FI105046B - Menetelmä terapeuttisesti aktiivisen polypeptidin valmistamiseksi, rekombinanttivektori ja isäntäsolu - Google Patents

Description

105046

MENETELMÄ TERAPEUTTISESTI AKTIIVISEN POLYPEPTIDIN VALMISTAMISEKSI, REKOMBINANTTIVEKTORI JA ISÄNTÄSOLU

Keksintö koskee materiaaleja hepatitisvirustartunnan, joka ei ole tyyppiä A tai B s (NANBV), levinneisyyden selvittämiseksi. Tarkemmin se koskee menetelmää polypeptidi-en, jotka ovat peräisin NANBVin etiologisen aineen, hepatitis-C-viruksen (HCV) genomista, valmistamiseksi. Nämä reagenssit ovat hyödyllisiä HCV:n ja sen infektion seulomisaineina ja taudin vastaisina suoja-aineina.

10 Selityksessä viitataan seuraaviin julkaisuihin Ban· et ai. (1986), Biotechniques 4:428.

Botstein (1979), Gene 8:17.

Brinton, M.A. (1986), julkaisussa THE VIRUSES: THE TOGAVIRIDAE AND FLAVI- RIDAE (Saijan toimittaja Fraenkel-Conrat and Wagner, painosten toimittaja Schlesinger n and Schlesinger, Plenum Press), ss. 327-374.

Broach (1981) julkaisussa Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Vol.l, s.445,

Cold Spring Harbor Press.

Broach et al. (1983), Meth. Enz. 101:307.

Chang et al. (1977), Nature 198:1056.

., 20 Chirgwin et al. (1979), Biochemistry 18:5294.

» · · • « · ;‘.’t Chomczynski and Sacchi (1987), Analytical Biochemistry 162:156.

« « ,...: Clewell et al. (1969), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 62:1159.

• *

Clewell (1972), J. Bacteriol. 110:667.

• ·

Cohen (1972), Proc. Natl. Acad. Sci. USA £9:2110.

« 25 Cousens et al. (1987), Gene 61:265.

: De Boer et al. (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 292:128.

* φ·;*§ · Dreesman et al. (1985), J. Infect. Disease 151:761.

*. f·.: Feinstone, S.M. and Hoofhagle, J.H. (1984), New Engl. J. Med. 3JJ.: 185.

•:: Fields & Knipe (1986), FUNDAMENTAL VIROLOGY (Raven Press, N.Y.) 30 Fiers et al. (1978), Nature 273:113.

:.*· Gerety, R.J. et al. julkaisussa VIRAL HEPATITIS AND LIVER DISEASE (Vyas, B.N.,

Dienstag, J.L., and Hoofhagle, J.H., toim., Grune and Stratton, Inc., 1984) ss. 23-47.

2 105046

Goeddel et ai. (1980), Nucleic Acids Res. 8:4057.

Graham and Van der Eb (1978), Virology 52:546.

Grunstein and Hogness (1975), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73:3961.

Grych et al. (1985), Nature 316:74. s Gubler and Hoffman (1983), Gene 25:263.

Hammerling et al. (1981), MONOCLONAL ANTIBODIES AND T-CELL HYBRIDO-MAS.

Han (1987), Biochemistry 26:1617.

Helfman (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:31. ίο Hess et al. (1968), J. Adv. Enzyme Reg. 7:149.

Hinnen et al. (1978), Proc. Natl. Acad. Sci. 75:1929.

Hitzeman et al. (1980), J. Biol. Chem. 255:2073.

Holland et al. (1978), Biochemistry 17:4900.

Holland (1981), J. Biol. Chem. 256:1385. π Houghton et al. (1981), Nucleic Acids Res. £:247.

Hunyh, T.V. et al. (1985), julkaisussa DNA CLONING TECHNIQUES; A PRACTICAL APPROACH (D. Glover, toim., IRL Press, Oxford, U.K.), ss. 49-78.

Immun. Rev. (1982) 62:185.

·. : Iwarson (1987), British Medical J. 295:946.

= :V: 20 Kenneth etal. (1980), MONOCLONAL ANTIBODIES.

ίV Kyte and Doolittle (1982), J. Mol. Biol. 157:105-132.

’ ' Laemmli (1970), Nature 227,680.

• · *·]·* Lee et al. (1988). Science 239:1288.

m · ·

Maniatis, T. et al. (1982), MOLECULAR CLONING; A LABORATORY MANUAL

^... % 25 (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y.).

• · ·

Mayer and Walker, toim. (1987), IMMUNOCHEMICAL METHODS IN CELL AND

• · « MOLECULAR BIOLOGY (Academic Press, London).

• · · • · · ' Maxam et al. (1980), Methods in Enzymology 65:499.

MacNamaraetal. (1984), Science226:1325.

I I

'' *. 30 Messing et al. (1981), Nucleic Acids Res. 9:309.

Messing (1983), Methods in Enzymology 101:20-37.

METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press).

3 105046

Michelle et ai., Int. Symposium on Viral Hepatitis.

Monath (1986) julkaisussa THE VIRUSES: THE TOGAVIRIDAE AND FLAVTRIDAE (Sagan toimittaja Fraenkel-Conrat and Wagner, painosten toimittaja Schlesinger and - Schlesinger, Plenum Press), ss. 375-440.

s Nagahuma et ai. (1984), Anal. Biochem. 141:74.

Neurath et ai. (1984), Science 224:392.

Nisonoff et ai. (1981), Clin. Immunol. Immunopathol. 21:397-406.

Overby, L.R. (1985), Curr. Hepatol. 5:49.

Overby, L.R. (1986), Curr. Hepatol. 6:65. ιο Overby, L.R. (1987), Curr. Hepatol. 7:35.

Peleg (1969), Nature 221:193.

Pferrerkom and Shapiro (1974), julkaisussa COMPREHENSIVE VIROLOGY, Vol.2 (Fraenkel-Conrat & Wagner, toim., Plenum, N.Y.) ss. 171-230.

Prince, A.M. (1983), Annu. Rev. Microbiol. 37:217. is Rice et ai. (1985), Science 229:726.

Rice et ai. (1986) julkaisussa THE VIRUSES: THE TOGAVIRIDAE AND FLAVIRIDAE (Saijan toimittaja Fraenkel-Conrat and Wagner, painosten toimittaja Schlesinger and Schlesinger, Plenum Press), ss. 279-328.

'· · Roehrig (1986) julkaisussa THE VIRUSES: THE TOGAVIRIDAE AND FLAVIRIDAE

20 (Saijan toimittaja Fraenkel-Conrat and Wagner, painosten toimittaja Schlesinger and I · · ·’ Schlesinger, Plenum Press).

Sadler et ai. (1980), Gene 8,279.

• · ·

Saiki et ai. (1986), Nature 324:163.

• · · „ ’ Saiki et ai. (1988), Science 239:487.

25 Sanger et ai. (1977), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74:5463.

• · < v Schlesinger et ai. (1986), J. Virol. 60:1153.

/ . Schreier, M., et ai. (1980), HYBRIDOMA TECHNIQUES.

• ·

Scopes (1984), PROTEIN PURIFICATION, PRINCIPLES AND PRACTICE, SECOND

.;. EDITION (Springer-Verlag, N.Y.).

!'/. io Shimatake et al. (1981), Nature 292:128.

« « ·

Steimer et al. (1986), J.Virol. 58:9.

4 105046

Stollar (1980), julkaisussa THE TOGA VIRUSES (R.W. Schlesinger, toim., Academic Press, N.Y.), ss. 584-622.

Sumiyoshi et al. (1987), Virology 161:497.

Taylor et al. (1976), Biochem. Biophys. Acta 442:324.

5 Towbin et al. (1979), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4350.

Tsu and Herzenberg (1980), julkaisussa SELECTED METHODS IN CELLULAR IMMUNOLOGY (W.H. Freeman and Co.) ss. 373-391.

Vytdehaag et al. (1985), J. Immunol. 134:1225.

Valenzuela, P., et al. (1982), Nature 298:344.

to Valenzuela, P., et al. (1984), julkaisussa HEPATITIS B (Millman, I., et al., toim., Plenum Press) ss. 225-236.

Warner (1984), DNA 3:401.

Wu and Grossman (1987), Methods in Enzymology, Vol. 154, RECOMBINANT DNA,

Part E, is. Wu (1987), Methods in Enzymology, Vol. 155, RECOMBINANT DNA, osa F.

Zoller (1982), Nucleic Acids Res. 10:6487.

Viitataan myös seuraaviin patentteihin: ' '"· EP-julkaisu No. 318,216; PCT-julkaisu No. WO 89/04669; US-patentit Not 4,341,761; :X: 20 4,399,121; 4,427,783; 4,444,887; 4,466,917; 4,472,500; 4,491,632 ja 4,493,890.

• · I

I « · • · » · * / Hepatitis, joka ei ole tyyppiä A eikä B (NANBH) on tarttuva tauti tai tautiperhe, jonka us- • · · » · · kotaan olevan viruksen aiheuttama ja joka on erotettavissa muista viruksen aiheuttamista * » * • · · maksasairauksien muodoista, mukaanlukien sen, jonka aiheuttavat tunnetut hepatitis- a» .···. 25 virukset, s.o. hepatitis-A-virus (HAV), hepatitis-B-virus (HBV) ja deltahepatitisvirus • · · (HDV), samoin kuin cytomegaloviruksen (CMV) ja Epstein-Barr-viruksen (EBV) aiheut- . tamat hepatitikset. NANBH tunnistettiin ensin verensiirtopotilaissa. Tarttuminen ihmisestä • ·« ,,.,: simpanssiin ja massatartunta simpanssien joukossa antoivat todisteita, että NANBH:n syy • · . . on tarttuva infektioaiheuttaj a tai -aiheuttaj at.

« · « · X': n • · · • ·

Epidemiologisista todisteista voidaan tehdä ehdotelmia, että voi olla kolmentyyppistä NANBH:a: vedessä syntynyt epideeminen tyyppi; vereen tai neulaan liittyvä tyyppi; ja 5 105046 satunnaisesti esiintyvä (yhteisön hankkima = community acquired) tyyppi. Kuitenkin niiden aineiden lukumäärä, jotka voivat aiheuttaa NANBH:n on tuntematon.

Kliininen NANBH:n diagnoosi ja tunnistus on tehty etupäässä sulkemalla pois muut vi-5 rusmerkkiaineet. Niiden menetelmien joukossa, joita käytetään havaitsemaan oletettuja ς NANBV-antigeenejä ja vasta-aineita ovat agargeelidiffuusio, vastaimmunoeletroforeesi, immunofluoresenssimikroskopia, immunoelektronimikroskopia, radioimmunologinen analyysi ja entsyymiin kytketty immunosorbenttianalyysi. Kuitenkaan mikään näistä analyyseistä ei ole osoittautunut olevan riittävän herkkä, spesifinen ja toistettava käytettäväksi ίο NANBH:n diagnostisena kokeena.

Aikaisemmin ei ole ollut selvyyttä eikä sopimusta NANBH.n aiheuttajiin liittyvien anti-geeni-vasta-ainejäijestelmien identtisyyden tai spesifisyyden suhteen. Tämä johtuu ainakin osittain siitä, että henkilöillä on ennalta tai samanaikaisesti NANBVrn kanssa saatu HBV-15 tartunta ja liukoisten ja partikkelimuotoisten HBV:een liittyvien antigeenien tunnetusta monimutkaisuudesta ja myös HBV:n DNA:n integraatiosta maksasolujen genomiin. Lisäksi on mahdollisuus, että NANBH.n aiheuttaa useampi kuin yksi infektoiva aine, minkä lisäksi on mahdollista, että NANBH on diagnosoitu väärin. Edelleen on epäselvää, mitä ’· · serologiset analyysit havaitsevat NANBH-potilaiden seerumista. On väitetty, että agargee- m » 20 Iidiffiiusio-ja vastaimmunoelektroforeesianalyysit havaitsevat autoimmuunivasteita tai « · · ··« t ... ··· .*·· ·' * epäspesifisiä proteiinien keskinäisiä reaktioita, joita esiintyy seeruminäytteiden välillä ja i | J että ne eivät edusta spesifisiä NANBV-antigeeni-vasta-ainereaktioita. Immunofluoresenssi • · · ja entsyymiin kytketty immunosorbentti ja radioimmunologiset analyysit näyttävät havait- • · • a » sevan alhaisia reumatekijän kaltaisen materiaalin tasoja, jota on tavantakaa läsnä sellaisten

S

25 potilaiden seerumissa, joilla on NANBH, samoin kuin myös potilaissa, joilla on muita i i · t ϊ maksasairauksia tai maksaan liittymättömiä sairauksia. Jonkin verran havaittua reaktii- . visuutta voi edustaa vasta-ainetta isännän määrittämille sytoplasmisille antigeeneille.

• n

• V

f • «

On olemassa lukuisia NANBV-ehdokkaita. Katso esimerkiksi selontekoja Prince (1983), « · 30 Feinstone ja Hoofnagle (1984) ja Overby (1985, 1986, 1987) ja Iwarsonin (1987) artikke- • · · lia. Kuitenkaan ei ole mitään todistetta, että mikään näistä ehdokkaista edustaisi NANBV:n etiologista aiheuttajaa.

6 105046

Vaatimus herkistä, spesifisistä menetelmistä NANBV:n kantajien ja NANBV:n saastuttaman veren tai verituotteiden seulomiseksi tai tunnistamiseksi on huomattava. Verensiirron jälkeinen hepatitis (Post Transfusion Hepatitits PTH) esiintyy noin 10 %:lla verensiirron s saaneista potilaista ja NANBH.n aiheuttamia näistä tapauksista on jopa 90 %. Pääongelma tässä taudissa on sen tavanomainen eteneminen kroonisiksi maksavaurioiksi (25-55 %).

Potilashuolto sekä NANBH:n tarttumisen estäminen veren tai verituotteiden tai läheisen henkilökohtaisen kontaktin välityksellä vaatii luotettavia diagnostisia ja ennustavia väli-lo neitä NANBV:hen liittyvien nukleiinihappojen, antigeenien ja vasta-aineiden havaitsemiseksi. Lisäksi on tarpeita tehokkaiden rokotteiden ja immunoterapeuttisten terapeuttisten aineiden aikaansaamiseksi taudin estämiseksi ja/tai hoitamiseksi.

Hakija on keksinyt uuden viruksen, hepatitis-C-virusken (HCV), jonka on osoitettu olevan is pääasiallinen veren kautta syntyneen NANBV:n (BB-NANBH) etiologinen aiheuttaja. Hakijan alkuperäinen työ sisältäen prototyyppi-HCV-eristeen, CDC/HCV1 (myös kutsutaan HCVl:ksi), osittaisen genomisekvenssin, on kuvattu EP-julkaisussa No. 318,216 (julkaistu 31.05.1989) ja PCT-julkaisussa No. WO 89/04669 (julkaistu 01.06.1989). Näi- • ; den patenttihakemusten ja myös minkä tahansa vastaavan kansallisen hakemuksen sisältö • · 20 liitetään tähän viitteeksi. Nämä hakemukset opettavat mm. yhdistelmä-DNA-menetelmiä : ·' HCV-sekvenssien kloonaamiseksi ja ekspressoimiseksi, HCV-polypeptidejä, HCV-im- munodiagnostisia tekniikoita, HCV-koettimien diagnostisia tekniikoita, HCV.n vastaisia • · · (Il *,* vasta-aineita ja menetelmiä uusien HCV-sekvenssien eristämiseksi, sisältäen uusien HCV- ( I I • · « eristeiden sekvenssejä.

... 25 I * · » » » .·;·. Tämä keksintö perustuu osittain uusiin HCV-sekvensseihin ja polypeptideihin, joita ei ole / .’ . esitetty EP-julkaisussa No. 318,216 tai PCT-julkaisussa No. WO 89/04669. Keksintö mah- • · · dollistaa näiden uusien sekvenssien ja polypeptidien käytön mm. immunodiagnostiikassa, • « koetindiagnostiikassa, HCV:n vastaisessa vasta-aineiden tuotannossa, PCR-teknologiassa * · 30 ja yhdistelmä-DNA-teknologiassa. Keksintö mahdollistaa myös uudet immunologiset me-^ netelmät, jotka perustuvat tässä esitettyjen HCV-polypeptidien immunogeenisyyteen. Täs- j sä vaaditulla uudella asialla, vaikka onkin kehitetty käyttäen tekniikoita, jotka on kuvattu 7 105046 esimerkiksi EP-julkaisussa No. 318,216, on prioriteettipäivä, mikä on aikaisempi kuin tuon tai minkään sen vastineen julkaiseminen. Täten keksintö aikaansaa uusia koostumuksia ja menetelmiä, jotka ovat hyödyllisiä HCV-antigeenien ja -vasta-aineiden näytteiden seulomisessa ja hyödyllisiä HCV-infektioiden hoidossa. s * Keksinnön kohde on menetelmä valmistaa puhdistettu polypeptidi, mikä käsittää epitoopin, joka on kooditettu HCV:n cDNA:ssa, jossa HCV.n cDNA on sekvenssi, jota on merkitty nukleotidinumeroilla -319 - 1348 tai 8659 - 8866 kuviossa 17.

ίο Muu keksinnön kohde on menetelmä peptidin valmistamiseksi, mikä käsittää HCV-epitoo-pin, jossa peptidillä on kaava AAx-AAy.

missä x ja y merkitsevät aminohapponumeroita, jotka on esitetty kuviossa 17 ja jossa peptidi on valittu ryhmästä, mikä käsittää is AA1-AA50; AA1-AA84; AA9-AA177; AA50-AA100; AA40-AA90; AA65-AA75; AA99-AA120; AA95-AA110; AA100-AA150; AA150-AA200; AA200-AA250; AA220-AA240; AA245-AA265; AA250-AA300; AA290-AA330; AA290-AA305; AA300-AA350; AA310-AA330; AA350-AA400; AA405-AA495; AA400-AA450; ' · AA437-AA582; AA450-AA500; AA475-AA495; AA500-AA550; AA511-AA690; 20 AA515-AA550; AA550-AA600; AA550-AA625; AA575-AA605; AA600-AA650; *·; AA600-AA625; AA635-AA665; AA650-AA700; AA645-AA680; AA700-AA750; 1 .* AA700-AA725; AA725-AA775; AA770-AA790; AA750-AA800; AA800-AA815; • · * AA850-AA875; AA800-AA850; AA920-AA990; AA850-AA900; AA920-AA945; i i « AA940-AA965; AA950-AA1000; AA1000-AA1060; AA1000-AA1050; AA1025-2s AA1040; AA1075-AA1175; AA1050-AA1200; AA 1070-AA 1100; AA1100- • · # 9 ;.·;·· AA1140; ΑΛΙ 192-AA1457; AA1195-AA 1250; AA1200-AA1225; AA1225- AA1250; AA1250-AA1300; AA1260-AA1310; AA1260-AA1280; AA1266- • · f ’ AA1428; AA1300-AA1350; AA1310-AA1340; AA1345-AA1405; AA1350- AA 1400; AA1365-AA1380; AA1380-AA1405; AA1400-AA1450; AA1450-

I I

30 AA1500; AA1475-AA1515; AA1475-AA1500; AA1500-AA1550; AA1515- * AA1550; AA1550-AA1600; AA1570-AA1590; AA1595-AA1610; AA1590- AA1650; AA1610-AA1645; AA1650-AA1690; AA1685-AA1770; AA1690- 8 105046 AA1720; AA1720-AA1745; AA1745-AA1770; AA1750-AA1800; AA1775- AA1810; AA1795-AA1850; AA1850-AA1900; AA1900-AA1950; AA1900- AA1920; AA1916-AA2021; AA1920-AA1940; AA1949-AA2124; AA1950- AA2000; AA1950-AA1985; AA2000-AA2050; AA2020-AA2045; AA2045- j AA2100; AA2045-AA2070; AA2054-AA2223; AA2070-AA2100; AA2100- AA2150; AA2150-AA2200; AA2200-AA2325; AA2250-AA2330; AA2265- AA2280; AA2280-AA2290; AA2287-AA2385; AA2300-AA2350; AA2350- AA2400; AA2345-AA2415; AA2345-AA2375; AA2348-AA2464; AA2370- AA2410; AA2400-AA2450; AA2400-AA2425; AA2415-AA2450; AA2445- io AA2500; AA2371-AA2502; AA2500-AA2550; AA2505-AA2540; AA2550- AA2600; AA2560-AA2580; AA2600-AA2650; AA2620-AA2650; AA2650- AA2700; AA2655-AA2670; AA2670-AA2700; AA2700-AA2750; AA2750- AA2800; AA2755-AA2780; AA2780-AA2830; AA2785-AA2810; AA2796- AA2886; AA2810-AA2825; AA2800-AA2850; AA2850-AA2900; AA2900- 15 AA2950; AA2910-AA2930; AA2925-AA2950; ja AA2945-loppuun (C'-pää).

Kuvio 1 esittää HCV:n cDNA:n sekvenssiä kloonissa 12f ja siihen kooditettuja aminohappoja.

•:··: 2o v.: Kuvio 2 esittää HCV:n cDNA:n sekvenssiä kloonissa k9-l ja siihen kooditettuja amino- a · : happoja.

• · • · • · · \,mm Kuvio 3 esittää HCV:n cDNArn sekvenssiä kloonissa 15e ja siihen kooditettuja aminohap-

« « · -B

9 * · 25 poja.

··· / taa ' • · · «

Kuvio 4 esittää HCV:n cDNA:n nukleotidisekvenssiä kloonissa 13i ja siihen kooditettuja • · · aminohappoja ja sekvenssejä, jotka menevät päällekkäin kloonin 12f kanssa.

' «a * a # ia 30 Kuvio 5 esittää HCV:n cDNA:n nukleotidisekvenssiä kloonissa 26j ja siihen kooditettuja « · • · aminohappoja ja sekvenssejä, jotka menevät päällekkäin kloonin 13i kanssa.

• «· « · 9 105046

Kuvio 6 esittää HCV:n cDNArn nukleotidisekvenssiä kloonissa CA59a ja siihen koostettuja aminohappoja ja sekvenssejä, jotka menevät päällekkäin kloonien 26j ja K9-1 kanssa.

. Kuvio 7 esittää HCV:n cDNA:n nukleotidisekvenssiä kloonissa CA84a ja siihen kooditet- 5 tuja aminohappoja ja sekvenssejä, jotka menevät päällekkäin kloonin CA59a kanssa.

Kuvio 8 esittää HCV:n cDNA:n nukleotidisekvenssiä kloonissa CAI 56e ja siihen kooditet-tuja aminohappoja ja sekvenssejä, jotka menevät päällekkäin kloonin CA84a kanssa.

Kuvio 9 esittää HCV:n cDNA:n nukleotidisekvenssiä kloonissa CAI67b ja siihen kooditet-lo tuja aminohappoja ja sekvenssejä, jotka menevät päällekkäin kloonin CAI 56e kanssa.

Kuvio 10 esittää HCV:n cDNA:n nukleotidisekvenssiä kloonissa CA216a ja siihen koodi-tettuja aminohappoja ja sekvenssejä, jotka menevät päällekkäin kloonin CAI 67b kanssa.

is Kuvio 11 esittää HCV.n cDNA.n nukleotidisekvenssiä kloonissa CA290a ja siihen koodi-tettuja aminohappoja ja päällekkäisyyttä kloonin CA216a kanssa.

Kuvio 12 esittää HCV:n cDNA:n nukleotidisekvenssiä kloonissa ag30a ja päällekkäin menemistä kloonin CA290a kanssa.

•:": 20 v.· Kuvio 13 esittää HCV:n cDNA:n nukleotidisekvenssiä kloonissa CA205a ja päällekkäin • · · • ’ .’· menemistä HCV:n cDNA:n sekvenssin kanssa kloonissa CA290a.

• · • · • « ’·];* Kuvio 14 esittää HCV:n cDNA:n nukleotidisekvenssiä kloonissa 18g ja päällekkäin me-

Sr · * * * * ’ 25 nemistä HCV:n cDNA:n sekvenssin kanssa kloonissa ag30a.

- · ·· v » · » • · t ,···. Kuvio 15 esittää HCV:n cDNA:n nukleotidisekvenssiä kloonissa 16jh, siihen kooditettuja i i i , aminohappoja ja nukleotidien päällekkäisyyttä HCV:n cDNA:n sekvenssin kanssa kloonis- sa ^e- 1 « JO • * * · t • * • · * • ♦ · • · 10 105046

Kuvio 16 esittää HCV:n cDNArn ORF:n, joka cDNA on peräisin klooneista pii4a, CA167b, CA156e, CA84a, CA59a, K9-1, 12f, 14i, 11b, 7f, 7e, 8h, 33c, 40b, 37b, 35, 36, 81, 32, 33b, 25c, 14c, 8f, 33f, 33g, 39c, 35f, 19g, 26g ja 15e.

g 5 Kuvio 17 esittää kootun HCV:n cDNA-sekvenssin, joka on peräisin yllämainituista klooneista, sense-säikeen ja kootun HCV:n cDNA-sekvenssin, joka on julkaistu EP-julkaisussa No. 318,216. Kloonit, joista sekvenssi on peräisin, ovat bll4a, 18g, ag30a, CA205a, CA290a, CA216a, pil4a, CA167b, CA156e, CA84a, CA59a, K9-1 (jota kutsutaan myös nimellä k9-l), 26j, 13i, 12f, 14i, 11b, 7f, 7e, 8h, 33c, 40b, 37b, 35, 36, 81, 32, 33b, 25c, /o 14c, 8f, 33f, 33g, 39c, 35f, 19g, 26g, 15e, b5a ja 16jh. Kuviossa kolme viivaa sekvenssin päällä merkitsee oletetun initiaattorimetioniinikodonin asemaa. Kuviossa on myös esitetty yhdistelmä-HCV.n cDNA.ssa kooditetun oletetun polyproteiinin aminohapposekvenssi.

Kuvio 18 on kaavio immunologisesta pesäkkeenseulontamenetelmästä, jota käytetään anti-15 geenin kartoitustutkimuksissa.

Kuvio 19 esittää HCV:ssä ja Länsi-Niilin viruksessa kooditettujen polyproteiinien hydro-fobisuusprofiilit.

' ” “ 20 Kuvio 20 on hydrofrilisyys/hydrofobisuusprofrilin seuranta ja oletetun HCV-polyproteiinin ::: antigeeni-indeksin seuranta.

• ·

Kuvio 21 esittää säilyneet yhteislineaariset peptidit HCV:ssä ja Flaviviruksissa.

• · t t i < • « »*· • *

I I I

25 I. Määritelmät • · · j • · · • » ·

Termi "hepatitis-C-virus" on varattu alalla tähän asti tuntemattomalle NANBV:n etiologi- I I · * , selle aiheuttajalle. Niinpä tässä käytettynä "hepatitis-C-virus" (HCV) viittaa NANBV:n « · syynä olevaan aiheuttajaan, johon aikaisemmin viitattiin NANBV:nä ja/tai BB-30 NANBV:nä. Termejä HCV, NANBV ja BB-NANBV käytetään tässä keskenään vaih-dellen. Tämän terminologian jatkona kutsutaan HCV:n aiheuttamaa sairautta, jota aikai- „ 105046 semmin kutsuttiin NANB-hepatitikseksi (NANBH), hepatitis-C:ksi. Termejä NANBH ja hepatitis-C käytetään tässä keskenään vaihdellen.

Termi "HCV" merkitsee tässä käytettynä viruslajeja, joista patogeeniset kannat aiheuttavat . NANBH:n ja siitä johdettuja heikennettyjä kantoja tai puutteellisia häiritseviä partikkeleita.

' s Kuten esitetään alla, HCV-genomi muodostuu RNA:sta. Tiedetään, että RNA:ta sisältävillä ' viruksilla on suhteellisen korkeat spontaanien mutaatioiden nopeudet, s.o. on raportoitu suuruusluokkaa 10*3 - 10^ nukleotidia kohti olevista nopeuksista (Fields & Knipe (1986)). Siksi alla kuvatun HCV-lajien joukossa on monia kantoja, jotka voivat olla virulentteja tai avirulentteja. Tässä kuvatut koostumukset ja menetelmät tekevät mahdolliseksi eri HCV-lo kantojen tai eristeiden lisääntymisen, määrittämisen, osoittamisen ja eristämisen. Edelleen tässä esitetty sallii diagnostisten välineiden ja rokotteiden valmistamisen eri kantoja varten ja se sallii myös koostumukset ja menetelmät, joilla on käyttöä seulontamenetelmissä an-tiviraalisia aineita varten farmakologiseen käyttöön siinä, että ne estävät HCV:n replikaati-on. is .

Tässä annettu tieto, vaikkakin se on peräisin yhdestä HCV-kannasta tai eristeestä, johon tästä lähtien viitataan nimellä CDC/HCV1 (jota myös kutsutaan HCVl:ksi), on riittävä virustaksonomeille salliakseen muidenkin kantojen identifioinnin, jotka ovat lajin sisällä. Tässä annettu tieto antaa uskon, että HCV on Flavi-tyyppinen virus. Flavivirus-·: : 20 partikkeleiden morfologia ja koostumus ovat tunnettuja ja niistä keskustellaan Brintonin v.: (1986) julkaisussa. Yleisesti morfologian suhteen, Flavivirukset sisältävät keskeisen ydin- : kapsidin, jota ympäröi kaksikerroksinen lipidi. Virionit ovat pallomaisia ja niiden halkaisi- * ja on noin 40-50 nm. Niiden ytimet ovat noin 25-30 nm halkaisijaltaan. Pitkin virionikuo- • • · « ren ulkopintaa on ulokkeita, jotka ovat noin 5-10 nm pitkiä ja niiden päässä olevat nupit *♦ « « • · · ' 2s ovat noin 2 nm halkaisijaltaan.

• · · • ♦ * • · · HCV:n en kantojen ja eristeiden odotetaan sisältävän vaihteluita aminohapoissa ja nukle- • · · . iinihapoissa verrattuna prototyyppieristeeseen, HCVl:een. Monien eristeiden odotetaan ' _ osoittavan suurta (s.o. suurempaa kuin 40 %) homologiaa kokonaisaminohapposekvenssis- 30 sä verrattuna HCVl:een. Kuitenkin voidaan myös havaita muita sitä vähäisemmän homo-logian HCV-eristeitä. Nämä voitaisiin määrittää HCV-kantoina eri kriteereiden mukaan, kuten ORF:nä, jossa on noin 9000 nukleotidia - noin 12000 nukleotidia, koodittaen poly- 12 105046 proteiinia, joka on kooltaan samanlainen kuin HCV1, kooditettuna polyproteiinina, jolla on samanlainen hydrofobinen ja antigeeninen luonne kuin HCVl:llä, ja yhteislineaaristen peptidisekvenssien läsnäolona, jotka säilyvät HCVl:n kanssa. Lisäksi genomi olisi posi-tiivisrihmaista RNA:ta.

