JP3195799B2 - 非ａ非ｂ型肝炎ウイルス構造蛋白質をコードするｄｎａ断片 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイル
ス構造蛋白質の構成ポリペプチドをコードする新規なＤ
ＮＡ断片、該ＤＮＡ断片を含む発現ベクター、該発現ベ
クターによって形質転換された形質転換体、並びに該形
質転換体を培養して得られる発現ポリペプチド及びその
製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】非Ａ非Ｂ型肝炎は、ウイルス性の伝染性
肝炎と考えられており、慢性化しやすく、肝硬変、肝癌
へ移行する率が高いことから、社会的に問題となってい
る。しかしながら患者あるいは健康キャリアー体内での
ウイルス発現量が少ないこと、また感染性ウイルスが同
定されておらず、原因ウイルスが１種なのかあるいは２
種以上存在するのかも分かっていないことなどからその
確定診断は、非常に困難である。現在まで非Ａ非Ｂ型肝
炎の診断は、臨床的には、血清中のアラニンアミノトラ
ンスフェラーゼとアスパラギン酸アミノトランスフェラ
ーゼのレベルの上昇を確認し、その上でＡ型肝炎、Ｂ型
肝炎およびＤ型肝炎、さらには肝障害を引き起こす既知
のウイルス、ＣＭＶ、ＥＢＶ等による肝炎か否かの診断
を行い、これらの疾病に該当しない場合に非Ａ非Ｂ型肝
炎と診断する、いわゆる除外診断によって行われてい
た。しかし、非Ａ非Ｂ型肝炎の臨床像は他のウイルス性
肝炎のものと似通っており、上記のような除外診断法で
は、他のウイルス性の肝炎との鑑別診断は難しい。ま
た、ＡＬＴ値に異常のみられない健康キャリアーを同定
するのはさらに困難である。このため、健康キャリアー
からの輸血による感染を防止することは困難で、輸血後
肝炎の90％以上をこの肝炎が占めており、患者数は年間
100万人にのぼるといわれている。

【０００３】かかる状況を改善するため、多くの研究者
が非Ａ非Ｂ型肝炎の診断用材料の開発を行ってきたが、
信頼性が低いものが多かった。これらの診断用材料で最
も信頼性の高いものは、カイロン社のM.Houghtonら（特
表平2-500880号公報）によって開発されたものだと考え
られている。カイロン社では、患者血漿をチンパンジー
に接種して非Ａ非Ｂ型肝炎を起こさせ、その中で高い感
染価の血漿を有する個体から血漿を分離し、これよりＲ
ＮＡを回収して蛋白質発現ベクターであるλｇｔ11を用
いて患者血清でスクリーニングしている。カイロン社で
は得られた遺伝子を用いさらに遺伝子のクローニングを
行い、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ＝カイロン社命名）の
ほぼ全遺伝子をクローニングし、一部遺伝子を発現して
得られた抗原蛋白質を用いて診断用のキット化を行って
いる。

【０００４】その後、日本でもイムノスクリーニングに
より、非Ａ非Ｂ型肝炎に特異的な遺伝子が分離されてき
ている。ところが、槙らの特許（特願平2-180889号）に
よると、分離された遺伝子は、カイロン社の分離したＨ
ＣＶに核酸、アミノ酸レベルでの相同性の高いＨＣＶ・
グループＩと、ホモロジーが低く、ＨＣＶ・グループＩ
とは異なるウイルスと考えてよい程度のホモロジーしか
示さないグループIIに分類できることが示された。また
このグループＩとグループIIの遺伝子の発現産物を用い
たＥＬＩＳＡの系で、グループＩに感染している患者と
グループIIに感染している患者を分類できることも示さ
れている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】カイロン社により非Ａ
非Ｂ型肝炎の原因ウイルスの１つと考えられるＨＣＶが
発見され、除外診断法に代わる診断が可能となった。し
かしながら、この診断材料を使用した患者血清スクリー
ニング結果は決して満足できるものではなく、カイロン
社のキットは特に日本人の非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清とで
は50〜70％程度の反応しか示さない。即ち、臨床的には
非Ａ非Ｂ型肝炎と診断されている患者血清、あるいは遺
伝子増幅（ＰＣＲ）によってＨＣＶの遺伝子の存在が確
認されている患者血清と反応しない例が認められる。こ
の原因としては、１つには、カイロン社の分離したウイ
ルス遺伝子がＨＣＶのグループＩに属するウイルス遺伝
子であるため、その発現産物も、グループＩ特異的であ
ると考えられる。そのため、グループIIのウイルスに感
染している患者血清は、カイロン社のキットでは、検出
できない可能性が考えられる。またグループＩ、グルー
プII以外にその中間に位置するようなウイルスやそのど
ちらにも属さない例えばグループIII に相当するような
ウイスルあるいは、全くＨＣＶに相同性のないウイルス
の存在する可能性も否定できない。

【０００６】これらの課題を解決するためには、グルー
プIIに感染している日本人患者血漿からグループII特異
的なウイルス遺伝子を得る必要がある。さらにＨＣＶグ
ループＩあるいはグループIIに対して相同性の低いウイ
ルスを得るためにはより多くの日本人患者から、日本人
由来の非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子を多数得て、可能
な限り多くの患者血清と反応する抗原を得る必要があ
る。

【０００７】本発明は上記課題を解決するための、非Ａ
非Ｂ型肝炎ウイルス構造蛋白質の構成ポリペプチドをコ
ードする新規なＤＮＡ断片、該ＤＮＡ断片を含む発現ベ
クター、該発現ベクターによって形質転換された形質転
換体、並びに該形質転換体を培養して得られる発現ポリ
ペプチド及びその製造方法を提供することを目的として
いる。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、かかる目
的を達成すべく鋭意検討を重ねた結果、ＨＣＶ・グルー
プIIのみに感染している日本人非Ａ非Ｂ型肝炎患者の血
漿から非Ａ非Ｂ型肝炎の原因ウイルスと考えられる病因
ウイルス遺伝子を精製・単離し、さらにその遺伝子を用
いて複数の日本人非Ａ非Ｂ型肝炎患者の血漿からウイル
ス遺伝子を得、該遺伝子から誘導されたＤＮＡを含む発
現ベクターを構築し、および該発現ベクターにより形質
転換された形質転換体を得ることによって、本発明を完
成するに至った。

