268 Arg Leu Asp Ala Ala Cys Asn Trp Thr Arg Gly Glu Arg Cys Asn Leu 640 645 650 GAG GAT AGG GAT AGA TTG GAG CTC AGC CCG CTA CTG CTG TCT ACA ACA 2316 Glu Asp Arg Asp Arg Leu Glu Leu Ser Pro Leu Leu Leu Ser Thr Thr 655 660 665 670 GAG TGG CAG GTG CTG CCC TGT TCT TTC ACC ACC CTA CCG GCT CTG TCC 2364 Glu Trp Gln Val Leu Pro Cys Ser Phe Thr Thr Leu Pro Ala Leu Ser 675 680 685 ACT GGT TTA ATT CAT CTC CAT CAG AAC ATC GTG GAC GTG CAA TAC CTG 2412 Thr Gly Leu Ile His Leu His Gln Asn Ile Val Asp Val Gln Tyr Leu 690 695 700 TAC GGT ATA GGG TCG GCA GTT GTT TCC TTT GCA ATC AAA TGG GAC TAT 2460 Tyr Gly Ile Gly Ser Ala Val Val Ser Phe Ala Ile Lys Trp Asp Tyr 705 710 715 ATC GTG ATA CTT TTC CTC CTC CTG GCG GAC GCG CGC GTC TGT GCC TGC 2508 Ile Val Ile Leu Phe Leu Leu Leu Ala Asp Ala Arg Val Cys Ala Cys 720 725 730 TTG TGG ATG ATG CTG CTG ATA GCC CAG GCC GAG GCC GCC TTA GAA AAC 2556 Leu Trp Met Met Leu Leu Ile Ala Gln Ala Glu Ala Ala Leu Glu Asn 735 740 745 750 CTG GTG GTC CTC AAT GCG GCG TCC GTG GCC GGA GCG CAT GGC ATT CTC 2604 Leu Val Val Leu Asn Ala Ala Ser Val Ala Gly Ala His Gly Ile Leu 755 760 765 TCC TTC CTT GTG TTC TTC TGT GCC GCC TGG TAC ATC AAG GGC AAG CTG 2652 Ser Phe Leu Val Phe Phe Cys Ala Ala Trp Tyr Ile Lys Gly Lys Leu 770 775 780 GTC CCC GGG GCA GCA TAT GCT TTC TAT GGA GTA TGG CCG CTG CTC CTG 2700 Val Pro Gly Ala Ala Tyr Ala Phe Tyr Gly Val Trp Pro Leu Leu Leu 785 790 795 CTT CTG CTG GCC TTA CCA CCA CGA GCT TAC GCT ATG GAG CGG GAG ATG 2748 Leu Leu Leu Ala Leu Pro Pro Arg Ala Tyr Ala Met Glu Arg Glu Met 800 805 810 GCT GCA TCG TGC GGA GGC GCG GTG TTT GTA GGT CTG GTA CTC TTG ACT 2796 Ala Ala Ser Cys Gly Gly Ala Val Phe Val Gly Leu Val Leu Leu Thr 815 820 825 830 TTG TCA CCA TAC TAT AAA GAG TTC CTC GCC AGG CTC ATA TGG TGG TTG 2844 Leu Ser Pro Tyr Tyr Lys Glu Phe Leu Ala Arg Leu Ile Trp Trp Leu 835 840 845 CAA TAT TTT ATC ACC AGA GCC GAG GCG CAC CTG CAA GTG TGG ATC CCC 2892 Gln Tyr Phe Ile Thr Arg Ala Glu Ala His Leu Gln Val Trp Ile Pro 850 855 860 CCC CTC AAC ATT CGG GGG GGC CGC GAT GCC ATC ATC CTC CTC GCG TGT 2940 Pro Leu Asn Ile Arg Gly Gly Arg Asp Ala Ile Ile Leu Leu Ala Cys 865 870 875 GTA GTC CAC CCA GAG CTA ATC TTT GAC ATC ACC AAA CTC CTG CTC GCC 2988 Val Val His Pro Glu Leu Ile Phe Asp Ile Thr Lys Leu Leu Leu Ala 880 885 890 ATA CTC GGT CCG CTC ATG GTG CTC CAG GCT AGC ATA ACT CAA GTG CCG 3036 Ile Leu Gly Pro Leu Met Val Leu Gln Ala Ser Ile Thr Gln Val Pro 895 900 905 910 TAC TTC GTA CGC GCC CAA GGG CTC ATT CGT GCA TGC ATG TTG GTG CGG 3084 Tyr Phe Val Arg Ala Gln Gly Leu Ile Arg Ala Cys Met Leu Val Arg 915 920 925 AAG GTT GCC GGG GGC CAT TAT GTC CAA ATG GCC TTT GTG AAG CTG ACC 3132 Lys Val Ala Gly Gly His Tyr Val Gln Met Ala Phe Val Lys Leu Thr 930 935 940 GCA CTG ACA GGT ACG TAC GTT TAT GAC CAT CTA ACT CCA CTG CGG GAC 3180 Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Val Tyr Asp His Leu Thr Pro Leu Arg Asp 945 950 955 TGG GCC CAC GCG GGC CTG CGA GAC CTC GCG GTG GCA GTA GAG CCC GTT 3228 Trp Ala His Ala Gly Leu Arg Asp Leu Ala Val Ala Val Glu Pro Val 960 965 970 GTC TTC TCT GAC ATG GAG ACC AAG GTC ATC ACC TGG GGG GCA GAC ACC 3276 Val Phe Ser Asp Met Glu Thr Lys Val Ile Thr Trp Gly Ala Asp Thr 975 980 985 990 GCG GCG TGT GGG GAC ATT ATC TTG GGT CTA CCT GTC TCC GCC CGA AGG 3324 Ala Ala Cys Gly Asp Ile Ile Leu Gly Leu Pro Val Ser Ala Arg Arg 995 1000 1005 GGT AGG GAG ATA CTT CTG GGG CCG GCC GAT AGT CTT GAA GGG CAG GGG 3372 Gly Arg Glu Ile Leu Leu Gly Pro Ala Asp Ser Leu Glu Gly Gln Gly 1010 1015 1020 TGG CGG CTC CTT GCG CCT ATC ACG GCC TA 3401 Trp Arg Leu Leu Ala Pro Ile Thr Ala 1025 1030
【図１】この図は、ＨＣＶ（＃４）５′側遺伝子構造及
び該遺伝子クローニングの戦略を示す。
び該遺伝子クローニングの戦略を示す。
【図２】この図は、ＨＣＶ（＃６）５′側遺伝子構造及
び該遺伝子クローニングの戦略を示す。
び該遺伝子クローニングの戦略を示す。
【図３】この図は、ＨＣＶ（＃４）のＮＳ１遺伝子を含
む組換えワクシニアウイルスの発現による組換えＮＳ１
蛋白質の産生を、間接蛍光抗体法で確認した写真であ
る。下の写真はコントロールである。
む組換えワクシニアウイルスの発現による組換えＮＳ１
蛋白質の産生を、間接蛍光抗体法で確認した写真であ
る。下の写真はコントロールである。
【図４】この図は、ＨＣＶ（＃４）のＮＳ１遺伝子をウ
イルス遺伝子内に組み込むための組換えプラスミドｐＢ
ａｃ・ＮＳ１及びｐＳＦ・ＮＳ１の構築法を示す。
イルス遺伝子内に組み込むための組換えプラスミドｐＢ
ａｃ・ＮＳ１及びｐＳＦ・ＮＳ１の構築法を示す。
【図５】この図は、組換えバキュロウイルスによるＨＣ
Ｖ（＃４）由来組換えＮＳ１蛋白質（ｇｐ５８）の発現
を、Ｃ型肝炎患者血清を用いる免疫沈降法／ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥで確認した写真である。レーン２はコントロール
である。
Ｖ（＃４）由来組換えＮＳ１蛋白質（ｇｐ５８）の発現
を、Ｃ型肝炎患者血清を用いる免疫沈降法／ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥで確認した写真である。レーン２はコントロール
である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成５年１０月７日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図５
【補正方法】変更
【補正内容】
【図５】 この図は、組換えバキュロウイルスによるＨ
ＣＶ（＃４）由来組換えＮＳ１蛋白質（ｇｐ５８）の発
現を、Ｃ型肝炎患者血清を用いる免疫沈降法／ＳＤＳ−
ＰＡＧＥで確認した電気泳動の写真である。レーン２は
コントロールである。
ＣＶ（＃４）由来組換えＮＳ１蛋白質（ｇｐ５８）の発
現を、Ｃ型肝炎患者血清を用いる免疫沈降法／ＳＤＳ−
ＰＡＧＥで確認した電気泳動の写真である。レーン２は
コントロールである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ (72)発明者 小原 恭子 東京都文京区本駒込三丁目18番22号 財団 法人 東京都臨床医学総合研究所内 (72)発明者 浅野 幸康 愛知県名古屋市東区東外堀町35番地 株式 会社三和化学研究所内 (72)発明者 三谷 隆彦 愛知県名古屋市東区東外堀町35番地 株式 会社三和化学研究所内 (72)発明者 澤井 喜一 愛知県名古屋市東区東外堀町35番地 株式 会社三和化学研究所内 (72)発明者 槙 昇 埼玉県入間郡大井町西鶴ケ岡一丁目３番１ 号 東燃株式会社総合研究所内 (72)発明者 小原 道法 埼玉県入間郡大井町西鶴ケ岡一丁目３番１ 号 東燃株式会社総合研究所内
Claims (15)
- 【請求項１】 非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原の配列番号
２によって示されるアミノ酸配列の全部又は一部をコー
ドするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片。 - 【請求項２】 配列番号２によって示される全ヌクレオ
チドから成るＤＮＡ断片。 - 【請求項３】 配列番号２によって示されるアミノ酸番
号 192から 383までの非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスＥＮＶ抗
原の全部又は一部をコードするＤＮＡ断片。 - 【請求項４】 配列番号２によって示されるアミノ酸番
号 384から 810までの非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスＮＳ１抗
原の全部又は一部をコードするＤＮＡ断片。 - 【請求項５】 配列番号２によって示されるアミノ酸番
号 811から1051までの非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスＮＳ２抗
原の全部又は一部をコードするＤＮＡ断片。 - 【請求項６】 非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原の配列番号