5 HCV koodittaa ainakin yhtä epitooppia, joka on immunologisesti identifioitavissa sen epi-toopin kanssa HCV-genomissa, josta tässä kuvatut cDNA:t ovat peräisin; mielellään epi-tooppi sisältyy tässä kuvattuun aminohapposekvenssiin. Epitooppi on ainutkertainen HCV:lie, kun sitä verrataan muihin tunnettuihin Flaviviruksiin. Epitoopin ainutkertaisuus ίο voidaan määrittää sen immunologisella reaktiivisuudella HCV:n vastaisten vasta-aineiden kanssa ja immunologisen reaktivisuuden puuttumisena muiden Flavi viruslajien vastaisten vasta-aineiden kanssa. Menetelmät immunologisen reaktiivisuuden määrittämiseksi ovat tunnettuja alalla, esimerkiksi radioimmunologinen analyysi, ELISA-analyysi, hemoagglu-tinaatio ja tässä annetaan lukuisia esimerkkejä sopivista tekniikoista analyysejä varten. li

Edellisen lisäksi voidaan käyttää seuraavia nukleiinihappohomologian ja aminohappoho-mologian parametrejä, joko yksin tai yhdistelmänä, kannan tai eristeen identifioimiseksi HCV:ksi. Koska HCV-kannat ja eristeet ovat kehityksensä suhteen sukulaisia, odotetaan että genomien kokonaishomologia nukleotiditasolla on todennäköisesti noin 40 % tai : : 2o enemmän, todennäköisesti noin 60 % tai enemmän ja vielä todennäköisemmin noin 80 % tai enemmän; ja lisäksi että niissä on vastaavia viereisiä ainakin noin 13 nukleotidin sek-; venssejä. Oletetun HCV-kannan genomisekvenssin ja CDC/CH1 cDNA-sekvenssin välinen vastaavuus voidaan määrittää alalla tunnetuilla tekniikoilla. Esimerkiksi ne voidaan määrit- • · • · · tää vertaamalla suoraan oletetun HCV:n polynukleotidin sekvenssitietoa ja tässä kuvattuja • · · * • · · a HCV:n cDNA-sekvenssejä. Esimerkiksi myös ne voidaan määrittää hybridisoimalla poly- .... nukleotideja olosuhteissa, jotka muodostavat stabiileja duplekseja homologisten alueiden • · · m välille (esimerkiksi niiden alueiden, joita käytettäisiin ennen Sj-pätkimistä), mitä seuraa » * ♦ . pätkiminen yksisäikeisillä erityisillä nukleaaseilla, mitä seuraa pätkittyjen fragmenttien • · koon määritys.

« I

io 1“. HCV-kantojen kehitykseen liittyvän suhteen takia voidaan oletetut HCV-kannat tai eristeet • ♦ · tunnistaa niiden polypeptiditasolla vallitsevan homologiansa avulla. Yleisesti HCV-kannat 13 105046 tai eristeet ovat enemmän kuin noin 40 % homologisia, todennäköisesti enemmän kuin noin 70 % homologisia ja vielä todennäköisemmin enemmän kuin noin SO % homologisia ja jotkut voivat olla enemmän kuin noin 90 % homologisia polypeptiditasolla. Tekniikat . aminohapposekvenssien homologian määrittämiseksi ovat tunnettuja alalla. Esimerkiksi s aminohapposekvenssi voidaan määrittää suoraan ja sitä voidaan verrata tässä annettuihin sekvensseihin. Vaihtoehtoisesti oletetun HCV:n genomimateriaalin nukleotidisekvenssi voidaan määrittää (tavallisesti cDNA-välituotteen kautta), siinä kooditettu aminohapposekvenssi voidaan määrittää ja vastaavia alueita voidaan verrata.

to Tässä käytettynä polynukleotidi, joka "on peräisin" annetusta sekvenssistä viittaa polynu-kleotidisekvenssiin, joka muodostuu arviolta ainakin noin 6 nukleotidin sekvenssistä, mieluummin ainakin noin 8 nukleotidin, vielä mieluummin ainakin noin 10-12 nukleotidin ja vieläkin mieluummin ainakin noin 15-20 nukleotidin sekvenssistä, mikä vastaa merkityn nukleotidisekvenssin aluetta. "Vastaaminen" merkitsee homologista tai komplementaarista n annetulle sekvenssille. Mieluummin alueen sekvenssi, josta polynukleotidi on peräisin, on homologinen tai komplementaarinen sekvenssille, joka on ainutkertainen HCV-genomille. Olipa sekvenssi ainutkertainen HCV-genomille tai ei, se voidaan määrittää tekniikoilla, jotka ovat alan ammattilaiselle tunnettuja. Esimerkiksi sekvenssiä voidaan verrata tietopankkien, esimerkiksi Genebank'in sekvensseihin sen määrittämiseksi, onko se läsnä infek-20 tottumattomassa isännässä tai muussa organismissa. Sekvenssiä voidaan myös verrata • · V.: muiden virusaineiden tunnettuihin sekvensseihin, sisältäen ne aineet, jotka ovat tunnettuja i hepatitiksen aiheuttajia, esimerkiksi HAV, HBV ja HDV ja muihin Flaviviridae-perheen ] ’ jäseniin. Vastaavuus tai vastaamattomuus johdetun sekvenssin ja muiden sekvenssien välil-

• · J

lä voidaan määrittää myös hydridisaation avulla sopivissa tiukoissa olosuhteissa. Hybri- »· · · • 25 disaatiotekniikat nukleiinihapposekvenSsien komplementaarisuuden määrittämiseksi ovat ;,···, tunnettuja alalla ja niistä keskustellaan alla. Katso myös esimerkiksi julkaisua Maniatis et • · · t ai. (1982). Lisäksi hybridisaatiolla muodostuneiden dupleksipolynukleotidien sopimatto-.' . muus voidaan määrittää tunnetuilla tekniikoilla, sisältäen esimerkiksi pätkimisen nukleaa- I · · silla, kuten S1 :llä, joka spesifisesti katkoo yksisäikeisiä alueita dupleksipolynukleotideissa. 30 Alueet, joista tyypillisiä DNA-sekvenssejä voidaan "johtaa", sisältävät, mutteivät ne ole niihin rajoitettuja, esimerkiksi alueet, jotka koodittavat erityisiä epitooppeja ja lisäksi ei- • « · transkriptoituja ja/tai ei-transloituja alueita.

14 105046

Johdettu polynukleotidi ei ole välttämättä fysikaalisesti peräisin esitetystä nukleotidisek-venssistä, mutta se voidaan luoda millä tahansa tavalla, sisältäen esimerkiksi kemiallisen synteesin tai DNA:n replikoimisen tai käänteisen transkription tai transkription. Lisäksi 5 niiden alueiden yhdistelmiä, jotka vastaavat annetun sekvenssin alueita, voidaan muokata tavoilla, joiden tiedetään alalla vastaavan aiottua käyttöä.

Samoin polypeptidi- tai aminohapposekvenssi, joka "on peräisin" annetusta nukleiinihap-posekvenssistä, viittaa polypeptidiin, jossa on aminohapposekvenssi, joka on identtinen sen ίο polypeptidin kanssa, joka on kooditettu sekvenssiin tai sen osaan, jossa osa käsittää ainakin 3-5 aminohappoa ja mieluummin ainakin 8-10 aminohappoa ja vielä mieluummin ainakin 11-15 aminohappoa tai joka on immunologisesti tunnistettavissa sekvenssiin kooditetun polypeptidin avulla.

n Yhdistelmä- tai johdettu polypeptidi ei ole välttämättä transloitu annetusta nukleiinihappo- sekvenssistä, esimerkiksi tässä kuvatusta HCV:n cDNA-sekvenssistä; se voi olla luotu millä tahansa tavalla, sisältäen esimerkiksi kemiallisen synteesin tai yhdistelmäekspressio- jäijestelmän ekspression tai eristämisen mutatoituneesta HCVistä. Yhdistelmä- tai johdettu polypeptidi voi sisältää yhden tai useamman aminohappojen tai ei-luonnon aminohappojen 20 analogin sekvenssissään. Menetelmät aminohappojen analogien panemiseksi sekvenssiin :.:. · ovat alalla tunnettuja. Se voi myös sisältää yhden tai useampia leimoja, jotka ovat tunnettu- • · · : ja alan ammattilaiselle.

• · • * • · · · *

Termi "yhdistelmäpolynukleotidi" käytettynä tässä merkitsee polynukleotidia, joka on pe- • « ' · • · « 25 räisin genomista, cDNAista, se on semiynteettistä tai synteettistä alkuperää, joka alkuperänsä tai manipulaa- • · · tionsa takia: (1) ei liity kaikkiin niihin polynukleotideihin tai niiden osaan, joihin se liittyy . luonnossa; (2) on kytketty polynukleotidiin, joka on muu kuin se, johon se on kytketty • « · ....; luonnossa tai (3) se ei esiinny luonnossa.

.1. 30

Termi "polynukleotidi" tässä käytettynä viittaa minkä tahansa pituisten nukleotidien, joko • · • · ribonukleotidien tai deoksiribonukleotidien, polymeeriseen muotoon. Tämä termi viittaa is 105046 vain molekyylin ensisijaiseen rakenteeseen. Täten tämä termi sisältää kaksi- ja yksisäikei-sen DNA:n ja lisäksi kaksi-ja yksisäikeisen RNA:n. Se sisältää myös tunnetut modifioidut tyypit, esimerkiksi leimat, jotka tunnetaan alalla, metylaation, "hännästämisen", yhden tai ♦ useamman luonnossa esiintyvän nukleotidin substituution analogilla, nukleotidien väliset s muunnokset, kuten esimerkiksi ne, joissa on varauksettomia liittymiä (esim. metyylifosfo- naatit, fosfotriesterit, fosfoamidaatit, karbamaatit jne.) ja varauksellisia liittymiä (esim. fosforotioaatit, fosforoditioaatit jne.) ne jotka sisältävät riippuvia puoliskoja, kuten esimerkiksi proteiinit (sisältäen esimerkiksi nukleaasit, toksiinit, vasta-aineet, signaalipeptidit, poly-L-lysiinin jne.), ne joissa on välikerrostajia (esim. akridiini, psoraleeni jne.), ne jotka ίο sisältävät kelaattoreita (esim. metallit, radioaktiiviset metallit, boori, hapettavat metallit jne.), ne jotka sisältävät alkyloivia aineita, ne joissa on muunnettuja liitoksia (esim. alfa-anomeeriset nukleiinihapot jne.) ja myös polynukleotidien modifioimattomat muodot.

Termi "puhdistettu viruspolynukleotidi" viittaa HCV-genomiin tai sen fragmenttiin, joka n on olennaisen vapaa, s.o. se sisältää vähemmän kuin noin 50 %, mieluummin vähemmän kuin noin 70 % ja vielä mieluummin vähemmän kuin noin 90 % polypeptidejä, joihin viruspolynukleotidi luonnollisesti liittyy. Tekniikat viruspolynukleotidien puhdistamiseksi viruspartikkeleista ovat tunnettuja alalla ja sisältävät esimerkiksi partikkelin katkaisun ka-otrooppisella aineella, polynukleotidien ja polypeptidien differentiaaliuuttamisen ja erot-·; ·: 20 tamisen ioninvaihtokromatografian, affiniteettikromatografian ja sedimentoimisen avulla V.’ tiheyden mukaan.

« < I

• ' * Termi "puhdistettu viruspolypeptidi" viittaa HCV-polypeptidiin tai sen fragmenttiin, joka /\\\ on olennaisen vapaa, s.o. se sisältää vähemmän kuin noin 50 %, mieluummin vähemmän • · · • · 1 ' 25 kuin noin 70 % ja vielä mieluummin vähemmän kuin noin 90 % solukomponentteja, joihin • viruspolypeptidi luonnollisesti liittyy. Tekniikat viruspolypeptidien puhdistamiseksi ovat ♦ · · alalla tunnettuja ja näiden tekniikoiden esimerkeistä keskustellaan alla. Termi "puhdistettu • · · , viruspolynukleotidi" viittaa HCV-genomiin tai sen fragmenttiin, joka on olennaisen vapaa, I < « I ♦ · ( i, , · s.o. se sisältää vähemmän kuin noin 20 %, mieluummin vähemmän kuin noin 50 % ja vielä • · 30 mieluummin vähemmän kuin noin 70 % polypeptidejä, joihin viruspolynukleotidi liittyy « · luonnossa. Viruspolynukleotidien puhdistustekniikat viruspartikkeleista ovat alalla tunnet- • * tuja ja sisältävät esimerkiksi partikkelin rikkomisen kaotrooppisella aineella ja polynu- 16 105046 kleotidien ja polypeptidien erottamisen ioninvaihtokromatografialla, affiniteettikromato-graiialla ja tiheyden mukaan sedimentoimalla.

"Yhdistelmäisäntäsolut", isäntäsolut", "solut", "solulinjat", "soluviljelmät" ja muut sellaiset 5 termit, jotka merkitsevät mikro-organismeja tai korkeampia eukarioottisolulinjoja, joita viljellään yksisoluisina kokonaisuuksina, viittaavat soluihin, joita voidaan käyttää tai on käytetty yhdistelmävektorin tai muun siirto-DNA:n vastaanottajana ja jotka sisältävät sen alkuperäisen solun perimän, johon siirros on tehty. Ymmärretään, että yksittäisen emäsolun perimä ei välttämättä ole täysin identtinen morfologialtaan tai genomiltaan tai ole täysi ίο DNA-komplementti alkuperäisenä vanhempana luonnon, onnettomuuden seurauksena tapahtuneen tai tarkoitetun mutaation seurauksena.

"Replikoni" (replicon) on mikä tahansa geneettinen elementti, esimerkiksi plasmidi, kromosomi, virus, kosmidi jne, joka käyttäytyy autonomisena polynukleotidin replikaation is yksikkönä solun sisällä; s.o. se pystyy replikoituinaan oman kontrollinsa alaisena.

"Vektori" on replikoni, johon on kiinnittynyt toinen polynukleotidisegmentti tuodakseen mukaan kiinnittyneen segmentin replikaation ja/tai ekspression.

20 "Säätösekvenssi" viittaa polynukleotidisekvensseihin, jotka ovat välttämättömiä niiden v.' koodaussekvenssien, joihin ne ovat sitoutuneet, ekspression aikaansaamiseen. Sellaisten • ·' säätösekvenssien luonne eroaa isäntäorganismin mukaan; prokariooteissa sellaiset säätö- sekvenssit sisältävät yleisesti promoottorin, ribosomin sidoskohdan ja terminaattoreita; • · · « · · eukariooteissa sellaiset säätösekvenssit sisältävät yleisesti promoottoreita, terminaattoreita • · t 25 ja joissakin tapauksissa vahvistajia. Termi "säätösekvenssit" on aiottu sisältämään mini-missään kaikki komponentit, joiden läsnäolo on välttämätöntä ekspressiota varten ja ne • · · voivat myös sisältää lisäkomponentteja, joiden läsnäolo on edullista, esimerkiksi joh- / ; tosekvenssejä.

· 30 "Toiminnallisesti kytketty" viittaa rinnakkainasetteluun, jossa niin kuvatut komponentit * · /. ’ *: ovat sellaisessa suhteessa, joka sallii niiden toiminnan aiotulla tavalla. Säätösekvenssi, joka • ♦ · • · on "toiminnallisesti kytketty" kooditussekvenssiin, on sidottu sellaisella tavalla, että koodi- 17 105046 tussekvenssin ekspressio saadaan aikaan olosuhteissa, jotka ovat yhteensopivia säätösek-venssien kanssa.

* "Avoin lukukehys" (Open reading frame ORF) on polynukleotidisekvenssin alue, joka 5 koodittaa polypeptidiä; tämä alue voi edustaa kooditussekvenssin osaa tai kokonaista kooditussekvenssiä.

"Kooditussekvenssi" on polynukleotidisekvenssi, joka on transkriptoitu mRNA:han ja/tai transloitu polypeptidiin, kun se on pantu sopivien säätävien sekvenssien kontrolliin. Koodi-lo tussekvenssin rajat määrittävät translaation aloittava kodoni 5'-päässä ja translaation lopettava kodoni 3'-päässä. Kooditussekvenssi voi sisältää, muttei se ole rajoitettu niihin, mRNA:n, cDNA:n ja yhdistelmäpolynukleotidisekvenssejä.

"Immunologisesti tunnistettavissa jollakin/jonakin" viittaa sellaisten epitooppien ja poly-15 peptidien läsnäoloon, jotka ovat myös läsnä ja ovat ainutkertaisia annetuille polypep-tideille, tavallisesti HCV-proteiineille. Immunologisen identiteetin voi määrittää vasta-aineen sitoutuminen ja/tai kilpailu sitoutumisessa; nämä tekniikat ovat tunnettuja alan keskitason ammattilaiselle ja niitä kuvataan myös alla.

Tässä käytettynä "epitooppi" viittaa polypeptidin antigeeniseen determinanttiin; epitooppi * · 2o voisi käsittää kolme aminohappoa epitoopille ainutkertaisessa avaruuskonformaatiossa, * f ·*’ yleisesti epitooppi käsittää ainakin viisi sellaista aminohappoa ja tavallisemmin se käsittää I ·

I I

; \ ainakin 8-10 sellaista aminohappoa. Aminohappojen avaruuskonformaation määrittämis- , . menetelmät ovat alalla tunnettuja ja sisältävät esimerkiksi röntgenkristallografian ja kak- • · · • t τ !.It siulotteisen ydinmagneettisen resonanssin.

S i » 25

Polypeptidi on "immunologisesti reaktiivinen" vasta-aineen kanssa, kun se sitoutuu vasta-aineeseen siten, että se tunnistaa tietyn polypeptidin sisältämän epitoopin vasta-aineen.

« : Immunologisen reaktiivisuuden voi määrittää vasta-aineen sitoutuminen, erityisemmin f · · • « vasta-aineen sitoutumisen kinetiikka ja/tai kilpailu sitoutumisessa käyttäen kilpailijoina 30 tunnettuja polypeptidejä, jotka sisältävät epitoopin, jota vastaan vasta-aine on suunnattu.

• I

I I I

.·. : Tekniikat sen määrittämiseksi onko polypeptidi immunologisesti reaktiivinen vasta-aineen • « kanssa vai ei, ovat alalla tunnettuja.

18 105046 Tässä käytettynä termi "immunogeeninen polypeptidi" on polypeptidi, joka antaa solu-ja/tai nestevasteen, joko yksin tai liitettynä kantajaan apuaineen läsnä- tai poissaollessa.

5 Termi "polypeptidi" viittaa aminohappojen polymeeriin, eikä viittaa tuotteen erityiseen pituuteen; täten peptidit, oligopeptidit ja proteiinit sisältyvät polypeptidin määritelmään.

Tämä termi ei myöskään viittaa polypeptidien ekspression jälkeisiin muunnoksiin eikä sulje niitä pois, esimerkiksi glykosylaatioihin, asetylaatioihin, fosforylaatioihin ja sen kaltaisiin. Määritelmään sisältyvät esimerkiksi polypeptidit, jotka sisältävät yhden tai useam-10 man aminohappojen analogin (sisältäen esimerkiksi ei-luonnon aminohapot jne.), polypeptidit, joissa on substituoituja liitoksia ja myös muut alalla tunnetut muunnokset, sekä luonnossa esiintyvät että ei-luonnossa esiintyvät.

"Transformaatio" tässä käytettynä viittaa ulkopuolisen polynukleotidin panemiseen isän-15 täsoluun, riippumatta panemiseen käytetystä menetelmästä, esimerkiksi suora otto, trans-duktio, f-liitto tai elektroporaatio. Ulkoinen polynukleotidi voidaan pitää integroi-mattomana vektorina, esimerkiksi plasmidina tai vaihtoehtoisesti se voidaan integroida isäntägenomiin.

% ' -" ’ 20 "Hoito" tässä käytettynä viittaa ennaltaehkäisyyn ja/tai terapiaan.

« · * · » • · · ; "Yksilö" tässä käytettynä viittaa selkärankaisiin, erityisesti imettäväislajin jäseniin ja sisäl- tää, muttei ole niihin rajoitettu, kotieläimet, urheilueläimet ja kädelliset sisältäen ihmiset.

• · « • · • * *·* * • · ·

I I I

25 Tässä käytettynä nukleiinihapon "sense-säie" sisältää sekvensin, jolla on sekvenssihomo- .···, logiaa mRNA:n sekvenssin kanssa. "Antisense-säie" sisältää sekvenssin, joka on "sense- • · säikeelle" komplementaarinen.

I « · < · · Tässä käytettynä viruksen "positiivisen säikeen genomi" on sellainen, jossa genomi, joko · 30 RNA tai DNA, on yksisäikeinen ja joka koodittaa viruspolypeptidejä. Esimerkit positii- v * • · visen säikeen RNA-viruksista sisältävät Togaviridae, Coronaviridae, Retroviridae, Picor- • t · * · 19 105046 naviridae, ja Caliciviridae. Mukaan sisältyvät myös Flaviviridae, joka aikaisemmin luokiteltiin kuulumaan lajiin Togaviridae. Katso Fields & Knipe (1986).

, Tässä käytettynä "vasta-aineen sisältävä raumiin osa" viittaa yksilön ruumiin osaan joka on s kyseessä olevien vasta-aineiden lähde. Vasta-aineita sisältävät ruumiin osat ovat tunnettuja * alalla ja sisältävät esimerkiksi, mutta eivät ole niihin rajoitettuja, plasman, seerumin, selkäydinnesteen, imunesteen, hengitysteiden, ruuansulatuskanavan ja sukupuoli-virtsakanavan ulko-osat, kyyneleet, syljen, maidon, veren valkosolut ja myeloomat.

ίο Tässä käytettynä "puhdistettu HCV" viittaa HCV-valmisteeseen, joka on eristetty soluosa-sista, joihin virus tavallisesti liittyy ja muista virustyypeistä, jotka voivat olla läsnä infektoituneessa kudoksessa. Tekniikat virusten eristämiseksi ovat tunnettuja alan ammattilaisille ja sisältävät esimerkiksi sentrifugoinnin ja affiniteettikromatografian; menetelmästä puhdistetun HCV:n valmistamiseksi keskustellaan alla.

li

Termi "HCV-partikkelit" sisältää tässä käytettynä koko virionin ja myös partikkelit, jotka ovat virionin muodostumisessa välituotteita. HCV-partikkeleissa on yleensä yksi tai useampia HCV-proteiineja HCV-nukleiiinihappoon liittyvinä.

' ·" '· 20 Tässä käytettynä "koetin" viittaa polynukleotidiin, joka muodostaa hybridirakenteen koh- « · \V dealueen sekvenssin kanssa johtuen ainakin yhden sekvenssin komplementaarisuudesta | | I I ’ < : ·' koettimessa kohdealueen sekvenssin kanssa. Koetin ei kuitenkaan sisällä sekvenssiä, joka ’ / on komplementaarinen sekvensseille, joita käytetään aloittamaan polymeraasiketjureaktio.

• * · • · • i

• «I

» ♦ · » · * 25 Tässä käytettynä termi "kohdealue" viittaa nukleiinihapon alueeseen, joka on amplifioitava ja/tai osoitettava.

*· · · • · · • · · • · · (: Tässä käytettynä termi "virus-RNA", mikä sisältää HCV:n RNA:n, viittaa RNA:han virus- « i * t * genomista, sen fragmenteista, sen transkripteista ja siitä peräisin olevista mutanttisek-.

.1. jo vensseistä.

• • · t · · f · I « · « «· • * 20 105046 Tässä käytettynä "biologinen näyte" viittaa kudos- tai nestenäytteeseen, joka on eristetty yksilöstä, sisältäen plasman, seerumin, selkäydinnesteen, imunesteen, ihon, hengitysteiden, ruuansulatuskanavan ja sukupuoli-virtsakanavan ulko-osat, kyyneleet, syljen, maidon, verisolut, kasvaimet, elimet ja myös in vitro soluviljelyosien näytteet (sisältäen, mutta ei niihin 5 rajoittuen, kuntoon laitetun viljelyväliaineen, joka on tulosta solujen kasvusta solujen vilje-lyväliaineessa, oietut virusinfektoidut solut, yhdistelmäsolut ja solukomponentit).

II. Keksinnön kuvaus ίο Tämän keksinnön käytännön suorituksessa käytetään, ellei toisin ole mainittu, molekyylibiologian, mikrobiologian, yhdistelmä-DNA-tekniikan ja immunologian tavanomaisia tekniikoita, jotka ovat alalla käytössä. Sellaisia tekniikoita selvitetään täysin kiijallisuudes-sa. Katso esimerkiksi seuraavia: Maniatis, Fitsch & Sambrook, MOLECULAR CLONING; A LABORATORY MANUAL (1982); DNA CLONING, VOLUMES I AND Π is (D.N. Glover toim. 1985); OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS (M.J. Gait toim. 1984); NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION (B.D. Hames & S.J. Higgins toim. 1984); ANIMAL CELL CULTURE (R.I. Freshney toim. 1986); IMMOBOLIZED CELLS AND ENZYMES (IRL Press, 1986); B.Perbal, A PRACTICAL GUIDE TO MOLECULAR CLONING ·. : (1984); saija, METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.); GENE TRANS- 20 FER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS (J.H. Miller ja M.P.Calos toim. 1987, Cold i '.· Spring Harbor Laboratory), Methods in Enzymology Vol. 154 and Vol. 155 (Wu ja

Grossman, ja vastaavasti Wu, toim.), Mayer ja Walker, toim. (1987), IM-MUNOCHEMICAL METHODS IN CELL AND MOLECULAR BIOLOGY (Academis • · ·

Press, Lontoo), Scopes, (1987), PROTEIN PURIFICATION: PRINCIPLES AND PRAC-25 TICE, Toinen painos (Springer-Verlag, N.Y.), ja HANDBOOK OF EXPERIMENTAL

• · · IMMUNOLOGY, VOLUMES I-IV (D.M.Weir ja C.C. Blackwell toim. 1986). Kaikki pa- I · · ,* , tentit, patenttihakemukset ja julkaisut, jotka tässä on mainittu, sekä yllä että alla, liitetään • · · • · · '(i'; tähän mukaan viitteeksi.

( I

« • · · • · . 30 Tämän keksinnön hyödylliset materiaalit ja menetelmät tekee mahdolliseksi läheisesti ho- • · · mologisten nukleotidisekvenssien, jotka on eristetty cDNA-kiijastoista, jotka sisältävät HCV:n cDNA-sekvenssejä. Nämä cDNA-kiijastot johdettiin infektoituneen simpanssin 21 105046 plasmassa olevista nukleiinihapposekvensseistä. Yhden näistä kirjastoista, "c"-kiijaston (ATCC No. 40394) rakenne raportoitiin EP-julkaisussa No. 318,216. Lukuisat kloonit, jotka sisälsivät tässä raportoitua HCV:n cDNA:ta, saatiin "c"-kiijastosta. Vaikka muut täs-. sä raportoidut kloonit saatiin muista HCV:n cDNA-kirjastoista, kloonien läsnäolo, jotka j sisälsivät sekvenssejä "c"-kiijastossa, vahvistettiin. Kuten keskusteltiin EP-julkaisussa No. 318,216, "c"-kiijastosta eristettyjen HCV:n cDNA-sekvenssien perhe ei ole peräisin ihmisestä tai simpanssista, eikä se osoita mitään merkittävää homologiaa HBV-genomiin sisältyvien sekvenssien kanssa.

ίο Tässä kuvattujen HCV:n cDNA:oiden saatavuus sallii sellaisten polynukleotidikoettimien rakentamisen, jotka ovat reagensseja, jotka ovat hyödyllisiä viruspolynukleotidien osoittamiseen, sisältäen luovutetun veren. Esimerkiksi sekvensseistä on mahdollista syntetisoida DNA-oligomeereja, joissa on noin 8-10 nukleotidia tai suurempia, jotka ovat hyödyllisiä hybridisaatiokoettimina HCV:n RNA:n osoittamiseksi esimerkiksi luovutetussa veressä, is sellaisten kohteiden seerumissa, joiden epäillään kantavan virusta tai soluviljely-jäijestelmissä, joissa virus replikoituu. Lisäksi cDNA-sekvenssit sallivat myös sellaisten HCV-spesifisten polypeptidien suunnittelemisen ja tuottamisen, jotka ovat hyödyllisiä diagnostisina reagensseina HCV-infektion aikana syntyvien vasta-aineiden läsnäolon to-: teamiseksi. cDNA:sta peräisin olevien puhdistettujen polypeptidien vasta-aineita voidaan :.v 20 myös käyttää virusantigeenien osoittamiseksi biologisissa näytteissä, sisältäen esimerkiksi : luovutetun veren näytteet, NANBH:ta sairastavien potilaiden seerumin ja kudosviljelyjär- | ’ jestelmät, joita käytetään HCV:n replikoimiseen. Lisäksi tässä esitetyt immunogeeniset « · · \,l polypeptidit, jotka ovat kooditettuja kuviossa 17 esitetyn HCV:n cDNA:n ORF:n osissa, i t * « · ovat myös hyödyllisiä HCV:n seulontaan, diagnooseihin ja hoitoon ja sellaisten vasta-25 aineiden kasvattamiseen, jotka ovat hyödyllisiä näitä tarkoituksia varten.

• · · »

• M

• · * . Lisäksi tässä kuvatut uudet cDNA-sekvenssit tekevät mahdolliseksi HCV-genomin lisäku- · · I » vaamisen. Näistä sekvensseistä peräisin olevia polynukleotidikoettimia ja -alukkeita voi-daan käyttää amplifioimaan sekvenssejä, jotka ovat läsnä cDNA-kiijastoissa ja/tai seulo- « · ’ 30 maan cDNA-kiijastoja sellaisten lisä-cDNA-sekvenssien varalta, jotka menevät päällek- • « käin niiden kanssa, joita vuorostaan voidaan käyttää päällekkäin menevien sekvenssien lisän saamiseen. Kuten mainitaan alla ja EP-julkaisussa No- 318,216, näyttää HCV:n 22 105046 genomi olevan RNArta, joka käsittää etupäässä suuren avoimen luentakehyksen (ORF), joka koodittaa suurta polyproteiinia.