【０００９】本発明は、非Ａ非Ｂ型肝炎患者血漿から直
接取得された非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスＲＮＡから遺伝子
工学的に誘導して得られた、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス構
造蛋白質の構成ポリペプチドをコードする塩基配列を含
むＤＮＡ断片を提供する。このＤＮＡ断片の調製にあた
っての重要な特徴は、ＥＬＩＳＡ法及びＰＣＲ法を用い
てグループIIのみに感染している慢性期の日本人非Ａ非
Ｂ型肝炎患者の新鮮血漿を出発材料として用いた点が挙
げられる。本発明者らは、この血漿プールから直接非Ａ
非Ｂ型肝炎ウイスルＲＮＡを含む全ＲＮＡを取り出し、
ランダムプライマー法によりｃＤＮＡを合成した。この
ｃＤＮＡをλファージに入れｃＤＮＡライブラリーを作
製した。さらにこのｃＤＮＡライブラリーをグループII
のみに感染している非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清を用いてイ
ムノスクリーニングし、グループIIに特異的なＤＮＡ断
片を得た。この得られたＤＮＡ断片をプローブとして用
い、複数の慢性期非Ａ非Ｂ型肝炎患者血漿より得られた
ｃＤＮＡライブラリーをハイブリダイゼーションアッセ
イによりスクリーニングし、相同性の異なる日本人非Ａ
非Ｂ型肝炎患者に特異的なｃＤＮＡを単離した。

【００１０】このように、グループIIに感染している非
Ａ非Ｂ型肝炎患者血漿からグループII特異的な非Ａ非Ｂ
型肝炎ウイルスＲＮＡを単離する手法を採用したこと、
及びさらに得られたＤＮＡ断片を用い、多数の非Ａ非Ｂ
型肝炎患者血漿からスクリーニングを行ったことは、い
くつかのグループがあり且つ変異しやすいと考えられて
いる非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス関連の患者の診断および該
肝炎ウイルスを有する非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスキャリア
ーの輸血用血液の検出確度を上げるうえで非常に有効な
抗原を提供するものである。

【００１１】以下に本発明のｃＤＮＡライブラリーの調
製方法、ＤＮＡ断片の単離、配列の決定、ポリペプチド
の発現、精製単離、及び酵素抗体法の詳細な説明を行
う。

【００１２】先ず、グループIIにのみ感染している非Ａ
非Ｂ型肝炎患者の新鮮血漿から細胞破砕物を分離し、そ
の遠心上清を更に遠心によりペレット化する。このペレ
ットからセシウムトリフルオロアセテートを用いる平衡
密度勾配遠心法によって全ＲＮＡを沈澱として分離し、
フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈澱を行い
全ＲＮＡを精製する。

【００１３】得られたＲＮＡ画分から、GublerとHoffma
n の方法により、ランダムプライマーを用いｃＤＮＡを
合成する。これをＤＮＡメチラーゼ（例えば、EcoRI メ
チラーゼ）で処理してメチル化した後に、ＤＮＡリンカ
ー（例えば、EcoRI リンカー）又はＤＮＡアダプター
（例えばEcoRI アダプター）を連結し、このものをλフ
ァージ（例えば、λｇｔ10，λｇｔ11）等のクローニン
グベクターにクローニングし、ｃＤＮＡライブラリーを
構築した。これをｃＤＮＡライブラリーＡとする。また
同様の方法で、複数の非Ａ非Ｂ型肝炎患者の新鮮血漿か
らもｃＤＮＡライブラリーを構築した。これをｃＤＮＡ
ライブラリーＢとする。

【００１４】次に、λファージｃＤＮＡライブラリーＡ
を大腸菌に感染させ、例えば寒天プレート上で培養して
プラークを形成させる。プラークをニトロセルロースフ
イルターに移し取り、グループIIにのみ感染している非
Ａ非Ｂ型肝炎血清を用いるイムノスクリーニングにより
陽性クローンを検出する。このスクリーニングにより１
個のクローンＣ11−Ｃ21が得られた。スクリーニングの
効率化を計るため、及びより多くの人から非Ａ非Ｂ型肝
炎の原因ウイルス遺伝子を得るため、得られた陽性クロ
ーンをプラスミド等のクローニングベクターにクローニ
ングし、フラグメントを切り出し、ランダムプライマー
法により³²Ｐで標識し、ＤＮＡプローブを作製し、該プ
ローブを用いるハイブリダイゼーションアッセイにより
スクリーニングし、ｃＤＮＡライブラリーＢから陽性プ
ラークを検出する。このようにして得られたクローンを
用いさらにスクリーニングを行った。この一連のスクリ
ーニングによりさらに、４種のクローンが得られた。本
発明者らはこれらのクローンをＣ10−Ｅ12，Ｃ10−Ｅ1
3，Ｃ10−Ｅ24，Ｃ10−Ｅ15と命名した。

【００１５】これらの合計５つのクローン、即ちＣ11−
Ｃ21，Ｃ10−Ｅ12，Ｃ10−Ｅ13，Ｃ10−Ｅ24及びＣ10−
Ｅ15はいずれも大腸菌ＪＭ109 株に移入され、形質転換
株と成して夫々微工研菌寄第 11892号，同第 11894号，
同第 11895号，同第 11896号及び同第 11897号として平
成２年12月11日付けで工業技術院微生物工業技術研究所
に寄託されている。

【００１６】得られた５クローンのλファージＤＮＡか
ら常法に従ってｃＤＮＡを取得し、これを適切な制限酵
素（例えば、EcoRI, BamHI）で切断し、各ｃＤＮＡ断片
をアガロースゲル電気泳動で精製した後、ｐＵＣ119 あ
るいはＭ13ファージに組み込み、Sangerらのジデオキシ
鎖終止法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463(197
7)］を用いて各ｃＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。こ
のようにして決定された上記クローンＣ11−Ｃ21，Ｃ10
−Ｅ12，Ｃ10−Ｅ13，Ｃ10−Ｅ24及びＣ10−Ｅ15の塩基
配列及びそれから推定されるアミノ酸配列を夫々配列番
号１，２，３，４及び５に示した。これらは夫々369 B
P，932 BP，559 BP，276 BP及び742 BPから成る核酸配
列を有するＤＮＡ断片である。

【００１７】従って、本発明の実施態様により、本発明
は、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス構造蛋白質を構成するポリ
ペプチドが配列番号１，２，３，４又は５によって示さ
れる読み取り枠に従ってコードされるアミノ酸配列の全
部又は一部で表わされることを特徴とする、該ポリペプ
チドをコードする塩基配列を含むＤＮＡ断片を提供す
る。

【００１８】もちろん、これらの塩基配列において、各
アミノ酸に対応する他のコドンから成る他のいかなる塩
基配列も本発明に包含される。

【００１９】５クローンは全て連続的なオープンリーデ
ィングフレーム（読み取り枠）が開き、終止コドンはも
っていなかった。

【００２０】ＨＣＶはゲノムＲＮＡの解析により日本脳
炎ウイルスなどのフラビウルスと類似したウイルスであ
ることが知られており（蛋白質・核酸・酵素35(12)，21
17-2127(1990))、この公知のフラビウイルスの遺伝子及
びポリペプチドに対する相同性に基づいて、本発明ＤＮ
Ａ断片がＨＣＶ構造蛋白質をコードしているものと認め
られた。特に、クローンＣ11−Ｃ21はＨＣＶのcoreをコ
ードする遺伝子であり、またクローンＣ10−Ｅ12，Ｃ10
−Ｅ13，Ｃ10−Ｅ24及びＣ10−Ｅ15はいずれもＨＣＶの
coreの後半からenv 又はenv から下流の領域をコードす
る遺伝子であると認められる。

