DD297446A5 - Nanbv diagnostik und vakzine - Google Patents
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- DD297446A5 DD297446A5 DD90338836A DD33883690A DD297446A5 DD 297446 A5 DD297446 A5 DD 297446A5 DD 90338836 A DD90338836 A DD 90338836A DD 33883690 A DD33883690 A DD 33883690A DD 297446 A5 DD297446 A5 DD 297446A5
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Abstract
Die Erfindung betrifft NANBV-Diagnostik und Vakzine. Der Anmelder hat ein neues Virus, das Hepatitis-C-Virus, entdeckt, das sich als das aetiologische Hauptagens der durch Blut uebertragenen NANBH erwiesen hat. Die Erfindung, die teilweise auf neuen HCV-Sequenzen und Polypeptiden beruht, umfaszt die Anwendung dieser neuen Sequenzen und Polypeptide bei Immunoassays, bei der Sondendiagnostik, bei der Anti-HCV-Antikoerper-Produktion, in der PCR-Technik und der DNA-Rekombinationstechnik. In die Erfindung mit inbegriffen sind neue immunogene Polypeptide, die in HCV-cDNA enthaltenden Klonen codiert sind, neue Methoden zur Reinigung eines immunogenen HCV-Polypeptids und "anti-sense"-Polynukleotide, die von der HCV-cDNA abgeleitet sind.{NANBV-Diagnostik; Vakzine; NANBH; Hepatitis-C-Virus; HCV-Sequenzen; Polypeptide; Immunoassay; immunogene Polypeptide; Reinigung eines immunogenen Polypeptids; "anti-sense"-Polynukleotide; HCV-cDNA}
Description
Hierzu 40 Seiten Zeichnungen
Die Erfindung betrifft Materialien und Methodologien zur Beherrschung der Ausbreitung der Hepatitis-Nicht-A-Nicht-B-Virusinfektion (NANBV-Infektion). Insbesondere betrifft sie Polynucleotide, die von dem Genom eines ätiologischen Agens der Nicht-A-Nicht-B-Hepatitis (NANBH), Hepatitis-C-Virus (HCV), abgeleitet sind, darin codierte Polypeptide und Antikörper gegen die Polypeptide. Diese Reagenzien sind als Screoning-Agenzien für HCV und die HCV-Infektion und als protektive Agenzien gegen die Krankheit von Nutzen.
lmmun.Rev.62(1982)S.185
Zitiurte Patente EPOPub.No.318216 PCT Pub.No. WO 89/04669 U.S.Patent No.4341761 U.S.Patent No.4399121 U.S.Patent No.4427763 U.S.Patent No.4444 887 U.S.Patent No.4468917 U.S.Patent No.4472500 U.S.Patent No.4491632 U.S.Patent No.4493890
Hintergrund der Erfindung
Nicht-A-Nicht-B-Hepatitis (NANBH) ist eine übertragbare Krankheit oder Gruppe von Krankheiten, von denen angenommen wird, daß sie virusinduziert sind, und die sich von anderen Formen der mit Viren in Verbindung gebrachten Leberkrankheiten einschließlich derjenigen, die durch die bekannten Hepatitisviren, d. h. Hepatitis-A-Virus (HAV), Hepatitis-B-Virus (HBV) und Hepatitis-Delta-Virus (HDV), verursacht werden, als auch von der Hepatitis unterscheiden lassen, die durch Cytomegalievirus (CMV) oder Epstein-Barr-Virus (EBV) induziert wird. NANBH wurde zuerst bei Individuen identifiziert, bei denen eine Transfusion durchgeführt worden war. Die Übertragung vom Menschen auf Schimpansen und die Serienpassage (serial passage) in Schimpansen lieferten den Beweis, daß NANBH auf ein übertragbares infektiöses Agens oder übertragbare infektiöse Agenzien zurückzuführen ist.
Epidemiologisch erwiesen scheint, daß es drei NANBH-Typen gibt, und zwar den durch Trinkwasser übertragenen epidemischen Typ, den mit Blut oder Kanülen in Verbindung gebrachten Typ und den sporadisch auftretenden (community acquired) Typ. Die Zahl der als kausale Agenzien der NANBH in Frage kommenden Agenzien ist jedoch unbekannt.
Die klinische Diagnose und Identifizierung der NANBH erfolgte bisher hauptsächlich durch Ausschluß anderer viraler Marker. Zu den Verfahren für den Nachweis von mutmaßlichen NANBV-Antigenen und Antikörpern gehören die Agargeldiffusion, die Überwanderungselektrophorese, die Immunofluoreszenzmikroskopie, Immunelektronenmikroskopie, der Radiok munoassay und der heterogene Enzymimmunoassay. Keiner dieser Assays hat sich jedoch als hinreichend empfindlich, spezifisch und reproduzierbar für die Anwendung als diagnostischer Test für NANBH erwiesen.
Früher bestanden weder Klarheit noch Übereinstimmung hinsichtlich der Identität oder Spezifik der Antigen-Antikörper-Systeme, die mit den Agenzien der NANBH verbunden sind. Dies war zum mindesten teilweise auf die vorausgehende oder Coinfektion durch HBV mit NANBV bei Individuen und die bekannte Komplexität der löslichen und in Partikeln auftretenden, mit HBV verbundenen Antigene wie auch iuf die Integration der HBV-DNA in das Genom der Leberzellen zurückzuführen. Zusätzlich begeht die Möglichkeit, daß NANBH durch mehr als ein infektiöses Agens verursacht wird, und die Möglichkeit der NANBH-Fehldiagnosr. Darüber hinaus ist unklar, was die serologischen Assays im Serum von Patienten mit NANBH nachweisen. Angenommen wurde, daß die Agargeldiffussion und Überwanderungselektrophorese Autoimmunantworten oder nichtspezifische Protcinwech elwirkungen, die manchmal zwischen Serumproben auftreten, nachweisen, und daß sie keine spezifischen NANBV-Antigen-Antikörper-Reaktionen darstellen. Der Immunofluoreszenztest und der heterogene Enzymimmunoassy und der Radioimmunoassay scheinen niedrige Werte eines rheumafaktorähnlichen Materials nachzuweisen, das häufig im Serum von Patienten mit NANBH wie auch bei Patienten mit anderen hepatischei. <nd nichthepatischen Erkrankungen zugegen ist. Ein Teil der nachgewiesenen Reaktionsfähigkeit kann Antikörper-Wirt-bestimmte (antibody to host-determined) zytoplasrnatische Antigene darstellen.
Es hat eine Reihe von NANBV-Anwärtern gegeben. Siehe z. B. die Literaturstudien von Prince (1983). Feinstone und Hoofnagle (1984) und Overby (1935,1986,1987) und den Artikel von Iwarson (1987). Es gibt jedoch keinen Beweis, daß einer dieser Anwärter das ätiologische Agens der NANBH darstellt.
Der Bedarf an empfindlichen, spezifischen Methoden für das Screening und die Identifizierung der Träger von NANBV und von durch NANBV infiziertem Blut und Blutprodukten ist bedeutend. Posttransfusionshepatitis (PTH) kommt bei annähernd 10% der Transfusionspatienten vor, und NANBH macht bis zu 90% diesor Fälle aus. Das Hauptproblem bei dieser Krankheit ist die häufige Progression zu einer chronischen Leberschädigung (25-55%).
Die sorgfältige Behandlung der Patienten und die Vorbeugung der NANBH-Übertranung durch Blut und Blutprodukte oder durch engen Personenkontakt erfordern zuverlässige Screening-, Diagnose- und Progn jsemittel, um Nucleinsäuren, Antigene und Antikörper mit Bezug auf NANBV nachzuweisen. Außerdem werden wirksame Vakzine und immunotherapeutische Mittel für die Prophylaxe und/oder Behandlung der Krankheit benötigt.
Der Anmelder hat ein neues Virus, das Hepatitis-C-Virus (HCV), entdeckt, das sich als das ätiologische Hauptagens der hämatogenen (blood-borne) NANBH (BB-NANBH) erwiesen hat. Die erste Arbeit des Anmelders, die eine partielle genomische Sequenz des Prototyp-HCV-lsolats, CDC/HCV1 (auch HCV1 genannt), beinhaltet, wird in der EPO-Veröffentlichung Nr. 318 216 (veröffentlicht am 31. Mai 1989) und der PCT-Veröffentlichung Nr. WO 89/04669 (veröffentlicht am 1 .Juni 1989) beschrieben. Die Offenbarungen dieser Patentanmeldungen und alle entsprechenden nationalen Patentanmeldungen sind hier durch Bezugnahme einbezogen. Diese A^., Meldungen unterrichten u. a. über DNA-Rekombinationsmethoden zur Klonierung und Expression von HCV-Sequenzen, HCV-Polypeptide, HCV-immunodiagnostische Techniken, HCV-sondendiagnostische Techniken, Anti-HCV-Antikörper und Methoden zur Isolierung neuer HCV-Sequenzen einschließlich Sequenzen neuer HCV-Isolate.
Offenbarung der Erfindung
Die Erfindung beruht teilweise auf neuen HCV-Sequenzen und Polypeptiden, die in der EPO-Veröffentlichung Nr.318 216 oder in der PCT-Veröffentlichung Nr. WO 89/04669 nicht offenbart werden. Mit eingeschlossen in die Erfindung ist die Anwendung dieser neuen Sequenzen und Polypeptide u.a. in der Immunodiagnostik, Sondendiagnostik, Anti-HCV-Antikörper-Gewinnung, PCR-Technik und DNA-Rekombinationstechnik. Mit eingeschlossen in die Erfindung werden auch neue Immunoassays, die auf der Immunogenität der hier offenbarten HCV-Polypeptide beruhen. Der neue hier beanspruchte Gegenstand hat, sowohl er unter Anwendung von Techniken entwickelt wurde, die z. B. in der EPO-Veröffentlichung Nr.318216 beschrieben wurden, ein Prioritätsdatum, das jener Veröffentlichung oder einem Zweitstück derselben vorhergeht. Somit macht die Erfindung neue Zusammensetzungen und Methoden verfügbar, die für das Screenen von Proben auf HCV-Antigene und Antikörper und für die Behandlung von HCV-lnfektionen von Nutzen sind.
Demgemäß stellt einen Aspekt der Erfindung ein rekombinantes Polynucleotid dar, das eine von HCV-cDNA abgeleitete Sequenz umfaßt, wobei die HCV-cDNA in Klon 13i oder Klon 26j oder Klon 59a oder Klon 84a oder Klon CA156e oder Klon 167b oder Klon pi 14a oder Klon CA216a oder Klon CA290a oder Klon ag30a oder Klon 205a oder Klon 18g oder Klon 16jh ist oder wobei die HCV-cDNA von einer durch die Nucleotidnummern -319 bis 1348 oder 8659 bis 8866 in Fig. 17 angegebenen Sequenz ist. Einen anderen Aspekt der Erfindung stellt ein gereinigtes Polypeptid dar, das ein in HCV-cDNA codiertes Epitop umfaßt, wobei die HCV-cDNA von einer durch die Nucleotidnummern -319 bis 1348 oder 8659 bis 8866 in Fig. 17 angegebenen Sequenz ist. Einen weiteren Aspekt der Erfindung stellt ein immunogenes Polypeptid dar, das durch eine. <t einem rekombinanten Expressionsvektor transformierte Zelle erzeugt wird, der ein ORF einer von HCV-cDNA abgeleiteten DNA umfaßt, wobei die HCV-cDNA aus einer Sequenz besteht, die von der HCV-cDNA-Sequenz in Klon CA279a oder Klon CA74a oder Klon 13i oder Klon CA290a oder Klon 33coder Klon 40b oder Klon 33boder Klon 25coder Klon 14coder Klon 8f oder Klon 33f oder Klon 33g oder Klon 39c oder Klon 15e abgeleitet ist, und wobei das ORF operabel an eine Kontrollsequenz gebunden ist, die mit einem erwünschten Wirt verträglich ist.
Einen weiteren Aspekt der Erfindung bildet ein Peptid, das einen HCV-Epitop umfaßt, wobei das Peptid die Formel AAx-AAy
hat, worin χ und y die in Fig. 17 angegebenen Aminosäurenummern bezeichnen, und wobei das Peptid aus der aus
codiert ist, wobei die von einer durch die Nucleotidnummern -319 bis 1348 oder 8659 bis 8866 in Fig. 17 angegebenen Sequenzist oder die in Klon 13i oder Klon 26j oder Klon 59a Klon 84a oder Klon CA15f>e oder Klon 167 boder Klon pi 14 oder Klon CA216aoder Klon CA290a oder Klon ag30a oder Klon 205a oder Klon 18g oder Klon 16jh vorhandene Sequenz ist.
-!inen weiteren Aspekt der Erfindung stellt ein Präparat von gereinigten polyklonalen Antikörpern der, die gegen ein Polypeptidgerichtet sind, das aus einem Epitop besteht, das in HCV-cDNA codiert ist, wobei die HCV-cDNA von einer durch die
ag30a oder Klon 205a oder Klon 18g oder Klon 16jh vorhandene Sequenz ist.
besteht, die von einer HCV-cDNA-Sequenz abgeleitet ist, die durch die Nucleotidnummern -319 bis 1348 oder 8659 bis 8866 in
der eine Polynucleotidsonde umfaßt, die eine Nucleotidsequenz von etwa 8 oder mehr Nucleotiden enthält, wobei die
in Fig. 17 angegebenen Sequenz ist, wobei die Polynucleotidsonde in einem geeigneten Container enthalten ist.
codiert ist, die von einer durch die Nucleotidnummern -319 bis 1348 oder 8659 bis 8866 in Fig. 17 angegebenen Sequenz ist, oderwobei die HCV-cDNA in Klon 13ioderKlon 26j oder Klon 59a oder Klon 84aoderKlonCA156eoderKlon167boderKlonpi14aoder Klon CA216a oder Klon CA290a oder Klon ag30a oder Klon 205a oder Klon 18g oder Klon 16jh ist.
antigenes Polypeptid umfaßt, das ein HCV-Epitop enthält, das in HCV-cDNA codiert ist, die von einer durch die
oder Klon 18g oder Klon 16jh ist.
antigenes Polypeptid umfaßt, das von HCV-cDNA in Klon CA279a oder Klon CA74a oder Klon 13! oder Klon CA290a oder
exprimiert ist, wobei das antigene Polypeptid in einem geeigneten Container vorhanden ist.
umfaßt:
(a) Umsetzung der Nucleinsäuren der Probe mit einer Polynucleotidsonde für HCV, wobei die Sonde aus einer HCV-Sequenzbesteht, die von einer HCV-cDNA-Sequenz abgeleitet ist, die von der durch die Nucleotidnummern -319 bis 1348 oder 8659 bis8866 in Fig. 17 angegebenen Sequenz ist, und wobei die Umsetzung unter Bedingungen erfolgt, die die Bildung eines
gebildeten Polynucleotid-Duplexes, der die Sonde enthält.
Einen weiteren Aspekt der Erfindung bildet ein Immunoassay für den Nachweis eines HCV-Antigens, der folgendes umfaßt: (a) Inkubation einer Probe, von der angenommen wird, daß sie ein HCV-Antigen enthält, mit einem Antikörper, der gegen ein HCV-Epitop gerichtet ist, das in HCV-cDNA codiert ist, wobei die HCV-cDNA von der durch die Nucleotidnummern -319 bis 1348 oder 8659 bis 8866 in Fig. 17 angegebenen Sequenz Ist oder die Sequenz ist, die in Klon 13i oder Klon 26j oder Klon 59a oder Klon 84a oder Klon CA156e oder Klon 167 b oder Klon pi 14a oder Klon CA216a oder Klon CA290a oder Klon ag30a oder Klon 2C5a oder Klon 18g oder Klon 16jh vorhanden ist, und wobei die Inkubation unter Bedingungen erfolgt, die die Bildung eines Antigen-Antikörper-Komplexes erlauben; und (b) Nachwels eines in Stufe (a) gebildeten Antikörper-Antigen-Komplexes, der den Antikörper enthält.
Einen weiteren Aspekt der Erfindung bildet ein Immunoassay für den Nachweis von Antikörpern, die gegen ein HCV-Antigen gerichtet sind, der folgendes umfaßt:
(a) Inkubation einer Probe, von der angenommen wird, daß sie Anti-HCV-Antikörpor enthält, mit einem Antigenpolypeptid, das oin E oitop enthält, das in HCV-cDNA codiert ist, wobei die HCv-i INA von der durch die ι iucleotidnummern -319 bis 1348 oder 8.-,. 3 bis 8866 in Fig. 17 angegebenen Sequenz ist oder die Sequenz ist, die in Klon 13 i oder Klon 26j oder Klon 59 a oder Klon 84 a ooerKion CA 156e oder Klon 167boderKlon pi14aoder Klon CA216aoder Klon CA 290 a oder Klon ag30aoderKlon 205aoder Klon 18g oder Klon 16jh vorhanden ist, und wobei die Inkubation unter Bedingungen erfolgt, die die Bildung eines Antigen-Antikörper-Komplexes gestatten; und Nachweis eines in Stufe (a) gebildeten Antikörper-Antigen-Komplexes, der das Antigenpolypeptid enthält.
Einen weiteren Aspekt stellt ein Vakzin zur Behandlung der HCV-lnfektion dar, das ein immunogenes Polypeptid umfaßt, welches ein HCV-Epitop enthält, das in HCV-cDNA codiert ist, wobei die HCV-cDNA von einer durch die Nucleotidnummern -319 bis 1348 oder 8659 bis 8866 in Fig. 17 angegebenen Sequenz ist oder die Sequenz ist, die in Klon 13i oder Klon 26 j oder Klon 59a oder Klon 84a oder Klon CA 156e oder Klon 167b oder Klon pi 14a oder Klon CA216a oder Klon CA290a oder Klon ag30a oder Klon 205a oder Klon 18g oder Klon 16jh vorhanden ist, und wobei das immunogene Polypeptid in einer pharmakologisch wirksamen Dosis in einem pharmazeutisch annehmbaren Vehikel vorhanden ist.
Einen weiteren Aspekt der Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung von Antikörpern gegen HCV dar, das die Applikation eines isolierten immunogenen Polypeptide bei einem Individuum umfaßt, das ein HCV-Epitop enthält, das in HCV-cDNA codiert ist, wobei die HCV-cDNA von einer durch die Nucleotidnummern -319 bis 1348 oder 8659 bis 8866 in Fig. 17 angegebenen Sequenz ist oder die Sequenz ist, die in Klon CA279a oder Klon CA 74a oder Klon 13i oder Klon CA290a oder Klon 33coder Klon 40boder Klon 33boder Klon 25c oder Klon 14c oder Klon 8·'oder Klon 33f oder Klon 33g oder Klon 39c oder Klon 15e vorhanden ist, und wobei das immunogene Polypeptid in einer pharmakologisch wirksamen Dosis in einem pharmazeutisch annehmbaren Vehikel vorhanden ist.
Einen weiteren Aspekt der Erfindung bildet ein „anti-sense"-Polynucleotid, das von HCV-cDNA abgeleitet ist, wobei die HCV-cDNA die in Fig. 17 dargestellte ist.
Einen weiteren Aspekt der Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung des gereinigten Fusionspolypeptids C100-3, dar, das folgendes umfaßt:
(a) Bereitstellung eines rohen Zell-Lysats, das das Polypeptid C100-3 enthält,
(b) Behandlung des rohen Zell-Lysats mit Aceton in einer Menge, die das Polypeptid fällt,
(c) Isolieren und Löslichmachen der gefällten Substanz,
(d) Isolieren des Polypeptids C100-3 durch Anlonenaustauschchromatographie und
(e) weitere Isolierung des Polypeptids C100-3 von Stufe (d) durch Gelfiltration.
Fig. 1: zeigt die Sequenz der HCV-cDNA in Klon 12f und die darin codierten Aminosäuren.
Fig. 2: zeigt die HCV-cDNA-Sequenz in Klon k9—1 und die darin codierten Aminosäuren.
Fig. 3: zeigt die Sequenz von Klon 15e und die darin codierten Aminosäuren.
Fig. 4: zeigt die Nucleotidsequenz von HCV-cDNA in Klon 13 i, die darin codierten Aminosäuren und die Sequenzen, die mit
Klon 12f überlappen
Fig. 5: zeigt die Nucleotidsequenz von HCV-cDNA in Klon 26j, die darin codierten Aminosäuren und die Sequenzen, die Klon 13t
überlappen
Fig, 6: zeigt die Nucleotidsequenz von HCV-cDNA in Klon CA 59a, die darin codierten Aminosäuren und die Sequenzen, die mit
den Klonen 26j und K9-1 überlappen
Fig. 7: zeigt die Nucleotidsequenz von HCV-cDNA in Klon CA84a, die darin codierten Aminosäuren und die Sequenzen, die mit
Klon CA59a überlappen
Fig. 8: zeigt die Nucleotidsequenz von HCV-cDNA in Klon CA 156e, die darin codierten Aminosäuren und die Sequenzen, die
mit Klon CA84a überlappen
Fig. 9: zeigt die Nucleotidsequenz von HCV-cDNA in Klon CA 167 b, die darin codierten Aminosäuren und die Sequenzen, die
Klon CA156e überlappen
Fig. 10: zeigt die Nucleotidsequenz von HCV-cDNA in Klon CA216a, die darin codierten Aminosäuren und die Überlappung mit
Klon CA 167 b
Fig. 11: zeigt die Nucleotidsequenz von HCV-cDNA in Klon CA290a, die darin codierten Aminosäuren und die Überlappung mit KlonCA216a.
Fig. 12: zeigt die Nucleotidsequenz von HCV-cDNA in Klon ag 30a und die Überlappung mit Klon CA290a. Fig. 13: zeigt die Nucleotidsequenz von HCV-cDNA in Klon CA205a und die Überlappung mit der HCV-cDNA-Sequenz in Klon
CA290a
Fig. 14: zeigt die Nucleotidsequenz von HCV-cDNA in Klon 18g und die Überlappung mit der HCV-cDNA-Sequenz in
Klon ag30a
Fig. 15: zeigt die Nucleotidsequenz von HCV-cDNA in Klon 16jh, die darin codierten Aminosäuren und die Überlappung von Nucleotiden mit der HCV-cDNA-Sequenz in Klon 15e.
Fig. 16: zeigt das ORF von HCV-DNA, abgeleitet von den Klonen pi14a, CA167b, CA156e, CA84a, CA59a, K9-1,12f, 14i, 11 b, 7f,7e,8h,33c,40b,37b,35,36,81,32,33b,25c,14c,8f,33f,33g,39c,35f,19g,26gund15e.
Fig. 17: zeigt den codierenden Strang der kompilierten HCV-cDNA-Sequenz, die von den oben beschriebenen Klonen abgeleitet ist, und die kompilierte HCV-cDNA-Sequenz, die in der EPO-Veröffentlichung Nr.318216 veröffentlicht ist. Dia Klone, von denen die Sequenz abgeleitet wurde, sind b114a, 18g, ag30a, CA205a, CA290a, CA21Ga, pi 14a, CA 167b, CA 156θ, CA84a,CA59a,K9-1 (auch k9-1 genannt), 26j, 131,12^141,11^7^76,8^330,40^37^35,36,81,32,33b, 25c, 14c, 8f, 33f, 33g, 39c, 35f, 19g, 26g, 15e, b5a und 16jh. Die drei horizontalen Striche in der Figur oberhalb der Sequenz geben die Position des mutmaßlichen Methionin-Initiationscodons an; die beiden vertikalen Striche geben die ersten und . letzten Nucleotide der veröffentlichten Sequenz an. Die Figur zeigt auch die Aminosäuresequenz des mutmaßlichen Polyproteins, das in der HCV-cDNAcodiert ist.
Fig. 18: ist ein Diagramm der immunologischen Kolonie-Screening-Methode, die bei antigenen Kartierungsuntersuchungen angewendet wird.
Fig. 19: zeigt die Hydrophobieprofile von Polyproteinen, die im HCV und im West-Nile-Virus codiert sind.
Fig. 20: Ist eine Darstellung (tracing) des Hydrophilie/Hydrophobieprofils und des antigenen Index des mutmaßlichen HCV-Polyproic'ns.
Fig. 21: zeigt die konservierten colinearen Peptide in HCV und Flaviviren.
Verfahren zur Durchführung der Erfindung
I. Definitionen
Der Terminus „Hepatitis-C-Virus" wurde von den Fachleuten für ein bislang unbekanntes ätiologisches Agens der NANBH reserviert. Demgemäß bezieht sich der Terminus „Hepatitis-C-Virus" (HCV) hier auf ein NANBH verursachendes Agens, das früher als NANBV und/oder BB-NANBV bezeichnet wurde. DieTermini HCV, NANBVu.id BB-NANBV werden hier als Synonyme benutzt. In Erweiterung dieser Terminologie wird die durch das HCV verursachte und früher als NANB-Hepatitis (NANBH) bezeichnete Krankheit als Hepatitis C bezeichnet. Die Termini NANBH und Hepatitis C können hier als Synonyme verwendet werden.
DerTerminus „HCV" bezeichnet hier eine Virusspezies, deren pathogene Stämme NANBH verursachen, und attenuiorte Stämme oder fehlerhafte interferierende Partikeln, die davon abgeleitet sind. Wie nachstehend gezeigt wird, besteht das HCV-Genom aus RNA. Bekannt ist, daß RNA-haltige Viren relativ hohe Geschwindigkeiten der spontanen Mutation aufweisen, d. h. laut Berichten in der Größenordnung von 10~3 bis 10"4 je aufgenommenes Nucleotid (Fields u. Knipe, 1986). Daher gibt es multiple Stämme, die virulent oder avirulent sein können, innerhalb der unten beschriebenen HCV-Spezies. Die hier beschriebenen Zusammensetzungen und Methoden ermöglichen die Propagation, Identifizierung, den Nachweis und die Isolierung der verschiedenen HCV-Stämme oder -Isolate. Außerdem erlaubt die hie: gemachte Offenbarung die Präparation von diagnostischen Mitteln und Vakzinen für die verschiedenen Stämme wie auch Zusammensetzungen und Methoden, die bei Screening-Verfahren für antivirale Agenzien für pharmakologische Zwecke, z.B. Agenzien, die die Replikation des HCV inhibieren, von Nutzen sind.