HCV:n cDNA-sekvenssit, jotka on annettu tässä, polypeptidit, jotka ovat peräisin näistä ' s sekvensseistä ja tässä kuvatut immunogeeniset polypeptidit ja myös vasta-aineet, jotka on suunnattu näitä polypeptidejä vastaan, ovat myös hyödyllisiä verivälitteisten NABV-aineiden (BB-NANBV) eristämisessä ja tunnistamisessa. Esimerkiksi vasta-aineita, jotka ovat suunnattuja HCV-epitooppeja vastaan, jotka sisältyvät polypeptideihin, jotka ovat peräisin cDNA:sta, voidaan käyttää menetelmissä, jotka perustuvat affiniteettik-10 romatografiaan viruksen eristämiseksi. Vaihtoehtoisesti vasta-aineita voidaan käyttää tunnistamaan viruspartikkeleita, jotka on eristetty muilla tekniikoilla. Virusantigeenit ja genomimateriaali eristetyissä viruspartikkeleissa voidaan sitten edelleen karakterisoida.

Edellisen lisäksi tieto, joka annetaan alla, sallii lisä-HCV-kantojen tai -eristeiden identifi-15 oinnin. Lisä-HCV-kantojen tai eristeiden eristäminen ja määrittäminen voidaan suorittaa eristämällä nukleiiinihapot ruumiinosista, jotka sisältävät viruspartikkeleita ja/tai virus-RNA.ta, luoden cDNA-kiijastoja käyttäen polynukleotidikoettimia, jotka perustuvat alempana kuvattuihin HCV:n cDNA-koettimiin, seulomalla kiijastoja niiden kloonien varalta, '. · jotka sisältävät alla kuvattavia HCV:n cDNA-sekvenssejä ja vertaamalla HCV:n • · ::: 20 cDNA:oita uusista eristeistä alla kuvattaviin cDNA:oihin. Niissä tai virusgenomissa koodi- : tettuja polypeptidejä voidaan tarkkailla immunologisen ristireaktiivisuuden suhteen käyttä en yllä kuvattuja polypeptidejä ja vasta-aineita. Kannat tai eristeet, jotka sopivat HCV:n • · · parametreihin, kuten on kuvattu määritysosassa yllä, ovat helposti identifioitavissa. Muut • · « • · · HCV-kantojen identifioimismenetelmät ovat ilmeisiä alan ammattilaisille perustuen tässä ... 25 annettuun tietoon.

• « · • · ·

Ml • · · * « · . HCV:n cDNA-sekvenssien eristäminen « «· t ( « · I « «

Alla kuvattavat uudet HCV:n cDNA-sekvenssit laajentavat cDNA:n sekvenssin HCV- i · 30 genomia, joka on raportoitu EP-julkaisussa No. 318,216. Sekvenssit, jotka ovat läsnä kloo- • · · neissabll4a, 18g, ag30a, CA205a, CA290a, CA216a, pil4a, CA167b, CA156e, CA84aja CA59a, ovat ylävirtaan raportoidusta sekvenssistä ja koottuna antavat yhdistelmä-HCV:n 23 105046 cDNA-sekvenssin nukleotidit -319 - 1348. (Nukleotidin negatiivinen numero merkitsee sen etäisyyttä ylävirtaan nukleotidista, mikä aloittaa oletetun initiaattori-MET-kodonin.) Sekvenssit, jotka ovat läsnä klooneissa b5a ja 16jh, ovat alavirtaan raportoidusta sekvenssistä . ja antavat yhdistelmäsekvenssin nukleotidit 8659 - 8866. Yhdistelmä-HCV:n cDNA- 5 sekvenssi, mikä sisältää sekvenssit edellämainituissa klooneissa, on esitetty kuviossa 17.

Tässä kuvatut uudet HCV:n cDNA:t eristettiin lukuisista HCV:n cDNA-kiijastoista, sisältäen "c"-kiqaston, joka oli lambda gtll:ssä (ATCC No. 40394). HCV:n cDNA-kiijastot rakennettiin käyttäen varastoitua seerumia simpanssista, jolla oli krooninen HCV-infektio ίο ja mikä sisälsi korkean virustiitterin, s.o. ainakin 106 simpanssin infektioannosta/ml (CID/ml). Varastoitua seerumia käytettiin viruspartikkeleiden eristämiseen; näistä partikkeleista eristettyjä nukleiinihappoja käytettiin mallina rakennettaessa cDNA-kiijastoa vi-rusgenomille. Menetelmiä oletettujen HCV-partikkeleiden eristämiseksi ja HCV:n cDNA-kiijaston "c" rakentamiseksi kuvataan EP-julkaisussa No. 318,216. Muut menetelmät is HCV:n cDNA-kiijastojen rakentamiseksi ovat alalla tunnettuja ja joitakin näistä menetelmistä kuvataan alempana esimerkeissä. Sekvenssien eristäminen suoritettiin seulomalla kirjastoja käyttäen synteettisiä polynukleotidikoettimia, jonka sekvenssit olivat peräisin 5'-alueelta ja 3'-alueelta tunnetusta HCV:n cDNA-sekvenssistä. Kuvaus menetelmästä cDNA-; ; sekvenssien saamiseksi on enimmäkseen historiallisesti kiinnostavaa. Tulokseksi saadut v.: 20 sekvenssit (ja niiden komplementit) annetaan tässä ja sekvenssejä tai mitä tahansa niiden : osaa voitaisiin valmistaa käyttäen synteettisiä menetelmiä tai synteettisten menetelmien yhdistelmää saaden osittaisia sekvenssejä käyttäen menetelmiä, jotka ovat samanlaisia kuin • « · '·);* ne, joita on tässä kuvattu.

• · · • · · ..... 25 Viruspolvpeptidien ia -fragmenttien valmistus • » i • • Φ · ψ · · • « · * .* . cDNA-sekvenssien tai niistä peräisin olevien nukleotidisekvenssien (sisältäen sekvenssin • · · , · segmentit ja muunnokset) saatavuus sallii sellaisten ekspressiovektoreiden rakentamisen, .;. jotka koodittavat jompaan kumpaan säikeeseen kooditetun polypeptidin antigeenisesti ak- < ! ‘. 30 tiivisia alueita. Nämä antigeenisesti aktiiviset alueet voidaan johtaa päällys- tai kuorianti- geeneistä tai ydinantigeeneistä tai antigeeneistä, jotka ovat nonstrukturaalisia, sisältäen esimerkiksi polynukleotidia sitovat proteiinit, polynukleotidipolymeraasit ja muut viruspro- 24 105046 teiinit, joita vaaditaan viruspartikkelin replikaatiota ja/tai kokoonpanoa varten. Fragmentit, jotka koodittavat haluttuja polypeptidejä, johdetaan cDNA-klooneista käyttäen tavanomaista restriktiopilkkomista tai synteettisillä menetelmillä ja ne liitetään vektoreihin, jotka voivat esimerkiksi sisältää osia fiiusiosekvensseistä, kuten betagalaktosidaasista tai s superoksididismutaasista (SOD), mieluummin SOD:sta. Menetelmiä ja vektoreita, jotka ovat hyödyllisiä sellaisten polypeptidien tuottamiseksi, jotka sisältävät SOD:n fuusiosek-venssejä, kuvataan EP-julkaisussa numero 0196056, joka on julkaistu lokakuun 1 päivänä, 1986. Vektoreita SOD:n fuusiopolypeptidien ekspressoimiseksi ja HCV-polypeptidejä varten, jotka on kooditettu lukuisissa HCV-klooneissa, kuvataan alempana esimerkeissä. ίο Mikä tahansa HCV:n cDNA:n osa, joka sisältää avoimen luentakehyksen, kummassa tahansa sense-säikeessä, voidaan saada yhdistelmäpolypeptidinä, kuten kypsässä tai fuusio-proteiinina; vaihtoehtoisesti cDNA:han kooditettu polypeptidi voidaan saada aikaan kemiallisella synteesillä.

is Haluttua polypeptidiä koodaava DNA, joko fuusioidussa tai kypsässä muodossa ja sisältäen signaalisekvenssin salliakseen erityksen tai ollen sisältämättä, voidaan liittää ekspres-siovektoreihin, jotka ovat sopivia mitä tahansa sopivia isäntiä varten. Sekä eukariootti- että prokariootti-isäntäjäijestelmiä käytetään nykyään muodostettaessa yhdistelmäpolypeptidejä ja tiivistelmä muutamista yleisemmin käytetyistä säätöjäijestelmistä ja isäntäsolulinjoista • · f.:.: 20 on annettu alla. Polypeptidi eristetään sitten hajotetuista soluista tai viljelyväliaineesta ja : .' puhdistetaan siinä määrin kuin tarvitaan sen aiottua käyttöä varten. Puhdistus voidaan teh dä tekniikoilla, jotka ovat alalla tunnettuja, esimerkiksi differentiaaliuuttamisella, suolaf- • · · raktioinnilla, ioninvaihtohartseilla kromatografoimalla, afFiniteettikromatografialla, linko- ’ amalla ja sen kaltaisilla. Katso esimerkiksi: Methods in Enzymology lukuisia proteiinien 25 puhdistusmenetelmiä varten. Sellaisia polypeptidejä voidaan käyttää diagnostisina välinei- • · · nä tai niitä, jotka kehittävät neutraloivia vasta-aineita, voidaan muodostaa rokotteiksi.

• · · . Näitä polypeptidejä vastaan syntyneitä vasta-aineita voidaan myös käyttää diagnostiikassa I · · • * · ,5 ja passiivisessa immunoterapiassa. Lisäksi, kuten keskustellaan alla, näiden polypeptidien vasta-aineet ovat hyödyllisiä HCV-partikkeleiden eristämisessä ja tunnistamisessa.

i I

\: 30 4 · 25 105046

Antigeenisten polvpeptidien valmistaminen ia konjugaatio kantajan kanssa

Polypeptidin antigeeninen alue on yleensä suhteellisen pieni - tyypillisesti pituudeltaan 8-„ 10 aminohappoa tai vähemmän. Niinkin vähästä kuin 5 aminohaposta koostuvat fragmentit 5 voivat karakterisoida antigeenisen alueen. Nämä segmentit voivat vastata HCV-antigeenin • alueita. Niinpä, käyttäen HCV:n cDNA:oita pohjana, DNAroita, jotka koodittavat HCV-polypeptidien lyhyitä segmenttejä, voidaan ekspressoida yhdistelmänä joko fuusiopro-teiineina tai eristettyinä polypeptideinä. Lisäksi lyhyitä aminohapposekvenssejä voidaan saada sopivasti kemiallisella synteesillä. Esimerkiksi missä syntetisoitu polypeptidi on ίο muotoiltu oikein saadakseen aikaan oikean epitoopin, mutta on liian pieni ollakseen immu-nogeeninen, polypeptidi voidaan liittää sopivaan kantajaan.

Lukuisia tekniikoita sellaisen liitoksen saamiseksi on tunnettu alalla, mukaanlukien disul-fidiliitoksien muodostamisen käyttäen N-sukkinimidyyli-3-(2-pyridyylitio)propionaattia (SPDP) ja sukkinimidyyli 4-(N-maleiini-imidometyyli)sykloheksaani-l-karboksylaattia is (SMCC), joita saadaan Pierce Company'sta, Rockford, Illinois (jos peptidissä ei ole sulfhydryyliryhmää, se voidaan varustaa lisäämällä kysteiinijäännös). Nämä reagenssit luovat disulfidiliitoksen itsensä ja peptidin kysteiinijäännöksen välille yhdessä proteiinissa ja amidiliitoksen lysiinin epsilonaminon kautta tai muun vapaan, toisessa ryhmässä olevan • aminoryhmän kautta. Tunnetaan lukuisia sellaisia disulfidi/amidin muodostavia aineita.

l.:.: 20 Katso esimerkiksi Immun. Rev. (1982) £2:185. Muut kaksitoimiset kytkentäaineet muo- : ·' dostavat pikemminkin tioeetteri- kuin disulfidikytkentöjä. Monet näistä tioeettereitä muo- | t‘ dostavista aineista ovat kaupallisesti saatavia ja sisältävät 6-maleiini-imidokaproiinihapon, • « • · · LI 2-bromietikkahapon, 2-jodietikkahapon, 4-(N-maleiini-imidometyyli)sykloheksaani-l- • * « i · · karboksyylihapon ja sellaisten reaktiokykyiset esterit. Karboksyyliryhmät voidaan aktivoi-25 da yhdistämällä ne sukkinimidin tai l-hydroksyyli-2-nitro-4-sulfonihapon natriumsuolan i i · * kanssa. Lisämenetelmät antigeenien kytkemiseksi käyttävät rotavirus/"sidospeptidi"-jär-. jestelmää, joka on kuvattu EP-julkaisussa No. 259,149, jonka sisältö liitetään tähän mu- t · · r * im kaan viitteeksi. Edellisen listan ei ole tarkoitettu olevan tyhjentävä ja nimettyjen yhdistei-

• I

.;. den muunnoksia voidaan selvästi käyttää.

« · . 30 · a • · · * * ,

Voidaan käyttää mitä tahansa kantajaa, joka ei itse aiheuta isännälle haitallisten vasta-aineiden tuotantoa. Sopivat kantajat ovat tyypillisesti suuria, hitaasti metaboloituvia mak- 26 . 105046 romolekyylejä, kuten proteiineja; polysakkarideja, kuten lateksilla funktionalisoitua sefa-roosia, agaroosia, selluloosaa, selluloosapalloja ja sen kaltaisia; polymeerisiä aminohappoja, kuten polyglutaamihappo, polylysiini ja sen kaltaiset; aminohappokopolymeerejä; ja inaktiivisia viruspartikkeleita. Erityisen hyödyllisiä proteiinikantajia ovat seerumial-5 bumiinit, "keyhole Iimpef-hemosyaniini, immunoglobuliinimolekyylit, tyroglobuliini, ovalbumiini, jäykkäkouristustoksoidi, ja muut proteiinit, jotka ovat hyvin tunnettuja alan ammattilaiselle.

Täyspitkien virusproteiinien lisäksi ovat polypeptidit, jotka käsittävät typistettyjä HCV-lo aminohapposekvenssejä, jotka koodattavat ainakin yhtä virusepitooppia, hyödyllisiä immunologisina reagensseina. Esimerkiksi polypeptidejä, jotka käsittävät sellaisia typistettyjä sekvenssejä, voidaan käyttää reagensseina immunologisessa analyysissä. Nämä polypeptidit ovat myös ehdokasalayksikköantigeenejä koostumuksissa antiseerumin tuottamiseksi tai rokotteisiin. Vaikka näitä typistettyjä sekvenssejä voidaan tuottaa erilaisilla tunnetuilla is luonnon virusproteiinin käsittelyillä, pidetään yleisesti parempana tehdä synteettisiä tai yhdistelmäpolypeptidejä, jotka käsittävät HCV-sekvenssin. Polypeptidejä, jotka käsittävät näitä typistettyjä HCV-sekvenssejä, voidaan tehdä kokonaan HCV-sekvensseistä (yksi tai useampia epitooppeja, joko vierekkäisiä tai ei-vierekkäisiä) tai HCV-sekvensseistä ja hete-; ; roloogisista sekvensseistä fuusioproteiinissa. Hyödylliset heterologiset sekvenssit sisältävät 20 sekvenssit, jotka antavat erityksen yhdistelmäisännästä, vahvistavat HCV-epitooppien im-

i I

: ·' munologista reaktiivisuutta tai helpottavat polypeptidin kytkeytymistä immunologisen ^ J analyysin kantajaan tai rokotteen kantajaan. Ks. esimerkiksi EP-julkaisu No. 116,201; US- • · patentti No. 4,722,840; EP-julkaisu No. 259,149; US-patentti No. 4,629,783, joiden sisältö • · ·

« # I

liitetään tässä mukaan viitteeksi.

F

• · ·

Typistettyjä HCV-sekvenssejä käsittävien polypeptidien koko voi vaihdella laajalti, mini- * / . mikoon ollessa sekvenssi, jonka koko on riittävä antamaan HCV-epitoopin, kun taas mak- • · · simikokoei ole kriittinen. Mukavuussyistä maksimikoko ei tavallisesti ole olennaisesti suurempi kuin se, mikä vaaditaan antamaan halutut HCV-epitoopit ja heterologisen sek-. ; 30 venssin toiminnot, jos sellaisia on. Tyypillisesti typistetty HCV-aminohapposekvenssi on pituudeltaan noin 5 - noin 100 aminohappoa. Tyypillisemmin HCV-sekvenssi on kuitenkin maksimissaan noin 50 aminohappoa pitkä, mieluummin maksimissaan noin 30 aminohap- 27 105046 poa pitkä. On tavallisesti toivottavaa valita HCV-sekvenssejä, joissa on ainakin noin 10,12 tai 15 aminohappoa, maksimissaan noin 20 tai 25 aminohappoa.

. Typistettyjä HCV-aminohapposekvenssejä, jotka käsittävät epitooppeja, voidaan identifi- 5 oida lukuisilla tavoilla. Esimerkiksi koko virusproteiinisekvenssi voidaan seuloa valmista-' maila sarja lyhyitä peptidejä, jotka yhdessä kattavat koko proteiinisekvenssin. Esimerkki HCV-polyproteiinin alueiden antigeeniseulonnasta on esitetty alla. Lisäksi aloitettaessa esimerkiksi 100-meerisillä polypeptideillä, olisi rutiinia testata kukin polypeptidi niiden epitooppien läsnäolon varalta, jotka osoittavat haluttua reaktiivisuutta ja sitten testata prog-lo ressiivisesti pienempiä ja päällekkäisiä fragmentteja identifioidusta 100-meeristä kiinnostavan epitoopin kartoittamiseksi. Sellaisten peptidien seulonta immunologisella analyysillä on alan ammattitaitoa. Tunnetaan myös proteiinisekvenssien tietokoneanalyysin suorittaminen potentiaalisten epitooppien identifioimiseksi ja sitten oligopeptidien valmistamiseksi, jotka käsittävät identifioidut alueet seulontaa varten. Sellainen HCV-amino-15 happosekvenssin tietokoneanalyysi on esitetty kuviossa 20, jossa hydrofiili-nen/hydrofobinen luonne on näytetty antigeeni-indeksin päällä. Aminohapot on numeroitu aloittavasta MET.stä alkaen (asema 1), kuten esitetään kuviossa 17. Alan ammattilaiset antavat arvoa sille, että sellainen antigeenisyyden tietokoneanalyysi ei aina identifioi epi- • ; tooppia, joka on todella olemassa ja se voi myös virheellisesti identifioida proteiinin alueen 20 sisältävän epitoopin.

« I

Esimerkkejä HCV-aminohapposekvensseistä, jotka voivat olla hyödyllisiä, jotka ekspres- • · • · · M soidaan ekspressiovektoreista, jotka käsittävät kloonit 5-1-1, 81, CA74a, 35f, 279a, C36, • · · C33b, CA290a, C8f, C12f, 14c, 15e, C25c, C33c, C33f, 33g, C39c, C40b, Cal67b, on ku-25 vattu alla. Muita esimerkkejä HCV-aminohapposekvensseistä, jotka voivat olla hyödyllisiä, /·*; kuten tässä kuvataan, annetaan alla. On ymmärrettävä, että nämä peptidit eivät välttämättä ; tarkasti kartoita yhtä epitooppia ja ne voivat sisältää myös HCV-sekvenssin, joka ei ole m · · ♦ » ,...: immunogeeninen. Nämä sekvenssin ei-immunogeeniset osat voidaan määrittää, kuten ku- vataan yllä käyttäen tavanomaisia tekniikoita ja ne on poistettu kuvatuista sekvensseistä.

« · .·. : 30 Edelleen lisää typistettyjä HCV-aminohapposekvenssejä, jotka käsittävät epitoopin tai ovat

• t I

immunogeenisiä, voidaan identifioida, kuten kuvattiin yllä. Seuraavat aminohapposek- 28 105046 venssit on annettu aminohapponumeroina (s.o. "AAn"), missä n on aminohapon numero, kuten esitetään kuviossa 17: AA1-AA50; AA1-AA84; AA9-AA177; AA50-AA100; AA40-AA90; AA65-AA75; / AA99-AA120; AA95-AA110; AA100-AA150; AA150-AA200; AA200-AA250; AA220-AA240; AA245-AA265; AA250-AA300; AA290-AA330; AA290-AA305; AA300-AA350; AA310-AA330; AA350-AA400; AA405-AA495; AA400-AA450; AA437-AA582; AA450-AA500; AA475-AA495; AA500-AA550; AA511-AA690; AA515-AA550; AA550-AA600; AA550-AA625; AA575-AA605; AA600-AA650; ίο AA600-AA625; AA635-AA665; AA650-AA700; AA645-AA680; AA700-AA750; AA700-AA725; AA725-AA775; AA770-AA790; AA750-AA800; AA800-AA815; AA850-AA875; AA800-AA850; AA920-AA990; AA850-AA900; AA920-AA945; AA940-AA965; AA950-AA1000; AA1000-AA1060; AA1000-AA1050; AA1025-AA1040; AA1075-AA1175; AA1050-AA1200; AA1070-AA1100; AA1100- i5 AA1140; AA1192-AA1457; AA1195-AA1250; AA1200-AA1225; AA1225- AA1250; AA1250-AA1300; AA1260-AA1310; AA1260-AA1280; AA1266- AA1428; AA1300-AA1350; AA1310-AA1340; AA1345-AA1405; AA1350- AA1400; AA1365-AA1380; AA1380-AA1405; AA1400-AA1450; AA1450- • : AA1500; AA1475-AA1515; AA1475-AA1500; AA1500-AA1550; AA1515- ‘•'.0 20 AA1550; AA1550-AA1600; AA1570-AA1590; AA1595-AA1610; AA1590- : V AA1650; AA1610-AA1645; AA1650-AA1690; AA1685-AA1770; AA1690- AA1720; AA1720-AA1745; AA1745-AA1770; AA1750-AA1800; AA1775- • · I · · AA1810; AA1795-AA1850; AA1850-AA1900; AA1900-AA1950; AA1900- • · · AA1920; AA1916-AA2021; AA1920-AA1940; AA1949-AA2124; AA1950- AA2000; AA1950-AA1985; AA2000-AA2050; AA2020-AA2045; AA2045- • « /:·. AA2100; AA2045-AA2070; AA2054-AA2223; AA2070-AA2100; AA2100- m · · / . AA2150; AA2150-AA2200; AA2200-AA2325; AA2250-AA2330; AA2265- • · · J r • · # AA2280; AA2280-AA2290; AA2287-AA2385; AA2300-AA2350; AA2350- AA2400; AA2345-AA2415; AA2345-AA2375; AA2348-AA2464; AA2370- jo AA2410; AA2400-AA2450; AA2400-AA2425; AA2415-AA2450; AA2445- AA2500; AA2371-AA2502; AA2500-AA2550; AA2505-AA2540; AA2550- AA2600; AA2560-AA2580; AA2600-AA2650; AA2620-AA2650; AA2650- 29 105046 AA2700; AA2655-AA2670; AA2670-AA2700; AA2700-AA2750; AA2750- AA2800; AA2755-AA2780; AA2780-AA2830; AA2785-AA2810; AA2796- AA2886; AA2810-AA2825; AA2800-AA2850; AA2850-AA2900; AA2900- AA2950; AA2910-AA2930; AA2925-AA2950; ja AA2945-loppuun (C-pää).

' 5 ' Ylläolevia HCV-aminohapposekvenssejä voidaan valmistaa erillisinä peptideinä tai liitet tyinä suurempaan polypeptidiift ja niillä voi olla käyttöä, kuten tässä kuvataan. Lisäpoly-peptidejä, jotka käsittävät typistettyjä HCV-sekvenssejä, kuvataan esimerkeissä.

ίο Oletettujen HCV:n polyproteiinien havaittu suhde Flaviviruksien kanssa sallii HCV:n "nonstrukturaalisten" (NS) proteiinien oletettujen alueiden ennustamisen. Yksittäisten NS-proteiinien paikat oletetussa Flaviviruksen esivaiheen polyproteiinissa ovat melko hyvin tunnettuja. Lisäksi nämä yhtyvät myös havaittuihin kokonaisvaihteluihin polyproteiinin hydrofobisuusprofiilissa. On osoitettu, että Flavivirusten NS5 koodittaa virionipolymeraa-15 siä ja että NS1 vastaa komplementtikiinnitysantigeeniä, minkä on osoitettu olevan tehokas rokote eläimissä. Äskettäin on osoitettu, että flavivirusproteaasitoiminto on NS3:ssa. Johtuen havaituista samankaltaisuuksista HCV:n ja Flavivirusten välillä, joita kuvataan alla, ovat päätelmät mahdollisia koskien vastaavien proteiinialueiden suunnilleen paikkoja ja '; ; HCV-polyproteiinin toimintoja. Polypeptidien, jotka sisältävät näitä alueita lukuisissa yh- :· 20 distelmäisäntäsoluissa, sisältäen esimerkiksi bakteerit, hiivan, hyönteis- ja selkärankaisso- I » I · · ' ' lut, ekspression tulisi kasvattaa tärkeitä immunologisia reagensseja, joita voidaan käyttää \ / diagnooseihin, osoittamiseen ja rokotteisiin.

) · · » · # • · t · · a · • « ·

Vaikka tässä kuvatun HCV-eristeen ja Flavivirusten oletetuilla polyproteiinien nonstruktu-25 raalisilla alueilla näyttää olevan jotain samankaltaisuutta, on vähemmän samankaltaisuutta « · · /:·. niiden oletettujen strukturaalisten alueiden välillä, jotka ovat kohti N-päätä. Tällä alueella « t·* . on suurempi poikkeavuus sekvenssissä ja lisäksi kahden alueen hydrofobisuusprofiili • · · osoittaa vähemmän samankaltaisuutta. Tämä "poikkeavuus" alkaa HCVin oletetun NS1- I f alueen N-pään alueelta ja ulottuu oletettuun N-päähän. Joka tapauksessa voi olla vielä • · hydrofobinen) summittaiset paikat HCV-polyproteiinissa. Esimerkeissä ennustukset perustuvat muutoksiin, jotka havaittiin HCV-polyproteiinin hydrofobisessa profiilissa ja Flavivi- ’ : jo mahdollista ennustaa oletetun ydinkapselin (N-pään emäksinen alue) ja E-alueen (yleensä

• I I

• · 30 105046 rusproteiinien luonteen ja paikan tietoon. Näistä ennustuksista voi olla mahdollista identifioida HCV-polyproteiinin summittaiset alueet, jotka voisivat vastata hyödyllisiä immunologisia reagensseja. Esimerkiksi Flaviviruksien E-ja NS 1-proteiineilla tiedetään olevan tehoa suojarokotteina. Nämä alueet ja myös jotkin sellaiset, joiden on osoitettu olevan s antigeenisiä tässä kuvatussa HCV-eristeessä, esimerkiksi ne, jotka ovat oletetuissa NS3-, C- ja NS5-proteiineissa, antaisivat diagnostisia reagensseja. Lisäksi viruskooditettujen entsyymien asema ja ekspressio saattaa myös sallia virustenvastaisten entsyymi-inhibiittoreiden arvioimisen, s.o. esimerkiksi inhibiittoreiden, jotka estävät entsyymiaktiivisuutta itse näiden entsyymien kanssa tapahtuvan keskinäisen vaikutuksen johdosta tai ίο aineiden, jotka voivat estää entsyymin ekspression (esimerkiksi antisense-RNA tai muut lääkkeet, jotka sekaantuvat ekspressioon).

HCV-epitooppeia sisältävien hvbridipartikkeli-immunogeenien valmistaminen n HCV:n epitooppien immunogeenisyyttä voidaan myös vahvistaa valmistamalla ne imettä-väis- tai hiivajäijestelmässä, jotka on fuusioitu tai asennettu siten, että niissä on partikkeleita muodostavia proteiineja, kuten esimerkiksi se, joka liittyy hepatitis-B:n pinta-antigeeniin. Rakenteet, joissa NANBV-epitooppi on liitetty suoraan partikkeleita muodos-•;": tavaa proteiinia koodittavnn sekvensseihin, tuottavat hybridejä, jotka ovat immunogeenisiä ‘.V 20 HCV-epitoopin suhteen. Lisäksi kaikki valmistetut vektorit sisältävät HBV:lle spesifisiä • · < i epitooppeja, joissa on vaihteleva määrä immunogeenisyyttä, kuten esimerkiksi pre-S- peptidi (pre surface protein). Täten partikkeleita muodostavista proteiineista rakennetut »*· · ’\\l partikkelit, jotka proteiinit sisältävät HCV-sekvenssejä, ovat immunogeenisiä HCV:n ja t ♦ * HBV:n suhteen.

... 25 • · · • · · .···. Hepatitiksen pinta-antigeenien (HBSAg) on osoitettu muodostuvan ja liittyvän S. cerevi- * • · · .* . siae:n partikkeleihin (Valenzuela et ai. (1982)) ja myös esimerkiksi imettäväissoluihin • · · • · · '(ij (Valenzuela, P., et ai. (1984)). Sellaisten partikkeleiden muodostumisen on osoitettu vah vistavan monomeerialayksikön immunogeenisyyttä. Rakenteet voivat myös sisältää hepati-.

| · jo tiksen pinta-antigeenin immunodominantin epitoopin, joka käsittää ennen pintaa (pre-S) • « « olevan alueen 55 aminohappoa. Neurath et ai. (1984). Pre-S-HBSag-partikkelirakenteita, jotka ovat ekspressoitavissa hiivassa, esitetään EP-julkaisussa 174,444, joka on julkaistu 31 105046 19.03.1986; hybridejä, jotka sisältävät heterologisia vimssekvenssejä hiivaekspressiota varten, on esitetty EP-julkaisussa 175,261, joka on julkaistu 26.03.1986. Nämä rakenteet voivat olla ekspressoituja imettäväissoluissa, kuten kiinalaisen hamsterin munarar-jasoluissa (CHO) käyttäen SV40-dihydrofolaatti-reduktaasivektoria (Michelle et ai. r (1984)).

Lisäksi osia partikkeleita muodostavaa proteiinia koodittavasta sekvenssistä voidaan vaihtaa kodoneihin, jotka koodittavat HCV-epitooppia. Tässä vaihdossa alueet, joita ei vaadita välittämään yksiköiden yhdistämistä immunogeenisien partikkeleiden muodostamiseksi ίο hiivoissa tai imettäväisissä, voidaan poistaa välttäen täten ylimääräisten HBV-anti-geenipaikkojen kilpailu HCV-epitoopin kanssa.