【００２１】Ｃ11−Ｃ21クローンに関する配列番号１に
よって示される核酸配列369 BPとオープンリーディング
フレームに沿って翻訳したアミノ酸配列123 アミノ酸を
Houghtonら［国際公開第90／11089号］の報告したＨＣ
Ｖとオーバーラップした部分の相同性を比較すると核酸
レベルで81.8％、アミノ酸レベルで87％の相同性を示し
た。また岡本ら（Japan J.Exp.Med.,60,3,p.167-177,19
90）の発表した日本人より得られたＨＣＶクローンＨＣ
−Ｊ１およびＨＣ−Ｊ４との比較でも核酸レベルで82.1
％および82.7％、アミノ酸レベルで87.8％および89.4％
の相同性を示した。HoughtonらのＨＣＶおよびＨＣ−Ｊ
１、ＨＣ−Ｊ４の３つのクローン間での同じ領域での相
同性は、核酸レベルで92.1％〜97.6％、アミノ酸レベル
で95.5％〜96.7％とよく保存されており、我々の得たク
ローンＣ11−Ｃ21は、これら３つのクローンとは、相同
性において一定の距離があり、グループの異なるウイル
スの遺伝子だと考えられる。残りの４つのクローンのう
ち３クローン、Ｃ10−Ｅ12、Ｃ10−Ｅ13、Ｃ10−Ｅ15
は、ＨＣＶ、ＨＣ−Ｊ１、ＨＣ−Ｊ４と核酸レベルで83
〜93％、アミノ酸レベルで82〜95％の相同性を示してい
る。またＣ10−Ｅ24は核酸レベルで63％前後、アミノ酸
レベルで60％前後の相同性を示した。

【００２２】このように本発明ＤＮＡ断片は、従来公知
のＤＮＡ断片とは異なるもので新規のＤＮＡである。Ｈ
ＣＶは、グループＩおよびグループIIの２つのグループ
に分けられるが、宿主内で変異を受けやすいウイルスで
ある可能性が高く、グループＩ、グループIIの中間のタ
イプのものや、他のグループに分けられるウイルスが存
在する可能性もある。そのため、一種のＤＮＡ断片から
つくられる抗原蛋白だけでは、すべての非Ａ非Ｂ型肝炎
患者を診断することは困難である。この問題を解決する
ためには、ＤＮＡ等の調製方法を設定し、より多くのク
ローンを得ることが重要である。この得られたクローン
をいくつか組み合わせて診断に用いることにより、診断
の効率を高めることが可能である。

【００２３】本発明はまた、上述のようにして得られた
ＤＮＡ断片を、プロモーターの下流に存在するベクター
内のクローニング部位に、導入して得られる発現を提供
する。ベクターとしては、プラスミド、ファージ等の慣
用のベクターが用いられる。

【００２４】発現ベクターは、当該技術分野で公知の技
術を用いて構築される。図１は発現プラスミドの構築例
を示すものであるが、以下にその構築方法を説明する。

【００２５】先ず、前記Ｃ11−Ｃ21クローンをｐＵＣ11
9 に組み込んで得られたプラスミドｐＵＣ・Ｃ11−Ｃ21
DNA から２つのプライマー（５′−TTACGAATTCATGGGCAC
GAATCCT −３′、５′−TTAATCGATGACCTTACCCACATTGCG
−３′）を用いた遺伝子増幅法（ＰＣＲ）により３′末
端にストップコドンの入ったＤＮＡ断片を得る。このＤ
ＮＡ断片をＳｍａＩで消化したｐＵＣ118 に連結し、プ
ラスミドｐＵＣ118 ・Ｃ11−Ｃ21・Ｓｍａを得る。この
プラスミドをＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、Ｄ
ＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により分離し、グラ
スパウダー法により精製する。一方、発現ベクターであ
るＴｒｐ・ＴｒｐＥ ＤＮＡ（特願平2-180889号）をＢ
ａｍＨＩ，ＥｃｏＲＩ消化およびバクテリアアルカリ性
ホスファターゼ（ＢＡＰ）処理した後、フェノール抽
出、エタノール沈澱を行い処理ベクターＤＮＡを得る。
このベクターＤＮＡと前述のＣ11−Ｃ21 ＤＮＡ断片と
をライゲーション緩衝液中でＴ４ ＤＮＡリガーゼによ
り連結することによって、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス構造
蛋白質の構成ポリペプチドをコードするＤＮＡを転写制
御できる位置にプロモーターをもつ発現プラスミドＴｒ
ｐ・ＴｒｐＥ Ｃ11−Ｃ21を得た。

【００２６】他のクローンについても適当な制限酵素を
用いて処理し、発現ベクターに組込むことにより、対応
する発現プラスミドを得ることができる。

【００２７】プロモーターとしては、大腸菌、ファージ
等由来のものが挙げられる。例えば、トリプトファン合
成酵素オペロン（ｔｒｐ）、ラクトースオペロン（ｌａ
ｃ）、ラムダファージＰL ，ＰR などがある。また、転
写終結因子は必ずしも必要ないが、発現ベクター内に存
在させるのが好ましい。

【００２８】本発明は更に、宿主を、本発明発現ベクタ
ーで形質転換して得られる形質転換体を提供する。宿主
としては、大腸菌，枯草菌，酵母などのこの分野で慣用
される微生物が用いられる。

【００２９】形質転換は発現ベクターを宿主細胞に移入
するための慣用的方法によって実施される。宿主として
細菌（例えば大腸菌）を用いる場合には、塩化カルシウ
ムを用いる直接取込み法［Mandel,M. とHiga,A.,J.Mol.
Bio.53,159-162(1970)］が使用できる。

【００３０】さらに、発現ベクターを含む大腸菌等の宿
主を例えばアンピシリン含有２ＹＴ培地に接種し、培養
し、更にアンピシリン含有リン酸培地中で継代培養する
ことによって発現菌体を増殖し、目的ポリペプチドを産
生させることができる。

【００３１】宿主からの目的物の精製方法としては、宿
主細胞を例えば超音波破砕した後に遠心分離を行って非
Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスｃＤＮＡでコードされるポリペプ
チド又は該ポリペプチドを含む融合ポリペプチドを含有
する不溶性画分を得、このポリペプチドを尿素含有バッ
ファで可溶化抽出し、イオン交換カラムクロマトグラフ
ィー（例えば、S-Sepharose)に掛けて精製することがで
きる。

【００３２】従って、本発明はまた、配列番号１，２，
３，４又は５のＤＮＡ断片を構成する塩基配列によって
コードされるアミノ酸配列の全部又は一部を含む組換ポ
リペプチドの製造方法を提供する。即ち、本発明方法
は、該ＤＮＡ断片を適当な宿主細胞内で発現させ得る複
製可能な発現ベクターを構築する工程、該発現ベクター
を宿主細胞内に移入して形質転換体を得る工程、該ＤＮ
Ａ断片を発現させ得る条件下で該形質転換体を培養して
該組換えポリペプチドを産生する工程、該組換えポリペ
プチドを回収する工程を含む。

