DK176280B1 - NANBV-diagnostika og -vacciner - Google Patents

Description

DK 176280 B1 NANBV-diagnostika og -vacciner

Teknisk område 5 Den foreliggende opfindelse angår materialer og metodologier til styring af spredningen af non-A, non-B hepatitisvirus (NANBV) infektion. Den angår mere specifikt diagnostiske DNA-fragmenter, diagnostiske proteiner, diagnostiske antistoffer og beskyttende antigener og antistoffer mod en ætiologisk agens for NANB hepatitis, d.v.s. hepatitis-C-virus.

10

Opfindelsen angår specielt rekombinante vektorer, der omfatter en sammenhængende sekvens, der er i stand til selektivt at hybridisere til genomet af hepatitis C virus (HCV) eller komplementet deraf.

15 Opfindelsen angår også en værtscelle transformeret med en sådan vektor.

Endvidere angår opfindelsen en fremgangsmåde til fremstilling af et polypeptid omfattet af en HCV antigenisk determinant med en sammenhængende sekvens af mindst 8 aminosyrer, som er kodet for af 20 HCV-genomet.

Fremdraget kendt teknik i forbindelse med ansøgningen

Barr el al. (1986), Biotechniques 4:428.

25 Botstein (1979), Gene 8:17.

Brinton, M.A. (1986) i THE VIRUSES: THE TOGAVIRIDAE AND FLAVIVIRIDAE (Series eds. Fraenkel-Conrat and Wagner, bind eds.

Schlesinger and Schlesinger, Plenum Press), side 327-374.

Broach (1981) i: Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, bind 1, side 30 445, Cold Spring Harbor Press.

Broach et al. (1983), Meth. Enz. 101:307.

2 DK 176280 B1

Chang et al. (1977), Nature 198:1056.

Chirgwin et al. (1979), Biochemistry 18:5294.

Chomczynski and Sacchi (1987), Analytical Biochemistry 162:156.

Clewell et al. (1969), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 62:1159.

5 Clewell (1972), J. Bacteriol. 110:667.

Cohen (1972), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:2110.

Cousens et al. (1987), gene 61:265.

De Boer et al. (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 292:128.

Dreesman et al. (1985), J. Infect. Disease 151:761.

10 Feinstone, S.M. and Hoofnagle, J.H. (1984), New Engl. J. Med. 311:185.

Fields & Knipe (1986), FUNDAMENTAL VIROLOGY (Raven Press, N.Y.).

Fiers et al. (1978), Nature 273:113.

Gerety, R.J. et al., i VIRAL HEPATITIS AND LIVER DISEASE (Vyas, B.N.,

Dienstag, J.L., and Hoofnagle, J.H., eds, 15 Grune and Stratton, Inc.,(1984) side 23-47.

Goeddel et al. (1980), Nucleic Acids Res. 8:4057.

Graham and Van der Eb (1978), Virology 52:546.

Grunstein and Hogness (1975), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73:3961.

Grych et al. (1985), Nature 316:74.

20 Gubler and Hoffmann (1983), Gene 25:263.

Hammerling et al. (1981), MONOCLONAL ANTIBODIES AND T-CELL HYBRIDOMAS.

Hess et al. (1968), J. Adv. Enzyme Reg 7:149.

Hinnen et al. (1978), Proc. Natl. Acad. Sci. 75:1929.

25 Hitzeman et al. (1980), J. Biol. Chem. 255:2073.

Holland et al. (1978), Biochemistry 17:4900.

Holland (1981), J. Biol. Chem. 256: 1385.

Houghton et al. (1981), Nucleic Acids Res. 9:247 Hunyh, T.V. et al. (1985) i DNA CLONING TECHNIQUES; A PRACTICAL 30 APPROACH (D. Glover, Ed., IRL Press, Oxford, U K.) side 49-78.

Immun. Rev. (1982)62:185.

3 DK 176280 B1

Iwarson (1987), British Medical J. 295:946.

Kennet et al. (1980) MONOCLONAL ANTIBODIES.

Laemmli (1970), Nature 227, 680.

Lee et al. (1988), Science 239:1288.

5 Maniatis, T., et al. (1982) MOLECULAR CLONING; A LABORATORY MANUAL (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.).

Mayer and Walker, eds. (1987), IMMUNOCHEMICAL METHODS IN CELL AND MOLECULAR BIOLOGY (Academic Press, London).

Maxam et al. (1980), Methods in Enzymology 65:499.

10 MacNamara et al. (1984), Science 226:1325.

Messing et al. (1981), Nucleic Acids Res. 9:309.

Messing (1983), Methods in Enzymology 101:20-37.

METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press).

Michelle et al., Int. Symposium on Viral Hepatitis.

15 Monath (1986) i THE VIRUSES: THE TOGAVIRADAE AND FLAVIVIRIDAE (Series eds. Fraenkel-Conrat and Wagner, bind eds. Schlesinger and Schlesinger, Plenum Press), side 375-440.

Nagahuma et al. (1984), Anal. Biochem. 141:74.

Neurath et al. (1984), Science 224:392.

20 Nisonoff et al. (1981), Clin. Immunol. Immunopathol. 21:397-406.

Overby, L.R. (1985), Curr. Hepatol. 5:49.

Overby, L.R. (1986), Curr. Hepatol. 6:65.

Overby, L.R. (1987), Curr. Hepatol. 7:35.

Peleg (1969), Nature 221:193.

25 Pfefferkorn and Shapiro (1974), in COMPREHENSIVE VIROLOGY, bind 2, (Fraenkel-Conrat & Wagner, eds., Plenum, N.Y.) side 171-230.

Prince, A.M. (1983), Annu. Rev. Microbiol. 37:217.

Rice et al. (1986) i THE VIRUSES: THE TOGAVIRIDAE AND FLAVIVIRIDAE (Series eds. Fraenkel-Conrat and Wagner, bind. eds.

30 Schlesinger and Schlesinger, Plenum Press), side 279-328.

4 DK 176280 B1

Roehrig (1986) i THE VIRUSES: THE TOGAVIRIDAE AND FLAVIVIRIDAE (Series eds. Fraenkel-Conrat and Wagner, bind. eds. Schlesinger and Schlesinger, Plenum Press)

Sadler et al. (1980), Gene 8, 279.

5 Saiki et al. (1986), Nature 324: 163.

Sanger et al. (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463.

Schlesinger et al. (1986), J. Virol. 60:1153.

Schreier, M„ et al. (1980) HYBRIDOMA TECHNIQUES

Scopes (1984), PROTEIN PURIFICATION, PRINCIPLES AND PRACTICE, 10 SECOND EDITION (Springer-Verlag, N.Y.).

Shimatake et al. (1981), Nature 292:128.

Steimer et al. (1986), J. Virol. 58:9.

Stollar (1980), i THE TOGAVIRUSES (R.W. Schlesinger, ed. Academic Press, N.Y.), side 584-622.

15 Taylor et al (1976), Biochem. Biophys. Acta 442:324.

Towbin et al. (1979), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350.

Tsu and Herzenberg (1980), i SELECTED METHODS IN CELLULAR IMMUNOLOGY (W.H. Freeman and Co.) side 373-391.

Vytdehaag et al. (1985), J. Immunol. 134:1225.

20 Valenzuela, P., et al. (1982), Nature 298:344.

Valenzuela, P., et al. (1984), i HEPATITIS B (Millmann, I., et al., ed, Plenum Press) side 225-236.

Warner (1984), DNA 3:401.

Wu and Grossmann (1987), Methods in Enzymology bind 154, 25 RECOMBINANT DNA, afsnit E.

Wu (1987), Methods in Enzymology bind 155, RECOMBINANT DNA, afsnit F.

Zoller (1982), Nucleic Acids Res. 10:6487.

30 5 DK 176280 B1

Fremdragne patenter: US patent nr. 4.341.761 US patent nr. 4.399.121 5 US patent nr. 4.427.783 US patent nr. 4.444.887 US patent nr. 4.466.917 US patent nr. 4.472.500 US patent nr. 4.491.632 10 US patent nr. 4.493.890

Den hidtil kendte teknik

Non-A, non-B hepatitis (NANBH) er en overførbar sygdom eller syg-15 domsfamilie, der antages at være virusinduceret, og som kan skelnes fra andre former af virusforbundne leversygdomme, herunder de kendte hepatitisvirus-forårsagede sygdomme, d.v.s. hepatitis A-virus (HAV), hepatitis B-virus (HBV),og deltahepatitisvirus (HDV), såvel som den af cytomegalovirus (CMV) eller Epstein-Barr virus (EBV) inducerede hepatitis.

20 NANBH identificeredes først i individer, der havde modtaget transfusion. Overførelse fra menneske til chimpanse og serieoverførelse i chimpanser tilvejebragte vidnesbyrd om, at NANBH skyldes et overført infektionsagens eller -agenser. Det overførbare agens, der er ansvarlig for NANBH, er imidlertid stadigvæk uidentificeret og antallet af agenser, der forårsager 25 sygdommen, er ukendt.

Epidemiologisk vidensbyrd antyder, at der kan være tre typer NANBH: den epidemiske type, der overføres gennem vand, den med blod eller kanyle forbundne type og den sporadisk forekommende (samfundserhvervede) 30 type. Antallet af agenser, der kan være årsag til NANBH, er imidlertid ukendt.

6 DK 176280 B1

Klinisk diagnose og identifikation af NANBH er primært opnået ved udelukkelse af andre virusmarkører. Blandt de metoder, der er anvendt til at spore formodede NANBV-antigener og -antistoffer er agargeldiffusion, kontraimmunoelektroforese, immunofluorescensmikroskopi, immunelektron-5 mikroskopi, radioimmunoanalyse og enzymbundet immunosorbentanalyse.

Ingen af disse analyser har imidlertid vist sig at være tilstrækkeligt følsomme, specifikke og reproducerbare til anvendelse som en diagnostisk test for NANBH.

10 Der har hidtil hverken været klarhed eller enighed med hensyn til identiteten eller specificiteten af de antigen/antistof systemer, der er forbundet med NANBH-agenser. Dette skyldes, i det mindste delvis, forudgående eller samtidig infektion med HBV og NANBV hos individer samt den kendte kompleksitet af de opløselige og partikelformige antigener, der er forbundet 15 med HBV, såvel som integrationen af HBV-DNA i levercellers genom. Hertil kommer, at der er mulighed for, at NANBH skyldes mere end et infektionsagens såvel som mulighed for, at NANBH er blevet fejldiagnosticeret. Det er yderligere uklart, hvad de serologiske analyser påviser i serum fra patienter med NANBH. Det har været påstået, at 20 agargeldiffusionen og kontraimmunoelektroforeseanalyser påviser autoimmunreaktioner eller ikke-specifikke proteininteraktioner, der af og til kan optræde mellem serumprøver, og at de ikke repræsenterer specifikke NANBV-antigen-antistofreaktioner. Immunofluorescens- og enzymbundet immunosorbent- og radioimmunoanalyser synes at påvise lave niveauer af et 25 rheumatoid-faktorlignende stof, der ofte er tilstede i serum hos patienter med NANBH såvel som hos patienter med andre lever- og ikke-lever sygdomme.

Noget af den påviste reaktivitet kan repræsentere antistof mod værtsbestemte cytoplasmatiske antigener.

30 Der er et antal NANBV-kandidater. Se f.eks. redegørelserne af Prince (1983), Feinstone and Hoofnagle (1984) og Overby (1985, 1986, 1987) og 7 DK 176280 B1 artiklen af Iwarson (1987). Men der er ikke noget bevis for, at nogen af disse kandidater repræsenterer det ætiologiske agens for NANBH.

Der er et betydeligt behov for følsomme, specifikke metoder til at screene og 5 identificere bærere af NANBV og NANBV-kontamineret blod eller blodprodukter. Posttransfusionhepatitis (PTH) forekommer hos ca. 10% af patienter, der har modtaget transfusion, og NANBH udgør op imod 90% af disse tilfælde. Hovedproblemet med denne sygdom er den hyppige udvikling mod kroniske leverskader (25 - 55%).

10

Patientpleje såvel som forebyggelse mod overførelse af NANBH med blod og blodprodukter eller ved tæt personlig kontakt, forudsætter pålidelige diagnostiske og prognostiske redskaber til påvisning af nukleinsyrer, antigener og antistoffer forbundet med NANBV. Hertil kommer, at der også 15 er et behov for effektive vacciner og immunoterapeutiske terapeutiske midler til forebyggelse og/eller behandling af sygdommen.

Beskrivelse af opfindelsen 20 Opfindelsen vedrører isolering og karakterisering af et nyopdaget ætiologisk agens for NANBH, hepatitis-C-virus (HCV). Opfindelsen vedrører navnlig en familie af cDNA replika af dele af HCV-genomet. Disse cDNA-replika blev isoleret ved en teknik, der omfattede et hidtil ukendt screeningstrin for ekspressionsprodukter fra cDNA-biblioteker skabt ud fra et partikelformigt 25 agens i inficeret væv med sera fra patienter med NANBH til påvisning af nysyntetiserede antigener afledt fra genomet af det hidtil ikke-isolerede og ikke-karakteriserede virusagens, og udvælgelse af kloner, der producerede produkter, som reagerede immunologisk, udelukkende med sera fra inficerede individer i modsætning til ikke-inficerede individer.

30 8 DK 176280 B1

Studier af HCV-genomets natur under anvendelse af probér, der er afledt fra HCV-cDNA'et såvel som sekvensinformation indeholdt i HCV-cDNA’et antyder, at HCV er et flavivirus eller et flavi-lignende virus.

5 Dele af de fra HCV afledte cDNA-sekvenser er velegnede som prober til at diagnosticere tilstedeværelsen af virus i prøver og til at isolere naturligt forekommende varianter af viruset. Disse cDNA'ere gør også polypeptidsekvenser af HCV-antigener, der er kodet for i HCV-genomet (HCV-genomerne) tilgængelige og gør det muligt at fremstille polypeptider, 10 der er velegnede som standarder eller reagenser i diagnostiske undersøgelser og/eller som vaccinebestanddele. Både polyklonale og monoklonale antistoffer rettet mod HCV-epitoper, der indeholdes i disse polypeptidsekvenser, er velegnede til diagnostiske undersøgelser, som terapeutiske midler, til screening af antivirusmidler og til isolering af den 15 NANBV-agens, hvorfra disse cDNA'er er afledt. Ved at anvende prober, der er afledt fra disse cDNA'er er det yderligere muligt, at isolere og sekvensere andre dele af HCV-genomet, og således afføde yderligere prober og polypeptider, der er velegende til diagnose og/eller behandling, både profylaktisk og terapeutisk, af NANBH.

20

Ifølge ovenstående beskrives med hensyn til polynucleotider: et oprenset HCV-polynucleotid, et rekombinant HCV-polynucleotid, et rekombinant polynucleotid omfattende en fra et HCV-genom eller fra HCV-cDNA afledt sekvens, et rekombinant polynucleotid, der koder for en HCV-epitop, en 25 rekombinant vektor, der indeholder en hvilken som helst af de ovennævnte rekombinante polynucleotider og en værtscelle transformeret med en hvilken som helst af disse vektorer.

Der beskrives også: et rekombinant ekspressionssystem, der omfatter en 30 åben læseramme (ORF) af DNA afledt fra et HCV-genom eller fra HCV-aDNA, hvor ORF er funktionsdygtigt forbundet til en kontrolsekvens, der er forenølig med en ønsket vært, en celle der er transformeret med det rekombinante ekspressionssystem og et polypeptid, der er produceret af den transformerede celle.

9 DK 176280 B1 5 Yderligere beskrives: oprenset HCV, en præparation af polypeptider fra det oprensede HCV, et oprenset HCV-polypeptid, et oprenset polypeptid, der omfatter en epitop, som er immunologisk identificerbar med en i HCV indeholdt epitop.

10 Derudover beskrives et rekombinant HCV-polypeptid, et rekombinant polypeptid bestående af en sekvens, der er afledt fra et HCV-genom eller fra HCV-cDNA, et rekombinant polypeptid bestående af en HCV-epitop og et fusionspolypeptid bestående af et HCV-polypeptid.

15 Endvidere beskrives et monoklonalt antistof rettet mod en HCV-epitop, og en oprenset præparation af polyklonale antistoffer rettet mod en HCV-epitop.

Der beskrives også en partikel, der immuniserer imod HCV-infektion omfattende et ikke-HCV-polypeptid, der har en aminosyresekvens, der er i 20 stand til at danne en partikel, når sekvensen frembringes i en eukaryotisk vært og en HCV-epitop.

Der beskrives blandt andet en polynucleotidprobe for HCV.

25 Yderligere beskrives analysesæt der vedrører: at analysere prøver for forekomst af polynucleotider, der er afledt fra HCV, omfattende en polynucleotidprobe, der indeholder en nucleotidsekvens fra HCV på ca. 8 eller flere nucleotider i en egnet beholder, at analysere prøver for forekomst af et HCV-antigen, der omfatter et antistof rettet mod HCV-antigenet, der 30 skal påvises, i en egnet beholder, at analysere prøver for forekomst af 10 DK 176280 B1 antistoffer rettet mod et HCV-antigen, der omfatter et polypeptid, som indeholder en HCV-epitop i nærvær af HCV-antigenet, i en egnet beholder.

Derudover beskrives: et polypeptid bestående af en HCV-epitop, der er 5 forbundet med et fast substrat, og et antistof mod en HCV-epitop, der er forbundet til et fast substrat.

Der beskrives endvidere: en metode til fremstilling af et polypeptid, der indeholder en HCV-epitop omfattende inkubation af værtsceller, der er 10 transformeret med en ekspressionsvektor, der indeholder en sekvens, som koder for et polypeptid, der indeholder en HCV-epitop, under betingelser, der tillader ekspression af polypeptidet, og et polypeptid, der indeholder en HCV-epitop, der er fremstillet ved denne fremgangsmåde.

15 Der beskrives også en fremgangsmåde til påvisning af HCV-nukleinsyre i en prøve omfattende omsætning af prøvens nukleinsyre med en probe for et HCV-polynucleotid under betingelser, der tillader dannelsen af et polynucleotidduplex mellem proben og HCV-nukleinsyren fra prøven, og påvisning af et polynucleotidduplex, der indeholder proben.

20

Immunoanalyser er også beskrevet. Disse omfatter en immunoanalyse til påvisning af et HCV-antigen, der omfatter inkubation af en prøve, der antages at indeholde et HCV-antigen med et probeantistof rettet mod HCV-antigenet, der skal påvises, under betingelser, der tillader dannelsen af et 25 antigen-antistofkompleks, og påvisning af et antigen-antistofkompleks, der indeholder probeantistoffet. En immunoanalyse til påvisning af antistoffer rettet mod et HCV-antigen, der omfatter inkubation af en prøve, der formodes at indeholde anti-HCV-antistoffer med et probepolypeptid, der indeholder en epitop af HCV, under betingelser, der tillader dannelse af et antistof-30 antigenkompleks, samt påvisning af antistofantigenkomplekset, der indeholder probeantigenet.

11 DK 176280 B1

Der beskrives også vacciner til behandling af HCV-infektion, herunder et immuniserende peptid, der indeholder en HCV-epitop, eiler en inaktiveret præparation af HCV eller en svækket præparation af HOV.

5

Yderligere beskrives en vævskulturdyrket celle, der er inficeret med HCV.

Endvidere beskrives en fremgangsmåde til fremstilling af antistoffer mod HCV omfattende indgiven til et individ af et isoleret, immuniserende 10 polypeptid, der indeholder en HCV-epitop i en mængde, der er tilstrækkelig til at frembringe et immunrespons.

Endelig beskrives en fremgangsmåde til at isolere cDNA'er afledt fra genomet af et uidentificeret infektionsagens, omfattende (a) at tilvejebringe 15 værtsceller, der er transformeret med ekspressionsvektorer, der indeholder et cDNA-bibliotek fremstillet af nukleinsyrer, der er isoleret fra væv, der er inficeret med agenset, samt dyrkning af værtscellerne under betingelser, der tillader ekspression af polypeptid (polypeptider), der kodes for i cDNA'et; (b) at vekselvirke cDNA'ets ekspressionsprodukter med et antistof, der 20 indeholder legemsbestanddele fra et individ, der er inficeret med infektionsagenset under betingelser, der tillader en immunreaktion, samt påvisning af antistof-antigenkomplekser, der er dannet som et resultat af indvirkningen; (c) at dyrke værtsceller, der udtrykker polypeptider, der danner antistof-antigenkomplekser i trin (b) under betingelser, der tillader deres 25 vækst som individuelle kloner samt at isolere klonerne; (d) at dyrke celler fra klonerne i (c) under betingelser, der tillader ekspression af polypeptid (polypeptider), der kodes i cDNA'et, og at vekselvirke ekspressions-produkterne med antistof, der indeholder legemsbestanddele fra andre individer end individet i trin (a), der er inficeret med infektionsagenset og med 30 kontrolindivider, der ikke er inficeret med agenset samt at påvise antistof-antigenkomplekser, der er dannet som et resultat af indvirkningen; (e) at 12 DK 176280 B1 dyrke værtsceller, der udtrykker polypeptider, der danner antistof-antigenkomplekser med antistof, der indeholder legemsbestanddele fra inficerede individer og individer, der menes at være inficerede og ikke med legemsbestanddele fra kontrolindivider under betingelser, der tillader 5 dyrkningen heraf som individuelle kloner samt at isolere klonerne; og (f) at isolere cDNA fra værtscelleklonerne i (e).

Kort beskrivelse aftegningerne

10 Figur 1 viser den dobbeltstrengede nucleotidsekvens af HCV-cDNA

insertionet i klon 5-1-1 og den formodede aminosyresekvens af det deri indkodede polypeptid.

Figur 2 viser homologierne mellem de overlappende HCV-cDNA sekvenser i 15 klonerne 5-1-1, 81, 1-2 og 91.

Figur 3 viser en HCV-cDNA-kompositsekvens, der er afledt fra overlappende kloner 81, 1-2 og 91 og den deri indkodede aminosyresekvens.

20 Figur 4 viser den dobbeltstrengede nucleotidsekvens af HCV-cDNA- insertionel i klon 81 og den formodede aminosyresekvens af det deri indkodede polypeptid.

Figur 5 viser HCV-cDNA-sekvensen i klon 36, segmentet, der overlapper 25 NANBV-cDNA'et i klon 81 og den i klon 36 indkodede polypeptidsekvens.

Figur 6 viser den samlede ORF eller HCV-cDNA'er i klonerne 36 og 81 og det deri indkodede polypeptid.

30 Figur 7 viser klon 32's HCV-cDNA-sekvens, segmentet der overlapper klon 81 og det deri indkodede polypeptid.

Figur 8 viser klon 35's HCV-cDNA-sekvens, segmentet, der overlapper klon 36 og det deri indkodede polypeptid.

13 DK 176280 B1 5 Figur 9 viser den samlede ORF af HCV-cDNA’er i klonerne 35, 36, 81 og 32 og det deri indkodede polypeptid.

Figur 10 viser klon 37b's HCV-cDNA-sekvens, segmentet, der overlapper klon 35 og det deri indkodede polypeptid.

10

Figur 11 viser klon 33’s HCV-cDNA-sekvens, segmentet, der overlapper klon 32 og det deri indkodede polypeptid.

Figur 12 viser klon 40b's HCV-cDNA-sekvens, segmentet, der overlapper 15 klon 37b og det deri indkodede polypeptid.

Figur 13 viser klon 25c’s HCV-cDNA-sekvens, segmentet, der overlapper klon 33b og det deri indkodede polypeptid.

20 Figur 14 viser nucleotidsekvensen og det deri indkodede polypeptid i ORF, som strækker sig gennem hele HCV-cDNA'erne i klonerne 40b, 37b, 35, 36, 81,32, 33b og 25c.

Figur 15 viser HCV-cDNA-sekvensen i klon 33c, segmentet, der overlapper 25 klonerne 40b og 33c og de deri indkodede aminosyrer.

Figur 16 viser HCV-cDNA-sekvensen i klon 8h, segmentet, der overlapper klon 33c og de deri indkodede aminosyrer.

30 Figur 17 viser HCV-cDNA-sekvensen i klon 7e, segmentet, der overlapper klon 8h og de deri indkodede aminosyrer.

Figur 18 viser HCV-cDNA-sekvensen i klon 14c, segmentet, der overlapper klon 25c og de deri indkodede aminosyrer.

14 DK 176280 B1 5 Figur 19 viser HCV-cDNA-sekvensen i klon 8f, segmentet, der overlapper klon 14c og de deri indkodede aminosyrer.

Figur 20 viser HCV-cDNA-sekvensen i klon 33f, segmentet, der overlapper klon 8f og de deri indkodede aminosyrer.

10

Figur 21 viser HCV-cDNA-sekvensen i klon 33g, segmentet, der overlapper klon 33f og de deri indkodede aminosyrer.

Figur 22 viser HCV-cDNA-sekvensen i klon 7f, segmentet, der overlapper 15 sekvensen i klon 7e og de deri indkodede aminosyrer.

Figur 23 viser HCV-cDNA-sekvensen i klon 11b, segmentet, der overlapper sekvensen i klon 7f og de deri indkodede aminosyrer.

20 Figur 24 viser HCV-cDNA-sekvensen i klon 14i, segmentet, der overlapper sekvensen i klon 11b og de deri indkodede aminosyrer.

Figur 25 viser HCV-cDNA-sekvensen i klon 39c, segmentet, der overlapper sekvensen i klon 33g og de deri indkodede aminosyrer.

25

Figur 26 viser en komposit HCV-cDNA-sekvens, der er afledt fra de rækkestillede cDNA'er i klonerne 14i, 11b, 7f, 7e, 8h, 33c, 40b, 37b, 35, 36, 81, 32, 33b, 25c, 14c, 8f, 33f og 33g, aminosyresekvensen af det i det udvidede ORF i den afledte sekvens indkodede polypeptid er også vist.

30

Figur 27 viser sekvensen af HCV-cDNA’et i klon 12f, segmentet, der overlapper klon 14i og de deri indkodede aminosyrer.

15 DK 176280 B1

Figur 28 viser sekvensen af HCV-cDNA'et i klon 35f, segmentet, der 5 overlapper klon 39c og de deri indkodede aminosyrer.

Figur 29 viser HCV-cDNA’et sekvensen i klon 19g, segmentet, der overlapper klon 35f og de deri indkodede aminosyrer.

10 Figur 30 viser klon 26g sekvensen, segmentet, der overlapper klon 19g og de deri indkodede aminosyrer.

Figur 31 viser klon 15e sekvensen, segmentet, der overlapper klon 26g og de deri indkodede aminosyrer.

15

Figur 32 viser sekvensen i en komposit cDNA, der blev afledt ved at rækkestille klonerne 12f-15e i 5' til 3’-retningen, der vises også de i den kontinuerlige ORF-indkodede aminosyrer.

20 Figur 33 viser et fotografi af Western-blots af et fusionsprotein, SOD-NANB5-1-1· med chimpanseserum fra chimpanser, der er inficeret med BB-NANB, HAV og HBV.

Figur 34 viser et fotografi af Western-blots af et fusionsprotein, 25 SOD-NANB5_1_r med serum fra mennesker, der er inficeret med NANBV, HAV, HBV og serum fra kontrolpersoner.

Figur 35 er et kort, der viser de signifikante træk hos pAB24-vektoren.

30 Figur 36 viser den formodede carboxylterminals aminosyresekvens af fusionspolypeptidet C100-3 og nukleinsyresekvensen, der koder herfor.

16 DK 176280 B1

Figur 37A er et fotografi af en coomassie blue farvet polyacrylamidgel, der identificerer C100-3 udtrykt i gær.

5 Figur 37B viser et Western-blot af C100-3 med serum fra et NANBV-inficeret menneske.

Figur 38 viser et autoradiografi af et Northern-blot af RNA, der er isoleret fra leveren af en BB-NANBV-inficeret chimpanse, der er probet med BB-10 NANBV-cDNA fra klon 81.

Figur 39 viser et autoradiografi af NANBV-nukleinsyre, der er behandlet med RNase A eller DNase I og probet med BB-NANBV-cDNA fra klon 81.

15 Figur 40 viser et autoradiografi af nukleinsyre, der er ekstraheret fra NANBV-partikler, der er indfanget fra inficeret plasma med anti-NANB5.-i.-i og probet med 32P-mærket NANBV-cDNA fra klon 81.

Figur 41 vise autoradiografier af filtre, der indeholder isolerede NANBV-20 nukleinsyrer, der er probet med 32P-mærket plus- og minusstreng DNA prober, der er afledt fra NANBV-cDNA i klon 81.

Figur 42 viser homologierne mellem et polypeptid indkodet i HCV-cDNA og et NS protein fra Dengue flavivirus.

25

Figur 43 viser et histogram af HCV-infektionsfordelingen i stokastiske prøver som bestemt ved en ELISA-screening.

Figur 44 viser et histogram af HCV-infektionsfordelingen i stokastiske prøver 30 under anvendelse af to konfigurationer af immunoglobulin-enzymkonjugat i en ELISA-analyse.

17 DK 176280 B1

Figur 45 viser sekvenserne i en "primer mix", der er afledt fra en konserveret sekvens i NS1 fra flavivira.

5 Figur 46 viser HCV-cDNA-sekvensen i klon k9-1, segmentet, der overlapper cDNA i figur 26 og de deri indkodede aminosyrer.

Figur 47 viser sekvensen af en komposit cDNA, der blev afledt ved at rækkestille klonerne k9-1 - 15e i 5'- 3-retningen; der vises også de i den 10 kontinuert ORF indkodede aminosyrer.

Udførelsesformer L_Definitioner 15

Betegnelsen "hepatitis C virus" har af forskere inden for området været reserveret et hidtil ukendt ætiologisk agens for NANBH. Følgelig henviser "hepatitis C virus" (HCV) som anvendt heri, til et agens, der forårsager NANBH, der tidligere blev henvist til som NANBV og/eller BB-NANBV.

20 Betegnelserne HCV, NANBV og BB-NANBV anvendes med samme betydning heri. Som en udvidelse af denne terminologi kaldes den sygdom, der forårsages af HCV, tidligere kaldet NANB-hepatitis (NANBH), hepatitis C. Betegnelserne NANBH og hepatitis C kan heri anvendes med samme betydning.

25

Betegnelsen "HCV", som anvendt heri, betegner en virusart, der forårsager NANBH, og svækkede stammer eller defekte interfererende partikler afledt derfra. Som vist nedenfor udgøres HCV-genomet af RNA. Det er kendt, at RNA-indeholdende vira har relativt høje spontane mutationsrater, d.v.s.

30 angiveligt i størrelsesordenen fra 10'3 - 104 pr. nucleotid (Fields & Knipe (1986)). Derfor er der en flerhed af stammer inden for de nedenfor 18 DK 176280 B1 beskrevne HCV-arter. De heri beskrevne præparater og fremgangsmåder muliggør formering, identifikation, påvisning og isolering af de forskellige beslægtede stammer. Hertil kommer, at de også muliggør fremstilling af diagnostiska og vacciner for de forskellige stammer og er anvendelige i 5 screeningsprocedurer for antiviraie midler til farmakologisk anvendelse, idet de inhiberer HCV-replikationen.

Den heri tilvejebragte information, selvom den hidrører fra én HCV-linje, i det følgende kaldet CDC/HCV1, er tilstrækkelig til at gøre det muligt for en 10 virustaxonom at identificere andre stammer, der falder indenfor arten. Som heri beskrevet er det opdaget, at HCV er et flavivirus eller flavi-lignende virus. Morfologien og sammensætningen af flavivirus-partikler er kendt og omtalt i Brinton (1986). Flaviviraene indeholder i almindelighed, med hensyn til morfologi, et centralt nucleocapsid omgivet af et lipiddobbeltlag. Virioner er 15 sphæriske og har en diameter på ca. 40 - 50 nm. Deres kerner er ca. 25 - 30 nm i diameter. Langs den ydre overflade af virionkappen er projektioner, der er ca. 5 -10 nm lange med terminale knopper, der er ca. 2 nm i diameter.

HCV koder for en epitop, der er immunologisk identificerbar med en epitop i 20 HCV-genomet, hvorfra de heri beskrevne cDNA'er er afledt, hvor epitopen fortrinsvis er indkodet i den heri beskrevne cDNA. Epitopen er enestående for HCV sammenlignet med andre kendte flavivira. Epitopens enestående karakter kan bestemmes ved dens immunologiske reaktivitet med HCV og mangel på immunoloigisk reaktivitet med andre fla vi vi rusarter. Der kendes 25 inden for fagområdet metoder til bestemmelse af immunologisk reaktivitet, f.eks. radioimmunoanalyse, ELISA-analyse, hæmagglutination, og der gives heri adskillige eksempler på velegnede analyseteknikker.

Foruden de ovenstående er følgende parametre anvendelige, enten alene 30 eller i kombination, til identifikation af en HCV-stamme. Eftersom HCV-linjer er evolutionært beslægtede, forventes det, at genomernes generelle 19 DK 176280 B1 homologi på nucleotidniveauet vil være ca. 40% eller mere, fortrinsvis ca.

60% eller mere og endnu mere fortrinsvis ca. 80% eller mere, og der vil foruden være korresponderende sammenhængende sekvenser på mindst ca. 13 nucleotider. Korrespondensen mellem den formodede HCV-stamme 5 genomsekvens og CDC/CH1 HCV-cDNA-sekvensen kan bestemmes ved teknikker, der er kendte indenfor fagområdet. For eksempel kan den bestemmes ved en direkte sammenligning af sekvensinformationen hos det formodede HCV-polynucleotid og de heri beskrevne HCV-cDNA-sekvens(er).

De kan f.eks også bestemmes ved polynucleotidhybridisering under 10 betingelser, der danner stabile duplekser mellem homologe områder (f.eks. de, der ville kunne anvendes forud for Si-fordøjelse), fulgt af fordøjelse med enkeltstrenget specifik nuklease (nukleaser) og fulgt af størrelsesbestemmelse af de fordøjede fragmenter.

15 På grund af HCV-linjernes evolutionære slægtskab er de formodede HCV-linjer identificerbare ved deres homologi på polypeptidniveauet. Almindeligvis er HCV-linjer mere end ca. 40% homologe, fortrinsvis mere end ca. 60% homologe og endnu mere fortrinsvis mere end ca. 80% homologe på polypeptidniveauet. Teknikkerne til bestemmelse af aminosyresekvens-20 homologi kendes inden for fagområdet. For eksempel kan aminosyre-sekvensen bestemmes direkte og sammenlignes med de heri tilvejebragte sekvenser. For eksempel kan det formodede HCV-genommateriales nucleotidsekvens også bestemmes (sædvanligvis via en cDNA-intermediær) den deri indkodede aminosyresekvens kan bestemmes og de tilsvarende 25 områder sammenlignes.

Som anvendt heri henviser et polynucleotid "afledt fra" en angivet sekvens, f.eks. HCV-cDNA'et navnligt de, der er eksemplificeret i figurerne 1 - 32, eller fra et FICV-genom, til en polynucleotidssekvens, der udgøres af en sekvens 30 på tilnærmelsesvis mindst ca. 6 nucleotider, og fortrinsvis er på mindst ca. 8 nucleotider, og mere fortrinsvis er på mindst ca. 10 -12 nucleotider og endnu 20 DK 176280 B1 mere fortrinsvis er på mindst 15-20 nucleotider, der korresponderer, d.v.s. er homologe til eller komplementære til et område af de angivne nucleotid-sekvens. Sekvensen af det område, hvorfra polynucleotidet er afledt, er fortrinvis homologt til eller komplementært til en sekvens, der er enestående 5 for et HCV-genom. Hvorvidt en sekvens er enestående med hensyn til HCV-genomet eller ej, kan bestemmes ved teknikker, der kendes af fagfolk. For eksempel kan sekvensen sammenlignes med sekvenser i databanker, f.eks. Genebank, til fastsættelse af om den er tilstede i den ikke-inficerede vært eller andre organismer. Sekvensen kan også sammenlignes med de andre 10 viraie agensers kendte sekvenser, herunder de, der vides at inducere hepatitis, f.eks. HAV, HBV, og HDV, og med andre medlemmer af flavi-viridae. Korrespondensen eller ikke-korrespondensen af den afledte sekvens med andre sekvenser kan også bestemmes ved hybridisering under passende stringensbetingelser. Hybridiseringsteknikker til bestemmelse af 15 nukleinsyresekvensers komplementaritet kendes inden for fagområdet og diskuteres i det følgende. Se også f.eks. Maniatis et al. (1982). Desuden kan fejldannelse af duplex-polynucleotider dannet ved hybridisering bestemmes ved kendte teknikker, der f.eks. omfatter fordøjelse med en nuklease, såsom S1, der specifikt fordøjer enkeltstrengede områder i duplex-polynucleotider.

20 Områder, hvorfra typiske DNA sekvenser kan "afledes" omfatter, men er ikke begrænset til, f.eks. områder, der koder for specifikke epitoper, såvel som ikke-transskriberede og/eller ikke-translaterede områder.

Det afledte polynucleotid er ikke nødvendigvis fysisk afledt fra den viste 25 nucleotidsekvens, men kan frembringes på en hvilken som helst måde, herunder f.eks. kemisk syntese eller DNA-replikation eller revers transskription eller transskription, der er baseret på den af basesekvenserne i området (områderne), hvorfra polynucleotidet afledes, tilvejebragte information.

30 21 DK 176280 B1

Desuden kan kombinationer af områder, der korresponderer med områder i den angivne sekvens, modificeres til at være i overensstemmelse med en påtænkt anvendelse på måder, der er kendt inden for fagområdet.

5 På lignende måde henviser et polypeptid eller aminosyresekvens "afledt fra" en angivet nukleinsyresekvens, f.eks. sekvenserne i figurerne 1 - 32, eller fra et HCV-genom, til et polypeptid, der har en aminosyresekvens, der er identisk med aminosyresekvensen af et polypeptid, der er indkodet i sekvensen eller en del deraf, hvori delen består af mindst 3-5 aminosyrer 10 og mere fortrinsvis mindst 8-10 aminosyrer og endnu mere fortrinsvis mindst 11 - 15 aminosyrer, eller der er immunologisk identificerbare med et polypeptid, der er indkodet i sekvensen.

Et rekombinant eller afledt polypeptid translateres ikke nødvendigvis fra en 15 angivet nukleinsyresekvens, f.eks. sekvenserne i figurerne 1 - 26 eller fra et HCV-genom, idet det kan frembringes på en hvilken som helst måde, herunder f.eks. kemisk syntese eller ekspression af et rekombinant-ekspressionssystem eller isolering fra muteret HCV.

20 Betegnelsen "rekombinant polynucleotid" som anvendt heri betegner et polynucleotid af genomisk, cDNA, semisyntetisk eller syntetisk oprindelse, der i kraft af sin oprindelse eller manipulation: (1) ikke er forbundet med hele eller en del af polynucleotidet, hvormed det er forbundet i naturen eller i form af et bibliotek, og/eller (2) er bundet til et andet polynucleotid end det, hvortil 25 det er bundet i naturen.

Betegnelsen "polynucleotid" som anvendt heri henviser til en polymerform af nucleotider af en hvilken som helst længde enten ribonucleotider eller deoxyribonucleotider. Denne betegnelse henviser kun til molekylets primære 30 struktur. Denne betegnelse omfatter således dobbelt- og enkeltstrenget DNA såvel som dobbelt- og enkeltstrenget RNA. Den omfatter også modificerede, f.eks. ved methylering og/eller ved "capping", og umodificerede former af po- lynudeotidet.

22 DK 176280 B1

Som anvendt heri betyder betegnelsen ”HCV indeholdende en sekvens, der 5 korresponderer med et cDNA", at HCV'et indeholder en polynu-cleotidsekvens, der er homolog med eller komplementær med en sekvens i det angivne DNA, idet graden af homologt eller komplementaritet til cDNA'et vil være ca. 50% eller mere, fortrinsvis mindst ca. 70% og endnu mere fortrinsvis mindst ca. 90%. De korresponderende sekvenser vil være mindst 10 ca. 70 nucleotider, fortrinsvis mindst ca. 80 nucleotider og endnu mere fortrinsvis mindst ca. 90 nucleotider lange. Korrespondensen mellem HCV-sekvensen og cDNA'et kan bestemmes ved teknikker, der er kendt inden for fagområdet, herunder f.eks. en direkte sammenligning af det sekventerede materiale med de beskrevne cDNA'er, eller hybridisering og fordøjelse med 15 enkeltstrengede nukleaser fulgt af størrelsesbestemmelse af de fordøjede fragmenter.