Rokotteiden valmistus n Rokotteita voidaan valmistaa yhdestä tai useammasta immunogeenisesta polypeptidistä, jotka ovat peräisin HCV:n cDNA:sta sisältäen esimerkeissä kuvatut cDNA-sekvenssit. HCV:n ja Flaviviruksien välillä havaittu homologia antaa tietoa koskien polypeptidejä, jotka voivat olla kaikkein tehok-: ·': kaimpia rokotteina ja myös niistä genomin alueista, joihin ne on kooditettu. Flaviviruksien 20 genomin yleisestä rakenteesta keskustellaan julkaisussa Rice et ai. (1986). Flaviviruksen genomin RNA:n uskotaan olevan ainoa virusspesifinen mRNA-laji ja se kansioidaan kolmeksi viruksen strukturaaliproteiiniksi, s.o. C:ksi, M:ksi ja E:ksi ja myös kahdeksi non- « « · strukturaaliproteiiniksi, NS4 ja NS5 ja monimutkaiseksi Saijaksi pienempiä nonstrukturaa- I · < f · * * liproteiineja. Tiedetään, että pääasialliset neutraloivat epitoopit Flaviriruksia varten ovat E- f...e 25 proteiinissa (kuori = envelope) (Roehrig (1986)). Täten rokotteet voivat muodostua yhdis- · * • _ telmäpolypeptideistä, jotka sisältävät HCVrn E:n epitoopit. Näitä polypeptidejä voidaan .* . ekspressoida bakteeri-, hiiva- tai imettäväissoluissa tai vaihtoehtoisesti ne voidaan eristää · • · · virusvalmisteista. Ennakoidaan myös, että muut strukturaaliproteiinit voivat myös sisältää

I

epitooppeja, jotka synnyttävät suojaavia HCV:n vastaisia vasta-aineita. Täten polypeptide- t · • » jo jä, jotka sisältävät E:n, C:n ja M:n epitooppeja, voidaan myös käyttää, joko itsekseen tai • · * yhdistelmänä, HCV-rokotteissa.

105046 32

Lisänä edelliseen on esitetty, että immunointi NSl:llä (nonstrukturaaliproteiini 1 = non-structural protein 1), antaa tuloksena suojan keltakuumetta vastaan (Schlesinger et ai. (1986)). Tämä on totta, vaikkakaan immunointi ei synnytä neutraloivia vasta-aineita. Täten erityisesti koska tämä proteiini näyttää olevan hyvin säilössä Flaviviruksien joukossa, on > s todennäköistä, että HCV:n NS1 suojaisi myös HCV-infektiota vastaan. Lisäksi se osoittaa myös, että nonstrukturaaliproteiinit voivat antaa suojaa viruspatogeenisyyttä vastaan, vaikkakaan ne eivät aiheuta neutraloivien vasta-aineiden tuotantoa.

Esimerkeissä annettu tieto koskien polypeptidien, jotka ekspressoidaan kloonatuista ίο HCV.n cDNA.oista, jotka kattavat HCV.n ORF:n eri alueet, immunogeenisyyttä sallii myös ennustukset koskien niiden käyttöä rokotteissa.

Edellisen valossa monenarvoiset rokotteet HCV.tä vastaan voivat muodostua yhdestä tai useammasta yhden tai useamman strukturaaliproteiinin epitoopista ja/tai yhden tai useam- 15. man nonstrukturaaliproteiinin yhdestä tai useammasta epitoopista. Nämä rokotteet voivat muodostua esimerkiksi yhdistelmä-HCV-polypeptideistä ja/tai polypeptideistä, jotka on eristetty virioneista. Erityisesti rokotteiden suunnitellaan käsittävän yhden tai useamman seuraavaista HCV-proteiineista tai niistä peräisin olevista alayksikön antigeeneistä: E, '·NS1, C, NS2, NS3, NS4 ja NS5. Erityisen parhaina pidettyjä ovat rokotteet, jotka käsittä-• « :,v 20 vät E:täja/tai NSl:tä tai niiden alayksikköjä.

• ·

Sellaisten rokotteiden valmistus, jotka sisältävät immunogeenisia polypeptidejä aktiivisina • · · aineksina, on tunnettua alan ammattilaiselle. Tyypillisesti sellaiset rokotteet valmistetaan · · • « · ruiskeiksi, joko nesteliuoksiksi tai suspensioiksi; kiinteitä muotoja, jotka sopivat liuotet-25 taviksi tai suspendoitaviksi nesteeseen ennen injektoimista, voidaan myös valmistaa. Vai- • · · mistus voidaan myös tehdä emulsioksi tai proteiini voidaan kapseloida liposomeihin. Ak- ; .* . tiiviset immunogeeniset ainekset sekoitetaan usein täyteaineiden kanssa, jotka ovat farma-

• M

,.,seuttisesti hyväksyttäviä ja yhteensopivia aktiivisten aineksien kanssa. Sopivia täyteaineita ovat esimerkiksi vesi, suolaliuos, dekstroosi, glyseroli, etanoli, ja sen kaltaiset ja niiden • · • l'1. 30 yhdistelmät. Lisäksi rokote voi sisältää haluttaessa pieniä määriä apuaineita, kuten kostu- 4 · · tusaineita tai emulgointiaineita, pH-puskuriaineita ja/tai apuaineita, jotka vahvistavat rokotteen tehoa. Esimerkit apuaineista, jotka saattavat olla tehokkaita, sisältävät seuraavia, mut- „ 105046 33

teivat ole niihin rajoitettuja: alumiinihydroksidi, N-asetyylimuramyyli-L-treonyyli-D-isoglutamiini (thr-MDP), N-asetyylinormuramyyli-L-alanyyli-D-isoglutamiini (CGP 11637, johon viitataan nor-MDP:nä), N-asetyylimuramyyli-L-alanyyli-D-isoglutaminyyli-, L-alaniini-2-(l ,-2,-dipalmitoyyli-sn-glysero-3-hydroksifosforyylioksi)-etyyliamiini (CGP

5 19835A, johon viitataan MTP-PE:nä) ja RIBI, joka sisältää kolmea komponenttia, jotka on ' uutettu bakteereista, monofosforyylilipidi-A:ta, trehaloosidimykolaattia ja soluseinämän runkoa (MPL+TDM+CWS) 2 %:ssa skvaleeni/Tween 80-emulsiossa. Apuaineen teho voidaan määrittää mittaamalla niiden vasta-aineiden määrä, jotka ovat suunnattuja immuno-geenistä polypeptidiä vastaan, joka sisältää HCV:n antigeenisen sekvenssin, joka on tulok-lo sena tämän polypeptidin antamisesta rokotteissa, jotka muodostuvat eri apuaineista.

Rokotteet annetaan perinteisesti parenteraalisesti, injektioina esimerkiksi joko ihonalaisesti tai lihaksensisäisesti. Lisäformulaatiot, jotka ovat sopivia muita annostelutapoja varten, sisältävät peräpuikot ja joissakin tapauksisssa suun kautta otettavat koostumukset. Perä-15 puikkoja varten perinteiset sideaineet ja kantajat voivat sisältää esimerkiksi polyalkylee-niglykoleja tai triglyseridejä; sellaiset peräpuikot voidaan muodostaa seoksista, jotka sisältävät aktiivista ainetta 0,5-10 %, mieluummin 1-2 %. Suun kautta annettavat valmisteet sisältävät sellaisia tavallisesti käytettyjä täyteaineita, kuten esimerkiksi farmaseuttista laatua olevat mannotolin, laktoosin, tärkkelyksen, magnesiumstearaatin, natriumsakkariinin, 20 selluloosan, magnesiumkarbonaatin ja sen kaltaiset. Näiden koostumusten muoto on liuos, suspensio, tabletti, pilleri, kapseli, hitaasti vapauttava koostumus tai jauhe ja ne sisältävät 10-95 % aktiivista ainesta, mieluummin 25-70 %.

• · • · · * · · • · • * · 9 9 9 9 9

Proteiinit voidaan formuloida rokotteeksi neutraalissa tai suolamuodossa. Farmaseuttisesti ,···. 25 hyväksyttävät suolat sisältävät happoadditiosuolat (jotka ovat muodostuneet peptidin va- • · · päiden aminoryhmien kanssa) ja jotka ovat muodostuneet epäorgaanisten happojen, kuten . suolahapon tai fosforihapon kanssa tai orgaanisten happojen kanssa, kuten etikkahapon, • · · oksaalihapon, viinihapon, maleiinihapon ja sen kaltaisten kanssa. Suoloja, jotka ovat muo-dostuneet vapaiden karboksyyliryhmien kanssa, voidaan myös johtaa epäorgaanisista • · 30 emäksistä, kuten esimerkiksi natriumhydroksidi, kaliumhydroksidi, ammoniumhydroksidi, « · kalsiumhydroksidi tai rautahydroksidit ja orgaanisista emäksistä, kuten isopropyyliamiini, trimetyyliamiini, 2-etyyliaminoetanoli, histidiini, prokaiini ja sen kaltaiset.

„ 105046 34

Rokotteiden annos ia anto

Rokotteet annetaan tavalla, joka sopii annosformulaatioon ja siinä määrin, mikä on teho-5 kasta ennaltaehkäisevässä ja/tai hoidollisessa mielessä. Annettava määrä, joka on yleensä 5 pg - 250 pg antigeeniä annosta kohti, riippuu käsiteltävästä kohteesta, kohteen immuunijärjestelmän kapasiteetista syntetisoida vasta-aineita ja halutun suojan asteesta. Annettavaksi vaadittavan aktiivisen aineksen tarkka määrä voi olla riippuvainen lääkärin harkinnasta ja voi olla kullekin kohteelle ominainen.

10

Rokote voidaan antaa yhtenä annoksena tai mieluummin monena annoksena. Moniannok-sinen menettelytapa on sellainen, jossa alustava rokotusohjelma voidaan tehdä 1-10 erillisellä annoksella, mitä seuraa muita annoksia sen jälkeisinä aikaväleinä, jotka vaaditaan ylläpitämään tai uudelleen vahvistamaan immuunivastetta, esimerkiksi 1-4 kk toista annos-is ta varten ja jos tarvitaan, seuraava annos annetaan useiden kuukausien päästä. Annosteluohjeet, ainakin osittain, määritetään yksilön tarpeiden mukaan ja ne riippuvat lääkärin harkinnasta.

Lisäksi rokotetta, joka sisältää immunogeenisiä HCV-antigeenejä, voidaan antaa muiden v.: 20 immuunijärjestelmää säätävien aineiden yhteydessä, esimerkiksi immunoglobuliinien • < « : kanssa.

• I

• · • · ·

Vasta-aineiden valmistaminen HCV-epitooppeia vastaan i i i • · · 25 Immunogeenisiä polypeptidejä, jotka on valmistettu yllä kuvatusti, käytetään tuottamaan | » · t vasta-aineita, sekä polyklonaalisia että monoklonaalisia. Jos halutaan polyklonaalisia vasta- . aineita, valittu imettäväinen (esimerkiksi hiiri, kani, vuohi, hevonen jne.) immunoidaan • · · » 9 immunogeenisellä polypeptidillä, joka kantaa HCV-epitooppeja. Seerumia immunoidusta < 9 . eläimestä kerätään ja sitä käsitellään tunnetuilla menettelytavoilla. Jos seerumi, joka sisäl- « · 9 30 tää polyklonaalisia vasta-aineita HCV-epitoopille, sisältää vasta-aineita muille antigee- « * · « neille, polyklonaaliset vasta-aineet voidaan puhdistaa immunoaffiniteettikromatografialla.

35 105046

Tekniikat polyklonaalisen antiseerumin tuottamiseksi ja käsittelemiseksi ovat alalla tunnettuja, katso esimerkiksi Mayer ja Walker (1987).

Vaihtoehtoisesti polyklonaaliset vasta-aineet voidaan eristää imettäväisestä, joka on aikaisemmin infektoitu HCV:llä. Esimerkki HCV-epitooppien vasta-aineiden puh-5 distusmenetelmästä infektoidun yksilön seerumista, perustuen affiniteettikromatografiaan ja käyttäen SOD:n fuusiopolypeptidiä ja polypeptidiä, joka on kooditettu kloonin 5-1-1 cDNA:ssa, on esitetty EP-julkaisussaNo. 318,216.

Monoklonaalisia vasta-aineita, jotka on suunnattu HCV-epitooppeja vastaan, voi myös ίο tuottaa helposti alan ammattimies. Yleiset menetelmät monoklonaalisten vasta-aineiden tekemiseksi hybridomien kautta ovat hyvin tunnettuja. Kuolemattomia, vasta-aineita tuottavia solulinjoja voidaan luoda solufuusiolla ja myös muilla tekniikoilla, kuten suoralla B-lymfosyyttien trasformaatiolla onkogeenisellä DNA:lla tai Epstein-Barr-viruksen avulla tehtävällä transfektiolla. Katso esimerkiksi M. Schreier et ai. (1980); Hammerling et ai. is (1981); Kennett et ai. (1980); katso myös US-patentteja numerot 4,341,761; 4,399,121; 4,427,783; 4,444,887; 4,466,917; 4,472,500; 4,491,632 ja 4,493,890. HCV-epitooppeja vastaan tuotettujen monoklonaalisten vasta-aineiden sarjoja voidaan seuloa eri ominaisuuksien suhteen; s.o. isotyypin, epitoopin affiniteetin jne. suhteen.

« • ·

• I

20 Vasta-aineet, sekä monoklonaaliset että polyklonaaliset, jotka ovat suunnattuja HCV- • · * • « « : ·j epitooppeja vastaan, ovat erityisen hyödyllisiä diagnooseissa ja ne, jotka ovat neutraloivia, ovat hyödyllisiä passiivisessa imunoterapiassa. Monoklonaalisia vasta-aineita voidaan « · « • · « käyttää erityisesti synnyttämään anti-idiotyypin vasta-aineita.

* · · · t m 25 Anti-idiotyypin vasta-aineet ovat immunoglobuliineja, joissa on "sisäinen kuva" infektoi-j/j*; van aineen, jota vastaan suojaa halutaan, antigeenistä. Katso esimerkiksi NisonofT, A., et t·', ; ai. (1981) ja Dreesman et ai. (1985).

· · • · • i ,λ Tekniikat anti-idiotyypin vasta-aineiden synnyttämiseksi ovat alalla tunnettuja. Katso esi- • · : 30 merkiksi Grzych (1985), MacNamara et ai. (1984), ja Uytdehaag et ai. (1985). Nämä anti- • * · • · idiotyypin vasta-aineet voivat olla myös hyödyllisiä NANBH:n hoidossa ja/tai diagnoosissa ja myös HCV-antigeenien immunogeenisten alueiden selventämisessä.

36 10EC46

Alan keskiverto ammattimies havaitsisi, että lukuisia vasta-ainetyyppejä, jotka on suunnattu HCV-epitooppeja vastaan voidaan tuottaa. Tässä käytettynä "vasta-aine" viittaa poly-peptidiin tai polypeptidien ryhmään, jotka muodostuvat ainakin yhdestä vasta-aineen yh-5 distymispaikasta. "Vasta-aineen yhdistymispaikka" tai "sitoutumisalue" muodostuu vasta-ainemolekyylien vaihtelevien alueiden poimuttumisesta muodostaakseen kolmiulotteisia sitoutumistiloja, joiden sisäinen pintamuoto ja varauksen jakaantuminen on komplementaarinen antigeenin epitoopin piirteille. Vasta-aineen yhdistymispaikka voi muodostua raskaan ja/tai kevyen ketjun alueesta (VH ja vastaavasti VL), jotka muodostavat erittäin ίο vaihtelevia silmukoita, jotka antavat tukea antigeenin sitoutumiselle. Termi "vasta-aine" sisältää esimerkiksi selkärankaisvasta-aineet hybridivasta-aineet, kuvitellut vasta-aineet, muutetut vasta-aineet, yksiarvoiset vasta-aineet, Fab-proteiinit ja yksialueiset vasta-aineet.

"Yksialueinen vasta-aine" (dAb) on vasta-aine, joka muodostuu VH-alueesta, joka reagoi is immunologisesti tarkoitetun antigeenin kanssa. dAb ei sisällä VL-aluetta, mutta voi sisältää muita antigeenin sitoutumisalueita, joiden tiedetään olevan vasta-aineissa, esimerkiksi kappa- ja lambda-alueet. Menetelmät dAb:eiden valmistamiseksi ovat alalla tunnettuja.

Katso esimerkiksi Ward et ai. (1989).

• · V.: 20 Vasta-aineet voivat muodostua myös VH- ja VL-alueista ja myös muista tunnetuista anti-

I » I

i \: geenin sitoutumisalueista. Esimerkit näistä vasta-aineiden tyypeistä ja menetelmistä niiden % .....

' ' valmistamiseksi ovat alalla tunnettuja (ks. esim US-patentti No. 4,816,467, joka liitetään **♦'· tähän viitteeksi) ja sisältävät seuraavat. Esimerkiksi "selkärankaisvasta-aineet" viittaavat • * · • · · * vasta-aineisiin, jotka ovat tetrameerejä tai niiden yhteenliittymiä, käsittäen kevyitä ja ras-25 kaita ketjuja, jotka ovat tavallisesti liittyneet yhteen "Y"-konfiguraatiossa ja joissa voi olla • · · tai olla olematta kovalenttisia sidoksia ketjujen välillä. Selkärankaisvasta-aineissa kaikkien _ * · ,* , erityisen vasta-aineen ketjujen aminohapposekvenssit ovat homologisia niiden ketjujen • ·· kanssa, jotka on löydetty yhdessä vasta-aineessa, jonka on tuottanut lymfosyytti, joka I « ,;, tuottaa tuota vasta-ainetta in situ tai in vitro (esimerkiksi hydridomissa). Selkärankaisvasta- I · « · 30 aineet sisältävät tyypillisesti luonnon vasta-aineita, esimerkiksi puhdistettuja polyklonaali- • «9 • 4 siä vasta-aineita ja monoklonaalisia vasta-aineita. Esimerkkejä näiden vasta-aineiden valmistusmenetelmistä kuvataan alla.

37 105046 "Hybridivasta-aineet" ovat vasta-aineita, jossa yksi raskaan ja kevyen ketjun pari on homologinen ketjujen kanssa ensimmäisessä vasta-aineessa, kun taas toinen raskaan ja kevyen * ketjun pari on homologinen ketjujen kanssa toisessa eri vasta-aineessa. Tyypillisesti kum-j pikin näistä kahdesta parista sitoo eri epitooppeja, erityisesti eri antigeeneihin. Tämä on ' tulosta "divalenssi"-ominaisuudesta, s.o. kyvystä sitoa kahta antigeeniä samanaikaisesti.

Sellaisia hybridejä voidaan muodostaa myös käyttäen kuviteltuja ketjuja, kuten esitetään alla.

ίο "Kimeeriset vasta-aineet" ovat vasta-aineita, joissa raskas ja/tai kevyt ketju on fuusioprote-iineja. Tyypillisesti ketjujen vakioalue on yhdestä erityisestä lajista ja/tai luokasta ja vaihte-levat alueet ovat eri lajista ja/tai luokasta. Tähän sisältyy myös mikä tahansa vasta-aine, jossa joko raskas tai kevyt ketju tai molemmat on kokoonpantu sellaisten sekvenssien yhdistelmistä, jotka matkivat sekvenssejä eri lähteistä saaduissa vasta-aineissa, olkoon nämä is lähteet eri luokkia tai eri lajeja alkuperältään ja olkoon fuusiokohta vaihtelevan/vakion rajalla. Täten on mahdollista tuottaa vasta-aineita, joissa ei vakio- eikä vaihteleva alue matki tunnettuja vasta-ainesekvenssejä. Sitten tulee mahdolliseksi esimerkiksi rakentaa vasta-aineita, joiden vaihtelevalla alueella on korkeampi spesifinen affiniteetti erityiselle antigeenille tai jonka vakioalue voi antaa vahvistuneen komplementin kiinnityksen tai teh- •: · · i 20 dä muita parannuksia erityisen valtioalueen omaavissa ominaisuuksissa.

• · • ·

I I I

• I I

: V Toinen esimerkki on "muutettu vasta-aine", mikä viittaa vasta-aineisiin, joissa luonnossa * * esiintyvä aminohapposekvenssi selkärankaisvasta-aineessa on vaihdeltu. Käyttäen yhdis- • * telmä-DNA-tekniikoita voidaan vasta-aineita muotoilla uudelleen haluttujen ominaisuuksi- * · · · • · · ’ 25 en saamiseksi. Mahdolliset muuntelut ovat monia ja ulottuvat yhden tai useamman amino- t...# hapon muuttamisesta täydelliseen alueen, esimerkiksi vakioalueen, uudelleen muotoilemi- » · · seen. Muutokset varoalueella yleensä saavat aikaan haluttuja solumenetelmäominaisuuk- • · · . * . siä, esimerkiksi muutoksia komplementin kiinnityksessä, membraanien välisen keskinäisen • · · • · · /,,,· vaikutuksen ja muita effektoritoimintoja. Vaihtelevan alueen muutokset voidaan panna.

30 muuttamaan antigeenin sitoutumisominaisuuksia. Vasta-aine voidaan myös rakentaa aut-tamaan molekyylin tai aineen spesifistä toimitusta erityiseen solun tai kudoksen paikkaan.

• * · • · 38 105046

Halutut muuttamiset voidaan tehdä tunnetuilla tekniikoilla molekyylibiologiassa, esimerkiksi yhdistelmätekniikoilla, paikkasuunnatuilla mutagenoinneilla jne.

Vielä muu esimerkki ovat "yksiarvoiset vasta-aineet", jotka ovat aggregaatteja, jotka muo-5 dostuvat raskaan ketjun/kevyen ketjun dimeeristä, joka on sidottu toisen raskaan ketjun Fc-alueeseen (s.o. valtioalueeseen). Tämän tyyppiselle vasta-aineelle ei voi tehdä antigeeni-modulaatiota. Ks. esim. Glennie et ai. (1982).

Vasta-aineiden määritelmän alla ovat myös vasta-aineiden "Fab"-fragmentit. "Fab"-alue to viittaa niihin raskaiden ja kevyiden ketjujen osiin, jotka ovat karkeasti ekvivalentteja tai analogisia sekvensseille, jotka käsittävät raskaiden ja kevyiden ketjujen haarautumisosan ja joiden on osoitettu osoittavan immunologista sitoutumista erityiseen antigeeniin, mutta joissa ei ole effektorin Fc-osaa. "Fab" sisältää yhden raskaan ja yhden kevyen ketjun aggregaatit (yleisesti tunnetaan Fab'.na), ja myös tetrameerit, jotka sisältävät 2H- ja 2L-ketjut is (johon viitataan F(ab)2:na), jotka kykenevät reagoimaan selektiivisesti annetun antigeenin tai antigeeniperheen kanssa. "Fab"-vasta-aineet voidaan jakaa alaryhmiin, jotka ovat analogisia yllä kuvatuille, s.o. "selkärankais-Fab", "hybridi-Fab", "kimeerinen Fab" ja "muutettu Fab". Menetelmät vasta-aineiden "Fab"-fragmenttien tuottamiseksi ovat alalla tunnettuja ja sisältävät esimerkiksi proteolyysin ja synteesin yhdistelmätekniikoilla.

·:··: 20 « «

Diagnostiset olieinukleotidikoettimet ia välinesariat • I f • « « • 1 • · • 1 Käyttäen eristettyjä HCV:n cDNA:ojen esitettyjä osia pohjana, voidaan valmistaa oligo- • « • · · meerejä, joissa on noin 8 nukleootidia tai enemmän, joko pätkimällä tai synteettisesti, jotka * ( i ' 25 oligomeerit hybridisoituvat HCV-genomin kanssa ja ovat hyödyllisiä virusaineiden tunnis- ... tamisessa, virusgenomien lisäkarakterisoinnissa ja myös virusten osoittamisessa sairaissa • 1 · * · « ,···, yksilöissä. HCV-polynukleotidejä varten olevien koettimien (joko luonnollisten tai johdet- • · · .· . tujen) pituudet ovat sellaisia, että ne sallivat ainutkertaisten virussekvenssien osoittamisen • a ·

« I I

' hybridisaation avulla. Kun 6-8 nukleotidia voi olla toimiva pituus, pidetään 10-12 nukle- « · jo otidin sekvenssejä parempana ja noin 20 nukleotidia näyttää olevan optimi. Mieluummin • · ’·.1·. nämä sekvenssit ovat peräisin alueilta, joissa ei ole heterogeenisyyttä. Nämä koettimet voi- • 1 · daan valmistaa käyttäen rutiinimenetelmiä, sisältäen automatisoidut oligonukleotidin syn- 39 105046 teettiset menetelmät. Hyödyllisten koettimien joukossa ovat esimerkiksi ne, jotka ovat peräisin äskettäin eristetyistä klooneista, jotka on annettu tässä ja myös eri oligomeerit, jotka ovat hyödyllisiä cDNA-kiijastoja tutkittaessa, ja joita on kuvattu alla. Minkä tahansa HCV-. genomin ainutkertaisen osan komplementti on myös tyydyttävä. Käytettäväksi koettimina ' s on täydellinen komplementaarisuus toivottavaa, vaikka se voi olla tarpeetonta, kun fragmentin pituus kasvaa.

Sellaisten koettimien käyttämiseksi diagnostiikassa, biologista analysoitavaa näytettä, kuten verta tai seerumia, voidaan käsitellä haluttaessa sen sisältämien nukleiinihappojen uut-10 tamiseksi. Näytteestä tuloksena oleville nukleiinihapoille voidaan suorittaa geelielektrofo-reesi tai jokin muu koon mukaan erotteleva tekniikka; vaihtoehtoisesti nukleiinihapponäyte voidaan pisteblotata ilman kokoerottelua. Koettimet leimataan sitten. Sopivat leimat ja koettimien leimausmenetelmät ovat alalla tunnettuja ja sisältävät esimerkiksi radioaktiiviset leimat, jotka on liitetty nicktranslaation tai kinaasion avulla, biotiinin, fluoresoivat is koettimet ja kemiluminesoivat koettimet. Näytteestä uutettuja mukleiinihappoja käsitellään sitten leimatulla koettimella sopivan tiukoissa hybridisaatio-olosuhteissa ja polynukleotidi-dupleksit, jotka sisältävät koettimen, osoitetaan.

Koettimet voidaan tehdä täysin komplementaarisiksi HCV-genomille. Siksi hyvin tiukat "'i 20 olosuhteet ovat toivottavia väärien positiivisten estämiseksi. Kuitenkin hyvin tiukkoja olo- ::: suhteita tulisi käyttää vain, jos koettimet ovat komplementaarisia sellaiselle virusgenomin « « « i alueelle, jossa ei ole heterogeenisyyttä. Hybridisaation tiukkuuden määrittävät lukuisat hybridisaation aikaiset ja pesumenettelyn aikaiset tekijät, mukaanlukien lämpötila, ioni- • · · vahvuus, ajan pituus ja formamidin pitoisuus. Näitä tekijöitä on hahmotellut esimerkiksi * « · · * 25 Maniatis, T. (1982).

r ··· • · · • · ·

Yleisesti odotetaan, että HCV-genomia on läsnä infektoituneiden uksilöiden seerumissa • ·

• 2 I

. suhteellisen alhaisina tasoina, s.o. tasolla noin 10-10 simpanssin infektoivaa annosta I «

• I I

(CID) ml:aa kohti. Tämä taso voi vaatia, että hybridisaatioanalyysissä käytetään amplifl-,·. 30 kaatiotekniikkaa. Sellaiset tekniikat ovat alalla tunnettuja. Esimerkiksi Enzo Biochemical . Corporationin "Bio-Bridge"-jäijestelmä käyttää terminaalista deoksinukleotiditransferaasia # · · modifioimattomien 3'-poly-dT-häntien lisäämiseksi DNA-koettimeen. Poly- dT-häntäinen 40 105046 koetin hybridisoidaan kohdenukleotidisekvenssiin ja sitten biotiinimodifioituun poly-A:han. PCT-hakemus 84/03250 ja EP-julkaisu 124221 kuvaavat DNA-hybridisaatio-analyysiä, jossa: (1) analyytti lämpökäsitellään yksisäikeiseksi DNA-koettimeksi, joka on komplementaarinen entsyymileimatulle olinukleotidille; ja (2) tuloksena oleva hännällinen s dupleksi hybridisoidaan entsyymileimattuun oligonukleotidiin. EP-julkaisu 204510 kuvaa DNA-hybridisaatioanalyysiä, jossa analyytti-DNA saatetaan kosketuksiin koettimen kanssa, jolla on häntä, kuten poly-dT-häntä, amplifikaatiosäie, jossa on sekvenssi, joka hybri-disoituu koettimen häntään, kuten poly-A-sekvenssi, ja joka voi sitoa useita leimattuja säikeitä. Erityisen haluttava tekniikka voi ensin käsittää seerumissa kohteena olevien HCV-lo sekvenssien amplifikaation noin 10000-kertaiseksi, s.o. noin 106 sekvenssiin/ml. Tämä voidaan tehdä esimerkiksi polymeraasiketjureaktiotekniikalla (PCR), jonka ovat esittäneet Saiki et ai. (1986), Mullis US-patentissa 4,683,195 ja Mullis et ai. US-patentissa 4,683,202. Amplifioidut sekvenssit voidaan sitten osoittaa käyttäen hybridisaatioanalyysiä, jota on kuvattu EP-julkaisussa 317,077, joka on julkaistu 24.05.1989. Nämä hybridisaatio-15 analyysit, joiden tulisi havaita sekvenssit tasolla 106/ml, käyttävät nukleiinihappomul-timeerejä, jotka sitoutuvat yksisäikeiseen analyyttinukleiinihappoon ja jotka sitoutuvat myös moniin yksisäikeisiin leimattuihin oligonukleotideihin. Sopivaa liuosmuotoista sandwich-analyysiä, jota voidaan käyttää leimattujen polynukleotidikoettimien kanssa ja menetelmiä koettimien valmistamiseksi on kuvattu EP-julkaisussa 225,807, joka on jul-·;1: 20 kaistu 16.6.1987.

• 'Koettimet voidaan pakata diagnostisiksi välinesaijoiksi. Diagnostiset välinesaijat sisältävät ’ ’ koetin-DNA:n, joka voi olla leimattu; vaihtoehtoisesti koetin-DNA voi olla leimaamaton ja • i • · · ';1·' leimaamistarvikkeet voivat sisältyä välinesaijaan erillisissä säiliöissä. Välinesaija voi myös

Φ I I I I I

• 25 sisältää muita sopivasti pakattuja reagensseja ja materiaaleja, joita tarvitaan tiettyä hybri- disaatiotoimintatapaa varten, esimerkiksi standardeja ja myös ohjeet kokeen suorittamisek- « · ··· si.