【００３３】本発明はまた、このようにして得られる、
配列番号１，２，３，４又は５によって示される非Ａ非
Ｂ型肝炎ウイルス構造蛋白質の構成ポリペプチドを含む
組換えポリペプチドも提供する。本明細書中、「組換え
ポリペプチド」とは、ベクター内の非Ａ非Ｂ型肝炎ウイ
ルス構造蛋白質を構成するポリペプチドをコードするＤ
ＮＡを発現させて得られるポリペプチド自体又は該ポリ
ペプチドとｔｒｐＥなどの他のペプチドとの融合ポリペ
プチドを意味する。

【００３４】本発明の発現ポリペプチドをＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動に掛けた後、ウェスタンブ
ロット法により正常人血清又は非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清
各２検体と抗原抗体反応させた結果、図３に示すように
患者血清とのみ強く反応することから、この発現ポリペ
プチドは非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス特異抗原として作用す
ることが確認された。

【００３５】また酵素抗体法により、本発明の発現ポリ
ペプチドＴｒｐＥ・Ｃ11−Ｃ21、槙らの特許［特願平2-
180889号］で得られたグループＩの遺伝子より発現させ
たポリペプチドＴｒｐＥ・Ｃ11−７、およびカイロン社
のキット（オーソＨＣＶ Ａｂ ＥＬＩＳＡキット）を
用いて、臨床的に非Ａ非Ｂ型肝炎と判断された患者の血
清と反応させ陽性率を検討した。カイロン社キットは33
例中、23例が陽性で69.7％、グループＩであるＴｒｐＥ
・Ｃ11−７は26例が陽性で、78.8％の陽性率を示した。
一方、本発明の発現ポリペプチドＴｒｐＥ・Ｃ11−Ｃ21
の場合28例が陽性で84.8％の陽性率を示し、カイロン社
のキットより高い陽性率を得た。さらに、グループＩの
発現ポリペプチドであるＴｒｐＥ・Ｃ11−７と、グルー
プIIであると考えられるＴｒｐＥ・Ｃ11−Ｃ21とを組み
合わせることにより31例中、30例が陽性となり、陽性率
は93.9％と上昇する。（表１、図２参照）

【００３６】

【実施例】以下の実施例により、本発明を更に詳細に説
明するが、本発明は本発明の要旨を変えない限りこれら
の実施例に限定されるものではない。

【００３７】実施例１非Ａ非Ｂ型肝炎患者血漿からのｃＤＭＡライブラリーの
調製 慢性期にある日本人非Ａ非Ｂ型肝炎患者の新鮮血漿を、
槙らがクローニングした、グループＩのｃＤＮＡクロー
ンＣ11-7の発現産物及びグループIIのｃＤＮＡクローン
Ｃ10-14 の発現産物を用いたＥＬＩＳＡの系でスクリー
ニングし、Ｃ10-14 のみに反応してくる患者血漿を得
た。この患者血漿をさらに、グループＩでよく保存され
ている領域のプライマー（５′−ＣＡＣＡＴＴＴＧＡＴ
ＣＣＣＡＣＧＡＴＧＧ−３′，５′−ＣＴＧＧＧＡＧＡ
ＧＣＧＴＣＴＴＣＡＣＡＧ−３′）及びグループIIでよ
く保存されている領域のプライマー（５′−ＧＡＴＧＣ
ＣＣＡＣＴＴＣＣＴＣＴＣＣＣＡ−３′，５′−ＧＴＣ
ＡＧＧＧＴＡＡＣＣＴＣＧＴＴＧＧＴ−３′）を用いた
遺伝子増幅法（ＰＣＲ法）を行なった。ＰＣＲ法はGene
AmpTM（DNA Amplification Reagent Kit, Perkin Elme
r Cetus)を用い、ＤＮＡ変性95℃、 1.5分、アニーリン
グ55℃、２分、ＤＮＡ合成70℃、３分の条件で行った。
この条件でグループIIのプライマーでのみ、遺伝子が増
幅してくる患者血漿をプールして用いた。この患者の新
鮮血漿から以下に述べる手順でＲＮＡ画分を調製後、λ
ｇｔ10、λｇｔ11ファージを用いてｃＤＮＡライブリラ
ーを作製した。

【００３８】まず、血漿１ｌを等量の50m Ｍ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ（pH8.0)、１m Ｍ ＥＤＴＡで希釈後、細胞破
砕物等を3500ｇで20分間遠心することにより除去する。
この上清をさらに4500rpm （約100000ｇ）、４℃で４時
間遠心することによりペレットを得た。このペレットを
常法に従い蛋白変性剤である６Ｍグアニジウムチオシア
ネートを用いて溶解後、セシウムトリフルオロアセテー
ト液の上に重層し、ベックマンＳＷ50ローターで33000r
pm、20℃で18時間遠心してペレットを得た。このペレッ
トを10m Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH7.5)、１m Ｍ ＥＤ
ＴＡ溶液に溶かし、フェノール：クロロホルム（１：
１）混合液で２回の抽出操作の後、上清をとり５Ｍ Ｎ
ａＣｌを10分の１量およびエタノールを 2.5倍量加えて
−20℃に２時間放置した。２時間放置後 15000ｇで20分
間遠心し得られたペレットをジエチルピロカーボネート
処理水に溶解しＲＮＡ試料とした。

【００３９】得られたＲＮＡ試料を用いて、Gubler & H
offmanの方法に従い、市販キット（Amersham社あるいは
BRL社）を用いランダムプライマー法によりｃＤＮＡを
合成した。合成されたｃＤＮＡをＥｃｏＲＩメチラーゼ
で処理した後にＥｃｏＲＩリンカーあるいはＥｃｏＲＩ
アダプターを連結し、λｇｔ11ファージのＥｃｏＲＩ部
位にクローニングした。作製したｃＤＮＡライブラリー
は、平均106 −107 ＰＦＵの組み換え体ファージを含ん
でいた。このｃＤＮＡライブラリーをｃＤＮＡライブラ
リーＡとする。またＥＬＩＳＡ ＰＣＲ法でのスクリー
ニングを行っていない複数の非Ａ非Ｂ型肝炎患者の新鮮
血漿５ｌを出発材料とし、同様の方法でλｇｔ10ファー
ジを用いたｃＤＮＡライブラリーＢを構築した。ｃＤＮ
ＡライブラリーＢも平均10⁶−10⁷ＰＦＵの組み換え体フ
ァージを含んでいた。

【００４０】実施例２非Ａ非Ｂ型肝炎特異的ｃＤＮＡの単離 実施例１で作製したｃＤＮＡライブラリーＡから非Ａ非
Ｂ型肝炎に特異的なｃＤＮＡをイムノスクリーニングに
よりクローニングした。

【００４１】イムノスクリーニングに使用する血清は、
ＥＬＩＳＡおよびＰＣＲ法でグループIIのみに感染して
いることを確認した非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清でＨＢｃ抗
体およびＨＢｓ抗体陰性のもの２サンプルをプールして
用いた。