Betegnelsen "renset viruspolynucleotid" henviser til et HCV-genom eller fragment deraf, der i det væsentlige er frit, d.v.s. indeholder mindre end ca.

20 50%, fortrinsvis mindre end ca. 70% og endnu mere fortrinsvis mindre end ca. 90% polypeptider, hvormed viruspolynucleotidet er naturligt forbundet. Teknikker til rensning af viruspolynucleotider fra viruspartikler kendes inden for fagområdet og omfatter f.eks. sprængning af partiklen med et chaotropt middel og separation af polynucleotidet (polynucleotiderne) og polypeptider 25 ved ionbytningskromatografi, affinitetskromatografi og sedimentation efter massefylde.

Betegnelsen "rensede viruspolypeptider" henviser til et HCV-polypeptid eller fragment deraf, der i det væsentlige er frit, det vil sige indeholder mindre end 30 ca. 50%, fortrinsvis mindre end ca. 70% og endnu mere fortrinsvis mindre end ca. 90% cellebestandele, hvormed viruspolypeptidet er naturligt 23 DK 176280 B1 forbundet. Teknikker til oprensning af viruspolypeptider kendes inden for fagområdet og eksempler herpå diskuteres i det følgende.

"Rekombinante værtsceller’', "værtsceller", "celler", "cellelinjer", "celle-5 kulturer" og andre sådanne betegnelser for mikroorganismer eller højere eukaryotiske cellelinjer, der dyrkes som encellede helheder, henviser til celler, som kan anvendes eller har været anvendt som recipienter for rekombinantvektor eller andet transfer DNA, og omfatter afkommet af den originale celle, der er blevet transficeret. Det vil forstås, at afkommet af en 10 enkelt forældrecelle ikke nødvendigvis er fuldstændig identisk i morfologi eller i genomisk eller totalt DNA-komplement med den oprindelige forældrecelle på grund af tilfældig eller tilsigtet mutation. Afkom af forældrecellen, der har tilstrækkelig lighed med forældreceller til at blive karakteriseret ved den relevante egenskab, såsom forekomst af en nucleotidsekvens, der koder for 15 et ønsket peptid, medtages i det ved denne betegnelse påtænkte afkom og dækkes af den ovennævnte betegnelse.

Et "replikon" er et hvilket som helst genetisk element, f.eks. et plasmid, et kromosom, en virus, der opfører sig som en autonom enhed for poly-20 nucleotidreplikation inden for en celle, d.v.s. er i stand til replikation under sin egen kontrol.

En "vektor" er et replikon, hvori der er fæstnet et andet polynucleotid-segment, således at der udføres replikation og/eller ekspression af det 25 fæstnede segment.

"Kontrolsekvens" henviser til polynucleotidsekvenser, der er nødvendige til udførelse af ekspressionen af kodende sekvenser, hvortil de er ligeret. Sådanne kontrolsekvensers natur varierer med værtsorganismen; i 30 prokaryoter omfatter sådanne kontrolsekvenser almindeligvis promotor, ribosomalt bindingssted og terminatorer; i eukaryoter omfatter sådanne 24 DK 176280 B1 kontrolsekvenser almindeligvis promotorer, terminatorer og i nogle tilfælde forstærkere. Betegnelsen "kontrolsekvenser" skal som et minimum omfatte alle bestanddele, hvis nærvær er nødvendig for ekspression, og kan også omfatte yderligere bestanddele, hvis nærvær er fordelagtig, f.eks. leder-5 sekvenser.

"Funktionsdygtigt bundet" henviser til en sammenstilling, hvori de således beskrevne bestanddele er i et forhold, der gør det muligt for dem at fungere på den tilsigtede måde. En kontrolsekvens, der er "funktionsdygtigt bundet" 10 til en kodende sekvens er ligeret på en sådan måde, at ekspression af den kodende sekvens opnås under betingelser, der er forenelige med kontrolsekvenserne.

En "åben læseramme" (ORF) er et område af en polynucleotidsekvens, der 15 koder for et polypeptid; dette område kan repræsentere en del af en kodende sekvens eller den totale kodende sekvens.

En "kodende sekvens" er en polynucleotidsekvens, som transskriberes til mRNA og/eller translateres til at polypeptid, når den anbringes under kontrol 20 af passende regulerende sekvenser. Grænseområderne for den kodende sekvens bestemmes ved et translationsstartcodon ved S'-terminalen og et translationsstopcodon ved 3'-terminalen. En kodende sekvens kan omfatte, men er ikke begrænset til, mRNA, cDNA og rekombinante polynucleotid-sekvenser.

25 "Immunologisk identificerbar med/som" henviser til forekomst af en epitop (epitoper) og polypeptid (polypeptider), der også er tilstede i og er enestående for det angivne polypeptid (polypeptider), sædvanligvis HCV-proteiner. Immunologisk identitet kan bestemmes ved antistofbinding og/eller 30 kompetitiv binding; disse teknikker kendes af fagfolk med gennemsnitlig fagkundskab og illustreres også i det følgende. En epitops enestådende 25 DK 176280 B1 karakter kan også bestemmes ved computersøgninger i kendte databanker, f.eks. Genebank, efter de poiynucleotidsekvenser, der koder for epitopen, og ved aminosyresekvenssammenligninger med andre kendte proteiner.

5 Som anvendt heri henviser "epitop" til en antigendeterminant af et polypeptid; en epitop kan omfatte tre aminosyrer i en rummelig konformation, som er enestående for epitopen, der almindeligvis består af mindst 5 sådanne aminosyrer og mere sædvanligvis af mindst 8-10 sådanne aminosyrer. Metoder til bestemmelse af den rumlige konformation af amino-10 syrer kendes inden for fagområdet og omfatter f.eks. røntgenkrystallografi, og todimensional kernemagnetisk resonans.

Et polypeptid er "immunologisk reaktivt" med et antistof, når det bindes til et antistof på grund af antistofgenkendelse af en specifik epitop, der indeholdes 15 i poiypeptidet. Immunologisk reaktivitet kan bestemmes ved antistofbinding, mere specifikt ved antistofbindingskinetik og/eller ved kompetitiv binding under anvendelse af et kendt polypeptid (polypeptider), der indeholder en epitop, hvorimod antistoffet rettes, som kompetitiv binder. Teknikkerne til fastsættelse af, om et polypeptid er immunologisk reaktivt med et antistof, 20 kendes inden for fagområdet.

Som anvendt heri omfatter betegnelsen "immunogent polypeptid, der indeholder en HCV-epitop" naturligt forekommende HCV-polypeptider eller fragmenter deraf såvel som polypeptider, der er fremstillet på andre måder 25 f.eks. ved kemisk syntese eller ved ekspression af poiypeptidet i en rekombinant organisme.

Betegnelsen "polypeptid" henviser til en molekylkæde af aminosyrer og henviser ikke til en specifik længde af produktet, således er peptider, 30 oligopeptider og proteiner omfattet af definitionen af poiypeptidet. Denne betegnelse henviser heller ikke til post-ekspressionensmodifikationer af 26 DK 176280 B1 polypeptidet, f.eks. glycosyleringer, acetyleringer, phosphoryleringer og lignende.

"Transformation" som anvendt heri henviser til insertionel af et eksogent 5 polynucleotid i en værtscelle, uanset den anvendte metode til insertionel, f.eks. direkte optagelse, transduktion eller f-bakteriekryds. Det eksogene polynucleotid kan vedligeholdes som en ikke-integreret vektor, f.eks. et plasmid, eller kan alternativt integreres i værtsgenomet.

10 "Behandling" som anvendt heri henviser til profylaxe og/eller terapi.

Et "individ" som anvendt heri henviser til hvirveldyr, navnlig medlemmer af pattedyrarterne og omfatter, men er ikke begrænset til, husdyr, sportsdyr, primater og mennesker.

15

Som anvendt heri indeholder "plusstrengen" af en nukleinsyre den sekvens, der koder for polypeptidet. "Minusstrengen" indeholder en sekvens, der er komplementær til "plusstrengens".

20 Som anvendt heri er "et positivt strenget genom" af et virus, et hvori genomet, hvad enten det er RNA eller DNA, er enkeltstrenget og som koder for et viralt polypeptid (polypeptider). Eksempler på positivt stengede RNA-vira omfatter Togaviridae, Coronaviridae, Retroviridae, Picornaviridae og Caliciviridae. Flaviviridiae, der tidligere blev klassificeret som Togaviradae, er 25 også omfattet. Se Fields & Knipe (1986).

Som anvendt heri henviser "antistof-indeholdende legemsbestanddel” til en bestanddel af et individs legeme, der er en kilde til de antistoffer, der har interesse. Antistof-indeholdende legemsbestanddele er kendt inden for 30 fagområdet og omfatter, men er ikke begrænset til, f.eks. plasma, serum, 27 DK 176280 B1 spinalvæske, lymfevæske, de ydre dele af luftvejene, tarmkanalen og urogenitalkanalerne, tårer, spyt, mælk, hvide blodceller og myelomer.

Som anvendt heri henviser "oprenset HCV" til en præparation af HCV, der er 5 blevet isoleret fra de cellebestanddele, hvormed viruset normalt er forbundet, og fra andre typer af vira, der kan være tilstede i det inficerede væv. Teknikkerne til isolering af vira er kendt af fagfolk og omfatter, f.eks. centrifugering og affinitetskromatografi; der omtales nedenfor en metode til fremstilling af oprenset HCV.

10 II. Beskrivelse af opfindelsen

Udførelsen af den foreliggende opfindelse vil omfatte, med mindre andet er angivet, sædvanlige molekylærbiologiske, mikrobiologiske, rekombinant DNA 15 og immunologiske teknikker, der ligger inden for fagfolks kunnen. Sådanne teknikker er udførligt forklaret i litteraturen. Se f.eks. Maniatis, Fitsch & Sambrook, MOLECULAR CLONING; A LABORATORY MANUAL (1982); DNA CLONING, BIND I OG II (D.N. Glover ed. 1985); OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS (M.J. Gait ed. 1984); NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION (B.D.

20 Hames & S.J. Higgins eds. 1984); TRANSCRIPTION AND TRANSLATION (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); ANIMAL CELL CULTURE (R.l. Freshney ed. 1986); IMMOBILIZED CELLS AND ENZYMES (IRL Press,

1986); B. Perbal, A PRACTICAL GUIDE TO MOLECULAR CLONING

(1984); serien METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.); GENE 25 TRANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS (J.H. Miller og M.P.

Calos eds. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods in Enzymology bind 154 og bind 155 (Wu and Grossman, henholdsvis Wu, eds.); Mayer and Walker, eds. (1987), IMMUNOCHEMICAL METHODS IN CELL AND MOLECULAR BIOLOGY (Academic Press, London); Scopes, (1987), 30 PROTEIN PURIFICATION: PRINCIPLES AND PRACTICE, anden udgave 28 DK 176280 B1 (Springer-Verlag, N.Y.) og HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY, BIND I - IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell eds. 1986).

Alle patenter, patentansøgninger og heri nævnte publikationer både ovenfor 5 og nedenfor medtages herved heri ved henvisning.

De velegnede materialer og fremgangsmåder ifølge den foreliggede opfindelse er muliggjort ved tilvejebringelsen af en familie af nært homologe nucleotidsekvenser, der er isoleret fra et cDNA-bibliotek, der er afledt fra 10 nukleinsyresekvenser, der er tilstede i plasmaet af en HCV-inficeret chimpanse. Denne familie af nucleotidsekvenser er ikke af human eller chimpanse oprindelse, idet den hverken hybridiserer med menneske- eller chimpansegenomisk DNA fra ikke-inficerede individer, idet nucleotider af denne sekvensfamilie kun er tilstede i lever og plasma hos chimpanser med 15 HCV-infektion, og idet sekvensen ikke er tilstede i Genebank. Desuden viser sekvensfamilien ingen signifikant homologi med sekvenser, der er indeholdt i HBV-genomet. Sekvensen af et familiemedlem, der er indeholdt i klonen 5-1-1, har en kontinuert åben læseramme (ORF), der koder for et polypeptid på ca. 50 aminosyrer. Sera fra HCV-inficerede mennesker indeholder anti-20 stoffer, der binder til dette polypeptid, hvorimod sera fra ikke-inficerede mennesker ikke indeholder antistoffer mod dette polypeptid. Endelig induceres antistofferne i chimpanser efterfølgende akut NANBH-infektion, hvorimod sera fra ikke-inficerede chimpanser ikke indeholder antistoffer mod dette polypeptid. Hertil kommer, at antistoffer mod dette polypeptid ikke er 25 påvist i chimpanser og mennesker, der er inficeret med HAV og HBV. Udfra disse kriterier er sekvensen et cDNA af en virussekvens, hvorved viruset forårsager eller er forbundet med NANBH; denne cDNA-sekvens er vist i figur 1. Som omtalt i det følgende adskiller cDNA-sekvensen i klon 5-1-1 sig fra de andre isolerede cDNA'ers sekvenser ved at indeholde 28 ekstra 30 basepar.

29 DK 176280 B1

En komposit af andre identificerede medlemmer af cDNA-familien, der blev isoleret under anvendelse af en probe som syntetisk ækvivalentsekvens til cDNA-fragment i klon 5-1-1, er vist i figur 3. Et medlem af cDNA-familien, der blev isoleret under anvendelse af en syntetisk sekvens, der er afledt fra 5 cDNA’et i klon 81 er vist i figur 5 og kompositten af denne sekvens med sekvensen i klon 81 er vist i figur 6. Andre medlemmer af cDNA-familien omfatter de medlemmer, der er tilstede i klonerne 12f, 14i, 11b, 7f, 7e, 8h, 33c, 40b, 37b, 35, 36, 81, 32, 33b, 25c, 14c, 8f, 33f og 33g, 39c, 35f, 19g, 26g og 15e er beskrevet i afsnit IV.A. En komposit af cDNA'erne i disse 10 kloner er beskrevet i afsnit IV.A.19 og vist i figur 32. Det kompositte cDNA viser, at det indeholder en kontinuert ORF og således koder for et polyprotein. Disse oplysninger er i overensstemmelse med nedenstående forslag om, at HCV er et flavivirus eller flavi-lignende virus.

15 Tilgængeligheden af denne familie af cDNA'er, der er vist i figurerne 1 - 32 inklusive, gør det muligt at konstruere DNA-prober og polypeptider, der er velegnede til at diagnosticere NANBH, der skyldes HCV-infektion, og screening for infektion af bloddonorer såvel som af doneret blod og blodprodukter. For eksempel er det muligt ud fra sekvenserne at syntetisere 20 DNA-oligomerer på ca. 8 - 10 nucleotider eller større, der er velegnede som hybridiseringsprober til påvisning af forekomsten af det virale genom i f.eks. sera fra patienter, der formodes at have viruset i sig eller til screening af doneret blod for forekomsten af viruset. Familier af cDNA-sekvenser muliggør også konstruktion og fremstilling af HCV-specifikke polypeptider, 25 der er velegnede som diagnostiske reagenser for forekomst af antistoffer, der er frembragt under NANBH. Antistoffer mod oprensede polypeptider, der er afledt fra cDNA'erne kan også anvendes til påvisning af virale antigener hos inficerede individer og i blod.

30 Kendskab til disse cDNA-sekvenser muliggør også konstruktion og fremstilling af polypeptider, der kan anvendes som vacciner mod HCV og 30 DK 176280 B1 også til fremstilling af antistoffer, der igen kan anvendes til beskyttelse mod sygdommen og/eller til terapi af HCV-inficerede individer.

Familien af cDNA-sekvenser muliggør yderligere karakterisering af HCV-5 genomet.

Polynucleotidprober, der er afledt fra disse sekvenser, kan anvendes til at screene cDNA-biblioteker for yderligere overlappende cDNA-sekvenser, der igen kan anvendes ti! at opnå flere overlappende sekvenser. Med mindre 10 genomet er sekvenseret og segmenterne mangler fælles sekvenser, kan denne teknik anvendes til at opnå hele genomets sekvens. Hvis genomet imidlertid er segmenteret, kan der opnås andre genomsegmenter ved at gentage den Iambda-gt11 serologiske screeningsprocedure, der anvendes til at isolere cDNA-kloner, der er beskrevet heri, eller alternativt ved at isolere 15 genomet fra oprensede HCV-partikler.

Familien af cDNA-sekvenser og polypeptiderne, der er afledt fra disse sekvenser såvel som antistoffer rettet mod disse polypeptider er også velegnede til isolering og identifikation af BB-NANBV-agenset (agenserne).

20 For eksempel kan antistoffer, der er rettet mod HCV-epitoper, der er indeholdt i fra cDNA'erne afledte polypeptider, anvendes i processer, der er baseret på affinitetskromatografi, til isolering af viruset. Alternativt kan antistofferne anvendes til identifikation af virale partikler, der er isoleret ved andre teknikker. De virale antigener og det genomiske materiale i de 25 isolerede virale partikler kan herefter yderligere karakteriseres.

Den information, der er opnået ved yderligere sekvensering af HCV-genomet (genomerne) såvel som ved yderligere karakterisering af HCV-antigenerne og karakterisering af genomet, muliggør konstruktion og syntese af 30 yderligere prober og polypeptider og antistoffer, der kan anvendes til 31 DK 176280 B1 diagnose, tit forebyggelse og til terapi af HCV-induceret NANBH og til screening for inficeret blod og blodrelaterede produkter.

Tilgængeligheden af HCV, herunder antigener og antistoffer, og 5 polynucleotider, der er afledt fra genomet, hvorfra familien af cDNA'er er afledt, muliggør også udvikling af vævskultursystemer, som vil få større betydning i klarlægningen af HCV’s biologi. Dette kan igen føre til udvikling af nye behandlingskure, baseret på antivirale forbindelser, der fortrinsvis hæmmer replikationen af eller infektionen med HCV.

10

Den anvendte fremgangsmåde til at identificere og isolere den ætiologiske agens for NANBH er hidtil ukendt og kan anvendes til identificeringen og/eiler isoleringen af hidtil ukarakteriserede agenser, der indeholder et genom, og som er forbundet med en række sygdomme, herunder de 15 sygdomme, der induceres af vira, viroider, bakterier, svampe og parasitter.

Ifølge denne fremgangsmåde blev et cDNA-bibliotek frembragt ud fra de nukleinsyrer, som er tilstede i inficeret væv fra et inficeret individ. Biblioteket blev frembragt i en vektor, der tillod ekspression af polypeptider, der er indkodede i cDNA'et. Kloner af værtsceller, der indeholder vektoren, som 20 udtrykte et immunologisk reaktivt fragment af et polypeptid af det ætiologiske agens, blev udvalgt ved immunologisk screening af bibliotekets ekspressionsprodukter med en antistof-indeholdende legemsbestanddel fra et andet individ, der tidligere var blevet inficeret med det formodede agens. Trinene i den immunologiske screeningsteknik omfattede interaktion af 25 ekspressionsprodukterne af de cDNA-indeholdende vektorer med den antistofindeholdende legemsbestanddel fra et andet inficeret individ samt påvisning af dannelsen af antistof-antigenkomplekser mellem ekspressionsproduktet (produkterne) og antistoffer fra det andet inficerede individ. De isolerede kloner screenes yderligere immunologisk ved interaktion mellem 30 deres ekspressionsprodukter og den antistofindeholdende legemsbestanddel fra andre individer, der er inficeret med det formodede agens, og med 32 DK 176280 B1 kontrolindivider, der ikke er inficeret med det formodede agens, samt ved påvisning af dannelsen af antigen-antistofkomplekser med antistoffer fra de inficerede individer; de cDNA-indeholdende vektorer, der koder for polypeptider, der reagerer immunologisk med antistoffer fra inficerede 5 individer og individer, som antages at være inficeret med agenset, men ikke med kontrolindivider, isoleres. De inficerede individer, der anvendes til konstruktionen af cDNA-biblioteket og til den immunologiske screening behøver ikke være af samme art.

10 De som et resultat af denne fremgangsmåde isolerede cDNA’er og deres ekspressionsprodukter og antistoffer rettet mod ekspressionsprodukterne er velegnede til karakterisering og/eller indfangning af det ætiologiske agens.

Som beskrevet mere detaljeret i det følgende har denne fremgangsmåde med succes været anvendt til isolering af en familie af cDNA'er, der er afledt 15 fra HCV-genomet.

II.A. Fremstilling af cDNA-sekvensen

Forenet serum fra en chimpanse med kronisk HCV-infektion og inde-20 holdende en høj titer af viruset, d.v.s. mindst 106 chimpanse infektiøse doser/ml (CID/ml) anvendtes til at isolere virale partikler; nukleinsyrer, der var isoleret fra partiklerne blev anvendt som skabelon (engelsk: template) i konstruktionen af et cDNA-bibliotek for virusgenomet. Fremgangsmåderne til isolering af formodede HCV-partikler og ti! konstruktion af cDNA-biblioteket i 25 Iambda-gt11 omtales i afsnit IV.A.1. Lambda-gt11 er en vektor, der er blevet udviklet specielt til at udtrykke indsatte cDNA'er som fusionspolypeptider med betagalactosidase og til at screene store antal af rekombinante fager med specifikke antisera, der er frembragt mod et defineret antigen. Lambda-gt11 cDNA-biblioteket, der er frembragt ud fra en cDNA-pulje, der indeholder 30 cDNA med en tilnærmet middelstørrelse på 200 basepar blev screenet for indkodede epitoper, som kunne bindes specifikt med sera, der er afledt fra 33 DK 176280 B1 patienter, der tidligere har haft NANB-hepatitis. Huynh, T.V. et al (1985). Ca.

106 fager blev screenet og 5 positive fager blev identificeret, oprenset og derefter afprøvet for bindingsspecificitet overfor sera fra forskellige mennesker og chimpanser, der tidligere var inficeret med HCV-agenset. En 5 af disse fager, 5-1-1, bandt 5 af de 8 afprøvede humane sera. Denne binding forekom selektiv med hensyn til sera, der er afledt fra patienter med tidligere NANB-hepatitisinfektioner, idet 7 normale donorsera ikke udviste sådan binding.

10 cDNA Sekvensen i rekombinant fag 5-1-1 blev bestemt og er vist i figur 1.

Det polypeptid, der er indkodet af dette klonede cDNA, der er i samme translationsramme som den N-terminale beta-galactosidasedel af fusion-polypeptidet, er vist over nucleotidsekvensen. Denne translations-ORF koder derfor for en epitop (epitoper), der specifikt genkendes af sera fra patienter 15 med NANB-hepatitisinfektioner.

Tilgængeligheden af cDNA i rekombinant fag 5-1-1 har muliggjort isoleringen af andre kloner, der indeholder yderligere segmenter og/eller alternative segmenter af cDNA for det virale genom. Det ovenfor beskrevne Lambda-20 gt11 cDNA biblioteket, blev screenet under anvendelse af et syntetisk polynucleotid, der er afledt fra sekvensen af de klonede 5-1-1 cDNA. Denne screening gav 3 andre kloner, som blev identificeret som 81, 1-2 og 91; de i disse kloner indeholdte cDNA'er blev sekvenseret. Se afsnitne VI.A.3. og IV.A.4. Homologierne mellem de 4 uafhængige kloner er vist i figur 2, hvor 25 homologierne angives ved de lodrettte linjer. Nukleotidsekvenser, der udelukkende er tilstede i klonerne 5-1-1, 81 og 91 er angivet ved små bogstaver.

De klonede cDNA'er, som er tilstede i rekombinante fager i klonerne 5-1-1, 30 81, 1-2 og 91, er stærkt homologe og afviger kun i to områder. For det første er nucleotid nr. 67 i klon 1-2 thymidin, hvorimod de andre tre kloner 34 DK 176280 B1 indeholder en cytidinrest i denne stilling. Denne substitution ændrer imidlertid ikke arten af den indkodede aminosyre.

Den anden forske! mellem klonerne er, at klon 5-1-1 indeholder 28 basepar 5 ved S'-terminalen, der ikke er tilstede i de andre kloner. Den ekstra sekvens kan være en 5’-terminal kloningsartefakt; 5'-terminal kloningsartefakter observeres almindeligt i produkterne af cDNA-metoder.

Syntetiske sekvenser, der er afledt fra 5-området og 3-området af HCV-10 cDNA i klon 81 anvendtes til at screene og isolere cDNA'erne fra iambda-gt11 NANBV cDNA-biblioteket, der overlappede klon 81 cDNA (afsnit IV.A.5.). De resulterende cDNA'ers sekvenser, der er i henholdsvis klon 36 og klon 32, er vist i figur 5 og figur 7.

15 På lignende måde blev et syntetisk polynucleotid, der er baseret på 5'-området i klon 36, anvendt til at screene og isolere cDNA'erne fra lambda gt-11 NANBV cDNA-biblioteket, der overlappede klon 36 cDNA (afsnit IV.A.8.).

En oprenset klon af rekombinant fag-indeholdende cDNA, der hybridiserer med den syntetiske polynucleotidprobe, benævntes klon 35, og NANBV-20 cDNA-sekvenser, der er indeholdt i denne klon, er vist i figur 8.

Ved at anvende isoleringsteknikken for overlappende cDNA-sekvenser er der opnået kloner, der indeholder yderligere opstrøms- og nedstrøms HCV-cDNA-sekvenser. Isoleringen af disse kloner beskrives nedenfor i afsnit IV.A.

25

Analyse af HCV-cDNA-nucleotidsekvenserne, der er indkodet i de isolerede kloner, viser, at det kompositte cDNA indeholder en lang kontinuert ORF.

Figur 26 viser det kompositte DNA's sekvens fra disse kloner sammen med det formodede HCV-polypeptid, der er indkodet deri.

30 35 DK 176280 B1

Beskrivelsen af metoden til at generhverve cDNA-sekvenserne er mest af historisk interesse. De resulterende sekvenser (og deres komplementer) er tilvejebragt deri, og sekvenserne eller en hvilken som helst del deraf kunne fremstilles under anvendelse af syntetiske metoder eller ved en kombination 5 af syntetiske metoder med generhvervelse af delsekvenser under anvendelse af metoder, der ligner de heri beskrevne.

Lambda-gt11 stammer, der er repliceret fra HCV cDNA-bibiioteket og fra klonerne 5-1-1, 81, 1-2 og 91 er blevet deponeret under Budapest traktatens 10 betingelser hos American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn,

Dr. Rockville, Maryland 20852 og er blevet tildelt de følgende deponeringsnumre.

15 Iambda-gt11_ATCC Nr._Oeponerinqsdato HCV-cDNA-bibliotek 40394 1. december 1987 klon 81 40388 17. november 1987 klon 91 40389 17. november 1987 20 klon 1-2 40390 17. november 1987 klon 5-1-1 40391 18. november 1987

Ved tildeling og udstedelse af denne ansøgning som et US patent vil alle restriktioner på tilgængeligheden af disse deponeringer uigenkaldeligt blive 25 fjernet; og adgang til de angivne deponeringer vi! være mulig, medens ovennævnte ansøgning verserer for en person, der har fået tilladelse dertil under 37 CFR 1,14 og 35 USC 1,22 af rette vedkommende. Desuden vil de angivne deponeringer blive opretholdt over en 30 års periode fra deponeringsdatoen eller 5 år efter den sidste anmodning om deponeringen 30 eller i US patenters levetid, alt efter hvilken, der er længst. Disse deponeringer og andre heri deponerede materialer er kun foretaget af 36 DK 176280 B1 bekvemmelighedshensyn og kræves ikke for at udføre den foreliggende opfindelse i betragtning af nærværende beskrivelse. HCV-cDNA-Sekvenserne i alle de deponerede materialer medtages heri.

5 Ovennævnte beskrivelse af "genom walking" ved isolering af overlappende cDNA'sekvenser fra HCV lambda gt11 biblioteket tilvejebringer en metode, hvorved cDNA'er, der korresponderer med hele HCV-genomet, kan isoleres.

Med den heri tilvejebragte information er imidlertid andre metoder til isolering af disse cDNA åbenbare for en fagmand. Nogle af disse metoder beskrives i 10 afsnit IV.A. nedenfor.

II.B. Fremstillino af virale polypeptider og fragmenter

Tilgængeligheden af cDNA-sekvenser, enten de, der er isoleret ved 15 anvendelse af cDNA-sekvenserne i figurerne 1 - 32, som omtalt nedenfor, såvel som cDNA-sekvenserne i disse figurer, muliggør konstruktion af ekspressionssvektorer, der koder for antigent aktive områder i polypeptidet, der er indkodet i begge strenge. Disse antigent aktive områder kan afledes fra kappeantigener eller fra kerneantigener, herunder f.eks. polynucleotid-20 bindende proteiner, polynucleotidpolymerase (polymeraser) og andre virale proteiner, der kræves til replikation og/eller samling af viruspartiklen. Fragmenterne, der koder for de ønskede polypeptider, er afledt fra cDNA-klonerne under anvendelse af sædvanlig restriktionsfordøjelse eller ved syntetiske metoder og ligeres ind i vektorer, som f.eks. kan indeholde dele af 25 fusionsekvenser, såsom beta-galactosidase eller superoxiddismutase (SOD), fortrinsvis (SOD). Metoder og vektorer, der er egnede til fremstilling af polypeptider, der indeholder fusionssekvenser af SOD er beskrevet i EPO publikationsnr. 0196056, offentligjort 1. oktober 1986. Vektorer, der koder for fusionspolypeptider af SOD og HCV-polypeptider, d.v.s. NANBso-v NANB81, 30 og C100-3, som er indkodet i en komposit af HCV-cDNA'er er beskrevet i afsnitne IV.B.1, IV.B.2 henholdsvis IV.B.4. En hvilken som helst ønsket del af 37 DK 176280 B1 HCV-cDNA'er, der indeholder en åben læseramme i hvilken som helst af strengene kan opnås som et rekombinant polypeptid, såsom et modent eller et fusionsprotein; alternativt kan der ved kemisk syntese tilvejebringes et polypeptid, der er indkodet i cDNA'et.

5

Det DNA, der koder for det ønskede polypeptid, hvad enten det er i fusioneret eller moden form, og hvad enten det indeholder en signalsekvens, som tillader secernering, eller ej, kan ligeres ind i ekspressionsvektorer, der er egnede til en hvilken som helst hensigtsmæssig vært. Der anvendes for 10 tiden både eukaryotiske og prokaryotiske værtssystemer til dannelse af rekombinante polypeptider og der gives i afsnit III.A. Nedenfor et resume af nogle af de mere almindelige styringssystemer og værtscellelinjer. Polypeptidet isoleres herefter fra lyserede celler eller fra kulturmediet og oprenses i det omfang det er nødvendigt for dets påtænkte anvendelse.

15 Oprensningen kan ske ved kendte teknikker, f.eks. saltfraktionering, kromatografi på ionbytterharpikser, affinitetskromatografi, centrifugering og lignende. Se f.eks. "Methods in Enzymology" angående en række metoder ti! oprensning af proteiner. Sådanne polypeptider kan anvendes som diagnostika eller de, der bevirker produktion af neutraliserende antistoffer, kan 20 formuleres til vacciner. Antistoffer, der er produceret mod disse polypeptider kan også anvendes som diagnostika eller til passiv immunoterapi. Desuden er antistoffer mod disse polypeptider velegnede til isolering og identificering af HCV-partikler, som beskrevet i nedenstående afsnit II.J..

25 HCV-Antigenerne kan også isoleres ud fra HCV-virioner. Virionerne kan dyrkes i HCV-inficerede celler i vævskultur eller i en inficeret vært.

30 38 DK 176280 B1 II.C. Fremstilling af antiqenpolypeptider og koniuqerinq med bærer

Et antigent område af et poiypeptid er i almindelighed relativt lille - typisk 8-10 aminosyrer eller mindre i længde. Fragmenter på så få som 5 aminosyrer 5 kan kendetegne et antigent område. Disse segmenter kan korrespondere med områder af HCV-antigen. DNA'er, Der koder for korte HCV-polypeptidsegmenter kan derfor, under anvendelse af HCV-cDNA'er som basis, udtrykkes rekombinant enten som fusionsproteiner eller som isolerede polypeptider. Desuden kan korte aminosyresekvenser hensigtsmæssigt 10 opnås ved kemisk syntese. I tilfælde, hvor det syntetiserede poiypeptid er korrekt konfigureret for tilvejebringelse af den korrekte epitop, men er for lille til at være immunogen, kan polypeptidet bindes til en passende bærer.

Der kendes inden for fagområdet en række teknikker til opnåelse af sådan 15 binding, herunder dannelse af disulfidbindinger under anvendelse af N-succinimidyl-3-(2-pyndylthio)-propionat (SPDP) og succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat (SMCC), der fås fra Pierce Company, Rockford, Illinois, (hvis peptidet mangler en sulfhydrylgruppe kan dette tilvejebringes ved addition af en cysteinrest). Disse reagenser 20 frembringer en disulfid binding mellem sig selv og peptidcysteinrester på et protein og en amidbinding gennem epsilonaminogruppen på et lysin eller andre frie aminogrupper på den anden. Der kendes en række sådanne disulfid/amiddannende midler. Se f.eks. Immum. Rev. (1982) 62:185. Andre dobbeltfunktionelle koblingsmidler danner en thioether snarere end en 25 disulfidbinding. Mange af disse thioetherdannende midler er kommercielt tilgængelige og omfatter reaktive estere af 6-maleimidocapronsyre, 2-bromeddikesyre, 2-iodeddikesyre, 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexan-1 -carboxylsyre og lignende. Carboxylgrupperne kan aktiveres ved at kombinere dem med succinimid eller 1-hydroxyF2-nitro-4-sulfonsyre, 30 natriumsaltet. Den foregående liste skal ikke forestille at være udtømmende og der kan selvfølgelig anvendes modifikationer af de nævnte forbindelser.

39 DK 176280 B1

Der kan anvendes en hvilken som helst bærer, der ikke i sig selv inducerer produktion af antistoffer, der er skadelige for værten. Velegnede bærere er typisk store, langsomt metaboliserede makromolekyler, såsom proteiner, 5 polysaccharider, såsom latexfunktionaliseret sepharose, agarose, cellulose, celluloseperler og lignende, polymere aminosyrer, såsom polyglutaminsyre, polylysin og lignende; aminosyrecopolymerer og inaktive viruspartikler, se f.eks. afsnit II.D. Særligt velegnede proteinsubstrater er serumalbuminer, hæmocyanin fra "keyhole limpet" (en art af albueskæl), immunoglobulin-10 molekyler, thyroglobulin, ovalbumin, tetanustoxoid og andre proteiner, der er velkendte for fagfolk.

II.D. Fremstilling af hybride partikelimmunoaener, der indeholder HCV-epitoper 15 HCV-epitopernes immunogenicitet kan også forstærkes ved at fremstille dem i pattedyrs- eller gærsystemer fusioneret med eller samlet med partikeldannende proteiner, såsom f.eks. det med hepatitis B overfladeantigen forbundne protein. Konstruktioner, hvori NANBV-epitopen 20 er bundet direkte til de partikeldannende proteinkodende sekvenser producerer hybrider, der er immunogene med hensyn til HCV-epitopen. Desuden omfatter alle de fremstillede vektorer epitoper, der er specifikke over for HBV og har varierende grader af immunogenicitet, såsom f.eks. præ-S peptidet. Således er partikler, der er konstrueret ud fra partikei-25 dannende protein, der omfatter HCV-sekvenser, immunogene med hensyn til HCV og HBV.

Det er fundet, at hepatitis overfladeantigen (HBSAg) er dannet og samlet til partikler i S. cerevisiae, (Valenzuela et al. (1982)), såvel som i f.eks.

30 pattedyrsceller (Valenzuela, P., et al. (1984)). Det er fundet, at dannelsen af sådanne partikler forstærker monomerunderenhedens immunogenicitet.

40 DK 176280 B1

Konstruktionerne kan også omfatte den immunodominante epitop hos HBSAg, herunder de 55 aminosyrer i præoverflade (præ-S)-området. Neurath et al. (1984). Konstruktioner af præ-S-HBSAg-partiklen, som kan udtrykkes i gær, er beskrevet i EPO nr. 174.444, fremlagt 19. marts 1986; 5 hybrider, som omfatter heterologe virale sekvenser ti! gærekspression er beskrevet i EPO 175.261, fremlagt 26. marts 1966. Begge ansøgninger er overdraget til nærværende ansøgere og medtages heri ved nærværende henvisning. Disse konstruktioner kan også udtrykkes i pattedyrsceller, såsom ovarieceller af kinesisk hamster (CHO) under anvendelse af en SV40-10 dihydrofolat reduktasevektor (Michelle et al. (1984)).

Desuden kan dele af den sekvens, der koder for det partikeldannende protein udskiftes med codoner, som koder for en HCV-epitop. I denne udskiftning kan der udelades områder, der ikke kræves til at mediere 15 aggregeringen af enhederne til dannelse af immunogene partikler i gær eller pattedyr, hvorved yderligere HBV-antigene steder udelukkes fra kompetition med HCV-epitopen.

II.E. Fremstilling af vacciner 20

Vacciner kan fremstilles ud fra et eller flere immunogene polypeptider, der er afledt fra HCV-cDNA såvel som fra cDNA-sekvenserne i figurerne 1 - 32 eller fra det korresponderende HCV-genom. Den observerede homologi mellem HCV og flavivira tilvejebringer information vedrørende de polypeptider, der 25 sandsynligvis er mest effektive som vacciner, såvel som de områder af genomet, hvori de er indkodet. Flavivirusgenomets almene struktur omtales i Rice et al. (1986). Flavivirus RNA-genomet antages at være den eneste virusspecifikke mRNA-art og det translateres til tre virale strukturproteiner, d.v.s. C, M og E såvel som to store ikke-strukturelle proteiner, NV4 og NV5, 30 samt et kompleks af mindre ikke-strukturelle proteiner. Det er kendt, at større neutraliserende epitoper for flavivira ligger i E-(kappe)-proteinet, (Roehrig 41 DK 176280 B1 1986)). Det korresponderende HCV E-gen og polypeptidkodende område kan forudsiges på basis af flaviviraenes homologt. Vacciner kan således omfatte rekombinante polypeptider, der indeholder epitoper af HCV E. Disse polypeptider kan udtrykkes i bakterier, gær eller pattedyrsceller eller de kan 5 alternativt isoleres fra virale præparationer. Det forventes desuden, at de andre strukturproteiner også kan indeholde epitoper, der forårsager produktion af beskyttende anti-HCV-antistoffer. Polypeptider, der indeholder epitoperne af E, C og M kan således også anvendes i HCV-vacciner, enten alene eller i kombination.

10

Ud over det ovennævnte er det påvist, at immunisering med NS1 (ikke-strukturprotein 1), fører til beskyttelse mod gul feber (Schlesinger et al. (1986)). Dette gælder selvom immuniseringen ikke forårsager produktion af de neutraliserende antistoffer. Navnlig fordi dette protein synes at være 15 stærkt konserveret blandt flavivira er det således sandsynligt, at HCV NS1 også vil beskytte mod HCV-infektion. Det viser desuden, at ikke-strukturproteiner kan tilvejebringe beskyttelse mod viral pathogenicitet, selvom de ikke forårsager produktion af neutraliserende antistoffer.

20 I betragtning af ovenstående kan multivalente vacciner mod HCV omfatte et eller flere strukturproteiner og/eller flere ikke-strukturproteiner. Vaccinerne kan omfatte f.eks. rekombinante HCV-polypeptider og/eller polypeptider, der er isoleret fra virionerne. Desuden er det muligt at anvende inaktiveret HCV i vacciner; inaktivering kan ske ved fremstilling af virale lysater eller ved andre 25 kendte metoder, der bevirker inaktivering af flavivira, f.eks. behandling med organiske opløsningsmidler eller detergenter eller behandling med formalin.

Hertil kommer, at vacciner også kan fremstilles ud fra svækkede HCV-stammer. Fremstillingen af svækkede HCV-stammer beskrives nedenfor.

30 Det er kendt, at nogle af proteinerne i flavivira indeholder stærkt konserverede områder, og der forventes således nogen immunologisk 42 DK 176280 B1 krydsreaktivitet mellem HCV og andre flavivira. Det er muligt, at fælles epitoper mellem flaviviraene og HCV vil give anledning til produktion af beskyttende antistoffer mod en eller flere af de sygdomme, der forårsages af disse patogene agenser. Det er således muligt at konstruere vacciner til flere 5 formål på basis af denne viden.