• · ·

I I

Immunologinen analyysi ia diagnostiset välinesariat • · 50 * ·

Sekä polypeptidit, jotka reagoivat immunologisesti HCV-vasta-aineita sisältävän seerumin kanssa, esimerkiksi ne, jotka on osoitettu alla esimerkeissä kuvatulla antigeenin seulonta- ,, 105046 41 menetelmällä ja myös ne, jotka ovat peräisin esimerkeissä kuvatuista eristetyistä klooneista tai jotka ovat niissä kooditettuja ja niiden komposiitit ja vasta-aineet, jotka ovat syntyneet näissä polypeptideissä olevia HCV:n spesifisiä epitooppeja vastaan, ovat hyödyllisiä immunologisissa analyyseissä HCV-vasta-aineiden läsnäolon osoittamiseksi tai viruksen s ja/tai virusantigeenien osoittamiseksi biologisissa näytteissä. Immunologisten analyysien suunnittelu on suuren vaihtelun kohde ja näitä tunnetaan alalla lukuisia. Esimerkiksi immunologinen analyysi voi käyttää yhtä virusepitooppia; vaihtoehtoisesti immunologinen analyysi voi käyttää virusepitooppien yhdistelmää, jotka epitoopit ovat peräisin näistä lähteistä; nämä epitoopit voivat olla peräisin samasta tai eri viruspolypeptideistä ja ne voivat 10 olla erillisissä yhdistelmä- tai luonnon polypeptideissä tai yhdessä samoissa yhdistelmäpo-lypeptideissä. Se voi käyttää esimerkiksi monoklonaalista vasta-ainetta, joka on suunnattu virusepitooppeja vastaan, monoklonaalisten vasta-aineiden yhdistelmää, joka on suunnattu yhden virusantigeenin epitooppeja vastaan, monoklonaalisia vasta-aineita, jotka ovat suunnatut erilaisten virusantigeenien epitooppeja vastaan, polyklonaalisia vasta-aineita, jotka on is suunnattu samaa virusantigeeniä vastaan tai polyklonaalisia vasta-aineita, jotka ovat suunnattuja eri virusantigeenejä vastaan. Toimintatavat voivat perustua esimerkiksi kilpailuun, tai suoraan reaktioon tai sandwich-tyyppisiin analyyseihin. Toimintatavat voivat myös käyttää esimerkiksi kiinteitä kantajia tai ne voidaan tehdä immunosaostamalla. Useimpiin analyyseihin liittyy leimatun vasta-aineen tai polypeptidin käyttö; leimat voivat olla esi-20 merkiksi fluoresoivia, kemiluminesoivia, radioaktiivisia tai värillisiä molekyylejä. Ana- » :lyysit, jotka vahvistavat koettimelta tulevat signaalit, ovat myös tunnettuja; joista esimerk-; '.: kejä ovat analyysit, jotka käyttävät biotiinia ja avidiinia ja entsyymileimattuja ja entsyymi- ' ' välitteisiä immunologisia analyysejä, kuten ELISA-analyysiä.

• · « • · * • · • · · # · · · • · » ’ 25 Jotkin oletetun polyproteiinin antigeenialueet on kartoitettu ja identifioitu seulomalla ^ ..... HCV:n cDNA:oiden, jotka koodittavat polyproteiinin osaa, bakteeriekspressiotuotteiden • · · antigeenisyyttä. Katso esimerkkejä. Muita HCV:n antigeenialueita voidaan osoittaa eks- • · · .' . pressoimalla HCV:n cDNA:oiden alueet muissa ekspressiojäijestelmissä, sisältäen hiivajär- . Il jestelmät ja solujäijestelmät, jotka ovat peräisin hyönteisistä ja selkärankaisista. Lisäksi f 30 tutkimukset, jotka antavat antigeenisyysindeksin ja hydrofobisuus/hydrofiilisyysprofiilin,

I

!‘. antavat tietoa, joka koskee alueen antigeeni syyden todennäköisyyttä.

• Il « · 42 . 105046

Tutkimukset antigeenisyyden kartoituksesta ekspressoimalla HCV:n cDNA:oita, osoittivat, että lukumäärä klooneja, jotka sisältävät näitä cDNAroita, ekspressoivat polypeptidejä, jotka olivat immunologisesti reaktiokykyisiä seerumin kanssa, joka tuli yksilöistä, joilla oli NANBH. Mikään yksittäinen polypeptidi ei ollut immunologisesti reaktiokykyinen kaikki-s en seerumien kanssa. Viisi näistä polypeptideistä oli hyvin immonogeenistä siinä, että HCV-epitooppien vasta-aineita näissä polypeptideissä osoitettiin monissa eri potilasseeru-meissa, vaikka osoituksen päällekkäisyys ei ollutkaan täydellinen. Täten eri klooneissa kooditettujen polypeptidien immunogeenisyystulokset ehdottavat, että tehokkaat osoitus-jäijestelmät voivat sisältää epitooppipaneelien käytön. Paneelin epitoopit voivat olla ra-10 kennettuja yhteen tai moniin polypeptideihin.

Välinesaijat, jotka ovat sopivia immunologisia diagnooseja varten ja jotka sisältävät sopivasti leimattuja reagensseja, ovat rakennetut pakkaamalla sopivat materiaalit, mukaanlukien keksinnön polypeptidit, jotka sisältävät HCV-epitooppeja tai HCV-epitooppeja is vastaan suunnattuja vasta-aineita sopivissa astioissa yhdessä niiden muiden reagenssien ja materiaalien kanssa, joita vaaditaan analyysin suorittamiseksi ja myös sopivat analyysioh-jeet.

HCV-eenomin. virionien ia virusantieeenien lisäkarakterisointi käyttäen koettimia. jotka "' ‘ · 20 ovat peräisin virusgenomin cDNA:sta • » • « · • · · • « · » : ·' HCV:n cDNA-sekvenssitietoa äskettäin eristetyissä klooneissa, joita kuvataan esimerkeis- sä, voidaan käyttää saamaan lisää tietoa HCV-genomin sekvenssistä ja tunnistamaan ja * · « *;/ eristämään HCV-aine ja täten se auttaa sen karakterisoinnissa sisältäen genomin luonteen, I t · t « r 25 viruspartikkelin rakenteen ja niiden antigeenien luonteen, joista se koostuu. Tämä tieto vuorostaan voi johtaa lisämäärään polynukleotidikoettimia, polypeptidejä, jotka ovat pe- • « · t räisin HCV-genomista ja vasta-aineita HCV-epitooppeja vastaan, jotka voisivat olla hyö- .* . dyllisiä HCV:n aiheuttaman NANBH:n diagnoosissa ja/tai hoidossa.

jo Yllämainittujen kloonien cDNA-sekvenssitieto on hyödyllinen suunniteltaessa koettimia • · • · lisä-cDNA-sekvenssien erottamiseksi, jotka ovat peräisin HCV-genomien vielä tunnista- • «· mattomilta alueilta, joista genomeista cDNA:t tässä ja EP-julkaisussa 318,216 kuvatuissa 43 105046 klooneissa ovat peräisin. Esimerkiksi leimattuja koettimia, jotka sisältävät noin 8 tai enemmän nukleotidin sekvenssin ja mieluummin 20 tai enenmmän nukleotidin sekvenssin, jotka nukleotidit ovat peräisin alueilta, jotka ovat lähellä kuviossa 17 esitettyjen yhdistel-mä-HCV:n cDNA-sekvenssin 5-päätä tai 3'-päätä, voidaan käyttää eristämään päällekkäin s meneviä cDNA-sekvenssejä HCV:n cDNA-kirjastoista. Vaihtoehtoisesti genomi-* segmenttien karakterisointi voitaisiin tehdä virusgenomeista, jotka on eristetty puhdiste tuista HCV-partikkeleista. Menetelmiä HCV-partikkeleiden puhdistamiseksi ja niiden osoittamiseksi puhdistusmenettelyn aikana kuvataan tässä alla. Menettelyt polynukleoti-digenomien eristämiseksi viruspartikkelista ovat tunnettuja alalla ja eräs käyttökelpoinen to menetelmä on kuvattu EP-julkaisussa 218,316. Eristetyt genomisegmentit voitaisiin sitten kloonata ja sekventoida. Esimerkki tästä tekniikasta, mikä käyttää kloonattavien sekvenssien monistusta, on annettu alla ja se antoi tuloksena kloonin 16jh.

Menetelmät cDNA-kiijastojen luomiseksi ovat alalla tunnettuja ja niistä keskustellaan is ylempänä ja alempana; menetelmästä HCV-.n cDNA-kiijaston luomiseksi lambda-gtll-vektoriin keskustellaan EP-julkaisussa 318,216. Kuitenkin cDNA-kiijastoja, jotka ovat käyttökelpoisia nukleiinihappokoettimilla seulomiseen, voidaan myös rakentaa muilla alalla tunnetuilla vektoreilla, esimerkiksi lambda-gtlO:llä (Huynh et ai. (1985)).

’:: 20 HCV:ta vastaan suunnattujen antiviraalisten aineiden seulonta * ·

• I I

• * «

Soluviljelmä- ja eläinmallijärjelmien saatavuus HCV:tä varten tekee myös mahdolliseksi HCV:n replikaation estävien viruksenvastaisten aineiden seulonnan ja erityisesti sellaisten • · # • · · aineiden seulonnan, jotka etupäässä sallivat solujen kasvun ja monistumisen, mutta estävät * ! i * 25 virusten replikaation. Nämä seulontamenetelmät ovat tunnettuja alan ammattilaisille. Ylei- ,.·:·. sesti virusten vastaisia aineita testataan lukuisilla pitoisuuksilla niiden tehon suhteen estää viruksen replikaatio solunviljelyjäijestelmissä, jotka tukevat viruksen replikaatiota ja sitten ; viruspatogeenin infektiivisyyden eston suhteen (ja alhaisen tason myrkyllisyyden suhteen) * · eläinmallijäijestelmässä.

.·'··. 30 • · Nämä menetelmät ja koostumukset, jotka tässä annetaan HCV-antigeenien ja HCV- * t · • * polynukleotidien havaitsemiseksi, ovat hyödyllisiä virusten vastaisten aineiden seulonnassa 44 105046 siinä, että antavat vaihtoehdon ja ehkä herkemmän välineen aineen tehon havaisemiseen virasreplikaation suhteen, kuin soluplakkianalyysi tai ID50-analyysi. Esimerkiksi tässä kuvattuja HCV-polynukleotidikoettimia voidaan käyttää soluviljelmässä tuotetun virusnukle-iinihapon määrän selvittämisessä. Tämä voitaisiin tehdä esimerkiksi infektoitujen so-5 lunukleiinihappojen hybridisaation tai kilpailevan hybridisaation avulla leimatun HCV-polynukleotidikoettimen kanssa. Esimerkiksi myös anti-HCV-vasta-aineita voidaan käyttää soluviljelmässä olevien HCV-antigeenien tunnistamiseen ja niiden määrän selvittämiseen käyttäen tässä kuvattuja immunologisia analyysejä. Lisäksi, koska voi olla toivottavaa selvittää HCV-antigeenien määrä infektoidussa soluviljelmässä kilpailuanalyysillä, tässä ίο kuvattuihin HCV:n cDNAroihin kooditetut polypeptidit ovat hyödyllisiä näissä kilpai-luanalyyseissä. Yleisesti yhdistelmä-HCV-polypeptidi, joka on peräisin HCV:n cDNA:sta, voisi olla leimattu ja tämän leimatun polypeptidin sitoutumisen estoa HCV-polypeptidiin soluviljelmäjäijestelmässä tuotetun antigeenin takia, tarkkailtaisiin. Lisäksi nämä tekniikat ovat erityisen hyödyllisiä tapauksissa, joissa HCV voi kyetä replikoituinaan solulinjassa is aiheuttamatta solukuolemaa.

Viruksenvastaiset aineet, jotka voidaan testata tehon suhteen näillä menetelmillä, ovat alalla tunnettuja ja sisältävät esimerkiksi ne, jotka vaikuttavat toisiinsa virioni- komponenttien ja/tai solukomponenttien kanssa, jotka ovat välttämättömiä viruksen sitou- 20 tumista ja/tai replikointia varten. Tyypilliset viruksenvastaiset aineet voivat sisältää esi- ::; merkiksi virionipolymeraasin ja/tai -proteaasin, jotka ovat tarpeen esivaiheen polypeptidien : .· lohkaisemiseksi, inhibiittorit. Muut viruksenvastaiset aineet voivat sisältää ne, jotka vaikut- ' * tavat nukleiinihappoihin estääkseen virusreplikoinnin, esimerkiksi antisense- • · · polynukleotidit jne.

• · « • t ·

2S

...^ Antisense-polynukleotidimolekyylit muodostuvat komplementaarisesta nukleotidisek- • · · venssistä, joka sallii niiden hybridisoitumisen spesifisesti RNA:oiden genomien annettui- • · · . hin alueisiin. Antisense-polynukleotidit voivat sisältää esimerkiksi molekyylit, jotka estä- « · · • · · ' vät proteiinitranslaation sitoutumalla mRNA:han tai ne voivat olla molekyylejä, jotka estä- « · 1 vät virus-RNA:n replikoinnin transkriptaasilla. Ne voivat myös sisältää molekyylejä, jotka • · • · kuljettavat aineita (ei-kovalenttisesti kiinnittyneitä tai kovalenttisesti sidottuja), jotka ai- • · · heuttavat virus-RNA:n olemisen ei-aktiivinen aiheuttamalla esimerkiksi leikkauksia virus- 45 105046 RNAihan. Ne voivat myös sitoutua solupolynukleotideihin, jotka vahvistavat ja/tai joita vaaditaan viruksen tartuntakykyä, replikoitumiskykyä tai kroonisuutta varten. Antisense-molekyylit, joiden tulee hybridisoitua HCVistä peräisin oleviin RNA:oihin, voidaan suunnitella perustuen tässä annettuun HCV:n cDNAroiden sekvenssitietoon. Viruksenvas-5 täiset aineet, jotka perustuvat HCV:n antisense-polynukleotideihin, voidaan suunnitella *· sitoutumaan suurella spesifisyydellä, olemaan liukoisuudeltaan lisääntynyt, olemaan sta biili ja olemaan myrkyllisyydeltään alhainen. Niinpä niitä voidaan toimittaa erikoisjäijes-telmissä, esimerkiksi liposomeissa tai geeniterapialla. Lisäksi ne voivat sisältää analogeja, kiinnittyneitä proteiineja, substituoidun tai muutetun sidoksen emäksien välillä jne.

10

Muun tyyppiset lääkkeet voivat perustua polynukleotideihin, jotka "matkivat" tärkeitä HCV-genomin säätelyalueita ja jotka voivat olla hoitavia johtuen niiden keskinäisistä vaikutuksista järjestelmän avainkomponenttien kanssa, jotka ovat vastuussa viruksen tarttuvuudesta tai replikoinnista. is

Yleisiä menetelmiä

Yleiset tekniikat, joita käytetään genomin uuttamiseen viruksesta, cDNA-kiijaston valmistamiseen ja testaamiseen, kloonien sekventoimiseen, ekspressiovektoreiden rakentamiseen, 20 solujen transformoimiseen, immunologisten analyysien, kuten radioimmunologiset ana- • ♦ v.: lyysit ja ELISA-analyysit, suorittamiseen, solujen kasvattamiseen viljelmässä ja sen kai- : V täisiin, ovat alalla tunnettuja ja laboratoriokäsikiijoja, jotka kuvaavat näitä tekniikoita, on saatavana. Kuitenkin yleisenä ohjeena seuraava asettaa esiin muutamia lähteitä, jotka ovat • » v 1/, nykyään saatavilla sellaisia menettelyjä varten ja materiaaleja varten, jotka ovat hyödyllisiä f* · * » » · ' 2S niiden suorittamiseksi.

• ·· <* ♦ · • · ·

Sekä prokariootti- että eukariootti-isäntäsoluja voidaan käyttää haluttujen kooditussek- • . venssien ekspressiota varten, kun käytetään sopivia säätösekvenssejä, jotka ovat yhteen- ...,: sopivia aiotun isännän kanssa. Prokariootti-isäntien joukosta käytetään useimmiten E. Co- 30 li’a. Ekspression säätösekvenssit prokarioottisoluja varten sisältävät promoottoreita, jotka • « sisältävät mahdollisesti operaattoriosia, ja ribosomin sitoutumispaikkoja. Siirtovektorit, · · jotka ovat yhteensopivia prokariootti-isäntien kanssa, ovat yleensä peräisin esimerkiksi 46 105046 pBR322:sta, plasmidista, joka sisältää operoneja, jotka antavat ampisilliini- ja tetrasykliini-resistenssin ja erilaisia pUC-vektoreita, jotka myös sisältävät sekvenssejä, jotka antavat antibioottiresistenssimarkkereita. Näitä markkereita voidaan käyttää saamaan onnistuneita transformantteja valinnan kautta. Yleisesti käytetyt prokarioottisäätösekvenssit sisältävät s betalaktamaasi- (penisillinaasi) ja laktoosipromoottorijäijestelmiä (Chang et ai. (1977)), tryptofaanipromoottorijäijestelmän (trp) (Goeddel et ai. (1980)) ja lambdajohdetun PL-promoottorin ja N-geenin ribosomin sitoutumispaikan (Shimatake et ai. (1981)) ja hybridin tac-promoottorin (De Boer et ai. (1983)), joka on peräisin trp-ia lac-UV5-promoottoreiden sekvensseistä. Edelläolevat järjestelmät ovat erityisen yhteensopivia E. Coli:n kanssa; haro luttaessa voidaan käyttää muita prokariootti-isäntiä, kuten Bacillus- tai Pseudomonas-kantoja voidaan käyttää vastaavien säätösekvenssien kanssa.

Eukariootti-isännät sisältävät hiiva- ja nisäkässolut viljelyjäijestelmissä. Saccharomvces cerevisiae ja Saccharomvces carlsbereensis ovat yleisimmin käytettyjä hiivaisäntiä ja ne n ovat mukavia sieni-isäntiä. Hiivaan sopivissa vektoreissa on markkereita, jotka sallivat onnistuneiden transformanttien valinnan antamalla prototrofian auksotrooppisille mutan-teille tai resistenssin raskaille metalleille villityyppisillä kannoilla. Hiivojen kanssa yhteensopivat vektorit voivat käyttää 2 pm:n replikaatioalkua (Broach et ai. (1983)), CEN3:n ja ARSl:n yhdistelmää tai muita välineitä replikaation varmistamiseksi, kuten sekvenssejä, : 20 jotka aikaansaavat sopivan fragmentin liittymisen isäntäsolun genomiin. Säätösekvenssit hiivavektoreita varten ovat tunnettuja alalla ja sisältävät promoottoreita glykolyyttisten ; . entsyymien synteesiä varten (Hess et ai. (1968); Holland et ai. (1978)), sisältäen pro- ’ * moottorin 3-fosfoglyseraattikinaasia varten (Hitzeman (1980)). Terminaattoreita voidaan • * • « · *·]·* myös sisällyttää, kuten niitä, jotka ovat peräisin enolaasigeenistä (Holland (1981)). Erityi- • « · • · · * 25 sen hyödyllisiä säätöjärjestelmiä ovat ne, jotka käsittävät glyseraldehydi-3- fosfaattidehydrogenaasipromoottorin (GAPDH) tai alkoholidehydrogenaasin (ADH) sää- i • · · dettävän promoottorin, terminaattoreita, jotka ovat peräisin myös GAPDH:sta ja jos halu- • · · ,* . taan eritystä, johtosekvenssi hiivan alfatekijästä. Lisäksi transkriptiota säätävä alue ja • « * ’.j transkription aloittava alue, jotka ovat toiminnallisesti liitettyjä toisiinsa, voivat olla sellai- .·. 30 siä, että ne eivät luonnostaan liity villityyppisiin organismeihin. Näitä järjestelmiä kuva- • · • · taan yksityiskohtaisesti EP-julkaisuissa 120,551, julkaistu 3.10.1984; 116,201, julkaistu • * · • · · • · 47 105046 22.8.1984 ja 164,556, julkaistu 18.12.1985, jotka ovat kaikki tämän keksinnön hakijan omistuksessa ja joihin tässä viitataan.

Imettäväissolulinjat, jotka ovat saatavissa isäntinä ekspressiota varten, ovat tunnettuja s alalla ja sisältävät monia elossa pidettyjä solulinjoja, jotka ovat saatavilla American Type t Culture Collection'ista (ATCC), sisältäen HeLa-solut, kiinalaisen hamsterin munasaijasolut (CHO), hamsterinpoikasen munuaissolut (BHK) ja lukuisia muita solulinjoja. Alalla tunnetaan myös sopivia promoottoreita imettäväissoluja varten ja ne sisältävät viruspromootto-reita, kuten ne jotka ovat peräisin Ihmisapinaviruksesta 40 (SV40) (Fiers (1978)), Rous'n to sarkoomaviruksesta (RSV), adenoviruksesta (ADV) ja härän papilloomaviruksesta (BPV). Imettäväissolut voivat myös vaatia terminaattorisekvenssejä ja poly-A-additiosekvenssejä; vahvistussekvenssejä, jotka lisäävät ekspressiota voidaan myös sisällyttää ja sekvenssit, jotka aiheuttavat geenin amplifikaation, voivat olla myös haluttavia. Nämä sekvenssit ovat alalla tunnettuja. Imettäväissoluissa tapahtuvaa replikaatiota varten sopivat vektorit voivat n sisältää virusreplikoneja tai sekvenssejä, jotka varmistavat sopivien NANBV-epitooppeja koodittavien sekvenssien integraation isäntägenomiin.

Transformaatio voidaan suorittaa millä tahansa tunnetulla menetelmällä polynukleotidien viemiseksi isäntäsoluun, sisältäen esimerkiksi polynukleotidin pakkaamisen virukseen ja *: ’ ·: 20 isäntäsolun muuntamisen viruksella tai polynukleotidin suoralla otolla. Käytetty transfor- ’.v maatiomenettely riippuu trasformoitavasta isännästä. Esimerkiksi E. Coli-isäntäsolujen I « : '.· transformaatiosta BB-NANBV-sekvenssejä sisältävällä lambda-gtl 1-vektorilla keskustel laan esimerkkiosassa alla. Bakteeritransformaatio suoralla otolla yleensä käyttää käsittelyä • · · kalsium- tai rubidiumkloridilla (Cohen (1972); Maniatis (1982)). Hiivatransformaatio suo- 25 ralla otolla voidaan suorittaa käyttäen Hinnen et ai. (1978) menetelmää. Imettäväis- ;·, transformaatio suoralla otolla voidaan suorittaa käyttäen kalsiumfosfaattisaostusmenetel- « · · mää, jonka ovat esittäneet Graham ja Van der Eb (1978) tai sen erilaisia tunnettuja muun- 9 .* . noksia.

• * · • · * • · « « jo Vektorin rakentaminen käyttää tekniikoita, jotka ovat alalla tunnettuja. Paikkaspesifmen • t • · i''. DNA-lohkaisu suoritetaan käsittelemällä sopivilla restriktioentsyymeillä olosuhteissa, jotka • «· on yleensä määritellyt näiden kaupallisesti saatavien entsyymien valmistaja. Yleensä noin 48 105046 1 pg plasmidia tai DNA-sekvenssiä lohkaistaan 1 yksiköllä entsyymiä noin 20 μ1:η puskuriliuoksessa inkuboimalla 1 - 2 tuntia 37°C lämpötilassa. Restriktioentsyymillä inku-boinnin jälkeen proteiini poistetaan fenoli/kloroformiuutoksella ja DNA palautetaan saos-tamalla etanolilla. Lohjenneet fragmentit voidaan erottaa käyttäen polyakryyliamidi- tai s agaroosigeelielektroforeesitekniikoita niiden yleisten menettelytapojen mukaan, jotka löydetään julkaisusta Methods in Enzymology (1980) 65:499-560.

Tarttuvapäisiä lohkaisufragmentteja voidaan typistää päästään käyttäen E.Coli'n DNA-polymeraasi I:tä (Klenow) sopivien deoksinukleotiditrifosfaattien (dNTP) ollessa läsnä to seoksessa. Käsittelyä Sl-nukleaasilla voidaan myös käyttää, mistä tulee tulokseksi minkä tahansa yksisäikeisen DNA-osien hydrolyysi.

Liittämiset suoritetaan käyttäen standardeja puskuri- ja lämpötilaolosuhteita käyttäen T4-DNA-ligaasia ja ATP:tä; tarttuvapäiset liittämiset vaativat vähemmän ATP:tä ja vähemmän is ligaasia kuin tylppäpäiset liitokset. Kun vektori fragmentteja käytetään osana liitosseosta, vektorifragmenttia käsitellään usein bakteerin alkaalifosfataasilla (BAP) tai vasikan suolen alkaalifosfataasilla 5'-fosfaatin poistamiseksi ja täten vektorin uudelleen liittymisen estämiseksi; vaihtoehtoisesti haluamattomien fragmenttien restriktioentsyymikatkominen voidaan suorittaa liittymisen estämiseksi.

’: ”: 20 ^ I

Liittymisseokset transformoidaan sopiviin kloonausisäntiin, kuten E. Coli'in ja onnistuneet • I ·

I I I

: transformantit valitaan esimerkiksi antibioottiresistenssin perusteella ja ne seulotaan oikean rakenteen löytämiseksi.

• · · • · · • · • · « * · · * • * · 25 Synteettisiä oligonukleotideja voidaan valmistaa käyttäen automatisoituja oligonukleotidi-syntetisoijia, kuten Warner (1984) kuvaa. Haluttaessa synteettiset säikeet voidaan leimata • ♦ · 32P:llä käsittelemällä polynukleotidikinaasilla 32P-ATP:n läsnäollessa käyttäen standardeja . reaktio-olosuhteita.

• « · • * • · . 30 DNA-sekvenssejä, mukaanlukien ne, jotka on eristetty cDNA-kiijastoista, voidaan muoka- • t » · ta tunnetuilla tekniikoilla, sisältäen esimerkiksi paikkasuunnatun mutagenoinnin, jota on « · · • · kuvannut Zoller (1982). Lyhyesti muokattava DNA pakataan faagiin yksisäikeisenä sek- 49 105046 venssinä ja se muutetaan kaksisäikeiseksi DNA.ksi DNA-polymeraasilla käyttäen alukkee-na synteettistä oligonukleotidia, joka on komplementaarinen DNA:n muokattavalle osalle ja jossa on haluttu modifikaatio sisältyvänä omaan sekvenssiinsä. Tuloksena oleva kaksi-säikeinen DNA transformoidaan faagiin, joka kantaa isäntäbakteeria. Transformoidun s bakteerin viljelmät, jotka sisältävät faagin kunkin säikeen replikaatiotuotteita, pinnoitetaan ' agariin plakkien saamiseksi. Teoreettisesti 50 % uusista plakeista sisältää faagin, jossa on mutaatiosekvenssi ja jäljellä olevassa 50 %:ssa on alkuperäinen sekvenssi. Plakkien repli-kaatit hybridisoidaan leimattuihin synteettisiin koettimiin lämpötiloissa ja olosuhteissa, jotka sallivat hybridisaation oikean säikeen kanssa, mutta ei modifioimattoman sekvenssin ίο kanssa. Sekvenssit, jotka on tunnistettu hybridisaation avulla, otetaan talteen ja kloonataan.

DNA-kiijastoja voidaan seuloa koettimilla käyttäen Grunsteinin ja Hognessin (1975) menetelmää. Lyhyesti tässä menettelyssä tutkittava DNA immobilisoidaan nitroselluloosa-filttereille, denaturoidaan ja esihybridisoidaan puskurin kanssa, joka sisältää 0-50 % for-15 mamidia, 0,75 M NaCl.a, 75 mM Na-sitraattia, 0,02 % (w/v) häränseerumialbumiinia, po-lyvinyylipyrrolidonia ja Fricoll'ia kutakin, 50 mM Na-fosfaattia (pH 6,5), 0,1 % SDS:a ja 100 μg/ml kantajadenaturoitua DNA:ta. Formamidin prosenttimäärä puskurissa ja myös esihybridisaatio- ja sen jälkeisen hybridisaatiovaiheiden aika- ja lämpötilaolosuhteet riippuvat vaadittavasta ankaruudesta. Oligomeerikoettimia, jotka vaativat alhaisemman anka-. ,,: 20 rat olosuhteet, käytetään yleisesti alhaisten formamidimäärien, alhaisempien lämpötilojen : ’; ja pitempien hybridisaatioaikojen kanssa. Koettimet, jotka sisältävät enemmän kuin 30 tai

I I

;' · 40 nukleotidia, kuten ne, jotka ovat peräisin cDNAtsta tai genomisekvensseistä, käyttävät yleensä korkeampia lämpötiloja, esim. noin 40-42°C ja korkeaa formamidipitoisuutta, V.1 esim. 50 %. Seuraten esihybridisaatiota 5'-32P-leimattu oligonukleotidikoetin lisätään pus- * ·1< • · · ·’ ’ 25 kuriin ja filttereitä inkuboidaan tässä seoksessa hybridisaatio-olosuhteissa. Pesun jälkeen käsitellyt filtterit autoradiografoidaan hybridisoidun koettimen paikan osoittamiseksi; • · DNA:ta vastaavissa paikoissa alkuperäisillä agarlevyillä käytetään halutun DNA:n lähtee- • · · • · · nä.

• · • · · 9 t · • · · . 30 Rutiineja vektorirakenteita varten liitosseokset transformoidaan E. Coli-kantaan HB 101 tai ·«· ’··' muuhun sopivaan isäntään ja onnistuneet transformantit valitaan antibioottiresistenssin tai f'· · muiden markkereiden avulla. Sitten valmistetaan plasmideja transformanteista Clevvell et so . 105046 ai. (1969) esittämän menetelmän mukaisesti, tavallisesti seuraten klooriani feniko-liampliiikaatiota (Clewell (1972)). DNA eristetään ja analysoidaan tavallisesti restriktio-entsyymianalyysin ja/tai sekventoimisen avulla. Sekventoiminen voidaan tehdä dideok-simenetelmällä, jonka on esittänyt Sanger et ai. (1977) ja jota on edelleen kuvannut Mes-, s sing et ai. (1981) tai menetelmällä, jonka on kuvannut Maxam et ai. (1980). Ongelmat, jotka liittyivät nauhojen kokoonpuristumiseen, mitä huomataan joskus GC-rikkailla alueilla, voitettiin käyttämällä T-deatsoguanosiinia Barr et ai. (1986) mukaisesti.

Entsyymiliittävää immunosorbenttianalyysiä (ELISA) voidaan käyttää mittaamaan joko ίο antigeeni- tai vasta-ainepitoisuuksia. Tämä menetelmä riippuu entsyymin liittymisestä joko antigeeniin tai vasta-aineeseen ja se käyttää sidotun entsyymin aktiivisuutta kvantitatiivisena leimana. Vasta-aineen mittaamiseksi tunnettu antigeeni kiinnitetään kiinteään faasiin (esim. mikrolevyyn tai muovikuppiin), sitä inkuboidaan tutkittavan seerumin laimennoksilla, pestään, inkuboidaan entsyymillä leimatun anti-immunoglobuliinin kanssa ja pestään is taas. Leimaukseen sopivat entsyymit ovat alalla tunnettuja ja sisältävät esimerkiksi pipar-juuriperoksidaasin. Kiinteään faasin sidottu entsyymiaktiivisuus mitataan lisäämällä spesifistä substraattia ja määrittämällä tuotteen muodostuminen tai substraatin käyttö kolorimet-risesti. Sidottu entsyymiaktiivisuus on suora sidotun vasta-aineen määrän funktio.