【００４２】まず、大腸菌Ｙ1090株にλｇｔ11ファージ
を37℃で15分間感染させ、これを適当な密度で寒天プレ
ートにまき、43℃、３時間インキュベートしプラークを
形成させる。このプレートの寒天上に、10m Ｍ ＩＰＴ
Ｇを染み込ませたHybond-Nニトロセルロースフィルター
をのせ37℃で３時間培養し融合蛋白の発現を誘発する。
発現蛋白の吸着したニトロセルロースフィルターを３％
ゼラチン溶液でブロッキングした後、非Ａ非Ｂ型肝炎
（ＮＡＮＢＨと略称する）患者血清と４℃で一晩反応さ
せる。ＴＢＳＴ溶液で３回洗浄後、ペルオキシダーゼ標
識抗ヒトＩｇＧ（ヤギ抗体）と室温で 1.5時間反応させ
る。このフィルターを再びＴＢＳＴ溶液で３回洗浄し、
基質であるジアミノベンチジンとＨ₂Ｏ₂との混合液と反
応させ陽性プラークを得た。得られたクローンＣ11−Ｃ
21はＨＢｃ抗体、ＨＢｓ抗体とは陽性の反応は認められ
なかった。

【００４３】次にスクリーニングの効率化をはかるた
め、及びグループII以外のウイルス遺伝子をスクリーニ
ングするため得られたＣ11−Ｃ21クローンをｐＵＣ119
にリクローニングしたものを、制限酵素で消化し、ラン
ダムプライマーラベリング法で³²Ｐ標識しプローブとし
て用い、ハイブリダイゼーションアッセイによりｃＤＮ
ＡライブラリーＢのスクリーニングを行った。スクリー
ニングは、Ｃ600 ｈｆｌ（−）大腸菌に、 5×10⁴ＰＦ
Ｕの組み換え体ファージを37℃、15分間で感染させ、15
0mm Ｌプレートにまく。37℃で一晩インキュベートし、
プラークが出現したら４℃に１時間放置する。このプレ
ートの寒天にHybond-Nフィルターをかぶせ30秒間放置す
る。次に、変性溶液(0.5Ｍ ＮａＯＨ， 1.5Ｍ ＮａＣ
ｌ）で湿らせた濾紙の上にこのフィルターをのせ、２分
間放置後、中和溶液(0.5Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ pH7.0
， 1.5Ｍ ＮａＣｌ）に５分間浸し、更に、 2×ＳＳ
Ｃ中で洗浄後、風乾させる。乾燥したフィルターは 304
nmＵＶを２分間照射し、ＵＶ−クロスリンキングした。

【００４４】このフィルターをＮＡＮＢＨ患者血清との
イムノスクリーニングにより得られたＣ11−Ｃ21クロー
ンの³²Ｐ標識ＤＮＡプローブとハイブリダイズさせ、ス
クリーニングした。ＤＮＡプローブをハイブリダイゼー
ションバッファーで希釈し、ハイブリダイゼーションバ
ッファ中で55℃、一晩インキュベートし反応させる。そ
の後、バックグラウンドをおとすため、１×ＳＳＣ55℃
で10分間ずつ、２回洗浄する。このフィルターを−70℃
でオートラジオグラフィーを行い、陽性ブラークを検出
する。フィルムとＬ−プレートをあわせて、Ｌ−プレー
トから陽性プラークをＳＭバッファにかきとる。このス
クリーニングにより得られたクローンをプローブとして
用い、さらにｃＤＮＡライブラリーＢのスクリーニング
を行った。この一連のスクリーニングにより４クローン
が得られ、それぞれＣ10−Ｅ12，Ｃ10−Ｅ13，Ｃ10−Ｅ
24，Ｃ10−Ｅ15と命名した。

【００４５】実施例３非Ａ非Ｂ型肝炎特異的ｃＤＮＡの配列決定 得られた５クローンのλｇｔ11あるいはλｇｔ10のファ
ージを大腸菌に感染させ、大量のファージを回収する。
このファージから、常法に従い、アルカリ法によりＤＮ
Ａを抽出する。このＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ、Ｂａ
ｍＨＩあるいはＫｐｎＩで消化しアガロースゲル電気泳
動により精製する。一方、シークエンス用ベクターであ
るＭ13ファージのｍｐ18およびｍｐ19(Messing, J., Me
thod inEnzymology, 101, 20-78) あるいはｐＵＣ118
およびｐＵＣ119 (Vieira, J. とMessing, J., Methods
in Enzymology, 153, 3-11)を制限酵素ＥｃｏＲＩ、Ｂ
ａｍＨＩあるいはＫｐｎＩで消化し、線状化した。前記
のｃＤＮＡ断片とベクターＤＮＡを緩衝液中でＴ４リガ
ーゼにより連結し、この反応物を用い、大腸菌ＪＭ109
株に形質導入あるいは形質転換した。これらの大腸菌を
培養し、アルカリ法によりＤＮＡを回収しSangerらのジ
デオキシ鎖終止法を用い塩基配列を決定した。クローン
Ｃ10−Ｃ21，Ｃ10−Ｅ12，Ｃ10−Ｅ13，Ｃ10−Ｅ24及び
Ｃ10−Ｅ15の塩基配列及びそれから推定されるアミノ酸
配列は、夫々配列番号１，２，３，４及び５に示される
とおりであった。

【００４６】実施例４非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスｃＤＮＡでコードされるポリペ
ブチドの発現および精製 （ｉ） 発現プラスミドの構築 得られたクローンの１つであるＣ11−Ｃ21を大腸菌(E.
coli) 内でプロモーターの下流にｔｒｐＥとの融合ポリ
ペプチドとして発現させた。

【００４７】まず、Ｃ11−Ｃ21クローンをｐＵＣ119 に
組み込んで得られたプラスミドｐＵＣ・Ｃ11−Ｃ21 Ｄ
ＮＡ１ngを、２つのプライマー（５′−ＴＴＡＣＧＡＡ
ＴＴＣＡＴＧＧＧＣＡＣＧＡＡＴＣＣＴ−３′，５′−
ＴＴＡＡＴＣＧＡＴＧＡＣＣＴＴＡＣＣＣＡＣＡＴＴＧ
ＣＧ−３′）を用いＰＣＲ法を行う。ＰＣＲはGene Amp
TM(DNA Amplification Reagent Kit, Perkin Elmer Cet
us) のキットを用い、ＤＮＡ変性95℃、 1.5分、アニー
リング50℃、２分、ＤＮＡ合成70℃３分の条件で行い、
得られたＤＮＡ断片を 0.8％アガロース電気泳動により
分解し、グラスパウダー法で精製した。一方、ｐＵＣ11
8 を制限酵素ＳｍａＩで消化し、ＰＣＲ法によって得ら
れたＤＮＡ断片と緩衝液中でＴ４リガーゼにより連結
し、プラスミドｐＵＣ118 ・Ｃ11−Ｃ21・Ｓｍａを得
た。このプラスミドＤＮＡ１μｇを制限酵素反応液20μ
ｌ［150mＭ ＮａＣｌ，6mＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH7.
9)，6mＭ ＭｇＣｌ₂ 、15単位のＥｃｏＲＩ酵素および
15単位のＢａｍＨＩ酵素］中で37℃１時間消化反応を行
い、その後 0.8％アガロース電気泳動を行って約 380bp
のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片を分離し、これをグラス
パウダー法（Gene CleanTM，Ｂｉｏ−101 社）により精
製した。