Die hier verfügbar gemachten Informationen sind - auch wenn sie vom Prototyp-Stamm oder -Isolat des HCV, nachstehend als CDC/HCV1 (auch HCV1 genannt) bezeichnet, abgeleitet sind - ausreichend, um es dem Virus-Systematiker zu erlauben, andere Stämme zu identifizieren, die zu der Spezies gehören. Die hier verfügbar gemachten Informationen lassen die Annahme zu, daß das HCV ein den Flaviviren ähnliches Virus ist. Die Morphologie und Zusammensetzung der Flaviviruspartikeln sind bekannt und werden von Brinton (1986) diskutiert. Was die Morphologie betrifft, so enthalten die Flaviviren im allgemeinen ein zentrales Nucleocapsid, das von einer Lipiddoppelschicht umgeben ist. Die Virionen sind sphärisch und haben einen Durchmesser von etwa 40-50nm. Ihre Innenkörper (cores) haben einen Durchmesser von etwa 25-30nm. An der Außenfläche der Virionpeplos befinden sich Oberflächenprojektionen von etwa 5-1 Onm Länge mit terminalen Knobs von etwa 2 nm Durchmesser. Verschiedene HCV-Stämme oder -Isolate enthalten wahrscheinlich Variationen an der Aminosäure und den Nucleinsäuren im Vergleich zum Prototyp-Isolat HCV1. Es wird erwartet, daß viele Isolate beträchtliche Homologie (d. h. über 40%) in der Gesamtaminosäuresequenz im Vergleich zu HCV1 zeigen. Es kann jedoch auch festgestellt werden, daß es andere weniger homologe HCV-lsolate gibt. Diese wären als HCV-Stämme nach verschiedenen Kriterien wie einem ORF von annähernd 9000 Nucleotiden bis annähernd 12000 Nucleotiden, die ein Polyprotein von ähnlicher Größe wie das HCV1 codieren, ein codiertes Polyprotein von ähnlichem hydrophobem und antigenem Charakter wie beim HCV1, und der Gegenwart von colinearen Paptidsequenzen, die mit HCV1 konserviert sind, zu definieren. Außerdem wäre das Genom eine Plusstrang-RNA. HCV codiert zum mindesten ein Epitop, das immunologisch mit einem Epitop in dem HCV-Genom identifizierbar ist, von dem die hier beschriebenen cDNAs abgeleitet sind; vorzugsweise ist das Epitop in einer hier beschriebenen Aminosäuresequenz enthalten. Das Epitop ist im Vergleich zu anderen bekannten Flaviviren für das HCV einmalig. Die Einmaligkeit des Epitops kann durch seine immunologische Reaktivität mit anti-HCV-Antikörpern und die mangelnde immunologische Reaktivität mit Anitkörpern auf andere Flavivirusspezies bestimmt werden. Verfahren zur Bestimmung der immunologischen Reaktivität sind im Fachgebiet bekannt, z. B. Bestimmung durch Radioimmunoassay, ELISA und Hämagglutination, und verschiedene Beispiele für geeignete Techniken für Assays werden hier beschrieben.
Ergänzend zu dem oben Gesagten sind die folgenden Parameter der Nucleinsäurehomologie und der Aminosäurohomologie entweder allein oder kombiniert bei der Identifizierung eines Stamms oder Isolats als HCV anwendbar. Da HCV-Stämme und -isolate evolutionär verwandt sind, ist zu erwarten, daß die Gesamthomologie der Genome auf dem Nucleotidniveau vermutlich etwa 40% oder größer, wahrscheinlich etwa 60% oder größer und noch wahrscheinlicher etwa 80% oder größer sein wird; zusätzlich ist zu erwarten, daß entsprechende benachbarte Sequenzen von mindestens etwa 13 Nucleotiden vorliegen. Die Übereinstimmung zwischen der genomischen Sequenz des mutmaßlichen HCV-Stamms und der CDC/HCV 1-cDNA-Sequenz kann nach im Fachgebiet bekannten Techniken bestimmt werden. Beispielsweise kann sie durch direkten Vergleich der Sequenzinformation des Polynucleotide von dem mutmaßlichen HCV und der hier beschriebenen HCV-cDNA-Sequenz(en) bestimmt werden. Sie kann beispielsweise auch durch Hybridisierung der Polynucleotide unter Bedingungen bestimmt werden.
die stabile Duplexe zwischen homologen Regionen bilden (z. B. jene, die vor der S,-Digestion benutzt würden), worauf Digestion mit (einer) einzelsträngigen spezifischen Nuclease(n) folgt, woran sich Größenbestimmung der digerierten Fragmente anschließt. Wegen der evolutionären Verwandtschaft der HCV-Stämme oder -Isolate sind die mutmaßlichen HCV-Stämme oder -Isolate durch ihre Homologie auf dem Polypeptldniveau identifizierbar. Im allgemeinen wird angenommen, daß die HCV-Stämme oder -Isolate zu mehr als etwa 40% homolog sind, wahrscheinlich zu mehr als etwa 70% homolog sind und noch wahrscheinlicher zu mehr als etwa 80% hc;nolog sind, und einige können auf dem Polypeptidniveau sogar zu mehr als etwa 90% homolog sein. Die Techniken zur Bestimmung der Aminosäuresequenzhomologie sind im Fachgebiet bekannt. Beispielsweise kann die Aminosäuresequenz direkt bestimmt und mit den hier verfügbar gemachten Sequenzen verglichen werden. Zum anderen kann die Nucleotidsequenz des genomischen Materials des mutmaßlichen HCV (gewöhnlich über ein cDNA-Zwischenprodukt) bestimmt werden, die darin codierte Aminosäuresequenz kann bestimmt werden, und die entsprechenden Regionen können verglichen werden.
Ein Polynucleotid, „abgeleitet von" einer bestimmten Sequenz, bezieht sich hier auf eine Polynucleotidsequenz, die aus einer Sequenz von ungefähr mindestens etwa 6 Nucleotiden, vorzugsweise mindestens etwa 8 Nucleotiden, besser mindestens etwa 10-12 Nucleotiden und am besten etwa 15-20 Nucleotiden besteht, die einer Region der bestimmten Nucleotidsequenz entsprechen. „Entsprechen(d)" bedeutet homolog mit oder komplementär zu der bestimmten Sequenz. Vorzugsweise ist die Sequenz der Region, von der das Polynucleotid abgeleitet ist, homolog mit oder komplementär zu einer Sequenz, die für ein HCV-Genom einmalig ist. Ob eine Sequenz für das HCV-Genom einmalig ist oder nicht, kann durch in Fachkreisen bekannte Techniken bestimmt werden. Beispielsweise kann dio Sequenz mit Sequenzen in Datenbanken, z. B. einer Genbank, verglichen werden, um zu bestimmen, ob sie in einen nicht infizierten Wirt oder anderen Organismen vorhanden ist. Die Sequenz kann auch mit den bekannten Sequenzen anderer viraler Agenzien unter Einschluß derjenigen, von denen bekannt ist, daß sie Hepatitis induzieren, z.B. HAV, HBV und HDV, und mit anderen Vertretern der Flaviviren verglichen werden. Die Übereinstimmung oder Nichtübereinstimmung der abgeleiteten Sequenz mit anderen Sequenzen kann auch durch Hybridisierung unter den geeigneten kontrollierten Bedingungen (stringency conditions) bestimmt werden. Hybridisierungstechniken zur Bestimmung der Komplementaritäi von Nucleinsäuresequenzen sind im Fachgebiet bekannt und werden nachstehend diskutiert. Siehe auch z. B. Maniatis et al. (1982). Ferner kann die fehlende Übereinstimmung der Duplex-Polynucleotide, die durch Hybridisierung gebildet wurden, nach bekannten Techniken bestimmt werden, die z. B. die Digestion mit einer Nuclease wie der Nuclease S1 einschließen, die spezifisch Einzelstrangbereiche in Duplex-Polynucleotiden digeriert. Regionen, von denen typische DNA-Sequenzen „abgeleitet" werden können, umfassen z.B. Regionen, die spezifische Epitope codieren, und nichttranskribierte und/oder nichttranslatierte Regionen, ohne daß sie sich darauf beschränken.
Das abgeleitete Polynucleotid ist nicht notwendigerweise physisch von der dargestellten Nucleotidsequenz abgeleitet, kann aber auf jede Weise erzeugt werden, z. B. durch chemische Synthese oder DNA-Replikation oder Umkehrtranskription oder Transkription. Ferner können Kombinationen der Regionen, die der der bestimmten Sequenz entsprechen, auf im Fachgebiet bekannten Wegen modifiziert werden, um mit einer vorgesehenen Verwendung vereinbar zu sein.
Ähnlich bezieht sich ein Polypeptid oder eine Aminosäuresequenz, „abgeleitet von" einer bestimmten Nucleinsäureseque />z, auf ein Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz hat, die mit der eines in der Sequenz codierten Polypeptide identisch ist, oder einen Teil desselben, wobei der Teil aus mindestens 3-5 Aminosäuren und besonders bevorzugt aus mindestens 8-10 Aminosäuren und noch stärker bevorzugt aus mindestens 11-15 Aminosäuren besteht oder mit einem in der Sequenz codierten Polypeptid immunologisch identifizierbar ist.
Ein rekombinantes oder abgeleitetes Polypeptid ist nicht notwendigerweise aus einer bestimmten Nuclainsäuresequenz, z. B. den hier beschriebenen HCV-cDNA-Sequenzen, oder aus einem HCV-Genom translatiert; es kann auf jede Weise erzeugt werden, incl. z. B. durch chemische Synthese oder Expression eines rekombinanten Expressionssystems oder Isolierung aus mutierten HCV. Ein rekombinantes oder abgeleitetes Polypeptid kann ein Analogon oder mehrere Analoga der Aminosäuren oder nicht in der Natur vorkommenden Aminosäuren in seiner Sequenz enthalten. Verfahren zum Inserieren von Analoga der Aminosäuren in eine Sequenz sind im Fachgebiet bekannt. Es kann auch eine oder mehrere Markierungen enthalten, die in Fachkreisen bekannt sind.
Der Terminus „rekombinantes Polynucleotid" bedeutet hier ein Polynucleotid genomischen, cDNA-, halbsynthetischen oder synthetischen Ursprungs, das auf Grund seines Ursprungs oder der Manipulation (1) nicht mit dem gesamten Polynucleotid oder einem Teil eines Polynucleotide assoziiert ist, mit dem es in der Natur assoziiert ist, (2) an ein Polynucleotid gebunden ist, das von dem verschieden ist, an das es in der Natur gebunden ist, oder (3) in der Natur nicht vorkommt. Der Terminus „Polynucleotid" bezieht sich hier auf eine polymere Form von Nucleotiden beliebiger Länge, entweder Ribonucleotide oder Desoxyribonucleotide. Dieser Terminus bezieht son nur auf die Primärstruktur des Moleküls. Somit schließt dieser Terminus doppelsträngige und einzelsträngige DNA und doppelsträngige und einzelsträngige RNA ein. Er umfaßt auch bekannte Modifizierungstypen, z. B, im Fachgebiet bekannte Markierungen, Methylierung, „Caps", Substitution eines oder mehrerer natürlich vorkommender Nucleotide mit einem Analogon, Internucleotidmodifikationen wie z. B. jene mit ungeladenen Bindungen (z. B. Methylphosphonate, Phosphotriester, Phosphoamidate, Carbamate usw.) und mit geladenen Bindungen (z. B. Phosphorthioate, Phosphordithioate usw.), jene, die anhängende Teile enthalten, z. B. Proteine (incl. z. B. Nucleasen, Toxine, Antikörper, Signalpeptide, Poly. L Lysin usw.), jene mit interkalierenden Agenzien (z.B. Acridin, Psoralen usw.), jene, die Chelatbildner enthalten (z. B. Metalle, radioaktive Metalle, Bor, oxydative Metalle usw.), jene, die Alkylierungsmittel enthalten, jene mit modifizierten Bindungen (z.B. alpha-anomere Nucleinsäuren usw.) und nichtmodifizierte Formen des Polynucleotide. Der Terminus „gereinigtes virales Polynucleotid" bezieht sich auf ein HCV-Genom oder ein Fragment desselben, das im wesentlichen frei ist, d. h. weniger als etwa 50%, bevorzugt weniger als etwa 70% und noch stärker bevorzugt weniger als etwa 90% zellulärer Komponenten enthält, mit denen das virale Polynuclaotid natürlich assoziiert ist. Techniken zur Reinigung von viralen Polypeptiden sind im Fachgebiet bekannt, und Beispiele für diese Techniken werden nachstehend diskutiert. Der Terminus „gereinigtes virales Polynucleotid" bezieht sich auf ein HCV-Genom oder ein Fragment desselben, das im wesentlichen frei ist, d. h. weniger als etwa 20%, bevorzugt weniger als etwa K0% und noch stärker bevorzugt weniger als etwa 70% der Polypeptide enthält, mit denen das virale Polynucleotid natürlich assoziiert ist. Techniken zur Reinigung viraler Polynucleotide von Viruspartikeln sind im Fachgebiet bekannt und umfassen z. B. die Spaltung der Partikel mit einem chaotropen Agens und die Trennung des/der Polynucleotids/Polynucleotide und Polypeptide du ch lonenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie und Sedimentation nach der Dichte.
„Rekombinante Wirtszellen", „Wirtszellen", „Zellen", „Zellinien", „Zellkulturen" und andere derartige Termini, die Mikroorganismen oder höhere eukaryontische Zellinien bezeichnen, die als einzellige Gebilde kultiviert wurden, beziehen sich auf Zellen, die als Reziplenten für rekombinante Vektor- oder andere Transfer-DNA benutzt werden können oder wurden, und umfassen die Nachkommenschaft der ursprünglichen Zelle, die transfiziert wurde. Es versteht sich, daß die Nachkommenschaft einer einzelnen Elternzelle nicht unbedingt in der Morphologie oder im genomischen oder gesamten DNA-Komplement vollständig identisch mit dem ursprünglichen Elternteil ist, was auf natürliche, zufällige oder beabsichtigte Mutation zurückzuführen ist.
Ein „Replikon" ist ein genetisches Element, z. B. sin Plasmid, ein Chromosom, ein Virus, ein Cosmid usw., das sich als autonome Einheit der Polynucleotidreplikation in einer Zelle verhält, d. h. zur Replication unter seiner eigenen Kontrolle in der Lage ist.
Ein „Vektor" ist ein Replikon, an das ein anderes Polynuclr,otidsegment gebunden ist, um die Replikation und/oder Expression des gebundenen Segments herbeizuführe:.
„Kontrollsequenz" bezieht sich auf Polynucleotidsequenzen, die notwendig sind, um die Expression der codierenden Sequenzen zu bewirken, an die sie ligiert sind. Die Natur dieser Kontrollsequenzen ist in Abhängigkeit vom Wirtsorganismus verschieden, in Prokaryonten gehören zu solchen Kontrollsequenzen im allgemeinen der Promotor, die Ribosomen-Bindungsstelle und Terminatoren; in Eukaryonten gehören zu solchen Kontrollsequenzen im allgemeinen Promotoren, Terminatoren und manchmal Verstärker. Der Terminus „Kontrollsequenz" soll mindestens alle Komponenten enthalten, deren Gegenwart für die Expression notwendig ist, und kann zusätzliche Komponenten enthalten, deren Gegenwart vorteilhaft ist, z. B. Leader-Sequenzen.
„Operabel gebunden" bezieht sich auf eine Juxtaposition (Anlagerung), bei der die so beschriebenen Komponenten in einer Beziehung stehen, die es ihnen erlaubt, in ihrer vorgesehenen Weise zu funktionieren. Eine Kontrollsequenz, die an eine codierende Sequenz „operabel gebunden" ist, ist in einer solchen Weise ligiert, daß die Expression der codierenden Sequenz unter Bedingungen erreicht wird, die mit den Kontrollsequenzen vereinbar sind.
Ein „open reading frame" (ORF) (offene Leseraster) ist eine Region einer Polynucleotidsequenz, die ein Polypeptid codiert; diese Region kann einen Teil einer codierenden Sequenz oder eine gesamte codierende Sequenz darstellen.
Eine „codierende Sequenz" ist eine Polynucleotidsequenz, dio in mRNA transkribiert und/oder in ein Polypeptid translatiert wird, wenn sie unter die Kontrolle geeigneter Regulations-Sequenzen gestellt wird. Die Begrenzungen der codierenden Sequenz werden durch ein Translations-Startcodon am B'-Ende und ein Translations-Stoppcodon am 3'-Ende bestimmt. Eine codierende Sequenz kann mRNA, cDNA und rekombinante Polynucleotidsequenzen enthalten, ohne darauf beschränkt zu sein.
„Immunologisch identifizierbar mit/als" bezieht sich auf die Gegenwart eines Epitops und Polypeptide (von Epitopen und Polypeptiden), die auch in dem (den) bestimmten Polypeptid(en), gewöhnlich HCV-Proteinen, zugegen sind. Die immunologische Identität kann durch Antikörperbindung und/oder Konkurrenz bei der Bindung bestimmt werden; diese Techniken sind in Fachkreisen bekannt und werden nachstehend veranschaulicht.
„Epitop" bezieht sich hier auf eine antigene Determinante eines Polypeptids; ein Epitop könnte 3 Aminosäuren in einer räumlichen Konformation enthalten, die einmalig für das Epitop ist, im allgemeinen besteht ein Epitop aus mindestens 5 derartigen Aminosäuren und gewöhnlich aus mindestens 8-10 derartigen Aminosäuren. Verfahren zur Bestimmung der räumlichen Konformation der Aminosäuren sind im Fachgebiet bekannt und umfassen z. B. die Röntgenkristallographie und die zweidimensionalc NMR.
Ein Polypeptid ist „immunologisch reaktiv" mit einem Antikörper, wenn es sich wegen der Antikörpererkennung eines spezifischen Epitops, das im Polypeptid enthalten ist, an einen Antikörper bindet. Die immunologische Reaktivität kann bestimmt werden durch Antikörperbindung, insbesondere durch die Kinetik der Antikörperbindung, und/oder durch Konkurrenz bei der Bindung, wobei als „Konkurrent(en)" ein bekanntes Polypeptid (Polypeptide) verwendet wird, das ein Epitop enthält, gegen das der Antikörper gerichtet ist. Die Techniken, mit denen bestimmt werden kann, ob ein Polypeptid mit einem Antikörper immunologisch reaktiv ist, sind im Fachgebiet bekannt.
Der Terminus „immunogenes Polypeptid" bedeutet hier ein Polypeptid, das eine zelluläre und/oder humorale Antwort entweder allein oder gebunden an einen Carrier in Gegenwart oder Abwesenheit eines Adjuvans auslöst.
Der Terminus „Polypeptid" bezieht sich auf ein Polymer aus Aminosäuren und nicht auf die spezifische Länge des Produkts; so gehören Peptide, Oligopeptide und Proteine zum Definitionsbereich des Polypeptids. Dieser Terminus bezieht sich auch nicht auf Postexpressionsmodifikationen des Polypeptids, z.B. Glycosilierungen, Acetylierungen, Phosphorylierungen und dgl., oder schließt diese aus. Einbezogen in die Definition sind beispielsweise Polypeptide, die ein oder mehrere Analoga einer Aminosäure enthalten (inkl. z. B. nicht in der Natur vorkommende Aminosäuren usw.), Polypeptide mit substituierten Bindungen sowie andere im Fachgebiet bekannte Modifikationen, die natürlich vorkommen und nicht in der Natur vorkommen.
„Transformation" bezieht sich hier auf die Insertion eines exogenen Polynucleotide in eine Wirtszelle, unabhängig vom Insertionsverfahren, z. B. direkte Aufnahme, Transduktion, f-Paarung (f-mating) oder Elektroporation. Das exogene Polynucleotid kann als nichtintegrierter Vektor erhalten bleiben, z. B. ein Plasmid, oder anderenfalls in das Wirtsgenom integriert werden.
„Behandlung" bezieht sich hierauf Prophylaxe und/oder Therapie.
Ein „Individuum" bedeutet hier Wirbeltiere, insbesondere Vertreter der Spezies Säugetiere, und umfaßt Haustiere, Tiere für den Sport und Primaten einschließlich Menschen.
Ein „codierender Strang" einer Nucleinsäure, in dem hier benutzten Sinn, enthält die Sequenz, die Sequenzhomologie zu der von mRNA aufweist. Der „anti-sense-Strang" enthält eine Sequenz, die komplementär zu der des „codiei enden Strangs" ist.
Ein „Plusstrang-Genom" eines Virus ist hier ein solches, bei dem das Genom, entweder RNA oder DNA, einzelsträngig ist und (ein) virale(s) Polypeptid(e) codiert. Beispiele für Plusstrang-RNA-Viren sind Togaviren, Coronaviren, Retroviren, Picornaviren und Caliciviren. Inbegriffen sind auch die Flaviviren, die früher als Togaviren klassifiziert wurden. Siehe Fields u. Knipe (1986).
Eine „antikörperhaltige Körperkomponema" bezieht sich hier auf eine Komponente des Körpers eines Individuums, die Quelle der interessierenden Antikörper ist. Antikörperhaltige Korperkomponenten sind im Fachgebiet bekannt und umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, z.B. Plasma, Serum, Hirn-Rückenmark-Flüssigkeit, Lymphe, die äußeren Sektionen des Respirations-, Intestinal-Urogenitaltrakts, Tränen, Speichel, Milch, weiße Blutzellen und Myelome.
„Gereinigtes HCV" bezieht sich hier auf ein Präparat von HCV, das aus den Zellbestandteilen, mit denen das Virus normalerweise assoziiert ist, und aus anderen Typen von Viren, die im infizierten Gewebe zugegen sein können, isoliert wurde. Die Techniken zur
bildet, was auf die Komplementarität von mindestens einer Sequenz in der Sonde mit einer Sequenz in der Targetregionzurückzuführen ist. Die Sonde enthält jedoch keine Sequenz, die zu der/den Sequenz(on) komplementär ist, die zum Starten der
wozu z.B. Plasma, Serum, Hirn-Rückenmark-Flüssigkeit, Lymphe, die äußeren Sektionen der Haut, des Respirations-, Intestinei-und Urogenitaltrakts, Tränen, Speichel, Milch, Blutzellen, Tumoren, Organe und auch Proben der In-vitro-Zellkulturbestandteile(inkl. ein konditioniertes Medium, das aus dem Wachstum von Zellen im Zellkulturmedium resultiert, mutmaßlich virusinfizierte
Bei der praktischen Ausführung der Erfindung werden - wenn nicht anders angegeben - übliche Techniken der Molekularbiologie, der Mikrobiologie, der DNA-Rekombination und der Immunologie angewendet, die in Fachkreisen bekannt sind. Derartige Techniken werden in der Literatur vollständig beschrieben. Siehe z. B. Maniatis, Fitsch u. Sambrook, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning, Bd. I u. Il (Hrsg. D. N. Glover, 1985); Oligonucleotide Synthesis (Hrsg. M. J. Gait, 1984); Nucleic Acid Hybridization (Hrsg. B.D. Hamas u. S. J. Higgins, 1984); Animal Cell Culture (Hrsg. R. I. Freshney, 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IR Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); Reihe: Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Gene Transfer Vectors fo- Mammalian Cells (Hrsg. J. H. Miller u. M. P. Calos, 1987, Cold Spring Harbor Laboratory), Methods in Enzymology Bd. 154 u. Bd. 155 (Hrsg. Wu u. Grossmann bzw. Wu), Mayer u. Walker, Hrsg. (1987), Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London), Scopes (1987) Protein Purification: Principles and Practics, 2.Aufl. (Springer Ve, lag, N. Y.), und Handbook of Experimental Immunology, Bd. MV (Hrsg. D. M. Weir und C. C. Blackwell, 1986). Alle sowohl vor- als auch nachstehend erwähnten Patente, Patentanmeldungen und Veröffentlichungen werden hiermit durch Bezugnahme einbezogen.
Die nützlichen Materialien und Prozesse der Erfindung werden durch die Bereitstellung einer Familie von Nucleotidsequenzen ermöglicht, die aus cDNA-Banken isoliert wurden, die HCV-cDNA-Sequenzen enthalten. Diese cDNA-Banken wurden von Nucleinsäuresequenzen abgeleitet, die im Plasma eines HCV-infizierten Schimpansen vorhanden sind. Die Konstruktion einer dieser Banken, der „c"-Bank (ATCC No.40394), wurde in der EPO-Veröffentlichung Nr.318216 beschrieben. Verschiedene hier beschriebene Klone, die HCV-cDNA enthalten, wurden aus der „c"-Bank erhalten. Obwohl andere hier beschriebene Klone aus anderen HCV-cDNA-Banken erhalten wurden, wurde die Präsenz der Klone, die die Sequenzen in der „c"-Bank enthalten, bestätigt. Wie in der EPO-Veröffentlichung Nr.318216 diskutiert, hat die Familie der aus der „c"-Bank isolierten HCV-cDNA-Sequenzen ihren Ursprung nicht beim Menschen oder Schimpansen und zeigt keine signifikante Homologie mit Sequenzen, die im HCV-Genom enthalten sind.
Die Verfügbarkeit der hier beschriebenen HCV-cDNAs gestattet, Polynucleotidsonden zu konstruieren, die als Reagenzien für den Nachweis von viralen Polynucleotiden in biologischen Proben einschließlich Spenderblut brauchbar sind. Beispielsweise ist es möglich, aus den Sequenzen DNA-Oligomere von etwa 8-10 Nucleotiden oder größere zu synthetisieren, die als Hybridisierungssonden brauchbar sind, um die Gegenwart von HCV-RNA z. B. in Spenderblut, Seren von Individuen, von denen vermutet wird, daß sie das Virus beherbergen, oder Zellkultursystemen nachzuweisen, in denen das Virus repliziert wird. Außerdem gestatten die cDNA-Sequenzen auch die Konstruktion und Produktion von HCV-spezifischen Polypeptiden, die als diagnostische Reagenzien auf die Gegenwart von Antikörpern brauchbar sind, die während der HCV-lnfektion gebildet wurden. Antikörper zu gereinigten Polypeptiden, die von den cDNAs abgeleitet sind, können auch verwendet werden, um Virusantigene in biologischen Proben einschließlich z. B. Spenderblutproben, Seren von Patienten mit NANBH und in Gewebekultursystemen nachzuweisen, die für die HCV-Replikation benutzt werden. Außerdem sind die hier offenbarten immunologenen Polypeptide, die in Teilen des in Fig. 17 dargestellten ORF der HCV-cDNA codiert sind, auch für HCV-Screening, Diagnose und Behandlung und für die Bildung von Antikörpern von Nutzen, die auch für diese Zwecke brauchbar sind.
Außerdem ermöglichen die hier beschriebenen neuen cDNA-Sequenzen die weitere Charakterisierung des HCV-Genoms. Polynucleotidsonden und Primer, die von diesen Sequenzen abgeleitet sind, können benutzt werden, um in cDNA-Banken vorhandene Sequenzen zu verstärken und/oder cDNA-Banken auf zusätzliche überlappende cDNA-Sequenzen zu screenen, die ihrerseits benutzt werden können, um stärker überlappende Sequenzen zu erhalten.