Fremstillingen af vacciner, der indeholder et immunogent polypeptid (polypeptider) som aktive bestanddele, kendes af fagfolk. Sådanne vacciner fremstilles typisk i injicerbar form, enten i form af væskeformige opløsninger 10 eller som suspensioner; de kan også fremstilles i fast form, der er egnet til opløsning eller suspension i væske forud for injektion. Præparationen kan også emulgeres eller proteinet kan indkapsles i liposomer. De aktive immunogene bestanddele blandes ofte med ekscipienser, der er farmaceutisk acceptable og forenelige med den aktive bestanddel. Egende 15 ekscipienser omfatter f.eks. vand, saltopløsning, dextrose, glycerol, ethanol eller lignende og kombinationer heraf. Desuden kan vaccinen, om ønsket, indeholde mindre mængder hjælpestoffer, såsom fugtnings- eller emulgeringsmidler, pH-puffermidler og/eller adjuvanser, der forstærker vaccinens virkning. Eksempler på adjuvanser, der kan være effektive, omfatter, men er 20 ikke begrænset til: aluminiumhydroxid, N-acetyl-muramyl-L-threonyl-D- isoglutamin (thr-MDP), N-acetyl-nor-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin (CGP 11637, betegnet nor-MDP), N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanin^-il'^'-dipalmitoyl-sn-glycero-S-hydroxyphosphoryloxyj-ethylamin (CGP 19835A, betegnet MTP-PE), og RIBI, som indeholder tre komponenter 25 ekstraheret fra bakterier: monophosphoryllipid A, trehalosedimycolat og cellevægsskelet (MPL+TDM+CWS) i en 2% squalen/Tween 80-emulsion. En adjuvans effektivitet kan bestemmes ved at måle mængden af antistoffer, der er rettet mod et immunogent polypeptid, der indeholder en HCV-antigensekvens, som stammer fra indgivelse af polypeptidet i vacciner, der 30 også omfatter de forskellige adjuvanser.

43 DK 176280 B1

Vaccinerne indgives sædvanligvis parenteralt ved injektion, f.eks. enten subcutant eller intramuskulært. Yderligere formulationer, der er velegnede til andre indgivelsesmåder omfatter suppositorier og i visse tilfælde orale formulationer. Til suppositorier kan traditionelle bindemidler og bærere 5 omfatte f.eks. polyalkylenglycoler eller triglycerider, sådanne suppositorier kan dannes ud fra blandinger, der indeholder den aktive bestanddel i en mængde på fra 0,5% - 10%, fortrinsvis 1% - 2%. Orale formulationer omfatter de normalt anvendte ekscipienser, såsom farmaceutiske kvaliteter af mannitol, lactose, stivelse, magnesiumstearat, natriumsaccharin, 10 cellulose, magnesiumcarbonat og lignende. Sammensætningerne tager form af opløsninger, suspensioner, tabletter, piller, kapsler, formulationer med forsinket frigivelse eller pulvere og indeholder 10% - 95% aktiv bestanddel, fortrinsvis 25% - 70%.

15 Proteinerne kan formuleres i vaccinen som neutrale eller i saltformer. Farmaceutisk acceptable salte omfatter syreadditionssaltene (dannet med frie aminogrupper af peptidet) og som dannes med uorganiske syrer, såsom f.eks. saltsyre eller phosphorsyre eller organiske syrer, såsom eddikesyre, oxalsyre, vinsyre, maleinsyre og lignende. Salte dannet med de frie 20 carboxylgrupper kan også afledes fra uorganiske baser, såsom f.eks. natriumhydroxid, kaliumhydroxid, ammoniumhydroxid, calciumhydroxid eller ferri hydroxid er og organiske baser, såsom isopropylamin, trimethylamin, 2-ethylaminoethanol, histidin, procain og lignende.

25 II.F. Dosering og indgivelse af vacciner

Vacciner indgives på en måde, der er forenelig med doseringsformulationen og i en mængde, der er profylaktisk og/eller terapeutisk effektiv. Den mængde, der skal indgives, og som almindeligvis ligger på fra 5 pm - 250 pm 30 antigen pr. dosis afhænger af den patient, der skal behandles, patientens immunsystemkapacitet til syntetisering af antistoffer samt den ønskede grad 44 DK 176280 B1 af beskyttelse. Den nøjagtige mængde af aktive bestanddele, der skal indgives, kan afhænge af den praktiserende læges vurdering og kan være individuel fra patient til patient.

5 Vaccinen kan gives som en enkelt dosis eller fortrinsvis som flere doser. En multidosisplan karakteriseres ved et primært vaccinationsforløb, der kan bestå af 1 - 10 separate doser fulgt af andre doser, som gives ved de efterfølgende tidsintervaller, der måtte være nødvendige for vediigholdelse eller forstærkning af immumreaktionen, f.eks. efter et interval på 1 - 4 10 måneder for den anden dosis' vedkommende, og om nødvendigt, en efterfølgende dosis (doser) efter adskillige måneder. Dosismønstret vil også, i det mindste delvis, være bestemt af individets behov og være afhængigt af den praktiserende tæges vurdering.

15 Desuden kan vaccinen, der indeholder det immunogene HCV-antigen (antigener), indgives sammen med andre immunoregulatoriske midler, f.eks. immunglobuliner.

ll.G. Fremstilling af antistoffer mod HCV-epitoper 20

De immunogene polypeptider, der er fremstillet som beskrevet ovenfor, anvendes til at fremstille antistoffer, der både kan være polyklonale og monoklonale. Hvis der ønskes polyklonale antistoffer, immuniseres et udvalgt pattedyr (f.eks. mus, kanin, ged, hest o.s.v.) med et immunogent 25 polypeptid, der bærer en HCV-epitop (epitoper). Serum fra det immuniserede dyr opsamles og behandles ifølge kendte fremgangsmåder. Hvis serum, der indeholder polyklonale antistoffer mod en HCV-epitop, indeholder antistoffer mod andre antigener kan de polyklonale antistoffer oprenses ved immunoaffinitetskromatografi. Teknikker til fremstilling og videre behandling 30 af polyklonale antisera kendes inden for fagområdet, se f.eks. Mayer and Walker (1987).

45 DK 176280 B1

Alternativt kan polyklonale antistoffer isoleres fra et pattedyr, der tidligere er blevet inficeret med HCV. Et eksempel på en metode til oprensning af antistoffer mod HCV-epitoper fra serum fra et inficeret individ, baseret på 5 affinitetskromatografi og under anvendelse af et fusionpolypeptid af SOD og et polypeptid, der er indkodet i cDNA klon 5-1-1, gives i afsnit V.E.

Monoklonale antistoffer rettet mod HCV-epitoper kan også med lethed fremstilles af en fagmand. Den generelle metodologi for fremstilling af 10 monoklonale antistoffer ved hybridomer er velkendt. Vedvarende antistofproducerende cellelinjer kan fremstilles ved cellefusion og også ved andre teknikker, såsom direkte transformation af B-lymfocytter med onkogent DNA eller transfektion med Epstein-Barr virus. Se f.eks. M. Schreier et al. (1980); Hammerling et al. (1981); Kennett et al. (1980); se 15 også, US patentskrifterne nr. 4.341.761, 4.399.121, 4.427.783, 4.444.887 4.466.917, 4.472.500, 4.491.632 og 4.493.890. Referencegrupper af monoklonale antistoffer, der er produceret mod HCV-epitoper kan screenes for forskellige egenskaber, f.eks. isotype, epitopaffinitet o.s.v.

20 Både monoklonale og polyklonale antistoffer, der er rettet mod HCV-epitoper er specielt velegnede til diagnostisering og de, der virker neutraliserende, er velegende til passiv immunoterapi. Navnlig kan monoklonale antistoffer anvendes til produktion af anti-idiotype antistoffer.

25 Anti-idiotype antistoffer er immunoglobuliner, der bærer et "indre billede" af antigenet af det infektiøse agens, hvorimod der ønskes beskyttelse. Se f.eks. Nisonoff, A. et al (1981) og Dreesman et al. (1985).

Der kendes inden for fagområdet teknikker til produktion af anti-idiotype 30 antistoffer. Se f.eks. Grzych (1985), MacNamara et al. (1984) og Uytdehaag et al. (1985). Disse anti-idiotype antistoffer kan også være effektive til 46 DK 176280 B1 behandling af NANBH, såvel som til klarlægning af HCV-antigenernes immunogene områder.

II.H. Diagnostiske oliqonucieotidprober og analysesæt 5

Under anvendelse af de beskrevne dele af de isolerede HCV-cDNA'er som basis, medregnet de i figurerne 1 - 32 omtalte, kan oligomerer på ca. 8 nucleotider eller flere fremstilles enten ved afskæring eller syntetisk, hvilke oligomerer hybridiserer med HCV-genomet og er velegnede til identifikation 10 af det virale agens (agenser), yderligere karakterisering af det virale genom (genomer) samt til påvisning af viruset (viraene) hos syge individer. Proberne for HCV polynucleotider (naturlige eller afledte) har en længde, der muliggør påvisning af enestående virale sekvenser ved hybridisering. Skønt 6 - 8 nucleotider kan være en anvendelig længde, foretrækkes de sekvenser på 15 10-12 nucleotider og ca. 20 nucleotider forekommer optimalt. Disse sekvenser vil fortrinsvis være afledt fra områder, som mangler heterogenitet. Proberne kan fremstilles rutinemæssigt ved metoder, der omfatter automatiserede oligonucleotidsyntesemetoder. Eksempler på velegnede prober er klonen 5-1-1 og de yderligere heri beskrevne kloner er de forskellige 20 oligomerer, der er velegnede til at probe cDNA-biblioteker, som omtalt nedenfor. Et komplement til en hvilken som helst enestående del af HCV-genomet vil være tilfredsstillende. Der ønskes fuldstændig komplementaritet til anvendelse som prober, selvom det måske er unødvendigt, når fragmentets længde øges.

25

Til anvendelse af proberne som diagnostika behandles den biologiske prøve, der skal analyseres, såsom blod eller serum, om ønsket, for at ekstrahere de deri indeholdte nukleinsyrer. Den resulterende nukleinsyre fra prøven kan underkastes gelelektroforese eller andre teknikker til størrelsesadskillelse; 30 alternativt kan nukleinsyreprøven dotblottes uden størrelsesadskillelse. Proberne mærkes herefter. Egnede mærker og metoder til mærkning af 47 DK 176280 B1 prober kendes inden for fagområdet og omfatter f.eks. radioaktive mærker, der inkorporeres ved "nick translation" eller behandling med kinase, biotin, fluorescerende prober og kemiluminescerende prober. De fra prøven ekstraherede nukleinsyrer behandles herefter med den mærkede probe 5 under hybridiseringsbetingelser af passende stringens.

Proberne kan gøres fuldstændigt komplementære til HCV-genomet. Der ønskes derfor sædvanligvis høje stringensbetingelser for at forhindre falske positive resultater. Der bør imidlertid kun anvendes høje 10 stringensbetingelser, hvis proberne er komplementære til de områder af det viraie genom, der mangler heterogenicitet.

Hybridiseringsstringensen bestemmes af en række faktorer under hybridiseringen og under vaskeproceduren, herunder temperatur, ionstyrke, 15 varighed og formamidkoncentration. Disse faktorer er skitseret i f.eks. Maniatis, T. (1982).

Det forventes i almindelighed, at HCV-genomsekvenserne vil forekomme i relativt lave niveauer i serum fra inficerede individer, d.v.s. i mængder på ca.

20 102-103 sekvenser pr. ml. Dette niveau kan forudsætte anvendelse af forstærkningsteknikker i hybridiseringsanalyserne. Der kendes sådanne teknikker inden for fagområdet. For eksempel anvendes der i Enzo Biochemical Corporation "Bio-Bridge"-systemet terminaldeoxynucleotid-transferase for tilføjelse af umodificere, 3’-poly-dT-haler til en DNA-probe.

25 Poly-dT-haleproben hybridiseres til målnucleotidsekvensen og derefter til et biotinmodificeret poly-A. Der beskrives i PCT ansøgningnr. 84/03520 og EP A 124221 en DNA-hybridiseringsanalyse, hvori: (1) "analyt” hærdes på en enkeltstrenget DNA-probe, der er komplementær med et enzymmærket oligonucleotid, og (2) den resulterende duplex med hale hybridiseres med et 30 enzymmærket oligonucleotid. Der beskrives i EPA nr. 204.510 en DNA-hybridiseringsanalyse, hvori "analyt" DNA bringes i kontakt med en probe, 48 DK 176280 B1 der har en hale, såsom en poly-dT-hale, en forstærkerstreng, der har en sekvens, som hybridiseres med probens hale, såsom en poly-A-sekvens, og som er i stand til at binde en flerhed af mærkede strenge. En særlig ønsket teknik kan først omfatte forstærkning på ca. 10.000 fold af mål-HCV-5 sekvenserne i sera d.v.s. til ca. 106 sekvenser/ml. Dette kan f.eks. opnås ved teknikken ifølge Saiki et al. (1986). Den forstærkede sekvens (sekvenser) kan herefter påvises under anvendelse af en hybridiseringsanalyse, der beskrives i verserende US patentansøgning (Fuldmægtigs ref. nr. 2300-0171), der blev indleveret 15. oktober 1987, og som er overdraget til 10 nærværende ansøger, og medtages heri ved nærværende henvisning.

Denne hybridiseringsanalyse, der skulle påvise sekvenser i niveauet fra 106/ml anvender nukleinsyremultimerer, som bindes til enkeltstrenget analyt-nukleinsyre og som også bindes til en flerhed af mærkede enkeltstrengede oligonucleotider. En velegnet opløsningsfase-sandwichanalyse, der kan 15 anvendes med mærkede polynucleotidprober og metoderne til fremstilling af proberne beskrives i EPO nr. 225.807, offentliggjort 16. juni 1987, der er overdraget til nærværende ansøger, og som hermed medtages heri ved nærværende henvisning.

20 Proberne kan pakkes i diagnostiske analysesæt. Diagnostiske analysesæt omfatter DNA-proben, der kan være mærket; alternativt kan DNA-proben være umærket og bestanddeiene til mærkningen kan forefindes i analysesættet. Analysesættet kan også indeholde andre egnede pakkede reagenser og materialer, der er nødvendige for den specielle hybridiseringsprotokol, 25 f.eks. standarder samt instruktioner til udføring af testen.

II.I Immunoanalyse og diagnostiske analvsesæt Både de polypeptider, der reagerer immunologisk med serum, der 30 indeholder HCV-antistoffer, f.eks. de, der er afledt fra eller indkodet i de i afsnit IV.A beskrevne kloner samt kompositter heraf (se afsnit IV.A), og de 49 DK 176280 B1 antistoffer, som er produceret fra de HCV-specifikke eptitoper i disse poiypeptider, se f.eks. afsnit IV.E, er velegnede i immunoanalyser til påvisning af forekomsten af HCV-antistoffer eller forekomsten af viruset og/eller virale antigener i biologiske prøver, herunder f.eks. blod- eller 5 serumprøver. Konstruktionen af immunoanalyserne undergår en del variationer, og en række heraf kendes inden for fagområdet. For eksempel kan der i immunoanalysen anvendes et vira It antigen, f.eks. et polypeptid, der er afledt fra en hvilken som helst af de kloner, der indeholder HCV-cDNA, og som er beskrevet i afsnit IV.A, eller fra de komposit cDNA'er, der 10 er afledt fra cDNA'erne i klonerne, eller fra HCV-genomet, hvorfra cDNA'et i disse kloner er afledt; alternativt kan der i immunoanalysen anvendes en kombination af virale antigener, der er afledt fra disse kilder. Der kan f.eks. anvendes et monoklonalt antistof, der er rettet mod en vira! epitop (epitoper), en kombination af monokionaie antistoffer, som er rettet mod et viralt anti-15 gen, monokionaie antistoffer, der er rettet mod forskellige virale antigener, polyklonale antistoffer, der er rettet mod det samme virale antigen eller polyklonale antistoffer, der er rettet mod forskellige virale antigener. For eksempel kan protokoller være baseret på kompetition eller direkte reaktion eller analyser af sandwichtypen. Til protokollerne kan der f.eks. også 20 anvendes faste underlag eller de kan foregå ved hjælp af immunopræcipitation. De fleste analyser omfatter anvendelse af mærket antistof eller polypeptid; mærkerne kan f.eks. være fluorescerende, kemiluminescerende, radioaktive molekyler eller farvemolekyler. Der kendes også analyser, der forstærker signalerne fra proben; eksempler herpå er 25 analyser, som anvender biotin og avidin og enzymmærkede og -medierede immunoanalyser, såsom ELISA-analyser.

HCV-flavivirus-modelien gør det muligt at forudsige den sandsynlige lokalisering af diagnostiske epitoper for virionets strukturproteiner. C-, præ-30 Μ, M Og E-domænerne indeholder sandsynligvis alle epitoper med signifikant potentiale til påvisning af virale antigener og navnlig til diagnose.

50 DK 176280 B1

Ikke-struktur proteinernes domæner forventes på lignende på måde at indeholde vigtige diagnostiske epitoper (f.eks. NS5, der koder for en formodet polymerase og NS1, der koder for et formodet komplementbindende antigen). Rekombinante polypeptider eller virale polypeptider, der 5 indeholder epitoper fra disse specifikke domæner, kan være velegnede til påvisning af virale antistoffer hos infektiøse bloddonorer og inficerede patienter.

Antistoffer, der er rettet mod E- og/eller Μ-proteinerne kan desuden 10 anvendes i immunoanalyser til påvisning af virale antigener hos patienter med HCV-forårsaget NANBH og hos infektiøse bloddonorer. Visse antistoffer vil yderligere være ekstremt anvendelige til påvisning af akutfasedonorer og patienter.

15 Analysesæt, der er egnede til immundiagnose og som indeholder passende mærkede reagenser konstrueres ved at pakke de passende materialer, herunder polypeptiderne ifølge opfindelsen, der indeholder HCV-epitoper eller antistoffer rettet mod HCV-epitoper, i egnede beholdere sammen med de øvrige reagenser og materialer, som skal anvendes til udførelsen af 20 analysen, samt et passende sæt af analyseinstruktioner.

II.J. Yderligere karakterisering af HCV-qenomet, vironer og virale antigener under anvendelse af prober afledt fra cDNA af det virale qenom 25 HCV-cDNA-Sekvensinformationen i de i afsnit IV.A. beskrevne kloner, som vist i figurerne 1 - 32 inklusiv, kan anvendes til opnåelse af yderligere information om HCV-genomsekvensen og til identifikation og isolering af HCV-agenset, og vil således bidrage til dets karakterisering, herunder genomets natur, de virale partiklers struktur og naturen af de antigener, 30 hvoraf det er sammensat. Denne information kan igen føre til yderligere polynucleotidprober, polypeptider, der er afledt fra HCV-genomet samt 51 DK 176280 B1 antistoffer rettet mod HCV-epitoper, der kan være velegnede til diagnose og/eller behandling af HCV-forårsaget NANBH.

cDNA-Sekvensinformationen i de ovennævnte kloner er velegnede til 5 konstruktion af prober til isolering af yderligere cDNA-sekvenser, der er afledt fra hidtil udefinerede områder af HCV-genomet (genomerne), hvorfra cDNA'erne i klonerne, der er beskrevet i afsnit IV.A. er afledt. For eksempel kan mærkede probér, der indeholder en sekvens på ca. 8 eller flere nucieotider og fortrinsvis 20 eller flere nucleotider, og som er afledt fra 10 områder tæt på 5'-termini eller 3'-termini af familien af HCV-cDNA-sekvenser, der er vist i figur 1, 3, 6, 9, 14 og 32, anvendes til at isolere overlappende cDNA-sekvenser fra HCV-cDNA-biblioteker. Disse sekvenser, der overlapper cDNA'erne i de ovennævnte kloner, men som også indeholder sekvenser, der er afledt fra områder af genomet, hvorfra cDNA'et 15 ide ovennævnte kloner ikke er afledt, kan herefter anvendes til at syntetisere prober til identifikation af andre overlappende fragmenter, der ikke nødvendigvis overlapper cDNA'erne i de i afsnit IV.A. beskrevne kloner. Med mindre HCV-genomet er segmenteret og segmenterne mangler fælles sekvenser, er det muligt at sekvensere hele det virale genom (genomer) 20 under anvendelse af isoleringsteknikken for overlappende cDNA'er, der er afledt fra det virale genom (genomer). Selvom det er usandsynligt, hvis genomet er et segmenteret genom, der mangler fælles sekvenser, kan genomets sekvens bestemmes ved at screene serologiske Iambda-gt11 HCV-cDNA-biblioteker, som anvendt til isolering af klon 5-1-1, ved at 25 sekvensere cDNA-isolater, og ved at anvende de isolerede cDNA'er til at isolere overlappende fragmenter under anvendelse af den teknik, der er beskrevet til isolering og sekvensering af klonerne, der er beskrevet i afsnit IV.A. Alternativt kan karakteriseringen af de genomiske segmenter ske ud fra det virale genom (genomer), der er isoleret fra oprensede HCV-partikler.

30 Fremgangsmåder til oprensning af HCV-partikler og til påvisning heraf under oprensningsproceduren er beskrevet nedenfor. Fremgangsmåder til isolering 52 DK 176280 B1 af polynucleotidgenomer fra virale partikler kendes inden for fagområdet og en anvendelig fremgangsmåde, er vist i eksempel IV.A.1. De isolerede genomiske segmenter kan herefter klones og sekventeres. Det er således muligt med den heri tilvejebragte information at kione og sekvensere HCV-5 genomet (genomerne) uanset deres natur.

Der kendes inden for fagområdet metoder til konstruktion af cDNA-biblioteker, som omtalt ovenfor og nedenfor; en metode til konstruktion af HCV-cDNA-biblioteker i Iambda-gt11 omtales nedenfor i afsnit IV.A. cDNA-10 Biblioteker, der er velegnede til screening med nukleinsyreprober, kan imidlertid også konstrueres i andre inden for fagområdet kendte vektorer, f.eks. Iambda-gt10 (Huynh et al. (1985)). Det HCV-afledte cDNA, der er påvist af de prober, der er afledt fra cDNA'erne i figur 1 - 32 og fra de probér, som er syntetiseret fra polynucleotider, der er afledt fra cDNA’erne kan isole-15 res fra klonen ved fordøjelse af det isolerede polynucleotid med det hensigtmæssige restriktionsenzym (restriktionsenzymer) og sekvenseres. Se f.eks. afsnit IV.A.3 og IV.A.4. angående de teknikker, der er anvendt til isolering og sekvensering af HCV-cDNA, som overlapper HCV-cDNA i klon 5-1-1, afsnit IV.A.5. og IV.A.7 angående isolering og sekvensering af HCV-20 cDNA, der overlapper HCV-cDNA i klon 81 og afsnit IV.A.8. og IV.A.9 angående isolering og sekvensering af en klon, der overlapper en anden klon (klon 36), som overlapper klon 81.

Den fra disse overlappende HCV-cDNA’er afledte sekvensinformation er 25 velegnet til bestemmelse af områder med homologi og heterogenicitet inden for det virale genom (genomer), der kunne angive forekomst af forskellige stammer af genomet og/eller af populationer af defekte partikler. Sekvensinformationen er også velegnet til konstruktion af hydridiserings-prober til påvisning af HCV eller HCV-antigener eller HCV-nukleinsyre i 30 biologiske prøver samt under isolering af HCV (omtalt nedenfor) under anvendelse i de i afsnit II.G beskrevne teknikker. De overlappende cDNA’er 53 DK 176280 B1 kan yderligere anvendes til skabelse af ekspressionsvektorer for polypeptider, der er afledt fra HCV-genomet (genomeme), der også koder for de i klonerne 5-1-1, 36, 81, 91 og 1-2 indkodede polypeptider og i de øvrige kloner, der er beskrevet i afsnit IV.A. Teknikkerne til frembringelsen af 5 polypeptiderne, der indeholder HCV-epitoper og af antistoffer, som er rettet mod HCV-epitoper, der er indeholdt heri, såvel som anvendelser heraf, er analoge med de teknikker, som er beskrevet for polypeptider, der er afledt fra NANBV-cDNA-sekvenser, som er indeholdt i klonerne 5-1-1, 32, 35, 36, 1 -2, 81 og 91, der er omtalt ovenfor og nedenfor.

10

Der er i familien af cDNA-sekvenser, som er indeholdt i klonerne 5-1-1, 32, 35, 36, 81, 91, 1-2 og de øvrige i afsnit IV.A. beskrevne kloner, indkodet antigen (antigener), der indeholder epitoper, som forekommer at være enestående for HCV; d.v.s. antistoffer, der er rettet mod disse antigener, 15 mangler hos individer, som er inficeret med HAV eller HBV og hos individer, der ikke er inficeret med HCV (se de i afsnit IV.B. fremlagte serologiske data). En sammenligning af sekvensinformationen af disse cDNA'er med sekvenserne af HAV, HBV, HDV og med de genomiske sekvenser i Genebank viser yderligere, at der eksisterer minimal homologi mellem disse 20 cDNA'er og kildernes polynucleotidsekvenser. Antistoffer, der er rettet mod de antigener, som er indkodet i disse kloners cDNA’er, kan således anvendes til identifikation af BB-NANBV-partikler, der er isoleret fra inficerede individer. Hertil kommer, at de også er velegnede til isolering af NANBH-agenset (agenserne).

25 HCV-partiklerne kan isoleres fra sera fra BB-NANBV-inficerede individer eller fra cellekulturer ved en hvilken som helst af de inden for fagområdet kendte metoder, herunder f.eks. teknikker, der er baseret på størrelsesdiskrimination, såsom sedimentation eller eksklusionsmetoder eller teknikker, 30 der er baseret på massefylde, såsom ultracentrifugering, identitetsgradienter eller præcipitation med midler, såsom polyethylenglycol, eller kromatografi 54 DK 176280 B1 på en række materialer, såsom anion- eller kationbyttermaterialer og materialer, der bindes på grund af hydrofobicitet, samt affinitetssøjler. Under isoleringsproceduren kan forekomst af HCV påvises ved hydridiserings-analyse af det ekstraherede genom under anvendelse af probér, som er 5 afledt af de ovenfor beskrevne HCV-cDNA'er eller ved immunoanalyse (se afsnit II.I), der som prober anvender antistoffer rettet mod HCV-antigener, der er indkodet i familien af cDNA-sekvenser, der er vist figurerne 1 - 32 og også rettet mod HCV- antigener, som er indkodet i de overlappende HCV-cDNA-sekvenser, der er omtalt ovenfor. Antistofferne kan være monoklonale 10 eller polyklonale og det kan være ønskeligt at oprense antistofferne før anvendelse heraf i immunoanalysen. En oprensningsprocedure for polyklonale antistoffer rettet mod antigen (antigener), der er indkodet i klon 5-1-1, er beskrevet i afsnit IV.E.; analoge oprensningsprocedurer kan anvendes til antistoffer, der er rettet mod andre HCV-antigener.

15

Antistoffer rettet mod HCV-antigener, der er indkodet i familien af cDNA’er, der er vist i figur 1 - 32, ligesom de, der er indkodet i de overlappende HCV-cDNA'er, der er fæstnet til faste underlag, er velegnede til isolering af HCV ved immunoaffinitetskromatografi. Der kendes inden for fagområdet 20 teknikker til udførelse af immunoaffinitetskromatografi, herunder teknikker til fæstning af antistoffer til faste underlag, således at de bibeholder deres immunoselektive aktivitet; det kan være de teknikker, hvori antistofferne er adsorberet på underlaget (se f.eks. Kurstak i ENZYME IMMUNO-DIAGNOSIS, side 31 - 37) såvel som de, hvori antistofferne er kovalent 25 bundet til underlaget. Teknikkerne ligner generelt de, der anvendes til kovalent binding af antigener til et fast underlag, som generelt beskrevet i afsnit II.C.; men afstandsgrupper kan være inkluderet i de dobbeltfunktionelle koblingsmidler, således at antigenbindingsstedet for antistoffet forbliver tilgængeligt.

30 55 DK 176280 B1

Under oprensningsproceduren kan forekomst af HCV påvises og/eller verificeres ved nukleinsyrehybridisering under anvendelse af polynucleotider som prober, hvilke polynucleotider er afledt fra familien af HCV-cDNA-sekvenser, der er vist i figurerne 1 - 32, såvel som fra overlappende HCV-5 cDNA-sekvenser, der er beskrevet ovenfor. I dette tilfælde behandles fraktionerne under betingelser, der kan forårsage sprængning af virale partikler, f.eks. med detergenter i nærvær af gelateringsmidler og viralt nukleinsyre, der er bestemt ved de hybridiseringsteknikker, der er beskrevet i afsnit II.H. Yderligere bekræftelse af, at de isolerede partikler er de agenser, 10 som inducerer HCV, kan opnås ved at inficere chimpanser med de isolerede viruspartikler fulgt af bestemmelse af, hvorvidt NANBH-symtomerne stammer fra infektionen.

Viruspartikler fra de oprensede præparationer kan herefter yderligere 15 karakteriseres. Den genomiske nukleinsyre er blevet oprenset. På basis af på dens følsomhed over for RNase, og ikke DNase I, ser det ud til, at viruset består af et RNA-genom. Se eksempel IV.C.2. nedenfor. Strengetheden og cirkulariteten eller ikke-cirkulariteten kan bestemmes ved teknikker, der er kendt inden for fagområdet, herunder f.eks. visualisering af genomet ved 20 elektronmikroskopi, migration heraf i densitetgradienter og sedimentationskarakteristikker heraf. På basis af det opfangede HCV-genoms hybridisering af HCV-cDNA'ernes negative ser det ud til, at HCV kan bestå af et positivt strenget RNA-genom (se afsnit IV.H.1). Teknikker som disse er beskrevet i f.eks. METHODS IN ENZYMOLOGY. Den oprensende nukleinsyre kan 25 yderligere klones og sekvenseres ved kendte teknikker, herunder reverstranskription, idet det genomiske materiale er RNA. Se f.eks. Maniatis (1982) og Glover (1985). Ved anvendelse af nukleinsyren, der er afledt fra de virale partikler, er det muligt at sekvensere hele genomet, hvad enten det er segmenteret eller ej.

30 56 DK 176280 B1

Homologiundersøgelse af polypeptidet, der er indkodet i den kontinuerte ORF af de kombinerede kloner 14i - 39c (se figur 26) viser, at HCV-polypeptidet indeholder homologiområder med de korresponderende proteiner i konserverede områder hos flavivira. Et eksempel på disse er 5 beskrevet i afsnit IV.H.3. Dette fund har mange vigtige udløbere. For det første er dette vidnesbyrd sammen med de resultater, der viser, at HCV indeholder et positivt strenget genom, hvis størrelse er ca. 10.000 nucleotider, overensstemmende med den antagelse, at HCV er et flavivirus eller flavi-lignende virus. Generelt har flavivirusvirioner og deres genomer en 10 relativt konsekvent struktur og organisering, der er kendt. Se Rice et al.

(1986) og Brinton, M.A. (1988). De strukturgener, der koder for polypeptiderne C, præ-M/M og E, kan være lokaliseret i 5'-terminalen af genomet ovenstrøms for klon 14i. Ved sammenligning med andre flavivira kan der yderligere forudsiges den præcise lokalisering af sekvenserne, der 15 koder for disse proteiner

Isolering af sekvenserne ovenstrøms for sekvenserne i klon 14i kan opnås på en række måder, der ud fra den heri givne information er nærliggende for en fagmand. For eksempel kan "genom walking"-teknikken anvendes til at 20 isolere andre sekvenser, der er 5' til sekvenserne i klon 14i, men som overlapper med denne klon; dette kan igen føre til isolering af yderligere sekvenser. Denne teknik er fyldigt demonstreret nedenfor i afsnit IV.A. Det er f.eks. også kendt, at flaviviraene har konserverede epitoper og områder med konserverede nukleinsyresekvenser. Polynucleotider, der indeholder de 25 konserverede sekvenser kan anvendes som prober, som binder HCV-genomet, og således muliggør isolering heraf. Disse konserverede sekvenser kan yderligere i forbindelse med sekvenserne, der er afledt fra HCV-cDNA’erne, der er vist i figur 22, anvendes ti! at konstruere primere til anvendelse i systemer, der forstærker genomsekvenserne ovenstrøms for 30 sekvenserne i klon 14i under anvendelse af polymerasekæde-reaktionsteknologi, Et eksempel herpå beskrives nedenfor.

57 DK 176280 B1 HCV-strukturen kan også bestemmes og dens komponenter isoleres. Morfologien og størrelsen kan f.eks. bestemmes ved elektronmikroskopi. Identifikation og lokalisering af specifikke virale polypeptidantigener, såsom 5 kappeantigener eller interne antigener, såsom nukleinsyrebindingsproteiner, kerneantigener og polynucleotidpoiymerase (polymeraser) kan også bestemmes, f.eks. ved at bestemme, hvorvidt antigenerne er tilstede som større eller mindre virale komponenter, samt ved at anvende antistoffer, der er rettet mod de specifikke antigener, der er indkodet i isolerede cDNA'er 10 som prober. Denne information er anvendelig til konstruktion af vacciner; det kan f.eks. foretrækkes at inkludere et ydre antigen i en vaccinepræparation. Multivalente vacciner kan f.eks. bestå af et polypeptid, der er afledt fra det genom, som koder for et strukturprotein, f.eks. E såvel som af et polypeptid fra en anden del af genomet, f.eks. et ikke-struktur- eller struktur-polypeptid.

15 H.K. Cellekultursystemer og dyremodelsystemer for HCV-replikation

Den antagelse, at HCV er et flavivirus eller flavi-lignende virus tilvejebringer også information om metoder til dyrkning af HCV. Betegnelsen "flavi-20 lignende" betyder, at viruset viser en signifikant mængde homologi med de kendte konserverede områder af flavivira, og at størstedelen af genomet er en enkelt ORF. Metoder til dyrkning af flavira er kendt af fagfolk. (Se f.eks. redegørelserne af Brinton (1986) og Stollar, V. (1980)). Generelt kan velegnede celler eller cellelinjer til dyrkning af HCV omfatte de, der er kendte 25 til understøttelse af flavivirusreplikation, f.eks. følgende: abenyrecellelinjer (f.eks. MK2> VERO); svinenyrecellelinjer (f.eks. PS); babyhamster-nyrecellelinjer (f.eks. BHK); musemakrofagcellelinjer (f.eks. P388D1, MK1,

Mm1); humane makrofagcellelinjer (f.eks. U-937); humane perifere blodleukocytter; humane adhærente monocytter; hepatocytter eller 30 hepatocytcellelinjer (f.eks. HUH7, HEPG2); embryoer eller embryoceller (f.eks. kyllinge-embryofibroblaster); eller cellelinier, der er afledt fra 58 DK 176280 B1 invertebrater, fortrinsvis fra insekter (f.eks. drosophilacellelinjer) eller mere fortrinsvis fra arthropoder, f.eks. myggecellelinjer {f.eks. A. albopictus, Aedes aegypti, Culex tritaeniorhynchus) eller midecellelinjer (f.eks. RML-14 Dermacentor parumapertus).

5

Det er muligt, at primære hepatocytter kan dyrkes og derefter inficeres med HCV; eller alternativt kan hepatocytkulturerne afledes fra leveren fra inficerede individer (f.eks. mennesker eller chimpanser). Det sidstnævnte tilfælde er et eksempel på en celle, der er inficeret in vivo overført in vitro.

10 Desuden kan der anvendes forskellige metoder til opnåelse af vedvarende cellelinjer, der er afledt fra hepatocytkulturer. F.eks. kan primære leverkulturer (før og efter berigelse af hepatocytpopulationen) fusioneres med en række celler til vedligeholdelse af stabilitet. Kulturer kan f.eks. også inficeres med transformerende vira eller transficeres med transformerende 15 gener for at skabe permanente eller semi-permanente celleiinjer. Desuden kan f.eks. celler i leverkulturer fusioneres til etablerede cellelinjer (f.eks. HepG2). Der kendes inden for fagområdet metoder til cellefusion, og herunder f.eks. anvendelse af fusionsmidler, såsom polyethylenglycol,

Sendai Virus og Epstein-Barr virus.

20

Som ovenfor omtalt er HCV et flavivirus eller flavi-lignende virus. Det er derfor sandsynligt, at HCV-infektion af cellelinjer kan opnås ved teknikker, der er kendt inden for fagområdet, til infektion af celler med flavivira. Disse omfatter f.eks. inkubation af cellerne med virale præparationer under 25 betingelser, der tillader virusindtrægning i cellen. Det kan desuden være muligt at opnå virusproduktion ved transfektion af cellerne med isolerede virale polynucleotider. Det er kendt, at Togavirus- og flavivirus-RNA’er er infektiøse hos et udvalg af vertebratcellelinjer (Pfefferkom og Shapiro (1974)) og i en myggecellelinje (Peleg (1969)).

30 59 DK 176280 B1

Der kendes inden for fagområdet metoder til transfektion af vævskulturceller med RNA-duplekser, positivt strengede RNA'er og DNA'er (herunder cDNA'er) og de omfatter f.eks. teknikker, hvortil der anvendes elektroporation og præcipitation med DEAE-Dextran eller caiciumphosphat.

5 Der kan opnås en rig kilde til HCV-RNA ved udførelse af in vitro-transkription af et HCV-cDNA, der korresponderer med det komplette genom,

Transfektion med dette materiale eller med klonet HCV-cDNA bør resultere i vira! replikation og in vitro-formerinq af viruset.

10 Ud over dyrkede celler kan der anvendes dyremodelsystemer til virusreplikation; dyresystemer, hvori flavivira er kendt af fagfolk (se f.eks. redegørelsen af Monath (1986)). HCV-Replikation kan således ikke blot optræde hos chimpanser, men også f.eks. hos egernaber og pattende mus.

15 II.L. Screening for anti-virale midler mod HCV

Tilgængeligheden af cellekultur og animalske modelsystemer for HCV muliggør også screening for antivirale midler, der hæmmer HCV-replikation, og navnlig for de midler, der fortrinsvis tillader cellevækst og formering 20 medens virusreplikationen hæmmes. Disse screeningsmetoder kendes af fagfolk. De antivirale midler afprøves generelt ved en række koncentrationer for deres effekt med hensyn til forhindring af virusreplikation i cellekultursystemer, der understøtter virusreplikationen, og derefter for en hæmning af infektiviteten eller af viral patogenicitet (og et lavt toksicitetsniveau) i et 25 dyremodelsystem.

De heri tilvejebragte fremgangsmåder og præparater til påvisning af HCV-antigener og HCV-polynucleotider er velegnede til screening af antivirale midler ved, at de tilvejebringer en alternativ, og måske mere følsom, måde til 30 påvisning af midlets effekt på virusreplikation end celleplaqueanalysen eller IDso-analysen. F.eks. kan de heri beskrevne HCV-polynucleotidprober 60 DK 176280 B1 anvendes til at kvantificere mængden af viral nucleinsyre, der produceres i en cellekultur. Dette kan f.eks. opnås ved hybridisering eller kompetitiv hybridisering af de inficerede cellenukleinsyrer med en mærket HCV-polynucleotidprobe. F.eks. kan anti-HCV-antistoffer også anvendes til at 5 identificere og kvantificere HCV-antigen (antigener) i cellekulturen under anvendelse af de heri beskrevne immunoanalyser. Idet det er ønskeligt at kvantificere HCV-antigener i den inficerede cellekultur ved en kompetitiv analyse er polypeptiderne, der er indkodet i de heri beskrevne HCV-cDNA’er, desuden velegnede til disse kompetitive analyser. Generelt vil et 10 rekombinant HCV-polypeptid, der er afledt fra HCV-cDNA'et, være mærket og hæmningen af bindingen af denne mærkede polypeptid til et HCV-polypeptid på grund af de i cellekultursystemet producerede antigener vil være overvåget. Desuden er disse teknikker navnlig velegnede i de tilfælde, hvor HCV'et kan være i stand til at repliceres i en ceilelinje uden at forårsage 15 celledød.