【００４８】次に、発現ベクターであるＴｒｐ・Ｔｒｐ
ＥのＤＮＡ１μｇを反応液20ml［150mＭ ＮａＣｌ，6m
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH7.5)，6mＭ ＭｇＣｌ₂，15
単位のＥｃｏＲＩ酵素および15単位のＢａｍＨＩ酵素］
中37℃で１時間消化し、その反応液に水39μｌを加え、
70℃で５分間熱処理した後にバクテリアアルカリ性ホス
ファターゼ（ＢＡＰ）１μｌ（250単位／μｌ）を加え
て37℃で１時間保温した。この反応液にフェノールを加
えてフェノール抽出を行い、得られた水層をエタノール
沈澱し、沈澱物を乾燥した。得られたＥｃｏＲＩ−Ｂａ
ｍＨＩ処理ベクターＤＮＡ１μｇと上述のＣ11−Ｃ21Ｄ
ＮＡ断片を10×リガーゼ用バッファ［660mＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ（pH7.5) 66mＭ ＭｇＣｌ₂，100mＭジチオス
レイトール，1mＭ ＡＴＰ］５μｌ，Ｔ４リガーゼ１μ
ｌ(350単位／μｌ）に水を加えて50μｌとし、16℃で一
晩保温し、連結反応を行った。

【００４９】この反応液の10μｌを用いて大腸菌ＨＢ10
1 株を形質転換した。形質転換に用いる感受性大腸菌株
は、塩化カルシウム法［Mandel, M.とHiga, A., J. Mo
l. Biol. 53, 159-162 (1970)］により作られる。形質
転換大腸菌を25μｇ／mlのアンピシリンを含むＬＢ−プ
レート（１％トリプトン， 0.5％酵母エキス， 0.5％Ｎ
ａＣｌ， 1.5％寒天）上に塗布し、37℃に一晩保温し
た。プレート上に生じた菌のコロニーを一白金耳取り、
25μｇ／mlアンピシリンを含むＬＢ培地に移し、一晩37
℃で培養した。 1.5mlの菌培養液を遠心して集菌し、プ
ラスミドＤＮＡのミニプレパレーションをアルカリ法(M
aniatis ら Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
1982)により行った。得られたプラスミドＤＮＡ１μｇ
を反応液20μｌ［150mＭ ＮａＣｌ，6mＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ（pH7.5)，6mＭ ＭｇＣｌ ₂ ，15単位のＥｃｏＲ
ＩおよびＢａｍＨＩ酵素］中で37℃、１時間消化し、ア
ガロース電気泳動を行って、約 380ｂのＥｃｏＲＩ−Ｂ
ａｍＨＩ断片が生じるＴｒｐ・ＴｒｐＥ Ｃ11−Ｃ21発
現プラスミドを選別した。このプラスミドは大腸菌101
株に移入され、形質転換体と成して微工研菌寄第 11893
号として平成２年12月11月付で工業技術院微生物工業技
術研究所に寄託されている。

【００５０】（ii） クローンＣ11−Ｃ21でコードされ
るポリペプチドの発現および精製発現プラスミドＴｒｐ
・ＴｒｐＥ Ｃ11−Ｃ21をもつ大腸菌ＨＢ101 株を50μ
ｇ／mlのアンピシリンを含む３mlの２ＹＴ培地(1.6％ト
リプトン，１％酵母エキス， 0.5％ＮａＣｌ）に接種
し、37℃で９時間培養する。この培養液１mlを50μｇ／
mlのアンピシリンを含む 100mlのＭ９−ＣＡ培地(0.6％
Ｎａ₂ＨＰＯ₄， 0.5％ ＫＨ₂ＰＯ₄， 0.5％ ＮａＣ
ｌ， 0.1％ ＮＨ₄Ｃｌ，0.1mＭ ＣａＣｌ₂，2mＭ Ｍ
ｇＳＯ₄， 0.5％ カザミノ酸， 0.2％ グルコース）
に植え継ぎ、37℃で21時間培養した。更に、本培養液18
mlを 1.2ｌのＭ９−ＣＡ培地に植え継ぎ、37℃で培養し
た。ＯＤ600 ＝0.3のときに終濃度40mg／ｌになるよう
にインドールアクリル酸を加え、さらに16時間培養し
た。この培養液を遠心分離して菌体を集めた。菌体に20
mlのバッファＡ(50mＡ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH8.0)，1m
ＭＥＤＴＡ， 30mＭ ＮａＣｌ）を加えて懸濁し、再び
遠心分離を行って発現菌体 2.6ｇを得た。得られた菌体
をバッファＡ10ml中に懸濁し、超音破砕により大腸菌膜
を破砕した後に遠心分離を行い、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイル
スｃＤＮＡでコードされるポリペプチドとｔｒｐＥの融
合ポリペプチドを含む不溶性画分を得た。その画分に10
mlの６Ｍ尿素を含むバッファＡを加えて融合ポリペプチ
ドを可溶化抽出した。可溶化した抽出物をS-Sepharose
を用いたイオン交換カラムクロマトグラフィーに掛けて
ＮａＣｌの０Ｍから 0.5Ｍまでの濃度勾配により融合ポ
リペプチドの精製を行った。

【００５１】実施例５非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清中のＨＣＶ抗体の測定 （ｉ） ウェスタンブロット法による測定 実施例４により精製された発現産物をＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動［Laemmli, Nature 277, 680
(1970)]を行った後、常法に従ってニトロセルロースフ
ィルター（Bio-rad,Trans-blot) にブロッティングを行
った。このフィルターを３％ゼラチン溶液でブロッキン
グ後、正常人血清および非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清を４℃
で反応させる。洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ヒトＩｇ
Ｇ（ヤギ抗体）を反応させた。再びフィルターを洗浄
し、基質であるジアミノベンチジン溶液に浸し、発色を
確認した。図２に示したように正常人血清に対しては全
く反応していないが、患者血清に対しては強く反応し特
異的なバンドがみられた。

【００５２】 （ii） 酵素抗体測定法（ＥＬＩＳＡ法）による測定 ウエスタンブロット法より大量の血清を診断する手段の
１つとしてＥＬＩＳＡ法が使用できる。方法は常法を用
いて行い、精製抗原をＰＢＳ（−）で５μｇ／mlの濃度
に希釈し、４℃あるいは室温でマイクロプレートに固定
する。洗浄液で数回洗浄後、希釈被検血清を加え、37℃
あるいは室温で１時間インキュベートする。洗浄後、ペ
ルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ（ヤギ抗体）を加え37
℃あるいは室温で反応させる。更に数回洗浄し、ジアミ
ノベンチジン溶液を50μｌ加え、37℃で発色させる。 2
Ｍ Ｈ₂ＳＯ₄で発色を停止させ、比色計で測定を行っ
た。表１に示したように、現在上市されているカイロン
社のキット（オーソＨＣＶＡｂ ＥＬＩＳＡテスト）と
陽性率を比較したところ、カイロン社のものは69.7％で
あるのに対し、本発明による発現抗原を用いたものは8
4.8％の陽性率であった（表１）。