Wie nachstehend und in der EPO-Veröffentlichung Nr.318216 gezeigt wird, scheint das Genom des HCV im wesentlichen aus einem großen offenen Leseraster (ORF) zu bestehen, das ein großes Polyprotein codiert.
Die hier verfügbar gemachten HCV-cDNA-Sequenzen, die von diesen Sequenzen abgeleiteten Polypeptide und die hier beschriebenen immunogenen Polypeptide sowie auch die Antikörper, die gegen diese Polypeptide gerichtet sind, sind auch von Nutzen bei der Isolierung und Identifizierung des/der durch Blut übertragenen NANBV-(BB-NANBV)-Agens/Agenzien. Beispielsweise können Antikörper, die gegen HCV-Epitope gerichtet sind, die in von den cDNA abgeleiteten Polypeptiden enthalten sind, bei auf der Affinitätschromatographie beruhenden Prozessen benutzt werden, um das Virus zu isolieren. Anderenfalls können die Antikörper benutzt werden, um mit anderen Techniken isolierte Viruspartikeln zu identifizieren. Die Virtisantigene und das genomische Material innerhalb der isolierten Viruspartikeln können dann weiter charakterisiert werden. Zusätzlich zu dem Vorstehenden gestatten die nachstehend verfügbar gemachten Informationen die Identifizierung weiterer HCV-Stämme oder -Isolate. Die Isolierung und Charakterisierung der zusätzlichen HCV-Stämme oder -Isolate kann durch
Isolierung der Nucleinsäuren aus Körperkomponenten, die Viruspartikeln und/oder Virus-RNA enthalten, Schaffung von cDNA-Bankf, η unter Verwendung von Polynucleotidsonden, die auf den nachstehend beschriebenen HCV-cDNA-Sonden beruhen, Screenen der Banken hinsichtlich Klonen, die nachstehend beschriebene HCV-cDNA-Sequenzen enthalten, und Vergleich der HCV-cDNAs aus den neuen Isolaten mit den nachitehend beschriebenen cONAs erreicht werden. Die darin oder im Virusgenom codierten Polypeptide können hinsichtlich der immunologischen Kreuzreaktivität unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Polypeptide und Antikörper überwacht werden. Stämme oder Isolate, die zu den Parametern des HCV passen, die vorstehend im Abschnitt Definitionen beschrieben wurden, sind leicht identifizierbar. Andere Verfahren zur Identifizierung der HCV- Stämme werden für Fachleute- ausgehend von den hier verfügbar gemachten Informationen - klar.
Isolierung der HCV-cDNA-Sequenzen
Die nachstehend beschriebenen neuen HCV-cDNA-Sequenzen erwei'jrn die Sequenz der cDNAauf das HCV-Genom, über das in der EPO-Veröffentlichung Nr.318216 berichtet wurde. Die Sequeni^n, die in den Klonen b 114a, 18g, ag30a, CA205a, CA290a, CA216a, pi 14a, CA 167b, CA 156β, CA84a und CA59a vorliegen, befinden sich stromaufwärts von der dargestellten Sequenz und liefern zusammengestellt (compiled) die Nucleotide Nr. 1310 bis 1348 der zusammengesetzten HCV-cDNA-Sequenz. (Die negative Nummer an einem Nucleotid gibt seine Entfernung stromaufwärts von dem Nucleotid an, das das mutmaßliche Methionin-Initiationscodcn startet.) Die Sequenzen, die in den Klonen b5e und 16jh vorliegen, liegen stromabwärts von der dargestellten Sequenz und ergeben die Nucleotide Nr.8659 bis 8866 der zusammengesetzten Sequenz. Die zusammengesetzte HCV-cDNA-Sequenz, die die Sequenzen in den obenerwähnten Klonen einschließt, zeigt Fig. 17. Die hier beschriebenen neuen HCV-cDNAs wurden aus einer Reihe von HCV-cDNA-Banken isoliert, die die „c"-Bank einschließen, die in lambda gt 11 (ATCC Nr. 40394) vorhanden ist. Die HCV-cDNA-Banken wurden unter Verwendung von Poolserum von einem Schimpansen mit chronischer HCV-lnfektion konstruiert, das einen hohen Titer des Virus hat, d. h. mindestens 10e infektiöse Schimpansendosen/ml (chimp infectious doses/ml - CID/ml). Das Poolserum wurde zur Isolierung der Viruspartikeln benutzt; die aus diesen Partikeln isolierten Nucleinsäuren wurden als Matrize bei der Konstruktion von cDNA-Banken zu dem Virusgenom benutzt. Die Verfahren zur Isolierung der mutmaßlichen HCV-Partikeln und zur Konstruktion der „c'-HCV-cDNA-Bank werden in der EPO-Veröffentlichung Nr.318216 beschrieben. Andere Verfahren für die Konstruktion von HCV-cDNA-Banken sind im Fachgebiet bekannt, und einige dieser Verfahren werden nachstehend in den Beispielen beschrieben. Die Isolierung der Sequenzen erfolgte durch Screenen der Banken unter Verwendung synthetischer PoK -<ucleotidsonden, deren Sequenzen von der 5'-Region und der 3'-Region der bekannten HCV-cDNA-Sequenz abgeleitet wurden. Die Beschreibung der Methode zur Wiedergewinnung (retrieval) der cDNA-Sequenzen ist hauptsächlich von historischem Interesse. Die resultierenden Sequenzen (und ihre Komplemente) werden hier verfügbar gemacht, und die Sequenzen oder ein Teil derselben können unter Anwendung von Synthesemethoden oder durch eine Kombination von Synthesemethoden mit der Wiedergewinnung von Teilsequenzen unter Anwendung von Methoden hergestellt werden, die den hier beschriebenen ähneln.
Präparation von viralen Polypeptiden und Fragmenten
Die Verfügbarkeit der HCV-cDNA-Sequenzen oder der davon abgeleiteten Nucleotidsequenzen (einschließlich Segmente und Modifikationen der Sequenz) gestattet die Konstruktion von Expressionsvektoren, die antigen aktive Regionen des Polypeptids codieren, das in einem Strang codiert ist. Diese antigen aktiven Regionen können von Coat- oder Peplos-Antigenen oder von Core-Antigenen oder von Nichtstrukturantigenen einschließlich z.B. Polynucleotid-Bindungsproteinen, Polynucleotiöpolymerase(n) und anderen Virusproteinen abgeleitet sein, die für die Replikation und/oder den Aufbau der Viruspartikel erforderlich sind. Fragmente, die die erwünschten Polypeptide codieren, werden von den cDNA-Klonen unter Anwendung herkömmlicher Restriktionsdigestions- oder Synthesemethoaen abgeleitet und in Vektoren ligiert, die z. B. Teile von Fusionssequenzen wie ß-Galactosidase oder Superoxiddismutase (SOD), vorzugsweise SOD, enthalten können. Methoden und Vektoren, die für die Herstellung von Polypeptiden brauchbar sind, die Fusionssequenzen der SOD enthalten, werden in der EPO-Veröffentlichung Nr. 196056 beschrieben, die am 1 .Oktober 1986 veröffentlich wurde. Vektoren für die Expression von Fusionspolypeptiden von SOD und HCV-Polypeptiden, die in einer Reihe von HCV-Klonen codiert sind, werden nachstehend in den Beispielen beschrieben. Jeder erwünschte Teil der HCV-cDNA, der ein offenes Leseraster in einem codierenden Strang enthält, kann als rekombinantes Polypeptidd, z. B. ein reifes (mature) oder Fusionsprotein, erhalten werden; alternativ kann ein Polypeptid, das in der cDNA codiert ist, durch chemische Synthese verfügbar gemacht werden.
Die DNA, die das erwünschte Polypeptid codiert, sei es in fusioniertet' oder reifer Form und mit oder ohne Signalsequenz für die Sekretion, kann in Expressionsvektoren ligiert werden, die für einen passenden Wirt geeignet sind. Sowohl eukaryontische als auch prokaryontische Wirtsysteme werden gegenwärtig bei der Bildung rekombinanter Polypeptide verwendet, und eine Zusammenfassung der üblicheren Kontrollsysteme und Wirtszellen folgt nachstehend. Das Polypeptid wird danach aus Iy -ierten Zellen oder aus dem Kulturmedium isoliert und dem Verwendungszweck entsprechend gereinigt. Die Reinigung kann nach im Fachgebiet bekannten Techniken erfolgen, z.B. durch differentielle 'Extraktion, Salzfraktionierung, Chromatographie an lopinaustauscherharzen, Aifinitätschromatographie, Zentrifugiertί und dgl. Siehe z.B. Methods in Enzymology hinsichtlich einer Vielzahl von Proteinreinigungsverfahren. Derartige Polypeptide können als diagnostische Mittel verwendet werden, oder jene, die die Neutralisation der Antikörper bewirken, können zu Vakzinen formuliert werden. Antikörper, die gegen diese Polypeptide gebildet werden, können auch als Diagnostika oder für die passive Immunotherapie verwendet werden. Außerdem sind - wie nachstehend ausgeführt wird - Antikörper zu diesen Polypeptiden für Hie Isolierung und Identifizierung von HCV-Partikeln brauchbar.
Präparation von antigenen Polypeptiden und Konjugaten mit dem Carrier
Eine antigene Region eines Polypeptids ist im allgemeinen relativ klein - typischerweise 8-10 Aminosäuren oder weniger lang. Fragmente von nur 5 Aminosäuren können eine antigene Region charakterisieren. Diese Segmente können Regionen des HCV-Antigens entsprechen. Dementsprechend können bei Verwendung der HCV-cDNAs als Basis CHfKs1 die kurze Segmente von HCV-Polypeptiden codieren, rekombinant entweder als Fusionsproteine oder als isolierte Polypeptide exprimiert werden. Ferner können kurze Aminosäuresequenzen bequem durch chemische Synthese erhalten werden. In Fällen, in denen das
synthetisierte Polypeptid richtig konfiguriert ist, um das richtige Epitopzu liefern, aber zu klein ist, um immunogen zu sein, kann das Polypeptid an einen geeigneten Carrier gebunden werden.
Eine Reihe von Techniken zur Gewinnung einer solchen Bindung sind im Fachgebiet bekannt, wozu die Bildung von Disulfidbindundsn unter Verwendung von N-Succinimidyl-3-(2-pyridylthio)propionat (SPDP) und Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyi)cyclohexan-1-carboxylat (SMCC von der Pierce Company, Rockford, lllionis) gehören (wenn dem Peptid eine Sulfhydrylgruppe fehlt, kann diese durch Addition eines Cysteinrests beigesteuert werden). Diese Reagenzien bilden eine Disulfidbindung zwischen sich und den Peptiolcysteinresten an einem Protein und eine Amidbindung über die ε-Aminogruppe an einem Lysin oder eine andere freie Aminogruppe in dem anderen. Eine Anzahl solcher Disulfid/Amid bildender Agenzien ist bekannt. Siehe z.B. Immun. Rev. 62 (1982) S. 185. Andere bifunktionelle Verknüpfungsagenzien bilden anstelle einer Disulfidbindung einen Thioether. Viele dieser Thioether bildenden Agenzien sind handelsüblich, und zu ihnen gehören die reaktionsfähigen Ester der 6-Maleimidocapronsäure, der 2-Brimessigsäure, der 2-lodessigsäure, der 4-(N-Maleimidomethyl)-cyclohexan-1 -carbonsäure und dgl. Die Carboxylgruppen können durch Kombination mit Succinimid oder 1 -Hydroxyl^-nitro-'tsulfonsäure, Natriumsalz aktiviert werden. Weitere Methoden zur Verknüpfung von Antigenen verwenden das Rotavirus/ „binding peptide"-System, das in der EPO-Veröffentlichung Nr. 259149 beschrieben wird, dessen Offenbarung hier durch Bezugnahme einbezogen wird. Die vorstehende Aufstellung ist nicht als vollständig zu betrachten, und Modifikationen der genannten Verbindungen können natürlich verwendet werden.
Verwendet werden kann jeder Carrier, der nicht selbst die Produktion von für den Wirt schädlichen Antikörpern induziert. Geeignete Carrier sind typischerweise große, langsam inetabolisierte Makromoleküle wie Proteine; Polysaccharide wie Latex funktionalisierte Sepharose, Agarose, Cellulose, Celluloseperlen und dgl.; polymere Aminosäuren wie Polyglutaminsäure, Polylysin und dgl.; Aminosäure-Copolymere; und inaktive Viruspartikeln. Besonders nützliche Proteinsubstrate sind Serumalbumine, „keyhole limpef-Hämocyanin, Immunoglobulinmoleküle, Thyreoglobulin, Ovalbumin, Tetanustoxoid und andere in Fachkreisen gut bekannte Proteine.
Neben den Virusproteinen von voller Länge sind Polypeptide, die verkürzte HCV-Aminosäuresequenzen enthalten, die mindestens ein virales Epitop codieren, brauchbare immunologische Reagenzien. Beispielsweise können Polypeptide, die derartige verkürzte Sequenzen enthalten, als Reagenzien bei einem Immunoassay verwendet werden. Diese Polypeptide sind auch Anwärter für Untereinheitsantigene in Zusammensetzungen für die Antiserumproduktion oder Vakzine. Während diese verkürzten Sequenzen durch verschiedene bekannte Behandlungen von natürlichem Virusprotein erzeugt werden können, wird es im allgemeinen bevorzugt, synthetische oder rekombinante Polypeptide herzustellen, die eine HCV-Sequenz enthalten. Polypeptide, die diese verkürzten HCV-Sequenzen enthalten, können vollständig aus HCV-Sequenzen (ein oder mehrere Epitop(e), entweder benachbart oder nicht benachbart) oder HCV-Sequenzen und heteroiogen Sequenzen in einem Fusionsprotein hergestellt werden. Zu den brauchbaren heteroiogen Sequenzen gehören Sequenzen, die für die Sekretion aus einem rekombinanten Wirt sorgen, die immunologische Reaktivität des/der HCV-Epitops/HCV-Epitope erhöhen oder die Verknüpfung eines Polypeptide mit einem Immunoassay-Träger oder einem Vakzine-Carrier erleichtern. Siehe z. B. EPO-Veröffentlichung 116201, U.S.-Pat.4722840, EPO-Veröffentlichung 259149, U.S.-Pat.4629783, deren Offenbarungen hier durch Bezugnahme einbezogen werden.
Die Größe der Polypeptide, die die verkürzten HCV-Sequenzen enthalten, kann in weiten Grenzen variieren, wobei die minimale Größe eine Sequenz von genügender Größe ist, um ein HCV-Epitopzu liefern, während die maximale Größe nicht kritisch ist. Der Einfachheit halber liegt die maximale Größe gewöhnlich nicht wesentlich über der für die Schaffung der gewünschten HCV-Epitope und Funktion(en) der heteroiogen Sequenz, falls vorhanden, erforderlichen. Typischerweise variiert die verkürzte HCV-Aminosäuresequenz in der Länge zwischen etwa 5 und etwa 100 Aminosäuren. Besonders typisch ist jedoch eine HCV-Sequenz von maximal etwa 50 Aminosäuren Länge, vorzugsweise von maximal etwa 30 Aminosäuren Länge. Es ist gewöhnlich wünschenswert, HCV-Sequenzen von mindestens etwa 10,12 oder 15 Aminosäuren bis maximal etwa 20 oder 25 Aminosäuren zu wählen.
Verkürzte HCV-Aminosäuresequenzen, die Epitope enthalten, können auf verschiedenen Wegen identifiziert werden. Beispielsweise kann die ganze Virusproteinsequenz durch Herstellung einer Serie kurzer Peptide gescreent werden, die zusammen die ganze Proteinsequenz überspannen. Ein Beispiel für das Antigen-Screening der Regionen des HCV-Polypro'.oir.s wird nachstehend gegeben. Außerdem wäre es z. B. ausgehend von lOOmer Polypeptiden Routinearbeit, jedes Polypeptid auf die Gegenwart eines/von Epitops/Epitopen zu testen, die die erwünschte Reaktivität zeigen, und dmn nacheinander kleinere und überlappende Fragmente von einem identifizierten lOOmer zu testen, um das interessierende Epitop zu kartieren. Das Screenen solcher Peptide bei einem Immunoassay ist im Fachgebiet bekannt. Es ist auch bekannt, eine Computeranalyse einer Proteinsequenz durchzuführen, um potentielle Epitope zu identifizieren, und dann Oligopeptide, die die identifizierten Regionen enthalten, für das Screenen herzustellen. Eine solche Computeranalyse der HCV-Aminosäuresequenz zeigt Fig. 20, in der der hydrophile/hydrophobe Charakter über dem Antigsn-Index dargestellt ist. Die Aminosäuren sind vom Start-MET (Position 1) numeriert, wie dies Fig. 17 zeigt. Fachleute erkennen, daß eine solche Computeranalyse der Antigenität nicht immer ein Epitop identifiziert, das tatsächlich existiert, und fälschlicherweise eine Proteinregion als epitophaltig identifizieren kann. Beispiele für brauchbare HCV-Aminosäuresequenzen, die von Expressionsvektoren exprimiert werden, die aus den Klonen 5-1-1,81, CA74a, 35f, 279a, C36, C33b, CA290a, C8f, C12f, 14c, 15e, C25c, C33c, C33f, 33g, C39c, C40b, CA 167 b bestehen, werden nachstehend beschrieben. Andere Beispiele für HCV-Aminosäuresequenzen, die - wie hier beschrieben - von Nutzen sein können, werden unten dargestellt, b's versteht sich, daß diese Peptide ein Epitop nicht unbedingt genau kartieren und auch eine HCV-Sequenz enthalten können, die nicht immunogen ist. Diese nicht immunogenen Teile der Sequenz können - wie vorstehend beschrieben - unter Anwendung herkömmlicher Techniken definiert und von den beschriebenen Sequenzen deletiert werden. Ferner können zusätzliche verkürzte HCV-Aminosäuresequenzen, die ein Epitop enthalten oder immunogen sind, wie vorstehend beschrieben, identifiziert werden. Die folgenden Sequenzen werden durch die Aminosäurenummer (d. h. „AAn") angegeben, wobei η die in Fig. 17 angegebene Aminosäurenummer ist:
AA1-AA25; AA1-AA50; AA1-AA84; AA9-AA177; AA1-AA10; AA5-AA20; AA20-AA25; AA35-AA45; AA50-AA100; AA40-AA90; AA45-AA65; AA65-AA75; AA80-AA90; AA99-AA120; AA95-AA110; AA105-AA120; AA100-AA150; AA150-AA200; AA155-AA170; AA190-AA210; AA200-AA250; AA22O-AA240; AA245-AA265; AA250-AA300; AA29O-AA33O; AA290-AA305; AA300-AA350; AA310-AA330; AA350-AA400; AA380-AA395; AA405-AA495;
AA400-AA450; AA405-AA415; AA416-AA425; AA425-AA435; AA437-AA582; AA450-AA500; AA440-AA460; AA460-AA470; AA475 AA495; AA500-AA550; AA511-AA690; AA515-AA550; AA550-AA600; AA55O-AA625; AA575-AA605; AA585-AA600; AA60O-AA650; AA600-AA625; AA63&-AA665; AA650-AA700; AA645-AA680; AA700-AA750; AA70O-AA725; AA700-AA750; AA725-AA775; AA770-AA790; AA750-AA800; AA800-AA815; AA825-AA850; AA850-AA875; AA800-AA850; AA920-AA990; AA850-AA90O; AA920-AA945; AA940-AA965; AA970-AA990; AA950-AA1000; AA1000-AA1060; AA1000-AA1025; AAI000-AA1050; AA1025-AA1040; AA1040-AA1055; AA1075-AA1175; AA1050-AA1200; AA1070-AA1100; AA1100-AA1130; AA1140-AA1165; AA1192-AA1457; AA1195-AA1250; AA1200-AA1225; AA1225-AA1250; AA125O-AA1300; AA1260-AA1310; AA126Q-AA1280; AA126fr-AA1428; AA1300-AA1350; AA129O-AA1310; AA1310-AA1340; AA1345-AA1405; AA134^-AA1365; AA135Ö-AA1400; AA1365-AA1380; AA1380-AA1405; AA1400-AA1450; AA1450-AA1500; AA1460-AA1475; AA1475-AA1 515; AA1475-AA1 500; AA1 500-AA1550; AA1 500-AA1 515; AA1 515-AA1 550; AA1 550-AA1600; AA1545-AA1560; AA1 569-AA1931; AA1 570-AA1690; AA1 595-AA1 610; AA1 590-AA1650; AA1610-AA1645; AA165O-AA1690; AA1685-AA1770; AA1689-AA1805; AA1690-AA1720; AA1694-AA1735; AA1720-AA1745; AA1745-AA1770; AA1750-AA1800; AA1775-AA1810; AA1795-AA1850; AA1850-AA1900; AA1900-AA1950; AA1900-AA1920; AA1916-AA2021; AA1920-AA1940; AA1949-AA2124; AA1950-AA2000; AA1950-AA1985; AA1980-AA2000; AA2000-AA2050; AA2005-AA2025; AA2020-AA2045; AA2045-AA2100; AA2045-AA2070; AA2054-AA2223; AA2070-AA2100; AA 2100-AA 2150; AA 2150-AA 2 200; AA2200-AA2250; AA2200-AA2325; AA2250-AA2330; AA2255-AA2270; AA2265-AA2280; AA2280-AA2290; AA2287-AA2385; AA2300-AA2350; AA229O-AA2310; AA2310-AA2330; AA2330-AA2350; AA2350-AA2400; AA2348-AA2464; AA2345-AA2415; AA2345-AA23/5; AA2370-AA2410; AA2371-AA2502; AA2400-AA2450; AA2400-AA2425; AA2415-AA2450; AA2445-AA2500; AA2445-AA2475; AA2470-AA2490; AA2500-AA2550; AA2505-AA2540; AA2535-AA2560; AA2550-AA2600; AA2560-AA2580; AA2600-AA2650; AA2605-AA2620; AA2620-AA2650; AA2640-AA2660; AA2650-AA2700; AA2655-AA2670; AA2670-AA2700; AA2700-AA2750; AA2740-AA2760; AA2750-AA2800; AA27 * /*A2780; AA2780-AA2830; AA2785-AA2810; AA2796-AA2886; AA2810-AA2825; AA2800-AA285C; AA<:J50-AA2900; AA2850-AA2865; AA2885-AA2905; AA2900-AA2950; AA2910-AA2930; AA2925-AA2950; AA2945-Ende (C'-terminal).
Die vorstehenden HCV-Aminosäuresequenzen können als diskrete Peptide oder eingebaut in ein größeres Polypeptid hergestellt werden, und, wie hier beschrieben, Verwendung finden. Weitere Polypeptide, die verkürzte HCV-Sequenzen enthalten, werden in den Beispielen beschrieben.
Die beobachtete Verwandtschaft der mutmaßlichen Polyproteine des HCV und der Flaviviren gestattet eine gewisse Vorhersage der mutmaßlichen Domänen der „nichtstrukturellen" (NS) HCV-Proteine. Die Lage der einzelnen NS-Proteine in dem mutmaßlichen Flavivirus-Präkursorpolyprotein ist recht gut bekannt. Außerdem stimmt diese auch mit den beobachteten Gesamtf'uktuationen im Hydrophobieprofil des Polyproteins überein. Es ist erwiesen, daß NS5 der Flaviviren die Virionpolymerase codiert und daß NS1 einem Komplementfixationsantigen entspricht, da-s sich als ein wirksamer Vakzin bei Tieren erwiesen hat. Vor kurzem wurde gezeigt, daß NS3 eine flavivirale Proteasefunktion innewohnt. Auf Grund der beobachteten Ähnlichkeiten zwischen HCV und den Flaviviren, die nachstehend beschrieben werden, sind Schlußfolgerungen hinsichtlich der annähernden Lage der entsprechenden Proteindomänen und Funktionen im HCV-Polyprotein möglich. Die Expression der Polypeptide, die diese Domänen enthalten, in einer Vielzahl rekombinanter Wirtszellen, inkl. z. B. Bakterien-, Hefe-, Insekten- und Wirbeltierzellen, sollte wichtige immunologische Reagenzien hervorbringen, die zur Diagnose, zum Nachweis und für Vakzine verwendet werden können.
Obwohl die nichtstrukturellen Proteinregionen der mutmaßlichen Polyproteine des hier beschriebenen HCV-lsolats und der Flaviviren eine gewisse Ähnlichkeit zu haben scheinen, besieht geringere Ähnlichkeit zwischen den mutmaßlichen Strukturregionen nach dem N-Ende hin. In dieser Region besteht eine größere Divergenz in der Sequenz, und das hydrophobe Prom beider Regionen zeigt zudem geringere Ähnlichkeit. Diese „Divergenz" beginnt in der N-terminalen Renion der mutmaßlichen NS1 -Domäne im HCV und erstreckt sich bis zum angenommenen N-Ende. Nichtsdestoweniger kann es noch möglich sein, die annähernde Lage der mutmaßlichen Nucleocapsiddomänd (N-terminale Grunddomäne) und der E 'im allgemeinen hydrophoben)-Domäne innerhalb des HCV-Polyproteins vorherzusagen. In den Beispielen beruhen die Vorhersagen auf den im hydrophoben Profil des HCV-Polyproteins beobachteten Änderungen und der Kenntnis von der Lage und vom Charakter der Flavivirusproteine. Nach diesen Vorhersagen ist es möglich, die annähernden Regionen des HCV-Polyproteins zu identifizieren, die nützlichen immunologischen Reagenzien entsprechen könnten. Beispielsweise ist von den E- und NS1-Proteinen der Flaviviren bekannt, daß sie als protektive Vakzine wirksam sind. Diese Regionen und einige, die sich in dem hier beschriebenen HCV-lsolat als antigen erwiesen haben, beispielsweise jene im mutmaßlichen NS3, C und NS5, müßten auch diagnostische Reagenzien liefern. Außerdem können auch Lage und Expression der viral-codierten Enzyme die Bewertung der antiviralen Ezyminhibitoren, d. h. z. B. der Inhibitoren, die die Enzymaktivität auf Grund einer Wechselwirkung mit dem Enzym selbst verhindern, oder Substanzen, die die Expression des Enzyms verhindern können (z. B. „antisense"-RNA oder andere Arzneimittel, die mit der Expression interferieren), zulassen.