II.M. Fremstilling af svækkede HCV-stammer

Ud over det ovennævnte kan det være muligt at isolere svækkede HCV-20 stammer under anvendelse af vævskultursystemerne og/eller dyremodelsystemerne. Disse stammer vil være velegnede til vacciner eller til isolering af virale antigener. Det er muligt at isolere svækkede stammer efter en flerhed af overførsler i cellekultur og/eller en dyremodel. Påvisning af en svækket stamme i en inficeret celle eller individ kan opnås ved teknikker, der 25 er kendt inden for fagområdet, og kan f.eks. omfatte anvendelse af antistoffer mod én eller flere epitoper, der er indkodet i HCV, som en probe, eller anvendelse af et polynucleotid, der indeholder en HCV-sekvens på mindst ca. 8 nucleotider som en probe. En svækket stamme kan som et alternativ eller en tilføjelse konstrueres under anvendelse af den heri 30 tilvejebragte genomiske HCV-information og under anvendelse af rekombinantteknikker. Man vil generelt forsøge at deletere et område af 61 DK 176280 B1 genomet, der f.eks. koder for et polypeptid, der vedrører patogenicitet, men som tillader virusreplikation. Genomkonstruktionen vil desuden tillade ekspression af en epitop, der bevirker produktion af neutraliserende antistoffer mod HCV. Det ændrede genom kan herefter anvendes til at 5 transformere celler, der tillader HCV-replikation og cellerne dyrkes under betingelser, der tillader virusreplikation. Svækkede HCV-stammer er ikke kun velegnede til vaccineformål, men også som kilder til den kommercielle fremstilling af virale antigener, idet bearbejdningen af disse vira ville kræve mindre stringente beskyttelsesforholdsregler for de ansatte, der er involveret 10 i virusproduktion og/eller produktionen af virale produkter.

Ml·_Generelle fremgangsmåder

De almindelige teknikker, der anvendes til at ekstrahere genomet fra et virus, 15 fremstilling og probning af et cDNA-bibliotek, sekvensering af kloner, konstruktion af ekspressionsvektorer, transformation af celler, udførelse af immunologiske analyser, såsom radioimmunoanalyser og ELISA-analyser til dyrkning af celler i kultur og lignende, er kendt inden for fagområdet og laboratoriehåndbøger, hvori disse teknikker beskrives, er tilgængelige. I det 20 nedenstående fremsættes imidlertid som en almen vejledning nogle kilder, der for tiden er tilgængelige til sådanne procedurer, samt materialer, der er egnede til udførelse heraf.

III.A. Værter og ekspressionskontrolsekvenser 25

Der kan både anvendes prokaryotiske og eukaryotiske værtsceller til ekspression af ønskede kodningssekvenser, når der anvendes passende kontrolsekvenser, der er forenelige med den angivne vært. Blandt prokaryotiske værter anvendes hyppigst E, coli. Ekspressionskontrol-30 sekvenser til prokaryoter omfatter promotorer, der eventuelt indeholder operatordele, og nbosombindingssteder. Transfervektorer, der er forenelige 62 DK 176280 B1 med prokaryotiske værter, afledes almindeligvis fra f.eks. pBR322, der er et plasmid, der indeholder operoner, der overfører ampicillin- og tetracyclinresistens, samt de forskellige pUC-vektorer, der også indeholder sekvenser, som overfører antibiotikaresistensmarkører. Markørerne kan 5 anvendes til opnåelse af vellykkede transformanter ved selektion. Almindeligt anvendte prokaryotiske kontrolsekvenser omfatter beta-lactamase- (penicillinase-) og lactosepromotorsystemer (Chang et al. (1977)), tryptophan- (trp) promotorsystemet (Goeddel et al. (1980)) og den lambda-afledte PL-promotor og N-genribosombindingsstedet (Shimatake et al. (1981)) og den 10 hybride ta c-p ro motor (De Boer et al. (1983)), der er afledt fra sekvenser af trp og lac UV5-promotorerne. De foregående systemer er navnlig forenelige med E. coli; hvis det ønskes kan andre prokaryotiske værter, såsom stammer af Bacillus eller Pseudomonas anvendes med tilsvarende kontrolsekvenser.

15

Eukaryotiske værter omfatter gær- og pattedyrsceller i kultursystemer. Saccharomyces cerevisiae og Saccharomyces carlsberqensis er de mest almindeligt anvendte gærværter og er hensigtsmæssige svampeværter. Gærkompatible vektorer bærer markører, der muliggør udvælgelse af 20 vellykkede transformanter ved overførsel af prototrofi til auxotrofe mutanter eller resistens mod tungmetaller i vildtypestammer. Gærkompatible vektorer kan anvende 2 micron replikationsoriginet (Broach et al. (1983)), kombinationen af CEN3 og ARS1 eller andre måder til at sikre replikation, såsom sekvenser, der vil føre til inkorporering af et passende fragment i 25 værtscellegenomet. Kontrolsekvenser til gærvektorer er kendt inden for fagområdet og omfatter promotorer til syntesen af glycolytiske enzymer (Hess et al. (1968), Holland et al. (1978)), herunder promotoren for 3-phos-phoglyceratkinase (Hitzeman (1980)). Der kan også medtages terminatorer, såsom de, der er afledt fra enolasegenet (Holland (1981)). Specielt 30 velegnede kontrolsystemer er de, der omfatter glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH) -promotoren eller alkoholdehydrogenase (ADH) - 63 DK 176280 B1 regulerbar promotor, terminatorer afledes også fra GAPDH og hvis der ønskes secernering, ledersekvensen fra gær alfafaktor. Det transkriptions-regulerende område og det transkriptionsinitierende område, der er funktionsdygtigt forbundne kan være af en sådan art, at de ikke er naturligt 5 forbundne i vildtypeorganismen. Disse systemer er beskrevet detaljeret i EPO nr. 120.551, fremlagt 3. oktober 1984; EPO nr. 116.201, fremlagt 22. august 1984 og EPO nr. 164.556, fremlagt 18, december 1985, der alle er overdraget til nærværende ansøger og medtages heri ved nærværende henvisning.

10

Der kendes inden for fagområdet pattedyrscellelinjer, der er tilgængelige som ekspressionsværter, og de omfatter mange vedvarende cellelinjer, der er tilgængelige fra The American Type Culture Collection (ATCC), omfattende HeLa-celler, Kinesiske hamsterovarie (CHO) -celler, 15 babyhamstemyre (BHK) -celler og en række andre cellelinjer. Der kendes også inden for fagområdet velegnede promotorer til pattedyrsceller og de omfatter virale promotorer, såsom promotoren fra Simian Virus 40 (SV40) (Fiers (1978)), Rous sarcomavirus (RSV), adenovirus (ADV) og bovin papillomavirus (BPV). Pattedyrsceller kan også kræve terminatorsekvenser 20 og poly-A-additionssekvenser; forstærkersekvenser, der forøger ekspressionen, kan også medtages og sekvenser, der forårsager forstærkning af genet, kan også være ønskelige. Disse sekvenser er kendt inden for fagområdet. Vektorer, der er velegnede til replikation i pattedyrsceller, kan omfatte virale replicorier eller sekvenser, der sikrer integrationen af de behørige sekvenser, 25 der koder for NANBV-epitoper, i værtsgenomet.

III.B. Transformationer

Transformationen kan foregå ved en hvilken som helst kendt metode til 30 introduktion af polynucieotider i en værtscelle, herunder f.eks. pakning af polynucleotidet i en virus og transduktion af en værtscelle med viruset, samt 64 DK 176280 B1 ved direkte optagelse af polynucleotidet. Den anvendte transformationsprocedure afhænger af den vært, der skal transformeres. F.eks. omtales der i eksempeldelen nedenfor transformation af E. coli-værtscellerne med Iambda-gt11, der indeholder BB-NANBV-sekvenser. Transformation af 5 bakterier ved direkte optagelse omfatter i almindelighed behandling med calcium- eller rubidiumchlorid (Cohen (1972); Maniatis (1982)). Gær-transformationen ved direkte optagelse kan udføres under anvendelse af Hinnen et al. (1978) -metoden. Pattedyrstransformation ved direkte optagelse kan udføres under anvendelse af calciumphosphat 10 præcipitationsmetoden ifølge Graham og Van der Eb (1978), eller de forskellige kendte modifikationer heraf.

lll.C. Vektorkonstruktion 15 Til konstruktion af vektorer anvendes teknikker, der er kendte inden for fagområdet. Stedspecifik DNA-kløvning udføres ved behandling med egnede restriktionsenzymer under betingelser, der generelt specificeres af fremstilleren af disse kommercielt tilgængelige enzymer. I almindelighed kløves ca. 1 pg plasmid eller DNA-sekvens af 1 enzymenhed i ca. 20 pi 20 pufferopløsning ved inkubering i 1-2 timer ved 37°C. Efter inkubering med restriktionsenzymet fjernes proteinet ved phenol/chloroformekstraktion og DNA'et genvindes ved præcipitation med ethanol. De kløvede fragmenter kan separeres under anvendelse af polyacrylamid- eller agarosegel-elektroforeseteknikker ifølge de generelle procedurer, der findes i "Methods 25 in Enzymology" (1980) 65:499-560.

Kløvningsfragmenter med adhæsive ender kan gøres stumpendede under anvendelse af E. coli DNA-polymerase I (Klenow) i nærvær af de hensigtsmæssige deoxynucleotidtriphosphater (dNTP'er), der er til stede i 30 blandingen. Behandling med S1-nuklease kan også anvendes, hvilket fører ti! hydrolyse af en hvilken som helst enkeltstrenget DNA-del.

65 DK 176280 B1

Ligeringer udføres med standard puffer og under temperaturbetingelser under anvendelse af T4 DNA-ligase og ATP; ligeringer af adhæsive ender forudsætter mindre ATP og mindre ligase end ligeringer af stumpe ender.

5 Når vektorfragmenterne anvendes som en del af en ligeringsblanding, behandles vektorfragmentet ofte med bakteriel alkalisk phosphatase (BAP) eller akalisk phosphatase fra kalvetarm til fjernelse af 5'-phosphatet og således forhindre religering af vektoren; alternativt kan der anvendes restriktionsenzymfordøjelse af uønskede fragmenter til forhindring af ligering.

10

Ligeringsblandinger transformeres ind i egnede kloningsværter, såsom E. coli og vellykkede transformanter udvælges efter f.eks. antibiotikaresistens og de screenes for korrekt konstruktion.

15 III.D. Konstruktion af ønskede DNA-sekvenser

Syntetiske oligonucleotider kan fremstilles under anvendelse af et automatisk oligonucleotidsyntetiseringsapparat som beskrevet af Warner (1984). Hvis det ønskes, kan de syntetiske strenge mærkes med 32P ved 20 behandling med polynucleotidkinase i nærvær af 32P-ATP under anvendelse af standardbetingelser for reaktionen.

DNA-Sekvenser, herunder de, der er isolerede fra cDNA-biblioteker, kan modificeres ved kendte teknikker, herunder f.eks. stedrettet mutagenese 25 som beskrevet af Zoller (1982). I korthed pakkes det DNA, der skal modificeres, ind i en fag som en enkeltstrenget sekvens og konverteres til en dobbeltstrenget DNA med DNA-polymerase, under anvendelse af et syntetisk oiigonucleotid som primer, hvilket oligonukleotid er komplementært med den DNA-del, der skal modificeres, og har den ønskede modifikation 30 inkluderet i sin egen sekvens. Det resulterende dobbeltstrengede DNA transformeres ind i en fagunderstøttende værtsbakterie. Kulturer af de 66 DK 176280 B1 transformerede bakterier, der indeholder repiikationer af hver streng af fagen, udplades i agar til opnåelse af plaque. 50% Af de nye plaquer indeholder teoretisk fag med den muterede sekvens og de resterende 50% har den oprindelige sekvens. Replikater af disse plaquer hybridiseres med 5 en mærket syntetisk probe ved temperaturer og betingelser, der tillader hybridisering med den korrekte streng, men ikke med den ikke-modificerede sekvens. De sekvenser, der er blevet identificeret ved hybridisering, genvindes og klones.

10 III.E. Hybridisering med probe DNA-Biblioteker kan probes under anvendelse af Grunstein og Hogness (1975) -proceduren. I korthed immobiliseres det DNA, der skal probes, ved denne procedure på nitrocellulosefiltre, denatureres og præhybridiseres med 15 en puffer, der indeholder 0-50% formamid, 0,75 M NaCI, 75 mM Na-citrat, 0,02% (vægt/volumen) af hver af bovin serumalbumin, polyvinylpyrrolidon og Ficoll, 50 mM Na-phosphat (pH 6,5), 0,1% SDS og 100 pg/ml bærerdenatureret DNA. Procentdelen af formamid i pufferen, såvel som tidsrummet og temperaturbetingelserne for præhybridiseringen og efter-20 følgende hybridiseringstrin, afhænger af den krævede stringens. Oligomere probér, der kræver lavere stringensbetingelser, anvendes generelt med lave procentdele af formamidet, lavere temperaturer og længere hybridiserings-tidsrum. Prober, der indeholder mere end 30 eller 40 nucleotider, såsom de, der er afledt fra cDNA eller genomiske sekvenser, anvender generelt højere 25 temperaturer, f.eks. ca. 40-42°C og en høj procentdel, f.eks. 50%, formamid.

Efter præhybridisering sættes 5'-32P-mærket oligonucieotidprobe til pufferen og filtrene inkuberes i denne blanding under hybridiseringsbetingelser. Efter vaskning underkastes de behandlede filtre a uto radiografi til at vise lokaliseringen af den hybridiserede probe; DNA i korresponderende lokali-30 seringer på de originale agarplader anvendes som kilde til det ønskede DNA.

67 DK 176280 B1 III.F. Verifikation af konstruktion og sekvensering

Tit rutinevektorkonstruktioner transformeres tigeringsblandinger ind i E. coti stamme HB101 eller anden egnet vært og vellykkede transformanter 5 udvælges efter antibiotikaresistens eller andre markører. Plasmider fra transformanterne fremstilles herefter ifølge metoden af Clewell et al. (1969), sædvanligvis efter chloramphenicolforstærkning (Clewell (1972)). DNA'et Isoleres og analyseres sædvanligvis ved restriktionsenzymanalyse og/eller sekvensering. Sekvensering kan foregå ved Sanger et al. (1977) 10 -dideoxymetoden, som yderligere beskrives af Messing et al. (1981) eller ved Maxam et al. (1980) -metoden. De problemer med båndkompression, der ofte observeres i GC-rige områder, blev overvundet ved hjælp af T-deazoguanosin ifølge Barr et al. (1986).

15 HI G. Enzvmforbundet immunosorbentanalyse

Den enzymforbundne immunosorbentanalyse (ELISA) kan anvendes til at måle enten antigen- eller antistofkoncentrationer. Denne metode afhænger af konjugation af et enzym enten til antigen eller antistof og der anvendes 20 den bundne enzymaktivitet som et kvantitativt mærke. Til måling af antistof fikseres det kendte antigen til en fast fase (f.eks. en mikroplade eller plastikkop), inkuberes med forsøgsserumfortyndinger, vaskes, inkuberes med antiimmunoglobulin, der er mærket med et enzym, og vaskes igen.

Egnede enzymer til mærkning kendes inden for fagområdet og omfatter 25 f.eks. peberrodsperoxydase. Enzymaktivitet, der er bundet til den faste fase, måles ved at tilsætte det specifikke substrat og bestemme produktdannelse og substratudnyttelse kolorimetrisk. Den bundne enzymaktivitet er en direkte funktion af mængden af bundet antistof.

30 Til måling af antigen fikseres et kendt specifikt antistof til den faste fase, der tilsættes forsøgsmaterialet indeholdende antigen, efter inkubation vaskes . 68 DK 176280 B1 den faste fase og et sekundært enzymmærket antistof tilsættes. Efter vask tilsættes substratet og enzymaktiviteten vurderes kolorimetrisk og relateres til antigenkoncentration.

5 IV. Eksempler

Der er nedenfor beskrevet eksempler for den foreliggende opfindelse, der er tilvejebragt udelukkende til illustrative formål og ikke til begrænsning af den foreliggende opfindelses rammer. I lyset af den foreliggende beskrivelse vil 10 utallige udførelsesformer, der ligger inden for kravenes rammer, være nærliggende forfagmænd. De beskrevne procedurer, f.eks. i afsnit IV.A. kan, hvis det ønskes, gentages, men behøver ikke at blive det, idet der er tilgængelige teknikker til rådighed til konstruktion af de ønskede nucleotid-sekvenser baseret på den med opfindelsen tilvejebragte information.

15 Ekspression eksemplificeres i E. coli; men andre systemer er tilgængelige som det er fremsat mere fyldestgørende i afsnit IILA. Der kan også produceres yderligere epitoper, der er afledt fra genomstrukturen, og disse kan anvendes til at frembringe antistoffer som beskrevet nedenfor.

20 IV-A- Fremstilling, isolering og sekvensering af HC-cDNA

IV.A-1._Fremstilling af HCV-cDNA

Kilden til NANB-agens var en plasmapulje, der var afledt fra en chimpanse 25 med kronisk NANBH. Chimpansen var eksperimentelt blevet inficeret med blod fra en anden chimpanse med kronisk NANBH, der stammede fra infektion med HCV i en kontamineret batch af faktor 8 koncentrat, der var afledt fra forenede humane sera. Chimpanseplasmapuljen blev fremstillet ved kombination af mange individuelle plasmaprøver, der indeholdt høje 30 niveauer af alaninaminotransferaseaktivitet; denne aktivitet stammer fra leverskade på grund af HCV-infektionen. Idet 1 ml af en 106 fortynding af 69 DK 176280 B1 dette forenede serum givet i.v. forårsagede NANBH i en anden chimpanse, var dens CID mindst 106/ml, dvs. den havde en høj infektiøs virustiter.

Et cDNA-bibliotek fra højtiterplasmapuljen blev frembragt som følger. Først 5 blev virale partikler isoleret fra plasmaen; en 90 ml prøvemængde blev fortyndet med 310 ml opløsning indeholdende 50 mM Tris-HCI, pH 8,0, 1 mM EDTA, 100 mM NaCI. Rester blev fjernet ved centrifugering i 20 min ved 15.000 x g ved 20°C. Virale partikler i den resulterende supernatant blev herefter pelleteret ved centrifugering i en Beckman SW28 rotor ved 28.000 10 rpm i 5 timer ved 20°C. Til frigivelse af det virale genom blev partiklerne sprængt ved at suspendere pellets i 15 ml opløsning indeholdende 1% natriumdodecylsulfat (SDS), 10 mM EDTA, 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, også indeholdende 2 mg/ml proteinase k, fulgt af inkubation ved 45°C i 90 min. Nukleinsyre blev isoleret ved tilsætning af 0,8 pg MS2-bakteriofag RNA som 15 bærer og ekstrahering af blandingen 4 x med en 1:1-blanding af phenolxhloroform (phenol mættet med 0,5 M Tris-HCI, pH 7,5, 0,1% (volumen/volumen) beta-mercaptoethanol, 0,1% (vægt/volumen) hydroxy-quinolon fulgt af ekstraktion to gange med chloroform). Den vandige fase koncentreredes med 1-butanol forud for præcipitation med 2,5 voluminer 20 absolut ethanol natten over ved -20°C. Nukleinsyre blev fjernet ved centrifugering i en Beckman SW41 rotor ved 40.000 rpm i 90 min ved 4°C og opløst i vand, der var blevet behandlet med 0,05% (volumen/volumen) diethylpyrocarbonat, og autoklaveret.

25 Nukleinsyre opnået ved den ovennævnte procedure (<2 pg) denatureredes med 17,5 mM CH3HgOH; cDNA blev syntetiseret under anvendelse af det denaturerede nukleinsyre som skabelon og blev klonet ind i EcoRI-stedet I fag Iambda-gt11 under anvendelse af metoder, der er beskrevet af Huynh (1985), med den undtagelse, at stokastiske primere erstattede oligo(dT) 12-30 18 under syntesen af den første cDNA-streng ved reverstranskriptase (Taylor et al. (1976)). Det resulterende dobbeltstrengede cDNA er blevet 70 DK 176280 B1 fraktioneret efter størrelse på en Sepharose CL-4B-søjle; elueret materiale af ca. middelstørrelse 400, 300, 200 og 100 basepar blev forenet i cDNA-puljer 1, 2, 3 henholdsvis 4. Lambda-gt11 cDNA-bibfioteket blev frembragt fra cDNA i pulje 3.

5

Lambda-gt11 cDNA-biblioteket, der var frembragt fra pulje 3, blev screenet for epitoper, der kan bindes specifikt med serum, der er afledt fra en patient, som tidligere har været udsat for NANBH. Ca. 106 fager blev screenet med patientsera ved metoderne ifølge Huynh et al. (1985), med den undtagelse, 10 at bundet humant antistof blev påvist med fåreantihuman Ig antisera, der var radioaktivtmærket med 125l. Fem positive fager blev identificeret og oprenset.

De fem positive fager blev herefter testet for bindingsspecificitet til sera fra 8 forskellige mennesker, der tidligere var inficeret med NANBH-agenset under anvendelse af den samme metode. Fire af fagerne kodede for et polypeptid, 15 der reagerede immunologisk med kun et human serum, dvs. det der blev anvendt til primær screening af fagbiblioteket. Den femte fag (5-1-1) kodede for et polypeptid, der reagerede immunologisk med 5 ud af 8 af de testede sera. Dette polypeptid reagerede desuden ikke immunologisk med sera fra 7 normale bloddonorer. Det ser derfor ud til, at klon 5-1-1 koder for et 20 polypeptid, der specifikt genkendes immunologisk af sera fra NANB-patienter.

IV.A.2. HCV-cDNA-sekvenser i rekombinant fag 5-1-1 og polypeptidse-kvenser. der er indkodet i sekvensen 25 cDNA'et I rekombinant fag 5-1-1 blev sekvenseret ved Sanger et al. (1977)-metoden. I det væsentlige blev cDNA'et afskåret med EcoRI, isoleret ved størrelsesfraktionering under anvendelse af gelelektroforese. EcoRI-Restriktionsfragmenterne blev subklonet i M13-vektorerne, mp18 og mp19 30 (Messing (1983)), og sekvenseret under anvendelse af dideoxykæde- 71 DK 176280 B1 termineringsmetoden af Sanger et al. (1977). Den opnåede sekvens er vist i figur 1.

Det i figur 1 indkodede polypeptid, der er indkodet i HCV-cDNA'et, er i 5 samme translationsramme som den N-terminaie beta-galactosidasedel, hvortil det er fusioneret. Som vist i afsnit IV.A. koder den åbne translationslaeseramme (ORF) af 5-1-1 for epitoper, der specifikt genkendes af sera fra patienter og chimpanser med NANBH-infektioner.

10 IV.A.3._Isolering af HCV-cDNA, der overlapper med cDNA i klon 5-1-1

Overlappende HCV-cDNA, der overlapper med cDNA'et i klon 5-1-1 blev opnået ved at screene det samme Iambda-gt11 bibliotek, frembragt som beskrevet i afsnit IV.A.1. med et syntetisk polynucleotid, der er afledt fra 15 HCV-cDNA-sekvensen i klon 5-1-1 som vist i figur 1. Polynucleotidsekvensen der blev anvendt til screening var: 5'-TCC C TT GCT CGA TGT ACG GTA AGT GCT GAG AGC ACT CTT CCA TCT CAT CGA ACT CTC G GT AGA GGA CTT CCC TGT 20 CAG GT-3'.

Lambda-gt11 biblioteket blev screenet med denne probe under anvendelse af metoden beskrevet i Huynh (1985). Ca. 1 ud af 50.000 kloner hybridiserede med proben. Tre kloner, der indeholdt cDNA'er, der 25 hybridiserede med den syntetiske probe er blevet nummereret 81, 1-2 og 91.

IV.A.4. Nucleotidsekvenser af HCV-cDNA'er, der overlapper med cDNA i klon 5-1-1 30 Nukleotidsekvenserne af de tre cDNA’er i klon 81, 1-2 og 91 blev i det væsentlige bestemt som i afsnit IV.A.2. Disse kloners sekvenser i forhold til DK 176280 B1 72 HCV-cDNA-sekvensen i fag 5-1-1 er vist i figur 2, der viser den streng, der koder for den påviste HCV-epitop og hvor homologierne i nucleotid-sekvenserne er angivet ved lodrette linjer mellem sekvenserne.

5 Sekvenserne af de klonede HCV-cDNA'er er stærkt homologe i de overlappende regioner (se figur 2). Imidlertid er der forskelle i to områder. Nukleotid 67 i klon 1-2 er thymidin, hvorimod de andre tre kloner indeholder en cytidinrest i denne position. Det bør imidlertid bemærkes, at den samme aminosyre er indkodet, når enten C eller T optager denne stilling.

10

Den anden forskel er, at klon 5-1-1 indeholder 28 basepar, der ikke findes i de andre tre kloner. Disse basepar optræder ved starten af cDNA-sekvensen i 5-1-1 og er angivet ved små bogstaver. Baseret på radioimmuno-analysedata, der omtales nedenfor i afsnit IV.D., er det muligt, at en HCV-15 epitop kan være indkodet i dette 28 bp område.

Fravær af de 28 basepar i 5-1-1 fra klonerne 81, 1-2 og 91 kan betyde, at cDNA'et i disse kloner blev afledt fra defekte HCV-genomer; alternativt kunne 28 bp området være en terminal artefakt i klon 5-1-1.

20

Sekvenserne af små bogstaver i nucleotidsekvensen i klon 81 og 91 angiver simpelthen, at disse sekvenser ikke er blevet fundet i andre cDNA'er, fordi cDNA'er, der overlapper disse regioner, hidtil ikke er blevet isoleret.

25 En komposit HCV-cDNA-sekvens, der er afledt fra overlappende cDNA’er i klon 5-1-1,81 og 1 -2 og 91 er vist i figur 3. I denne figur er de enestående 28 basepar fra klon 5-1-1 imidlertid udeladt. Figuren viser også sekvensen af det polypeptid, der er indkodet i ORF af det kompositte HCV-cDNA.

30 IV.A.5._Isolering af HCV-cDNA'er, der overlapper med cDNA i klon 81 73 DK 176280 B1

Isoleringen af HCV-cDNA-sekvenser ovenstrøms for og som overlapper med de i klon 81 cDNA blev opnået som følger. Lambda-gt11 cDNA-biblioteket, 5 fremstillet som beskrevet i afsnit IV.A.1., blev screenet ved hybridisering med en syntetisk polynucleotidprobe, der var homolog til en 5'-terminalsekvens i klon 81. Sekvensen i klon 81 er vist i figur 4. Den syntetiske polynucleotidsekvens, der blev anvendt til screening var: 10 5' CTG TCA GGT ATG ATT GCC GGC TTC CCG GAC 3'.

Metoderne var i det væsentlige som beskrevet af Huynh (1985), med den undtagelse, at biblioteksfiltrene blev vasket to gange under stringente betingelser, dvs. de blev vasket i 5 x SSC, 01,% SDS ved 55°C i 30 min 15 hver. Ca. 1 ud af 50.000 kloner hybridiserede med proben. En positiv rekombinant fag, der indeholdt cDNA, der hybridiserede med sekvensen, blev isoleret og oprenset. Denne fag er blevet nummereret klon 36.

Nedenstrøms cDNA-sekvenser, der overlapper med carboxylendesekvens-20 erne i klon 81 cDNA, blev isoleret under anvendelse af en procedure, der ligner isoleringen af ovenstrøms cDNA-sekvenser med den undtagelse, at der blev fremstillet en syntetisk oligonucleotidprobe, der er homolog med en 3'-terminalsekvens i klon 81. Den syntetiske polynucleotidsekvens, der blev anvendt til screening var: 25 5' TTT GGC TAG TGG TT A GTG GGC TGG TGA CAG 3'.

En positiv rekombinant fag, der indeholdt cDNA, som hybridiserede med sidstnævnte sekvens, blev isoleret og oprenset og er blevet nummereret klon 30 32.

IV.A.6._HCV-cDNA-nucieotidsekvens i klon 36 74 DK 176280 B1 cDNA'ets nucleotidsekvens i klon 36 blev i det væsentlige bestemt som beskrevet i afsnit IV.A.2. Dette cDNA's dobbeltstrengede sekvens, dets 5 område, der overlapper med HCV-cDNA'et i klon 81, og det af ORF indkodede polypeptid er vist i figur 5.

ORF i klon 36 er i den samme translationsramme som HCV-antigenet, der er indkodet i klon 81. ORF'ne i klonerne 36 og 81 koder således i kombination 10 for et polypeptid, der repræsenterer en del af et større HCV-antigen. Sekvensen af dette formodede HCV-polypeptid og den dobbeltstrengede DNA-sekvens, der koder herfor, som er afledt fra de kombinerede ORF af HCV-cDNA'erne i klon 36 og 81, er vist i figur 6.

15 IV.A.7 HCV-cDNA-nucleotidsekvens i klon 32 cDNA’ets Nucleotidsekvens i klon 32 blev i det væsentlige bestemt som beskrevet i afsnit IV.A.2. for sekvensen af klon 5-1-1. Sekvensdata viste, at cDNA’et i klon 32 rekombinantfag var afledt fra to forskellige kilder. Et 20 fragment af cDNA’et udgjordes af 418 nucleotider, der var afledt fra HCV-genomet; det andet fragment udgjordes af 172 nucleotider, der var afledt fra bakteriofag MS2-genomet, der havde været anvendt som bærer under fremstillingen af Iambda-gt11 plasmid cDNA-biblioteket.

25 cDNA-Sekvensen i klon 32 der korresponderer med sekvensen af HCV-genomet, er vist i figur 7. Det område af sekvenserne, der overlapper området i klon 81 og det af ORF'en indkodede polypeptid, er også vist i figuren. Denne sekvens indeholder en kontinuert ORF, der er i samme translationsramme som HCV-antigenet, der er indkodet af klon 81.

30 75 IV.A.8._Isolering af HCV-cDNA, der overlapper med cDNA i klon 36 DK 176280 B1

Isolering af HCV-cDNA-sekvenser ovenstrøms for og som overlapper med de i klon 36 cDNA blev udført som beskrevet i afsnit IV.A.5., for de, der 5 overlapper klon 81 cDNA, med den undtagelse, at det syntetiske polynucleotid var baseret på 5’-området i klon 36. Den syntetiske polynucleotidsekvens der blev anvendt til screening var: 5' AAG CCA C CG TGT GCG CTA GGG CTC AAG CCC 3'.

10

Ca. 1 ud af 50.000 kloner hybridiserede med proben. Den isolerede oprensede klon af rekombinant fag, der indeholdt cDNA, som hybridiserede med denne sekvens, blev benævnt klon 35.

15 IV.A.9-_HCV-cDNA-nucleotidsekvens i klon 35 cDNA-Nucleotidsekvensen i klon 35 blev i det væsentlige bestemt som beskrevet i afsnit IV A.2. Sekvensen, dens overlapningsområde med cDNA'ets i klon 36 og det formodede polypeptid, der er indkodet deri, er vist i 20 figur 8.

Klon 35 indeholder tilsyneladende en enkelt, kontinuert ORF, der koder for et polypeptid i samme translationsramme som det polypeptid, som klon 36, klon 81 og klon 32 koder for. Figur 9 viser sekvensen af den lange 25 kontinuerte ORF, der strækker sig over klonerne 35, 36, 81 og 32 sammen med det formodede HCV-polypeptid, der er indkodet deri. Denne kombinerede sekvens er blevet bekræftet under anvendelse af andre uafhængige cDNA-kloner, der er afledt fra samme iambda-gt11 cDNA-bibliotek.

30 IV.A.10. Isolering af HCV-cDNA, der overlapper med cDNA i klon 35 76 DK 176280 B1

Isoleringen af HCV-cDNA-sekvenser ovenstrøms for og som overlapper med sekvenserne i klon 35 cDNA blev udført som beskrevet i afsnit IV.A.8., for 5 de, der overlapper klon 36 cDNA, med den undtagelse, at det syntetiske polynucleotid var baseret på 5'-området i klon 35. Den syntetiske polynucleotidsekvens der blev anvendt til screening var: 5’ CAG GAT GCT GTC TCC CGC ACT C AA CGT 3'.

10

Ca. 1 ud af 50.000 kloner hybridiserede med proben. Den isolerede oprensede klon af rekombinant fag, der indeholdt cDNA, der hybridiserede med denne sekvens, blev benævnt klon 37b.

15 IV.A.11. HCV-nucleotidsekvens i klon 37b cDNA-Nucleotidsekvensen i klon 37b blev i det væsentlige bestemt som beskrevet i afsnit IV.A.2. Sekvensen, dens overlapningsområde med cDNA'et i klon 35 og det deri indkodede formodede polypeptid er vist i figur 10.

20 5'-Terminalnucleotidet i klon 35 er T, medens det korresponderende nucleotid i klon 37b er A. cDNA’erne Fra 3 andre uafhængige kloner, der blev isoleret under proceduren, hvori klon 37b blev isoleret, beskrevet i afsnit IV.A.10., er også blevet sekvenseret. cDNA'erne Fra disse kloner indeholder 25 også A i denne position. Det 5'-terminale T i klon 35 kan således være et artefakt af kloningsproceduren. Det er kendt, at artefakter ofte opstår ved 5’-termini i cDNA-molekyler.

Klon 37b indeholder tilsyneladende en kontinuert ORF, der koder for et 30 polypeptid, der er en forlængelse af det polypeptid, der er indkodet i ORF, som strækker sig gennem de overlappende kloner 35, 36, 81 og 32.

IV.A.12. Isolering af HCV-cDNA, dér overlapper med cDNA i klon 32 77 DK 176280 B1

Isolering af HCV-cDNA-sekvenser nedenstrøms for klon 32 blev udført som 5 følger. Først blev klon c1a isoleret under anvendelse af en syntetisk hybridiseringsprobe, der var baseret på nucleotidsekvensen af HCV-cDNA-sekvensen i klon 32. Metoden var i det væsentlige den, der er beskrevet i afsnit IV.A.5., med den undtagelse, at den syntetiske probes sekvens var: 10 5' AGT GCA GTG GAT G AA CCG GCT GAT AG C CTT 3'.

Under anvendelse af nucleotidsekvensen fra klon c1a blev et andet syntetisk nucleotid syntetiseret, der havde sekvensen: 15 5’ TCC TG A GGC GAC TGC ACC AGT GGA ΤΑ A GCT 3’.

Screening af Iambda-gt11 -biblioteket under anvendelse af den fra klon c1a afledte sekvens som probe gav ca. 1 ud af 50.000 positive kolonier. En isoleret oprenset klon, der hybridiserede med denne probe blev kaldt klon 33b.

20 IV.A.13. HCV-cDNA-nucleotidsekvens i klon 33b cDNA-Nucleotidsekvensen i klon 33b blev i det væsentlige bestemt som beskrevet i afsnit IV.A.2. Sekvensen, dens overlapningsområde med cDNA'ets i 25 klon 32 og det formodede polypeptid, der er indkodet deri, er vist i figur 11.

Klon 33b indeholder tilsyneladende en kontinuert ORF, der er en forlængelse af ORF’ne i overlappende kloner 37b, 35, 36, 81 og 32. Det i klon 33b indkodede polypeptid er i samme translationsramme som polypeptidet, der 30 er indkodet i den forlængede ORF af disse overlappende kloner.

DK 176280 B1 78 IV.A.14. Isolering af HCV-cDNA'er, der overlapper med cDNA i klon 37b og med cDNA i klon 33b

For at isolere HCV-cDNA'er, der overlapper med cDNA'er i klon 37b og i klon 5 33b blev følgende syntetiske oligonucleotidprober, der afledtes fra cDNA'et i disse kloner, anvendt til at screene Iambda-gt11 -biblioteket i det væsentlige under anvendelse af metoden beskrevet i afsnit IV.A.3. De anvendte prober var: 10 5' CAG GAT GCT GTC TCC CGC ACT C AA CGT C 3’ og 5' TCC TGA GGC GAC TGC ACC AGT GGA TAA GCT 3’ 15 ti! påvisning af kolonier, der indeholder HCV-cDNA-sekvenser, der overlapper med sekvenserne i klonerne 37b og 33b. Ca. 1 ud af 50.000 kolonier blev påvist med hver probe. En klon, der indeholdt cDNA, der var oven-strøms for og som overlappede med cDNA'et i klon 37b, blev benævnt klon 20 40b. En klon, der indeholdt cDNA, der var nedenstrøms for og som overlappede med cDNA'et i klon 33b, blev benævnt klon 25c.

IV.A.15._HCV-cDNA-nucleotidsekvenser i klon 40b og i klon 25c 25 Nucleotidsekvenserne af cDNA'erne i klon 40b og klon 25c blev i det væsentlige bestemt som beskrevet i afsnit IV.A.2. Sekvenserne af 40b og 25c, deres overlapningsområder med cDNA'et i klonerne 37b og 33b og de formodede polypeptider, der er indkodet deri, er vist i figur 12 (klon 40b) og figur 13 (klon 25c).

30 79 DK 176280 B1 5'-Terminalnucleotidet i klon 40b er G. cDNA’erne Fra 5 andre uafhængige kloner, der blev isoleret under proceduren, hvori klon 40b blev isoleret, beskrevet i afsnit IV A. 14., er imidlertid også blevet sekvenseret. cDNA'erne For disse kloner indeholder også T i denne position. G'et kan således 5 repræsentere et kloningsartefakt, (se omtalen i afsnit IV.A.11.).

Klon 25c's 5’-terminus er ACT, men dette områdes sekvens i klon cla (sekvensen ikke vist) og i klon 33b er TCA. Denne forskel kan også repræsentere et kloningsartefakt ligesom de 28 ekstra 5-terminale 10 nucleotider i klon 5-1-1.

Klonerne 40b og 25c indeholder tilsyneladende en ORF, der er en forlængelse af den kontinuerte ORF i de tidligere sekvenserede kloner. Nukleotidsekvensen af ORF'en, der strækker sig gennem klonerne 40b, 37b, 15 35, 36, 81, 32, 33b og 25c, og aminosyresekvensen af det formodede polypeptid, der er indkodet deri, er vist i figur 14. I figuren er de potentielle artefakter udeladt fra sekvensen og de korresponderende sekvenser i non-S'-terminale områder af multipleoverlappende kloner er vist i stedet.

20 IV.A.16. Fremstilling af et komposit HCV-cDNA ud fra cDNA'erne i klonerne 36, 81 og 32

Det kompositte HCV-cDNA, C100, blev konstrueret som følger. Først blev cDNA’erne fra klonerne 36, 81 og 32 skåret med EcoRl. EcoRI-Fragmentet 25 af cDNA fra hver klon blev individuelt klonet ind i EcoRI-stedet af vektoren pGEM3-blue (Promega Biotec). De resulterende rekombinante vektorer, der indeholdt cDNA'erne fra klonerne 36, 81 og 32, blev benævnt pGEM3-blue/36, pGEM3-blue/81 og pGEM3-blue/32. Den behørigt orienterede pGEM3-blue/81 rekombinante blev fordøjet med Nael og Narl og det større 30 (-2,850 bp) fragment blev oprenset og ligeret med det mindre (-570 bp)

Nael/Narl oprensede restriktionsfragment fra pGEM3-blue/36. Denne DK 176280 B1 80 komposit af cDNA'erne fra klonerne 36 og 81 blev anvendt til at frembringe en pGEM3-blue vektor, der indeholder den kontinuerte HCV ORF, der er indeholdt i det overlappende cDNA i disse kloner. Det nye plasmid blev herefter fordøjet med Pvuil/EcoRI til frigørelse af et fragment på ca. 680 bp, 5 der herefter blev ligeret med det mindre (580 bp) Pvuli/EcoRI-fragment, der er isoleret fra det behørigt orienterede pGEM3-blue/32-plasmid og det kompositte cDNA fra klonerne 36, 81 og 32 blev ligeret ind i den EcoRI-lineariserede vektor pSODcfl, der er beskrevet i afsnit IV.B.1. og som blev anvendt til at udtrykke klon 5-1-1 i bakterier. Rekombinanter, der indeholder 10 ca. 1.270 bp EcoRf-fragmentet af komposit HCV-cDNA (C100), blev udvalgt, og cDNA'et fra plasmiderne blev skåret med EcoRI og oprenset.