【００５３】

【表１】

【００５４】

【発明の効果】本発明によって得られたｃＤＮＡ配列
は、非Ａ非Ｂ型肝炎に特異的であり、これらの遺伝子を
微生物、例えば大腸菌等を利用した蛋白質発現系に組み
込むことによって産生されたポリペプチドは、多数の非
Ａ非Ｂ型肝炎患者の血清と反応するため、極めて感度の
よい且つ判定確度の高い診断キットを作製することがで
きる。また、これらを直接プローブとして用いたり、こ
れらの配列に基づいて特異性の高いプローブを合成した
りして、診断することも可能である。更に遺伝子増幅法
（ＰＣＲ）と組み合わせることによって診断や、非Ａ非
Ｂ型肝炎に特異的な遺伝子を得ることもできる。

【００５５】また、これらのポリペプチドは、非Ａ非Ｂ
型肝炎ウイルス抗原としての機能を有するため、ワクチ
ンとしてこのポリペプチドを免疫することにより非Ａ非
Ｂ型肝炎ウイルスの感染を防御できることも期待でき
る。更にまた、これらのポリペプチドをウサギ等に免疫
することにより、患者体内のウイルス検出、分離に有用
な抗体を得ることができる。

【００５６】

【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：３６９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to genomic RNA 配列 ATG GGC ACG AAT CCT AAA CCT CAA AGA AAA ACC AAA AGA AAC ACT AAC 48 Met Gly Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn 1 5 10 15 CGT CGC CCA CAA GAC GTT AAG TTT CCG GGC GGC GGC CAG ATC GTT GGC 96 Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly 20 25 30 GGA GTA TAC TTG TTG CCG CGC AGG GGC CCC AGA TTG GGT GTG CGC GCG 144 Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala 35 40 45 ACA AGG AAG ACT TCG AAG CGG TCC CAG CCA CGT GGG GGG CGC CGG CCC 192 Thr Arg Lys Thr Ser Lys Arg Ser Gln Pro Arg Gly Gly Arg Arg Pro 50 55 60 ATC CCT AAA GAT CGG CGC TCC ACT GGC AAG TCC TGG GGG AAA CCA GGA 240 Ile Pro Lys Asp Arg Arg Ser Thr Gly Lys Ser Trp Gly Lys Pro Gly 65 70 75 80 TAC CCC TGG CCC CTA TAT GGG AAT GAG GGA CTC GGC TGG GCA GGG TGG 28 8 Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Leu Gly Trp Ala Gly Trp 85 90 95 CTT CTG TCC CCC CGA GGT TCC CGT CCC TCT TGG GGC CCC ACT GAC CCC 336 Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro 100 105 110 CGG CAT AGG TCG CGC AAT GTG GGT AAG GTC ATC 369 Arg His Arg Ser Arg Asn Val Gly Lys Val Ile 115 120 配列番号：２配列の長さ：９３２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to genomic RNA 配列 CG CGC AAC TTG GGT AAG GTC ATC GAT ACC CTC ACA TGC GGC TTC GCC 47 Arg Asn Leu Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys Gly Phe Ala 1 5 10 15 GAC CTC ATG GGG TAC ATT CCG CTT GTC GGC GCC CCC CTA GGG GGT GCT 95 Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu Gly Gly Ala 20 25 30 GCC AGG GCC CTG GCA CAT GGT GTC CGG GTT CTG GAG GAC GGC GTG AAC 143 Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp Gly Val Asn 35 40 45 TAT GCA ACA GGG AAT TTG CCC GGT TGC TCT TTC TCT ATC TTC CTC TTG 191 Tyr Ala Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile Phe Leu Leu 50 55 60 GCT TTG CTG TCC TGT TTG ACC ATC CCA GCT TCC GCT TAT GAG GTG CGC 239 Ala Leu Leu Ser Cys Leu Thr Ile Pro Ala Ser Ala Tyr Glu Val Arg 65 70 75 AAC GTA TCC GGG ATA TAC CAT GTC ACG AAC GAC TGC TCC AAC TCA AGT 287 Asn Val Ser Gly Ile Tyr His Val Thr Asn Asp Cys Ser Asn Ser Ser 80 85 90 95 ATT GTG TAT GAG GCA GCG GAC ATG ATC ATG CAT ACC CCC GGG TGC GTG 335 Ile Val Tyr Glu Ala Ala Asp Met Ile Met His Thr Pro Gly Cys Val 100 105 110 CCC TGC GTT CGG GAG AAC AAC TCC TCC CGT TGC TGG GCA GCG CTC ACT 383 Pro Cys Val Arg Glu Asn Asn Ser Ser Arg Cys Trp Ala Ala Leu Thr 115 120 125 CCC ACG TTA GCG GCC AGG AAC ACC AGC GTC CCC ACT ACG ACA ATA CGA 431 Pro Thr Leu Ala Ala Arg Asn Thr Ser Val Pro Thr Thr Thr Ile Arg 130 135 140 CGG CAT GTC GAT TTG CTC GTT GGG GCG GCT GCT TTC TGC TCC GCT ATG 479 Arg His Val Asp Leu Leu Val Gly Ala Ala Ala Phe Cys Ser Ala Met 145 150 155 TAC GTG GGG GAT CTC TGT GGA TCT GTC TTC CTC GTT TCC CAG CTG TTC 527 Tyr Val Gly Asp Leu Cys Gly Ser Val Phe Leu Val Ser Gln Leu Phe 160 165 170 175 ACT TTC TCA CCT CGT CGG CAT GAG ACA GTA CAG GAC TGC AAC TGC TCA 575 Thr Phe Ser Pro Arg Arg His Glu Thr Val Gln Asp Cys Asn Cys Ser 180 185 190 ATC TAT CCC GGC CAC TTG ACA GGT CAT CGC ATG GCT TGG GAT ATG ATG 623 Ile Tyr Pro Gly His Leu Thr Gly His Arg Met Ala Trp Asp Met Met 195 200 205 ATG AAC TGG TCA CCT ACA ACA GCC CTA GTG GTG TCG CAT CTA CTC CGG 671 Met Asn Trp Ser Pro Thr Thr Ala Leu Val Val Ser His Leu Leu Arg 210 215 220 ATC CCA CAA GCT GTC ATG GAC ATG GTG GCG GGG GCT CAC TGG GGA GTC 719 Ile Pro Gln Ala Val Met Asp Met Val Ala Gly Ala His Trp Gly Val 225 230 235 CTA GCG GGC CTC GCC TAC TAT TCC ATG GTG GGG AAC TGG GCT AAG GTT 767 Leu Ala Gly Leu Ala Tyr Tyr Ser Met Val Gly Asn Trp Ala Lys Val 240 245 250 