Die Immunogenität der Epitope des HCV kann auch erhöht werden, indem sie in Säugetier- oder Hefesystemen hergestellt werden, die mit partikelformenden Proteinen wie z. B. solchen, die mit Hepatitis-B-Oberflächenantigen assoziiert sind, fusioniert oder aufgebaut (assembled) sind. Konstrukte (constructs), bei denen das NANBV-Epitop direkt an die partikelformendes Protein codierenden Sequenzen gebunden ist, produzieren Hybride, die immunogen in bezug auf das HCV-Epitop sind. Ferner enthalten alle hergestellten Vektoren gegenüber HBV spezifische Epitope, die unterschiedliche Immunogenitätsgrade haben w'e z.B. das pre-S-Peptid. Somit sind die Partikeln, die aus partikelformendem Protein konstruiert wurden und HCV-Sequenzen enthalten, in bezug auf HCV und HBV immunogen.
Gezeigt wurde, daß Hepatitis-B-Oberflächenantigen (HBSAg) sowohl in S.cerevisiae (Valenzuela, P., 1982) als auch z.B. in Säugerzellen (Valenzuela, P., et al., 1984) zu Partikeln geformt und aufgebaut wird. Es wurde aufgezeigt, daß die Bildung solcher Partikeln die Immunogenität der monomeren Untereinheit erhöht. Die „constructs" können auch das immunodominante Epitop des HBSAg enthalten, das die 55 Aminosäuren der presurface-Region (pre-S-Region) umfaßt.
Neurath et al. (1984). „Constructs" der pre-S-HBSAg-Partikel, die in Hefe exprimierbar sind, werden in der EP0174444, veröffentlicht am 19. März 1986, offenbart; Hybriden, die heterologe virale Sequenzen für die Hefeexpression enthalten, werden in der EPO 175261, veröffentlicht am 26. März 1966, offenbart. Diese „constructs" können auch in Säugetierzellen wie Ovarialzellen des Chinesischen Hamsters (CHO-Zellen) exprimiert werden, wobei ein SV40-Dihydrofolatreduktasevektor verwendet wird (Michelle et al., 1984).
Ferner können Teile der partikelformendes Protein codierenden Sequenz durch Codons ersetzt werden, die ein HCV-Epitop codieren. Bei diesem Ersatz können Regionen, die nicht erforderlich sind, um die Aggregation der Einheiten zur Bildung von immunogenen Partikeln in Hefe oder Säugetieren zu vermitteln, deletiert werden, so daß zusätzliche HBV-antigene Orte von der Konkurrenz mit dem HCV-Epitop eliminiert werden.
Vakzine können aus einem oder mehreren immunogenen Polypeptiden hergestellt werden, die von HCV-cDNA abgeleitet sind, einschließlich der in den Beispielen beschriebenen cDNA-Sequenzen. Die beobachtete Homologie zwischen HCV und Flaviviren liefert Informationen in bezug auf die Polypeptide, die besonders wirksam als Vakzine sein können, wie auch die Regionen Jis Günoms, in dem sie codiert sind. Die allgemeine Struktur des Flavivirus-Genoms wird bei Rice et al. (1986) diskutiert. Von der Flavivirus-genomischen-RNA wird angenommen, daß sie die einzige virusspezifische m-RNA-Spezies ist, und sie wird in die drei viralen Strukturproteine, d.h. C, M und E sowie zwei große Nichtstrukturproteine, NS4 und NS5, und einen komplexen Satz kleinerer Nichtstrukturproteine translatiert. Es ist bekannt, daß größere neutralisierende Epitope für Flaviviren im E-Protein (Hüllprotein) angesiedelt sind (Roehring, 1986). Somit können Vakzine aus rekombinanten Polypeptiden bestehen, die Epitope von HCV-E enthalten. Diese Polypeptide können in Bakterien-, Hefe- oder Säugetierzellen exprimiert oder anderenfalls aus Viruspräparaten isoliert werd..n. Es wird auch erwartet, daß die anderen Strukturproteine ebenfalls Epitope enthalten können, die protektive Anti-HCV-A .tiköi per verursachen. Somit können Polypeptide, die die Epitope von E, C und M enthalten, allein oder kombiniert in HCV-Vakzinen verwendet werden.
Ergänzend zu Vorstehendem wurde gezeigt, daß die Immunisierung mit NS1 (Nichtstrukturprotein 1) zum Schutz gegen Gelbfieber führt (Schlesinger et al,, 1986). Dies trifft zu, obwohl die Immunisierung keine neutralisierenden Antikörper hervorbringt. Es ist somit wahrscheinlich, daß HCV-NS1 auch gegen HCV-lnfekticn schützt, insbesondere, da dieses Protein hoch konserviert unter den Flaviviren zu sein scheint. Außerdem zeigt sich auch, daß Nichtstrukturproteine gegen virale Pathogenität schützen können, selbst wenn sie nicht die Produktion von neutralisierenden Antikörpern verursachen. Die in den Beispielen enthaltenen Informationen hinsichtlich der Immunogenität der aus Monierten HCV-cDNA exprimierten Polypeptide, die die verschiedenen Regionen des HCV-ORF überspannen, gestatten auch Voraussagen in bezug auf ihre Verwendung in Vakzinen.
In Anbetracht des Gesagten können multivalente Vakzine gegen HCV aus einem oder mehreren Epitopen von einem oder mehreren Strukturproteinen und/oder einem oder mehreren Epitopen von einem oder mehreren Nichtstrukturproteinen bestehen. Diese Vakzine können z.B. aus rekombinanten HCV-Polypeptiden und/oder Polypeptiden bestehen, die aus den Virionen isoliert sind. Insbesondere wird an Vakzine gedacht, die ein oder mehrere der folgenden HCV-Proteine oder davon abgeleitete Untereinheitenantigene enthalten: E, NS1, C, NS2, NS3, NS4 und NS5. Besoonders bevorzugt sind Vakzine, die E und/oder NS1 oder Untereinheiten derselben umfassen.
Die Präparation von Vakzinen, die immunogene(s) Polypeptid(e) als wirksame(n) Bestandteil(e) enthalten, ist dem Fachmann bekannt. Typischerweise werden derartige Vakzine als zur Injektion geeignete Präparate hergestellt, entweder als flüssige Lösungen oder Suspensionen; feste, zum Lösen oder Suspendieren in Flüssigkeit vor der Injektion geeignete Formen können ebenfalls hergestellt werden. Die Zubereitung kann auch emulgiert oder das Protein in Liposome eingekapselt sein. Die wirksamen immunoganen Bestandteile sind oft mit Trägerstoffen gemischt, die pharmazeutisch annehmbar und mit dem wirksamen Bestandteil verträglich sein. Geeignete Trägerstoffe sind beispielsweise Wasser, physiologische Kochsalzlösung, Dextrose, Glycerol, Ethanol oder dgl. und Kombinationen davon. Ferner kann das Vakzin - falls erwünscht - geringere Mengen an Hilfsstoffen wie Netzmitteln oder Emulgatoren, pH-Puffersubstanzen und/oder Adjuvanzien enthalten, die die Wirksamkeit des Vakzins verstärken. Beispielsweise für Adjuvanzien, die wirksam sein können, sind - ohne Beschränkung auf diese -Aluminiumhydroxid, N-Acetyl-muramy! -threonyl-D-isoglutamin (thr-MDP), N-Acetyl-nor-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin (CGP 11637, auch als nor-MDP bezeichnet), N-Acetyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanin-2-(1'-2'-dipalmitoyl-snglycero-3-hydroxy-phosphoryloxy)-ethylamin (CGP 19835 A, als MTP-PE bezeichnet) und RIBI, das drei aus Bakterien extrahierte Komponenten, Monophosphoryl-Lipid A, Trehalose-Dimycolat und Zellwandskeleton (MPL + TDM + CWS), in einer 2proz. Squalen/Tween 80-Emulsion enthält. Die Wirksamkeit eines Adjuvans kann durch Messung der Men'j^ der Antikörper bestimmt werden, die gegen ein immunogenes Polypeptid gerichtet sind, das eine HCV-Antigensequenz enthält, die aus der Applikation dieses Polypeptids in Vakzinen herrührt, die ebenfalls aus den verschiedenen Adjuvanzien bestehen.
Die Vakzine werden üblicherweise parenteral, durch Injektion, beispielsweise entweder subkutan oder intramuskulär, appliziert. Weitere Zubereitungen, die sich für andere Appiikationsarton eignen, umfassen Suppositorien und in gewissen Fällen orale Zubereitungen. Für Suppositorien können zu den herkömmlichen Bindemitteln und Trägerstoffen z. B. Polyalkylonglycole oder Triglyceride gehören; solche Suppositorien können aus Mischungen geformt werden, die 0,5% bis 10%, vorzugsweise 1 %-2% wirksamen Bestandteil enthalten. Orale Zubereitungen enthalten solche normalerweise verwendeten Trägerstoffe wie z.B. pharmazeutische Qualitäten von Mannitol, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Saccharin-Natriumsalz, Cellulose, Magnesiumcarbonat und dgl. Diese Zusammensetzungen erhalten die Form von Lösungen, Suspensionen, Tabletten, Pillen, Kapseln, langsam wirkenden Formulierungen oder Pulvern und enthalten 10%-95%, vorzugsweise 25%-70%, wirksamen Bestandteil.
Für die Vakzinformulierung können die Proteine in neutraler oder Salzform vorliegen. Zu den pharmazeutisch annehmbaren Salzen gehören die Säureadditionssalze (die mit den freien Aminogruppen des Peptids gebildet werden) und die mit anorganischen Säuren wie z. B. Chlorwasserstoffsäure oder Phosphorsäure oder organischen Säuren wie Essig-, Oxal-, Wein-, Maleinsäure und dgl. gebildet werden. Salze, die mit den freien Carboxylgruppen gebildet werden, können auch von anorganischen Basen wie z. B. Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium- oder Eisen(lll)-hydroxid und solchen organischen Basen wie Isopropylamin, Trimethylamin, 2-Ethylaminoethanol, Histidin, Procain und dgl. abgeleitet sein.
Die Vakzine werden in einer Weise, die mit der Dosiszubereitung vereinbar ist, in einer solchen Menge appliziert, die prophylaktisch und/oder therapeutisch wirksam ist. Die zu applizierende Menge, die im allgemeinen im Bereich von 5 Mikrogramm bis 250 Mikrogramm Antigen je Dosis liegt, ist von dem zu behandelnden Individuum, von der Fähigkeit des Immunsystems des Individuums zur Synthese von Antikörpern und vom erwünschten Schutzgrad abhängig. Die genauen Wirkstoffmengen, die appliziert werden müssen, können vom Ermessen des praktischen Arztes abhängen und individuell verschieden sein.
Das Vakzin kann nach einem Einzeldosierungsschema oder vorzugsweise nach einem Mehrfachdosierungsschema gegeben werden. Ein Mehrfachdosierungsschema ist ein Schema, bei dem eine Erstimpfkur mit 1-10 getrennten Dosen erfolgen kann, denenweitere Dosen folgen, die in späteren Zeitintervallen, die zur Aufrechterhaltung und/oder Vei Stärkung der Immunantwort erforderlich sind, gegeben werden, z. B. nach 1-4 Monaten für eine zweite Dosis, und gegebenenfalls (eine) nachfolgende Dosis/Dosen nach einigen Monaten. Das Dosierungsregime wird auch - zum mindesten teilweise - c'urch die Bedürfnisse des Individuums bestimmt und liegt im Ermessen des praktischen Arztes.
Ferner kann das Valain, welches das/die immunogene/n HCV-Antigen(e) enthält, in Verbindung mit anderen immunregulatorischen Agenzien, z. B. Immunglobulinen, appliziert werden.
Die in der beschriebenen Weise hergestellten immunogenen Polypeptide werden benutzt, um sowohl polygonale als auch monoklonal Antikörper zu produzieren. Wenn polygonale Antikörper erwünscht sind, wird ein ausgewähltes Säugetier (z. B. Maus, Kaninchen, Ziege, Pferd etc.) mit einem immunogenen Polypeptid immunisiert, das ein HCV-Epitop/HCV-Epitope trägt. Von dem immunisierten Tier wird Serum gesammelt und nach bekannten Verfahren behandelt. Wenn das Serum, das polygonale Antikörper zu einem HCV-Epitop enthält, Antikörper zu anderen Antigenen enthält, können die polyklonalen Antikörper durch Immunoaffinitätschromatographie gereinigt werden. Techniken zur Produktion und Verarbeitung polyklonaler Antisera sind in Fachkreisen bekannt. Siehe z.B. Mayer und Walker (1987).
Alternativ können polygonale Antikörper aus einem Säugetier isoliert werden, das zuvor mit HCV infiziert wurde. Ein Beispiel für ein Verfahren zur Reinigung von Antikörpern zu HCV-Epitopen aus Serum von einem infizierten Individuum, das auf der Affinitätschromatographib beruht und bei dem ein Fusionspolypeptid von SOD und einem im cDNA-Klon 6-1-1 codierten Polypeptid verwandet wird, wird in der EPO-Veröffentlichung Nr. 318 216 gegeben.
Monoklonal Antikörper, die gegen HCV-Epitope gerichtet sind, können vom Fachmann ebenfalls leicht produziert werden. Die allgemeine Methodologie zur Produktion monoklonaler Antikörper durch Hybridome ist gut bekannt. Immortale antikörperproduzierende Zellinien können durch Zellfusion und auch durch andere Techniken wie die direkte Transformation von B-Lymphozyten mit onkogener DNA oder Transfektion mit Epstein-Barr-Virus geschaffen werden. Siehe z. B. M.Schreier et al. (1980); Hammerlingetal. (1981); Kennett et al. (1980); siehe auch U.S.-Patente 4341761,4399121,4427783,4444 887, 4466917,4472500,4491632 und 4493890. »Panels" monoklonaler Antikörper, die gegen HCV-Epitope produziert wurden, können auf verschiedene Eigenschaften gescreent werden, d.h. auf Isotyp, Epitop-Affinität usw.
Sowohl monoklonal als auch polygonale Antikörper, die gegen HCV-Epitope gerichtet sind, sind besonders nützlich bei der Diagnose, und die neutralisierenden Antikörper sind bei der passiven Immunotherapie von Nutzen. Monoklonal Antikörper können insbesondere verwendet werden, um Anti-idiotyp-Antikörper zu schaffen.
Anti-Idiotyp-Antikörper sind Immunglobuline, die ein „inneres Bild" des Antigens des infektiösen Agens tragen, gegen das der Schutz brwünscht ist. Siehe z. B. Nisonoff, A., et al. (1981) und Dressman et al. (1985).
Techniken zur Schaffung von Anti-Idiotyp-Antikörpern sind in Fachkreisen bekannt. Siehe z. B. Grzycn (1985), MacNamara et al. (1984) und Uytdehaag et al. (1985). Diese Anti-Idiotyp-Antikörper können für die Behandlung und/oder Diagnose der NANBH wie auch für einen Aufschluß über die immunogenen Regionen der HCV-Antigene von Nutzen sein.
Ein Fachmann wird auch erkennen, daß eine Vielzahl von Antikörpertypen, die gegen HCV-Epitope gerichtet sind, produziert worden kann. Der Terminus „Antikörper" bezieht sich hier auf ein Polypeptid oder eine Gruppe von Polypeptiden, die aus mindestens einer Antikörper-Bindungsstelle (antibody combining site) bestehen. Eine „Antikörper-Bindungsstelle" oder „Bindungsdomäne" wird aus der Faltung von variablen Dämonen eines Antikörper-Moleküls gebildet, um dreidimensionale Bindungsräume mit einer inneren Oberflächengestalt und Ladungsverteilung komplementär zu den Merkmalen eines Epitops eines Antigens zu bilden, wodurch eine immunologische Reaktion mit dem Antigen gestattet wird. Eine Antikörper-Bindungsstelle kann aus einer schweren und/oder leichten Kettendomäne (VH bzw. VL) gebildet werden, die hypervariable Schleifen bilden, die zur Antigen-Bindung beitragen. Der Terminus „Antikörper" umfaßt z. B. Wirbeltierantikörper, Hybridantikörper, chimäre Antikörper, veränderte Antikörper, monovalente Antikörper, die Fab-Proteine und Einzeldomänen-Antikörper.
Ein „Einzeldomänen-Antikörper" (dAb) ist ein Antikörper, der aus einer VH-Domäne besteht, die immunologisch mit einem designierten Antigen reagiert. Ein dAb enthält keine VL-Domäne, kann aber andere Antigen-Bindungsdomänen enthalten, von denen bekannt ist, daß sie in Antikörpern existieren, z. B. die kappa- und lambda-Domäne. Methoden zur Herstellung von dAb sind im Fachgebiet bekannt. Siehe z. B. Ward et el. (1989).
Antikörper können auch aus VH- und VL-Domänen sowie auch aus anderen bekannten Antigen-Bindungsdomänen bestehen. Beispiele für diese Antikörpertypen und Methoden und ihrer Herstellung sind im Fachgebiet bekannt (siehe z. B. U. S.Patent 4816467, das hier durch die Bezugnahme einbezogen wird) und umfassen folgendes.
Beispielsweise bezieht sich der Terminus „Wirbeltierantikörper" auf Antikörper, die Tetramere oder Aggregate derselben sind, die leichte und schwere Ketten umfassen, die gewöhnlich in einer „Y"-Konfiguration aggregiert sind und die kovalente Bindungen zwischen den Ketten haben können oder nicht. Bei Wirbeltierantikörpern sind die Aminosäuresequenzen aller Ketten eines speziellen Antikörpers mit den Ketten homolog, die in einem Antikörper gefunden wurden, der durch den Lymphozyten produziert wurde, der diesen Antikörper in situ oder in vitro produziert (z. B. in Hybridomen). Wirbeltitrantikörper enthalten typischerweise native Antikörper, z. B. gereinigte polygonale Antikörper und monoklonal Antikörper. Beispiele für Verfahren zur Herstellung dieser Antikörper werden nachstehend beschrieben.
„Hybridantikörper" sind Antikörper, bei denen ein Paar schwerer und leichter Ketten homolog mit denen in einem ersten Antikörper ist, während das andere Paar schwerer und leichter Ketten homolog mit denen in einem anderen zweiten Antikörper ist. Typischerweise bindet jedes dieser beiden Paare verschiedene Epitope, insbesondere an verschiedenen Antigenen. Dies führt zu der Eigenschaft der „Bivalenz", d. h. zu der Fähigkeit, zwei Antigene gleichzeitig zu binden. Solche Hybride können auch bei Verwendung von Chimären Ketten gebildet werden, wie nachstehend gezeigt wird.
„Chimäre Antikörper" sind Antikörper, in denen die schweren und/oder leichten Ketten Fusionsproteine sind. Typischerweise ist die konstante Domäne der Ketten aus einer speziellen Spezies und/oder Klasse, und die variablen Domänen sind aus einer anderen Spezies und/oder Klasse. Ebenfalls mit inbegriffen ist jeder Antikörper, in dem eine oder beide der schweren oder leichten Ketten aus Kombinationen von Sequenzen zusammengesetzt ist/sind, die die Sequenzen in Antikörpern aus verschiedenen Quellen nachahmen (mimicking), sei es, daß diese Quellen nach dem Ursprung verschiedene Klassen oder verschiedene Spezies sind, und sei es, daß der Fusionspunkt an der variablen/konstanten Grenze liegt oder nicht. Somit ist es möglich, Antikörper zu produzieren, in denen weder die konstante noch die variable Region bekannte Antikörpersequenzen nachahmen. Es wird dann z. B. möglich, Antikörper zu konstruieren, deren variable Region eine höhere spezifische Affinität für ein spezielles Antigen hat oder deren konstante Region eine erhöhte Komplementfixation hervorrufen kann, oder andere Verbesserungen an den Eigenschaften vorzunehmen, die eine spezielle konstante Region besitzt.
Ein anderes Beispiel stellen „veränderte Antikörper" dar; dies bezieht sich auf Antikörper, in denen die natürlich vorkommende Aminosäuresequenz in einem Wirbeltierantikörper variiert worden ist. Unter Anwendung von DNA-Rekombinationstechniken können Antikörper neu konstruiert (redesigned) werden, um die erwünschten Charakteristiken zu erhalten. Es gibt viele mögliche Variationen, und sie reichen von der Veränderung einer oder mehrerer Aminosäuro/n bis zur vollständigen Neukonstruktion einer Region, z. B. der konstanten Region. Veränderungen in der konstanten Region erfolgen im allgemeinen, um die erwünschten zellulären Prozeßcharakteristiken zu erreichen, z. B. Änderungen in der Komplementfixation, Wechselwirkung mit Membranen und andere Effektor-Funktionen. Änderungen in der variablen Region können vorgenommen werden, um die Antigenbindungs-Charakteristiken zu ändern. Der Antikörper kann auch konstruiert (engineered) werden, um die spezifische Zufuhr eines Moleküls oder einer Substanz zu einer spezifischen Zelle oder einem Gewebeort zu unterstützen. Die erwünschten Veränderungen können nach in der Molekularbiologie bekannten Techniken, z. B. Rekombinationstechniken, durch ortsspezifische Mutagenese usw., vorgenommen werden.
Ein weiteres Beispiel sind „monovalente Antikörper", das sind Aggregate, die aus einem schwere Kette/leichte Kette-Dimer bestehen, das an die Fc-Region (d. h. konstante Region) einerzweiten schweren Kette gebunden ist. Dieser Antikörpertyp entgeht der antigenon Modulation. Siehe z. B. Glennie et al. (1982).
In die Definition der Antikörper mit inbegriffen sind auch die „Fab"-Fragmente der Antikörper. Die „Fab"-Region sind jene Teile der schweren und leichten Ketten, die den Sequenzen annähernd äquivalent oder analog sind, die den verzweigten Teil der schweren und leichten Kette umfassen und von denen gezeigt wurde, daß sie eine immunologische Bindung an ein spezifiziertes Antigen aufweisen, denen aber der Effektor-Fc-Teil fehlt. „Fab" umfaßt Aggregate einer schweren und einer leichten Kette (gemeinhin als Fab' bekannt) sowie Tetra mere, die 2 H- und 2 L-Ketten enthalten (als F[ab)2 bezeichnet), die in der Lage sind, selektiv mit einem bestimmten Antigen oder einer Antigenfamilie zu reagieren. „Fab"-Antikörper können in Untergruppen analog den vorstehend beschriebenen unterteilt werden, d. h. „Wirbet.ier-Fab", „Hybrid-Fab", „chimäre Fab" und „veränderte Fab". Verfahren zur Produktion von „Fab"-Fragmenten sind in Fachkreisen bekannt und umfassen z. B. Hroteolyse und Synthese nach Rekombinationstechniken.
Ii. H. Diagnostische Ollgonucleotldsonden und Kits
Unter Verwendung der offenbarten Teile der isolierten HCV-cDNA als Basis können Oligomere aus annähernd 8 oder mehr Nucleotiden entweder durch Exzision oder synthetisch hergestellt werden, die mit dem HCV-Genom hybridisieren und bei der Identifizierung des/der viralen Agens/Agenzien, des weiteren Charakterisierung des/der viralen Genoms/Genome sowie beim Nachweis des Virus/der Viren in erkrankten Individuen von Nutzen sind. Die Sonden für HCV-Polynucleotide (natürlich oder abgeleitet) haben eine Länge, die den Nachweis von einmaligen viralen Sequenzen durch Hybridisierung gestattet. Während &-8 Nucleotide eine brauchbare Länge darstellen können, werden Sequenzen von 10-12 Nucleotiden bevorzugt, und etwa 20 Nucleotide scheinen optimal zu sein. Vorzugsweise werden diese Sequenzen von Regionen abgeleitet, dbnen die Heterogenität fehlt. Diese Sonden können mit Hilfe von Routinemethoden einschließlich der Methoden zur automatisierten Oligonucleotidsynthese hergestellt werden. Unter den brauchbaren Sonden befinden sich z. B. die von den neu isolierten, hier beschriebenen Klonen abgeleiteten sowie die verschiedenen Oligomere, die beim Sondieren der cDNA-Banken brauchbar sind, wie nachstehend dargestellt. Ein Komplement zu irgendeinem einmaligen Teil des HCV-Genoms ist hinreichend. Für die Verwendung als Sonden ist die vollständige Komplementarität erwünscht, obwohl sie unnötig sein kann, wenn die Länge des Fragments vergrößert wird.
Zur Verwendung derartiger Sonden als diagnostisches Mittel kann die zu analysierende biologische Probe wie z. B. Blut oder Serum - falls erwünscht - behandelt werden, um die enthaltenen Nucleinsäuren zu extrahieren. Die resultierende Nucleinsi'ure aus der Probe kann der Gelelektrophorese oder anderen Techniken zur Trennung nach der Größe unterworfen werden; alterna iv kann die Nucleinsäureprobe ohne Trennung nach der Größe Dot-Blotting unterzogen werden. Die Sonden werden dann markiei t. Geeignete Markierungen und Methoden zum Markieren der Sonden sind im Fachgebiet bekannt und umfassen zum Beispiel radioaktive Markierungen, die durch „nick'-Translation oder durch „Kinasieren" (kinasing) eingesetzt werden, mit Biotin markierte, fluoreszenzmarkierte Sonden und chemilumineszenzmarkierte Sonden. Die aus der Probe extrahierten Nucleinsäuren werden dann mit der markierten Sonde unter geeigneten stringenten (streng kontrollierten) Hybridisierungsbedingungen behandelt, und Polynucleotidduplexe, die die Sonde enthalten, werden nachgewiesen.
Die Sonden können vollständig komplementär zum HCV-Genom hergestellt werden. Daher sind gewöhnlich hochstringente Bedingungen erwünscht, um falsche positive Ergebnisse zu vermeiden. Hochstringente Bedingungen sollten jedoch nur angewendet werden, wenn die Sonden Regionen des viralen Genoms komplementär sind, denen Heterogenität fehlt. Die strenge Kontrolle (stringency) der Hybridisierung wird durch eine Reihe von Faktoren während der Hybridisierung und während des Waschvorgangs bestimmt, zu denen die Temperatur, die lonenstärke, die Zeitdauer und die Formamidkonzentration gehören. Diese Faktoren werden z. B. bei T. Maniatis (1982) beschrieben.