,.,.: 20 Antigeenin mittaamiseksi kiinnitetään tunnettu spesifinen vasta-aine kiinteään faasiin, lisä- .'.'; tään tutkittava materiaali, joka sisältää antigeenin, inkuboinnin jälkeen kiinteä faasi pestään • < ja lisätään toinen entsyymileimattu vasta-aine. Pesun jälkeen lisätään substraatti ja ent- *:**ί syymiaktiivisuus arvioidaan kolorimetrisesti ja se suhteutetaan antigeenipitoisuuteen.

• · • · f • · · • ·

Ml *.· ’ 25 Esimerkit • · · • · ·

Alla on kuvattu tämän keksinnön esimerkkejä, jotka on annettu vain kuvaamistarkoitukses- ti· • · t ’. sa, eikä rajoittamaan tämän keksinnön piiriä. Tämän selvityksen valossa lukuisat suoritus- • · « · · '· '· muodot vaatimusten suojapiirissä ovat ilmeisiä alan keskitason ammattimiehille.

« « 30 • » · 1 · »Il « · ·

• I

si 105046 Päällekkäin menevien HCV:n cPNA-kloonien 13i. 26i. CA59a. CA84a. CA156e ia CAI67b eristäminen ia sekvenssi

Kloonit 13i, 26j, CA59a, CA84a, CA156e ja CA167b eristettiin lambda-gtll-kiijastosta, s joka sisältää HCV:n cDNA.ta (ATCC No. 40394), jonka valmistus on kuvattu EP-T julkaisussa 318,216 (julkaistu 31.05.1989) ja julkaisussa WO 89/04669 (julkaistu 01.06.1989). Kiijaston seulonta tapahtui koettimilla, joita kuvataan alla, käyttäen menetelmää, jonka on kuvannut Huynh (1985). Frekvenssi, jolla positiivisia klooneja ilmestyi vastaavien koettimien kanssa on noin 1:50000.

10

Kloonin 13i eristäminen suoritettiin käyttäen synteettistä koetinta, joka oli peräisin kloonin 12f sekvenssistä. Koettimen sekvenssi oli: 5' GAA CGT TGC GAT CTG GAA GAC AGG GAC AGG 3'.

is Kloonin 26j eristäminen suoritettiin käyttäen koetinta, joka oli peräisin kloonin K9-1 5'-alueelta. Koettimen sekvenssi oli: 5' TAT CAG TTA TGC CAA CGG AAG CGG CCC CGA 3'.

Kloonin 12f ja kloonin k9-l (jota kutsutaan myös K9-l:ksi) eristysmenettelyt on kuvattu . 20 EP-julkaisussa 318,216 ja niiden sekvenssit on esitetty kuvioissa 1 ja vastaavasti 2. Kloo- t · ... nien 13i ja 26j HCV:n cDNA-sekvenssit on esitetty kuvioissa 4 ja vastaavasti 5. Niissä on « · esitetty myös niihin kooditetut aminohapot ja myös kloonin 13i päällekkäisyys kloonin 12f » · kanssa ja kloonin 26j päällekkäisyys kloonin 13i kanssa. Näiden kloonien sekvenssit var- :Y: mistivat kloonin K9-1 sekvenssin. Klooni K9-1 oli eristetty eri HCV:n cDNA-kiijastosta « · V:'s (Ks. EP-218,316).

«r • ·# *.* * Klooni CA59a eristettiin käyttäen koetinta, joka perustui kloonin 26j 5'-alueeseen. Tämän ··· *·* *·’ koettimen sekvenssi oli: ‘/•j -5' CTG GTT AGC AGG GCT TTT CTA TCA CCA CAA 3'.

» 30

Kloonin CA59a sekvenssistä peräisin olevaa koetinta käytettiin eristämään klooni CA84a.

* » •.’ · Tätä eristystä varten käytetyn koettimen sekvenssi oli: 52 105046 5' AAG GTC CTG GTA GTG CTG CTG CTA TTT GCC 3'.

Klooni CA156e eristettiin käyttäen koetinta, joka oli peräisin kloonin CA84a sekvenssistä. Koettimen sekvenssi oli: s 5' ACT GGÄ CGA CGC AAG GTT GCA ATT GCT CTA 3'.

' Klooni CAI 67b eristettiin käyttäen koetinta, joka oli peräisin kloonin CA156e sekvenssis tä. Koettimen sekvenssi oli: 5' TTC GAC GTC ACA TCG ATC TGC TTG TCG GGA 3'.

10 HCV:n cDNAioiden nukleotidisekvenssit klooneissa CA59a, CA84a, CA156e ja CA167b on esitetty vastaavasti kuvioissa 6, 7, 8 ja 9. Niissä kooditetut aminohapot ja myös päällekkäisyys relevanttien kloonien kanssa on myös esitetty kuvioissa.

is HCV:n cDNA-kiriaston "pj" luominen HCV:n cDNA-kiijasto, "pi"-kiijasto, rakennettiin samasta erästä infektoitunutta simpanssin plasmaa, mitä käytettiin HCV:n cDNA:n lambda-gtl 1-kiijaston rakentamiseen (ATCC No. 40394), mitä kuvattiin EP-julkaisussa No. 318,216 ja käyttäen olennaisesti samoja teknii-. 2o koita. Kuitenkin pi-kiijaston rakentaminen käytti alukepidennysmenetelmää, jossa kään- I · f. . t teistranskriptaasin aluke perustui kloonin CA59A sekvenssiin. Alukkeen sekvenssi oli: ;V. 5' GGT GAC GTG GGT TTC 3'.

• · • t • ff

Kloonin pii4a eristäminen ia sekvenssi • · i·· i i * 25

% · · *J

HCV:n cDNA-kiijaston "pi", jota kuvattiin yllä, seulonta koettimella, jota käytettiin eris- ··· '·,! · tämään klooni CAI67b (Ks. yllä) antoi tuloksena kloonin pii4a. Klooni sisältää noin 800 ·« * V : cDNA:n emäsparia, jotka menevät päällekkäin kloonien CA167b, CA156e, CA84a ja CA59a kanssa, jotka eristettiin HCV:n lambda-gtl 1 cDNA-kiijastosta (ATCC No. 40394).

« jo Lisäksi pii4a sisältää myös noin 250 emäsparia DNA:ta, jotka ovat ylävirtaan HCV:n cDNA:sta kloonissa CAI67b.

< i « « I · ' < I · I « 53 105046

Kloonien CA216a. CA290a ia ae30a eristäminen ia sekvenssi

Perustuen kloonin CA167b sekvenssiin tehtiin synteettinen koetin, jolla oli seuraava sek-- venssi: 5 5’ GGC TTT ACC ACG TCA CCA ATG ATT GCC CTA 3'.

T

Ylläolevaa koetinta käytettiin seulomaan kiijastoa, mistä oli tuloksena klooni CA216a, jonka HCV-sekvenssit on esitetty kuviossa 10.

to Tehtiin toinen koetin, käyttäen kloonin CA216a sekvenssiä, jolla oli seuraava sekvenssi: 5' TTT GGG TAA GGT CAT CGA TAC CCT TAC GTG 3'.

Lambda-gtl 1-kiijaston (ATCC No. 40394) seulonta tällä koettimella antoi kloonin is CA290a, siinä olevien HCV-sekvenssien ollessa esitettyjä kuviossa 11.

Rinnakkaisessa lähestymisessä tehtiin alukepidennys-cDNA-kiijasto käyttäen nukleiinihappoa, joka oli uutettu samasta infektiokykyisestä plasmasta, mitä käytettiin alkuperäisessä ylläkuvatussa lambda-gtl 1-cDNA-kirjastossa. Käytetty aluke perustui kloonien CA216a 20 ja CA290a sekvenssiin: • · · l:*:’ 5' GAA GCC GCA CGT AAG 3'.

< · · ψ • » * • · m.'.m cDNA-kiijasto tehtiin käyttäen menetelmiä, jotka olivat samanlaisia kuin ne, joita kuvattiin a * « aikaisemmin kiijastoja varten kloonien pil4a ja k9-l eristämiseen. Tämän kirjaston seu- • * · 25 lomiseen käytetty koetin perustui kloonin CA290a sekvenssiin: • a · » * · p · « v a 5' CCG GCG TAG GTC GCG CAA TTT GGG TAA 3'.

• · • i i « Il

I I

Klooni ag30a eristettiin uudesta kirjastosta ylläolevalla koettimella ja se sisälsi noin 670 .!.f 3o HCV-sekvenssin emäsparia. Katso kuvio 12. Osa tästä sekvenssistä menee päällekkäin • ·

• · I

.·. : kloonien CA216a ja CA290a HCV-sekvenssin kanssa. Kloonin ag30a sekvenssin noin 300 emäsparia on kuitenkin ylävirtaan kloonista CA290a saadusta sekvenssistä. Sekvenssissä, 54 105046 joka ei mene päällekkäin, on aloituskodoni (1) ja lopetuskodoneita, jotka voivat merkitä HCV:n ORF:n alkua. Kuviossa 12 ovat myös merkittyinä oletetut pienet kooditetut peptidit (#), joilla voi olla osa translaation säätelyssä ja myös oletettu ensimmäinen oletetun poly-peptidin aminohappo (/) ja siihen kooditetut alavirran aminohapot.

5

Kloonin CA205a eristäminen ia sekvenssi

Klooni CA205a eristettiin alkuperäisestä lambda gtl 1-kiijastosta (ATCC No. 40394) käyttäen synteettistä koetinta, joka oli peräisin HCV-sekvenssistä kloonissa CA290a /o (kuvio 11). Koettimen sekvenssi oli: 5' TCA GAT CGT TGG TGG AGT TTA CTT GTT GCC 3'.

HCV:n cDNA:n sekvenssi CA205a:ssa, esitettynä kuviossa 13, menee päällekkäin mo-/5 lempien kloonien ag30a ja CA290a cDNA-sekvenssien kanssa. Sekvenssin päällekkäisyys CA290a:n sekvenssin kanssa on esitetty pisteviivalla sekvenssin päällä (kuvio esittää myös oletetut aminohapot, jotka on kooditettu tässä fragmentissa).

. Kuten havaitaan HCV:n cDNA-sekvensseistä klooneissa CA205a ja ag30a, oletettu HCV- . . 20 polyproteiini näyttää alkavan ATG-aloituskodonista; HCV-sekvenssit molemmissa kloo- neissa sisältävät kehyksessä olevan vierekkäisen kaksoislopetuskodonin (TGATAG) 42 « < « < nukleotidia ylävirtaan tästä ATG:stä. HCV:n ORF näyttää alkavan näiden lopetuskodonien jälkeen ja ulottuvan ainakin 8907 nukleotidin matkan (katso kuviossa 17 esitetty yhdistel- • · mä-HCV:n cDNA).

« , 25 I»· V · Kloonin 18g eristäminen ia sekvenssi ·«· • » · • · · · '·/·· Perustuen kloonin ag30a sekvenssiin (ks. kuvio 12) alkuperäisestä lambda gtl 1-kirjastosta ‘: ” · (ATCC No. 40394) saatuun päällekkäin menevän kloonin sekvenssiin, tehtiin synteettinen jo koetin, jolla oli seuraava sekvenssi: :’1.j 5' CCA TAG TGG TCT GCG GAA CCG GTG AGT ACA 3' .

55 105046

Alkuperäisen lambda gtll-HCV:n cDNA-kiijaston seulominen koettimella antoi kloonin 18g, jonka HCV:n cDNA-sekvenssi on esitetty kuviossa 14. Kuviossa ovat esitettynä päällekkäisyys kloonin ag30a kanssa ja HCV.n cDNA.ssa kooditetut oletetut polypeptidit.

s cDNA-sekvenssi kloonissa 18g (Cl8g tai 18g) menee päällekkäin kloonien ag30a ja * CA205a sekvenssien kanssa, joita kuvattiin yllä. C18g:n sekvenssi sisältää lopetuskodoni- alueen, joka havaittiin kloonissa ag30a. Näistä lopetuskodoneista ylävirtaan olevan poly-nukleotidin alue oletettavasti edustaa osaa HCV-genomin 5'-alueesta, mikä voi sisältää lyhyitä ORF:iä ja mikä voidaan vahvistaa suoralla puhdistetun HCV-genomin sekventoi-lo misella. Näillä oletetuilla pienillä kooditetuilla peptideillä voi olla säätävä osa translaatiossa. HCV-genomin C18g:n edustamasta alueesta ylävirtaan oleva alue voidaan eristää sekvenssianalyysiä varten käyttäen olennaisesti EP-julkaisussa 318,216 kuvattua tekniikkaa cDNA-sekvenssien eristämiseksi kloonissa 12f olevasta HCV:n cDNA-sekvenssistä ylävirtaan. Olennaisesti syntetisoidaan pieniä käänteistranskriptaasin oligonukleo-15 tidialukkeita, jotka perustuvat C18g:n sekvenssiin ja niitä käytetään sitoutumaan vastaavaan sekvenssiin HCV:n genomi-RNArssa. Alukesekvenssit ovat läheisiä tunnetulle C18g:n 5'-päälle, mutta riittävästi alavirtaan salliakseen koetinsekvenssien suunnittelun ylävirtaan alukesekvensseistä. Tunnettuja vakiomenetelmiä alukkeilla varustamiseksi ja . kloonaamiseksi käytetään. Tulokseksi saatuja cDNA-kiijastoja seulotaan sekvensseillä • · 20 ylävirtaan alukepaikoista (pääteltynä Cl8g:n selvitetystä sekvenssistä). HCV:n genomi-

' *; RNA saadaan joko plasma- tai maksanäytteistä yksilöistä, joilla on NANBH. Koska HCV

* « ·;··· näyttää olevan Flavityyppinen virus, genomin 5’-päätä voidaan muuntaa "cap"-rakenteella.

• * _ :.ϊρ! On tunnettua, että Flaviviruksien genomit sisältävät 5'-pään "cap"-rakenteita.

Ml ·.· · (Keltakuumevirus, Rice et ai. (1988); Dengue-virus, Hahn et ai. (1988); Japanilainen enke- 25 faliittivirus (1987)).

• · · • · · • · f * *-

»M

• · · \ ' Kloonien eristäminen ia sekvenssi beta-HCV:n cDNA-kiriastoista • · • » · • ·

Klooneja, jotka sisälsivät cDNA:ta, joka edusti HCV-genomin 3'-pään aluetta, eristettiin

• * I

jo cDNA-kiijastosta, joka oli rakennettu alkuperäisestä infektoivasta simpanssin plasmava- • · • Il ’· *·’ rastosta, jota oli käytetty HCV:n cDNA:n lambda-gtll-kiijaston luomiseen (ATCC No.

40394), joka on kuvattu EP-julkaisussa No. 318,216. DNA-kiijaston luomiseksi varustet- 56 105046 tiin plasmasta saatu RNA "hännällä" poly-rA:n kanssa käyttäen poly-(rA)-polymeraasia ja cDNA syntetisoitiin käyttäen oligo(dT)12_18:a alukkeena käänteistranskriptaasia varten. Tulokseksi saatu RNArcDNA-hybridi pilkottiin RNAasi H:lla ja muutettiin kaksisäikei-seksi HCV:n cDNArksi. Tulokseksi saatu HCV:n cDNA kloonattiin lambda-gtlO:een 5 käyttäen olennaisesti tekniikkaa, jonka on kuvannut Huynh (1985), mistä saatiin beta- (tai b-) HCV:n cDNA-kiqasto. Käytetyt menettelytavat olivat seuraavia.

Plasman näyte (12 ml) käsiteltiin proteinaasi K:lla ja sitä uutettiin samalla tilavuudella fenolia, joka oli kyllästetty 0,05M Tris-HCl:llä, pH 7,5, 0,05 % (v/v) betamerkaptoetanolilla, /o 0,18 % (w/v) hydroksikinoliinilla, 1 mM EDTA:lla. Tulokseksi saatua vesifaasia uutettiin uudelleen fenoliseoksella, mitä seurasi 3 uutosta l:l-seoksella, joka sisälsi fenolia ja kloroformi risoamyylialkoholia (24:1), mitä seurasi 2 uutosta kloroformin ja isoamyylialkoholin (1:1) seoksella. Sen jälkeen kun vesifaasi oli säädetty 200 mM:ksi NaCl:n suhteen, saos-tettiin vesifaasin nukleiinihapot yli yön -20°C:ssa 2,5 tilavuudella kylmää absoluuttista n etanolia. Saostumat kerättiin linkoamalla 10000 kierroksella 40 minuutin ajan, pestiin 70 %:lla etanolilla, joka sisälsi 20 mM NaCl:a ja 100 %:lla kylmällä etanolilla, kuivattiin 5 minuuttia dessikkaattorissa ja liuotettiin veteen.

____; Infektoivasta simpanssin plasmavarastosta olevat eristetyt nukleiinihapot varustettiin poly- • · 2o rA-hännällä käyttäen poly-A-polymeraasia ihmisen istukkaribonukleaasi-inhibiittorin (HPRI) läsnäollessa (ostettiin Amersham Corp:lta) käyttäen MS2:n RNA:ta kantajana.

• « ·;·; Eristettyjä nukleiiinihappoja, joita oli yhtä paljon kuin 2 ml:ssa plasmaa, inkuboitiin liuok- : V: sessa, joka sisälsi TMN:ää (50 mM Tris-HCl, pH 7,9, 10 mM MgCL2, 250 mM NaCl, 2,5 ·' mM MnCl2, 2 mM ditiotreitolia (DTT)), 40 mikromolaarista alfa-[32P] ATP:tä, 20 yksik si köä HPRI:tä (Amersham Corp.) ja noin 9-10 yksikköä RNaasivapaata poly-A- • · · I * i _ v * polymeraasia (BRL). Inkuboitiin 10 minuuttia 37°C:ssa ja reaktiot pysäytettiin EDTA:lla • « · • · · * (lopullinen pitoisuus noin 250 mM). Liuosta uutettiin yhtäläisellä tilavuudella fenoli- • · V'* kloroformia ja samalla tilavuudella kloroformia ja nukleiinihappoja saostettiin yli yön -

I « I M

20°C:ssa 2,5 tilavuudella etanolia 200 mM NaCl:a läsnäollessa.

so * · • « · • · · 57 105046

Kloonin b5a eristäminen

Beta-HCV:n cDNA-kirjastoa seulottiin hybridisaatiolla käyttäen synteettistä koetinta, jolla oli sekvenssi, joka perustui HCV:n cDNA-sekvenssiin kloonissa 15e. Kloonin 15e eristä-, s minen on kuvattu EP-julkaisussa 318,216 ja sen sekvenssi on esitetty kuviossa 3. Synteetti-- sen koettimen sekvenssi oli: 5’ ATT GCG AGA TCT ACG GGG CCT GCT ACT CCA 3'.

Kirjaston seulominen antoi kloonin beta-5a (b5a), joka sisältää HCV:n cDNA-alueen, joka ίο on suunnilleen 1000 emäsparia. Tämän cDNArn 5'-alue menee päällekkäin kloonien 35f, 19g, 26g ja 15e kanssa (kloonit on kuvattu edellä). Alue poly-A-sekvenssin 3'-pään ja sen 3’-sekvenssin, joka menee päällekkäin kloonin 15e kanssa, välissä sisältää suunnilleen 200 emäsparia. Tämä klooni sallii HCV-genomin 3'-pään sekvenssin alueen identifioimisen.

is b5a:n sekvenssi sisältyy HCV:n cDNA-sekvenssiin kloonissa 16jh (kuvataan alla). Lisäksi sekvenssi on läsnä myös CC34a:ssa, mikä on eristetty alkuperäisestä lambda-gtl 1-kiijastosta (ATCC No. 40394). (Alkuperäiseen lambda-gtl 1-kiijastoon viitataan tässä "C"-kiijastona).

20 Sellaisten kloonien sekvenssin eristäminen, jotka on luotu HCV-eenomin 3'-alueen PCR- « · t amplifikaatiolla • · : V: On luotu monia cDNA-klooneja, jotka sisältävät nukleotidisekvenssejä, jotka ovat peräisin • · · HCV-genomin 3'-alueelta. Tämä tehtiin amplifioimalla genomin kohdealuetta polyme-25 raasiketjureaktiotekniikalla, jota on kuvannut Saiki et ai. (1986) ja Saiki et ai. (1988), mitä • · « • · · *·' * muunnettiin kuten kuvataan alla. HCV:n RNA, joka amplifioitiin, saatiin alkuperäisestä » · i ’ infektoivasta simpanssin plasmavarastosta, jota käytettiin HCV:n cDNA:n lambda-gtl 1- • · *. *': kirjaston luomiseen (ATCC No. 40394), mitä kuvataan EP-julkaisussa 318,216. HCV.n RNA:n eristäminen tehtiin kuten kuvataan yllä. Eristetty RNA varustettiin hännällä 3'- · * \· 30 päässä ATP:llä E. colin poly-A-polymeraasilla, kuten kuvaa Sippel (1973), paitsi että sim panssin seerumista eristetyt nukleiiinihapot korvasivat nukleiiinihapposubstraatin. Hännällä varustettu RNA käänteiskopioitiin sitten cDNA:ksi käänteistranskriptaasilla käyttäen 58 105046 oli go dT-alukesovitinta olennaisesti kuten kuvaa Han (1987), paitsi että alukesovittimen sekvenssin komponentit olivat:

Stufferi Notl SP6 promoottori Aluke AATTC GCGGCCGC CATACGATTTAGGTGACACTATAGAA Ti5 5

Tulokseksi saadulle cDNA.lle tehtiin amplifikointi PCR:llä käyttäen kahta aluketta:

Aluke Sekvenssi

JH32 (30-meeri) ATAGCGGCCGCCCTCGATTGCGAGATCTAC

JH11 (20-meeri) AATTCGGGCGGCCGCCATACGA

10 JH32-aluke sisälsi 20 nukleotidisekvenssiä, jotka kykenivät hybridisoitumaan cDNA:n kohdealueen 5'-päähän, arvioidun Tm:n ollessa 66°C. JH11 oli peräisin oligo dT-alukesovittimen osasta; täten se oli spesifinen cDNA:n 3'-päälle Tm:n ollessa 64°C. Molemmat alukkeet oli suunniteltu niin, että niillä oli restriktioentsyymin, Notl, tunnistus-15 paikka 5'-päässä käytettäväksi sitä seuraavassa amplifioidun HCV:n cDNArn kloonaamisessa.

PCR-reaktio suoritettiin suspendoimalla cDNA ja alukkeet 100 pl:aan reaktioseosta, joka . sisälsi neljää deoksinukleosiditrifosfaattia, puskurisuoloja ja metalli-ioneja ja lämpöstabii- • « • 20 lia DNA-polymeraasia, joka oli eristetty Thermus aauaticuksesta (Taq-polymeraasi), jotka I · ovat Perkin Elmer Cetus-yhtiön PCR-välinesaijassa (N801-0043 tai N801-0055). PCR- • · reaktio suoritettiin 35 syklin ajan Perkin Elmer Cetus-yhtiön DNA:n lämpösyklerissä (DNA thermal cycler). Kukin jakso käsitti 1,5 minuutin denaturoimisvaiheen 94°C:ssa, • · :T: lämpökäsittelyvaiheen 60°C:ssa 2 minuutin ajan ja alukkeen pidennysvaiheen 72°C:ssa 3 25 minuutin ajan. PCR-tuotteille tehtiin Southem-blot-analyysi käyttäen 30 nukleotidin koe- • · · V : tinta, JH34, jonka sekvenssi perustui kloonin 15e 3'-pään sekvenssiin. JH34:n sekvenssi • · · • · · * · · • on: • « · • · · 5’ CTT GAT CTA CCT CCA ATC ATT CAA AGA CTC 3’.

HCV:n cDNA-koettimella osoitettujen PCR-tuotteiden kokoalue ulottui noin 50:stä noin 400:aan emäspariin.

50 59 . 105046

Amplifioidun HCV:n cDNA:n kloonaamiseksi lohkaistiin PCR-tuotteet NotI:llä ja valittiin koon mukaan polyakryyliamidigeelielektroforeesilla. Suuremmat kuin 300 emäsparin DNA:t kloonattiin pUC18S:n Notl-paikkaan. Vektori pUC18S on rakennettu sisällyttämäl-j lä Notl-polylinkkeri, joka on kloonattu pUC18:n EcoRI- ja Sali-paikkojen väliin. Kloonit * seulottiin HCV:n cDNA:n suhteen käyttäen JH34-koetinta. Saatiin ja sekventoitiin luku määrä positiivisia klooneja. HCV:n cDNA-insertin nukleotidisekvenssi yhdessä näistä klooneista, 16 jh, ja aminohapot, jotka on kooditettu siinä, on esitetty kuviossa 15. Nukleotidien heterogeenisyys, mikä havaittiin HCV:n cDNA:n sekvenssissä kloonissa 16jh ίο verrattuna toiseen tämän alueen klooniin on merkitty kuvioon.

Kootut HCV:n cPNA-sekvenssit HCV.n cDNA-sekvenssi on koottu sarjasta päällekkäin meneviä klooneja, jotka ovat peri räisin eri HCV:n cDNA-kirjastoista, joita kuvataan yllä. Tässä sekvenssissä koottu HCV:n cDNA-sekvenssi, joka on saatu klooneista bll4a, 18g, ag30a, CA205a, CA290a, CA216a, pil4a, CA167b, CA156e, CA84a ja CA59a, on ylävirtaan kootusta HCV:n cDNA-sekvenssistä, joka on julkaistu EP-julkaisussa No. 318,216, ja on esitetty kuviossa 16. Koottu HCV:n cDNA-sekvenssi, joka on saatu klooneista b5a ja 16jh, on alavirtaan koo-: V: 20 tusta HCV:n cDNA-sekvenssistä, joka on julkaistu EP-julkaisussa No. 318,216.

• I I

« I

* * Kuvio 17 esittää kootun HCV;n cDNA-sekvenssin, joka on peräisin ylläkuvatuista kloo- • · • · · *·'·’ neista ja kootun HCV.n cDNA-sekvenssin, joka on julkaistu EP-julkaisussa No. 318,216.

• · t '·* ’ Kloonit, joista sekvenssi on peräisin, ovat bl 14a, 18g, ag30a, CA205a, CA290a, CA216a, ... 25 pil4a, CA167b, CA156e, CA84a, CA59a, K9-1 (jota kutsutaan myös k9-l:ksi), 26j, 13i, • · · „ y.'m 12f, 14i, 1 Ib, 7 f, 7e, 8h, 33c, 40b, 37b, 35, 36, 81,32, 33b, 25c, 14c, 8f, 33f, 33g, 39c, 35f, • · · .· . 19g, 26g, 15e, b5a ja 16jh. Kuviossa kolme täplää sekvenssin päällä merkitsee oletetun • · · • · · initiaattorimetioniinikodonin asemaa.

· · • · 30 Klooni bl 14a saatiin käyttäen kloonausmenettelyä, jota kuvattiin kloonia b5a varten yllä, » ·« paitsi että koetin oli synteettinen koetin, jota käytettiin kloonin 18g osoittamiseen yllä. Klooni bl 14a menee päällekkäin kloonien 18g, ag30a ja CA205a kanssa, paitsi että klooni 60 105046 bl 14a sisältää ylimääräiset kaksi nukleotidia ylävirtaan kloonin 18g sekvenssistä (s.o. 5'-CA). Nämä kaksi ylimääräistä nukleotidia on sisällytetty kuviossa 17 esitettyyn HCV:n genomin sekvenssiin.

' 5 Olisi huomattava, etä vaikka useat yllä kuvatuista klooneista on saatu kirjastoista, jotka ovat muita kuin alkuperäinen HCV:n cDNA:n lambda-gtl l-C-kiijasto (ATCC No. 40394), nämä kloonit sisältävät HCV:n cDNA-sekvenssejä, jotka menevät päällekkäin alkuperäisen kirjaston HCV:n cDNA-sekvenssien kanssa. Täten olennaisesti kaikki HCV-sekvenssit voidaan johtaa alkuperäisestä lambda-gtl 1-C-kiijastosta (ATCC No. 40394), jota käytettiin ίο ensimmäisen HCV:n cDNA-kloonin (5-1-1) eristämiseen. Kloonin 5-1-1 eristäminen on kuvattu EP-julkaisussa No. 318,216.

Fuusiopolypentidin C100-3 puhdistaminen CV aihtoehtoinen menetelmät 15

Fuusiopolypeptidi C100-3 (jota myös kutsutaan HCV:n cl00-3:ksi ja vaihtoehtoisesti cl00-3:ksi) muodostuu superoksididismutaasista (SOD) N-päässä ja kehyksessä olevasta Cl00:n HCV-popypeptidistä C-päässä. Menetelmä polypeptidin valmistamiseksi ekspres-·;··· soimalla hiivassa ja uutettujen isäntähiivasolujen liukenemattoman fraktion differentiaali- 20 uuttamiseksi on kuvattu EP-julkaisussa No. 318,216. Vaihtoehtoinen menetelmä tämän • · * i fuusiopolypeptidin valmistamiseksi kuvataan alla. Tässä menetelmässä antigeeni saoste- * ‘ taan raa'asta solulysaatista asetonilla; asetonilla saostetulle antigeenille tehdään sitten io- • · • · · *·*·* ninvaihtokromatografia ja se puhdistetaan edelleen geelisuodatuksella.

• · · » · · • · ·

... 25 Fuusiopolypeptidi C100-3 (HCV:n cl00-3) ekspressoidaan hiivakannassa JSC 308 (ATCC

• · n

No. 20879), joka on transformoitu pAB24C 100-3:11a (ATCC No. 67976); transformoituja « « · • _ / t hiivasoluja kasvatetaan olosuhteissa, jotka sallivat ekspression (s.o. kasvattamalla YEP:ssä, • t « • · · ! joka sisältää 1 % glukoosia). (Ks. EP-julkaisu No. 318,216). Solulysaatti valmistettiin sus- • « pendoimalla solut puskuriin A ( 20 mM Tris-HCI:a, pH 8,0, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF).

• · jo Solut rikottiin jauhamalla lasihelmien kanssa Dynomill-tyyppisessä homegenoijassa tai « · · • · · vastaavassa. Solujen rikkoutumisen astetta tarkkailtiin laskemalla soluja mikroskoopin alla Ä1 105046

Oi faasioptiikalla. Rikkoontuneet solut näyttävät tummilta, kun taas elinkykyiset solut ovat vaaleanvärisiä. Määritettiin rikkoontuneiden solujen prosenttimäärä.