IV.A.17.lsolerinq og nucleotidsekvenser af HCV-cDNA'er i klonerne 14i. 11b, 7f, 7e, 8h, 33c, 14c, 8f, 33f, 33q og 39c 15 HCV-cDNA'erne i klonerne 14i, 11b, 7f, 7e, 8h, 33c, 14c, 8f, 33f, 33g og 39c blev isoleret ved teknikken til isolering af overlappende cDNA-fragmenter fra Iambda-gt11 -biblioteket af HCV-cDNA'er, beskrevet i afsnit IV.A.1. Den anvendte teknik var i det væsentlige i overensstemmelse med det i afsnit 20 IV.A.3. beskrevne, med den undtagelse, at de anvendte prober blev konstrueret ud fra nucleotidsekvensen i de sidst isolerede kloner fra 5‘- og 3'-enden af de kombinerede HCV-sekvenser. Frekvensen af kloner, der hybridiserede med de nedenfor beskrevne kloner, var ca. 1 ud af 50.000 i hvert tilfælde.

25 HCV-cDNA-Nucleotidsekvenserne i klonerne 14i, 7f, 7e, 8h, 33c, 14c, 8f, 33f, 33g og 39c blev i det væsentlige bestemt som beskrevet i afsnit IV.A.2., med den undtagelse, at det afskårede cDNA fra disse fager erstattede cDNA'et, der er isoleret fra klon 5-1-1.

30 DK 176280 B1 81

Klon 33c blev isoleret under anvendelse af en hybridiseringsprobe, der er baseret på nucleotidsekvensen i klon 40b. Nucleotidsekvensen i klon 40b vises i figur 12. Nucleotidsekvensen af den probe, der anvendes til at isolere 33c, var: 5 5’ ATC AGG ACC GGG GTG AGA ACA ATT ACC ACT 3'.

Sekvensen af HCV-cDNA i klon 33c og overlappet med den i klon 40b er vist i figur 15, der også viser de deri indkodede aminosyrer.

10

Klon 8h blev isoleret under anvendelse af en probe, der er baseret på nucleotidsekvensen i klon 33c. Nucleotidsekvensen af proben var: 5’ AGA GAC AAC CAT GAG GTC CCC GGT G TT C 3’.

15 HCV-cDNA-Sekvensen i klon 8h og overlappet med den i klon 33c og de deri indkodede aminosyrer er vist i figur 16.

Klon 7e blev isoleret under anvendelse af en probe, der er baseret på 20 nucleotidsekvensen i klon 8h. Nucleotidsekvensen af proben var: 5’ TCG GAC CTT TAC CTG GTC ACG AGG CAC 3'.

HCV-cDNA I klon 7e, overlappet med klon 8h og de deri indkodede 25 aminosyrer, er vist i figur 17.

Klon 14c blev isoleret med en probe, der er baseret på nucleotidsekvensen i klon 35c. Sekvensen i klon 35c er vist i figur 13. Proben til isolering af klon 14c havde sekvensen: 5’ ACC TTC CCC ATT AAT GCC TAC ACC ACG GGC 3'.

30 82 DK 176280 B1 HCV-cDNA-Sekvensen i klon 14c, dens overtap med klon 25c og de deri indkodede aminosyrer, er vist i figur 18.

5 Klon 8f blev isoleret under anvendelse af en probe, der er baseret på nucleotidsekvensen i klon 14c. Probens nucleotidsekvens var: 5’ TCC ATC TCT CAA GGC AAC TTG CAC CGC TAA 3’.

10 HCV-cDNA-Sekvensen i klon 8f, dens overlap med klon 14c og de deri indkodede aminosyrer, er vist i figur 19.

Klon 33f blev isoleret under anvendelse af en probe, der er baseret på nucleotidsekvensen, der er til stede i klon 8f. Probens nucleotidsekvens var: 15 5' TCC ATG GCT GTC CGC TTC CAC CTC CAA AGT 3'.

HCV-cDNA-Sekvensen i klon 33f, dens overlap med klon 8f og de deri indkodede aminosyrer, er vist i figur 20.

20

Klon 33g blev isoleret under anvendelse af en probe, der er baseret på nucleotidsekvensen i klon 33f. Probens nucleotidsekvens var: 5* GCG ACA ATA CGA CAA CAT CCT CTG AGC CCG 3'.

25 HCV-cDNA-Sekvensen i klon 33g, dens overlap med klon 33f og de deri indkodede aminosyrer, er vist i figur 21.

Klon 7f blev isoleret under anvendelse af en probe, der er baseret på 30 nucleotidsekvensen i klon 7e. Probens nucleotidsekvens var: DK 176280 B1 83 5’ AGC AGA CAA GGG GCC TCC TAG GGT GCA TAA T 3’.

HCV-cDNA-Sekvensen i klon 7f, dens overlap med klon 7e og de deri indkodede aminosyrer, er vist i figur 22.

5

Klon 11 b blev isoleret under anvendelse af en probe, der er baseret på sekvensen i klon 7f. Nukleotidsekvensen af proben var: 5' CAC CTA TGT TT A TAA CCA TCT CAC TCC TCT 3’.

10 HCV-cDNA-Sekvensen i klon 11b, dens overlap med klon 7f og de deri indkodede aminosyrer, er vist i figur 23.

Klon 14i blev isoleret under anvendelse af en probe, der er baseret på 15 nucleotidsekvensen i klon 11b. Probens nucleotidsekvens var: 5' CTC TGT CAC CAT ATT ACA AGC GCT ATA TCA 3'.

HCV-cDNA-Sekvensen i klon 14i, dens overlap med 11b og de deri 20 indkodede aminosyrer, er vist i figur 24.

Klon 39c blev isoleret under anvendelse af en probe, der er baseret på nucleotidsekvensen i klon 33g. Probens nucleotidsekvens var: 25 5’ CTC G TT GCT ACG TCA CCA CAA TTT GGT GTA 3'.

HCV-cDNA-Sekvensen i klon 39c, dens overlap med klon 33g og de deri indkodede aminosyrer, er vist i figur 25.

30 84 DK 176280 B1

IV.A.18. Den kompositte HCV-cDNA-sekvens, der er afledt fra isolerede kloner indeholdende HCV-cDNA

HCV-cDNA-sekvenserne i de ovenfor beskrevne kloner er blevet sat på 5 række for at skabe en komposit HCV-cDNA-sekvens. De isolerede kloner, der er rækkestillet i 5'- til 3'-retningen er: 14i, 7f, 7e, 8h, 33c, 40b, 37b, 35, 36, 81,32, 33b, 25c, 14c, 8f, 33f, 33g og 39c.

En komposit HCV-cDNA-sekvens, der er afledt fra de isolerede kloner og de 10 deri indkodede aminosyrer, er vist i fig. 26.

Ved frembringelsen af den kompositte sekvens er i følgende sekvens heterogeneiteter taget i betragtning. Klon 33c indeholder et HCV-cDNA på 800 basepar, der overlapper cDNA'erne i klonerne 40b og 37c. I klon 33c 15 såvel som i fem andre overlappende kloner er nucleotid nr. 789 G. I klon 37b (se afsnit IV.A.11) er det korresponderende nucleotid imidlertid A. Denne sekvensforskel skaber en tilsyneladende heterogeneitet i de deri indkodede aminosyrer, der enten kan være CYS eller TYR, for henholdsvis G eller A.

Denne heterogeneitet kan have vigtige udløbere med hensyn til 20 proteinfoldning.

Nucieotidrest nr. 2 i klon 8h HCV-cDNA er T. Men som vist i det følgende, er den korresponderende rest i klon 7e A; desuden er der også fundet A i denne position i tre andre isolerede, overlappede kloner. Således kan T-25 resten i klon 8h repræsentere et kloningsartefakt. Derfor betegnes i fig. 26 resten i denne position A.

3’-Terminalnucleotidet i klon 8f HCV-cDNA er G. Men den korresponderende rest i klon 33f og i to andre overlappende kloner er T. Derfor er resten i 30 denne position betegnet T i figur 26.

85 DK 176280 B1 3'-Terminalsekvensen i klon 33f HCV-cDNA er TTGC. Men den korresponderende sekvens i klon 33g og i ίο andre overlappende kloner er ATTC. Derfor er det korresponderende område i fig. 26 betegnet ATTC.

5 Nucleotidrest nr. 4 i klon 33g HCV-cDNA er T. Men i klon 33f og i to andre overlappende kloner er den korresponderende rest A. Derfor er den korresponderende rest i fig. 26 betegnet A.

3'-Terminalen i klon 14i er AA, medens det korresponderende dinucleotid i 10 klon 11 b og i tre andre kloner er TA. Derfor er TA-resten afbildet i fig. 26.

Løsningen af andre sekvensheterogeneiteter er omtalt ovenfor.

En undersøgelse af det kompositte HCV-cDNA viser, at det indeholder én 15 større ORF. Dette antyder, at det virale genom translateres ind i et større polypeptid, der processeres samtidig med eller efterfølgende translation.

IV.A. 19. Isolering og nucieotidsekvenser af HCV-cDNA'er i klonerne 12f, 35f. 19a. 26a og 15e 20 HCV-cDNA'erne i klonerne 12f, 35f, 19g, 26g og 15e blev i det væsentlige isoleret ved de i afsnit IV.A. 17 beskrevne teknikker med den undtagelse, at grupperne var som nedenfor vist. Frekvensen af kloner, der hybridiserede med proberne var ca. 1 ud af 50.000 i hvert tilfælde. HCV-cDNA-25 Nucleotidsekvenserne i disse kloner blev i det væsentlige bestemt som beskrevet i afsnit IV.A.2 med den undtagelse, at cDNA'et fra de viste kloner erstattede cDNA, der er isoleret fra klon 5-1-1.

Isoleringen af klon 12f, der indeholder cDNA ovenstrøms for HCV-cDNA i fig.

30 26, blev udført under anvendelse af en hybridiseringsprobe, der er baseret på nucleotidsekvensen i klon 14i. Probens nucleotidsekvens var 86 DK 176280 B1 5’ TGC TTG TGG ATG ATG CTA CTC ATA TCC CAA 3'.

HCV-cDNA-Sekvensen i klon 12f, dens overlap med klon 14i og de deri 5 indkodede aminosyrer er vist i fig. 27.

Isolering af klon 35f, der indeholder cDNA nedenstrøms for HCV-cDNA’et i fig. 26, blev udført under anvendelse af en hybridiseringsprobe, der er baseret på nucleotidsekvensen i klon 39c. Probens nucleotidsekvens var 10 5’ AGC AGC GGC GTC AAA AGT G AA GGC TAA CTT 3'.

Sekvensen i klon 35f, dens overlap med sekvensen i klon 39c og de deri indkodede aminosyrer er vist i fig. 28.

15

Isolering af klon 19g blev udført under anvendelse af en hybridiseringsprobe, der er baseret på 3’-sekvensen af klon 35f. Probens nucleotidsekvens var: 5' TT C TCG TAT GAT ACC CGC TGC TTT GAC TCC 3'.

20 HCV-cDNA-Sekvensen i klon 19g, dens overlap med sekvensen i klon 35f og de deri indkodede aminosyrer er vist i fig. 29.

Isolering af klon 26g blev udført under anvendelse af en hybridiseringsprobe, 25 der er baseret på 3'-sekvensen af klon 19g. Probens nucleotidsekvens var 5’ TGT GTG GCG ACG ACT TAG TCG TTA TCT GTG 3'.

HCV-cDNA-Sekvensen af klon 26g, dens overlap med sekvensen i klon 19g 30 og de deri indkodede amonosyrer er vist i fig. 30.

DK 176280 B1 87

Klon 15e blev isoleret under anvendelse af en hybridiseringsprobe1 der er baseret på 3’-sekvensen af klon 26g. Probens nucleotidsekvens var 5’ CAC ACT CCA GTC AAT TCC TGG CTA GGC AAC 3'.

5 HCV-cDNA-Sekvensen af klon 15e, dens overlap med sekvensen i klon 26g og de deri indkodede aminosyrer er vist i fig. 31.

De i dette afsnit beskrevne kloner er deponeret med ATCC under de i afsnit 10 II.A. beskrevne betingelser og er blevet tildelt følgende deponeringsnumre:

Lambda-qt11_ ATCC nr._Deponerinqsdato

Klon 12f 40514 10Nov. 1988 15 Klon 35f 40511 10Nov. 1988

Klon 15e 40513 10 Nov. 1988

Klon K9-1 40512 10 Nov. 1988 HCV-cDNA-Sekvenserne i de ovenfor beskrevne kloner er blevet stillet på 20 række for at frembringe en komposit HCV-cDNA-sekvens. De isolerede kloner, der er rækkestillede i 5' til 3’ retningen, er: 12f, 14i, 7f, 7e, 8h, 33c, 40b, 37b, 35, 36, 81, 32, 33b, 25c, 14c, 8f, 33f, 33g, 39c, 35f, 19g, 26g og 15e.

25 En komposit HCV-cDNA-sekvens, der er afledt fra de isolerede kloner og de deri indkodede aminosyrer, er vist i fig. 32.

30 DK 176280 B1 88 IV.A.20. Alternativ metode til isolering af cDNA-sekvenser ovenstrøms for HCV-cDNA-sekvensen i klon 12f

Baseret for det meste på 5' HCV-sekvensen i fig. 32, der er afledt fra HCV-5 cDNA i klon 12f, syntetiseres mindre syntetiske oligonucleotidprimere af reverstranskriptase og anvendes til at bindes til den korresponderende sekvens i genomisk HVC-RNA til at prime reverstranskription af ovenstrømssekvenserne. Primersekvenserne er proksimale til den kendte 5'-terminalsekvens i klon 12f, men tilstrækkeligt nedenstrøms til at tillade 10 konstruktionen af probesekvenser ovenstrøms for primersekvenserne. Der anvendes kendte standardmetoder til priming og kloning. De resulterende cDNA-biblioteker screenes med sekvenser ovenstrøms for primingstederne (som udledt fra den belyste sekvens i klon 12f). Genomisk HCV-RNA opnås fra enten plasma- eller leverprøver fra chimpanser med NANBH, eller fra 15 analoge prøver fra mennesker med NANBH.

IV.A.21. Alternativ metode, der gør brug af påsætning af hale til isolering af sekvenser fra 5'-terminalområdet af HCV-qenomet.

20 For at isolere de ekstreme 5’-terminale sekvenser af HCV-RNA-genomet påsættes cDNA-produktet af første runde af reverstranskription, der duplekses med skabelon RNA’et, en oligo C-hale. Dette udføres ved at inkubere produktet med terminaltransferase i nærvær af CTP. Den anden runde af cDNA-syntese, der giver komplementet til den første cDNA-streng udføres 25 under anvendelse af oligo G som en primer for reverstranskriptase-reaktionen. Kilderne til genomisk HCV-RNA er som beskrevet i afsnit IV.A.20. Metoderne til påsætning af hale med terminaltransferase og for reverstranskriptasereaktionerne er som beskrevet i Maniatis et al. (1982). cDNA-Produkterne klones herefter, screenes og sekvenseres.

30 89 DK 176280 B1 IV.A.22. Alternativ metode, der anvender påsætning af hale til isolering af frekvenser fra 3'-terminalområdet af HCV-qenomet.

Denne metode er baseret på tidligere anvendte metoder til kloning af 5 cNDA’er af flayivirus RNA. I denne metode underkastes RNA’et denatureringsbetingelser til fjernelse af sekundære strukturer ved 3'-terminalen og påsættes herefter hale med Poly A polymerase under anvendelse af rATP som substrat. Reverstranskriptionen af RNA'et med påsat poly A-hale katalyseres af reverstranskriptase under anvendelse af oligo dT som primer.

10 cDNA'ets Nr. to strenge syntetiseres, cDNA-produkterne klones, screenes og sekvenseres.

IV.A.23. Fremstilling af Lambda-qt11 HCV-cDNA-biblioteker, der indeholder større cDNA-insertioner.

15

Metoden, der anvendes til at fremstille og screene Lambda-gt11-bibliotekerne, er i det væsentlige som beskrevet i afsnit IV.A.1. med den undtagelse, at biblioteket frembringes fra en pulje af cDNA'er af større størrelse, og som er elueret fra Sepharose CL-4B-søjlen.

20 IV.A.24. Fremstilling af HCV-cDNA-biblioteker under anvendelse af syntetiske oliqomerer som primere.

Nye HCV-cDNA-biblioteker er blevet fremstillet fra RNA’et, der er afledt fra 25 den infektiøse chimpanseplasmapulje, der er beskrevet i afsnit IV.A.1. og fra poly A+-Fraktionen, der er afledt fra dette inficerede dyrs lever. cDNA'et blev konstrueret i det væsentlige som beskrevet af Gubier og Hofmann (1983) med den undtagelse, at primere for den første cDNA-strengs syntese var to syntetiske oligomerer baseret på den ovenfor beskrevne HCV-genom-30 sekvens. Primere baseret på sekvensen i afsnit 11 b og 7e var henholdsvis: 90 DK 176280 B1 5' CTG GCT TG A AG A ATC 3' og 5' AGT TAG GCT G GT GAT TAT G C 3'.

5 De resulterende cDNA’er blev klonet ind i lamdabakteriofagvektorer og screenet med forskellige andre syntetiske oligomerer, hvis sekvenser var baseret på HCV-sekvensen i fig. 32.

IV.B. Ekspression af polypeptider, der er indkodet i HCV-cDNA'er og 10 identifikation af ekspressionsprodukterne som HCV-inducerede antigener IV.B.1. Ekspression af det i klon 5-1-1 indkodede polypeptid HVC-polypeptidet, der er indkodet i klon 5-1-1 {se afsnit IV.A.2, ovenfor) blev 15 udtrykt som et fusionspolypeptid med superoxiddismutase (SOD). Dette blev udført ved at subklone klonen 5-1-1 cDNA-insertionet i ekspressionsvektoren pSODcfl (Steimer et al. (1986)) som følger.

Først blev DNA, der var isoleret fra pSODcfl behandlet med BamH1 og 20 EcoRI, og den følgende linker blev ligeret ind i det lineære DNA, der var skabt af restriktionsenzymerne: 5' GAT CCT GGA ATT CTG ΑΤΑ A 3' 3’ GA CCT TAA GAC TAT TTT AA 5' 25

Efter kloningen blev plasmiden, der indeholdt insertionet, isoleret.

Plasmidet, der indeholdt insertionet, blev restriktionsbehandlet med EcoRI. HCV-cDNA-Insertionet i klon 5-1-1 blev udskåret med EcoRI og ligeret ind i 30 dette EcoRI-lineariserede plasmid DNA. DNA-Blandingen blev anvendt til at transformere E. coli-stamme D1210 (Sadler et al. (1980)). Rekombinanter DK 176280 B1 91 med 5-1-1 cDNA'et i den korrekte orientering til ekspression af ORF’en, der er vist i fig. 1, blev identificeret ved restriktionskortlægning og nucleotid-sekvensering.

5 Rekombinante bakterier fra en klon blev induceret til at udtrykke SOD-NANB5μ polypeptid ved at dyrke bakterierne i nærvær af IPTG.

IV.B.1. Ekspression af det i klon 81 indkodede polypeptid 10 HCV-cDNA'et, der er indeholdt i klon 81, blev udtrykt som et SOD-NANBsi fusionspolypeptid. Metoden til fremstilling af vektoren, der kodede for dette fusionspolypeptid, var analog med den til frembringelse af vektoren, der koder for SOD-NANB5-m, anvendte metode med den undtagelse, at kilden til HCV-cDNA-klon 81, der blev isoleret og beskrevet i afsnit IV.A.3., og for 15 hvilken cDNA-sekvensen var bestemt som beskrevet i afsnit IV.A.4. HCV-cDNA-Nucleotidsekvensen i klon 81 og den formodede aminosyresekvens af det deri indkodede polypeptid er vist i fig. 4.

HCV-cDNA-Insertionet i klon 81 blev skåret med EcoRI og ligeret ind i den 20 pSODcfl, der indeholdt linkeren (se IV.B.1) og som var lineariseret ved behandling med EcoRI. DNA-Blandingen blev anvendt til at transformere B coli-stamme D1210. Rekombinanter med klon 81 HCV-cDNA'et i den korrekte orientering til ekspression af den i fig. 4 viste ORF, blev identificeret ved restriktionskortlægning og nucleotidsekvensering.

25

Rekombinante bakterier fra en klon blev induceret til at udtrykke SOD-NANBsi polypeptid ved at dyrke bakterierne i nærvær af IPTG.

30 92 DK 176280 B1 IV.B.3. Identifikation af det i kion 5-1-1 indkodede polypeptid som et HCV-og NANBH-associeret antigen.

Det i HCV-cDNA'et af klon 5-1-1 indkodede polypeptid blev identificeret som 5 et NANBH-associeret antigen ved at demonstrere, at sera fra chimpanser og mennesker, der er inficeret med NANBH, reagerede immunologisk med fusionspolypeptidet, SOD-NANB5.1-1, der udgøres af superoxiddismutase ved N-terminalen og "in-frame 5-1-1-antigenet" ved C-terminalen. Dette blev opnået ved Western-blotting (Towbin et al. (1979)) som følger.

10

En rekombinant bakteriestamme, der er transformeret med en ekspressionsvektor, der er koder for SOD-NANB5_i_i polypeptidet, som beskrevet i afsnit IV.B.I., blev induceret til at udtrykke fusionspolypeptidet ved dyrkning i nærvær af IPTG. Totalt bakterielysat blev underkastet elektroforese gennem 15 polyakrylamidgeler i nærvær af SDS ifølge Laemmli (1970). De separarerede polypeptider blev overført til nitrocellulosefiltre (Towbin et al. (1979)). Filtrene blev herefter skåret ud i tynde strimler, og strimlerne blev inkuberet individuelt med de forskellige chimpanse- og menneskesera. Bundne antistoffer blev påvist ved yderligere inkubation med 125l-mærket 20 fåreantihuman Ig som beskrevet i afsnit IV.A.1.

Karakteriseringen af de til Western-blots anvendte chimpansesera og resultaterne, der er vist i fotografiet af de autoradiograferede strimler, vises i fig. 33. Nitrocellulosestrimler, der indeholder polypeptider, blev inkuberet 25 med sera afledt fra chimpanser på forskellige tidspunkter i løbet af akutte NANBH (Hutchinson stamme) infektioner (vandringsvejene 1-16), hepatitis A-infektioner (vandringsvejene 17-24 og 26-33) og hepatitis-B-infektioner (vandringsvejene 34-44). Vandringsvejene 25 og 45 viser positive kontroller, hvori immunoblot'ene blev inkuberet med serum fra den pågældende patient 30 til identifikation af den rekombinante klon 5-1-1 i den originale screening i Lambda-gt11 cDNA-biblioteket (se afsnit IV.A.1).

93 DK 176280 B1

Det synlige bånd i kontrolvandringsvejene, 25 og 46 i fig. 23, afspejler bindingen af antistoffer til NANBs-vrdelen af SOD-fusionspolypeptidet. Antistofferne udviser ikke binding til SOD alene, idet dette også er blevet 5 medtaget som en negativ kontrol i prøverne og ville være fremkommet som et bånd, der vandrede signifikant hurtigere end SOD-NANBs-m-fusionspolypeptidet.

Vandringsvejene 1-16 i fig. 33 viser bindingen af antistoffer i serumprøver fra 10 fire chimpanser; sera blev opnået umiddelbart forud for infektionen med NANBH og sekventielt under akut infektion. Som det ses fra figuren, manglede antistoffer, der reagerede immunologisk med SOD-NANB5-1-1 polypeptidet i serumprøver, der var opnået før indgivelse af infektiøst HCV-inokulum og under den tidlige akutte infektionsfase, medens alle fire dyr til 15 sidst inducerede cirkulerende antistoffer mod dette polypeptid i den sidste del af eller efterfølgende den akutte fase. Yderligere observerede bånd på immunoblot'ene med chimpansenumrene 3 og 4 skyldtes baggrundsbinding til værtsbakterieproteiner.

20 I modsætning til de resultater, der er opnået med sera fra chimpanser inficeret med NANBH, observeredes der ikke udvikling af antistoffer mod NANB5-i-i-delen af fusionspolypeptidet hos fire HAV-inficerede chimpanser eller tre HBV-inficerede chimpanser. Den eneste binding i disse tilfælde var baggrundsbinding til værtsbakterieproteiner, der også forekom i de HCV-25 inficerede prøver.

Karakteriseringen af de humane sera, der anvendtes til Western-blots, og resultaterne, der er vist i fotografiet af de autoradiograferede strimler, vises i fig. 34. Nitrocetlulosestrimler indeholdende polypeptider blev inkuberet med 30 sera afledt fra mennesker på forskellige tidspunkter under infektion med NANBH (vandringsvejene 1-21), HAV (vandringsvejene 33-40) og HBV (van- 94 DK 176280 B1 dringsvejene 41-49). Vandringsvejene 25 og 50 viser positive kontroller, hvori immunoblot'ene blev inkuberet med serum fra en patient, der blev anvendt i den oprindelige screening af det ovenfor beskrevne iambda-gt11-bibliotek. Vandringsvejene 22-24 og 26-32 viser "ikke-inficerede" kontroller, hvori sera 5 stammende fra "normale" bloddonorer.

Som det ses i fig. 34 indeholdt sera fra ni NANBH-patienter, herunder det til screeningen af Iambda-gt11 -biblioteket anvendte serum, antistoffer mod NANB5.M-delen af fusionspolypeptidet. Sera fra tre patienter med NANBH 10 indeholdt ikke disse antistoffer. Det er muligt, at anti-NANBs.-M-antistofferne vil udvikles på et senere tidspunkt hos disse patienter. Det er også muligt, at denne mange! på reaktion skyldtes, at det var et andet NANBV-agens, der forårsagede sygdommen hos de individer, hvorfra det ikke-responderende serum blev taget.

15

Fig. 34 viser også, at sera fra mange HAV- og HBV-inficerede patienter ikke indeholdt anti-NANBs-i-i-antistoffer, og at disse antistoffer heller ikke fandtes i sera fra "normale" kontroller. Selv om én HAV-patient {vandringsvej 36) tilsynelandende indeholder anti-NANBs_i-i-antistof, er det muligt, at denne 20 patient tidligere har været inficeret med HCV, idet NANBH-incidensen er meget høj, og idet den ofte er subklinisk.

Disse serologiske studier viser, at cDNA'et i klon 5-1-1 koder for epitoper, der genkendes specifikt af sera fra BB-NANBV-inficerede patienter og dyr. Hertil 25 kommer, at cDNA'et tilsyneladende ikke er afledt fra primatgenomet. En ud fra klon 5-1-1 eller fra klon 81 fremstillet hybridiseringsprobe hybridiserede ikke med "Southern"-blots af humant og chimpanse genomisk kontrol-DNA fra ikke-inficerede individer under betingelser, hvor enestående, enkeltkopigener kan påvises. Probeme hybridiserede heller ikke med 30 Southern-blots af bovin genomisk DNA.

95 DK 176280 B1 IV.B.4. Ekspression af polypeptidet, der er indkodet i et komposit af HCV-cDNA'erne i kloneme 36, 81 og 32.

HCV-Polypeptidet, der er indkodet i ORF'en, der strækker sig igennem 5 klonerne 36, 81 og 32, blev udtrykt som et fusionspolypeptid med SOD.

Dette blev udført ved at indsætte det kompositte cDNA, C100, i en ekspressionskassette, der indeholder det humane superoxiddismutasegen, indsætte ekspressionskassetten i en gærekspressionsvektor og udtrykke polypeptidet i gær.

10

En ekspressionskassette, der indeholder det kompositte C100 cDNA, der er afledt fra klonerne 36, 81 og 32, blev konstrueret ved at indsætte ~270pb EcoRI-fragmentet i EcroRI-stedet af vektoren pS3-56 (også kaldet pS356), der gav plasmidet pS3-56cioo- Konstruktionen af C100 er beskrevet i afsnit 15 IV.A. 16., ovenfor.

Vektoren pS3-56, der er et pBR322-derivat, indeholder en ekspressionskassette, der udgøres af ADH2/GAPDH-hybridgærpromotoren oven-strøms for det humane superoxiddismutasegen og en nedenstrøms GAPDH 20 transkriptionsterminator. En lignende kassette, der indeholder disse kontrolelementer og superoxiddismutasegenet, er blevet beskrevet i Cousens et al. (1987) og i verserende EP patentansøgning nr. 196.056, fremlagt 1. oktober 1986, der ejes i fællesskab af nærværende ansøger. Kassetten i pS3-56 adskiller sig imidlertid fra kassetten i Cousens et al.

25 (1987) ved, at det heterologe proinsulingen og immunoglobulinhængslet er deleteret, og ved at superoxiddismutasens gln145 følges af en adaptorsekvens, der indeholder et EcoRI-sted. Adaptorsekvensen er: 5’-ATT TTG GGA ATT CCA TAA TGA G -3'

30 AC CCT TAA GGT ATT ACT CAG CT

96 DK 176280 B1

EcroRI-stedet tillader insertion af hetorologe sekvenser, der, når de udtrykkes fra en vektor, der indeholder kassetten, giver polypeptider, der er fusioneret med superoxiddismutase via en oligopeptidlinker, der indeholder aminosyresekvensen 5 -asn-leu-gly-ile-arg-.

Der er den 29. april 1988 deponeret en prøve af pS356 under Budapesttraktatens betingelser hos Amerian Type Culture Collection 10 (ATCC), 12301 Parklawn Dr., Rockville, Maryland 20853, og som er blevet tildelt deponeringsnummeret 67683. Betingelserne for tilgængelighed og adgang til deponeringen og for vedligeholdelse af deponering er de samme som de i afsnit II.A. specificerede for stammer, der indeholder NANBV-cDNA'er. Denne deponering er kun foretaget af bekvemmelighedshensyn og 15 er ingen forudsætning for udførelse af den foreliggende opfindelse i betragtning af den foreliggende beskrivelse. De deponerede materialer medtages heri ved nærværende henvisning.

Efter isoleringen af rekombinanter, der indeholder C100 cDNA-insertionet 20 med den korrekte orientering, blev ekspressionskassetten, der indeholdt C100 cDNA skåret fra pS3-56Cioo med BamHI, og et fragment på ~3400bp, der indeholder kassetten, blev isoleret og oprenset. Dette fragment blev derefter indsat i BamHI-stedet i gærvektoren pAB24.

25 Plasmid pAB24, hvis signifikante træk er vist i fig. 35, er en g ærfærge vektor, der indeholder den komplette 2 micron-sekvens for replikation [Broach (1981)] og pBR322-sekvenser. Den indeholder også gær URA3-genet afledt fra plasmid YEp24 [Botstein et al (1979)] og gær LEU2d,genet afledt fra plasmid pC1/1 EPO publikationnummer 116.201. Plasmid pAB24 blev 30 konstrueret ved fordøjelse af YEp24 med EcoRI og religering af vektoren til fjernelse af de partielle 2 micron-sekvenser. Det resulterende plasmid, 97 DK 176280 B1 YEP24deltaRI, blev lineariseret ved fordøjelse med Clal og ligeret med det komplette 2 micron-plasmid, der var blevet lineariseret med Clal. Det resulterende plasmid, pCBou, blev herefter fordøjet med Xbal og 8605 bp vektorfragmentet blev gelisoleret. Det isolerede Xbal-fragment blev ligeret 5 med et 4460 pb Xbal-fragment, der indeholdt LEU2d-genet isoleret fra pCI/1; orienteringen af LEU2d-genet har samme retning som URA3-genet. Insertion af ekspressionen skete i det enestående BamHI-sted i pBR322-sekvensen, hvilket således afbrød bakterieresistensgenet mod tetracyclin.

10 Det rekombinante plasmid, der indeholdt SOD-CIOO-ekspressionskassetten, pAB24C100-3, blev transformeret ind i gærstamme JSC 308 samt i andre gærstammer. Cellerne blev transformeret som beskrevet af Hinnen et al.

(1978) og udpladet på ura-selektive plader. Enkeltkolonier blev inokuleret på leu-selektive medier og dyrket til mætning. Kulturen blev induceret til at 15 udtrykke SOD-C100-polypeptidet (kaldet C100-3) ved dyrkning i YEP indeholdende 1% glucose.

Stamme JSC 308 har genotypen MAT@, Ieu2, ura3(del), DM15 (GAP/ADR1) integreret ved ADR1-locus. I JSC 308 resulterer 20 overekspression af det positive aktivatorgenprodukt, ADR1, i hyper-derepression (i forhold til en ADR1 -vildtypekontrol) og signifikant højere udbytter af udtrykte heterologe proteiner, når sådanne proteiner syntetiseres via et ADH2 UAS reguleringssystem. Konstruktionen af gærstammen JSC 308 er beskrevet i verserende patentansøgning US nr. (Fuldmægtigs ref. nr.

25 2300-0229), der er indleveret samtidig hermed, og som medtages heri ved nærværende henvisning. En prøve af JSC 308 blev deponeret den 5. maj 1988 hos ATCC under Budapesttraktatens betingelser og er blevet tildelt deponeringsnummer 20879. Betingelserne for tilgængelighed og adgang til deponeringen og for vedligeholdelse af deponering er de samme som 30 specificeret i afsnit II.A. for stammer indeholdende HCV-cDNA'er.

98 DK 176280 B1

Det komplette C100-3 fusionspolypeptid, der er indkodet i pAB24C100-3 bør indeholde 154 aminosyrer af human SOD ved amino-terminalen, 5 aminosyrerester afledt fra den syntetiske adaptor, der indeholder EcoRI-stedet, 363 aminosyrerester, der er afledt fra C100 cDNA og 5 5 carboxyterminale aminosyrer, der er afledt fra MS2-nucleotidsekvensen, der grænser op til HCV-cDNA-sekvensen i klon 32. {Se afsnit IV.A.7.). Den formodede aminosyresekvens af dette polypeptids carboxy-terminal, som begynder ved den næstsidste Afa-rest af SOD, er vist i fig. 36; den nucleotid-sekvens, der koder for denne del af polypeptidet, er også vist.

10 IV.B.5. Identifikation af det i C100 indkodede polypeptid som et NANBH-associeret antigen C100-3 Fusionspolypeptidet, der er udtrykt fra plasmidet pAB24C100-3 i 15 gærstammen JSC 308 var karakteriseret med hensyn til størrelse, og det i C100 indkodede polypeptid blev identificeret som et NANBH-associeret antigen ved dets immunologiske reaktivitet med serum fra et menneske med kronisk NANBH.

20 C100-3 Polypeptidet, der udtryktes som beskrevet i afsnit IV.B.4. blev

analyseret som følger. JSC 308 Gærceller transformeredes med pAB24 eller med pAB24C100-3, og induceredes til at udtrykke det heterologe plasmidkodede polypeptid. De inducerede gærceller i 1 ml kultur (OD65o nm ~20) pelleteredes ved centrifugering ved 10.000 rpm i et minut og lyseredes 25 ved at hvirvel-behandle dem kraftigt (10 x 1 min.) med to volumener opløsning og et volumen glasperler (0,2 millimicron i diameter). Opløsningen indeholdt 50 mM Tris-HCI, pH 8,0, 1 mM EDTA, 1mM phenylmethyl-sulphonylfluorid (PMSF) og 1 mikrogram/ml pepstatin. Uopløseligt materiale i lysatet, der omfatter C100-3-peptidet, blev opsamlet ved centrifugering 30 (10.000 rpm i 5 min.) og opløstes ved kogning i 5 min. i Laemmli SDS

prøvepuffer. [Se Laemmli (1970)]. En polypeptidmængde, der er ækvivalent 99 DK 176280 B1 med mængden i 0,3 ml af den inducerede gærkultur, blev underkastet elektroforese gennem 10% polyakrylamidgeler i nærvær af SDS ifølge Laemmli (1979). Proteinstandarder blev co-elektroforeret på gelerne. Geler indeholdende de udtrykte polypeptider blev enten farvet med Coomassie 5 brilliant blue eller blev underkastet "Western”-blot som beskrevet i afsnit IV.B.2. under anvendelse af serum fra en patient med kronisk NANBH til bestemmelse af den immunologiske reaktivitet af de fra pAB24 og pAB24C100-3 udtrykte polypeptider.

10 Resultaterne er vist i fig. 37. I fig. 37A blev polypeptiderne farvet med Coomassie brilliant blue. Det uopløselige polypeptid (polypeptider) fra JSC 308, der var transformeret med pAB24, og fra to forskellige kolonier af JSC, der var transformeret med pAB24C100-3, er vist i vandringsvej 1 (pAB24) og vandringsvejene 2 henholdsvis 3. En sammenligning af vandringsvej 2 og 3 15 med vandringsvej 1 viser, at den inducerede ekspression af et polypeptid svarer til en molekylvægt på -54.000 daltons fra JSC 308 transformeret med pAB24C100-3, der ikke er induceret i JSC308 transformeret med pAB24.

Dette polypeptid vises ved pilen.

20 Fig. 37B viser resultaterne af Western-blots af de uopløselige polypeptider, der udtrykkes i JSC 308 transformeret med pAB24 (vandringsvej 1) eller med pAB24C100-3 (vandringsvej 2). De fra pAB24 udtrykte polypeptider var ikke immunologisk reaktive med serum fra et menneske med NANBH. Men som vist ved pilen udtrykte JSC 308 transformeret med pAB324C100-3 et 25 polypeptid på -354.000 dalton molekylevægt, der reagerede immunologisk med det humane NANBH-serum. De øvrige immunologisk reaktive polypeptider i vandringsvej 2 kan være nedbrydnings- og/eller aggregeringsprodukter af dette ca. -354.000 dalton polypeptid.

30 100 DK 176280 B1 IV.B.6. Oprensning af fusionspolypeptid C100-3

Fusionspeptidet, C100-3, der består af SOD ved N-terminalen og "in-frame” C100 HCV-polypeptid ved C-terminalen blev oprenset ved differential-5 ekstraktion af den uopløselige del af de ekstraherede værtsgærceller, hvori polypeptidet blev udtrykt.

Fusionspolypeptidet, C100-3, udtryktes i gærstamme JSC 308 transformeret med pAB24C100-3 som beskrevet i afsnit IV.B.4. Gærcellerne lyseredes 10 herefter ved homogenisering, det uopløselige materiale i iysatet ekstraheredes ved pH 12,0, og C100-3 i den resterende, uopløselige fraktion solubiliseredes i puffer, der indeholdt SDS.

Gærlysatet blev i det væsentlige fremstillet ifølge Nagahuma et al. (1984).

15 Der fremstilledes en gærcellesuspension, der bestod af 33% celler (volumen/volumen) suspenderet i en opløsning (puffer A) indeholdende 20 mM Tris HCI, pH 8,0, 1 mM dithiotreitol og 1 mM phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF). En suspensionsprøvemængde (15 ml) blev blandet med et tilsvarende volumen af glasperler (0,45 - 0,50 mm/diameter), og blandingen 20 blev hvirvelbehandlet ved højeste hastighed på en supermixer (Lab Line Instruments, Inc.) i 8 min. Homogenatet og glasperlerne separeredes, og glasperlerne blev vasket tre gange med det samme volumen af puffer A som de oprindeligt pakkede celler. Efter forening af vaskene og homogenatet opnåedes det uopløselige materiale i Iysatet ved centrifugering af 25 homogenatet ved 7.000 x g i 15 min. ved 4°C, resuspendering af pellets i puffer A svarende til 2 x volumenet af oprindeligt pakkede celler samt repelletering af materialet ved centrifugering ved 7.000 x g i 15 min. Denne vaskeprocedure blev gentaget tre gange.

30 Det uopløselige materiale fra Iysatet blev ekstraheret ved pH 12,0 som følger. Pellet blev suspenderet i puffer indeholdende 0,5 M NaCI, 1 mM

101 DK 176280 B1 EDTA, hvor det suspenderende volumen var lig med 1,8 gange de oprindeligt pakkede cellers volumen. Suspensionens pH blev justeret ved tilsætning af 0,2 volumener 0,4 M Na phosphatpuffer, pH 12,0. Efter blanding blev suspensionen centrifugeret ved 7.000 x g i 15 min. ved 4°C og 5 supernatanten fjernedes. Ekstraktionen blev gentaget to gange. De ekstraherede pellets blev vasket ved at suspendere dem i 0,5 M NaCI, 1 mM EDTA under anvendelse af et suspensionsvolumen svarende til to volumener af de oprindeligt pakkede celler, fulgt af centrifugering ved 7.000 x g i 15 min. ved 4°C.

10 C100-3 Polypeptidet i den ekstraherede pellet opløstes ved behandling med SDS. Pellets blev suspenderet i puffer A svarende til 0,9 volumen af det oprindeligt pakkede celievolumen, og 0,1 volumen af 2% SDS tilsattes. Efter at suspensionen var blevet blandet, blev den centrifugeret ved 7.000 x g i 15 15 min. ved 4°C. Den resulterende pellet blev ekstraheret yderligere tre gange med SDS. De resulterende supernatanter, der indeholdt C100-3, forenedes.