Im allgemeinen wird erwartet, daß die HCV-Genomsequenzen im Serum von infizierten Individuen auf einem relativ niedrigen Niveau vorkommen, d.h. etwa 10a—103 infektiöse Schimpansendosen (CID) je ml. Dieses Niveau kann erfordern, daß Verstärkungstechniken bei Hybridisierungsassays angewendet werden. Diese Techniken sind in Fachkreisen bekannt. Beispielsweise benutzt das „Biobridge"-System der Enzo Biochemical Corporation terminale Desoxynucleotidtransferase, um unmodifizierte 3'-Poly-dT-Tails an eine DNA-Sonde anzuhängen. Die poly-dT-getailte Sonde wird an eine Target-Nucleotic'sequenz und dann an eine mit Biotin modifizierte poly-A-Sequenz hybridisiert. Die PCT-Anmeldung 84/03520 und EPA 124221 beschreiben eine DNA-Hybridisierungsassay, bei dem (1) Analyt an eine einzelsträngige DNA-Sonde hybridisiert (annealed) wird, die zu einem enzymmarkierten Oligonucleotid komplementär ist, und (2) der resultierende getaute Duplex an ein enzymmarkiertes Oligonucleotid hybridisiert wird. Die EPA 204510 beschreibt einen DNA-Hybridisierungsassay, bei dem Analyt-DNA in Kontakt gebracht wird mit einer Sonde, die einen Tail wie z. B. einen Poly-dT-Tail hat, einen Verstärker-Strang, der eine Sequenz aufweist, die an den Tail der der Sonde hybridisiert, z. B. eine Poly-A-Sequenz, und die in der Lage ist, eine Vielzahl von markierten Strängen zu binden. Eine besonders erwünschte Technik kann zunächst die Verstärkung der Target-HCV-Sequenzen in Seren auf etwa das 1000Ofache umfassen, d.h. annähernd 10* Sequenzen/ml. Dies kann z. B. durch die PolymerasekettenreaktionstechniMPCR-Technik) erreicht werden, die von Saiki et al. (1986), Mullis, U. S.-Patent 4683195, und Mullis et al., U. S.-Patent 4683202 beschrieben wird. Die verstärkte(n) Sequenz(en) können dann durch einen Hybridisierungsassay nachgewiesen werden, der in der EP 317077, veröffentlicht am 24. Mai 1989, beschrieben wird. Diese Hybridisierungsassays, die Sequenzen auf einem Niveau von 10Vml nachweisen sollen, nutzen Nucleinsäure-Multimere, die sich an einzelsträngige Analyt-Nucleinsäure binden, und die sich auch an eine Vielzahl von einzelsträngigen markierten Oligonucleotiden binden.
Ein geeigneter Lösungsphasen-Sandwichassay, der mit markierten Polynucleotidsonden benutzt werden kann, und die Verfahren zur Herstellung der Sonden werden in der EPO 225807, veröffentlicht am 16. Juni 1987, beschrieben. Die Sonden können in Diagnose-Kits verpackt werden. Diagnose-Kits enthalten die Sonden-DNA, die markiert sein kann; alternativ kann die Sonden-DNA unmarkiert sein, und die Bestandteile für die Markierung können in dem Kit in gesonderten Containern aufgenommen werden. Der Kit kann auch andere geeignet verpackte Reagenzien und Materialien enthalten, die für ein spezielles Hybridisierungsprotokoll benötigt werden, z. B. Standards, sowie Anweisungen für die Testdurchführung.
Sowohl die Peptide, die immunologisch mit Serum, das HCV-Antikörper enthält, reagieren, z. B. jene, die durch die nachstehend in den Beispielen beschriebene antigene Screening-Methode nachgewiesen werden, sowie jene, die von den in den Beispielen beschriebenen Klonen abgeleitet oder in ihnen codiert sind, und Zusammensetzungen derselben als auch die Antikörper, die gegen die HCV-spezifischen Epitope in diesen Polypeptiden gebildet werden, sind bei Immunoassays brauchbar, um die Gegenwart von HCV-Antikörpern oder die Gegenwart des Virus und/oder von viralen Antigenen in biologischen Proben nachzuweisen. Die Gestaltung (design) der Immunoassays unterliegt sehr vielen Variationen, von denen viele im Fachgebiet bekannt sind. Beispielsweise kann der Immunoassay ein virales Epitop nutzen; alternativ kann der Immunoassay eine Kombination von viralen Epitopen nutzen, die von diesen Quellen abgeleitet sind; diese Epitope können von den gleichen oder von verschiedenen viralen Polypeptiden abgeleitet sein und in gesonderten rekombinanten oder natürlichen Polypeptiden oder zusammen in den gleichen rekombinanten Polypeptiden vorliegen. Er kann z.B. einen monoklonalen Antikörper, der gegen ein virales Epitop/gegen virale Epitope gerichtet ist, eine Kombination von monoklonalen Antikörpern, die gegen Epitope eines viralen Antigens gerichtet sind, monoklonale Antikörper, die gegen Epitope von verschiedenen viralen Antigenen gerichtet sind, polyklonale Antikörper, die gegen das gleiche virale Antigen gerichtet sind, oder polygonale Antikörper, die gegen verschiedene virale Antigene gerichtet, nutzen. Die Protokolle können z. B. auf der Konkurrenz (competition) oder der direkten Reaktion oder Assays vom Sandwichtyp beruhen. Die Protokolle können auch z. B. feste Träger nutzen oder durch Immunpräzipitation erstellt werden. Die meisten Assays schließen die Verwendung eines markierten Antikörpers oder Polypeptide ein; die Markierungen können z. B. fluoreszierende, chemilumineszente, radioaktive oder Farbstoffmoleküle sein. Bekannt sind auch Assays, die die Signale von der Sonde verstärken; Beispiele hierfür sind Assays mit Biotin und Avidin und enzymmarkierte und vermittelte Immunoassays wie ELISA.
Einige antigene Regionen des mutmaßlichen Polyproteins wurden kartiert und durch Screenen der Antigenität der bakteriellen Expressionsprodukte von HCV-cDNAs, die Teile des Polyproteins codieren, identifiziert. Siehe Beispiele. Andere antigene Regionen des HCV können durch Expression der Teile der HCV-cDNAs in anderen Expressionssystemen einschließlich Hefesystemen und Zellsystemen, die von Insekten und Wirbeltieren abgeleitet sind, nachgewiesen werden. Ferner führen Untersuchungen, die einen Antigenitäts-Index und ein Hydrophobie/Hydrophilie-Profil liefern, zu Informationen hinsichtlich der Wahrscheinlichkeit für die Antigenität einer Region.
Die Untersuchungen über das antigene Kartieren durch Expression von HCV-cDNAs zeigten, daß eine Reihe von Klonen, die diese cDNAs enthalten, Polypeptide exprimierte, die immunologisch mit Serum von Individuen mit NANBH reaktionsfähig waren. Kein einziges Polypeptid war immunologisch mit allen Seren reaktionsfähig. Fünf dieser Polypeptide waren sehr immunogen, insofern als Antikörper zu den HCV-Epitopen in diesen Polypeptiden in vielen verschiedenen Patientenseren nachgewiesen wurden, obwohl die Überlappung beim Nachweis nicht vollständig war. Somit lassen die Ergebnisse über die Immunogenität der Polypeptide, die in den verschiedenen Klonan codiert sind, schließen, daß wirksame Nachweissysteme die Verwendung von Epitop-"Panels" einschließen können. Die Epitope im „Panel" können zu einem oder multiplen Polypeptiden konstruiert werden.
Kits, die für die Immunodiagnose geeignet sind und die geeigneten markierten Reagenzien enthalten, werden durch Verpackung der geeigneten Materialien einschließlich der erfindungsgemäßen Polypeptide, die HCV-Epitope oder gegen HCV-Epitope gerichtete Antikörper enthalten, in geeignete Container zusammen mit den übrigen Reagenzien und Materialien, die für die Assaydurchführung erforderlich sind, sowie eines geeigneten Satzes von Assayvorschriften zusammengestellt.
Weitere Charakterisierung des HCV-Genoms, der Virionen und vlralen Antigene du. oh Verwendung der Sonden, die von der cDNA zum vlralen Genom abgeleitet sind
Die HCV-cDNA-Sequenz-lnformation in den neu isolierten Klonen, die in den Beispielen beschrieben werden, kann benutzt werden, um weitere Informationen über die Sequenz des HCV-Genoms und für die Identifizierung und Isolierung des HCV-Agens zu gewinnen, und trägt somit zu einer Charakterisierung einschließlich der Natur des Genoms, der Struktur der Viruspartikel und der Natur der Antigene bei, aus denen es zusammengesetzt ist. Diese Information kann ihrerseits zu zusätzlichen Polynucleotidsonden, vom HCV-Genom abgeleiteten Polypeptiden und Antikörpern führen, die gegen HCV-Epitope gerichtet sind, die von Nutzen für die Diagnose und/oder Behandlung von durch HCV verursachter NANBH wären. Die cDNA-Sequenz-lnformation in den obenerwähnten Klonen ist von Nutzen für die Konstruktion von Sonden für die Isolierung von zusätzlichen cDNA-Sequenzen, die von noch nicht definierten Regionen des HCV-Genoms der HCV-Genome abgeleitet sind, von denen diecDNAs in den hier und in der EP 0316218 beschriebenen Klonen abgeleitet sind. Beispielsweise können markierte Sonden, die eine Sequenz von annähernd 8 oder mehr Nucleotiden und vorzugsweise 20 oder mehr Nucleotiden enthalten, die von Regionen nahe den 5'-Enden oder 3'-Enden der in Fig. 17 dargestellten zusammengesetzten HCV-cDNA-Sequenz abgeleitet sind, benutzt werden, um überla spende cDNA-Sequenzen aus HCV-cDNA-Banken zu isolieren. Alternativ könnte die Charakterisierung der genomischen Segmente aus dem/den viralen Genom/en erfolgen, das/die aus den gereinigten HCV-Partikoln isoliert wurden. Verfahren zur Reinigung von HCV-Partikeln und zum Nachweis derselben während der Reinigung werden nachstehend beschrieben. Verfahren zur Isolierung von Polynucleotidgenomen aur Viruspartikeln sind im Fachgebiet bekannt, und ein anwendbares Verfahren ist das in der EP 0218316 beschriebene. Die isolierten genomischen Segmente können dann Moniert und sequenziert werden. Ein Beispiel für diese Technik, das die Amplifikation der zi; klonierenden Sequenzen nutzt, wird nachstehend beschrieben und lieferte Klon 16jh.
Methoden zur Konstruktion von cDNA-Banken sind im Fachgebiet bekannt und werden vor· und nachstehend diskutiert; ein Verfahren zur Konstruktion von HCV-cDNA-Banken im lambda-gt 11 wird in der EP 0 318 216 diskutiert. cDNA-Banken, die für das Screenen mit Nucleinsäuren von Nutzen sind, können jedoch auch in anderen im Fachgebiet bekannten Vektoren, z. B. lambdagt 10, konstruiert werden (Huynh et al., 1985).
Die Verfügbarkeit von Zellkultur- und tierischen Modellsystemen für HCV macht es möglich, auf antivirale Agenzien zu screenen, die die HCV-Replikation inhibieren, und speziell auf jene Agenzien, die vorzugsweise Zellwachstum und Zellvermehrung zulassen, während sie die Virusreplikation inhibieren. Diese Screening-Methoden sind in Fachkreisen bekannt. Im allgemeinen werden die antiviralen Agenzien bei einer Vielzahl von Konzentrationen auf ihre Wirkung auf die Verhinderung der Virusreplikation ir> Zellkultursystemen, die die Virusreplikation unterstützen, und danach auf Inhibierung der Infektiosität und viralen Pathogenität (und eines niedrigen Niveaus der Toxizität) in einem tierischen Modellsystem getestet. Die hier verfügbar gemachten Methoden und Zusammensetzungen für den Nachweis von HCV-Antigenen und HCV-Polynucleotiden sind von Nutzen für das Screenen von antiviralen Agenzmn, weil sie eine Alternative und vielleicht sensitivere Mittel für den Nachweis der Wirkung des Agens auf die Virusreplikation alc der Zell-Plaque-Assay oder der ID60-Assay darstellen. Beispielsweise können die hier beschriebenen HCV-Polynucleotidsonden benutzt werden, um die Menge der in einer Zellkultur produzierten viralen Nucleinsäure quantitativ zu bestimmen. Dies könnte z. B. durch Hybridisierung oder Konkurrenzhybridisierung der infizierten Zell-Nucleinsäuren mit einer markierten HCV-Polynucleotidsonde erfolgen. Zum Beispiel können auch Anti-HCV-Antikörper benutzt werden, um HCV-Antigen/e in der Zeilkultur unter Anwendung der hier beschriebenen Immunoassays zu identifizieren und quantitativ zu bestimmen. Da es wünschenswert sein kann, die HCV-Antigene in der infizierten Zellkultur durch einen Konkurrenzassay quantitativzu bestimmen, sind die in den hier beschriebenen HCV-cDNAs codierten Polypeptide ferner bei diesen Konkurrenzassays von Nutzen. Im allgemeinen würde ein rekombinantes HCV-Polypeptid, das von der HCV-cDNA abgeleitet ist, markiert, und die Inhibierung der Bindung dieses markierten Polypeptide an ein HCV-Polypeptid aufgrund des im Zellkultursystem produzierte Antigens würde überwacht. Außerdem sind diese Techniken in den Fällen besonders nützlich, in denen das HCV zur Replikation in einer Zellinie ohne Verursachung von Zelltod in der Lage sein kann.
Die antiviralen Agenzien, die mit Hilfe dieser Methoden auf Wirksamkeit getestet werden können, sind in Fachkreisen bekannt und umfassen z. B. jene, die mit Virion-Komponenten und/oder zellulären Komponenten in Wechselwirkung treten, die für die Bindung und/oder Replikation des Virus notwendig sind. Zu den typischen antiviralen Agenzien können ζ. Β Inhibitoren der Virion-Polymerase und/oder Protease(n) gehören, die für die Spaltung der Präkursor-Polypeptide notwendig sind. Andere antivirale Agenzien können jene umfassen, die mit Nucleinsäuren zur Verhinderung der Virusreplikation, z. B. „anti-sense"-Polynucleotide usw., zusammenwirken.
„Anti-sense"-Polynucleotid-Moleküle bestehen aus einer komplementären Nucleotidsequenz, die es ihnen gestattet, spezifisch an bestimmte Regionen von Genomen oder RNAs zu hybridisieren. „Anti-sense"-Polynucleotide können z.B. Moleküle, die die Proteintranslation durch Bindung an mRNA blockieren, oder Moleküle umfassen, die dio Replikation von Virus-RNA durch Transkriptase verhindern. Sie können auch Moleküle einschließen, die Agenzien (nichtkovalent oder kovalent gebunden) tragen, die die Virus-RNA veranlassen, inaktiv zu sein, indem sie z. B. Spaltungen (scissions) in der Virus-RNAverursachen. Sie können sich auch an zelluläre Polynucleotide binden, die die virale Infektiosität, das Replikationsvermögen oder die Chronizität verstärken und/oder für diese erforderlich sind. „Anti-sense"-Moleküle, die an HCV-abgeleitete RNAs hybridisieren sollen, können ausgehend von der hier verfügbar gemachten Sequenzinformation der HCV-cDNA konstruiert (designed) werden. Die antiviralen Agenzien, die auf „Anti-sense"-Polynucleotiden für HCV basieren, können so konstruiert werden, daß sie mit hoher Spezifität binden, von erhöhter Löslichkeit sind, stabil sind und niedrige Toxizität aufweisen. Daher können sie in spezialisierten Systemen, z. B. Liposomen, oder durch Gentherapie geliefert werden. Ferner können sie Analoge, angelagerte Proteine, substituierte oder veränderte Bindung zwischen den Basen usw. umfassen.
Andere Arzneimitteltypen können auf Polynucleotiden basieren, die wichtige Kontrollregionen des HCV-Genoms „nachahmen" und die auf Grund ihrer Wechselwirkungen mit den Schlüsselkomponenten das Systems, das für die virale Infektiosität oder Replikation verantwortlich ist, therapeutisch wirksam sein können.
Die allgemeinen Techniken, die bei der Extraktion des Genoms aus einem Virus, bei der Herstellung und Sondierung einer cDNA-Bank, beim Sequenzieren von Klonen, bei der Konstruktion von Expressionsvektoren, bei der Zelltransforn ,non, bei der Durchführung von immunologischen Assays wie Radioimmunoassays und ELISA, für das Zellwachstum in einer Kultur und dgl. angewendet werden, sind in Fachkreisen bekannt, und Laborhandbücher mit einer Beschreibung dieser Techniken stehen zur Verfügung. Als allgemeine Richtschnur werden jedoch im folgenden einige Quellen, die gegenwärtig für derartige Verfahren verfügbar sind und für Materialien, die bei ihrer Ausführung von Nutzen sind, dargestellt.
Sowohl prokaryontische als auch eukaryontische Wirtszellen können zur Expression der erwünschten codierenden Sequenzen benutzt werden, wenn geeignete Kontrollsequenzen, die mit dem vorgesehenen Wirt verträglich sind, verwendet werden. Von den prokaryontischen Wirten wird E. coil besonders häufig verwendet. Zu den Expressionskontrollsequenzen für Prokaryonten gehören Promotoren, die wahlfrei Operatorteile enthalten, und Ribosomen-Bindungsstellen. Transfervektoren, die mit prokaryontischen Wirten verträglich sind, werden gewöhnlich z. B. von pBR 322 abgeleitet, einem Plasmid, das Operone enthält, die Ampicillin- und Tetracyclin-Resistenz verleihen, und den verschiedenen pUC-Vektoren, die ebenfalls Sequenzen enthalten, die antibiotische Resistenz-Marker übertragen. Diese Marker können benutzt werden, um durch Selektion erfolgreiche Transformanten zu erhalten. Die gewöhnlich benutzten prokaryontischen Kontrollsequenzen umfassen die ß-Lactamase (Penicillinase) und Lactose-Promotorsysteme (Chang et al., 1977), das Tryptophan-(trp)-Promotorsystem (Goeddel et al., 1980) und den lambda-abgeleiteten PL-Promotor und die N-Gen-Ribooomen-Bindungsstelle (Shimatake et al., 1981) und den Hybridtac-Promotor (De Boer et al., 1983) abgeleitet von Sequenzen der trp- und lac-UVB-Promotoren. Die vorstehend genannten Systeme sind mit E. coil besonders verträglich; falls erwünscht, können andere prokaryontische Wirte wie Bacillus- oder Pseudomonas-Sta'mme mit entsprechenden Kontrollsequenzen benutzt werden.
Zu den eukaryontischan Wirten zählen Hefe- und Säugetierzellen in Kultursystemen. Saccharomyces cerevlslae und Saccharomyces carlsbergensls sind die gebräuchlichsten Hefewirte und geeignete pilzliche Wirte. Mit Hefe verträgliche Vektoren tragen Marker, die die Selektion von erfolgreichen Transformanten durch Übertragung der Prototrophie auf auxotrophe Mutanten oder der Resistenz gegen Schwermetalle auf Wildtyp-Stämme gestatten. Mit Hefe verträgliche Vektoren können den 2-Mikron-Replikationsstartpunkt (Broach et al., 1983), die Kombination von CEN 3 und ARS 1 oder andere Mittel zur Gewährleistung der Replikation wie Sequenzen verwenden, die im Einbau eines geeigneten Fragments in das Wirtszellgenom resultieren. Kontrollsequenzen für Hefevektoren sind im Fachgebiet bekannt und umfassen Promotoren für die Synthese von glycolytischen Enzymen (Hess et al., 1968; Holland et al., 1978) einschließlich des Promotors für die 3-Phosphoglyceratkinase (Hitzeman, 1980). Terminatoren können auch mit inbegriffen sein, z.B. die vom Enolase-Gen abgeleiteten (Holland, 19R1). Besonders nützliche Kontrollsysteme sind jene, die den Glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase-Promotor (GAPDH-Promotor) oder den Alkoholdehydrogenase-regulierbaren Promotor (ADH-regulierbaren Promotor), Terminatoren, ebenfalls von GAPDH abgeleitet, und eine Leader-Sequenz des Hefe-a-Faktors, falls Sekretion erwünscht ist, umfassen. Ferner können die Transkriptionsregulationsregion und die Transkriptionsinitiationsregion, die operabel verbunden sind, dergestalt sein, daß sie im Wildtyp-Organismus nicht natürlich assoziiert sind. Diese Systeme werden in der EPO 120551, veröffentlicht am 3.Oktober 1984, in der EPO 116201, veröffentlicht am 22. August 1984, und in der EPO 164556, veröffentlicht am 18.Dezember 1985, eingehend beschrieben, die alle an den hier angegebenen Zessionar abgetreten wurden und hiermit durch Bezugnahme einbezogen werden.
Säugerzellinien, die als Wirt für die Expression zur Verfügung stehen, sind im Fachgebiet bekannt und umfassen viele immortalisierte Zellinien aus der American Type Culture Collection (ATCC) incl. HeLa-Zellen, Ovarialzellen des Chinesischen Hamsters (CHO-Zellen), Babyhamsternierunzellen (BHK-Zellen) und eine Reihe anderer Zellinien. Geeignete Promotoren für Säugerzellon sind im Fachgebiet ebenfalls bekannt und umfassen virale Promotoren wie die aus Simianvirus 40 (SV40) (Fiers, 1978) Rous-Sarkomvirus (RSV), Adenovirus (ADV) und dem bovinen Papillomvirus (BPV). Säugerzellen können auch Terminatorsequanzen und Poly-A-Additionssequenzen erfordern; Enhancersequenzfan, die die Expression vergrößern, können ebenfalls mit inbegriffen sein, und Sequenzen, die die Amplifikation des Gens bewirken, können ebenfalls erwünscht sein. Diese Sequenzen sind in Fachkreisen bekannt. Für die Replikation in Säugerzellen geeignete Vektoren können virale Replikons oder Sequenzen enthalten, die die Integration der geeigneten NANBV-Epitope codierenden Sequenzen in das Wirtsgenom garantieren.
Die Transformation kann nach jeder bekannten Methode zur Einführung von Polynucleotiden in eine Wirtszelle erfolgen, eingeschlossen z. B. die Verpackung des Polynucleotide in ein Virus und Transduktor) einer Wirtszelle mit dem Virus und durch direkte Aufnahme des Polynucleotide. Das Transformationsverfahren hängt von dem zu transformierenden Wirt ab. Beispielsweise wird die Transformation von E.coli-Wirtszellen mit lambda-gt 11-haltigen BB-NANBV-Sequenzen nachstehend im Abschnitt Beispiele diskutiert. Die bakterielle Transformation durch direkte Aufnahme umfaßt im allgemeinen die Behandlung mit Calcium- oder Rubidiumchlorid (Cohen, 1972; Maniatis, 1982). Hefetransformation durch direkte Aufnahme kann mit Hilfe der Methode von Hinnen et al. (1978) durchgeführt werden. Säugertransformationen durch direkte Aufnahme können unter Anwendung der Calciumphosphatfällung von Graham und Van der Eb (1978) oder den verschiedenen bekannten Modifikationen dieser Methode durchgeführt werden.
Die Vektorkonstruktion bedient sich in Fachkreisen bekannter Techniken. Die ortsspezifische DNA-Spaltung erfolgt durch Behandlung mit geeigneten Restriktionsenzymen unter Bedingungen, die im allgemeinen durch den Hersteller dieser handelsüblichen Enzyme vorgeschrieben werden. Im allgemeinen wird etwa 1 Mikrogramm Plasmid oder DNA-Sequenz durch 1 Enzymeinheit in etwa 20 Mikroliter Pufferlösung durch 1-2 h Inkubation bei 380C gespalten. Nach der Inkubation mit dem Restriktionsenzym wird das Protein durch Phenol/Chloroform-Extraktion entfernt und die DNA durch Fällung mit Ethanol zurückgewonnen. Die gespaltenen Fragmente können unter Anwendung der Polyacrylamidgel- oder Agarosegelelektrophorese entsprechend den allgemeinen Verfahren in Methods in Enzymology 65 (1980) S.499-560 getrennt werden. Spaltfragmente mit kohäsiven Enden können durch Verwendung von E.coli-DNA-Polymerase I (Klenow) in Gegenwart der geeigneten Desoxynucleotid-triphosphate (dNTPs), die in der Mischung vorhanden sind, glattendig sein. Verwendet werden kann auch S 1-Nuclease, was zur Hydrolyse aller einzelsträngigen DNA-Teile führt.
Ligationen werden unter Anwendung von Standard-Puffer- und Temperaturbedingungen und Verwendung von T4-DNA-Ligas. und ATP durchgeführt; Ligationen kohäsiver Enden erfordern weniger ATP und weniger Ligase als Ligationen glatter Enden.
Wenn Vektorfragmente als Teil einer Ligationsmiscbung verwendet werden, wird das Vektorfragment oft mit bakterieller alkalischer Phosphatase (BAP) oder alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm behandelt, um das 5'-Phosphat zu er.'.fernen und die Re-Ligation des Vektors auf diese Weise zu verhindern; alternativ kann die Restriktionsenzymverdauung unerwünschter Fragmente zur Verhinderung der Ligation angewendet werden.
Ligationsmischungen werden in geeignete Kloniurungswirte wie E.coli transformiert, und erfolgreiche Transformanten werden z. B. durch Antibiotikaresistenz selektioniert und auf die richtige Konstruktion gescreent.
Synthetische Oligonucleotide können mit Hilfe eines automatischen Oligonucleotid-Synthesizers nach Warner (1984) hergestellt werden. Falls erwünscht, können die synthetischen Stränge durch Behandlung mit Polynucleotid-Kinase in Gegenwart von 32P-ATP mit 32P markiert werden, wobei für die Reaktion Standardbedingungen angewendet werden. DNA-Sequenzen mit Einschluß der aus cDWA-Banken isolierten können nach bekannten Techniken inkl. der ortsspezifischen Mutagenese, wie sie von Zoller (1982) beschrieben wurde, modifiziert werden. Die zu modifizierende DNA wird- kurz gesagt- in den Phagen als einzelsträngige Sequenz verpackt und mit DNA-Polymerase in eine doppelsträngige DNA umgewandelt, wobei als Prin.er ein synthetisches Oligonucleotid verwendet wird, das zu dom Teil der DNA, der zu modifizieren ist, komplementär ist und die erwünschte Modifikation in seiner eigenen Sequenz aufweist. Die resultierende doppelsträngige DNA wird in ein phagentragendes Wirtsbakterium transformiert. Kulturen der transformierten Bakterien, die Replikationen jedes Strangs des Phagen enthalten, werden in Agar plattiert, um Plaques zu erhalten. Theoretisch enthalten 50% der neuen Plaques Phagen mit der mutierten Sequenz, und die restlichen 50% haben die ursprüngliche Sequenz.
Replikate der Plaques werden an eine markierte synthetische Sonde bei Temperaturen und unter Bedingungen hybridisiert, die die Hybridisierung mit dem richtigen Strang, aber nicht mit der unmodifizierten Sequenz gestatten. Die Sequenzen, die durch Hybridisierung identifiziert wurden, werden zurückgewonnen und kloniert.