Kim rikkoontuneiden solujen prosenttiosuus oli suunnilleen 90 % tai enemmän, rikkoontu-s neiden solujen jäte erotettiin lasihelmistä linkoamalla ja lasihelmet pestiin puskuri A:lla. - Sen jälkeen kun pesut ja homogenaatti oli yhdistetty, saatiin lysaatin liukenematon materi aali linkoamalla. Pelletin materiaali pestiin liukenevien proteiinien poistamiseksi suspen-doimalla puskuriin B (50 mM glysiiniä, pH 12,0, 1 mM DTT, 500 mM NaCl). Liukenematon materiaali otettiin talteen linkoamalla ja tehtiin liukenevaksi suspendoimalla puskuriin /o C, joka sisälsi SDS:ää. Uutosliuosta voidaan kuumentaa betamerkaptoetanolin läsnäollessa ja se voidaan konsentroida ultrasuodatuksen avulla. HCV:n cl00-3 uutteessa saostettiin kylmällä asetonilla. Haluttaessa saostuma voidaan säilyttää lämpötiloissa, jotka ovat -15°C tai sen alle.

is Ennen ioninvaihtokromatografiaa asetonilla saostettu materiaali otettiin talteen linkoamalla ja se voitiin kuivata typpi-ilmakehässä. Saostuma suspendoitiin puskuriin D (50 mM glysiiniä, pH 10,0, 1 mM DTT, 7 M urea) ja lingottiin liukenemattoman materiaalin pelletiksi. Linkousnesteen materiaalia käytettiin anioninvaihtopylvääseen, joka oli aikaisemmin tasa- :·.· painotettu puskurilla D. Kerättiin fraktioita ja ne analysoitiin ultraviolettiabsorbanssilla tai 20 geelielektroforeesilla SDS-polyakryyligeeleillä. Ne fraktiot, jotka sisälsivät HCV:n cl00- I · 3:a, varastoitiin.

• · V.’ HCV:n cl00-3-polypeptidin puhdistamiseksi geelisuodatuksella varastoituja ioninvaih- « · • · · ' tofraktioita kuumennettiin betamerkaptoetanolin ja SDS.n läsnäollessa ja eluaatti konsent- 25 roitiin ultrasuodatuksella. Konsentraattia käytettiin geelisuodatuspylvääseen, joka oli aikai- • · · semmin tasapainotettu puskurilla E (20 mM Tris-HCl, pH 7,0, 1 mM DTT, 0,1 % SDS).

’li» ' • · HCV:n cl00-3:n läsnäolo eluoiduissa fraktioissa ja myös epäpuhtauksien läsnäolo määri- • · · *' * tettiin geelielektroforeesilla polyakryyliamidigeeleillä SDS:n läsnäollessa ja tekemällä po- . lypeptidit näkyviksi. Ne fraktiot, jotka sisälsivät puhdistettua HCV:n cl00-3:a, varastoitiin.

« « f ';"' jo H CV :n c 100-3 :sta rikkaat fraktiot voidaan edelleen puhdistaa toistamalla geelisuodatusme- netelmä. Jos halutaan osasmuotoisen materiaalin poistamista, voidaan HCV:n cl00-3:a sisältävä materiaali suodattaa 0.22 pm:n suodattimen läpi.

62 105046 HCV:n cDNA:ssa kooditettuien polvpeptidien ekspressio ia antigeenisws Polvpentidit. iotka ekspressnidaan F, colissa 5 Polypeptidit, jotka olivat kooditettuina lukuisissa HCV:n cDNA:oissa, jotka ulottuvat läpi HCV:n genomi-ORF:n, ekspressoitiin E. colissa ia testattiin niiden antigeenisyyden suhteen käyttäen seerumia, joka saatiin lukuisista yksilöistä, joilla oli NANBH. Eskpressiovek-torit, jotka sisälsivät kloonatut HCV:n cDNA:t rakennettiin pSODcfl:stä (Steimer et ai. (1986)). Jotta olisi oltu varmoja, että oikea luentakehys olisi saatu, luotiin kolme erillistä ίο ekspressiovektoria, pcfl AB, pcflCD ja pcflEF liittämällä jokin kolmesta linkkeristä AB, CD ja EF BamHI-EcoRI-fragmenttiin, joka oli peräisin täydellisestä vektorin pSODcfl pätkimisestä EcoRI:lla ja BamHElla, mitä seurasi käsittely alkaalisella fosfataasilla. Link-kerit luotiin kuudesta oligomeeristä, A, B, C, D, E ja F. Kukin oligomeeri fosforyloitiin käsittelemällä kinaasilla ATP:n läsnäollessa ennen lämpökäsittelyä komplementaarioligo-15 meeriksi. Synteettisten linkkereiden sekvenssit olivat seuraavat.

Nimi_DNA-sekvenssi (5' -> 3')

A GATC CTG AAT TCC TGA TAA

....: B GAC TTA AGG ACT ATT TTA A

• · .*.·. 20

C GATC CGA ATT CTG TGA TAA

D GCT TAA GAC ACT ATT TTA A

i « • · • · · • f ·

E GATC CTG GAA TTC TGA TAA

• · *

25 F GAC CTT AAG ACT ATT TTA A

• M

• # · • · ·

Kukin kolmesta linkkeristä tuhoaa alkuperäisen EcoRI-paikan ja luo uuden EcoRI-paikan ' .* . linkkeriin, mutta eri luentakehykseen. Tästä johtuen HCV:n cDNA:n EcoRI-fragmentit, • · * • · jotka eristettiin klooneista ekspressiovektoriin insertoitaessa, olivat kolmessa eri luentake- I · 30 hyksessä.

• · • • « · • i · • ·

Annetuissa lambda-gtl 1-klooneissa olevat HCV:n cDNA-fragmentit leikattiin pätkimällä EcoRLlla; kukin fragmentti insertoitiin pcflABihen, pcflCD:hen ja pcflEF:ään. Nämä 63 105046 ekspressiorakenteet transformoitiin sitten D1210 E. coli-soluihin, transformantit kloonattiin ja kunkin kloonin yhdistelmäbakteerit pantiin ekspressoimaan fuusiopolypeptidejä kasvattamalla bakteereita IPTG:n läsnäollessa.

5 Annettujen HCV:n cDNA:oiden ekspressiotuotteet testattiin antigeenisyyden suhteen pe-' säkkeiden suoralla immunologisella seulonnalla käyttäen muunnosta menetelmästä, jonka on kuvannut Helfman et ai. (1983). Lyhyesti, kuten esitetään kuviossa 18, bakteerit levitettiin nitroselluloosasuodattimille, jotka olivat ampisilliinilevyjen päällä antaakseen suunnilleen 1000 pesäkettä suodatinta kohti. Pesäkkeet levitettiin uudelleen nitroselluloo-io sasuodattimelle ja niitä kasvatettiin uudelleen yli yön 2 mM IPTG:n ja ampisilliinin läsnäollessa. Bakteeripesäkkeet hajotettiin suspendoimalla nitroselluloosasuodattimia noin 15-20 minuutin ajan ilmakehässä, joka oli kyllästetty CHCl3-höyryllä. Kukin suodatin pantiin sitten yksittäiseen 100 mm:n Petri-maljaan, joka sisälsi 10 ml 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 3 % (w/v) BSA, 40 pg/ml lysotsyymiä ja 0,1 pg/ml is DNaasia. Levyjä ravistettiin hellästi ainakin 8 tuntia huoneen lämpötilassa. Suodattimet huuhdeltiin TBST:ssä (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,005 % Tween 20). In-kuboinnin jälkeen solujäännökset huuhdeltiin ja niitä inkuboitiin TBSissä (TBST ilman Tweeniä), mikä sisälsi 10 % lampaan seerumia; inkubointia tehtiin 1 tunti. Suodattimia •: · I inkuboitiin sitten esikäsitellyn seerumin kanssa TBS.ssä yksilöistä, joilla oli NANBH, jot- :' ,·'; 20 ka sisälsivät: 3 simpanssia; 8 potilasta, joilla oli krooninen HANBH, joiden seerumit olivat • · · • V positiivisia HCV:n C100-3-polypeptidiä vastaan olevien vasta-aineiden suhteen (kuvattu « ; EP-julkaisussa No. 318,216 ja yllä) (myös kutsutaan C100:ksi); 8 potilasta, joilla oli kroo- • · *·*·* ninen NANBH, joiden seerumit olivat negatiivisia Cl00 vastaisten vasta-aineiden suhteen; ··· • # · *·’ toipunut potilas, jonka seerumi oli negatiivinen Cl00 vastaisten vasta-aineiden suhteen; ja ... 25 6 potilasta, joilla oli yhteisöhankittu NANBH, sisältäen yhden, jonka seerumi oli voimak- • « · • · « . I·,' kaasti positiivinen C100 vastaisten vasta-aineiden suhteen ja yhden, jonka seerumi oli raja- • » · tapauksena positiivinen C100 vastaisten vasta-aineiden suhteen. Seerumia, joka oli laimen- • · · • · # * nettu TBS:llä, esikäsiteltiin absorboimalla se ennalta hSOD:lla. Suodattimien inkubointia • · • seerumin kanssa tehtiin ainakin kaksi tuntia. Inkuboinnin jälkeen suodattimet pestiin kaksi • · 30 kertaa 30 minuutin ajan TBST:llä. Niiden ekspressoitujen proteiinien, joihin seerumin • · · • ·· , t # 12« vasta-aineet olivat kiinnittyneet, leimaus suoritettiin inkuboimalla 2 tuntia I-Ieimatun 64 105046 lampaan anti-ihmisvasta-aineen kanssa. Pesun jälkeen suodattimet pestiin kahdesti 30 minuutin ajan TBST:llä, kuivattiin ja suoritettiin autoradiografia.

Lukumäärä klooneja (ks. alla) ekspressoi polypeptidejä, jotka sisälsivät HCV-epitooppeja, s jotka olivat immunologisesti reaktiokykyisiä seerumin kanssa, joka oli yksilöistä, joilla oli NANBH. Viisi näistä polypeptideistä oli hyvin immunogeenistä siinä, että vasta-aineita HCV-epitoopeille näissä polypeptideissä havaittiin monissa eri potilasseerumeissa. Näitä polypeptidejä koodittavat kloonit ja polypeptidien asema oletetussa HCV-polyproteiinissa (jossa aminohapponumerot alkavat oletetusta initiaattorikodonista) ovat seuraavat: klooni ίο 5-1-1, aminohapot 1694-1735; klooni C100, aminohapot 1569-1931; klooni 33c, aminohapot 1192-1457; klooni CA279a, aminohapot 1-84; ja klooni CA290a, aminohapot 9-177. Immunogeenisten polypeptidien paikka oletetussa HCV-polyproteiinissa ovat esitetyt välittömästi alla.

is Kloonit, jotka koodittavat polypeptidejä. joilla on todistettu reaktiivisuus NANBH-notilaiden seerumin kanssa

Klooni Asema HCV-polvproteiinissa (aminohapponumero alkaen olete- ; · ·: 20 tusta initiaattorimetioniista) 9 9 9 9 9 • 99 • · • · · * CA279a 1-84 ! .* CA74a 437-582 • ♦ · 25 13i 511-690 • · · • · · CA290a 9-177 33c 1192-1457 • · * 9 40b 1266-1428 /. : 5-1-1 1694-1735 f ** 30 81 1689-1805 « < 33b 1916-2021 25c 1949-2124 14c 2054-2223 65 105046 8f 2200-3325 33f 2287-2385 33g 2348-2464 39c 2371-2502 s 15e 2796-2886 C100 1569-1931

Tulokset polypeptidien, jotka on kooditettu eri tutkituissa klooneissa, immunogeenisyydes-tä viittaavat tehokkaaseen osoittamiseen ja immunointijäijestelmät voivat sisältää ίο HCV-polypeptidien/epitooppien paneeleita.

HCV-epitooppien ekspressio hiivassa

Kolme erilaista hiivaekspressiovektoria, jotka sallivat HCV:n cDNA:n insertion kolmeen is eri luentakehykseen, rakennettiin. Yhden vektorin, pAB24C 100-3, rakenne on kuvattu EP-julkaisussa No. 318,216. Alla olevissa tutkimuksissa HCV:n cDNA yllä luetelluista klooneista antigeenisyyden kartoitustutkimuksessa E. colia käyttäen ekspressoidut tuotteet korvasivat C100-HCV:n cDNA:n. Muiden vektoreiden rakenne korvaa yllä olevissa E. coli- ·. ; tutkimuksissa käytetyn sovittimen yhdellä seuraavista sovittimista: • · : : : 20 • « • V Sovitin 1

ATT TTG AAT TCC TAA TGA G

V.: AC TTA AGG ATT ACT CAG CT

1*1 • · · • · · m 25 Sovitin 2 • · ·

:·* : AAT TTG GAA TTC TAA TGA G

:·5 * AC CTT AAG ATT ACT CAG CT

• f • · · • · · • · " Insertoitu HCV:n cDNA ekspressoidaan hiivassa, joka on transformoitu vektoreilla, käyt- 50 täen yllä kuvattuja ekspressio-olosuhteita fuusiopolypeptidiä Cl00-3 varten. Tulokseksi * · saadut polypeptidit seulotaan käyttäen seerumia yksilöistä, joilla on NANBH, joita kuvat- 66 105046 tiin yllä niiden immunogeenisten polypeptidien seulomiseksi, jotka on kooditettu E. colissa ekspressoiduissa HCV:n cDNA:oissa.

HCV-Polvproteiinien hydrofobisen profiilin vertaaminen Länsi-Niilin viruksen polvprote-5 iiniin ia Deneue-viruksen NS1 :een HCV-polyproteiinisegmentin hydrofobisuusprofiilia verrattiin tyypillisen Flaviviruksen, Länsi-Niilin viruksen vastaavaan. Länsi-Niilin viruspolyproteiinin polypeptidisekvenssi johdettiin tunnetusta polynukleotidisekvenssistä, joka koodittaa tuon viruksen nonstruktu-io raaliproteiineja. HCV:n polyproteiinisekvenssi johdettiin päällekkäin menevien cDNA-kloonien sekvenssistä. Profiilit määriteltiin antigeeniohjelmaa, joka käyttää 7 aminohapon levyistä ikkunaa (ko. aminohappo ja kolme tähdettä kummallakin puolella) antaakseen keskimääräisen hydrofobisuuden annetun aminohappotähteen suhteen. Parametrit, jotka antavat reaktiivisen hydrofobisuuden kullekin aminohappotähteelle ovat julkaisusta Kyte ja a Doolittle (1982). Kuvio 19 esittää kahden polyproteiinin hydrofobisuusprofiilit; alueet jotka vastaavat Länsi-Niilin viruksen nonstrukturaaliproteiineja, NS1-NS5, on merkitty kuvioon. Kuten kuviosta nähdään, on HCV-polyproteiinin ja Länsi-Niilin viruksen polyproteiinin profiileissa yleistä samanlaisuutta.

• ;..j Aminohappojen sekvenssiä, joka on kooditettu kuviossa 16 esitetyn HCV:n cDNA:n 5'- :Y: 20 alueella, on verrattu vastaavaan yhden Dengue-viruksen, jota kuvataan yllä, kannan aluee- • · j · : seen hydrofobisuus- ja hydrofiilisyysalueiden profiilin suhteen (tietoa ei esitetty). Tämä vertailu paljasti, että HCV:stä ja Dengue-viruksesta olevilla polypeptideillä, jotka kooditti- V.: vat tätä aluetta, mikä vastaa aluetta, joka koodittaa NSl:tä (tai sen osaa), oli samanlaiset ··· • ♦ · *·' * hydrofobisuus/hydrofiilisyysprofiilit.

25 ·· • · * « a » L. Samanlaisuus hydrofobisuusprofiileissa yhdessä aikaisemmin identifioitujen homologioi- • · t • · * den kanssa HCV:n ja Dengue Flaviviruksen aminohapposekvensseissä EP-julkaisussa No.

• *·· ’ ; 318,216, ehdottaa, että HCV on sukua näille Flaviviruksien perheen jäsenille.

• · « ti· • · ' · ] jo Oletettujen HCV:n ORF:ssä kooditettuien polypeptidien karakterisointi • « · • I I t · 67 105046

Kuviossa 17 esitetty HCV:n cDNA:n sense-säikeen sekvenssi johdettiin päällekkäin menevistä HCV:n cDNA:oista eri klooneissa, joita on kuvattu EP-julkaisussa No. 318,216 ja niissä, joita on kuvattu yllä. Sekvenssistä voidaan päätellä, että HCV-genomi sisältää etupäässä yhden pitkän jatkuvan ORF:n, joka koodittaa polyproteiinia. Sekvenssissä nukleo-’ s tidi numero 1 vastaa initiaattori-MET-kodonin ensimmäistä nukleotidia; miinusnumerot ' merkitsevät, että nukleotidit ovat tuon etäisyyden päässä 5'-suunnassa (ylävirtaan), kun taas positiiviset numerot merkitsevät, että nukleotidit ovat tuon etäisyyden päässä 3'-suunnassa (alavirtaan). Yhdistelmäsekvenssi esittää HCV:n cDNArn "sense"-säiettä.

ίο Oletetun HCV-polyproteiinin, joka on johdettu HCV:n cDNA-sense-säikeen sekvenssistä, aminohapposekvenssi on myös esitetty kuviossa 17, jossa asema 1 alkaa oletetusta initi-aattorimetioniinista.

Kooditetun HCV-polyproteiinin mahdolliset proteiinialueet ja myös summittaiset rajat ovat is. seuraavat (identifioidut polypeptidit suluissa ovat niitä, jotka on kooditettu Flavivirus-alueella):

Oletettu alue Raja suunnilleen (aminohapponumerot) 20 • · "C" (ydinkapseliproteiini) 1-120 • · "E" (virionikuoriproteiinitja • ·;··· mahdolliset matriisiproteiinit (M)) 120-400 "NS 1" (komplementinkiinnitysantigeeni?) 400-660 V · 25 "NS2" (tuntematon toiminto) 660-1050 "NS3" (proteaasi?) 1050-1640 * · 1 "NS4" (tuntematon toiminto) 1640-2000 • · · ', "NS5" (polymeraasi?) 2000-? loppu • · • 1 1 30 Tulisi kuitenkin huomata, että hydrofobisuusprofiilit (kuvaataan alla) merkitsevät, että • · · HCV poikkeaa Flavivirusmallista, erityisesti NS2:sta ylävirtaan olevan alueen suhteen.

• · ψ · 1 68 105046

Lisäksi merkittyjä rajoja ei ole tarkoitettu osoittamaan lujia rajalinjoja oletettujen polypep-tidien välillä.

Voidaan lisäksi päätellä kuviossa 17 esitetystä sekvenssistä, että siinä on neljä pientä 5 ORF.a, jotka sisältävät ATG:n, joka on ylävirtaan oletetusta suuren polyproteiinin initiaat-tori-MET:stä. Näiden ORF:ien ATG:t ovat nukleotidinumeroissa -310, -257, -246 ja -127.

Polvpeptidin hvdrofiilisvvs- ia antigeenisvysprofiili ίο Oletetun polyproteiinin, joka oli kooditettu HCV:n cDNA-sekvenssissä, joka on esitetty kuviossa 16, hydrofiilisyys/hydrofobisuusprofiilit ja antigeeninen indeksi määritettiin tietokoneanalyysillä. Hydrofiilisyyttä/hydrofobisuutta varten oleva ohjelma kuvattiin yllä. Antigeeninen indeksi on tulosta tietokoneohjelmasta, joka nojaa seuraaviin kriteereihin: 1) pintatodennäköisyys; 2) alfakierteisyyden ennustaminen kahdella eri menetelmällä; 3) beta-15 lamellialueiden ennustaminen kahdella eri menetelmällä; 4) U-käännösten ennustaminen kahdella eri menetelmällä; 5) hydrofiilisyys/hydrofobisuus; ja joustavuus. Tietokoneanalyysien profiilijäljet on esitetty kuviossa 20. Hydrofiilisyysprofiilissa merkitsee poikkeaminen abskissan yläpuolelle hydrofiilisyyttä ja abskissan alle merkitsee hydrofobisuutta. Sen todennäköisyyden, että polypeptidialue on antigeeninen, katsotaan yleensä lisääntyvän, 20 kun tapahtuu poikkeama ylöspäin abskissasta hydrofiilisyys- ja/tai antigeenisyysprofiilissa. Tulisi kuitenkin huomata, että nämä profiilit eivät välttämättä merkitse polypeptidin im- • · · : · . munogeenisyyden voimakkuutta.

• · « ·

Yhteislineaaristen peptidien identifiointi HCV:ssä ia Flaviviruksissa • · • ·· : : : HCV:n cDNA:n sense-säikeeseen kooditetun oletetun polyproteiinin aminohapposekvens- ··· ·.’ ‘ siä verrattiin useiden Flaviviruksien jäsenien tunnettuihin aminohapposekvensseihin. Ver- • · · * · · '·’ ’ tailu osoittaa, että homologia on vähäistä, mutta johtuen alueista, joista sitä löydettiin, se • · on mahdollisesti merkittävää. Säilyvät yhteislineaariset alueet on esitetty kuviossa 21. Alla 1 ‘ jo luetelluissa aminohapponumeroissa sekvenssit edustavat numeroa oletetussa HCV- • · · '·..polyproteiinissa (Ks. kuvio 17).

• · • · · • · · • · 105046 69 Näiden säilyvien aiheiden väli on samanlainen Flaviviruksien ja HCV:n välillä ja merkitsee, että HCV:n ja näiden flavivirusaineiden välillä on jonkin verran samankaltaisuutta.

Seuraavat luetellut materiaalit on talletettu Budapest Treatyrn ehdoilla American Type s Culture Collection'iin (ATCC), osoitteessa 12301 Parklawn Dr., Rockville, Maryland 20852, USA ja niille on annettu seuraavat talletusnumerot.

lambda-gtl 1 ATCC No. Talletuspäivä HCV:n cDNA-kiijasto 40394 01.12.1987 to klooni 81 40388 17.11.1987 klooni 91 40389 17.11.1987 klooni 1-2 40390 17.11.1987 klooni 5-1-1 40391 18.11.1987 klooni 12f 40514 10.11.1988 is klooni 35f 40511 10.11.1988 klooni 15e 40513 10.11.1988 klooni K9-1 40512 10.11.1988 JSC 308 20879 05.05.1988 pS356 67683 29.04.1988 ____; 20 m «

Lisäksi tehtiin seuraavat talletukset 11.05.1989.

• · * • · • · · • · · • · • · ·:·*: Kanta Linkkerit ATCC No.

D1210 (Cfl/5-1-1) EF 67967 O'1 D1210(Cfl/81) EF 67968 D1210 (Cfl/CA74a) EF 67969 • · · D1210 (Cfl/35f) AB 67970 » · · ' D1210(Cn/279a) EF .67971 D1210 (Cfl/C36) CD 67972 : , ' so D1210 (Cfl/13i) AB 67973 D1210 (Cfl/C33b) EF 67974 I · :·'·· D1210 (Cfl/290a) AB 67975 70 105046 HB 101 (AB24/C100 #3R) 67976

Seuraavat kannan D1210 johdannaiset talletettiin 03.05.1989.

j Kannan johdannainen ATCC No.

pCFlCS/C8f 67956 pCFlAB/C12f 67952 pCFlEF/14c 67949 pCFlEF/15e 67954 /o pCFl AB/C25c 67958 pCFlEF/C33c 67953 pCFlEF/C33f 67950 pCFlCD/33g 67951 pCFlCD/C39c 67955 is pCFlEF/C40b 67957 pCFlEF/CA167b 67959

Seuraavat kannat talletettiin 12.05.1989.

• 20 Kanta ATCC No.

Lambda gtl 1 (C35) 40603 : v. Lambda gt 10 (beta-5a) 40602 • · D1210 (C40b) 67980 :Y: D1210(M16) 67981

• M

• · * ... 25

Kun tätä vastaava hakemus on myönnetty patentiksi USA.ssa, poistetaan kaikki rajoitukset • · · • · * ’ näiden talletusten saatavuudesta peruuttamattomasti; ja merkittyjen talletusten saanti on • · · • · · '·[ * mahdollista tätä hakemusta vastaavan US-hakemuksen käsittelyn aikana sellaiselle, jolla patenttiviraston Commissioner katsoo olevan oikeuden siihen säännösten 37 CFR 1.14 ja 30 35 USC 1.22 nojalla. Lisäksi merkittyjä talletuksia ylläpidetään kolmenkymmenen (30) vuoden ajan talletuksen päivästä tai viisi (5) vuotta siitä, kun talletusta on viimeksi kysytty; m · 9 •. ’: tai vastaavan US-patentin voimassaoloajan, mikä niistä onkin pitempi. Tässä mainitut talle- 7i 105046 tusmateriaalit ovat tarkoitettuja vain mukavuuden vuoksi, eikä niitä vaadita tämän keksinnön käytäntöön soveltamiseen tässä annetun selityksen valossa ja lisäksi nämä materiaalit liitetään mukaan tähän viitteeksi.

j Teollinen käyttökelpoisuus

V

Keksinnöllä on, lukuisissa tässä esitetyissä ilmenemismuodoissaan, monia teollisia käyttöjä, joista muutamat ovat seuraavia. HCV:n cDNA:oita voidaan käyttää koettimien suunnitteluun HCV:n nukleiinihappojen osoittamiseeen näytteissä. cDNA:oista peräisin olevia 10 koettimia voidaan käyttää HCV:n nukleiinihappojen osoittamiseen esimerkiksi kemiallisissa synteettisissä reaktioissa. Niitä voidaan käyttää myös seulontaohjelmissa antiviraa-lisia aineita varten, aineiden tehon määrittämiseen estämään virusreplikaatiota soluviljely-jäijestelmissä ja eläinmallijäijestelmissä. HCV-polynukleotidikoettimet ovat myös hyödyllisiä virusnukleiinihappojen osoittamisessa ihmisissä ja täten ne voivat toimia perustee-i5 na HCV-infektion diagnosoimiseksi ihmisissä.

Yllä olevan lisäksi tässä esitetyt cDNA:t antavat tietoa ja välineet HCV:n epitooppeja sisältävien polypeptidien syntetisoimiseksi. Nämä polypeptidit ovat hyödyllisiä osoitettaessa vasta-aineita HCV-antigeeneille. Tässä kuvataan saija immunologisia analyysejä HCV- t>; 20 infektiolle perustuen yhdistelmäpolypeptideihin, jotka sisältävät HCV-epitooppeja ja ne « ovat kaupallisesti käytettävissä diagnosoitaessa HCV:n aiheuttamaa NANBHia, seulottaes- t · * • · sa veripankkien luovuttajia HCV:n aiheuttaman tarttuvan maksatulehduksen varalta ja • · ·:*·: myös osoittamaan saastunut veri, joka tulee tartuttavista verenluovuttajista. Vi- rusantigeeneillä on myös käyttöä tarkkailtaessa antiviraalisien aineiden tehoa eläinmallijär- ♦ · · : 25 jestelmissä. Lisäksi tässä kuvatuilla HCV:n cDNA:oista peräisin olevilla polypeptideillä on käyttöä rokotteina HCV-infektioiden hoidossa.

• · · • * • · · · * « · · ’ HCV:n cDNAioista peräisin olevat polypeptidit ovat käyttökelpoisia, yllä kuvattujen ·. : käyttöjen lisäksi, HCV:n vastaisten vasta-aineiden synnyttämiseksi. Täten niitä voidaan 30 käyttää HCV:n vastaisina rokotteina. Kuitenkin vasta-aineet, jotka ovat syntyneet HCV-polypeptideillä tapahtuneen immunisoinnin seurauksena, ovat myös käyttökelpoisia osoi-’ *: tettaessa virusantigeenien läsnäolo näytteessä. Täten niitä voidaan käyttää HCV-

Claims (21)

72 105046 polypeptidien tuotannon analysoimiseen kemiallisissa jäijestelmissä. HCV.n vastaisia vasta-aineita voidaan käyttää myös tarkkailemaan virustenvastaisten aineiden tehoa seulon-taohjelmissa, joissa näitä aineita testataan kudosviljelyjärjestelmissä. Niitä voidaan käyttää myös passiiviseen immunoterapiaan ja diagnosoimaan HCV:n aiheuttamaa NANBH:a sal-s limalla virusantigeenien osoittaminen sekä verenluovuttajissa että -vastaanottajissa. Toinen tärkeä käyttö HCV:n vastaisille vasta-aineille on affiniteettikromatografiassa viruksen ja viruspolypeptidien puhdistamiseksi. Puhdistettua virusta ja viruspolypeptidivalmisteita voidaan käyttää rokotteissa. Kuitenkin, puhdistettu virus voi olla myös hyödyllinen solu-viljelyjäijestelmien kehittämisessä, joissa jäijestelmissä HCV replikoituu.

1. Menetelmä terapeuttisesti aktiivisen polypeptidin valmistamiseksi, joka polypeptidi käsittää jatkuvan, ainakin 8 aminohapon sekvenssin HCV-polyproteiinistä sekä HCV-antigeenisen determinantin, missä jatkuva sekvenssi on peräisin kuvion 17 mukaisen HCV-polyproteiinin aminohapoista 1-450 tai 2887-2955, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää ,; 20 seuraavat vaiheet: a) otetaan käyttöön rekombinantti-isäntäsolu joka on transformoitu polypep-tidiä koodaavalla ekspressiojäijestelmällä ja ekspression ohjausyksiköillä joihin kuuluu • · ·;··: isäntäsolun kanssa yhteensopiva promoottori; ja • · b) inkuboidaan isäntäsolu polypeptidin ilmentämiseksi, jonka jälkeen peptidi V * 25 eristetään ja puhdistetaan. • · · • · I *’ * 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä että jatkuva aminohappo- • · · • * * *. sekvenssi on ainakin 10 aminohapon pituinen. jo 3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä että jatkuva aminohappo- ·...'· sekvenssi on ainakin 15 aminohapon pituinen. • · • ♦ · • · 73 105046

2. Förfarande enligt patentkrav 1, kännetecknat därav att längden pä nämnda obrutna aminosyrasekvens är minst 10 aminosyror.

3. Förfarande enligt patentkrav 1, käonetecknat därav att längden pä nämnda obrutna s aminosyrasekvens är minst 15 aminosyror.

4. Förfarande enligt patentkrav 1, kännetecknat därav att längden pä nämnda obrutna aminosyrasekvens är minst 20 aminosyror. jo 5. Förfarande enligt patentkrav 1, kännetecknat därav att nämnda obrutna aminosyrasekvens är vald ur gruppen: (a) HCV-aminosyror 1-84; (b) HCV- aminosyror 9-177; (c) HCV- aminosyror 1-120; is (d) HCV- aminosyror 2900-2950; eller (e) ett immunologiskt reaktivt fragment ur a-d.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä että jatkuva aminohappo-sekvenssi on ainakin 20 aminohapon pituinen.