Denne procedure oprenser C100-3 mere end 10 gange fra den uopløselige fraktion af gærhomogenatet, og genvindingen af polypeptidet er større end 20 50%.

Det oprensede fusionspolypeptid blev analyseret ved polyakrylamidgel-elektroforese ifølge Laemmii (1970). På basis af denne analyse var polypeptidet mere end 80% rent og havde en tilsyneladende molekylevægt på 25 -54.000 daltons.

IV.C. Identifikation af RNA i inficerede individer, der hvbridiserer med HCV-cDNA

30 IV.C.1. Identifikation af RNA i leveren fra en chimpanse med NANBH, der

hybridiserer med HCV-cDNA

102 DK 176280 B1 RNA Fra leveren af en chimpanse, der havde NANBH, vistes at indeholde en 5 art af RNA, der hybridiserede med HCV-cDNA'et indeholdt i klon 81 ved Northern-blotting som følger.

RNA blev isoleret fra en leverbiopsi af den chimpanse, hvorfra højtiterplasmaet afledtes (afsnit iV.A.1.), under anvendelse af teknikker 10 beskrevet i Maniatis et al. (1982) ti! isolering af totalt RNA fra pattedyrsceller og til separation heraf til poly A+- og poly A'- fraktioner. RNA-Fraktionerne blev underkastet elektroforese på en formaldehyd/agarose-gel (1% vægt/volumen) og overførtes til nitrocellulose. [Maniatis et al. (1982)]. Nitrocellulosefiltrene hybridiseredes med radiomærket HCV-cDNA fra klon 15 81 (se fig. 4 angående insertionets nucleotidsekvens). Til fremstilling af den radiomærkede probe blev HCV-cDNA-insertionet, der var isoleret fra klon 81, radiomærket med 32p ved nicktranslation under anvendelse af DNA polymerase l (Maniatis et al. (1982)). Hybridiseringen foregik over 18 timer ved 42°C i en opløsning, der indeholdt 10% (vægt/volumen) dextransulfat, 20 50% (vægt/volumen) deioniseret formamid, 750 mM NaCI, 75 mM Na-citrat, 20 mM Na2HP04, pH 6,5, 0,1% SDS, 0,02% (vægt/volumen) bovin serumalbumin (BSA), 0,02% (vægt/volumen) ficoll-400, 0,02% (vægt/volumen) polyvinylpyrrolidon, 100 microgram/ml laksesperm DNA, der var behandlet ved sonikering og denatureret, og 106 CPM/ml nicktranslateret cDNA-probe.

25

Der er i fig. 38 vist et autoradiografi af det probede filter. Vandringsvej 1 indeholder 32P-mærkede restriktionsfragmentmarkører. Vandringsvejene 2-4 indeholder chimpanselever-RNA som følger: Vandringsvej 2 indeholder 30 mikrogram total RNA, vandringsvej 3 indeholder 30 mikrogram poly A-RNA 30 og vandringsvej 4 indeholder 20 mikrogram poly A+-RNA. Som vist i fig. 38 indeholder leveren af chimpansen med NANBH en heterogen population af 103 DK 176280 B1 beslægtede poly- A+-molekyler, der hybridiserer med HCV-cDNA-proben, og som forekommer at have en størrelse på fra ca. 5.000 nucleotider til ca.

11.000 nucleotider. Dette RNA, der hybridiserer med HCV-cDNA, kunne repræsentere virale genomer og/eller specifikke transkriptioner af det virale 5 genom.

Det i nedenstående afsnit IV.C.2. beskrevne eksperiment stemmer overens med den antagelse, at HCV indeholder et RNA-genom.

10 IV.C.2. Identifikation af HCV-afledt RNA i serum fra inficerede individer

Nucleinsyre blev ekstraheret fra partikler, der var isoleret fra højtiterchimpanse-NANBH-plasma som beskrevet i afsnit IV.A.1. Portioner (ækvivalent med 1 ml oprindeligt plasma) af de isolerede nukleinsyrer blev 15 resuspenderet i 20 mikroliter 50 mM Hepes, pH 7,5, 1 mM EDTA og 16 mikrogram/ml opløselig gær-RNA. Prøverne blev denatureret ved kogning i 5 min. umiddelbart efterfulgt af frysning og blev behandlet med RNase A (5 mikroliter indeholdende 0,1 mg/ml RNase A i 25 mM EDTA, 40 mM Hepes, pH 7,5) eller med DNase I (5 mikroliter indeholdende 1 enhed DNase I i 10 20 mM MgCI2, 25 mM Hepes, pH 7,5), kontrolprøver inkuberedes uden enzym.

Efter inkubation tilsattes 230 mikroliter iskold 2XSSC indeholdende 2 mikro-gram/milliliter opløselig gær-RNA, og prøverne blev filtreret på et nitrocellulosefilter. Filtrene hybridiseredes med en cDNA-probe fra klon 81, der var blevet 32P-mærket ved nicktranslation. Fig. 39 viser et autoradiografi af 25 filteret. Hybridiseringssignaler blev påvist i de DNase-behandlede prøver og kontrolprøverne (vandringsveje 2 henholdsvis 1), men blev ikke påvist i den RNase-behandlede prøve (vandringsvej 3). Idet RNase A-behandling ødelagde de fra partiklerne isolerede nukleinsyrer og DNase !-behandling ikke havde nogen effekt, tyder materialet således stærkt på, at HCV-30 genomet består af RNA.

IV.C.3. Påvisning af forstærkede HCV-nukleinsvresekvenser afledt fra HCV-

nukleinsyresekvenser i lever- og plasmaprøver fra chimpanser med NANBH

104 DK 176280 B1 HCV-Nukieinsyre, der findes i lever og plasma hos chimpanser med NANBH 5 og hos kontrolchimpanser, forstærkedes i det væsentlige ved anvendelse af polymerasekædereaktionsteknikken (PCR), der er beskrevet af Saiki et al.

(1986). Primernucieotiderne afledtes fra HCV-cDNA-sekvensen i klon 81 eller klonerne 36 og 37. De forstærkede sekvenser påvistes ved gel-elektroforese og Southern-blot, hvor der som probér anvendtes den behørige 10 cDNA oligomer med en sekvens fra området mellem, men ikke omfattende, de to primere.

RNA-Prøver, som indeholder HCV-sekvenser, der skal undersøges ved forstærkningssystemet, isoleredes fra leverbiopsier fra tre chimpanser med 15 NANBH og fra to kontroichimpanser. Isoleringen af RNA-fraktionen skete ved guanidiniumthiocyanatfremgangsmåden ifølge afsnit IV.C.1.

RNA-Prøver, der skulle undersøges ved forstærkningssystemet, blev også isoleret fra plasmaer fra to chimpanser med NANBH og fra en 20 kontrolchimpanse, såvel som fra en plasmapulje fra kontrolchimpanser. Den ene inficerede chimpanse havde et CID/ml lig med eller større end 106, og den anden inficerede chimpanse havde et CID/ml lig med eller større end 105.

25 Nukleinsyrerne blev ekstraheret fra plasmaet som følger. Enten 0,1 ml eller 0,01 ml plasma fortyndedes til et slutvolumen på 1,0 ml med en TENB/proteinase K/SDS-opløsning (0,05 M Tris-HCI, pH 8,0, 0,001 M EDTA, 0,1 M NaCI, 1 mg/ml proteinase K og 0,5% SDS) indeholdende 10 mikrogram /ml polyadenylsyre, og inkuberedes ved 37°C i 60 min. Efter 30 denne proteinase K-fordøjelse blev de resulterende plasmafraktioner

deproteiniseret ved ekstraktion med TE (10,0 mM Tris-HCI, pH 8,0, 1 mM

105 DK 176280 B1 EDTA) -mættet phenol. Phenolfasen blev separeret ved centrifugering og reekstraheredes med TENB indeholdende 0,1% SDS. De resulterende vandfaser fra hver ekstraktion blev forenet og ekstraheret to gange med et lige så stort volumen phenol/chloroform/isoamylalkohol [(1:1(99:2)] og 5 herefter to gange med et lige så stort volumen af en 99:1 blanding af chloroform/isoamylalkohol. Efter faseseparation ved centrifugering blev den vandige fase bragt til slutkoncentration på 0,2 M Na-acetat og nukleinsyrerne præcipiteredes ved tilsætning af to volumener ethanol. De præcipiterede nukleinsyrer blev fjernet ved ultracentrifugering i en SW 41 rotor ved 38 K, i 10 60 min. ved 4°C.

Udover det ovennævnte blev højtiterchimpanseplasmaet og det forenede kontrolplasma alternativt ekstraheret med 50 mikrogram poly A-bærer ved proceduren ifølge Chomcyzski og Sacchi (1987). I denne procedure 15 anvendes der en syreguanidiniumthiocyanatekstraktion. RNA Blev indvundet ved centrifugering ved 10.000 RPM i 10 min. ved 4°C i en Eppendorf mikrocentrifuge.

Forud for cDNA-syntesen i PCR-reaktionen blev i to tilfælde de fra plasma 20 ved proteinase K/SDS/phenol-metoden ekstraherede nucleinsyrer yderligere oprenset ved binding til og eiuering fra S og S Elutip-R-søjler. Udførelsen af fremgangsmåden skete i overensstemmelse med fremstillerens anvisninger.

Det som skabelon anvente cDNA til PCR-reaktionen blev afledt fra de ifølge 25 ovenstående fremstillede nukleinsyrer (enten totalnukleinsyre eller RNA).

Efter ethanolpræcipitation blev de præcipiterede nukleinsyrer tørret og resuspenderet i DEPC-behandlet, destilleret vand. Sekundære strukturer i nukleinsyrerne blev brudt ved opvarmning til 65°C i 10 min. og prøverne afkøledes omgående på is. cDNA Syntetiseredes under anvendelse af 1 til 3 30 mikrogram total chimpanse RNA fra lever eller fra nukleinsyre (eller RNA) ekstraheret fra 10 til 100 ml plasma. Der anvendtes i syntesen 106 DK 176280 B1 reverstranskriptase, og syntesen foregik i en 25 mikroliter reaktion under anvendelse af den af fremstilleren, BRL, specificerede protokol. Primerne til cDNA-syntesen varde, der også anvendtes i PCR-reaktionen som beskrevet nedenfor. Alle reaktionsblandinger til cDNA-syntese indeholdt 23 enheder 5 RNase inhibitor, RNASIN® (Fisher/Promega). Efter c-DNA-syntesen blev reaktionsblandingerne fortyndet med vand, kogt i 10 min. og hurtigt afkølet på is.

PCR-Reaktionerne blev i det væsentlige udført ifølge fremstillerens 10 anvisninger (Cetus-Perkin-Elmer) med undtagelse af tilsætningen af 1 mikrogram RNase A. Reaktionerne udførtes i et slutvolumen på 100 ml. PCR Udførtes i 35 cyklusser under anvendelse af et regime på 37°C, 72°C og 94°C.

Primerne til cDNA-syntese og til PCR-reaktionerne blev afledt fra HCV-15 cDNA-sekvenserne i enten klon 81, klon 86 eller klon 37b. (HCV-cDNA-sekvenserne i klonerne 81,36 og 37b er vist i fig. 3, 5 henholdsvis 10). De to 16-mer primeres sekvenser, afledt fra klon 81, var: 5' CAA TCA TAC CTG ACA G 3’og 20 5’ GAT ACC CTC TGC CTG A 3'.

Primerens sekvens fra klon 36 var: 5' GCA TGT CAT GAT GTA T 3’.

25

Primerens sekvens fra klon 37b var: 5' ACA ATA CGT GTG TCA C 3’.

30 I PCR-reaktionerne bestod primerparrene af enten de to 16-mere, der er afledt fra klon 81 eller 16-meren fra klon 36 og 16-meren fra klon 37b.

107 DK 176280 B1 PCR-reaktionsprodukterne blev analyseret ved separering af produkterne ved alkalisk gelelektroforese, fulgt af Southern-blot samt påvist af de forstærkede HCV-cDNA-sekvenser med en 32P-mærket intern oligonucleotid-5 probe afledt fra et område af HCV-cDNA'et, der ikke overlapper primerne.

PCR-reaktionsblandingerne blev ekstraheret med phenol/chloroform og nukleinsyrerne præcipiteret fra vandfasen med salt og ethanol. De præcipiterede nukleinsyrer opsamledes ved centrifugering og opløstes i 10 destilleret vand. Portioner af prøverne blev underkastet elektroforese på 1,8% alkaliske agarosegeler. Enkeltstrenget DNA på 60, 108 og 161 nucleotidlængder blev co-elektroforeret på gelerne som molekylvægtmarkører. Efter elektroforese blev DNA'erne i gelen overført til Biorad Zeta Probe® papir. Præhybridisering og hybridisering og vaskebetingelser var 15 som specificeret af fremstilleren (Biorad).

De til hybridiseringspåvisningen af forstærkede HCV-cDNA sekvenser anvendte prober var følgende. Når et PCR-primerpar blev afledt fra klon 81, var proben en 108-mer med en sekvens, der korresponderede med den, der 20 er lokaliseret i området mellem de to primeres sekvenser. Når PCR- primerparret blev afledt fra klonerne 36 og 37b, var proben det nick-translaterede HCV-cDNA-insertion, der er afledt fra klon 35. Primerne er afledt fra nucleotiderne 155-170 af klon 37b-insertionet og 206-268 af klon 36-insertionet. 3'-Enden af HCV-cDNA-insertionet i klon 35 overlapper 25 nucleotiderne 1-186 af insertionet i klon 36; og 5'-enden af klon 35 insertionet overlapper nucleotiderne 207-269 af insertionet i klon 37b. (Sammenlign fig. 5, 8 og 10). cDNA-Insertionet i klon 35 spænder således over en del af området mellem sekvenserne af de fra klon 36 og 37b afledte primere og er velegnede som en probe til de forstærkede sekvenser, der 30 omfatter disse primere.

108 DK 176280 B1 RNA-Analysen fra leverprøverne blev udført ifølge ovennævnte procedure under anvendelse af begge sæt primere og prober. RNA'et Fra leveren fra de tre chimpanser med NANBH gav positive hybridiseringsresultater for forstærkningssekvenser af den forventede størrelse (161 og 586 nucleotider 5 for henholdsvis 81 og 36 og 37b), medens kontrolchimpanserne gav negative hybridiseringsresultater. Samme resultater opnåedes, når eksperimentet blev gentaget tre gange.

Analyse af nukleinsyrerne og RNA fra plasma udførtes også ifølge 10 ovenstående procedure under anvendelse af primerne og proben fra klon 81. Plasmaerne stammende fra to chimpanser med NANBH, fra en kontrolchimpanse samt fra forenet plasma fra kontrolchimpanser. Begge NANBH-plasmaerne indeholdt nukleinsyre/RNA, der gav positive resultater i den PCR-forstærkede analyse, medens begge kontrolplasmaerne gav negative 15 resultater. Disse resultater er gentagent blevet opnået adskillige gange.

IV.D. Radioimmunoanalyse til påvisning af HCV-antistoffer i serum fra inficerede individer 20 Fastfase radioimmunoanalyser til påvisning af antistoffer mod HCV-antigener blev udviklet baseret på Tsu og Herzenberg (1980). Mikrotiterplader (Immulon 2, Removawell strips) belægges med oprensede polypeptider, der indeholder HCV-epitoper. De belagte plader inkuberes med enten humane serumprøver, der mistænkes for at indeholde antistoffer mod HCV-25 epitoperne, eller med passende kontroller. Under inkubering bindes det eventuelt tilstedeværende antistof immunologisk til fastfaseantigenet. Efter fjernelse af det ubundne materiale og vask af mikrotiterpladerne påvises komplekser af human antistof-NANBV-antigen ved inkubation med I-mærket fåreantihumanimmunoglobulin. Ubundet, mærket antistof fjernes ved 30 opsugning, og pladerne vaskes. Radioaktiviteten i de individuelle brønde bestemmes; mængden af bundet, humant anti-HCV-antistof er proportionalt med radioaktiviteten i brønden.

109 DK 176280 B1 IV.D.1. Oprensning af fusionspolypeptid SOD-NANBs.-m 5

Fusionspolypeptidet SOD-NANBs.-m, udtrykt i rekombinante bakterier som beskrevet i afsnit IV.B.1., blev oprenset fra den rekombinante E. coli ved differentialekstraktion af celleekstrakterne med urinstof fulgt af kromatografi på anion- og kationbyttersøjler som følger.

10 Optøede celler fra 1 liter kultur resuspenderedes i 10 ml 20% (vægt/volumen) sucrose indeholdende 0,01 M Tris HCI, pH 8,0 og der tilsattes 0,4 ml 0,5M ETDA, pH 8,0. Efter 5 minutter ved 0°C blev blandingen centrifugeret ved 4.000 x g i 10 min. Den resulterende pellet suspenderedes i 10 ml 25% (vægt/volumen) sucrose indeholdende 0,05 M Tris HCI, pH 8,0, 15 1 mM phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) og 1 mikrogram/ml pepstatin A, fulgt af tilsætning af 0,5 ml lysozym (10 mg/ml) og inkubation ved 0°C i 10 min. Efter tilsætning af 10 ml 1% (volumen/volumen) Triton X-100 i 0,05 M Tris HCI, pH 8,0, 1 mM EDTA inkuberedes blandingen i 10 min. ved 0°C under lejlighedsvis omrystning. Den resulterende, viskøse opløsning 20 homogeniseredes ved passage 6 gange gennem en steril kaliber 20 kanyle og centrifugeredes ved 13.000 x g i 25. min. Det pelletterede materiale suspenderedes i 5 ml 0,01 M Tris HCI, pH 8,0 og suspensionen centrifugeredes ved 4.000 x g i 10 min. Pelletten, der indeholdt SOD-NANB5.m-fusionsprotein, blev opløst i 5ml 6 M urinstof i 0,02 M Tris HCI, pH 8,0, 1 mM 25 dithiotreitol (puffer A) og sattes på en Q-Sepharose Fast Flow søjle ækvilibreret med puffer A. Polypeptiderne elueredes med en lineær gradient på 0,0 til 0,3 M NaCI i puffer A. Efter eluering blev fraktionerne analyseret ved polyakrylamidgelelektroforese i nærvær af SDS til bestemmelse af deres indhold af SOD-NANB5-m. Fraktioner indeholdende dette polypeptid forene-30 des og dialyseredes mod 6 M urinstof i 0,02 M natriumfosfatpuffer, pH 6,0, 1 mM dithiotreitol (puffer B). Den dialyserede prøve sattes på en S-Sepharose DK 176280 B1 110

Fast Flow søjle ækvilibreret med puffer B, og polypeptiderne elueredes med en lineær gradient på 0,0 til 0,3 M NaCI i puffer B. Fraktionen blev analyseret ved polyakrylamidgelelektroforese i nærvær af SOD-NANB5.m, og de behørige fraktioner forenedes.

5

Slutpreparationen af SOD-NANBs.-M-polypeptid blev undersøgt ved elektroforese på polyakrylamidgeler i nærvær af SDS. Baseret på denne analyse var præparationen mere end 80% ren.

10 IV-D.2. Oprensning af fusionspolypeptid SOD-NANBfii

Fusionspolypeptidet SOD-NANB8i udtrykt i rekombinante bakterier som beskrevet i afsnit IV.B.2 blev oprenset fra rekombinante E. coli ved differentialekstraktion af celleekstrakterne med urinstof fulgt af kromatografi 15 på anion- og kationbyttersøjler under anvendelse af den til isolering af fusionspolypeptid SOD-NANB5-1-1 anvendte fremgangsmåde (se afsnit IV.D.1.).

Slutpræparationen af SOD-NANBs-m polypeptid blev undersøgt ved 20 elektroforese på polyakrylamidgeler i nærvær af SDS. Baseret på denne analyse var præparationen mere end 50% ren.

IV.D.3. Påvisning af antistoffer mod HCV-epitoper ved fastfase radioimmunoanaiyse 25

Serumprøver fra 32 patienter, der fik diagnosticeret ΝΑΝΒΗ, analyseredes ved radioimmunoanaiyse (RIA) til bestemmelse af, om antistoffer mod HCV-epitoper, der er til stede i fusionspolypeptider SOD-NANB5-m og SOD-NANB81, kunne påvises.

30 111 DK 176280 B1

Mikrotiterplader blev belagt med SOD-NANBs_-m eller SOD-NANB8i, der var delvis oprenset ifølge afsnit IV.D.1. og IV.D.2. Analyserne blev udført som følger.

5 Et hundrede mikroliter portioner indeholdende 0,1 til 1,5 mikrogram SOD-NANBs.!.·, eller SOD-NANB8i i 0,125 M Na boratpuffer, pH 8,3, 0,075 NaCI (BBS) sattes til hver brønd i en mikrotiterplade (Dynatech Immulon 2 Removawell Strips). Pladen blev inkuberet ved 4°C natten over i et fugtigt kammer, hvorefter proteinopløsningen fjernedes, og brøndene vaskedes tre 10 gange med BBS indeholdende 0,02% Triton X-100 (BBST). Til forhindring af ikke-specifik binding blev brøndene belagt med bovinserumalbumin (BSA) ved tilsætning af 100 mikroliter af en 5 mg/ml opløsning af BSA i BBS fulgt af inkubation ved stuetemperatur i én time; efter denne inkubation blev BSA-opløsningen fjernet. Polypeptiderne i de belagte brønde omsattes med 15 serum ved tilsætning af 100 mikroliter serumprøver fortyndet 1:100 i 0,01 M Na-fosfatpuffer, pH 7,2, 0,15 M NaCI (PBS) indeholdende 10 mg/ml BSA og ved inkubation i serumholdige brønde i 1 time ved 37°C. Efter inkubation blev serumprøverne fjernet ved opsugning, og brøndene vaskedes 5 gange med BBST. Anti-NANB5_M og anti-NANB8i bundet til fusionspoiypeptiderne 20 blev bestemt ved bindingen af 125l-mærket F'(ab)2 fåreanti-human IgG til de belagte brønde. 100 Mikroliters portioner af den mærkede probe (specifik aktivitet 5-20 mikrocurie/mikrogram) sattes til hver brønd, og pladerne inkuberedes ved 37°C i én time fulgt af fjernelse af overskydende probe ved opsugning og vask 5 gange med BBST. Den bundne mængde aktivitet i hver 25 brønd blev bestemt ved tælling i en tæller, der påviser gammastråling.

Resultaterne af påvisningen af anti-NANBs.-M og anti-NANBgi hos individer med NANBH er anført i tabel 1.

Tabel 1 112 DK 176280 B1 Påvisning af anti-5-1-1 og anti-81 i sera fra NANB-, HAV- og HBV-hepatitispatienter 5

Patient S/N

referencenr. Diagnose Anti-5-1-1 Anti-81 1.281 Kronisk NANB, IVD2 0,77 4,20 10 Kronisk NANB, IVD 1,14 5,14

Kronisk NANB, IVD 2,11 4,05 2. 291 AVH3, NANB, sporadisk 1,09 1,05

Kronisk, NANB 33,89 11,39 15 Kronisk, NANB 36,22 13,67 3. 301 AVH, NANB, IVD 1,90 1,54

Kronisk NANB, IVD 34,17 30,28

Kronisk NANB, IVD 32,45 30,84 20 4.31 Kronisk NANB, PT4 16,09 8,05 5.321 Sen AVH NANB, IVD 0,69 0,94

Sen AVH NANB, IVD 0,73 0,68 25 6.331 AVH, NANB, IVD 1,66 1,96 AVH, NANB, IVD 1,53 0,56

Tabe! 1 (fortsat1) 113 DK 176280 B1 Påvisning af anti-5-1-1 og anti-81 i sera fra NANB-, HAV- og HBV-hepatitispatienter 5

Patient S/N

referencenr. Diagnose Anti-5-1-1 Anti-81 7. 341 Kronisk NANB, PT 34,40 7,55 10 Kronisk NANB, PT 45,55 13,11

Kronisk NANB, PT 41,58 13,45

Kronisk NANB, PT 44,20 15,48 8. 351 AVH NANB, IVD 31,92 31,95 15 Nyligt "helbredt" NANB, 6,87 4,45

AVH

9.36 Sen AVH NANB PT 11,84 5,79 20 10.37 AVH NANB, IVD 6,52 1,33 11.38 Sen AVH NANB, PT 39,44 39,18 12.39 Kronisk NANB, PT 42,22 37,54 25 13.40 AVH, NANB, PT 1,35 1,17 14.41 Kronisk NANB? PT 0,35 0,28 30 15.42 AVH, NANB, IVD 6,25 2,34 DK 176280 B1 114

Tabel 1 (fortsat) Påvisning af anti-5-1-1 og anti-81 i sera fra NANB-, HAV- og HBV-hepatitispatienter 5

Patient S/N

reference nr. Diagnose Anti-5-1-1 Anti-81 16.43 Kronisk NANB, PT 0,74 0,61 10 17.44 AVH, NANB, PT 5,40 1,83 18.45 Kronisk, NANB, PT 0,52 0,32 15 19.46 AVH, NANB 23,35 4,45 20.47 AVH, type A 1,60 1,35 21.48 AVH, type A 1,30 0,66 20 22.49 AVH, type A 1,44 0,74 23.50 Nyligt svundet AVH, 0,48 0,56

type A

25 24.51 AVH, type A 0,68 0,64

Svundet AVH, type A 0,80 0,65 25.52 Nyligt svundet AVH, type A 1,38 1,04

Nyligt svundet AVH, type A 0,80 0,65 30 DK 176280 B1 115

Tabel 1 (fortsat) Påvisning af anti-5-1-1 og anti-81 i sera fra NANB-, HAV- og HBV-hepatitispatienter 5

Patient S/N

referencen r. Diagnose Anti-5-1-1 Anti-81 26.53 AVH, type A 1,85 1,16 10 Nyligt svundet AVH, type A 1,02 0,88 27.54 AVH, type A 1,35 0,74 28.55 Sen AVH, HBV 0,58 0,55 15 29.56 Kronisk HBV 0,84 1,06 30.57 Sen AVH, HBV 3,20 1,60 20 31.58 Kronisk HBV 0,47 0,46 32. 591 AVH, HBV 0,73 0,60

Helbredt AVH, HBV 0,43 0,44 25 33. 601 AVH, HBV 1,06 0,92

Helbredt AVH, HBV 0,75 0,68 34. 611 AVH, HBV 1,66 0,61

Helbredt AVH, HBV 0,63 0,36 30

Tabel 1 (fortsat) 116 DK 176280 B1 Påvisning af anti-5-1-1 og anti-81 ί sera fra NANB-, HAV- og HBV-hepatitispatienter 5

Patient S/N

reference nr. Diagnose Anti-5-1-1 Anti-81 35. 621 AVH, HBV 1,02 0,73 10 Helbredt AVH, HBV 0,41 0,42 36. 632 3 AVH, HBV 1,24 1,31

Helbredt AVH, HBV 1,55 0,45 15 37. 641 AVH, HBV 0,82 0,79

Helbredt AVH, HBV 0,53 0,37 38. 651 AVH, HBV 0,95 0,92

Helbredt AVH, HBV 0,70 0,50 20 39.662 AVH, HBV 1,03 0,68

Helbredt AVH, HBV 1,71 1,39

Sekventielle serumprøver, der er tilgængelige fra patienterne.

25 2 IVD = Intravenøs medikamentindtager 3 AVH = Akut viral hepatitis 117 DK 176280 B1

Som det ses i tabel 1, stammede 19 ud af 32 sera fra patienter, der har fået diagnosticeret NANBH, positive med hensyn til antistoffer rettet mod HCV-epitoper, der er til stede i SOD-NANB^.i og SOD-NANB8i.

5 De positive serumprøver var imidlertid ikke lige immunologisk reaktive med SOD-NANB5.1.1 og SOD-NANBei. Serumprøver fra patient nr. 1 var positive over for SOD-NANB8i, men ikke overfor SOD-NANB5.1-1· Serumprøver fra patienterne nr. 10, 15 og 17 var positive over for SOD-NANB5-M, men ikke over for SOD-NANBei. Serumprøver fra patienterne nr. 3, 8, 11 og 12 10 reagerede ens med begge fusionspolypeptider, medens serumprøver fra patienterne nr. 2, 4, 7 og 9 havde 2-3 gange større reaktion mod SOD-NANBa.-M end mod SOD-NANB8i. Disse resultater antyder, at NANBs^.i og NANBSi kan indeholde mindst tre forskellige epitoper; det vil sige, at det er muligt, at hvert polypeptid indeholder mindst én unik epitop, og at de to 15 polypeptider deler mindst én epitop.

IV.D.4. Fastfase RIA-specificitet overfor NANBH

Fastfase RIA-specificiteten over for NANBH blev afprøvet ved at anvende 20 analysen på serum fra HAV- eller HBV-inficerede patienter og på sera fra kontrolindivider. Der anvendtes delvist oprensede SOD-NANB5.1.1 og SOD-NANBøi i analyserne, der i det væsentlige udførtes som beskrevet i afsnit IV.D.3. med den undtagelse, at sera stammende fra patienter, der tidligere havde fået diagnosticeret HAV eller HBV, eller fra individer, der var 25 bloddonorer. Resultaterne for sera fra HAV- og HBV-inficerede patienter præsenteres i tabel 1. RIA Blev afprøvet under anvendelse af 11 serumprøver fra HAV-inficerede patienter og 20 serumprøver fra HBV-inficerede patienter. Som vist i tabel 1, gav ingen af disse sera nogen positiv immunologisk reaktion med fusionspolypeptider, der indeholdt BB-NANBV-.30 epitoper.

118 DK 176280 B1

Den RIA, hvor NANBs-vi-antigenet anvendes, anvendes til at bestemme immunologisk serumreaktivitet fra kontrolindivider. Ud af 230 serumprøver opnået fra den normale bloddonorpopulation gav kun 2 positive reaktioner i RIA (resultater ikke vist). Det er muligt, at de to bloddonorer, hvorfra disse 5 serumprøver stammede, tidligere havde været udsat for HCV.

IV.D.5. NANBs-i.i.-reaktivitet i løbet af NANBH-infektion

Forekomst af anti-NANB5.M-antistoffer under en NANBH-infektion hos to 10 patienter og fire chimpanser fulgtes under anvendelse af RIA som beskrevet i afsnit IV.D.3. RIA Blev desuden anvendt til at bestemme nærvær eller fravær af anti-NANB5 1 i-antistoffer i løbet af en HAV- og HBV-infektion hos inficerede chimpanser.

15 Resultaterne, der anføres i tabel 2, viser, at der hos chimpanser og mennesker blev påvist anti-NANB5-M-antistoffer efter begyndelsen af NANBH-infektionens akutte fase. Der blev ikke påvist anti-NANB5_M-antistoffer i serumprøver fra chimpanser, der var inficeret med enten HAV eller HBV. Anti-NANB5.-M-antistoffer tjener således som markør for et 20 individs udsættelse for HCV.

Tabel 2 119 DK 176280 B1

Serokonversion i sekventielle serumprøver fra hepatitis-patienter og chimpanser under anvendelse af 5-1-1-antiqen 5

Patient/ Prøvedato (dage) Hepatitis- Anti-5-1-1 ALT

chimpanse (Q=inokuierinqsdaq) vira (S/N) (mu/ml)

Patient 29 T* NANB 1,09 1180 10 T+180 33,89 425 T+208 36,22

Patient 30 T NANB 1,90 1830 T+307 34,17 290 15 T+799 32,45 276

Chimpanse 1 0 NANB 0,87 9 76 0,93 71 118 23,67 19 20 154 32,41

Chimpanse 2 0 NANB 1,00 5 21 1,08 52 73 4,64 13 25 138 25,01

Chimpanse 3 0 NANB 1,08 8 43 1,44 205 53 1,82 14 30 159 11,87 6

Tabel 2 (fortsat) 120 DK 176280 B1

Serokonversion i sekventielle serumprøver fra hepatitis-patienter og chimpanser under anvendelse af 5-1-1-antiqen 5

Patient/ Prøvedato (dage) Hepatitis- Anti-5-1-1 ALT

chimpanse (Q=inokulerinqsdaq) vira (S/N) (mu/ml)

Chimpanse 4 -3 NANB 1,12 11 10 55 1,25 132 83 6,60 140 17,51

Chimpanse5 0 HAV 1,50 4 15 25 2,39 147 40 1,92 18 268 1,53 5

Chimpanse 6 -8 HAV 0,85 20 15 - 106 41 0,81 10 129 1,33

Chimpanse 7 0 HAV 1,17 7 25 22 1,60 83 115 1,55 5 139 1,60

Tabel 2 (fortsat) 121 DK 176280 B1

Serokonversion i sekventielle serumprøver fra hepatitis-patienter og chimpanser under anvendelse af 5-1-1-antigen 5

Patient/ Prøvedato (dage) Hepatitis- Anti-5-1-1 ALT

chimpanse (0=inokulerinqsdaci) vira (S/N) (mu/ml)

Chimpanse 8 0 HAV 0,77 15 10 26 1,98 130 74 1,77 8 205 1,27 5

Chimpanse 9 -290 HBV 1,74 15 379 3,29 9 435 2,77 6

Chimpanse 10 0 HBV 2,35 8 111-118 2,74 96-156 20 (pulje) (pulje) 205 2,05 9 240 1,78 13

Chimpansen 0 HBV 1,82 11 25 28-56 1,26 8-100 (pulje) (pulje) 169 .9 223 0,52 10 30 *T = Første prøvedag 122 DK 176280 B1 IV.E. Oprensning af polyklonale serumantistoffer mod NANBs.-m På basis af SOD-NANB^., polypeptidets specifikke immunologiske 5 reaktivitet med anti-stofferne i serumprøver fra patienter med NANBH blev der udviklet en metode til at oprense serumantistoffer, der reagerer immunologisk med epitopen (epitoperne) i ΝΑΝΒ5.ι-ι- I denne metode anvendes affinitetskromatografi. Oprenset SOD-NANBs-M-polypeptid (se afsnit IV.D.1.) blev fæstnet til et uopløseligt underlag; fæstningen er således, 10 at det immobiliserede polypeptid bibeholder sin affinitet for antistof mod NANB5-1.1. Antistof i serumprøver absorberes til det matrixbundne polypeptid.

Efter vask til fjernelse af ikke-specifikt, bundne materialer og ubundne materialer frigøres det bundne antistof fra det bundne SOD-HCV-polypeptid ved pH-ændring og/ellerved chaotrope midler, f.eks. urinstof.

15

Nitrocellulosemembraner, der indeholder bundne SOD-NANB5--m blev fremstillet som følger. En nitrocellulosemembran, 2,1 cm Sartorius på 0,2 pm (micron) porestørrelse, vaskedes i tre minutter tre gange med BBS. SOD-NANB5-1-1 Blev bundet til membranen ved inkubation af den oprensede 20 preparation i BBS ved stuetemperatur i to timer; alternativt blev den inkuberet ved 4°C natten over. Opløsningen indeholdende ubundet antigen fjernedes, og filteret vaskedes tre gange med BBS i tre minutter pr. vask. De resterende aktive steder på membranen blev blokeret med BSA ved inkubation med en 5 mg/ml BSA-opløsning i 30 min. Overskydende BSA blev 25 fjernet ved at vaske membranen fem gange med BBS og tre gange med destilleret vand. Membranen indeholdende det virale antigen og BSA blev herefter behandlet med 0,5 M glycinhydrochlorid, pH 2,5, 0,10 M NaCI (GlyHCI) i 15 min., fulgt af vask tre gange å tre minutter hver med PBS.

30 Polyklonale anti-NANB5_i-rantistoffer blev isoleret ved at inkubere membranerne, der indeholder fusionspolypeptidet, med serum fra et individ 123 DK 176280 B1 med NANBH i to timer. Efter inkubationen blev filteret vasket 5 gange med BBS og to gange med destilleret vand. Bundne antistoffer blev herefter elueret fra hvert filter med 5 GlyHCI-elueringer med tre minutter pr. eluering. Eluaternes pH blev justeret til pH 8,0 ved at opsamle hvert eluat i et 5 reagensglas, der indeholder 2,0 M Tris HCI, pH 8,0. Indvinding af anti-NANB5.i-i-antistoffet efter affinitetskromatografi erca. 50%.

Nitrocellulosemembranerne indeholdende det bundne, virale antigen kan anvendes flere gange uden nævneværdigt fald i bindingskapacitet. Til 10 genbrug af membranerne, efter at antistofferne er blevet elueret, vaskes membranerne med BBS tre gange i tre minutter. De opbevares herefter i BBS ved 4°C.

IV.F. Indfangning af HCV-partikler fra inficeret plasma under anvendelse af 15 oprensede, humane, polyklonaie anti-HCV-antistoffer; hybridisering af

nukleinsyren i de indfangede partikler med HCV-cDNA

IV.F.1, Indfangning af HCV-partikler fra inficeret plasma under anvendelse af polyklonaie human anti-HCV-antistoffer 20

Protein-nukleinsyrekomplekser, der er tilstede i infektiøst plasma fra en chimpanse med NANBH, blev isoleret under anvendelse af polyklonaie human anti-HCV-antistoffer, der var bundet til polystyrenperler.

25 Polyklonaie anti-NANBs-M-antistoffer blev oprenset fra serum fra et menneske med NANBH under anvendelse af SOD-HCV-polypeptidet, der er indkodet i klon 5-1-1. Oprensningsmetoden var den i afsnit IV.E. beskrevne.

De oprensede anti-NANBs-M-antistoffer blev bundet til polystyrenperler (6,1 30 mm diameter, spejlende overfladebehandling, Precision Plastic Ball Co., Chicago, Illinois) ved at inkubere hver ved stuetemperatur natten over med 1 124 DK 176280 B1 ml antistoffer (1 mikrogram/ml i boratpuffer-saltopløsning, pH 8,5). Efter inkubation natten over blev perlerne vasket en gang med TBST (50 mM Tris-HCI, pH 8,0, 150 mM NaCI, 0,05% (volumen/volumen) Tween 20) og herefter med phosphatpuffersaltopløsning (PBS) indeholdende 10 mg/ml BSA.

5

Kontrolperler blev fremstillet på samme måde med den undtagelse, at de oprensede anti-NANBs^.i antistoffer udskiftedes med total human immunoglobulin.

10 Indfangning af HCV fra NANBH-inficeret chimpanseplasma under anvendelse af anti-NANBs.!^ antistoffer bundet til perler opnåedes som følger. Det anvendte plasma fra en chimpanse med NANBH er beskrevet i afsnit IV.A.1..

En portion (1 ml) af det NANBV inficerede chimpanseplasma blev inkuberet i 3 timer ved 37°C med hver af 5 perler, der er belagt med enten 15 anti-NANB5.M antistoffer eller med kontrolimmunoglobuliner. Perlerne blev vasket 3 gange med TBST.

IV.F.2. Hybridiserinq af nukleinsyren i de indfangede partikler med NANBV-cDNA

20

Den nukleinsyrekomponent, der blev frigjort fra de partikler, der var indfanget med anti-NANB5-i.i antistoffer, blev analyseret for hybridisering med HCV-cDNA, der er afledt fra klon 81.

25 HCV Partikler blev indfanget fra NANBH-inficeret chimpanseplasma som beskrevet i IV.F.1. Til at frigøre nukleinsyrerne fra partiklerne blev de vaskede perler inkuberet i 60 min. ved 37°C med 0,2 ml pr. perle af en opløsning, der indeholder proteinase k (1 mg/ml), 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 10 mM EDTA, 0,25% (w/v) SDS, 10 mikrogram/ml opløselig gær RNA, og 30 supernatantopløsningen blev fjernet. Supernatanten blev ekstraheret med phenol og chloroform, og nukleinsyrerne præcipiterede med ethanol natten 125 DK 176280 B1 over ved -20°C. Nukleinsyrepræcipitatet blev opsamlet ved centrifugering, tørret og opløst i 50 mM Hepes, pH 7,5. Dublet-portioner af de opløselige nukleinsyrer fra prøverne opnået fra de med anti-NANBs-M antistofbelagte perler og med kontrolperler indeholdende total human immunoglobulin blev 5 filtreret på nitrocellulosefiltre. Filtrene blev hybridiseret med en 32P-mærket nick-translateret probe, fremstillet fra det oprensede HCV-cDNA fragment i klon 81. Metoderne til fremstilling af proben og til hybridisering er beskrevet i afsnit IV.C.1..