DNA-Banken können nach dem Verfahren von Grunstein und Hognoss (1975) sondiert werden. Bei diesem Verfahren wird die zu sondierende DNA- kurz gesagt-auf Nitrocellulosefiltern immobilisiert, denaturiert und mit einem Puffer prähybridisiert, der 0-50% Formamid, 0,75m NaCI, 75mmol Na-Citrat, je0,02% (w/v) Rinderserumalbumin, Polyvinylpyrrolidon und Ficoll, 50mmol Na-Phosphat (pH 6,5), 0,1 % SDS und 100Mg/ml Carrier denaturierte DNA enthält. Der prozentuale Formamidgehalt des Puffers sowie die Zeit- und Temperaturbedingungen der Prä-Hybridisierung und der nachfolgenden Hybridisierung hängen von der erforderlichen strengen Kontrolle (stringency) ab. Oligomc ι Sonden, die weniger streng kontrollierte Bedingungen erfordern, werden im allgemeinen bei geringen Formamidgehalten, niedrigeren Temperaturen und längeren Hybridisierungszeiten verwendet. Sonden, die mehr als 30 oder 40 Nucleotide enthalten wie die von cDNA oder genomischen Sequenzen abgeleiteten erfordern im allgemeinen höhere Temperaturen, z. B. etwa 40-42°C und einen hohen Formamidgehalt, z. B. 50%. Nach der Prä-Hybridisierung wird die 5'-32P-markierte Oligonucleotidsondezu dem Puffer gegeben, und die Filter werden in dieser Mischung unter Hybridisierungsbedingungen inkubiert. Nach dem Waschen werden die behandelten Filter der Autoradiographie unterworfen, um die Lage der hybridisierten Sonde zu zeigen; DNA in entsprechenden Lagen auf den ursprünglichen Agrarplatten wird als Quelle der erwünschten DNA benutzt.
Für routinemäßige Vektc Konstruktionen werden die Ligatiohsgemische in den E.coli-Stamm HB101 oder einen anderen geeigneten Wirt transformiert, und erfolgreiche Transformanten werden durch Antibiotikaresistenz oder andere Marker selektioniert. Plasmide aus den Transformanten werden danach nach dem Verfahren von Clewell et al. (1969) hergestellt, worauf gewöhnlich die Chloramphenicol-Amplifikation (Clewell, 1972) folgt. Die DNA wird isoliert und analysiert, gewöhnlich durch Restriktionsenzymanalyse und/oder Sequenzierung. Die Sequenzierung kann nach der Didesoxy-DN VSequenzierungsmethode von Sanger et al. (1977) in der durch Messing n* !. (1981) weitergeführten Beschreibung oder nach der Methode von Maxam et al. (1980) erfolgen. Probleme mit der Bandenku, npression, die manchmal in GC-reichen Regionen beobachtet werden, wurden durch Verwendung von T-Desazoguanosin nach Barr et al. (1986) überwunden.
Die enzymverbundene Immunadsorptionsbestimmung (ELISA) kann zur Messung von Antigen- oder Antikörperkonzentrationen benutzt werden. Diese Methode ist von der Konjugation eines Enzyms an ein Antigen oder einen Antikörper abhängig und nutzt die gebundene Enzymaktivität als quantitative Markierung. Um den Antikörper zu messen, wird das bekannte Antigen an einer festen Phase (z. B. Mikroplatte oder Plastikschale) fixiert, mit Testserumverdünnungen inkubiert, gewaschen, mit Anti-Immunglobulin, das mit einem Enzym markiert ist, inkubiert und erneut gewaschen. Enzyme, die für die Markierung geeignet sind, sind in Fachkreisen bekannt und umfassen z. B. Meerrettichperoxydase. Die an die feste Phase gebundene Enzymaktivität wird durch Zugabe des spezifischen Substrats und kolorimetrische Bestimmung der Produktbildung oder Substratverwertung gemessen. Die gebundene Enzymaktivität ist eine direkte Funktion der gebundenen Antikörpermenge. Um das Antigen zu messen, wird ein bekannter spezifischer Antikörper an der festen Phase fixiert, das antigenhaltige Testmaterial wird zugegeben, nach der Inkubation wird die feste Phase gewaschen, und ein zweiter enzymmarkierter Antikörper wird zugefügt. Nach dem Waschen wird Substrat zugegeben, und die Enzymaktivität wird kolorimetrisch bewertet und auf die Antigenkonzentration bezogen.
Nachstehend beschrieben werden Beispiele für die Erfindung, die nur der Veranschaulichung dienen und den Geltungsbereich der Erfindung nicht einschränken. Im Lichte der vorliegenden Offenbarung wird der Fachmann zahlreiche Ausführungsformen erkennen, die in den Geltungsbereich der Patentansprüche fallen.
Isolierung und Sequenz der überlappenden HCV-cDNA-Klone 131,26], CA59a, CA84a, CA156e, und CA 167b Die Klone 13i, 26j, CA59a, CA156e, und CA167b wurden aus der lambda-gt11-Bank isoliert, die HCV-cDNA (ATCC Nr.40394) enthält, deren Präparation in der EPO-Veröffentlichung Nr.318216 (veröffentlicht am 31. Mai 1989) und WO 89/04669 (veröffentlicht am I.Juni 1989) beschrieben wird. Das Screening der Bank erfolgte mit den nachstehend beschriebenen Sonden unter Anwendung der bei Haynh (1985) beschriebenen Methode. Die Frequenzen, mit denen die positiven Klone mit den jeweiligen Sonden auftraten, lagen bei etwa 1 in 50000. Die Isolierung von Klon 13i erfolgte unter Verwendung einer synthetischen Sonde, die von der Sequenz von Klon 12f abgeleitet war. Die Sequenz der Sonde war:
5' GAA CGT TGC GAT CTG GAA GAC AGG GAC AGG 3'.
Die Isolierung von Klon 26j erfolgte unter Verwendung einer Sonde, die von der 5'-Region von Klon K9-1 abgeleitet war. Die Sequenz der Sonde war:
5' TAT CAG TTA TGC CAA CGG AAG CGG CCC CGA 3'.
Die Isolierungsverfahren für Klon 12f und Klon k9-1 (auch als K9-1 bezeichnet) werden in der EPO-Veröffentlichung Nr.318216 beschrieben, und ihre Sequenzen zeigen Fig. 1 bzw. Fig.2. Die HCV-cDNA-Sequenzen der Klone 13i und 26j zeigen Fig.4 bzw. Fig.5. Ebenfalls dargestellt sind die darin codierten Aminosäuren sowie die Überlappung von Klon 13i mit Klon 12f und die Überlappung von Klon 26j mit Klon 13 i. Die Sequenzen für diese Klone bestätigten die Sequenz von Klon K9-1. Klon K9-1 war aus einer anderen HCV-cDNA-Bank isoliert worden (siehe EPO 218316).
Klon CA 59 a wurde unter Verwendung einer auf der Sequenz der 5'-Region von Klon 26j basierenden Sonde isoliert. Die Sequenz dieser Sonde war:
5' CTG GTT AGC AGG GCT TTT CTA TCA CCA CAA 3'.
Eine von der Sequenz von Klon CA 59 a abgeleitete Sonde wurde verwendet, um Klon CA84 a zu isolieren. Die Sequenz der für diese Isolierung verwendeten Sonde war:
5' AAG GTC CTG GTA GTG CTG CTG CTA TTT GCC 3'.
Klon CAi66e wurde unter Verwendung einer von der Sequenz von Klon CA84a abgeleiteten Sonde isoliert. Die Sequenz der Sonde war:
5' ACT GGA CGA CGC AAG GTT GCA ATT GCT CTA 3'.
Klon CA 167 b wurde unter Verwendung einer von der Sequenz von Klon CA156e abgeleiteten Sonde isoliert. Die Sequenz der Sonde war:
5' TTC GAC GTC ACA TCG ATC TGC TTG TCG GGA 3'.
Die Nucleotidsequonzen der HCV-cDNAs in den Klonen CA59a, CA84a, CA156e und CA 167 b zeigen die Fig.6,7,8 bzw. 9. Die darin codierten Aminosäuren sowie die Überlappung mit den Sequenzen der betreffenden Klone sind ebenfalls in den Figuren dargestellt.
Eine HCV-cDNA-Bank- die „pi"-Bank-wurde aus der gleichen Partie des infektiösen Schimpansenplasmas, die für die Konstruktion der lambda-gt 11-HCV-cDNA-Bank (ATCC Nr.40394) benutzt wurde, die in der EPO-Veröffentlichung Nr.318216 beschrieben wird, und unter Anwendung der im wesentlichen gleichen Techniken konstruiert. Bsi der Konstruktion der pi-Bank wurde jedoch eine Primer-Extensionsmethode angewendet, bei der der Primer für die Umkehrtranskriptase auf der Sequenz von Klon CA59 A beruhte. Die Sequenz des Primers war:
5' GGT GAC GTG GGTTTC 3'.
Das Screenen der oben beschriebenen „pi"-HCV-cDNA-Bank mit der für die Isolierung von Klon CA 167 b (siehe oben) verwendeten Sonde lieferte Klon pi 14 a. Der Klon enthält etwa 800 Basenpaare der cDNA, die die Klone CA 167 b, CA 156e, CA84 a und CA50a überlappt, die aus der lambda-gt 11 -HCV-cDNA-Bank (ATCC Nr. 40394) isoliert wurden. Ferner enthält der Klon pi 14 a etwa 250 Basenpaare der DNA, die stromaufwärts der HCV-cDNA in Klon CA 167 b liegen.
5' GGC TTT ACC ACG TCA CCA ATG ATT GCC CTA 3'
Die obige Sonde wurde benutzt, um zu screenen, was Klon CA216a lieferte, dessen HCV-Sequenzen Fig. 10 zeigt. Ausgehend von der Sequenz von Klon CA216a wurde eine andere Sonde der folgenden Sequenz hergestellt:
5' TTT GGG TAA GGT CAT CGA TAC CCT TAC GTG 31
zeigt.
dem gleichen infektiösen Plasma extrahiert worden war, das in der oben beschriebenen ursprünglichen lambda-gt 11-cDNA-
5' GAA GCC GCA CGT AAG 3'
Die cDNA-Bank wurde unter Anwendung von Verfahren aufgebaut, die den zuvor für die Banken beschriebenen ähnelten, die bei der Isolierung der Klone pi 14a und k9-1 benutzt wurden. Die zum Screenen dieser Bank verwendete Sonde beruhte auf der Sequenz von Klon CA290 a;
5' CCG GCG TAG GTC GCG CAA TTT GGG TAA 3'
Klon ag30a wurde aus der neuen Bank mit der obigen Sonde isoliert und enthielt etwa 670 Basenpaare der HCV-Sequenz, siehe Fig. 12. Ein Teil dieser Sequenz überlappt die HCV-Sequenz der Klone CA216a und CA290 a. Etwa 300 Basenpaare der ag30a-Sequenz liegen jedoch stromaufwärts der Sequenz von Klon CA290a. Die nichtüberlappende Sequenz zeigt Startcodon C) und Stoppcodons, die den Start des HCV-ORF anzeigen können. Ebenfalls in Fig. 12 dargestellt sind mutmaßliche kleine codierte Peptids (Φ Φ), die bei der Regulation der Translation eine Rolle spielen können, sowie die mutmaßliche erste Aminosäure des mutmaßlichen Polypeptide (/) und stromabwärts darin codierte Aminosäuren.
von der HCV-Sequenz in Klon CA290a (Fig. 11) abgeleiteten Sonde isoliert. Die Sequenz der Sonde war:
5' TCA GAT CGT TGG TGG AGT TTA CTT GTT GCC 3'.
Die in Fig. 13 dargestellte Sequenz der HCV-cDNA in CA205a überlappt mit den cDNA-Sequenzen in den Klonen ag30a und CA290 a. Die Überlappung der Sequenz mit der von CA290a ist durch die punktierte Linie über der Sequenz dargestellt (die Figur zeigt auch die mutmaßlichen Aminosäuren, die in diesem Fragment codiert sind).
Wie an den HCV-cDNA-Sequenzen iii den Klonen CA205a und ag 30a beobachtet, scheint das mutmaßliche HCV-Polyprotein am ATG-Startcodon zu beginnen; die HCV-Sequenzen in beiden Klonen enthalten einen „in-frame" aneinanderstoßenden Doppel-Stoppcodon (TGATAG) zweiundvierzig Nucleotide strom aufwärts von diesem ATG. Das HCV-ORF scheint nach diesen Stoppcodons zu beginnen und sich über mindestens 8907 Nucleotide zu erstrecken (siehe die in Fig. 17 dargestellte zusammengesetzte HCV-cDNA).
11 -Bank (ATCC Nr. 40394) - CA 230 a - wurde eine synthetische Sonde der folgenden Sequenz hergestellt:
5' CCA TAG TGG TCT GCG GAA CCG GTG AGT ACA 3'.
Das Screenen der ursprünglichen lambda-gt 11-HCV-cDNA-Bank mit der Sonde lieferte Klon 18g, dessen HCV-cDNA-Sequenz Fig. 14 zeigt. In der Figur ebenfalls dargestellt sind die Überlappung mit Klon ag30a und mutmaßliche Polypeptide, die in der HCV-cDNA codiert sind.
Die cDNA in Klon 18g (C 18g oder 18g) überlappt die in den oben beschriebenen Klonen ag30a und CA205a. Die Sequenz von C 18g enthält auch die in Klon ag30a beobachtete Doppel-Stoppcodonregion. Die Polynucleotidregion stromaufwärts von diesen Stoppcodons stellt wahrscheinlich einen Teil der 5'-Region des HCV-Genoms dar, die kurze ORFs enthalten kann und die durch direktes Sequenzieren des gereinigten HCV-Genoms bestätigt werden kann. Diese mutmaßlichen kleinen codierten Peptide können eine regulatorische Rolle bei der Translation spielen. Die Region des HCV-Genoms stromaufwärts von der durch C 18g verkörperten kann für die Sequenzanalyse unter Anwendung von im wesentlichen der gleichen Technik isoliert werden, die in der EPO 318216 für die Isolierung der cDNA-Sequenzen stromaufwärts der HCV-cDNA-Sequenz in Klon 12f beschrieben wird. Im wesentlichen werden kleine synthetische Oligonucleotid-Primer der Umkehrtranskriptase, die auf der Sequenz von C18g basieron, synthetisiert und verwendet, um die entsprechende Sequenz in der HCV-genomischen RNA zu binden. Die Primersequenzen sind proximal zu dem bekannten 5'-Ende von C18g gelegen, aber hinreichend stromabwärts, um die Konstruktion (design) von Sondensequenzen stromaufwärts von den Primersequenzen zu erlauben. Angewendet werden bekannte Standardmethoden für das Priming und Klonieren.
Di« resultierenden cDNA-Banken werdon mit Sequenzen stromaufwärts der Priming-Orte (gemäß Ableitung von der ermittelten Sequenz von C18g) gescreent. Die HCV-genomische RNA wird entweder aus Plasma- oder Leberproben von Individuen mit NANBH gewonnen. Da das HCV ein den Flaviviren ähnliches Virus zu sein scheint, kann das 5'-Ende des Genoms mit einer „cap"-Struktur modifiziert werden. Bekannt ist, daß Flavivirus-Genome 5'-terminale „cap"-Strukturen enthalten (Yollow Fever virus) (Gelbfiebervirus), Rice et al., 1988; Dengue-Virus, Hahn et al., 1988; Japanese Enzephalitis Virus, 1987).
Klone, die für die 3'-terminale Region des HCV-Genoms repräsentative cDNA enthalten, wurden aus einer cDNA-Bank isoliert, die aus dem ursprünglichen infektiösen Schimpansenplasma-Pool konstruiert wurde, der für den Aufbau der HCV-cDNA-lambdagt11-8ank (ATCC Nr.40394), beschrieben in der EPO-VeröffentlichungNr.318216, benutzt wurde. Um die DNA-Bank aufzubauen, wurde aus dem Plasma extrahierte RNA mit poly rA unter Verwendung von poly(rA)-Polymerase „geteilt", und diecDNA wurde unter Verwandung von Oligo-(dT)12-i8 als Primer fürdie Umkehrtranskriptase synthetisiert. Die resultierende RNA:cDNA-Hybride wurde mit RNAase H digeriert und in doppelsträngige HCV-cDNA umgewandelt. Die resultierende HCV-cDNA wurde in lambdagt 10 Moniert, wobei im wesentlichen die bei Huynh (1985) beschriebene Technik angewendet und die Beta-(oder b-)HCV jDNA-Bank gebildet wurde. Angewendet wurden folgende Verfahren.
Eine aliquote Menge (12ml) Plasma wurde mit Proteinase K behandelt und mit einem gleichen Volumen Phenol, gesättigt mit 0.05M Tris-Cl vom pH 7,5,0,05% (v/v) ß-Mercaptoethanol, 0,1 % (w/v) Hydroxychinolin und 1 mM EDTA, extrahiert. Die resultierende wäßrige Phase wurde mit dem Phenoigemisch erneut extrahiert, gefolgt von 3 Extraktionen mit einem 1:1-Gemisch, das Phenol und Chloroform :lsoamylalkohol (24:1) enthielt, gefolgt von 2 Extraktionen mit einem Gemisch aus
Chloroform und Isoamylalkohol (1:1). Anschließend an die Einstelluno der wäßrigen Phase auf 20OmM in bezug auf NaCI wurden die Nucleinsäuren in der wäßrigen Phase über Nacht bei -200C mit 2,5 Volumina kaltem absolutem Ethanol gefällt. Die Niederschläge wurden durch 40 min Zentrifugieren mit 10OOrpm (min"') gesammelt, mit 70%igem Ethanol mit einem Gehalt von 2OmM NaCI und mit 100%igem kaltem Ethanol gewaschen, 5min in einem Exslkkator getrocknet und in Wasser gelöst. Die isolierten Nucleinsäuren aus dem infektiösen Schimpansenplasma-Pool wurden mit poly rA unter Verwendung von poly-A-Polymerase in Gegenwart von humanem Plazenta-Ribonuclease-Inhibitor (HPRI) (bezogen von Jo; Amersham Corp.) geteilt, wobei MS 2 RNA als Carrier verwendet wurde. Isolierte Nucleinsäuren, die denen in 2 ml Plasma äquivalent waren, wurden in einer Lösung inkubiert, die TMN (50mM Tris-HCI vom pH 7,9,1OmM MgCI2,250mM NaCI, 2,5mM MnCI2,2mM Dithiothreitol (DTT)), 40 mikromolaves a-|32p]-ATP, 20 Einheiten HRPI (Amersham Corp.) und etwa 9 bis 10 Einheiten RNase-freie po!y-A-Polymerase (BRL) enthielt. Die Inkubation dauerte 10min bei 37°C, und die Reaktionen wurden mit EDTA (Endkonzentration etwa 25OmM) gestoppt. Die Lösung wurde mit dem gleichen Volumen Phenol/Chloroform und dem gleichen Volumen Chloroform extrahiert, und die Nucleinsäuren wurden über Nacht bei -200C mit 2,5 Volumina Ethanol in Gegenwart von 20OmM NaCI gefällt.
Die beta-HCV-cDNA-Bar.k wurde durch Hybridisierung unter Verwendung einer synthetischen Sonde gescreent, die eine Sequenz auf der Basis der HCV-cDNA-Sequenz in Klon 15e hatte. Die Isolierung von Klon 15e wird in der EPO-Veröffentlichung Nr.318216 beschrieben, und seine Sequenz zeigt Fig.3. Die Sequenz der synthetischen Sonde war:
5' ATT GCG AGA TCTACG GGG CCT GCT ACT CCA 3'.
Das Screenen der Bank lieferte Klon beta-5a (b5a), dereine HCV-cDNA-Region von annähernd 1000 Basenpaaren enthält. Die 5'-Region dieser cDNA überlappt die Klone 35f, 19g, 26g und 15e (diese Klone werden oben beschrieben). Die Region zwischen der 3'-terminalen poly-A-Sequenz und der 3'-Sequenz, die Klon 15e überlappt, enthält annähernd 200 Basenpaare. Dieser Klon gestattet die Identifizierung einer Region der 3'-terminalen Sequenz des HCV-Genoms.Die Sequenz von b5a ist in der Sequenz der HCV-cDNA in Klon 16jh (nachstehend beschrieben) enthalten. Außerdem liegt die Sequenz auch in CC34a vor, isoliert aus der ursprünglichen lambda-gt11-Bank (ATCC Nr.40394). (Die ursprüngliche lambdagt 11 -Bank wird hier auch als „C-Bank bezeichnet.)
Isolierung und Sequenz der Klone, die durch PCR-Ampllflkatlon der 3'-Reglon des HCV-Genoms erzeugt wurden. Multiple cDNA-Klone wurden erzeugt, die von der 3'-Region des HCV-Genoms abgeleitete Nucleotidsequenzen enthalten. Dies erfolgte durch Amplifikation einer Targetregion des Genoms durch eine Polymerase-Kettenreaktionstechnik, die bei Saiki et al. (1986) und bei Saiki et al. (1988) beschrieben wird, und, wie nachstehend beschrieben, modifiziert wurde. Die HCV-RNA, die simplifiziert wurde, wurde aus dem ursprünglichen infektiösen Schimpansenplasma-Pool gewonnen, der für den Aufbau der in der EPO 318216 beschriebenen HCV-cDNA-lambda-gt 11-Bank (ATCC Nr.40394) verwendet wurde. Die Isolierung der HCV-RNA erfolgte, wie vorstehend beschrieben. Die isolierte RNA wurde am 3'-Ende mit ATP durch E.coll-poly-A-Polymerase entsprechend der Beschreibung bei Sippe! (1973) getailt, mit der Ausnahme, daß die aus dem Schimpansenserum isolierten Nucleinsäuren anstelle des Nucleinsäuresubstrats eingesetzt wurden. Die getaute RNA wurde dann durch Umkehrtranskriptase in cDNA umgekehrt transkribiert, wobei ein Oligo-dt-Primer-Adapter - im wesentlichen wie von Han (1987) beschrieben -verwendet wurde, mit der Ausnahme, daß die Komponenten und die Sequenz des Primer-Adapters folgende waren:
Der Primer JH32 enthielt 20 Nucleotidsequenzen, die zum 5'-Ende der Targetregion in der cDNA hybridisierbar waren, mit einer geschätzten Tn, von 66°C. Der Primer JH11 war von einem Teil des Oligo-dt-Primer-Adapters abgeleitet; somit ist er spezifisch für das 3'-Ende der cDNA mit einer Tm von 640C. Beide Primer wurden so konstruiert, daß sie eine Erkennungsstelle für das Restriktionsenzym Notl am 5'-Ende zwecks Verwendung beim nachfolgenden Klonieren der amplifizierten HCV-cDNA hatten. Die PCR-Reaktion erfolgte durch Suspendieren der cDNA und der Primer in 100μΙ Reaktionsgemisch, das die vier Desoxynucleosid-triphosphate, Puffersalze und Metallionen und eine thermostabile DNA-Polymerase enthielt, die aus Thermus aquaticu: isoliert wurde (Taq-Polymerase), die sich in einem Perkin Eimer Cetus PCR Kit (N 801-0043 oder N 801-0055) befinden. Die PCR-Reaktion wurde über 35 Zyklen in einem Perkin Eimer Cetus DNA Thermal Cycler durchgeführt. Jeder Zyklus bestand aus einer Denaturierungsstufe von 1,5min bei 940C, einer Hybridisierungsstufe von 2min bei 600C und einer Primer-Extensionsstufe von 3 min bei 720C. Die PCR-Produkte wurden der Southern-Blot-Analyse unterworfen, wobei eine 30-Nucleotid-Sonde, JH34, verwendet wurde, deren Sequenz auf der 3'-terminalen Region von Klon 15e basierte. Die Sequenz von JH34 ist folgende:
5' CTT GAT CTA CCT CCA ATC ATT CAA AGA CTC 3'.
Die PCR-Produkte, die durch die HCV-cDNA-Sonde nachgewiesen wurden, lagen in einem Größenbereich von etwa 50 bis etwa 400 Basenpaaren.
Um die amplifizierte HCV-cDNA zu klonieren, wurden die PCR-Produkte mit Notl gespalten und durch Polyacrylamidgalelektrophorese nach derGröße selektioniert. DNA von über 300 Basenpaare wurden in die Notl-Stelle von
pUC 18S Moniert. Der Vektor pUC18S wird durch Einschluß eines Not I-Polylinkers konstruiert, der zwischen die EcoRI- und die Sall-Stelle von pUC 18 Moniert wurde. Die Klone wurden unter Verwendung der JH 34-Sonde auf HCV-cDNA gescreent. Gewonnen und sequenziert wurde eine Reihe von positiven Klonen. Die Nucleotidsequenzen des HCV-cDNA-lnserts in einem dieser Klone, 16jh, und die darin codierten Aminosäuren zeigt Fig. 15. Eine Nudeotid-Heterogenität, die in der Sequenz der HCV-cDNA in Klon 16jh im Vergleich zu einem anderen Klon dieser Region nachgewiesen wurde, ist in der Figur dargestellt.
Kompilierte HCV-cDNA-Sequenzen
Eine HCV-cDNA-Sequenz wurde aus einer Serie von überlappenden Klonen kompiliert (zusammengestellt), die aus den verschiedenen oben beschriebenen HCV-cDNA-Banken abgeleitet wurden. In dieser Sequenz liegt die aus den Klonen b 114a, 18g, ag30a, CA205a, CA290a, CA216a, pi 14a, CA 167b, C.M56e, CA84a und CA59a gewonnene kompilierte HCV-cDNA-Sequenz stromaufwärts von der kompilierten HCV-cDNA-Sequenz, die in der EPO 318216 veröffentlicht ist und in Fig. 16 gezeigt wird. Die kompilierte HCV-cDNA-Sequenz, die aus den Klonen b5a und 16jh erhalten wurde, liegt stromabwärts von der kompilierten HCV-cDNA-Sequenz, die in der EPO 318216 veröffentlicht ist.
Fig. 17 zeigt die kompilierte HCV-cDNA-Sequenz, die von den oben beschriebenen Klonen abgeleitet ist und die in der EPO 318216 veröffentlichte kompilierte HCV-cDNA-Sequenz.
Die Klone, von denen die Sequenz abgeleitet wurde, sind b 114 a, 18g, ag 30a, CA205a, CA290 a, CA216a, pi 14 a, CA 167 b, CA156e, CA84a, CA59a, K9-1 (auch k9-1 bezeichnet), 26j, 13i, 12f, 14i, 11 b, 7f, 7e, 8h, 33 c, 40b, 37b, 35,36,81,32,33b, 25c, 14c, 8f, 33f, 33g, 39c, 35f, 19g, 26g, 15e, b5a und 16jh. In der Figur geben die drei Striche über der Sequenz die Position des mutmaßlichen Methionin-Initiationscodons an.