5 AA1-AA50; AA1-AA84; AA9-AA177; AA50-AA100; AA40-AA90; AA65- AA75; AA99-AA120; AA95-AA110; AA100-AA150; AA150-AA200; AA200-AA250; AA220-AA240; AA245-AA265; AA250-AA300; AA290-AA330; AA290-AA305; AA300-AA350; AA310-AA330; AA350-AA400; AA400-AA450; AA2900-AA2950; AA2910-AA2930; AA2925-AA2950; och AA2945-lo slut (C-änden).

5 AA625; AA575-AA605; AA600-AA650; AA600-AA625; AA635-AA665; AA650-AA700; AA645-AA680; AA700-AA750; AA700-AA725; AA725- AA775; AA770-AA790; AA750-AA800; AA800-AA815; AA850-AA875; AA800-AA850; AA920-AA990; AA850-AA900; AA920-AA945; AA940- AA965; AA950-AA1000; AA1000-AA1060; AA1000-AA1050; AA1025- ιο AA1040; ΑΑ1075-ΑΑΠ75; AA1050-AA1200; AA1070-AA1100; AA1100- AA1140; AA1192-AA1457; AA1195-AA1250; AA1200-AA1225; AA1225- AA1250; AA1250-AA1300; AA1260-AA1310; AA1260-AA1280; AA1266- AA1428; AA1300-AA1350; AA1310-AA1340; AA1345-AA1405; AA1350- AA1400; AA1365-AA1380; AA1380-AA1405; AA1400-AA1450; AA1450-

5 AA1-AA50; AA1-AA84; AA9-AA177; AA50-AA100; AA40-AA90; AA65- AA75; AA99-AA120; AA95-AA110; AA100-AA150; AA150-AA200; AA200-AA250; AA220-AA240; AA245-AA265; AA250-AA300; AA290-AA330; AA290-AA305; AA300-AA350; AA310-AA330; AA350-AA400; AA400-AA450; AA2900-AA2950; AA2910-AA2930; AA2925-AA2950; ja AA2945-lo loppuun (C'-pää).

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä että jatkuva aminohappo-s sekvenssi on valittu ryhmästä: (a) HCV-aminohapot 1-84; (b) HCV-aminohapot 9-177; (c) HCV-aminohapot 1-120; (d) HCV-aminohapot 2900-2950; tai ίο (e) jonkin kohdan a-d immunologisesti reaktiivisesta fragmentista.

6. Förfarande enligt nägot av patentkrav 1 - 5, kännetecknat därav att nämnda obrutna sekvens är ett immunologiskt reaktivt fragment valt ur HCV-aminosyror 1-50, 35-45, 50- 20 100,40-90,65-75,80-90,99-120,95-110, 100-150, 2910-2930 eller 2925-2950. I f I »

6. Jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä että jatkuva sekvenssi on immunologisesti reaktiivinen fragmentti valittuna HCV-aminohapoista 1-50, 35-45, 50-100, 40-90,65-75, 80-90,99-120,95-110,100-150,2910-2930 tai 2925-2950. is

7. Förfarande för framställning av en terapeutiskt aktiv polypeptid, vilket förfarande » · omfattar följande steg: a) en rekombinant värdcell tas i bruk, vilken är transformerad med ett expressionssystem • · 9 ' 25 som kodar en polypeptid, och kontrollelement för expression vilka innefattar en promotor som är kompatibel med värdcellen; och » · 9 * * · ’ b) värdcellen inkuberas för att erhälla expression av polypeptiden, varefter peptiden • · « '1 isoleras och renas; « > '. kännetecknat därav att sagda polypeptid omfattar en obruten sekvens nukleotider som jo förmär selektivt hybridisera tili genomet för hepatit-C-virus (HCV) eller dess komplement, « 4 · varvid den obrutna nukleotidsekvensen kodar en obruten sekvens aminosyror ur figur 17 • · ♦ · · '· och en HCV-antigen determinant, sagda obrutna aminosyrasekvens är vald ur följande 105046 grupp väri nämnda obrutna sekvens har formeln Aa* - Aay där x och y betecknar aminosyranummer i HCV-polyproteinet enligt figur 17: AA1-AA50; AA1-AA84; AA9-AA177; AA50-AA100; AA40-AA90; AA65-AA75; AA99-AA120; AA95-AA110; AA100-AA150; AA150-AA200; AA200-AA250; j AA220-AA240; AA245-AA265; AA250-AA300; AA290-AA330; AA290-AA305; AA300-AA350; AA310-AA330; AA350-AA400; AA405-AA495; AA400-AA450; AA437-AA582; AA450-AA500; AA475-AA495; AA500-AA550; AA511-AA690; AA515-AA550; AA550-AA600; AA550-AA625; AA575-AA605; AA600-AA650; AA600-AA625; AA635-AA665; AA650-AA700; AA645-AA680; AA700-AA750; ίο AA700-AA725; AA725-AA775; AA770-AA790; AA750-AA800; AA800-AA815; AA850-AA875; AA800-AA850; AA920-AA990; AA850-AA900; AA920-AA945; AA940-AA965; AA950-AA1000; AA1000-AA1060; AA1000-AA1050; AA1025-AA1040; AA1075-AA1175; AA1050-AA1200; AA1070-AA 1100; AA1100- AA1140; AA1192-AA1457; AA1195-AA 1250; AA1200-AA1225; AA1225-

7. Menetelmä terapeuttisesti aktiivisen polypeptidin valmistamiseksi, joka menetelmä käsittää seuraavat vaiheet: a) otetaan käyttöön rekombinantti-isäntäsolu joka on transformoitu polypep- tidiä koodaavalla ekspressiojäijestelmällä ja ekspression ohjausyksiköillä joihin kuuluu #,; 20 isäntäsolun kanssa yhteensopiva promoottori; ja * · , ·.·. b) inkuboidaan isäntäsolu polypeptidin ilmentämiseksi, jonka jälkeen peptidi » · : ·.'. eristetään ja puhdistetaan; • · ·:*·: tunnettu siitä että polypeptidi käsittää jatkuvan nukleotidisekvenssin joka kykenee selek- tiivisesti hybridisoitumaan hepatiitti-C-viruksen genomiin tai sen komplementtiin, jolloin • · * 25 jatkuva nukleotidisekvenssi koodaa kuviossa 17 esitettyä jatkuvaa aminohapposekvenssiä ja HCV-antigeenistä determinanttia jolloin mainittu jatkuva sekvenssi on valittu alla esite- * M· « · · ’·' ' tystä ryhmästä missä jatkuva sekvenssi on merkitty AAx-AAy ja x ja y merkitsevät amino- * » ; happojen numeroita kuvion 17 esittämässä HCV-polyproteiinissa: • · V". AA1-AA50; AA1-AA84; AA9-AA177; AA50-AA100; AA40-AA90; AA65-AA75; f so AA99-AA120; AA95-AA110; AA100-AA150; AA150-AA200; AA200-AA250; O AA220-AA240; AA245-AA265; AA250-AA300; AA290-AA330; AA290-AA305; • · :AA300-AA350; AA310-AA330; AA350-AA400; AA405-AA495; AA400-AA450; M 105046 AA437-AA582; AA450-AA500; AA475-AA495; AA500-AA550; AA511-AA690; AA515-AA550; AA550-AA600; AA550-AA625; AA575-AA605; AA600-AA650; AA600-AA625; AA635-AA665; AA650-AA700; AA645-AA680; AA700-AA750; AA700-AA725; AA725-AA775; AA770-AA790; AA750-AA800; AA800-AA815; s AA850-AA875; AA800-AA850; AA920-AA990; AA850-AA900; AA920-AA945; AA940-AA965; AA950-AA1000; AA1000-AA1060; AA1000-AA1050; AA1025-AA1040; AA 1075-AA 1175; AA1050-AA1200; AA1070-AA1100; AA1100- AA1140; AA1192-AA1457; AA1195-AA1250; AA1200-AA1225; AA1225- AA1250; AA1250-AA1300; AA1260-AA1310; AA1260-AA1280; AA1266- lo AA1428; AA1300-AA1350; AA1310-AA1340; AA1345-AA1405; AA1350- AA1400; AA1365-AA1380; AA1380-AA1405; AA1400-AA1450; AA1450- AA1500; AA1475-AA1515; AA1475-AA1500; AA1500-AA1550; AA1515- AA1550; AA1550-AA1600; AA1570-AA1590; AA1595-AA1610; AA1590- AA1650; AA1610-AA1645; AA1650-AA1690; AA1685-AA1770; AA1690-

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä että mainittu jatkuva sekvenssi on valittu alla esitetystä ryhmästä missä jatkuva sekvenssi on merkitty AAx-AAy> ja x ja y merkitsevät aminohappojen numeroita kuvion 17 esittämässä HCV-polyproteiinissa: AA1-AA50; AA1-AA84; AA9-AA177; AA50-AA100; AA40-AA90; AA65-AA75; j AA99-AA120; AA95-AA110; AA100-AA150; AA150-AA200; AA200-AA250; AA220-AA240; AA245-AA265; AA250-AA300; AA290-AA330; AA290-AA305; AA300-AA350; AA310-AA330; AA350-AA400; AA400-AA450; AA2900-AA2950; AA2910-AA2930; AA2925-AA2950; ja AA2945-loppuun (C-pää). ίο 9. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä että mainittu jatkuva sekvenssi koostuu kokonaisesta jatkuvasta sekvenssistä valittuna alla esitetystä ryhmästä missä kokonainen jatkuva sekvenssi on merkitty AAx-AAy ja x ja y merkitsevät aminohappojen numeroita kuvion 17 esittämässä HCV-polyproteiinissa: AA405-AA495; AA437-AA582; AA450-AA500; ja AA2850-AA2900. n

9. Förfarande enligt patentkrav 7, kännetecknat därav att sagda obrutna aminosyrasekvens is bestär av en hei obruten sekvens vald ur följande grupp väri nämnda obrutna sekvens har formeln Aa, - Aay där x och y betecknar aminosyranummer i HCV-polyproteinet enligt figur 17: AA405-AA495; AA437-AA582; AA450-AA500; och AA2850-AA2900. 20 10. Förfarande enligt nägot av patentkrav 1-9, kännetecknat därav att nämnda obrutna • · . ’. ’. sekvens är sammanfogad med en icke-HCV-aminosyrasekvens. I I « % % m · • · ·:··: 11. Förfarande enligt patentkrav 10, kännetecknat därav att nämnda icke-HCV- • · aminosyrasekvens är vald ur gruppen bestäende av superoxiddismutas-sekvens, - «Il *.* * 25 betagalaktosidas-sekvens, signalsekvens för utsöndring, partikelformande sekvens, hepatit- B pre-ytsekvens och hepatit-B ytantigensekvens. • * • · • · · • · · • · ·

10. Jonkin patenttivaatimuksista 1-9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä että jatkuva sekvenssi on fuusioituna ei-HCV-aminohapposekvenssiin.

10 Antisense-polynukleotideja voidaan käyttää virusreplikaation inhibiittoreina. Mukavuuden vuoksi HCV.n vastaiset vasta-aineet ja HCV-polypeptidit, joko luonnolliset tai yhdistelmät, voidaan pakata välinepakkauksiin. 15

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä että ei-HCV- (itf: 20 aminohapposekvenssi on valittu ryhmästä superoksididismutaasisekvenssi, « · beetagalaktoosidaasisekvenssi, erityksen mahdollistava signaalisekvenssi, partikkeleita I 1 :v. muodostava sekvenssi, hepatiitti-B esipintasekvenssi sekä hepatiitti-B pinta- « · ·:··; antigeenisekvenssi. • · • · · • · - 1»· V · 25 12. Rekombinanttivektori, tunnettu siitä että se kykenee ilmentämään terapeuttisesti aktiivisen polypeptidin joka sisältää ainakin 8 aminohapon pituisen sekvenssin kuvion 17 v 1·· » I I *·1 ’ mukaisen HCV-polyproteiinin aminohapoista 1-450 tai 2887-2955, jolloin mainittu vektori • · · • 1 1 1 I 1 · « ·, käsittää jatkuvan nukleotidisekvenssin joka koodaa aminohapposekvenssin sekä • · ” antigeenisen determinantin, missä koodaava sekvenssi on toiminnallisesti liitetty 30 ohjaussekvenssiin joka voi aikaansaada koodisekvenssin ilmentymisen isäntäsolussa. • · · • · • · « · · • » • · 1 · 7S 105046 /0

12. Rekombinantvektor, kännetecknad därav att den förmär uttrycka en terapeutiskt aktiv < I · ' ': polypeptid innehällande en obruten sekvens med minst 8 aminosyror firän aminosyroma 1 - 30 450 eller aminosyroma 2887-2955 i polyproteinet enligt figur 17, varvid nämnda vektor « « · omfattar nämnda obrutna nukleotidsekvens vilken kodar aminosyrasekvensen och en • « • < · 82 105046 HCV-antigen determinant, van den kodande sekvensen är funktionellt kopplad till en kontrollsekvens som kan ästadkomma expression av kodsekvensen i värdcellen.

13. Rekombinantvektor enligt patentkrav 12, kännetecknad därav att längden pä nämnda 5 obrutna aminosyrasekvens är minst 10 aminosyror.

13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen rekombinanttivektori, tunnettu siitä että mainittu jatkuva aminohapposekvenssi on vähintään 10 aminohapon pituinen.

14. Rekombinantvektor enligt patentkrav 12, kännetecknad därav att längden pä nämnda obrutna aminosyrasekvens är minst 15 aminosyror. ίο 15. Rekombinantvektor enligt patentkrav 12, kännetecknad därav att längden pä nämnda obrutna aminosyrasekvens är minst 20 aminosyror.

14. Patenttivaatimuksen 12 mukainen rekombinanttivektori, tunnettu siitä että mainittu 5 jatkuva aminohapposekvenssi on vähintään 15 aminohapon pituinen.

15 AA1500; AA1475-AA1515; AA1475-AA1500; AA1500-AA1550; AA1515- AA1550; AA1550-AA1600; AA1570-AA1590; AA1595-AA1610; AA1590- AA1650; AA1610-AA1645; AA1650-AA1690; AA1685-AA1770; AA1690- AA1720; AA1720-AA1745; AA1745-AA1770; AA1750-AA1800; AA1775- AA1810; AA1795-AA1850; AA1850-AA1900; AA1900-AA1950; AA1900- ... 20 AA 1920; AA1916-AA2021; AA1920-AA1940; AA1949-AA2124; AA1950- AA2000; AA1950-AA1985; AA2000-AA2050; AA2020-AA2045; AA2045- AA2100; AA2045-AA2070; AA2054-AA2223; AA2070-AA2100; AA2100* • · ·:·· AA2150; AA2150-AA2200; AA2200-AA2325; AA2250-AA2330; AA2265- :V: AA2280; AA2280-AA2290; AA2287-AA2385; AA2300-AA2350; AA2350- Vi': 25 AA2400; AA2345-AA2415; AA2345-AA2375; AA2348-AA2464; AA2370- AA2410; AA2400-AA2450; AA2400-AA2425; AA2415-AA2450; AA2445- * * · : AA2500; AA2371-AA2502; AA2500-AA2550; AA2505-AA2540; AA2550- * · « :·; 1 AA2600; AA2560-AA2580; AA2600-AA2650; AA2620-AA2650; AA2650- AA2700; AA2655-AA2670; AA2670-AA2700; AA2700-AA2750; AA2750-30 AA2800; AA2755-AA2780; AA2780-AA2830; AA2785-AA2810; AA2796- AA2886; AA2810-AA2825; AA2800-AA2850; AA2850-AA2900; AA2900-*’·**: AA2950; AA2910-AA2930; AA2925-AA2950; och AA2945-slut (C-änden). 84 105046

15 AA1250; AA1250-AA1300; AA1260-AA1310; AA1260-AA1280; AA1266- AA1428; AA1300-AA1350; AA1310-AA1340; AA1345-AA1405; AA1350- AA1400; AA1365-AA1380; AA1380-AA1405; AA1400-AA1450; AA1450- AA1500; AA1475-AA1515; AA1475-AA1500; AA1500-AA1550; AA1515- AA1550; AA1550-AA1600; AA1570-AA1590; AA1595-AA1610; AA1590-

15. Patenttivaatimuksen 12 mukainen rekombinanttivektori, tunnettu siitä että mainittu jatkuva aminohapposekvenssi on vähintään 20 aminohapon pituinen. to 16. Patenttivaatimuksen 12 mukainen rekombinanttivektori, tunnettu siitä että mainittu jatkuva aminohapposekvenssi on valittu seuraavasta ryhmästä: (a) HCV-aminohapot 1-84; (b) HCV-aminohapot 9-177; (c) HCV-aminohapot 1-120; is (d) HCV-aminohapot 2900-2950; tai (e) jonkin kohdan a-d immunologisesti reaktiivisesta fragmentista.

15 AA1720; AA1720-AA1745; AA1745-AA1770; AA1750-AA1800; AA1775- AA1810; AA1795-AA1850; AA1850-AA1900; AA1900-AA1950; AA1900- AA1920; AA1916-AA2021; AA1920-AA1940; AA1949-AA2124; AA1950- AA2000; AA1950-AA1985; AA2000-AA2050; AA2020-AA2045; AA2045- AA2100; AA2045-AA2070; AA2054-AA2223; AA2070-AA2100; AA2100-

16. Rekombinantvektor enligt patentkrav 12, kännetecknad därav att nämnda obrutna aminosyrasekvens är vald ur gruppen: is (a) HCV-aminosyror 1-84; (b) HCV- aminosyror 9-177; (c) HCV- aminosyror 1-120; (d) HCV- aminosyror 2900-2950; eller (e) ett immunologiskt reaktivt fragment ur a), (b), (c) eller (d). ____: 20 . ·. ·. 17. Rekombinantvektor enligt nägot av patentkrav 12-16, kännetecknad därav att nämnda ; obrutna sekvens är ett immunologiskt reaktivt fragment valt ur HCV-aminosyror 1-50, 35- • · ·:··: 45, 50-100, 40-90,65-75, 80-90,99-120, 95-110, 100-150, 2910-2930 eller 2925-2950. • · • · r • · * • · • · · · 25 18. Rekombinantvektor, kännetecknad därav att den omfattar en obruten sekvens nukleotider som förmär selektivt hybridisera tili genomet för hepatit-C-virus (HCV) eller • · · « · · ' dess komplement, varvid den obrutna nukleotidsekvensen kodar en obruten sekvens • · · *\ aminosyror ur figur 17 och en HCV-antigen determinant, och sagda obrutna • *. " aminosyrasekvens är vald ur följande grupp väri nämnda obrutna sekvens har formeln Aa, • t · · · jo - Aay där x och y betecknar aminosyranummer i HCV-polyproteinet enligt figur 17: AA1-AA50; AA1-AA84; AA9-AA177; AA50-AA100; AA40-AA90; AA65-AA75; AA99-AA120; AA95-AA110; AA100-AA150; AA150-AA200; AA200- 105046 AA250; AA220-AA240; AA245-AA265; AA250-AA300; AA290-AA330; AA290-AA305; AA300-AA350; AA310-AA330; AA350-AA400; AA405- AA495; AA400-AA450; AA437-AA582; AA450-AA500; AA475-AA495; AA500-AA550; AA511-AA690; AA515-AA550; AA550-AA600; AA550-

17. Jonkin patenttivaatimuksista 12-16 mukainen rekombinanttivektori, tunnettu siitä että jatkuva aminohapposekvenssi on immunologisesti reaktiivinen fragmentti joka on valittuna . 20 ryhmästä joka koostuu HCV-aminohapoista 1-50, 35-45, 50-100, 40-90, 65-75, 80-90, 99- • « 120,95-100, 100-150, 2910-2930 tai 2925-2950.

·*· · • · • · •;··· 18. Rekombinanttivektori, tunnettu siitä että se käsittää jatkuvan nukleotidisekvenssin joka kykenee selektiivisesti hybridisoitumaan hepatiitti-C-viruksen (HCV) genomiin tai • · · ·' 25 sen komplementtiin, jolloin jatkuva nukleotidisekvenssi koodaa kuviossa 17 esitetyn jatku van aminohapposekvenssin ja HCV-antigeenisen determinantin, ja jatkuva aminohappo- • ·· • · · *.* * sekvenssi on valittu seuraavasta ryhmästä, missä jatkuva sekvenssi on merkitty AAX-AAV *·· ** • · · *·’ * ja x ja y merkitsevät aminohappojen numeroita kuvion 17 esittämässä HCV- ( polyproteiinissa: "\l 30 AAI-AA50; AA1-AA84; AA9-AA177; AA50-AA100; AA40-AA90; AA65- C: AA75; AA99-AA120; AA95-AA110; AA100-AA150; AA150-AA200; AA200- • · AA250; AA220-AA240; AA245-AA265; AA250-AA300; AA290-AA330; 77 105046 AA290-AA305; AA300-AA350; AA310-AA330; AA350-AA400; AA405- AA495; AA400-AA450; AA437-AA582; AA450-AA500; AA475-AA495; AA500-AA550; AA511-AA690; AA515-AA550; AA550-AA600; AA550- AA625; AA575-AA605; AA600-AA650; AA600-AA625; AA635-AA665; s ΑΑ650-ΑΑ700; ΑΑ645-ΑΑ680; ΑΑ700-ΑΑ750; ΑΑ700-ΑΑ725; ΑΑ725- ΑΑ775; ΑΑ770-ΑΑ790; ΑΑ750-ΑΑ800; ΑΑ800-ΑΑ815; ΑΑ850-ΑΑ875; ΑΑ800-ΑΑ850; ΑΑ920-ΑΑ990; ΑΑ850-ΑΑ900; ΑΑ920-ΑΑ945; ΑΑ940- ΑΑ965; ΑΑ950-ΑΑ1000; ΑΑ1000-ΑΑ1060; ΑΑ1000-ΑΑ1050; ΑΑ1025-ΑΑ1040; AA 1075-AA 1175; AA1050-AA1200; AA 1070-AA 1100; AA1100-lo AA1140; AA1192-AA1457; AA1195-AA1250; AA1200-AA1225; AA1225- AA1250; AA1250-AA1300; AA1260-AA1310; AA1260-AA1280; AA1266-AA1428; AA1300-AA1350; AA1310-AA1340; AA1345-AA1405; AA1350-AA1400; AA1365-AA1380; AA1380-AA1405; AA1400-AA1450; AA1450-AA1500; AA1475-AA1515; AA1475-AA1500; AA1500-AA1550; AA1515-is AA1550; AA1550-AA1600; AA1570-AA1590; AA1595-AA1610; AA1590- AA1650; AA1610-AA1645; AA1650-AA1690; AA1685-AA1770; AA1690-AA1720; AA1720-AA1745; AA1745-AA1770; AA1750-AA1800; AA1775-AA1810; AA1795-AA1850; AA1850-AA1900; AA1900-AA1950; AA1900-AA1920; AA1916-AA2021; AA1920-AA1940; AA1949-AA2124; AA1950-20 AA2000; AA1950-AA1985; AA2000-AA2050; AA2020-AA2045; AA2045- • · AA2100; AA2045-AA2070; AA2054-AA2223; AA2070-AA2100; AA2100- « « 4 AA2150; AA2150-AA2200; AA2200-AA2325; AA2250-AA2330; AA2265-·:··: AA2280; AA2280-AA2290; AA2287-AA2385; AA2300-AA2350; AA2350- AA2400; AA2345-AA2415; AA2345-AA2375; AA2348-AA2464; AA2370-*·*:’: 25 AA2410; AA2400-AA2450; AA2400-AA2425; AA2415-AA2450; AA2445- AA2500; AA2371-AA2502; AA2500-AA2550; AA2505-AA2540; AA2550- ·♦· Σ AA2600; AA2560-AA2580; AA2600-AA2650; AA2620-AA2650; AA2650- • M ! AA2700; AA2655-AA2670; AA2670-AA2700; AA2700-AA2750; AA2750- « · :.··ί AA2800; AA2755-AA2780; AA2780-AA2830; AA2785-AA2810; AA2796-

30 AA2886; AA2810-AA2825; AA2800-AA2850; AA2850-AA2900; AA2900- '\\\: AA2950; AA2910-AA2930; AA2925-AA2950; ja AA2945-loppuun (C-pää). • • * * • · I • · 78 105046

19. Rekombinantvektor enligt patentkrav 18, kännetecknad därav att nämnda obrutna aminosyrasekvens är vald ur följande grupp väri nämnda obrutna sekvens har formeln Aa, - Aay där x och y betecknar aminosyranummer i HCV-polyproteinet enligt figur 17:

19. Patenttivaatimuksen 18 mukainen rekombinanttivektori, tunnettu siitä että mainittu jatkuva aminohapposekvenssi on valittu seuraavasta ryhmästä, missä jatkuva sekvenssi merkitty AAx-AAyt ja x ja y merkitsevät aminohappojen numeroita kuvion 17 esittämässä HCV-polyproteiinissa:

20. Rekombinantvektor enligt patentkrav 19, kännetecknad därav att nämnda obrutna aminosyrasekvens bestär av en hei obruten sekvens vald ur följande grupp väri nämnda obrutna sekvens har formeln Aa1 - Aay där x och y betecknar aminosyranummer i HCV- 15 polyproteinet enligt figur 17: AA405-AA495; AA437-AA582; AA450-AA500; och AA2850-AA2900.

20 AA1650; AA1610-AA1645; AA1650-AA1690; AA1685-AA1770; AA1690- · AA1720; AA1720-AA1745; AA1745-AA1770; AA1750-AA1800; AA1775- * · « :v. AA1810; AA1795-AA1850; AA1850-AA1900; AA1900-AA1950; AA1900- • · AA1920; AA1916-AA2021; AA1920-AA1940; AA1949-AA2124; AA1950- AA2000; AA1950-AA1985; AA2000-AA2050; AA2020-AA2045; AA2045- • · 2s AA2100; AA2045-AA2070; AA2054-AA2223; AA2070-AA2100; AA2100- AA2150; AA2150-AA2200; AA2200-AA2325; AA2250-AA2330; AA2265- • · · : AA2280; AA2280-AA2290; AA2287-AA2385; AA2300-AA2350; AA2350- • · · : AA2400; AA2345-AA2415; AA2345-AA2375; AA2348-AA2464; AA2370- AA2410; AA2400-AA2450; AA2400-AA2425; AA2415-AA2450; AA2445- jo AA2500; AA2371-AA2502; AA2500-AA2550; AA2505-AA2540; AA2550- AA2600; AA2560-AA2580; AA2600-AA2650; AA2620-AA2650; AA2650- AA2700; AA2655-AA2670; AA2670-AA2700; AA2700-AA2750; AA2750- 8i . 105046 AA2800; AA2755-AA2780; AA2780-AA2830; AA2785-AA2810; AA2796- AA2886; AA2810-AA2825; AA2800-AA2850; AA2850-AA2900; AA2900- AA2950; AA2910-AA2930; AA2925-AA2950; och AA2945-slut (C-änden). 5 8. Förfarande enligt patentkrav 7, kännetecknat därav att sagda obrutna aminosyrasekvcns är vald ur följande grupp väri nämnda obrutna sekvens har formeln Aa, - Aay där x och y betecknar aminosyranummer i HCV-polyproteinet enligt figur 17: AA1-AA50; AA1-AA84; AA9-AA177; AA50-AA100; AA40-AA90; AA65-AA75; AA99-AA120; AA95-AA110; AA100-AA150; AA150-AA200; AA200-AA250; AA220-AA240; ιο AA245-AA265; AA250-AA300; AA290-AA330; AA290-AA305; AA300-AA350; AA310-AA330; AA350-AA400; AA400-AA450; AA2900-AA2950; AA2910-AA2930; AA2925-AA2950; och AA2945-slut (C-änden).

20. Patenttivaatimuksen 19 mukainen rekombinanttivektori, tunnettu siitä että jatkuva aminohapposekvenssi koostuu kokonaisesta, jatkuvasta sekvenssistä valittuna seuraavasta ryhmästä, missä jatkuva sekvenssi merkitty AAx-AAy> ja x ja y merkitsevät aminohappojen is numeroita kuvion 17 esittämässä HCV-polyproteiinissa: AA405-AA495; AA437-AA582; AA450-AA500; and AA2850-AA2900.

21. Isäntäsolu, joka kykenee tuottamaan terapeuttisesti aktiivista polypeptidiä joka käsittää ainakin 8 aminohapon pituisen HCV-determinantin, tunnettu siitä että se on jonkin 20 patenttivaatimuksista 12-20 mukaisen rekombinanttivektorin transformoima. • · · Patentkrav · “ • · ·;··· 1. Förfarande för framställning av en terapeutiskt aktiv polypeptid omfattande en obruten sekvens om minst 8 aminosyror frän ett HCV-polyprotein och en HCV-antigen V ' 25 determinant, varvid sagda obrutna sekvens är frän aminosyroma 1-450 eller aminosyroma 2887-2955 i polyproteinet enligt figur 17, kännetecknat därav att förfarandet omfattar »I» • ’ följande steg: • · · • · · *'* a) en rekombinant värdcell tas i bruk, vilken är transformerad med ett I < expressionssystem som kodar en polypeptid, och kontrollelement för , | | < I 30 expression innefattande en promotor som är kompatibel med värdcellen; och •« « b) värdcellen inkuberas för att erhälla expression av polypeptiden, varefter '. peptidenisolerasochrenas. 79 105046

20 AA2150; AA2150-AA2200; AA2200-AA2325; AA2250-AA2330; AA2265- AA2280; AA2280-AA2290; AA2287-AA2385; AA2300-AA2350; AA2350- AA2400; AA2345-AA2415; AA2345-AA2375; AA2348-AA2464; AA2370- • « AA2410; AA2400-AA2450; AA2400-AA2425; AA2415-AA2450; AA2445- :V: AA2500; AA2371-AA2502; AA2500-AA2550; AA2505-AA2540; AA2550- • · :T: 25 AA2600; AA2560-AA2580; AA2600-AA2650; AA2620-AA2650; AA2650- AA2700; AA2655-AA2670; AA2670-AA2700; AA2700-AA2750; AA2750- : AA2800; AA2755-AA2780; AA2780-AA2830; AA2785-AA2810; AA2796- • · · V : AA2886; AA2810-AA2825; AA2800-AA2850; AA2850-AA2900; AA2900- '· .1·: AA2950; AA2910-AA2930; AA2925-AA2950; ja AA2945-loppuun (C-pää). 30 t I · · • · • » · • « 1 75 105046

21. Värdcell vilken kan producera en terapeutiskt aktiv polypeptid omfattande en HCV -determinant med ätminstone 8 aminosyror, kännetecknad därav att den är transformerad ..; 20 med en rekombinantvektor enligt nägot av patentkrav 12-20. « · I • · • I • · · • · • · • · • · • « · • I » I i , • · · • · · * · t ·♦ · • · · • · · • ♦ · • ♦ · I « • III I · « 4 9