10 Autoradiografier af et probefilter, der indeholder nukleinsyrerne fra partikler, der er indfanget med perler indeholdende anti-NANBs.M antistoffer, er vist i fig. 40. Det ved anvendelse af anti-NANB5.M antistoffet opnåede ekstrakt (A1A2) gav klare hybridiseringssignaler i forhold til kontrolantistofekstraktet (A3,A4) og i forhold til kontrolgær RNA (Bi,B2). Standarder bestående af 1pg, 15 5pg og 10pg af det oprensede klon 81 cDNA fragment er vist i henholdsvis C1 til 3.

Resultaterne påviser, at de fra NANBH plasma ved anti-NANBs.-M antistoffer indfangede partikler indeholder nukleinsyre, der hybridiserer med HCV-cDNA 20 i klon 81 og dermed tilvejebringer yderligere bevis for, at cDNAerne i disse kloner er afledt fra det ætiologiske agens for NANBH.

IV.G- Immunologisk reaktivitet af C100-3 med oprensede anti-NANBs.1-1 antistofferne 25

Den immunologiske reaktivitet af C100-3 fusionspolypeptid med anti-NANB5 μ antistoffer blev bestemt ved en radioimmunoanalyse, hvori antigenerne, der var bundet til en fast fase, blev udfordret med oprenset anti-NANB5.-M antistoffer og antigen-antistofkomplekset blev påvist med 125l-mærket fåre 30 anti-human antistoffer. Den immunologiske reaktivitet af C100-3 polypeptid blev sammenlignet med reaktiviteten af SOD-NANB5.M antigen.

126 DK 176280 B1

Fusionspolypeptidet C100-3 blev syntetiseret og oprenset som beskrevet i henholdsvis afsnit IV.B.5. og i afsnit IV.B.6.. Fusionspolypeptidet SOD-NANB5.M blev syntetiseret og oprenset som beskrevet i afsnit IV.B.1. henholdsvis afsnit IV.D.1. Oprensede anti-NANB5_-M antistoffer blev opnået 5 som beskrevet i afsnit iV.E.

Et hundrede mikroliter portioner indeholdende varierende mængder af oprenset C100-3 antigen i 0,125M Na-boratpuffer, pH 8,3, 0.075M NaCI (BBS) sattes til hver brønd i en mikrotiterplade (Dynatec Immulon 2 10 Removawell Strips). Pladen blev inkuberet ved 4°C natten over i et fugtigt kammer, hvorefter proteinopløsningen fjernedes og brøndene vaskedes 3 gange med BBS, der indeholdt 0,02% Triton X-100 (BBST). Forat forhindre ikke-specifik binding blev brøndene belagt med BSA ved tilsætning af 100 mikroliter af en 5 mg/ml opløsning af BSA i BBS fulgt af inkubation ved 15 stuetemperatur i en time, hvorefter overskydende BBS opløsning fjernedes. Polypeptiderne i de belagte brønde blev omsat med oprenset anti-NANB^-i antistoffer ved tilsætning af 1 mikrogram antistof/brønd og inkubation af prøverne i en time ved 37°C. Efter inkubation blev overskydende opløsning fjernet ved opsugning, og brøndene blev vasket 5 gange med BBST. Anti-20 NANB5.V1 bundet til fusionspolypeptiderne blev bestemt ved bindingen af 125l-mærket F'(ab)2 fåre anti-human IgG til de belagte brønde. Portioner på 100 mikroliter af den mærkede probe (specifik aktivitet 5-20 mikrocuries/mikrogram) sattes til hver brønd og pladerne blev inkuberet ved 37°C i en time fulgt af fjernelse af overskydende probe ved opsugning og 5 25 gange vask med BBST. Den bundne mængde af radioaktivitet i hver brønd blev bestemt ved tælling i en tæller, der påviser gammastråling.

Resultaterne af den immunologiske reaktivitet af C100 med oprenset anti-NANB5.M sammenlignet med reaktivitet af NANB^.-, med de oprensede 30 antistoffer, er vist i tabel 3.

127 DK 176280 B1

Tabel 3

Immunologisk reaktivitet af C100-3 sammenlignet med NANB5--m ved radioimmunoanalyse 5 RIA (cpm/analyse) AG(nq) 400 320 240 160 60_0 NANB5-1-1 7332 6732 4954 4050 3051 57 10 C100-3 7450 6985 5920 5593 4096 67

Resultaterne i tabel 3 viser, at anti-NANB5-i-i genkender en epitop (epitoper) i C100-delen af C100-3 polypeptid. NANB5-1-1 Og C100 deler derfor en fælles 15 epitop (epitoper). Resultaterne antyder, at den cDNA sekvens, der koder for denne NANBV epitop (epitoper) er tilstede i både klon 5-1-1 og i klon 81.

iV.H. Karakterisering af HCV

20 IV.H.1. Karakterisering af HCV qenomets strenqethed HCV genomet blev karakteriseret med hensyn til dets strengethed ved isolering af nukleinsyrefraktionen fra indfangede partikler på anti-NANBs.^ antistofbelagte polystyrenperler og bestemmelse af, om den isolerede 25 nukleinsyre hybridiserede med plus- og/eller minusstrenge af HCV-cDNA.

Partikler blev indfanget fra HCV inficeret chimpanseplasma under anvendelse af polystyrenperler belagt med immunooprenset anti-NANBs^.-i antistof som beskrevet i afsnit IV.F.1.. Partiklernes nukleinsyrebestanddel 30 blev frigivet under anvendelse af metoden beskrevet i afsnit IV.F.2. Portioner af den isolerede genomiske nukleinsyre, der var ækvivalent med 3 ml 128 DK 176280 B1 højtiterplasma blev blottet på nitrocellulosefiltre. Som kontroller blev portioner af denatureret HCV-cDNA fra klon 81 (2 picogram) også blottet på de samme filtre. Filtrene blev probet med 32P-mærket blanding af plus- eller blanding af minusstrenge af enkeltstreget DNA, der var klonet fra HCV-5 cDNAer; cDNAerne blev afskåret fra klonerne 40b, 81 og 25c.

De enkeltstrengede prober blev opnået ved at afskære HCV-cDNAerne fra klonerne 81,40b og 25c med EcoRI, og kloning af cDNA fragmenterne i M13 vektorer, MP18 og MP19 [Messing(1983)]. M13 Klonerne blev sekvenseret til 10 bestemmelse af, om de indeholdt plus- eller minusstrengene af DNA afledt fra HCV-cDNAerne. Sekvensering skete ved dideoxykædeterminerings-metoden ifølge Sanger et al. (1977).

Hvert sæt af filtre i to eksemplarer indeholdende portioner af HCV genomet, 15 der er isoleret fra de indfangede partikler, blev hybridiseret med enten pluseller minusstreng-prober afledt fra HCV-cDNAerne. Fig. 41 viser de autoradiografier, der opnås fra probning af NANBV genomet med blandingen af prober, der er afledt fra klonerne 81, 40b og 25c. Denne blanding blev anvendt til at forøge hybridtseringsanalysens følsomhed. Prøverne i panel I 20 blev hybridiseret med plusstreng-probeblandingen. Prøverne i panel II blev probet ved hybridisering med minusstreng-probeblandingen. Sammensætningen af prøverne i immunoblotpanelerne anføres i tabel 4.

129 DK 176280 B1

Tabel 4

A B

Vandringsvej 5 1 HCV-genom 2 10 3 * cDNA 81 4 — cDNA 81 * er en ubeskrevet prøve.

15

Som det fremgår af resultaterne i fig. 41 hybridiserer kun minusstreng DNA proben med det isolerede HCV genom. Dette resultat i kombination med det resultat, der viser, at genomet er følsomt overfor RNase og DNase ( se afsnit IV.C.2.), antyder, at NANBV genomet er positivt strenget RNA.

20

Disse data og data fra andre laboratorier vedrørende de fysisk/kemiske egenskaber af et eller flere formodede NANBV (NANBV'er) er i overensstemmelse med den mulighed, at HCV er et medlem af flaviviridae. Muligheden for, at HCV repræsenterer en ny klasse af virale agenser, er imidlertid 25 ikke udelukket.

IV-H.2. Påvisning af sekvenser i indfangede partikler, der når de forstærkes med PCR. hybridiserer med HCV-cDNA afledt fra klon 81 30 RNAet i indfangede partikler blev opnået som beskrevet i afsnit IV.H.1. Analysen for sekvenser, der hybridiserer med HCV-cDNA afledt fra klon 81, 130 DK 176280 B1 blev udført under anvendelse af PCR forstærkningsproceduren som beskrevet i afsnit IV.C.3, med den undtagelse, at hybridiseringsproben var et kinasebehandlet oligonucleotid afledt fra klon 81 cDNA sekvensen. Resultaterne viste, at de forstærkede sekvenser hybridiserer med den fra 5 klon 81 afledte HCV-cDNA probe.

IV.H.3. Homoloqi mellem Dengue flavivirus ikke-strukturel protein (MNWWVD1) og HCV poiypeptiderne, der er indkodet i den kombinerede ORF af klonerne 14i til 39c 10

De kombinerede HCV-cDNA’er i klonerne 14i til 39c indeholderen kontinuert ORF som vist i fig. 26. Det deri indkodede polypeptid blev analyseret for sekvenshomologi med det/de ikke-strukturelle polypeptidområder i Dengue flavivirus (MNWVD1). I analysen anvendtes Dayhoff proteindatabasen og 15 den udførtes på computer. Resultaterne er anført i fig. 42, hvor symbolet (:) viser en eksakt homologi, og symbolet (.) viser en konservativ udskiftning i sekvensen; stregerne viser indskudte ophold i sekvensen til opnåelse af de største homologier. Som set fra figuren er der signifikant homologi mellem den i HCV-cDNAet indkodede sekvens og Dengue virusets ikke-struktur 20 polypeptid(er). Ud over den i fig. 42 viste homologi indeholdt analysen af det i området mod 3'-enden af cDNA'et indkodede polypeptidsegment også sekvenser, der er homologe med sekvenser i Dengue polymerasen. Det har betydning, at den anerkendte Gly-Asp-Asp (GDD) sekvens, der menes at være væsentlig for RNA-afhængige RNA polymeraser, er fundet at være 25 indeholdt i det i HCV-cDNA indkodede polypeptid med en lokalisering, der er i overensstemmelse med lokaliseringen i Dengue 2 virus. (Resultater ikke vist).

30 131 DK 176280 B1 IV.H.4. HCV-DNA kan ikke påvises i NANBH inficeret væv I to typer undersøgelser tilvejebringes der resultater, der antyder, at HCV-DNA ikke kan påvises i væv fra et individ med NANBH. Disse resultater 5 sammenholdt med de i IV.C og IV.H.1. og IV.H.2. beskrevne tilvejebringer vidnesbyrd om, at HCV ikke er et DNA indeholdende virus, og at replikation heraf om ikke involverer cDNA.

IV.H.4.a. Southern-blot procedure 10

For at bestemme om NANBH-inficeret chimpanselever indeholder påviseligt HCV-DNA (eller HCV-cDNA), blev restriktionsenzym DNA-fragmenter, der var isoleret fra denne kilde, Southern-blottet, og blottene blev probet med 32P-mærket HCV-cDNA. Resultaterne viste, at det mærkede HCV-cDNA ikke 15 hybridiserede med det blottede DNA fra den inficerede chimpanselever. Det hybridiserede heller ikke med kontrolblottet DNA fra normal chimpanselever.

I en positiv kontrol hybridiserede en mærket probe af beta-interferon genet derimod stærkt med Southern-blots af restriktionsenzymfordøjet human placental DNA. Disse systemer blev konstrueret for at påvise en enkelt kopi af 20 det gen, der skulle påvises med den mærkede probe.

DNA'er blev isoleret fra leveren fra to chimpanser med NANBH. Kontrol DNA’er blev isoleret fra ikke-inficeret chimpanselever og fra human placentaer. Proceduren til ekstraktion af DNA udførtes i det væsentlige ifølge 25 Maniatis et al. (1982), og DNA prøverne blev behandlet med RNAse under isoleringsproceduren.

Hver DNA prøve blev behandlet med enten EcoRI, Mbol eller Hindi (12 mikrogram) ifølge fremstillerens anvisninger. De fordøjede DNA'er blev 30 elektroforeret på 1% neutral agarose geler, Southern-blottet på nitrocellulose og det blottede materiale blev hybridiseret med den behørigt nick- 132 DK 176280 B1 translaterede probe cDNA (3 x 106 cpm/ml hybridiseringsmix). DNA'et Fra inficeret chimpanselever og normal lever blev hybridiseret med 32P-mærket HCV-cDNA fra klonerne 36 plus 81; DNA'et Fra human placenta blev hybridiseret med 32P-mærket DNA fra beta-interferon genet. Efter 5 hybridisering blev blottene vasket under stringente betingelser, dvs. med en opløsning indeholdende 0,1 x SSC, 0,1% SDS ved 65°C.

Beta-interferon gen DNA'et blev fremstillet som beskrevet af Houghton et al (1981).

10 IV.H.4.b. Forstærkning ved PCR-teknikken

For at bestemme om HCV-DNA kan påvises i lever fra chimpanser med NANBH, blev DNA isoleret fra vævet og underkastet PCR teknikken ti! 15 påvisning af forstærkning under anvendelse af primere og probe-polynucleotider afledt fra HVC-cDNA fra klon 81. Som negative kontroller anvendtes DNA prøver isoleret fra ikke-inficeret HepG2 vævskulturceller og fra formodet ikke-inficeret human placenta. Som positive kontroller anvendtes prøver af de negative kontrol DNA'er, hvortil der sattes en kendt 20 relativt lille mængde (250 molekyler) af HCV-cDNA insertionet fra klon 81.

Til bekræftelse af, at RNA fraktioner isoleret fra de samme levere af chimpanser med NANBH indeholdt komplementære sekvenser til HCV-cDNA proben, blev desuden PCR-systemet til påvisning af forstærkning også 25 anvendt på de isolerede RNA prøver.

I studierne blev DNA'erne isoleret ved den i afsnit IV.H.4.a beskrevne procedure, og RNA'er blev ekstraheret i det væsentlige som beskrevet af Chirgwin et al. (1981).

30 133 DK 176280 B1 PNA-Prøver blev isoleret fra to inficerede chimpanselevere, fra ikke-inficeret hepG2 celler og fra human placenta. Et mikrogram af hvert DNA blev fordøjet med Hindlll ifølge fremstillernes anvisninger. De fordøjede prøver blev underkastet PCR-forstærkning og påvisning af forstærket HCV-cDNA i 5 det væsentlige som beskrevet i afsnit IV.C.3. med den undtagelse, at reverstranscriptase-trinnet blev udeladt. PCR-primerne og proben kom fra HCV-cDNA klon 81 og er beskrevet i afsnit IV.C.3.. Forud for forstærkningen blev for positiv kontrol en mikrogram prøve af hvert DNA "spiddet" ved tilsætning af 250 molekyler HCV-cDNA insertion, der er isoleret fra klon 81.

10

For at bestemme om HCV sekvenser var tilstede i RNA isoleret fra leveren af chimpanser med NANBH, blev prøver indeholdende 0,4 mikrogram total RNA underkastet forstærkningsproceduren i det væsentlige som beskrevet i afsnit IV.C.3. med den undtagelse, at reverstranscriptasen blev udeladt fra 15 nogle af prøverne som negativ kontrol. PCR-Primerne og proben kom fra HCV-cDNA klon 81 som beskrevet ovenfor.

Resultaterne viste, at forstærkede komplementære sekvenser til HCV-cDNA proben ikke kunne påvises i DNA'erne fra inficeret chimpanselever, og de 20 kunne heller ikke påvises i de negative kontroller. Tværtimod blev klon 81 sekvensen påvist i alle positive kontrolprøver, når prøverne, omfattende DNAet fra inficeret chimpanselever, blev "spiddet" med HCV-cDNA'et forud for forstærkning. I RNA undersøgelserne blev forstærkede HCV-cDNA klon 81 sekvenser desuden kun påvist, når reverstranscriptase anvendtes, hvilket 25 stærkt antyder, at resultaterne ikke skyldtes en DNA kontamination.

Resultaterne viser, at hepatocytter fra chimpanser med NANBH indeholder ingen eller ikke-påviselige niveauer af HCV-cDNA. Baseret på "spidnings"studiet forekommer det eventuelt tilstedeværende HCV-DNA, i et 30 niveau, der ligger langt under 0,06 kopier pr. hepatocyt. I modsætning hertil 134 DK 176280 B1 blev HCV sekvenserne i total RNA fra samme leverprøver umiddelbart påvist med PCR-teknikken.

IV.I- ELISA-bestemmelse af HCV infektion under anvendelse af HCV C100-5 3 som test antigen

Alle prøver blev analyseret under anvendelse af HCV C100-3 ELISA. I denne analyse anvendes der HCV C100-3 antigenet (der blev syntetiseret og oprenset som beskrevet i afsnit IV.B.5) og et peberrodsperoxidase (HRP)-10 konjugat af musemonoklonal anti-human IgG.

Plader belagt med HCV C100-3 antigenet blev fremstillet som følger. En opløsning indeholdende belægningspuffer (50mM Na-borat, pH 9,0), 21 ml-plade, BSA (25 mikrogram/ml), C100-3 (2,50 mikrogram/ml) blev fremstillet 15 umiddelbart forud for tilsætning til Removawell Immulon I pladerne (Dynatech Corp.). Efter blanding i 5 minutter sattes 0,2 ml/brønd af opløsningen til pladerne, de dækkedes til og inkuberedes i 2 timer ved 37°C, hvorefter opløsningen blev fjernet ved opsugning. Brøndene blev vasket en gang med 400 mikroliter vaskepuffer (100 mM natriumfosfat, pH 7,4, 140 20 mM natriumklorid, 0,1% (W/V) kasein, 1% (W/V) Triton x-100, 0,01% (W/V) Thimerosal). Efter fjernelse af vaskeopløsningen tilsattes 200 mikroliter/brønd Postcoat opløsning (10 mM natriumfosfat, pH 7,2, 150 mM natriumchlorid, 0,1% (w/v) kasein og 2 mM phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), pladerne blev dækket løst til at forhindre fordampning og de fik lov 25 til at henstå ved stuetemperatur i 30 minutter. Indholdet af brøndene blev herefter opsuget for at fjerne opløsningen og frysetørret natten over uden hyldeopvarmning. De preparede plader kan opbevares ved 2-8°C i forseglede aluminiumsposer.

30 Til udførelse af ELISA bestemmelsen sattes 20 miokroliter serumprøve eller kontrolprøve til en brønd, der indeholder 200 mikroliter prøvefortynder (100 135 DK 176280 B1 mM natriumphosphat, pH 7,4, 500 mM natriumchlorid, 1 mM EDTA, 0,1% (W/V) kasein, 0,015 (W/V) therosal, 1% (W/V) triton x-100, 100 mikrogram/ml gærekstrakt). Pladerne forsegledes og inkuberedes ved 37°C i 2 timer, hvorefter opløsningen blev fjernet ved opsugning og brøndene blev 5 vasket med 400 mikroliter vaskepuffer (phosphatpuffer saltopløsning (PBS) indeholdende 0,05% Tween 20). De vaskede brønde blev behandlet med 200 mikroliter muse anti-human IgG-HRP konjugat, der indeholdtes i en opløsning af Ortho konjugatdiluent (10mM natriumphosphat, pH 7,2, 150 mM natriumclorid, 50% (W/V) bovin fosterserum, 1% (W/V) varmebehandlet 10 hesteserum, 1 mM K3Fe(CN)6, 0,05% (W/V) Tween 20, 0,02% (W/V) thimerosal). Behandlingen varede en time ved 37°C og opløsningen blev fjernet ved opsugning og brøndene blev vasket med vaskepuffer, der også blev fjernet ved opsugning. Tii bestemmelse af mængden af bundet enzym-konjugat tilsattes 200 mikroliter substratopløsning (10 mg o-phe-15 nylendiamindihydrochlorid pr. 5 ml fremkalderopløsning). Fremkalderopløsning indeholder 50 mM natriumcitrat justeret til pH 5,1 med phosphorsyre og 0,6 mikroliter/ml 30% H202. Pladerne, der indeholder substratopløsningen, blev inkuberet i mørke i 30 minutter ved stuetemperatur, reaktionerne blev stoppet ved tilsætning af 50 mikroliter/ml 4N 20 svovlsyre, og OD'erne bestemtes.

De nedenfor tilvejebragte eksempler viser, at mikrotiterplade ELISA-screening, der gør brug af HCV C100-3 antigen, har en høj specificitetsgrad som vist ved en initiel reaktivitetsprocent på ca. 1% med en 25 gentagereaktionsprocent på ca. 0,5% på tilfældige donorer. Ved analysen kan den påvises en immunoreaktion i både den postakutte infektionsfase og under den kroniske sygdomsfase. Desuden er analysen i stand til at påvise nogle prøver, der har negativ scoring i surrogattestene for NANBH; prøverne kommer fra individer med NANBH historie eller fra donorer, der er impliceret i 30 NANBH overførsel.

136 DK 176280 B1 i de nedenfor beskrevne eksempler anvendes følgende forkortelser: ALT Alaninaminotransferase

Anti-HBc Antistof mod HBc 5 Anti-HBsAg Antistof mod HBsAg HBc Hepatitis B kerneantigen ABsAg Hepatitis B overfladeantigen

IgG Immunoglobulin G

IgM Immunoglobulin M

10 IU/L Internationale enheder/liter NA Ikke tilgængelig NT Ikke testet N Prøvestørrelse

Neg Negativ 15 OD Optisk densitet os Positiv S/CO Signal/grænse (engelsk: cutoff) SD Standard afvigelse .v Gennemsnit eller middel 20 WNL Indenfor normale grænser IV.1.1. HCV infektion i en population af tilfældige bloddonorer

En gruppe af 1056 prøver (friske sera) fra tilfældige bloddonorer blev 25 fremskaffet fra Irwin Memorial Blood Bank, San Franscisco, Californien. De med disse prøver opnåede forsøgsresultater opsummeres i et histogram, der viser OD værdiernes fordeling (fig. 43). Som det ses i fig. 43, viser 4 prøver værdier >3, 1 prøve viser værdier på mellem 1 og 3, 5 prøver viser værdier mellem 0,4 og 1 og de resterende 1046 prøver viser værdier <0,4 og over 30 90% af disse prøver viser værdier <0,1.

137 DK 176280 B1

Resultaterne af de reaktive tilfældige prøver vises i tabel 5. Ved anvendelse af en grænseværdi (engelsk: cutoff value) lig med middelværdien plus 5 standardafvigelser var 10 prøver ud af de 1056 (0,95%) initielt reaktive. Af disse var 5 prøver (0,47%) gentagent reaktive, da de blev analyseret anden 5 gang under anvendelse af ELISA. Tabel 5 viser også ALT- og anti-HBc statusen for hver af de gentagent reaktive prøver. Navnlig det faktum, at alle 5 gentagent reaktive prøver var negative i begge surrogattests for NANBH, mens de reagerede positivt i HCV-ELISA, er interessant.

138 DK 176280 B1

Tabel 5

Resultater af reaktive tilfældige prøver 5 N = 1051 i =0,0491 SD = ± 0,074

Grænseværdi: ,y + 5SD = 0,419 (0,400 + negativ kontrol) 10

Initielt Gentagent reaktive reaktive Αη^

Prøver OD OD ALT2 HBc3 (IU/L) (OD)

15 4227 0,462 0,084 NA NA

6292 0,569 0,294 NA NA

6188 0,699 0,326 NA NA

6157 0,735 0,187 NA NA

6277 0,883 0,152 NA NA

20 6397 1,567 1,392 30,14 1 433 6019 >3,000 >3,000 46,48 057 6651 >3,000 >3,000 48,53 1 343 6669 >3,000 >3,000 60,53 1 165 4003 >3,000 3,000 WNL4 Negativ 25 10/1056=0,95% 5/1056=0,47%

Prøver, der viser vædier >1,5 blev ikke medtaget i udregningen af middelværdien og SD

2 ALT =68 IU/L er over normale grænser.

3 30 3 Anti-HBc =0,535 (kompetitiv analyse) anses for at være positiv.

4 WNL: Indenfor normale grænser.

139 DK 176280 B1 IV.i.2. Chimpanse-serum-prøver

Serumprøver fra 11 chimpanser blev testet med HCV C100-3 ELISA. Fire af 5 disse chimpanser inficeredes med NANBH fra en kontamineret faktor VIII batch (formodentlig Hutchinson stamme) ifølge en etableret procedure i samarbejde med Dr. Daniel Bradley fra Centers for Disease Control. Fire andre chimpanser biev som kontroller inficeret med HAV og tre med HBV.

Der biev opnået serumprøver på forskellige tidspunkter efter infektion.

10

De i tabel 6 opsummerede resultater viser dokumenteret antistof-serokonversion hos alle chimpanser, der er inficeret med Hutchinson stammen af NANBH. Efter den akutte infektionsfase (som vist ved den signifikante stigning og efterfølgende tilbagevenden til normal af ALT-15 niveauer) kunne antistoffer mod HCV C100-3 påvises i sera af de 4/4 NANBH inficerede chimpanser. Som omtalt i afsnit IV.B.3. har 3 prøver tidligere vist sig at være positive ved en Western-analyse og en RIA. I modsætning hertil viste ingen af kontrolchimpanserne, der var blevet inficeret med HAV eller HBV, tegn på reaktivitet i ELISA.

20 140 DK 176280 B1

Tabel 6

Chimpanseserum-prøver

Inokule- Dato for ALT Trans-5 OD S/CO rinqsdato blodprøve QU/L) fusion

Negativ kontrol 0,001

Positiv kontrol 1,504 10 Grænseværdi 0,401

Chimpanse 1 -0,007 0,00 24/05/84 24/05/84 9 NANB

0,003 0,01 07/08/84 71 >3,000 >7,48 18/09/84 19 15 >3,000 >7,48 24/10/84

Chimpanse 2 ...... 07/06/84 — — NANB

-0,003 0,00 31/05/84 5 -0,005 0,00 28/06/84 52 20 0,945 2.36 20/08/84 13 >3,000 >7,48 24/10/84

Chimpanse 3 0,005 0,01 14/03/85 14/03/85 8 NANB

0,017 0,04 26/04/85 205 25 0,006 0,01 06/05/85 14 1,010 2,52 20/08/85 6

Chimpanse 4 -0,006 0,00 11/03/85 11/03/85 11 NANB

0,003 0,01 09/05/85 132 30 0,523 1,31 06/06/85 1,574 3,93 01/08/85 141 DK 176280 B1

Tabel 6

Chimpanseserum-prøver (fortsat)

Inokule- Dato for ALT Trans-5 ' OD S/CO rinqsdato blodprøve (IU/L) fusion

Chimpanse 5 -0,006 0,00 21/11/80 21/11/80 4 HAV

0,001 0,00 16/12/80 147 0,003 0,01 30/12/80 18 0,006 0,01 29/07 -21/08/81 5 10

Chimpanse 6 — — 25/05/82 — — HAV

-0,005 0,00 17/05/82 0,001 0,00 10/06/82 106 -0,004 0,00 06/07/82 10 15 0,290 0,72 01/10/8

Chimpanse 7 -0,008 0,00 25/05/82 25/05/82 7 HAV

-0,004 0,00 17/16/82 83 -0,006 0,00 16/09/82 5 20 0,005 0,01 09/10/82

Chimpanse 8 -0,007 0,00 21/11/80 21/11/80 15 HAV

0,000 0,00 16/12/80 130 0,004 0,01 03/02/81 8 25 0,000 0,00 03/06 - 10/06/81 4,5

Chimpanse 9 — — 24/07/80 — — HBV

0,019 0,05 22/08 - 10/10/79 11/03/81 57 30 0,015 0,04 01/07 -05/08/81 9 0,008 0,02 01/10/81 6 142 DK 176280 B1

Tabel 6

Chimpanseserum-prøver (fortsat)

Inokule- Dato for ALT Trans-5 OD S/CQ rinqsdato blodprøve (IU/L) fusion

Chimpanse 10 — — 12/05/82 — — HBV

0,011 0,03 21/04- 12/05/82 9 0,015 0,04 01/09-08/09/82 126 10 0,008 0,02 02/12/82 9 0,010 0,02 06/01/83 13

Chimpansen — — 12/05/82 — -7 HBV

0,000 0,00 06/01 - 12/05/82 11 15 -..... 23/06/82 100 -0,003 0,00 09/06 -07/07/82 -0,003 0,00 28/10/82 9 -0,003 0,00 20/12/82 10 20 IV.1.3. Referencegruppe 1: Påvist infektiøse sera fra kroniske human NANBH bærere

En referencegruppe bestod af 22 unikke kodede prøver, hver in duplo, med et total på 44 prøver. Prøverne var fra påvist infektiøse sera fra kroniske 25 NANBH bærere, infektiøse sera fra implicerede donorer samt infektiøse sera fra patienter med akutfase NANBH. Desuden stammede prøverne fra højt stambogsførte negative kontroller og andre sygdomskontroller. Denne referencegruppe blev tilvejebragt af Dr. H. Alter fra "Department of Health and Human Services", National Institutes of Health, Bethesda, Maryland.

30 Referencegruppen blev konstrueret af Dr. Alter for flere år siden og er blevet 143 DK 176280 B1 anvendt af Dr. Alter som en kvalificerende referencegruppe til formodede NANBH analyser.

Hele referencegruppen blev analyseret to gange med ELISA analysen, og 5 resultaterne blev sendt til Dr. Alter til opgørelse. Resultaterne af opgørelsen er vist i tabel 7. Selv om tabellen kun viser resultaterne af det ene sæt dubletter, blev de samme værdier opnået for hver af dubletprøverne.

Som det er vist i tabel 7, var 6 sera, der var påvist infektiøse i en 10 chimpansemodel, stærkt positive. Det syvende infektiøse serum svarede til en prøve fra et akut NANBH tilfælde og reagerede ikke i denne ELISA analyse. En prøve fra en impliceret donor med både normale ALT-niveauer og tvetydige resultater i chimpansestudierne var ikke-reaktiv i analysen. Tre andre serieprøver fra et individ med akut NANBH var heller ikke reaktive. Alle 15 prøver, der kommer fra de højt stambogsførte negative kontroller, der var opnået fra donorer med mindst 10 bloddonationer uden hepatitisimplikation, var ikke-reaktive i ELISA analysen. Endelig havde 4 af de afprøvede prøver tidligere vist sig positive i formodede NANBH analyser, der er udviklet af andre, men disse analyser kunne ikke bekræftes. Disse 4 prøver viste sig at 20 være negative i HCV ELISA-analysen.

144 DK 176280 B1

Tabel 7 H. Alters referencegruppe 1:

Referencegruppe_1. resultat 2. resultat 5 1) Påvist infektiøs ved chimpanseoverførsel A. Kronisk NANB: Post-Tx JF + + EB + + 10 PG + +

B. Implicerede donorer med forhøjdet ALT

BC + + JJ + + BB + + 15 C. Akut NANB: Post-Tx

WH

2) Tvetydigt infektiøs ved chimpanseoverførsel

A. Impliceret donor med normal ALT CC

20 3) Akut NANB: Post-Tx JLuge 1 JL uge 2 JL uge 3 4) Sygdomskontroller 25 A. Primær biliær cirrhosis ΕΚ

B. Alkoholisk hepatitis under helbredelse HB

30 145 DK 176280 B1

Tabei 7 H. Alters referencegruppe 1: (fortsat) 5 Referencegruppe_1. resultat 2. resultat 5) Stambogsførte negative kontroller

DM

DC

10 LV -

ML AH

6) Potentielle NANB "antigener" 15 JS-80-01T-0 (Ishida)

Asterix (Trepo)

Zurtz (Arnold)

Becassdine (Trepo)

20 IV.I.4. Referencegruppe 2: Donor/recipient NANBH

Referencegruppen bestod af 10 kodede utvetydige donor-recipienttiifælde af transfusionsforbundet NANBH med et total på 188 prøver. Hvert tilfælde bestod af prøver fra nogle eller alle recipientens donorer og af serieprøver 25 (udtaget 3, 6 og 12 måneder efter transfusion) fra recipienten. Indbefattet var også en foraftapning af blod taget fra recipienten før transfusion. Den kodede referencegruppe blev tilvejebragt af Dr. H. Alter fra NIH, og resultaterne blev sendt til ham til opgørelse.

30 De i tabel 8 opsummerede resultater viser, at der i ELISA analysen påvistes antistofserokonversion i 9 ud af 10 tilfælde af transfusionsforbundet NANBH.

146 DK 176280 B1

Prøver fra tilfælde nr. 4 (hvor der ikke påvistes serokonversion) reagerede konsekvent dårligt i ELISA analysen. To af de 10 recipientprøver var reaktive 3 måneder efter transfusion. Seks måneder efter var 8 recipientprøver reaktive og efter 12 måneder, med undtagelse af tilfælde nr. 4, var alle 5 prøver reaktive. Desuden blev mindst én antistofpositiv donor fundet i 7 ud af de 10 tilfælde, hvor tilfælde nr. 10 har 2 positive donorer. I tilfældet nr. 10 var recipientens forblodaftapning også positiv med hensyn til HCV antistoffer. Blodaftapningen efter én måned fra denne recipient faldt til grænseniveauet for reaktion, mens den var forhøjet til positiv ved 4 og 10 måneders 10 blodaftapningerne. Et S/CO på 0,4 betragtes i almindelighed som positivt.

Dette tilfælde kan således repræsentere en forudgående infektion af individet med HCV.

ALT- og HBc statusen for alle de reaktive, dvs. positive, prøver opsummeres 15 i tabel 9. Som det fremgår af tabellen, var 1/8 donorprøver negative med hensyn til surrogatmarkørerne og reaktive i HCV antistof ELISA analysen. På den anden side havde recipientprøverne (fulgt op indtil 12 måneder efter transfusion) enten forhøjet ALT, positiv anti-HBc eller både og.

147 DK 176280 B1

Tabel 8

Donor/recipient NANB referencegruppe 5 H. Alter donor/recipient NANB referencegruppe

Foraftapning af

Til- blod fra recipient Posl-Tx fælde Donor 3 mdr. 6 mdr. 12 mdr.

nr.

OD S/CO OD S/CO OD S/CO OD S/CO OD S/CO

1 — — ,032 0,07 ,112 0,26 >3,000 >6,96 >3.000 >6,96 2 — — ,059 0,14 ,050 0,12 1,681 3.90 >3,000 >6,96 3 ,403 0,94 ,049 0,11 ,057 0,13 >3,000 >6,96 >3,000 >6,96 4 — — ,065 0,15 ,073 0,17 .067 0,16 ,217 0,50 5 >3,000 >6,96 ,034 0,08 ,096 0,22 >3,000 >6,96 >3,000 >6,96 6 >3,000 >6,96 ,056 0,13 1,475 3,44 >3,000 >6,96 >3,000 >6,96 7 >3,000 >6,96 ,034 0,08 ,056 0,13 >3,000 >6,96 >3,000 >6,96 8 >3,000 >6,96 ,061 0,14 ,078 0,18 2,262 5,28 >3,000 >6,97 9 >3,000 >6,96 .080 0,19 ,127 0,30 .055 0,13 >3,000 >6,96 10 >3,000 >6,96 >3.000 >6,96 ,3171 0,74 >3,0001' >6,96 >3,000"1 >6,96 >3,000 >6,96 1 måned, ** 4 måneder, *** 10 måneder 148 DK 176280 B1

Tabel 9

Ait- og HBc-status for reaktive prøver i H. Alter referencegruppe 1 5 Prøver Anti-Alt* HBc**

Donorer

Tilfælde nr. 3 Normal Negativ 10 Tilfælde nr. 5 Forhøjet Positiv

Tilfælde nr. 6 Forhøjet Positiv

Tilfælde nr. 7 Ikke tilgængelig Negativ

Tilfælde nr. 8 Normal Positiv

Tilfælde nr. 9 Forhøjet Ikke tilgængelig 15 Tilfælde nr. 10 Normal Positiv

Tilfælde nr. 11 Normal Positiv

Recipienter 20 Tilfælde nr. 1 6 mdr. Forhøjet Positiv 12 mdr. Forhøjet Ikke analyseret

Tilfælde nr. 2 6 mdr. Forhøjet Negativ 12 mdr. Forhøjet Ikke analyseret 25

Tilfælde nr. 3 6 mdr. Normal Ikke analyseret*** 12 mdr. Forhøjet Ikke analyseret***

Tilfælde nr. 5 6 mdr. Forhøjet Ikke analyseret 30 12 mdr. Forhøjet Ikke analyseret 149 DK 176280 B1

Forts, af tabel 9

Tilfælde nr. 6 3 mdr. Forhøjet Negativ 6 mdr. Forhøjet Negativ 12 mdr. Forhøjet Ikke analyseret 5

Tilfælde nr. 7 6 mdr. Forhøjet Negativ 12 mdr. Forhøjet Negativ

Tilfælde nr. 8 6 mdr. Normal Positiv 10 12 mdr. Forhøjet Ikke analyseret

Tilfælde nr. 9 12 mdr. Forhøjet Ikke analyseret

Tilfælde nr. 10 4 mdr. Forhøjet Ikke analyseret 15 10 mdr. Forhøjet Ikke analyseret * ALT = 45 IU/L ligger over normale grænser.

** Anti-HBc = 50% (kompetitiv analyse) betragtes som positiv.

*** Foraftapning af blod og 3 måneders prøver var negative med hensyn til 20 HBc.

IV.i.5. Påvisning af HCV-infektion i prøver fra højrisikoqrupper

Prøver fra højrisikogrupper blev overvåget under anvendelse af ELISA-25 analysen til påvisning af reaktivitet med HCV-C100-3 antigen. Prøverne blev opnået fra dr. Gary Tegtmeier, Community Blood Bank, Kansas City. Resultaterne er opsummeret i tabel 10.

Som anført i tabellen opnåedes den højeste reaktivitet i prøver fra blødere 30 (76%). Desuden fandtes der 51% reaktive prøver fra individer med forhøjet ALT, og som var anti-HBc-positive, en værdi, der stemmer overens med den 150 DK 176280 B1 forventede værdi ud fra kliniske data og NANBH-prævalens i denne gruppe. Forekomsten af antistof mod HCV var også større hos bloddonorer med forhøjet ALT alene, bloddonorer, som kun er positive med hensyn til antistoffer mod hepatitis-B-kerne og hos bloddonorer, der er afvist af andre 5 grunde end højt ALT- eller anti-kerneantistofniveau, når det sammenlignes med tilfældige frivillige donorer.

151 DK 176280 B1

Tabel 10 NANBH-prøver fra høirisikoqruppe Fordeling 5 Gruppe_N N_OD_% Reaktive

Forhøjet ALT 35 3 >3000 11,4% 1 0,728 10 Anti-HBc 24 5 >3000 20,8%

Forhøjet ALT, a nti- 33 12 >3000 51,5% HBc 1 2768 1 2324 15 1 0,939 1 0,951 1 0,906

Afviste donorer 25 5 >3000 20,0% 20

Donorer med tidligere konstateret hepatitis 150 19 >3000 14,7% 1 0,837 25 1 0,714 1 0,469

Blødere 50 31 >3000 76,0% 1 2568 30 1 2483 1 2000 1 1979 1 1495 1 1209 35 1 0,819 IV.I.6- Sammenliqninqsundersøqelser under anvendelse af anti-lqG eller anti-lqM monoklonale antistoffer eller polyklonale antistoffer, som andet antistof i HCV-c100-3-ELISA-anaivsen 40 Følsomheden af ELISA-bestemmelsen, hvortil der anvendes anti-lgG-monoklonalt konjugat, blev sammenlignet med den opnåede følsomhed under anvendelse af enten et anti-lgM monoklonalt konjugat eller ved udskiftning af begge med et polyklonalt antiserum, der skulle være både tungt- og letkædet specifik. Der blev udført følgende undersøgelser.

152 DK 176280 B1 5 IV.I.ø.a. Serieprøver fra individer med serokonversion

Serieprøver fra tre NANB-serokonversionstilfælde blev undersøgt i HCV-C100-3 ELISA-analysen under anvendelse af enzymkonjugatet af enten det monoklonale anti-lgG alene eller i kombination med et monoklonalt anti-lgM 10 eller under anvendelse af et polyklonalt antiserum. Prøverne blev tilvejebragt af dr. Cladd Stevens, N.Y. Blood Center, N.Y.C., N.Y. Prøvehistorikken er anført i tabel 11.