Klon b 114a wurde unter Anwendung des vorstehend für Klon b5a beschriebenen Klonierungsverfahrens gewonnen, mit der Ausnahme, daß die Sonde eine synthetische Sonde war, die zum Nachweis von Klon 18g, siehe oben, benutzt wurde. Klon b 114a überlappt mit den Klonen 18g, ug30a und CA205a, mit der Ausnahme, daß Klon b 114a zwei zusätzliche Nucleotide stromaufwärts von der Sequenz in Klon 18g (d.h. 5'-CA) enthält. Diese beiden zusätzlichen Nucleotide wurden in die HCV-genomische Sequenz aufgenommen, die Fig. 17 zeigt.
Obwohl einige der vorstehend beschriebenen Klone aus anderen als der ursprünglichen HCV-cDNA-lambda-gt 11-C-Bank (ATCC Nr.40394) gewonnen wurde, ist zu bemerken, daß diese Klone HCV-cDNA-Sequenzen enthalten, die die HCV-cDNA-Sequenzen in der ursprünglichen Bank überlappen. Somit läßt sich im wesentlichen die gesamte HCV-Sequenz aus der ursprünglichen lambda-gt 11-C-Bank (ATCC Nr.40394) ableiten, die benutzt wurde, um den ersten HCV-cDNA-Klon (5-1-1) zu isolieren. Die Isolierung von Klon 5-1-1 wird in der EPO Veröffentlichung Nr.318216 beschrieben.
Reinigung des Fuslonspolypeptlds C100-3 (Alternativmethode)
Das Fusionspolypeptid C100-3 (auch als HCV c 100-3 und wahlfrei, als c 100-3 bezeichnet) besteht aus Superoxiddismutase (SOD) am N-Ende und einem „in-frame" C100-HCV-Polypeptid am C-Ende. Ein Verfahren zur Herstellung des Polypeptids durch Expression in Hefe und differentielle Extraktion der unlöslichen Fraktion der extrahierten Hefewirtszellen wird in der EPO 3'.8 J!16 beschrieben. Nachstehend wird eine Alternativmethode zur Herstellung dieses Fusionspolypeptids beschrieben. Bei dieser Methode wird das Antigen aus dem rohen Zell-Lysat mit Aceton gefällt; das mit Aceton gefällte Antigen wird danach der lonenaustauschchromatographie unterworfen und durch Gelfiltration weitergereinigt.
Das Fusionspolypeptid C100-3 (HCV dOO-3) wird im Hefestamm JSC308 (ATCC Nr. 20879) exprimiert, der mit pAB24C 100-3 (ATCC Nr. 67976) transformiert wurde; die transformierte Hefe wird unter Bedingungen vermehrt, die die Expression zulassen (d.h. Vermehrung in YEP mit 1 % Glucosegehalt). (Siehe EPO 318216). Ein Zell-Lysat wird durch Suspendieren der Zellen in Puffer A (2OmM Tris-HCI vom pH 8,0,1 mM EDTA, 1 mM PMSF) hergestellt. Die Zellen werden durch Mahlen mit Glasperlen in einem Dynomill-Homogenisator oder einer gleichwertigen Vorrichtung zertrümmert. Der Grad der Zellzertrümmerung wird durch Auszählen der Zellen unter einem Mikroskop mit Phasenoptik überwacht. Die zertrümmerten Zellen erscheinen dunkel, während die lebenden Zellen von heller Farbe sind. Die Zahl der zertrümmerten Zellen in Prozent wird bestimmt. Wenn der Anteil der zertrümmerten Zellen annähernd 90% oder mehr beträgt, werden die Zelltrümmer von den Glasperlen durch Zentrifugieren getrennt, und die Glasperlen werden mit Puffer A gewaschen. Nach dem Vereinigen von Waschflüssigkeiten und Homogenat wird das unlösliche Material im Lysat durch Zentrifugieren gewonnen. Das Material im Pellet wird zur Entfernung der löslichen Proteine durch Suspendieren in Puffer B (5OmM Glycin, pH 12,0 1 mM DTT, 50OmM NaCI) und anschließend in Puffer C (5OmM Glycin, pH 10,0 1 mM DTT) gewaschen. Das unlösliche Material wird durch Zentrifugieren zurückgewonnen und durch Suspendieren in Puffer C, der SDS enthält, löslich gemacht. Die Extraktlösung kann in Gegenwart von ß-Mercaptoethanol erwärmt und durch Ultrafiltration eingeengt werden. Das HCV c 100-3 im Extrakt wird mit kaltem Aceton gefällt. Falls erwünscht, kann der Niederschlag bei Temperaturen von etwa -150C oder darunter aufbewahrt werden.
Vor der lonenaustauschchromatographie wird das mit Aceton gefällte Material durch Zentrifugieren zurückgewonnen, und es kann unter Stickstoff getrocknet werden. Der Niederschlag wird in Puffer D (5OmM Glycin, pH 10,0,1 mM DTT, 7 M Harnstoff) suspendiert und zentrifugiert, um das unlösliche Material zu pelletieren. Das überstehende Material wird in eine Anionenaustauschsäule überführt, die zuvor mit Puffer D äquilibriert wurde. Die Fraktionen werden gesammelt und durch Ultraviolettabsorption oder Gelelektrophorese an SDS-Polyacrylamidgelen analysiert. Die Fraktionen, die das HCV-c 100-3-Polypeptid enthalten, werden „gepoolt".
Um das HCV-c 100-3-PoIypeptid durch Gelfiltration zu reinigen, werden die „gepoolten" Fraktionen aus der lonenaustauschsäule in Gegenwart von ß-Mercaptoethanol und SDS erwärmt, und das Eluat wird durch Ultrafiltration konzentriert. Das Konzentrat wird in eine Gelfiltrationssäule überführt, die zuvor mit Puffer E (2OmM Tris-HCI, pH 7,0,1 mM DTT, 0,1 % SDS) äquilibriert wurde. Die Präsenz von HCV c100-3 in den eluierten Fraktionen sowie die Gegenwart von Verunreinigungen werden durch Gelelektrophorese an Polyacrylamidgelen in Gegenwart von SDS und Sichtbarmachung der Polypeptide bestimmt. Die Fraktionen, die gereinigtes HCV c100-3 enthalten, werden „gepoolt". HCV-c 100-3-reiche Fraktionen können durch wiederholte Gelfiltration weiter gereinigt werden. Wenn die Entfernung von Partikelmaterial erwünscht ist, kann das HCV-c 100-3-haltige Material durch ein O,22-M-Filter filtriert werden.
Expression und Antigenität der In HCV-cDNA codierten Polypeptide In E. coil exprlmlerte Polypeptide
Die Polypeptide, die in einer Reihe von HCV-cDNAs, die das HCV-genomische ORF überspannen, wurden in E.coli exprimiert und auf ihre Antigenität unter Verwendung von Serum getestet, das von einer Vielzahl von Individuen mit NANBH gewonnen wurde. Die Expressionsvektoren, die die Monierten HCV-cDNAs enthalten, wurden aus pSODcf 1 (Steimer et al., 1986) konstruiert. Um sicher zu sein, daß ein richtiges Leseraster erzielt wird, wurden drei gesonderte Expressionsvektoren - pcf 1 AB, pcf 1 CD und pcf 1EF- durch Ligation eines der drei Linker AB, CD und EF an ein BamHI-EcoRI-Fragment, abgeleitet durch Digerieren bis zur Vervollständigung des Vektors psODcf 1 mit EcoRI und BamHI, worauf Behandlung mit alkalischer Phosphatase folgte, geschaffen. Die Linker wurden aus den sechs Oligomeren A, B, C, D, E und F erzeugt. Jedes Oligomer wurde durch Behandlung mit Kinase in Gegenwart von ATP vor der Hybridisierung an sein komplementäres Oligomer phosphoryliert. Die Sequenzen der synthetischen Linker waren folgende:
Name DNA-Sequenz (5'-» 3')
A GATC CTG AAT TCC TGA TAA
B GAC TTA AGG ACT ATT TTA A
C GATC CGA ATT CTG TGA TAA
D GCT TAA GAC ACT ATT TTA A
E GATC CTG GAA TTC TGA TAA
F GAC CTT AAG ACT ATT TTA A
Jeder der drei Linker zerstört die ursprüngliche EcoRI-Stelle und erzeugt eine neue EcoRI-Stelle innerhalb des Linkers, aber in einem anderen Leseraster. Daher befanden sich die HCV-cDNA-EcoRI-Fragmente, die aus den Klonen isoliert wurden, in drei verschiedenen Leserastern, wenn sie in den Expressionsvektor inseriert wurden.
Die HCV-cDNA-Fragmente in den bestimmten lambda-gt 11-Klonen wurden durch Digestion mit EcoRI ausgeschnitten; jedes Fragment wurde in pcf 1 AB, pcf 1 CD und pcf 1EF inseriert. Diese Expressionskonstrukte wurden danach in D1210-E.coli-Zellen transformiert, die Transformanten wurden Moniert, und die rekombinanten Bakterien aus jedem Klon wurden veranlaßt, die Fusionspoly peptide durch Vermehrung der Bakterien in Gegenwart von IPTG zu exprimieren.
Die Expressionsprodukte der angegebenen HCV-cDNAs wurden durch direktes immunologisches Screenen der Kolonien auf Antigenität getestet, wobei eine Modifikation des von Helfman et al. (1983) beschriebenen Verfahrens angewendet wurde. Wie Fig. 18 zeigt, wurden die Bakterien auf Nitrocellulosefiltern, die auf Ampicillin-Platten gelegt waren, plattiert, so daß etwa 1000 Kolonien je Filter entstanden. Die Kolonien wurden auf Nitrocellulosefilter replika-plattiert, und die „replice" wurden über Nacht in Gegenwart von 2mM IPTG und Ampicillin erneut vermehrt (regrown). Die Bakterienkolonien wurden lysiert, indem die Nitrocellulosefilter etwa 15 bis 20min in einer mit CHCI3-Dampf gesättigten Atmosphäre aufgehängt wurden. Jedes Filter wurde danach in einer gesonderten 100-mm-Petrischale untergebrächt, die 10ml 5OmM Tris-HCI vom pH 7,515OmM NaCI, 5mM MgCI2,3% (w/w) BSA, 40pg/ml Lysozym und 0,1 \igim\ DNase enthielt. Die Platten wurden mindestens 8 h bei Raumtemperatur schwach bewegt. Die Filter wurden in TBST (5OmM Tris-HCI vom pH 8,0,15OmM NaCI, 0,005% Tween 20) gespült. Nach dem Inkubieren wurden die Zellreste abgespült und in TBS (TBST ohne Tweed), das 10% Schafserum enthielt, inkubiert; inkubiert wurde 1 Stunde. Die Filter wurden danach in TBS mit vorbehandelten Seren von Individuen mit NANBH inkubiert; dazu gehörten: 3 Schimpansen, 8 Patienten mit chronischer NANBH, deren Seren in bezug auf Antikörper gegen HCV-C100-3-Polypeptid (beschrieben in der EPO 318216 und oben) (auch als C100 bezeichnet) positiv waren, 8 Patienten mit chronischer NANBH, deren Seren in bezug auf Anti-C 100-Antikörper negativ waren, ein Rekonvaleszent, dessen Serum in bezug auf Anti-C 100-Antikörper negativ war, und 6 Patienten mit sporadisch auftretender (community acquired) NANBH, darunter einer, dessen Seren in bezug auf Anti-C 100-Antikörper stark positiv waren, und einer, dessen Seren in bezug auf Anti-C 100-Antikörper gerade noch positiv waren. Die in THS verdünnten Seren wurden durch Vorabsorption mit hSOD vorbehandelt. Die Filter mit den Seren wurden mindestens 2h inkubiert. Nach dem Inkubieren wurden die Filter zweimal 30min mit TBST gewaschen. Die Markierung der exprimierten Proteine, an die die Antikörper in den Seren gebunden waren, erfolgte durch 2 h Inkubation mit 1251-markiertem Schaf-Antihuman-Antikörper. Nach dem Waschen wurden die Filter zweimal 30min mit TBST gewaschen, getrocknet und autoradiographiert.
Von einer Reihe von Klonen (siehe unten) wurden Polypeptide exprimiert, die HCV-Epitope enthielten, die immunologisch mit Serum von Individuen mit NANBH reaktionsfähig wann. Fünf dieser Polypeptide waren sehr immunogen, sofern als Antikörper zu den HCV-Epitopen in diesen Polypeptiden in vielen verschiedenen Patientenseren nachgewiesen wurden. Die Klone, die diese Polypeptide codieren, und die Lage des Polypeptids in dem mutmaßlichen HCV-Polyprotein (in dem die Aminosäurenummern mit dem mutmaßlichen Initiationscodon beginnen) sind folgende: Klon 5-1-1, Aminosäuren 1694-1735; Klon C100, Aminosäuren 1569-1931; Klon 33c, Aminosäuren 1192-1457; KlonCA279a, Aminosäuren 1-84; und Klon CA290a, Aminosäuren 9-177. Die Lage der immunogenen Polypeptide in dem mutmaßlichen HCV-Polyprotein wird unmittelbar anschließend wiedergegeben.
-29- 297 446 Klone, die Polypeptide von erwiesener Reaktionsfähigkeit mit Seren von NANBH-Patlenten codieren
(Aminosäurenummer beginnend mit dem mutmaßlichen Initiator-Methionin)
| CA 279 a | 1-84 |
| CA74a | 437-582 |
| 13i | 511-690 |
| CA290a | 9-177 |
| 33c | 1192-1457 |
| 40 b | 1266-1428 |
| 5-1-1 | 1694-1735 |
| 81 | 1689-1805 |
| 33 b | 1916-2021 |
| 25c | 1949-2124 |
| 14c | 2054-2223 |
| 8f | 2200-3325 |
| 33 f | 2287-2385 |
| 33g | 2348-2464 |
| 39c | 2371-2502 |
| 15e | 2796-2886 |
| C100 | 1 569-1931 |
Die Ergebnisse hinsichtlich der Immun genität der in den verschiedenen untersuchten Klonen ccodierten Polypeptide weisen auf einen wirksamen Nachweis hin, und die Immunisierungssysteme können „Panels" der HCV-Polypeptide/Epitope enthalten.
Drei verschiedene Hefe-Expressionsvektoren, die die Insertion von HCV-cDNA in drei verschiedene Leseraster gestatten, wurden konstruiert. Die Konstruktion eines der Vektoren - pAB 24C100-3-wird in der EPO-Veröffentlichung Nr.318216 beschrieben. In den nachstehenden Untersuchungen wurde die HCV-cDNA aus den oben verzeichneten Kloben in der Antigenitäts-Kartierungsuntersuchung unter Verwendung in der E.coli exprimierten Produkte mit der CIOO-HCV-cDNA ausgetauscht. Die Konstruktion der anderen Vektoren ersetzt den Adapter, der in den obigen E.coli-Untersuchungen beschrieben wird, durch einen der folgenden Adapter:
Adapter 1
AC TTA AGG ATT ACT CAG CT Adapter 2
Die inserierte HCV-cDNA wird in Hefe, die mit den Vektoren transformiert ist, unter denn vorstehend für die Expression des Fusionspolypeptide C100-3 beschriebenen Expressionsbedingungen exprimiert. Die resultierenden Polypeptide werden unter Verwendung der Seren von Individuen mit NANBH gescreent, die oben für das Screenen von immunogenen Polypeptiden, die in E.coli exprimierten HCV-cDNAs codiert sind, beschrieben wurden.
Vergleich des Hydrophobieprofils von HCV-Polyprotelnen mit West-Nile-Virus-Polyprotein und mit Dengue-Virus NS1 Das Hydrophieprofil eines HCV-Polyproteinsegments wurde mit dem eines typischen Flavivirus, des West-Nile-Virus, verglichen. Die Polypeptidsequenz des West-Nile-Virus-Polyproteins wurde von den bekannten Polynucleotidsequenzen abgeleitet, die die Nichtstrukturproteine dieses Virus codieren. Die HCV-Polyproteinsequenz wurde von der Sequenz überlappender cDNA-Klone abgeleitet. Die Profile wurden unter Anwendung eines Antigenprogramms bestimmt, das ein Fenster mit einer Breite von 7 Aminosäuren (die betreffende Aminosäure und 3 Reste auf jeder Seite) nutzt, um die durchschnittliche Hydrophobie um einen gegebenen Aminosäurerest festzustellen. Die Parameter, die die reaktive Hydrophobie für jeden Aminosäurerest angeben, stammen von Kyte und Doolittle (1982). Fig. 19 zeigt die Hydrophobieprofile der beiden Polyproteine; die Flächen, die den Nichtstrukturproteinen des West-Nile-Virus ns 1 bis ns5 entsprechen, sind in der Figur angegeben. Wie aus der Figur ersichtlich ist, besteht eine verbreitete Ähnlichkeit zwischen den Profilen des HCV-Polyproteins und des West-Nile-Virus-Polyproteins. Die Sequenz der Aminosäuren, die in der in Fig. 16 dargestellten 5'-Region der HCV-cDNA codiert sind, wurde mit der entsprechenden Region eines der vorstehend beschriebenen Stämme des Dengue-Virus in bezug auf das Profil von Regionen von Hydrophobie und Hydrophilie verglichen (keine Daten angegeben). Dieser Vergleich zeigt, daß die Polypeptide des HCV und des Dengue-Virus, die in dieser Region codiert sind, die der NS1 (oder einen Teil davon) codierenden Region entspricht, ein ähnliches Hydrophobie-/Hydrophilieprofil haben.
Die Ähnlichkeit der Hydrophobieprofile im Verein mit den früher in der EP 0218316 identifizierten Homologien in den Aminosäuresequenzen des HCV und des Dengue-Flavivirus deuten daraufhin, daß das HCV mit diesen Vertretern der Familie auf Flaviviren verwandt ist.
Die Sequenz des codiorenden Strangs der HCV-cDNA, die Fig. 17 zeigt, wurde von den überlappenden HCV-cDNAs in den verschiedenen Klonen abgeleitet, die in der EPO 318216 und oben beschrieben werden. Es kann aus der Sequenz gefolgt werden, daß das HCV-Genom im wesentlichen ein langes kontinuierliches ORF enthält, das ein Polyprotein codiert. In der Sequenz entspricht die Nucleotidnummer 1 dem ersten Nucleotid des MET-Initiationscodons; die Nummern mit Minuszeichen geben an, daß die Nucleotide um diese Distanz in 5'-Richtung (stromaufwärts) entfernt sind, während Nummern mit Pluszeichen anzeigen, daß die Nucleotide um diese Distanz in 3'-Richtung (stromabwärts) angeordnet sind. Die zusammengesetzte Sequenz zeigt den codierenden Strang der HCV-cDNA. Die Aminosäuresequenz uuo mutmaßlichen HCV-Polyproteins, die von der Sequenz des codierenden Strangs der HC-cDNA abgeleitet ist, ist ebenfalls in Fig. 17 dargestellt, in der Position 1 mit dem mutmaßlichen Initiator-Methionin beginnt.
Mögliche Proteindomänen des codierten HCV-Polyproteins sowie die annähernden Begrenzungen sind folgende (die in Anführungszeichen gesetzten Polypeptide sind jene, die in Flavivirus-Domäne codiert sind):
(Aminosäurenummern)
| „C" (Nucleocapsid-Protein) | i-120 |
| „E"(Virion-Hüllprotein[e] | |
| und | |
| mögliche Matrix-Proteine [M-ProteineJ) | 120-400 |
| „NS1"{Komplementfixationsantigen?) | 400-660 |
| „NS2" (unbekannte Funktion) | 660-1050 |
| „NS3" (Protease?) | 1050-1640 |
| „NS4" (unbekannte Funktion) | 1640-2000 |
| „NS5"(Polvmerase) | 2000-?Ende |
Zu bemerken ist jedoch, daß die Hydrophobieprofile (nachstehend beschrieben) zeigen, daß das HCV vom Flavivirus-Modell abweicht, insbesondere in bezug auf die Region stromaufwärts von NS 2. Außerdem sollen die angegebenen Begrenzungen keine unveränderlichen Grenzfestlegungen zwischen den mutmaßlichen Polypeptiden bedeuten.
Die Hydrophile-/Hydrophobieprofile und der Antigenindex des mutmaßlichen Polyproteins, das in der in Fig. 16 dargestellten HCV-cDNA-Sequenz codiert ist, wurden durch Computer-Analyse bestimmt. Das Programm für Hydrophilie/Hydrophobie entsprach der obigen Beschreibung. Der Antigenindex ergibt sich aus einem Computerprogramm, das auf folgenden Kriterien beruht: 1) Oberflächenwahrscheinlichkeit, 2) Vorhersage der a-Helizität nach zwei verschiedenen Verfahren, 3) Vorhersage der ß-Faltblattregionen nach zwei verschiedenen Verfahren, 4) Vorhersage der U-Schleifen nach zwei verschiedenen Verfahren, 5) Hydrophilie/Hydrophobie und Flexibilität. Die Spuren der Profile, die durch die Computer-Analyse erzeugt wurden, zeigt Fig. 20. Beim Hydrophilieprofil bedeutet die Auslenkung über der Abszisse Hydrophilie und unter der Abszisse Hydrophobie. Die Wahrscheinlichkeit, daß eine Polypeptidregion antigen ist, wird gewöhnlich als zunehmend betrachtet, wenn eine Auslenkung über der Abszisse in das Hydrophilieprofil und/oder antigene Profil erfolgt. Zu bemerken ist jedoch, daß diese Profile nicht unbedingt Indikatoren für die Stärke der Immunogenität eines Polypeptids sind.
den bekannten Aminosäuresequenzen verschiedener Vertreter der Flaviviren verglichen. Der Vergleich zeigt, daß die Homologieunbedeutend ist, aber wegen der Regionen, in denen sie festgestellt wurde, ist sie wahrscheinlich signifikant. Fig. 21 zeigt diekonservierten co-linearen Regionen. Die Aminosäurenummern unter den Sequenzen stellen die Nummer in der mutmaßlichen
diesen flaviviralen Agenzien eine gewisse Ähnlichkeit besteht.
| Iambda-gt11 | ATCC-Nr. | Hinterlegungstag |
| HCV-cDNA-Bank | 40394 | 1. Dez. 1987 |
| Klon 81 | 40388 | 17. Nov. 1987 |
| Klon 91 | 40389 | 17. Nov. 1987 |
| Klon 1-2 | 40390 | 17. Nov. 1987 |
| Klon 5-1-1 | 40391 | 18. Nov. 1987 |
| Klon12f | 40514 | 10. Nov. 1988 |
| Klon35f | 40511 | 10.Nov.1988 |
| Klon15e | 40513 | 10. Nov. 1988 |
| KlonK9-1 | 40512 | 10. Nov. 1988 |
| JSC303 | 20879 | 5. Mai 1988 |
| pS356 | 67683 | 29. April 1988 |
-31- 297 446 Ferner wurden am 11. Mai 1989 hinterlegt:
Stamm Linker ATCC-Nr.
| D1210 (Cf 1/5-1-1) | EF | I | ATCC-Nr. | 67967 |
| D1210 (Cn/81) | EF | Die folgenden Abkömmlinge von Stamm D1210 wurden am 3.Mai | 67956 | 67968 |
| D1210 (Cf1/CA74a) | EF | Stamm-Abkömmling | 67952 | 67969 |
| D1210 (Cf1/35f) | AB | pCF1CS/C8f | 67949 | 67970 |
| D1210 (Cf1/279a) | EF | pCF1AB/C12f | 67954 | 67971 |
| . D1210 (Cf1/C36) | CD | pCF1EF/14c | 67958 | 67972 |
| D1210 (Cf1/13i) | AB | pCF1EF/15e | 67953 | 67973 |
| D1210 (Cf1/C33b) | EF | pCF1AB/C25c | 67050 | 67974 |
| D1210 (CF 1/CA 29Oa) | AB | pCF1EF/C33c | 67951 | 87975 |
| HB101 (AB24/C100#3R) | pCF1EF/C33f | 67955 | 67976 | |
| pCF1 CD/33 g | 67957 | 1989 hinterlegt. | ||
| pCF1CD/C39c | 67959 | |||
| pCF1EF/C40b | ||||
| pCF1EF/CA167b | ||||
Die folgenden Stämme wurden am 12. Mai 1989 hinterlegt: Stamm ATCC-Nr.
| Lambda gt 11 (C35) | 40603 |
| Lambda gt 10 (beta-5 a) | 40602 |
| D1210(C40b) | 67980 |
| D1210IM16) | 67981 |
Nach Gewährung und Ausgabe dieser Anmeldung als Patent der Vereinigten Staaten werden alle Beschränkungen hinsichtlich der Verfügbarkeit dieser hinterlegten Materialien unwiderruflich aufgehoben, und der Zugang zu den bezeichneten hinterlegten Materialien wird während des Abhängigseins der obengenannten Anmeldung demjenigen gestattet, der durch den Bevollmächtigten als dazu gemäß 37 CFR1.14 und 35 USC1.22 Berechtigten bestimmt wird. Außerdem werden die bezeichneten hinterlegten Materialien für einen Zeitraum von dreißig (30) Jahren, gerechnet vom Hinterlegungsdatum an, oder für fünf (5) Jahre nach der letzten Nachfrage nach dem deponierten Material oder für die vollstreckbare Laufzeit des US-Patents erhalten, welcher (Zeitraum) auch immer der längere ist. Die hier genannten hinterlegten Materialien sind als Erleichterung gedacht und nicht erforderlich, um die Erfindung im Hinblick auf die hier gegebenen Beschreibungen in die Praxis umzusetzen, und ferner werden diese Materialien hier durch Bezugnahme einbezogen.
Technische Anwendbarkeit
Die Erfindung mit ihren hier offenbarten verschiedenen Enthüllungen hat viele technische Anwendungen, u.a. die folgenden. Die HCV-cDNAs können verwendet werden, um Sonden für den Nachweis der HCV-Nucleinsäuren in Proben zu konstruieren. Die von den cDNAs abgeleiteten Sonden können verwendet werden, um HCV-Nucleinsäuren z. B. bei chemischen Synthesen nachzuweisen. Sie können auch verwendet werden bei Screening-Programmen auf antivirale Agenzien, um die Wirkung der Agenzien bei der Inhibierung der Virusreplikation in Zellkultursystemen und animalen Modellsystemen zu bestimmen. Die HCV-Polynucleotidsonden sind ferner beim Nachweis von viralen Nucleinsäuren beim Menschen von Nutzen und können somit als Grundlage für die Diagnose von HCV-lnfektionen beim Menschen dienen. Außerdem liefern die hier verfügbar gemachten cDNAs Informationen und ein Mittel für die Synthese von Polypeptiden, die Epitope des HCV enthalten. Diese Polypeptide sind beim Nachweis von Antikörpern gegen HCV-Antigene brauchbar. Eine Reihe von Immunoassays auf HCV-lnfektion, die auf HCV-Epitope enthaltenden rekombinanten Polypeptiden beruht, wird beschrieben und findet wirtschaftliche Anwendung bei der Diagnose von HCV-induzierter NANBH, beim Screenen von Blutspendern auf durch HCV verursachte infektiöse Hepatitis sowie zum Nachweis von verunreinigtem Blut von infektiösen Blutspendern. Die Virusantigene sind auch bei der Überwachung der Wirksamkeit von antiviralen Agenzien in animalen Modellsystemen von Nutzen. Ferner sind die von den hier offenbarten HCV-cDNAs abgeleiteten Polypeptide als Vakzine zur Behandlung von HCV-Infektio.en verwendbar.