３によって示されるアミノ酸配列の全部又は一部をコー
ドするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片。 - 【請求項７】 配列番号３によって示される全ヌクレオ
チドから成るＤＮＡ断片。 - 【請求項８】 配列番号３によって示されるアミノ酸番
号 192から 383までの非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスＥＮＶ抗
原の全部又は一部をコードするＤＮＡ断片。 - 【請求項９】 配列番号３によって示されるアミノ酸番
号 384から 810までの非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスＮＳ１抗
原の全部又は一部をコードするＤＮＡ断片。 - 【請求項１０】 配列番号３によって示されるアミノ酸
番号 811から1031までの非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスＮＳ２
抗原の全部又は一部をコードするＤＮＡ断片。 - 【請求項１１】 請求項１〜１０のいずれか一項に記載
のＤＮＡ断片をプロモーターの下流に存在するベクター
内のクローニング部位に導入して得られる発現ベクタ
ー。 - 【請求項１２】 前記ベクターがウイルスである請求項
１１記載の発現ベクター。 - 【請求項１３】 宿主に、請求項１１又は１２に記載の
発現ベクターを導入して得られる形質転換体。 - 【請求項１４】 前記宿主が動物細胞である請求項１３
記載の形質転換体。 - 【請求項１５】 配列番号２又は３によって示される非
Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原のアミノ酸配列の全部又は一
部を含む組換え（ポリ）ペプチドの製造方法であって、 請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＤＮＡ断片を適
当な宿主細胞内で発現させ得る複製可能な発現ベクター
を構築する工程、 前記発現ベクターを宿主細胞内に導入して形質転換体を
得る工程、 前記ＤＮＡ断片を発現させ得る条件下で前記形質転換体
を培養して前記組換え（ポリ）ペプチドを発現させる工
程、及び前記組換え（ポリ）ペプチドを回収する工程を
包含する方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4088140A JPH06141870A (ja) | 1992-03-12 | 1992-03-12 | 非ａ非ｂ型肝炎ウイルス抗原をコードするｄｎａ断片 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4088140A JPH06141870A (ja) | 1992-03-12 | 1992-03-12 | 非ａ非ｂ型肝炎ウイルス抗原をコードするｄｎａ断片 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06141870A true JPH06141870A (ja) | 1994-05-24 |
Family
ID=13934634
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4088140A Pending JPH06141870A (ja) | 1992-03-12 | 1992-03-12 | 非ａ非ｂ型肝炎ウイルス抗原をコードするｄｎａ断片 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06141870A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996010997A1 (en) * | 1994-10-05 | 1996-04-18 | Apollon, Inc. | Hepatitis virus vaccines |
| US6025341A (en) * | 1995-06-06 | 2000-02-15 | The General Hospital Corporation | Chimeric hepatitis B/hepatitis C virus vaccine |
| US6235888B1 (en) * | 1994-10-05 | 2001-05-22 | The General Hospital Corporation | Hepatitis C virus vaccine |
| WO2002072126A3 (de) * | 2001-03-14 | 2002-11-14 | Transmit Technologietransfer | Erfindung betreffend hcv-erkrankungen |
-
1992
- 1992-03-12 JP JP4088140A patent/JPH06141870A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996010997A1 (en) * | 1994-10-05 | 1996-04-18 | Apollon, Inc. | Hepatitis virus vaccines |
| US6235888B1 (en) * | 1994-10-05 | 2001-05-22 | The General Hospital Corporation | Hepatitis C virus vaccine |
| US6025341A (en) * | 1995-06-06 | 2000-02-15 | The General Hospital Corporation | Chimeric hepatitis B/hepatitis C virus vaccine |
| WO2002072126A3 (de) * | 2001-03-14 | 2002-11-14 | Transmit Technologietransfer | Erfindung betreffend hcv-erkrankungen |
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