De ved anvendelse af et anti-lgG-monoklonalt antistof-enzymkonjugat 15 opnåede resultater er anført i tabel 12. Resultaterne viser, at der initielt påvistes stærk reaktivitet i prøverne 1-4, 2-8 og 3-5 fra tilfældene nr. 1, 2, henholdsvis 3.

De ved anvendelse af en kombination af et anti-lgG monoklonalt konjugat og 20 et anti-lgM-konjugat opnåede resultater er anført i tabel 13. Der blev analyseret tre forskellige forhold mellem anti-lgG og anti-lgM; 1:10.000 fortyndingen af anti-lgG var konstant hele tiden. Det for monoklonale anti-lgM konjugat analyserede fortyndinger var 1:30000, 1:60000 og 1:120000. Resultaterne viser, at i overensstemmelse med undersøgelserne med anti-25 IgG alene, påvises den initiel stærk reaktivitet i prøverne 1-4, 2-8 og 3-5.

De resultater, der er opnået med ELISA-analysen under anvendelse af anti-lgG monoklonalt konjugat (1:10000 fortynding) eller Tago-polyklonalt konjugat (1:80000 fortynding) eller Jackson-polyklonalt konjugat (1:80000 30 fortynding) er anført i tabel 14. Resultaterne viser, at der påvistes initiel stærk reaktivitet i prøverne 1-4, 2-8 og 3-5 under anvendelse af alle tre konfigurationer; Tago-polyklonale antistoffer afgav de svageste signaler.

153 DK 176280 B1

De ovenfor fremlagte resultater viser, at der ved afle tre konfigurationer 5 påvises reaktive prøver på samme tidspunkt efter sygdommens akutte fase {som påvist ved ALT-forhøjelsen). Resultaterne viser yderligere, at følsomheden af HCV-C100-3 ELISA-analysen, hvor der anvendes anti-lgG monoklonalt-enzymkonjugat, er lig med eller bedre end de ved anvendelse af de andre afprøvede konfigurationer for enzymkonjugatet opnåede resultater.

154 DK 176280 B1

Tabel 11

Beskrivelse af prøver fra Cladd Stevens referencegruppe _Dato HBsAq Anti-HBs Anti-HBc ALT Bilirubin 5

Tilfælde nr. 1 1-1 5/8/81 1,0 91,7 12,9 40,0 -1,0 1-2 2/9/81 1,0 121,0 15,1 274,0 1,4 10 1-3 17/10/81 1,0 64,0 23,8 261,0 0,9 1-4 19/11/81 1,0 67,3 33,8 75,0 0,9 1- 5 15/12/81 1,0 50,5 27,6 71,0 1,0

Tilfælde nr. 2 15 2- 1 19/10/81 1,0 1,0 116,2 17,0 -1,0 2-2 17/11/81 1,0 0,8 89,5 46,0 1,1 2-3 02/12/81 1,0 1,2 78,3 63,0 1,4 2-4 14/12/81 1,0 0,9 90,6 152,0 1,4 20 2-5 23/12/81 1,0 0,8 93,6 624,0 1,7 2-6 20/1/82 1,0 0,8 92,9 66,0 1,5 2-7 15/2/82 1,0 0,8 86,7 70,0 1,3 2-8 17/3/82 1,0 0,9 69,8 24,0 -1,0 2-9 21/4/82 1,0 0,9 67,1 53,0 1,5 25 2-10 19/5/82 1,0 0,5 74,8 95,0 1,6 2- 11 14/6/82 1,0 0,8 82,9 37,0 -1,0

Tilfælde nr. 3 30 3-1 7/4/81 1,0 1,2 88,4 13,0 -1,0 3- 2 12/5/81 1,0 1,1 126,2 236,0 0,4 3-3 30/5/81 1,0 0,7 99,9 471,0 0,2 3-4 9/6/81 1,0 1,2 110,8 315,0 0,4 3-5 6/7/81 1,0 1,1 89,9 273, 0,4 35 3-6 10/8/81 1,0 1,0 118,2 158,0 0,4 3-7 8/9/81 1,0 1,0 112,3 84,0 0,3 3-8 14/10/81 1,0 0,9 102,5 180,0 0,5 3-9 11.11.81 1,0 1,0 84,6 154,0 0,3 155 DK 176280 B1

Tabel 12 ELISA-anaiyseresultater opnået under anvendelse af et monoklonalt anti-lqG-konjugat 5 Prøvenr._Dato_ALT_OD_S/CO_

Negativ kontrol- 0,076 grænseværdi PC 0,476 (1:128) 1,390 10

Tilfælde nr. 1 1-1 05/08/91 40,0 0,178 0,37 1-2 02/09/81 274,0 0,154 0,32 15 1-3 07/10/81 261,0 0,129 0,27 1-4 19/11/81 75,0 0,937 1,97 1- 5 15/12/81 71,0 >3,000 >6,30

Tilfælde nr. 2 20 2- 1 19/10/81 17,0 0,058 0,12 2-2 17/11/81 46,0 0,050 0,11 2-3 02/12/81 63,0 0,047 0,10 2-4 14/12/81 152,0 0,059 0,12 25 2-5 23/12/81 624,0 0,070 0,15 2-6 20/01/82 66,0 0,051 0,11 2-7 15/02/82 70,0 0,139 0,29 2-8 17/03/82 24,0 1,867 3,92 2-9 21/04/82 53,0 >3,000 >6,30 30 2-10 19/05/82 95,0 >3,000 >6,30 2- 11 14/06/82 37,0 >3,000 >6,30

Tilfælde nr. 3 35 3-1 07/04/81 13,0 0,090 0,19 3- 2 12/05/81 236,0 0,064 0,13 3-3 30/05/81 471,0 0,079 0,17 3-4 09/06/81 315,0 0,211 0,44 3-5 06/07/81 273,0 1,707 3,59 40 3-6 10/08/81 158,0 >3,000 >6,30 3-7 08/09/81 84,0 >3,000 >6,30 3-8 14/10/81 180,0 >3,000 >6,30 3-9 11.11.81 154,0 >3,000 >6,30 156 DK 176280 B1

Tabel 13

ELISA-analyseresultater opnået under anvendelse af monoklonalt anti-lqG

og anti-lqM-konjugat 5 NANB ELISA-analvser_

Monoklonale Monoklonale Monoklonale

IgG 1:10K IgG 1:10K IgG 1:10K

IgM 1:30K IgM 1:60K IgM 1:120K

10

Prøvenr Dato ALT OD C/SO OD S/CQ OD S/CO

Negativ 0,100 0,08 0,079

kontrolgræn-15 se værd i PC

(1:128) 1,083 1,328 1,197

Tilfælde nr. 1 20 1-1 05/08/81 40 0,173 0,162 0,70 1-2 02/09/81 274 0,194 0,141 0,079 1-3 07/10/81 261 0,162 0,129 0,063 1-4 19/11/81 75 0,812 0,85 0,709 1-5 15/12/81 71 >3,00 >3,00 >3,00 25

Tilfælde nr. 2 1- 2 19/10/81 17 0,442 0,045 0,085 2- 2 17/11/81 46 0,102 0,029 0,030 30 2-3 02/12/81 63 0,059 0,036 0,027 2-4 14/12/81 152 0,065 0,041 0,025 2-5 23/12/81 624 0,082 0,033 0,032 2-6 20/01/82 66 0,102 0,042 0,027 2-7 15/02/82 70 0,188 0,068 0,096 35 2-8 17/03/82 24 1,728 1,668 1,541 2-9 21/04/82 53 >3,00 2,443 >3,00 2-10 19/05/82 95 >3,00 >3,00 >3,00 2- 11 14/06/82 37 >3,00 >3,00 >3,00 40 Tilfælde nr. 3 3- 1 07/04/81 13 0,193 0,076 0,049 3-2 12/05/81 236 0,201 0,051 0,038 157 DK 176280 B1 3-3 30/05/81 471 0,132 0,067 0,052 3-4 09/06/81 315 0,175 0,155 0,140 3-5 06/07/81 273 1,335 1,238 1,260 3-6 10/08/81 158 >3,00 >3,00 >3,00 5 3-7 08/09/81 84 >3,00 >3,00 >3,00 3-8 14/10/81 180 >3,00 >3,00 >3,00 3-9 11/11/81 154 >3,00 >3,00 >3,00 158 DK 176280 B1

Tabel 14 ELISA-analyseresultater opnået under anvendelse af polyklonale koniuqater _NANB ELiSA-anaivser_ 5 Monoklonal Tago Jackson

1:1 OK 1:80K 1:80K

Prøvenr. Dato ALT OD S/CQ OD S/CO OD S/CO

10 Negativ kontrol- 0,076 0,045 0,154 grænseværdi PC 0,476 0,545 0,654 (1:128) (eng. 1.390 0,727 2,154 cutoff) 15 Tilfælde nr. 1 1-1 05/08/81 40 0,178 0,37 0,067 0,12 0,153 0,23 1-2 02/09/81 274 0,154 0,32 0,097 0,18 0,225 0,34 1-3 07/10/81 261 0,129 0,27 0,026 0,05 0,167 0,26 20 1-4 19/11/81 75 0,937 1,97 0,324 0,60 0,793 1,21 1- 5 15/12/81 71 >3,00 >6,30 1,778 3,27 >3,00 >4,59

Tilfælde nr. 2 25 2-1 19/10/81 17 0,058 0,12 0,023 0,04 0,052 0,08 2- 2 17/11/81 46 0,050 0,11 0,018 0,03 0,058 0,09 2-3 02/12/81 63 0,047 0,10 0,020 0,04 0,060 0,09 2-4 14/12/81 152 0,059 0,12 0,025 0,05 0,054 0,08 2-5 23/12/81 624 0,070 0,15 0,026 0,05 0,074 0,11 30 2-6 20/01/82 66 0,051 0,11 0,018 0,03 0,058 0,09 2-7 15/02/82 70 0,139 0,29 0,037 0,07 0,146 0,22 2-8 17/03/82 24 1,867 3,92 0,355 0,65 1,429 2,19 2-9 21/04/82 53 >3,00 >6,30 0,748 1,37 >3,00 >4,59 2- 10 19/05/82 95 >3,00 >6,30 1,025 1,88 >3,00 >4,59 35 2-11 14/06/82 37 >3,00 >6,30 0,917 1,68 >3,00 >4,59

Tilfælde nr. 3 3- 1 07/04/81 13 0,090 0,19 0,049 0,09 0,138 0,21 40 3-2 12/05/81 236 0,064 0,13 0,040 0,07 0,094 0,14 3-3 30/05/81 471 0,079 0,17 0,045 0,08 0,144 0,22 3-4 09/06/81 315 0,211 0,44 0,085 0,16 0,275 0,42 3-5 06/07/81 273 1,707 3,59 0,272 0,50 1,773 2,71 3-6 10/08/81 158 >3,00 >6,30 1,347 2,47 >3,00 >4,59 45 3-7 08/09/81 84 >3,00 >6,30 2,294 4,21 >3,00 >4,59 3-8 14/10/81 180 >3,00 >6,30 >3,00 >5,50 >3,00 >4,59 3-9 11/11/81 154 >3,00 >6,30 >3,00 >5,50 >3,00 >4,59 159 DK 176280 B1 IV.I.ø.b._Prøver fra tilfældige bloddonorer

Prøver fra tilfældige bloddonorer (se afsnit IV.1.1.) blev screenet for HCV-infektion under anvendelse af HCV-C100-3 ELISA-analysen, hvori antistof-5 enzymkonjugatet enten var et monoklonalt anti-lgG konjugat eller et polyklonalt konjugat. Det totale antal screenede prøver var 1077 og 1056 for henholdsvis det polyklonale konjugat og det monoklonale konjugat. En opsummering af screeningsresultaterne er anført i tabel 15 og prøvefordelingerne er vist i histogrammet i figur 44.

10

Beregning af middelværdier og standardafvigelse blev udført med udelukkelse af prøver, der gav et signal større end 1,5, d.v.s., der anvendtes 1073 OD-værdier for beregninger under anvendelse af det polyklonale konjugat og 1051 for det monoklonale anti-lgG konjugat. Som det ses i tabel 15 15 skiftede middelværdien fra 0,0493 til 0,0931, når det polyklonale konjugat anvendtes, og standardafvigelsen forøgedes fra 0,074 til 0,0933. Desuden viser resultaterne også, at når kriteriet for .v + 5SD anvendes til definition af analysegrænseværdien, forudsætter den polyklonale enzym konjugat-konfiguration i ELISA-analysen en højere grænseværdi. Dette antyder en 20 nedsat analysespecificitet sammenlignet med det monoklonale system. Desuden optræder der, som afbildet i histogrammet i figur 44, en større adskillelse af resultater mellem negative og positive fordelinger, når tilfældige bloddonorer screenes i en ELISA-analyse under anvendelse af det monoklonale anti-lgG-konjugat sammenlignet med den analyse, hvori der 25 anvendes et kommercielt polyklonalmærke.

160 DK 176280 B1

Tabel 15

Sammenligning af to ELISA-analysekonfiqurationer ved analyse af prøver fra tilfældige bloddonorer

5 Konjuqat_ Polvklonal_Monoklonal anti-lqG

(Jackson)

Prøveantal 1073 1051

Middelværdi (λ ) 0,0931 0,04926 10 Standardafvigelse 0,0933 0,07427 5 SD 0,4666 0,3714

Grænseværdi (5 SD + x) 0,5596 0,4206 15 IV.J. Påvisning af HCV-serokonversion i NANBH-patienter fra en række geografiske lokaliteter

Sera fra patienter, der formodedes at have NANBH, baseret på forhøjede ALT-niveauer, og som reagerede negativt i HAV- og HBV-analyser, blev 20 screenet under anvendelse af RIA i det væsentlige som beskrevet i afsnit IV.D. med den undtagelse, at HCV-C100-3-antigenet anvendtes som screeningsantigenet i mikrotiterpladerne. Som det fremgår af de i tabel 16 viste resultater påvistes der med RIA positive prøver i en stor procentdel af tilfældene.

25

Tabel 16

Serokonversionsfrekvenser for anti-C100-3 blandt NANBH-patienter i forskellige lande 30 Land_Holland_Italien_Japan_

Antal undersøgte 5 36 26

Antal positive 3 29 19 % positive 60 80 73 35 161 DK 176280 B1

IV.K. Påvisning af HCV-serokonversion hos patienter med "samfund se rh ve rvet" NANBH

Sera, som var opnået fra 100 patienter med NANBH, for hvem der ikke 5 fandtes nogen åbenbar transmissionvej (f.eks. blev der ikke identificeret transfusioner, intravenøs medikamentanvendelse, promiskuitet, o.s.v. som risikofaktorer) blev tilvejebragt af dr. H. Alter fra "Center for Disease Control” og dr. J. Dienstag fra Harvard University. Prøverne blev screenet under anvendelse af RIA i det væsentlige som beskrevet i afsnit IV.D med den 10 undtagelse, at HCV-CIOO-3-antigenet blev anvendt som screeningsantigenet fæstnet til mikrotiterpladerne. Resultaterne viste, at af de 100 serumprøver indeholdt de 55 antistoffer, der reagerede immunologisk med HCV-C100-3-antigenet.

15 De ovenfor beskrevne resultater tyder på, at "samfundserhvervet" NANBH også forårsages af HCV. Da det heri er vist, at HCV er beslægtet med flaviviraene, hvoraf de fleste overføres af arthropoder, antydes det desuden, at HCV-transmisssion i de ''samfundserhvervede" tilfælde også stammer fra arthropodtransmission.

20 IV.L. Sammenligning af HCV-antistofincidens og surroqatmarkører hos donorer, der er impliceret i NANBH-transmissionen

Et fremtidsstudium blev udført for at bestemme, om der forekom 25 serokonversion til positiv overfor anti-HCV-antistof hos recipienter af blod fra formodede NANBH-positive donorer, der udviklede NANBH. Bloddonorerne blev analyseret for de surrogatmarkørunormaliteter, der for tiden anvendes som markører for NANBH-infektion, d.v.s. forhøjede ALT-niveauer og forekomst af antikerne-antistof. Donorerne blev desuden analyseret for 30 forekomst af anti-HCV-antistoffer. Bestemmelsen af forekomst af anti-HCV-antistoffer blev bestemt under anvendelse af en radioimmunoanalyse, som 162 DK 176280 B1 beskrevet i afsnit IV.K. Resultaterne af studiet fremlægges i tabel 17, der viser: patientnummeret (søjle 1); forekomst af anti-HCV-antistoffer i patientserum (søjle 2); antal bloddonationer modtaget af patienten, hvor hver donation er fra en forskellig donor (søjle 3); forekomst af anti-HCV-antistoffer 5 i donorserum (søjle 4) samt donorens surrogatunormalitet (søjle 5), (NT eller - betyder "ikke analyseret”), (ALT betegner forhøjet transaminase, og anti-HBc betegner a nti kerneantistof).

Resultaterne i tabel 17 viser, at HCV antistofanalysen er mere akkurat ved 10 påvisning af inficerede bloddonorer end surrogatmarkøranalyseme. 9 Ud af 10 patienter, der udviklede NANBH-symptomer viste positive analyser med hensyn til anti-HCV-antistofserokonversion. Af de 11 mistænkte donorer, (patient nr. 6 modtog bloddonationer fra 2 forskellige individer, der er mistænkt for at være NANBH-bærere), var 9 positive med hensyn til anti-15 HCV-antistoffer og 1 var grænsepositiv, og derfor tvetydig (donor for patient nr. 1). I modsætning hertil viste 6 ud af 10 donorer sig negative ved den forhøjede ALT-analyse og ved antikerneantistofanalysen viste 5 ud af 10 donorer sig at være negative. Det er dog af større betydning, at ALT-anaiysen og anti-HBC-analysen i tre tilfælde (donorer ti! patient nr. 8, 9 og 20 10) gav inkonsekvente resultater.

DK 176280 B1 ø ί_

CD

S

_Q

X

ω z < z ω £D i CD ø* — ø "ø 'αΓ — ø1 ™ ^ X c .55, c i .55, c .55, c .SS, c .55.

> 03 -γ to £É ϊ <- o ø o c „ **- -> co CO 1-0 0 ™ h j*; i

c o -J

ø t *£ __ _i __ __ _ iS ø ø H ’ø „ 'ø „ I— 'ø „ 'ø <2 U) 3 c Z c , .55, c .« Z c .55, c

E

L~ 0 TØ E ό 0 Cl 1 é § ro ^ X5 "σ —.

0= -i .> -£ ._ ^ "o < o5 ϋϋ .55, .55, c .55, .55, .55, .55, .55, .55, co — o ~ co 0 7_

p S

o ^ 0 É g o ø .g § "O _ Ό <-· is ø

-E TO c CO CO CO CO CO t- no LO

C <0 Τ-Τ-Χ-Ί-Τ-Λ- t-CNLOt- 0 ro > « g

° - cL

c C > O 0 > ,

0 j*: ccc CD

3= o TO 7 o £ Q. ^ —^ Q) <£

ΪΛ (/)(/3 “Z

V- I O , C > J= i ? υ c c > x o π 0 i e _ e

X C m 0 O

1 ^ CD (D CD CO CD 03 CD 03 CO CO

1 " ^ 8 ro -g g g φ

M S E

-* C C

> ø E

"D +-* ^ —ϊ CL T- (N CO ^ lO 0 S CO O) ^ ^ 164 DK 176280 B1 IV.M. Forstærkning af kloning af HCV-cDNA-sekvenser under anvendelse af PCR og primere afledt fra konserverede områder af flavivirusqenom-sekvenser 5 De ovenfor fremlagte resultater, der tyder på, at HCV er et flavivirus eller flavi-lignende virus, tillader en kloningsstrategi for ikke-karakteriserede HCV-cDNA-sekvenser under anvendelse af PCR-teknikken og primere afledt fra de områder, der koder for konserverede aminosyresekvenser i flavivira. Generelt afledes en af primerne fra en defineret HCV-genomsekvens og den 10 anden primer, der flankerer et område med ikke-sekvenseret HCV-polynucleotid, afledes fra et konserveret område af flavivirus-genomet. Flavirus-genomerne vides at indeholde konserverede sekvenser inden for NS1- og E-polypeptiderne, der er indkodet i flavivirus-genomets 5'-område. Korresponderende sekvenser, der koder for disse områder, ligger 15 ovenstrøms for HCV-cDNA-sekvensen, der er vist i figur 26. For at isolere cDNA-sekvenser, der er afledt fra dette område af HCV-genomet, konstrueres der derfor ovenstrømsprimere, der er afledt fra de konserverede sekvenser inden for disse flavirus-polypeptider. Nedenstrømsprimerne afledes fra en ovenstrømsende af den kendte del af HCV-cDNA'et.

20 På grund af kodens codon er det sandsynligt, at der vil forekomme fejlparring {eng. mismatch) mellem flavivus-proberne og den korresponderende HCV-genomsekvens. Der anvendes derfor en stategi, der ligner den af Lee (1988) beskrevne stategi. I Lee-proceduren anvendes den blandede oligonucleotid-25 primere, der er komplementære med reverstranslationsprodukterne af en aminosyresekvens; sekvenserne i de blandede primere tager højde for enhvercodondegeneration forden konserverede aminosyresekvens.

Der frembringes tre sæt af primerblandinger baseret på de aminosy-30 rehomologier, der er fundet i adskillige flavivira, herunder Dengue-2,4 {D-2,4), japansk Encephalitis Virus (JEV), gul feber (YF) og West Nile virus 165 DK 176280 B1 (WN). Primerblandingen, der er afledt fra den mest ovenstrøms konserverede sekvens (5'-1) er baseret på aminosyresekvensen gly-trp-gly, som er del af den konserverede sekvens asp-arg-gly-trp-gly-aspN, der er fundet i E-proteinet af D-2, JEV, YF og WN. Den næste primerblanding (5'-2) 5 er baseret på en nedenstrøms konserveret sekvens i E-protein, phe-asp-gly-asp-ser-tyr-ileu-phe-gly-asp-ser-tyr-ileu, og er afledt fra phe-gly-asp; den konserverede sekvens findes i D-2, JEV, YF og WN. Den tredje primerblanding (5'-3) er baseret på aminosyresekvensen arg-ser-cys, som er del af den konserverede sekvens cys-cys-arg-ser-cys i NS1-proteinet fra D-2, 10 D-4, JEV, YF og WN. De individuelle primere, der udgør blandingen i 5-3, er vist i figur 45. Udover de varierede sekvenser, som er afledt fra konserveret område, indeholder hver primer i hver blanding også et konstant område ved 5’-enden, hvilket område indeholder en sekvens, som koder for stederne for restriktionsenzymerne, Hindlll, Mbol og EcoRI.

15

Nedenstrømsprimeren, ssc5h20A, er afledt fra en nucleotidssekvens i klon 5h, der indeholder HCV-cDNA med sekvenser, som overlapper de fra klonerne 14i og 11b. Sekvensen af ssc5h20A er: 20 5’GTA ATA TGG TGA CAG AGT CA 3'.

Der kan også anvendes en alternativ primer, ssc5h34A. Denne primer er afledt fra en sekvens i klon 5h og indeholder desuden nucleotider ved 5’-enden, hvilke nucleotider skaber et restriktionsenzymsted og derved letter 25 kloningen. Sekvensen af ssc5h34A er: 5' GAT CTC TAG AGA AAT CAA TAT GGT GAC AGA GTC A 3’.

PCR-reaktionen, der oprindeligt er beskrevet af Saiki et al. (1986), udføres i 30 det væsentlige som beskrevet i Lee et al. (1988) med den undtagelse, at skabelonen for cDNA er RNA, der er isoleret fra HCV-inficeret 166 DK 176280 B1 chimpanselever, som beskrevet i afsnit IV.C.2., eller fra virale partikler, der er isoleret fra HCV-inficeret chimpanseserum, som beskrevet i afsnit IV.A.1. Desuden er hærdningsbetingelseme mindre stringente i den første forstærkningsrunde (0,6M NaCI og 25°C), idet den del af primeren, der vil 5 hærde til HCV-sekvensen kun er på 9 nucleotider og der kunne forekomme fejlparring. Hvis ssc5h34A anvendes, vil de yderligere sekvenser, der ikke er afledt fra HCV-genomet, desuden have tendens til at destabilisere "primer skabelon" hybriden. Efter den første forstærkningsrunde kan hærdningsbetingelserne være mere stringente (0,066M NaCI og 32°C - 37°C), 10 idet de forstærkede sekvenser nu indeholder områder, som er komplementære med eller duplekser af primerne. De første ti forstærkningscykluser foretages desuden med Klenowenzym I under passende PCR-betingelser for dette enzym. Efter færdiggørelsen af disse cykluser, ekstraheres prøverne og udføres med Taq-polymerase, ifølge analysesætanvisningerne, som 15 leveres af Cetus/Perkin-Elmer.

Efter forstærkningen påvises de forstærkede HCV-cDNA-sekvenser ved hydridisering under anvendelse af en probe, der er afledt fra klon 5h. Denne probe er afledt fra sekvenser, der er ovenstrøms for de sekvenser, som 20 anvendes til afledning af primere, og overlapper ikke med sekvenserne i de klon 5h afledte primere. Probens sekvens er: 5’ CCC AGC GGC GT A CGC GCT GGA CAC GGA GGT GGC CGC GTC GTG TGG CGG TGT TGT TCT CGT CGG G TT GAT GGC GC 3'.

25

IV.N.1. Frembringelse af HCV-cDNA-bibliotek fra lever fra en chimpanse med infektiøs NANBH

Et HCV-cDNA-bibliotek blev frembragt fra leveren af den chimpanse, hvorfra 30 HCV-cDNA-biblioteket i afsnit IV.A.1. blev frembragt. Teknikken til frembringelse af biblioteket svarer til den i afsnit IV.A.24. beskrevne med 167 DK 176280 B1 undtagelse af denne anden kilde til RNA’et, samt at der anvendtes en primer baseret på HCV-cDNA-sekvensen i klon 11b. Primersekvensen var: 5' CTG GCT TGA AGA ATC 3' 5 IV.N.2. Isolering af nucleotidsekvens af overlappende HCV-cDNA i klon k9-1 med cDNA i klon 11b

Klon k9-1 blev isoleret fra HCV-cDNA-bibliteket, der var frembragt fra leveren 10 af en NANBH-inficeret chimpanse, som beskrevet i afsnit IV.A.25. Biblioteket blev screenet for kloner, der overlapper sekvensen i klon 11b, under anvendelse af en klon, der overlapper klon 11b ved 5'-terminalen, klon 11e.

Klon 11b-sekvensen er vist i figur 23. Positive kloner blev isoleret med en frekvens på én ud af 500.000. En isoleret klon, k9-1, blev underkastet 15 yderligere undersøgelser. At HCV-cDNA’et i klon k9-1 af natur var overlappende med 5'-enden af HCV-cDNA-sekvensen i figur 26 blev bekræftet ved at probe klonen med klon Alex46; sidstnævnte klon indeholder en HCV-cDNA-sekvens på 30 basepar, der korresponderer med baseparrene ved 5'-terminalen af HCV-cDNA'et i klon 14i, der er beskrevet 20 ovenfor.

Nucleotidsekvensen af HCV-cDNA'et, der er isoleret fra klon k9-1, blev bestemt under anvendelse af de ovenfor beskrevne teknikker. Sekvensen af HCV-cDNA’et i klon k9-1, overlapningen med HCV-cDNA'et i figur 26 og de 25 deri indkodede aminosyrer er vist i figur 46.

HCV-cDNA-sekvensen i klon k9-1 er blevet sat på række med sekvenserne af de i afsnit IV A. 19. beskrevne kloner for at frembringe en komposit HCV-cDNA-sekvens, hvor k9-1-sekvensen er anbragt ovenstrøms for den i figur 30 32 viste sekvens. Det kompositte HCV-cDNA, der omfatter k9-1-sekvensen og de deri indkodede aminosyrer, er vist i figur 47.

168 DK 176280 B1

Sekvensen af de aminosyrer, der er indkodede i 5-området af det i figur 47 viste HCV-cDNA, er blevet sammenlignet med det korresponderende område af en af de ovenfor beskrevne Dengue-virusstrenge med hensyn til 5 profilen af hydrofobe og hydrofile områder. Denne sammenligning viste, at polypeptiderne fra HCV og Dengue, der er indkodet i dette område, der korresponderer med det område, som koder for NS1 (eller en del deraf), har en lignende hydrofob/h yd rofil profil.

10 Den nedenfor tilvejebragte information gør det muligt at identificere HCV-stammer. Isoleringen og karakteriseringen af andre HCV-stammer kan udføres ved isolering af nukleinsyrene fra legemsbestanddele, der indeholder virale partikler, frembringelse af cDNA-biblioteker under anvendelse af polynucleotidprober, der er baseret de nedenfor beskrevne 15 HCV-cDNA-prober, screening af bibliotekerne for kloner, der indeholder nedenfor beskrevne HCV-cDNA-sekvenser samt sammenligning af HCV-cDNA’eme fra de nye isolater med de nedenfor beskrevne cDNA'er. De deri indkodede polypeptider, eller i det virale genom, kan overvåges for immunologisk krydsreaktivitet under anvendelse af polypeptiderne og ovenfor 20 beskrevne antistoffer. Stammer, der passer med HCV-parameterne, som beskrevet i definitionsafsnittet ovenfor, kan umiddelbart identificeres. Andre metoder til identifikation af HCV-stammer vil være nærliggende for fagfolk baseret på den heri tilvejebragte information.

25 Industriel anvendelighed

Opfindelsen har i de heri beskrevne forskellige udførelsesformer mange industrielle anvendelser, hvoraf nogle beskrives i det følgende. HCV-cDNA'erne Kan anvendes til konstruktionen af prober til påvisning af HCV-30 nukleinsyre i prøver. De fra cDNA'erne afledte prober kan anvendes til påvisning af HCV-nukleinsyre i f.eks. kemiske syntesereaktioner. De kan 169 DK 176280 B1 også anvendes i screeningsprogrammer for antivirale midler, til bestemmelse af midlernes effekt ved hæmning af viral replikation i cellekultursystemer og dyremodelsystemer. HCV-Polynucleotidproberne er også velegnede til påvisning af virale nukleinsyrer hos mennesker og kan således tjene som en 5 basis for diagnosticering af HCV-infektioner hos mennesker.

De heri tilvejebragte cDNA'er tilvejebringer, udover det ovennævnte information og et middel til syntetisering af polypeptider, der indeholder epitoper af HCV. Polypeptiderne er velegende til påvisning af antistoffer mod 10 HCV-antigener. Der er heri beskrevet en række immunoanalyser for HCV-infektion baseret på rekombinante polypeptider, der indeholder HCV-epitoper, og disse vil finde kommerciel anvendelse til diagnosticering af HCV-induceret NANBH, til screening af bloddonorer for HCV-forårsaget infektiøs hepatitis og også til påvisning af kontamineret blod fra infektiøse 15 bloddonorer. De virale antigener vil også være anvendelige til overvågning af antivirale midlers virkningsfuldhed i dyremodelsystemer. Desuden vil de heri beskrevne polypeptider, der er afledt fra HCV-cDNA'erne, være anvendelige som vacciner til behandling af HCV-infektioner.

20 De fra HCV-cDNA'erne afledte polypeptider er, foruden de ovenfor nævnte anvendelser, velegnede til produktion af anti-HCV-antistoffer. De kan således anvendes i anti-HCV-vacciner. De som et resultat af immunisering med HCV-polypeptiderne producerede antistoffer er imidertid også velegnede til påvisning af forekomst af virale antigener i prøver. De kan 25 således anvendes til analyse for produktion af HCV-polypeptider i kemiske systemer. Anti-HCV-antistofferne kan også anvendes til overvågning af antivirale midlers virkningsfuldhed i screeningsprogrammer, hvor disse midler afprøves i vævskultursystemer. De kan også anvendes til passiv immunoterapi og til diagnosticering af HCV-forårsaget NANBH ved at 30 muliggøre påvisning af virale antigen (antigener) hos både bloddonorer og recipienter. En anden vigtig anvendelse for anti-HCV-antistoffer er til 170 DK 176280 B1 affinitetskromatografi til oprensning af virus og virale polypeptider. Det oprensede virus og virale polypeptidpræparationer kan anvendes i vacciner.

Det oprensede virus kan imidlertid også anvendes til udvikling af cellekultursystemer, hvori HCV repliceres.

5

Cellekultursystemer, der indeholder HCV-inficerede celler, kan have mange formål. De kan anvendes til produktion i relativt stor målestok af HCV, der normalt er et lavtitervirus. Systemerne kan også være egnede til klarlægning af viraets molekylære biologi og føre til udvikling af antivirale midler.

10 Cellekultursystemerne vil også være egnede til screening for antivirale midlers virkningsfuldhed. Desuden er HCV-permissive cellekultursystemer velegnede til produktion af svækkede stammer af HCV.

Anti-HCV-antistofferne og HCV-polypeptiderne, hvad enten de er naturlige 15 eller rekombinante, kan passende pakkes i analysesæt.

Den til isolering af HCV-cDNA anvendte metode, der består i at fremstille et cDNA-bibliotek, der er afledt fra et individs inficerede væv, i en ekspressionsvektor og at udvælge kloner, der producerer de ekspressions-20 produkter, som reagerer immunologisk med antistoffer i antistofindeholdende legemsbestanddele fra andre inficerede individer og ikke fra ikke-inficerede individer, kan også være anvendelige til isolering af cDNA'er, der er afledt fra andre hidtil ikke-karakteriserede sygdomsforbundne agenser, der udgøres af en genomisk bestanddel. Dette kunne igen føre til 25 isolering og karakterisering af disse agenser og til diagnostiske reagenser og vacciner mod disse andre sygdomsforbundne agenser.

Claims (22)

1. Rekombinant vektor kendetegnet ved, at den omfatter en sammenhængende nukleotidsekvens, hvilken sammenhængende sekvens 5 er i stand til selektivt at hybridisere til genomet af hepatitis C virus (HCV) eller komplementet deraf, hvor den sammenhængende nukleotidsekvens koder for en sammenhængende sekvens af mindst 8 aminosyrer i sekvensen i figur 47.

2. Rekombinant vektor ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den sammenhængende nukleotidsekvens kan hybridisere selektivt til enten den ene eller den anden streng af HCV cDNA'et deponeret hos American Type Cultuer Collection (ATCC) under ATCC nr. 40394, ATCC nr. 40388, eller ATCC nr. 40389, eller ATCC nr. 40390, eller ATCC nr. 40391, eller, ATCC 15 nr. 40514, eller ATCC nr. 40511, eller ATCC nr. 40512, eller ATCC nr. 40513.

3. Rekombinant vektor kendetegnet ved, at den omfatter en sammenhændende nukleotidsekvens, hvilken sammenhængende sekvens 20 er i stand til selektivt at hybridisere til genomet af hepatitis C virus (HCV) eller komplementet deraf, hvor den sammenhængende nukleotidsekvens koder for en sammenhængende sekvens af mindst 8 aminosyrer i sekvensen i figur 14.

4. Rekombinant vektor kendetegnet ved, at den omfatter en sammenhændende nukleotidsekvens, hvilken sammenhængende sekvens er i stand til selektivt at hybridisere til genomet af hepatitis C virus (HCV) eller komplementet deraf, hvor den sammenhængende nukleotidsekvens koder for en sammenhængende sekvens af mindst 8 aminosyrer i sekvensen i figur 30 26. DK 176280 B1

5. Rekombinant vektor kendetegnet ved, at den omfatter en sammenhændende nukleotidsekvens, hvilken sammenhængende sekvens er i stand til selektivt at hybridisere til genomet af hepatitis C virus (HCV) eller komplementet deraf, hvor den sammenhængende nukleotidsekvens koder 5 for en sammenhængende sekvens af mindst 8 aminosyrer i sekvensen i figur 32.

6. Rekombinant vektor kendetegnet ved, at den omfatter en sammenhændende sekvens af mindst 10 nukleotider, hvilken sammen- 10 hængende sekvens er i stand til selektivt at hybridisere til genomet af hepatitis C virus (HCV) eller komplementet deraf, hvor den sammenhængende sekvens er i Iambda-gt11 cDNA biblioteket deponeret hos ATCC under accession nr. 40394

7. Rekombinant vektor ifølge krav 6, kendetegnet ved at den sammenhængende nukleotidsekvens omfatter mindst 15 nukleotider.

8. Rekombinant vektor ifølge krav 6, kendetegnet ved at den sammenhængende nukleotidsekvens omfatter mindst 20 nukleotider. 20

9. Rekombinant vektor kendetegnet ved, at den omfatter en sammenhængende sekvens på mindst 10 nukleotider af enten den ene eller den anden streng af sekvensen i figur 47, hvor den sammenhængende nukleotidsekvens koder for en sammenhængende aminosyresekvens af 25 sekvensen i figur 47.

10. Rekombinant vektor ifølge krav 9, kendetegnet ved, at den sammenhængende nukleotidsekvens omfatter mindst 15 nukleotider.

11. Rekombinant vektor ifølge krav 9, kendetegnet ved, at den sammenhængende sekvens er mindst 20 nukleotider. DK 176280 B1

12. Rekombinant vektor ifølge ethvert af kravene 9 til 11,kendetegnet ved, at den sammenhængende aminosyresekvens er mindst 8 aminosyrer.

13. Rekombinant vektor omfattende et polynukleotid, kendetegnet ved, at polynukieotidet koder for et polypeptid, omfattet af en sammenhængende sekvens af mindst 8 aminosyrer kodet for af sekvensen i figur 47 og omfattende en HCV-antigendeterminant.

14. Rekombinant vektor omfattende et polynukleotid, kendetegnet ved, at polynukieotidet koder for et polypeptid, omfattet af en sammenhængende sekvens af mindst 8 aminosyrer kodet for af sekvensen i figur 14 og omfattende en HCV-antigendeterminant.

15. Rekombinant vektor omfattende et polynukleotid, kendetegnet ved, at polynukieotidet koder for et polypeptid, omfattet af en sammenhængende sekvens af mindst 8 aminosyrer kodet for af sekvensen i figur 26 og omfattende en HCV-antigendeterminant.

16. Rekombinant vektor omfattende et polynukleotid, kendetegnet ved, at polynukieotidet koder for et polypeptid, omfattet af en sammenhængende sekvens af mindst 8 aminosyrer kodet for af sekvensen i figur 32 og omfattende en HCV-antigendeterminant.

17. Rekombinant vektor ifølge ethvert af kravene 13 til 16, k e n d e t e g- n e t ved, at den sammenhængende aminosyresekvens omfatter mindst 10 aminosyrer.

18. Rekombinant vektor ifølge ethvert af kravene 13 til 16, kendeteg- 30 net ved, at den sammenhængende aminosyresekvens omfatter mindst 15 aminosyrer. DK 176280 B1

19. Rekombinant vektor ifølge ethvert af kravene 9 til 18, k e n d e t e g n e t ved, at den sammenhængende sekvens er kodet for i en sekvens som koder for et ikke-strukturelt viralprotein. 5

20. Rekombinant vektor ifølge ethvert af kravene 9 til 12 og 14 til 18, k ende t e g n e t ved, at den sammenhængende sekvens er kodet for i en sekvens som koder for et strukturelt viralprotein. 10

21. Værtscelle transformeret med en rekombinant vektor ifølge ethvert af kravene 1 til 20, k e n d e t e g n e t ved, at den rekombinante vektor omfatter en sekvens som koder for et polypeptid som er kodet for af HCV-genomet og omfattet af en HCV antigenisk determinant, og hvori den kodende sekvens er operabelt forbundet med en kontrolsekvens som er i 15 stand til at tilvejebringe ekspression af den kodende sekvens i værtscellen.

22. Fremgangsmåde til fremstilling af et polypeptid, kendetegnet ved, at fremgangsmåden fremstiller et polypeptid, omfattet af en HCV antigenisk determinant med en sammenhængende sekvens af mindst 8 aminosyrer 20 som er kodet for af HCV-genomet, omfattende trinnene: (a) tilvejebringelse af en rekombinant værtscelle, hvor værtscellen er transformeret med et ekspressionsystem, som koder for polypeptidet ifølge ethvert af kravene 1 til 20 og kontrolelementer til ekspression, indbefattende en promotor som er kompatibel med værtscellen, 25 (b) inkubering af værtscellen, og (c) isolering af polypeptidet.