Die von den HCV-cDNAs abgeleiteten Polypeptide sind, abgesehen von den oben genannten Anwendungen, auch die für Bildung von Anti-HCV-Antikörpern von Nutzen. So können sie in Anti-HCV-Vakzinen verwendet werden. Die im Ergebnis einer Immunisierung mit den HCV-Polypeptiden produzierten Antikörper sind jedoch auch beim Nachweis der Präsenz von Virusantigenen in Proben brauchbar. So können sie verwendet werden, um die Produktion von HCV-Polypeptiden in chemischen Systemen zu testen. Die Anti-HCV-Antikörper können auch verwendet werden, um die Wirksamkeit der antiviralen Agenzien bei
Screening-Programmen zu überwachen, bei denen diese Agenzien in Gewebekultursystemen getestet werden. Sie können ferner zur passiven Immunotherapie und zur Diagnose von durch HCV verursachter NANBH verwendet werden, indem sie den Nachweis des/der viralen Antigens/Antigene bei Blutspender und -empfängern gestatten. Eine andere wichtige Anwendung für die Anti-HCV-Antikörper liegt in der Affinitätschromatographie für die Reinigung des Virus und der viralen Polypeptide. Die Präparate des gereinigten Virus und viralen Polypeptids können in Vakzinen verwendet werden. Das gereinigte Virus kann jedoch auch von Nutzen sein für die Entwicklung von Zellkultursystemen, in denen das HCV repliziert. „Anti-sense"-Polynucleotide können als Inhibitoren der Virusreplikation verwendet werden.
Sowohl die natürlichen als auch die rekombinanten Anti-HCV-Antikörper und HCV-Polypeptide können zweckmäßig in Kits verpackt werden.
Claims (34)
1. Rekombinantes Polynucleotid, das eine von HCV-cDNA abgeleitete Sequenz enthält, dadurch gekennzeichnet, daß die HCV-cDNA in Klon 13i oder Klon 26j oder Klon 59a oder Klon 84a oder Klon CA156e oder Klon 167 b oder Klon pi 14a oder Klon CA216a oder Klon CA290a oder Klon ag30a oder Klon 205a oder Klon 18g oder Klon 16jh vorhanden ist oder daß die HCV-cDNA von einer durdi die Nucleotidnummern -319 bis 1348 oder 8659 bis 8866 in Fig. 17 angegebenen Sequenz ist.
2. Rekombinantes Polynucleotid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Epitop des HCV codiert.
3. Rekombinanter Vektor, dadurch gekennzeichnet, daß er das Polynucleotid nach Anspruch 1 oder An ;pruch 2 umfaßt.
4. Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit dem Vektor nach Anspruch 3 transformiert ist.
5. Rekombinantes Expressionssystem, das ein offenes Leseraster (ORF) der von dem rekombinanten Polynucleotid nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 abgeleiteten DNA enthält, dadurch gekennzeichnet, daß das ORF an eine Kontrollsequenz, die mit dem erwünschten Wirt verträglich ist, operabel gebunden ist.
6. Zelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit dem rekombinanten Expressionssystem nach Anspruch 5 transformiert ist.
7. Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, daß es durch die Zelle nach Anspruch 6 produziert ist.
8. Gereinigtes Polypeptid, das ein in HCV-cDNA codiertes Epitop enthält, dadurch gekennzeichnet, daß die HCV-cDNA von einer durch die Nucleotidnummern -319 bis 1348 oder 8659 bis 8866 in Fig. 17 angegebenen Sequenz ist.
9. Immunogenes Polypeptid, das durch eine mit einem rekombinanten Expressionsvektor transformierte Zelle produziert ist, der ein ORF einer von HCV-cDNA abgeleiteten DNA enthält, dadurch gekennzeichnet, daß die HCV-cDNA aus einer von der HCV-cDNA-Sequenz in Klon CA279a oder Klon CA74a oder Klon 13 i oder Klon CA290a oder Klon 33c oder Klon 40 b oder Klon 33 b oder Klon 25c oder Klon 14c oder Klon 8f oder Klon S3f oder Klon 33g oder Klon 39c oder Klon 15e abgeleiteten Sequenz besteht und daß das ORF operabel an eine Kontrollsequenz gebunden ist, die mit dem erwünschten Wirt verträglich ist.
10. Peptid, das ein HCV-Epitop enthält, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid die Formel
/Λ/Λ y"™ΛΛΛΛ y
hat, in der χ und y in Fig. 17 angegebene Aminosäurenummern bedeuten, und daß das Peptid aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus:
AA1-AA25, AA1-AA50, AA1-AA84, AA9-AA177, AA1-AA10, AA5-AA20, AA20-AA25, AA35-AA45, AA50-AA100, AA40-AA90, AA 45-AA 65, AA65-AA75, AA80-90, AA99-AA120, AA95-AA110,AA105-AA120,AA100-AA150,AA150-AA200,AA155-AA170,AA190-AA210,AA200-AA250, AA220-AA240, AA245-AA265, AA250-AA300, AA290-AA330, AA290-AA305, AA300-AA 350, AA 310-AA 330, AA350-AA400, AA380-AA395, AA405-AA495, AA400-AA450, AA 405-AA415, AA415-AA425, AA425-AA435, AA437-AA582, AA450-AA500, AA440-AA460, AA460-AA470, AA475-AA495, AA500-AA550, AA511-AA690, AA515-AA550, AA550-AA600, AA550-AA625, AA575-AA605, AA585-AA600, AA600-AA650, AA600-AA625, AA635-AA665, AA650-AA700, AA645-AA680, AA700-AA750, AA700-AA725, AA700-AA750, AA725-AA775, AA770-AA790, AA750-AA800, AA800-AA815, AA825-AA850, AA850-AA875, AA800-AA850, ΑΛ920-AA 990, AA850-AA900, AA920-AA945, AA940-AA965, AA970-AA990, AA950-AA1000, AA1000-AA1060, AA1000-AA1025, AA1000-AA1050, AA1025-AA1040, AA1040-AA1055, AA1075-AA1175, AA1050-AA1200, AA1070-AA1100, AA1100-AA1130, AA1140-AA116f>, AA1192-AA1457, AA1195-AA1250, AA1200-AA1225, AA1225-AA1250, AA1250-AA1300 AA1260-AA1310, AA1 260-AA1280, AA1266-AA1428, AA1300-AA1350, AA1290-AA1310, AA1310-AA1340, AA1345-AA1405, AA1345-AA1365, AA1350-AA1400, AA13'.5-AA1380, AA1380-AA1405, AA1400-AA1450, AA1450-AA1500, AA1460-AA1475, AA1475-AA1515, AA1475-AA1500, AA1 500-AA1550, AA1500-AA1515, AA1515-AA1 550, AA1550-AA1600, AA1 545-AA1560, AA1 569-AA1931, AA1 570-AA1590, AA1595-AA1 610, AA1 590-AA1650, AA1610-AA1645, AA1 650-AA1690, AA1685-AA1770, AA1689-AA1805, AA1690-AA1720, AA1694-AA1735, AA1720-AA1745, AA1745-AA1770, AA175Γ-ΑΑ1800, AA1775-AA'i 810,
AA1795-AA1850, AA1850-AA1900, AA1900-AA1950, AA1900-AA1920, AA1916-AA2021, AA192O-AA1940, AA1 949-AA2124, AA1950-AA2000, AAI9I0-AA1985, AA1980-AA2000, AA2000-AA2050, AA2005-AA2025, AA2020-AA2045, AA2045-AA2100, AA2045-AA2070, AA 2 054-AA 2 223, AA 2 070-AA 2100, AA 2100-AA 2150, AA 2150-AA 2 200, AA 2 200-AA 2 250, AA2200-AA2325, AA2250-AA2330, AA2255-AA2270, AA2265-AA2280, AA2280-AA2290, AA2287-AA2385, AA2300-AA2350, AA2290-AA2310, AA2310-AA2330, AA2330-AA2350, AA2350-AA2400, AA2348-AA2464, AA2345-AA2415, AA2345-AA2375, AA2370-AA2410, AA2371-AA2502,AA2400-AA2450,AA2400-AA2425,AA2415-AA2450,AA2445-AA2500, AA 2 445-AA 2 475, AA 2 470-AA 2 490, AA 2 500-AA 2 550, AA 2 505-AA 2 540, AA 2 535-AA 2 560, AA 2 550-AA 2 600, AA 2 560-AA 2 580, AA 2 600-AA 2 650, AA 2 605-AA 2 620, AA 2 620-AA 2 650, AA2640-AA2660, AA2650-AA2700, AA2655-AA2670, AA2670-AA2700, AA2700-AA275O, AA2740-AA2760, AA2750-AA2800, AA2755-AA2780, AA2780-AA2830, AA2785-AA2810, AA2796-AA2886, AA2810-AA2825, AA2800-AA2850, AA 2 850-AA 2 900, AA 2 850-AA 2 865, AA2885-AA2905, AA2900-AA2950, AA2910-AA2930, AA2925-AA2950, AA2945-end (C-terminal).
11. Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, daß es aus dem Peptid nach Anspruch 10 besteht.
12. Immunogenes Polypeptid, das an ein festes Substrat gebunden ist, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid einem der Ansprüche 7 oder 8 oder 9 oder 10 oder 11 entspricht oder daß das Polypeptid auu einem in HCV-cDNA codierten Epitop besteht, wobei die HCV-cDNA von einer durch die Nucleotidnummern -319 bis 1348 oder 8659 bis 8866 in Fig. 17 angegebenen Sequenz ist.
13. Monoklonaler Antikörper, der gegen ein in HCV-cDNA codiertes Epitop gerichtet ist, dadurch gekennzeichnet, daß die HCV-cDNA von einer durch die Nucleotidnummern -319 bis 1348 oder 8659 bis 8886 in Fig. 17 angegebenen Sequenz ist oder die in Klon 131 oder Klon 26j oder Klon 59a oder Klon 84a oder Klon CA 156e oder Klon 167b oder Klon pi 14 oder Klon CA216a oder Klon CA290a oder Klon ag30a oder Klon 20Ba oder Klon 18g oder Klon 16jh vorhandene Sequenz ist.
14. Präparat von gereinigten polyklonalen Antikörpern, die gegen ein Polypeptid gerichtet sind, das aus einem in der HCV-cDNA codierten Epitop besteht, dadurch gekennzeichnet, daß die HCV-cDNA von einer durch die Nucleotidnummern -319 bis 1348 oder 8659 bis 8866 in Fig. 17 angegebenen Sequenz ist oder die in Klon 13i oder Klon 26j oder Klon 59a oder Klon 84a oder Klon CA156e oder Klon 167 h oder Klon pi 14a oder Klon CA216a oder Klon CA290a oder Klon ag30a oder Klon 205a oder Klon 18g oder Klon 16jh vorhandene Sequenz ist.
15. Polynucleotidsonde für das HCV, dadurch gekennzeichnet, daß die Sonde aus einer von einer HCV-cDNA-Sequenz, die durch die Nucleotidnummern -319 bis 1348 oder8659 bis8866 in Fig. angegeben ist, oder von dem Komplement der HCV-cDNA-Sequenz abgeleiteten HCV-Sequenz besteht.
16. Kit für die Analyse von Proben auf die Gegenwart von Polynucleotiden aus dem HCV, dadurch gekennzeichnet, daß er eine Polynucleotidsonde umfaßt, die eine Nucleotidsequenz von etwa 8 oder mehr Nucleotiden enthält, wobei die Nucleotidsequenz von der HCV-cDNA abgeleitet ist, die von einer durch die Nucleotidnummern -319 bis 1348 oder 8659 bis 8866 in Fig. 17 angegebenen Sequenz ist, wobei die Polynucleotidsonde in einem geeigneten Container enthalten ist.
17. Kit für die Analyse von Proben auf die Gegenwart einos HCV-Antigens, dadurch gekennzeichnet, daß er einen Antikörper enthält, der immunologisch mit einem HCV-Antigen reagiert, wobei das Antigen ein Epitcp enthält, das in HCV-cDNA codiert ist, die von einer durch die Nucleotidnummern -319 bis 1348 oder 8659 bis 8866 in Fig. 17 angegebenen Sequenz ist, oder wobei die HCV-cDNA in Klon 13i oder Klon 26j oder Klon 59a oder Klon 84a oder Klon CA 156e oder Klon 167 b oder Klon pi 14a oder Klon CA216a oder Klon CA290a oder Klon ag30a oder Klon 205a oder Klon 18g oder Klon 16jh vorhanden ist.
18. Kit für die Analyse von Proben auf die Gegenwart eines HCV-Antikörpers, dadurch gekennzeichnet, daß er ein antigenes Polypeptid umfaßt, das ein HCV-Epitop enthält, das in HCV-cDNA codiert ist, die von einer durch die Nucleotidnummern -319 bis 1348 oder 8659 bis 8366 in Fig. 17 angegebener) Sequenz ist oder in Klon 13i oder Klon 26j oder Klon 59a oder Klon 84a oder Klon CA 156e oder Klon 167boderKlon pi14aoderKlon CA 290 a oder Klon ag30aoderKlon 205a oder Klon 18g oder Klon 16jh vorhanden ist.
19. Kit für die Analyse von Proben auf die Gegenwart eines HCV-Antikö rpers, dadurch gekennzeichnet, daß er ein antigenes Polypeptid umfaßt, das von HCV-cDNA in Klon CA279a oder Klon CA74a oder Klon 13ioderKlon CA290a oder Klon 33CoderKlon 40boderKlon 33boderKlon 25coder Klon 14c oder Klon 8f oder Klon 33f oder Klon 39 coder Klon 15eexprimiert wurde, wobei das antigene Polypeptid in einem geeigneten Container vorhanden ist.
20. Verfahren zum Nachweis von HCV-Nucleinsäuren in einer Probe, gekonnzeichnet durch:
(a) Reaktion der Nucleinsäuren der Probe mit einer Polynucleotidsonde für HCV, wobei die Sonde aus einer HCV-Sequenz besteht, die von einer HCV-cDNA-Sequenz von der durch die Nucleotidnummern - 319 bis 1348 oder 8659 bis 8866 in Fig. 17 angegebenen Sequenz abgeleitet ist, und wobei die Reaktion, unter Bedingungen erfolgt, die die Bildung eines Polynucleotid-Duplax zwischen der Sonde und der HCV-Nucleinsäure aus der Probe gestatten,
(b) Nachweis eines Polynucleotid-Duplex, der in Schritt (a) gebildet wurde und die Sonde enthält.
21. Immunoassay zum Nachweis eines HCV-Antigens, gekennzeichnet durch:
(a) Inkubation einer Probe, die vermutlich ein HCV-Antigen enthält, mit einem gegen ein in HCV-cDNA codierten HCV-Epitop gerichteten Antikörper, wobei die HCV-cDNA von einer durch die Nucleotidnummern -319 bis 1348 oder 8659 bis 8866 in Fig. 17 angegebenen Sequenz oder die in Klon 13i oder Klon 26j oder Klon 59a oder Klon 84a oder Klon CA156e oder Klon 167 b oder Klon pi 14a oder Klon CA216a oder Klon CA290a oder Klon ag30a oder Klon 205a oder Klon 18g oder Klon 16jh vorhandene Sequenz ist, und wobei die Inkubation unter Bedingungen erfolgt, die die Bildung eines Antigen-Antikörper-Komplexes gestatten, und
(b) Nachweis eines Antikörper-Antigen-Komplexes, der in Schritt (a) gebildet wurde und den Antikörper enthält.
22. Immunoassay zum Nachweis von Antikörpern, die gegen ein HCV-Antigen gerichtet sind, gekennzeichnet durch:
(a) Inkubation einer Probe, die vermutlich Anti-HCV-Antikörper enthält, mit einem Antigen-Polypeptid, das ein in HCV-cDNA codiertes Epitop enthält, wobei die HCV-cDNA von einer durch die Nucleotidnummern -319 bis 1348 oder 8659 bis 8866 in Fig. 17 angegebenen Sequenz odor die in Klon 13ioderKlon 26joderKlon 59aoderKlon 84aoderKlon CA 156e oder Klon 167boder Klon pi 14a oder Klon CA216a oder Klon CA290a oder Klon ag30a oder Klon 205a oder Klon 18g oder Klon 16jh vorhandene Sequenz ist, und wobei die Inkubation unter Bedingungen erfolgt, die die Bildung eines Antigen-Antikörper-Komplexes gestatten, und
(b) Nachweis eines Antikörper-Antigen-Komplexes, der in Schritt (a) gebildet wurde und das Antigen-Polypeptid enthält.
23. Immunoassay zum Nachweis von gegen ein HCV-Antigen gerichteten Antikörpern, gekennzeichnet durch:
(a) Inkubation einer Probe, die vermutlich Anti-HCV-Antikörper enthält, mit einem Polypeptid nach Anspruch 9 unter Bedingungen, die die Bildung eines Antigen-Antikörper-Komplexes gestatten, und
(b) Nachweis eines Antikörper-Antigen-Komplexes, der in Schritt (a) gebildet wurde und das Antigenpolypeptid enthält.
24. Vakzin zur Behandlung einer HCV-lnfektion, das ein immunogenes Polypeptid umfaßt, das ein in HCV-cDNA codiertes HCV-Epitop enthält, dadurch gekennzeichnet, daß die HCV-cDNA von einer durch die Nucleotidnummern -319 bis 1348 oder8659 bis 8866 in Fig. 17 angegebenen Sequenz ist oder die in Klon 13i oder Klon 26j oder Klon 59a oder Klon 84a oder Klon CA156e oder Klon 167b oder Klon pi 14a oder Klon CA216a oder Klon CA290a oder Klon ag30a oder Klon 205a oder Klon 18g oder Klon 16jh vorhandene Sequenz ist, und daß das immunogene Polypeptid in einer pharmakologisch wirksamen Dosis in einem pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoff vorliegt.
25. Verfahren zur Produktion von Antikörpern gegen das HCV, dadurch gekennzeichnet, daß einem Individuum ein isoliertes immunogenes Polypeptid verabreicht wird, das ein in HCV-cDNA codiertes Epitop enthält, wobei die HCV-cDNA von einer durch die Nucleotidnummern -319 bis 1348 oder 8659 bis 8866 in Fig. 17 angegebenen Sequenz ist oder die in Klon CA279a oder Klon CA74a oder Klon 13i oder Klon CA290a oder Klon 33c oder Klon 40b oder Klon 33b oder Klon 25c oder Klon 14c oder Klon 8f oder Klon 33f oder Klon 33g oder Klon 39c oder Klon 15e vorhandene Sequenz ist, und wobei das immunogene Polypeptid in einer pharmakologisch wirksamen Dosis in einem pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoff vorliegt.
26. „Anti-sense"-Polynucleotid, das von HCV-cDNA abgeleitet ist, dadurch gekennzeichnet, daß die HCV-cDNA die in Fig. 17 dargestellte ist.
27. Verfahren zur Herstellung des gereinigten Fusionspolypeptide C100-3, gekennzeichnet durch:
(a) Bereitstellung eines rohen Zell-Lysats, das das Polypeptid C100-3 enthält,
(b) Behandlung des rohen Zell-Lysats mit einer solchen Acetonmenge, die das Polypeptid ausfällt,
(c) Isolieren und Löslichmachen des gefällten Materials,
(d)' Isolieren des Polypeptids C100-3 durch Anionenaustauschchromatographie, und (e) weitere Isolierung des Polypeptids C100-3 aL3 Schritt (d) durch Gelfiltration.
28. Verfahren zur Herstellung eines HCV-Polypeptids, gekennzeichnet durch:
(a) Bereitstellung einer Wirtszelle, die mit einem rekombinanten Expressionssystem transformiert ist, das ein offenes Leseraster (ORF) der von der HCV-cDNA abgeleiteten DNA enthält, wobei die HCV-cDNA in Klon 13i oder Klon 26j oder Klon 59a oder Klon 84a oder Klon CA156e oder Klon 167b oder Klon pi 14a oder Klon CA216aodbi Klon CA290a oder Klon ag30a oder Klon 205a oder Klon 18g oder Klon 16jh vorhanden ist oder wobei die HCV-cDNA von einer durch die Nucleotidnummern -319 bis 1348 oder 8659 bis 8866 in Fig. 17 angegebenen Sequenz ist, wobei das ORF operabel an eine Kontrollsequenz gebunden ist, die mit einem erwünschten Wirt verträglich ist, und
(b) Inkubation der Wirtszelle unter Bedingungen, die die Expression des HCV-Polypeptids gestatten.
29. Verfahren zur Herstellung eines immunogenen HCV-Polypeptids, gekennzeichnet durch:
(a) Bereitstellung einer Wirtszelle, die mit einem rekombinanten Expressionsvektor transformiert ist, der ein ORF der von der HCV-cDNA abgeleiteten DNA enthält, wobei die HCV-cDNA aus einer Sequenz besteht, die von der HCV-cDNA-Sequenz in Klon CA279a oder Klon CA74a oder Klon 13i oder Klon CA290a oder Klon 33c oder Klon 40b oder Klon 33b oder Klon 25c oder Klon 14c oder Klon 8f oder Klon 33f oder Klon 33g oder Klon 39c oder Klon 15e abgeleitet ist, wobei das ORF operabel an eine Kontrollsequenz gebunden ist, die mit dem erwünschten Wirt verträglich ist, und
(b) Inkubation der Wirtszelle unter Bedingungen, die die Expression des HCV-Polypeptids gestatten.
30. Verfahren zur Herstellung einer Wirtszelle, die mit einem rekombinanten Polynucleotid transformiert ist, das eine Sequenz von HCV-cDNA umfaßt, die von der HCV-cDNA in Klon 13i oder Klon 26j oder Klon 59a oder Klon 84a oder Klon CA 156e oder Klon 167 b oder Klon pi 14a oder Klon CA216a oder Klon CA290a oder Klon ag30a oder Klon 205a oder Klon 18g oder Klon 16jh abgeleitet ist, oder wobei die HCV-cDNA von einer durch die Nucleotidnummern -319 bis 1348 oder 8659 bis 8866 in Fig. 17 angegebenen Sequenz ist, gekennzeichnet durch:
(a) Bereitstellung einer Wirtszelle, die zur Transformation in der Lage ist,
(b) Bereitstellung des rekombinanten Polynucleotide, und
(c) Inkubation von (a) mit (b) unter Bedingungen, die die Transformation der Wirtszelle mit dem Polynucleotid gestatten.
31. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Polynucleotide, das aus einer Sequenz von HCV-cDNA besteht, die von der HCV-cDNA in Klon 13 i oder Klon 26j oder Klon 59a oder Klon 84a oder Klon CA156e oder Klon 167 b oder Klon pi 14a oder Klon CA216a oder Klon CA290a oder Klon ag30a oder Klon 205a oder Klon 18g oder Klon 16jh abgeleitet ist, wobei die HCV-cDNA von einer durch die Nucleotidnummern -319 bis 1348 oder 8659 bis 8866 in Fig. 17 angegebenen Sequenz ist, gekennzeichnet durch:
(a) Bereitstellung einer Wirtszelle, die mit dem rekombinanten Polynucleotid transformiert ist, und
(b) Isolierung des Polynucleotide aus der Wirtszelle.
32. Verfahren zur Herstellung von HCV-freiem Blut, gekennzeichnet durch:
(a) Bereitstellung einer Blutprobe, die vermutlich HCV und Anti-HCV-Antikörper enthält,
(b) Bereitstellung eines immunogenen Polypeptids, dac nach Anspruch 28 oder 29 hergestellt wurde,
(c) Inkubation der Probe von (a) mit dem immunogenen Polypeptid von (b) unter Bedingungen, die die Bildung von Antikörper- HCV-Polypeptid-Komplexen i;estatten,
(d) Nachweis der in Schritt (c) gebildeten Komplexe, und
(e) Aufbewahrung des Blutes, bei dem in (d) keine Komplexe nachgewiesen wurden.
33. Verfahren zur Herstellung von HCV-freiem Blut, gekennzeichnet durch:
(a) Bereitstellung von Nucleinsäuren aus einer Blutprobe, die vermutlich HCV-Polynucleotide enthält,
(b) Bereitstellung einer Sonde für HCV, wobei die Sonde aus einer HCV-Sequenz besteht, die von einer HCV-cDNA abgeleitet ist, die von einer durch die Nucleotidnummern -319 bis 1348 oder 8659 bis 8866 in Fig. 17 angegebenen Sequenz ist,
(c) Reaktion von (a) mit (b) unter Bedingungen, die die Bildung eines Polynucleotid-Duplexes zwischen der Sonde und der HCV-Nucleinsäi're aus der Probe gestatten,
(d) Nachweis eines Polynucleotide, das in Schritt (c) gebildet wurde und die Sonde enthält, und
(e) Aufbewahrung des Blutes, bei dem in (d) keine Komplexe nachgewiesen wurden.
34. Verfahren zur Herstellung eines Hybridoms, das monoklonal Anti-HCV-Anti1 örper produziert, gekennzeichnet durch:
(a) Immunisieren eines Individuums mit einem immunogenen Polypeptid, das ein in HCV-cDNA codiertes Epitop enthält, wobei es sich bei der HCV-cDNA um die in Klon 13 i oder Klon 26] oder Klon 59a oder Klon 84a oder Klon CA156e oder Klon 167 b odör Klon pi 14a oder Klon CA216a oder Klon CA290a oder Klon ag30a oder Klon 205a oder Klon 18g oder Klon 16jh handelt oder wobei die HCV-cDNA von einer durch die Nucleotidnummern -319 bis 1348 oder 8659 bis 8866 in Fig. angegebenen Sequenz ist, oder
(b) Immunisieren eines Individuums mit einem nach Anspruch 29 hergestellten immunogenen Polypeptid,
(c) Immortalisierung Antikörper-produzierender Zellen aus dem immunisierten Individuum,
(d) Selektion einer immortalen Zelle, die Antikörper produziert, die mit einem HCV-Epitop in dem immunogenen Polypeptid von (a) oder (b) reagieren, und (e) Vermehrung der immortalen Zelle.
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