255 TTG ATT GTG ATG CTA CTC TTC GCC GGC GTT GAC GGG ACC ACC TAT GTG 815 Leu Ile Val Met Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp Gly Thr Thr Tyr Val 260 265 270 ACA GGG GGG ACG ACA GGC CGC ACC ACC AGC TCG TTC GCA TCC CTC TTT 863 Thr Gly Gly Thr Thr Gly Arg Thr Thr Ser Ser Phe Ala Ser Leu Phe 275 280 285 ACA CTT GGG TCG CAT CAG AAG GTC CAG CTT ATA AAT ACC AAT GGC AGC 911 Thr Leu Gly Ser His Gln Lys Val Gln Leu Ile Asn Thr Asn Gly Ser 290 295 300 TGG CAC ATC AAC AGG ACC GCC 932 Trp His Ile Asn Arg Thr Ala 305 310 配列番号：３配列の長さ：５５９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to genomic RNA 配列 CGC CGG TAT GAG ACG GCG CAA GAC TGC AAT TGC TCA CTC TAT CCC GGT 48 Arg Arg Tyr Glu Thr Ala Gln Asp Cys Asn Cys Ser Leu Tyr Pro Gly 1 5 10 15 CAC GTA TCT GGT CAC CGC ATG GCT TGG GAT ATG ATG ATG AAC TGG TCA 96 His Val Ser Gly His Arg Met Ala Trp Asp Met Met Met Asn Trp Ser 20 25 30 CCT ACA ACG GCC CTA GTG GTA TCG CAG CTA CTC CGG ATC CCA CAA GCC 144 Pro Thr Thr Ala Leu Val Val Ser Gln Leu Leu Arg Ile Pro Gln Ala 35 40 45 GTC GTG GAC ATG GTG GCG GGG GCC CAC TGG GGA GTC CTA GCG GGC CTT 192 Val Val Asp Met Val Ala Gly Ala His Trp Gly Val Ile Ala Gly Leu 50 55 60 GCC TAC TAT TCC ATG GTG GCG AAC TGG GCT AAG GTC TTG GTT GTG ATG 240 Ala Tyr Tyr Ser Met Val Ala Asn Trp Ala Lys Val Leu Val Val Met 65 70 75 80 CTA CTC TTT GCC GGC GTT GAC GAC GGG AAG ACC ACC GTG ACG GGG GGG 288 Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp Asp Gly Lys Thr Thr Val Thr Gly Gly 85 90 95 AGC GCA GCC TTC CAG TCC AGG AAG TTA GTG TCC TTC TTC TCA CCA GGG 336 Ser Ala Ala Phe Gln Ser Arg Lys Leu Val Ser Phe Phe Ser Pro Gly 100 105 110 CCG AAA CAA AAT ATC CAG CTT GAT AAC ACC AAC GGC AGC TGG CAC ATC 384 Pro Lys Gln Asn Ile Gln Leu Asp Asn Thr Asn Gly Ser Trp His Ile 115 120 125 AAC AGG ACT GCC CTG AAT TGC AAT GAC TCC CTC CAA ACT GGG TTC ATC 432 Asn Arg Thr Ala Leu Asn Cys Asn Asp Ser Leu Gln Thr Gly Phe Ile 130 135 140 GCT GCG CTG TTC TAC GCG CAC AAG TTC AAT TCG TCC GGA TGC CTA GAG 480 Ala Ala Leu Phe Tyr Ala His Lys Phe Asn Ser Ser Gly Cys Leu Glu 145 150 155 160 CGC ATG GCC AGC TGC CGC CCC ATT GAC AAG TTC GCG CAG GGG TGG GGT 528 Arg Met Ala Ser Cys Arg Pro Ile Asp Lys Phe Ala Gln Gly Trp Gly 165 170 175 CCC ATC ACT CAC GAT ACG CCT AAG ATC CCG G 559 Pro Ile Thr His Asp Thr Pro Lys Ile Pro 180 185 配列番号：４配列の長さ：２７６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to genomic RNA 配列 GA CAC CGT ATG GCA TGG GAC ATG ATG ATG AAC TGG TCG CCC ACG GCT 47 His Arg Met Ala Trp Asp Met Met Met Asn Trp Ser Pro Thr Ala 1 5 10 15 ACC ATG ATT CTG GCG TAT GTG ATG CGC ATC CCC GAG GTC GTC ATG GAC 95 Thr Met Ile Leu Ala Tyr Val Met Arg Ile Pro Glu Val Val Met Asp 20 25 30 ATC ATT GGC GGG GCT CAC TGG GGC GTC ATG TTC GGC TTG GGC TAT TTT 143 Ile Ile Gly Gly Ala His Trp Gly Val Met Phe Gly Leu Gly Tyr Phe 35 40 45 TCT ATG CAG GGG GCT TGG GCA AAA GTC GTT GTC ATC CTT CTG CTG GCC 191 Ser Met Gln Gly Ala Trp Ala Lys Val Val Val Ile Leu Leu Leu Ala 50 55 60 GCT GGG GTG GAT GCG ACT ACC CTC AGC GTT GGG GGC TCT GCC GCG CAC 239 Ala Gly Val Asp Ala Thr Thr Leu Ser Val Gly Gly Ser Ala Ala His 65 70 75 ACC ACC GGC GGC CTT GTC GGC TTG TTC AAG CCT GGC G 276 Thr Thr Gly Gly Leu Val Gly Leu Phe Lys Pro Gly 80 85 90 配列番号：５配列の長さ：７４２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to genomic RNA 配列 CG CTT GTC GGC GCC CCC CTA GGG GGT GCT GCC AGG GCC CTG GCA CAT 47 Leu Val Gly Ala Pro Leu Gly Gly Ala Ala Arg Ala Leu Ala His 1 5 10 15 GGT GTC CGG GTT CTG GAG GAC GGC GTG AAC TAT GCA ACA GGG AAT TTG 95 Gly Val Arg Val Leu Glu Asp Gly Val Asn Tyr Ala Thr Gly Asn Leu 20 25 30 CCC GGT TGC TCT TTC TCT ATC TTC CTC TTG GCT TTG CTG TCC TGT TTG 143 Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Leu 35 40 45 ACC ATC CCA GCT TCC GCT TAT GAG GTG CGC AAC GTA TCC GGG ATA TAC 191 Thr Ile Pro Ala Ser Ala Tyr Glu Val Arg Asn Val Ser Gly Ile Tyr 50 55 60 CAT GTC ACG AAC GAC TGC TCC AAC TCA AGT ATT GTG TAT GAG GCA GCG 239 His Val Thr Asn Asp Cys Ser Asn Ser Ser Ile Val Tyr Glu Ala Ala 65 70 75 GAC ATG ATC ATG CAT ACC CCC GGG TGC GTG CCC TGC GTT CGG GAG AAC 277 Asp Met Ile Met His Thr Pro Gly Cys Val Pro Cys Val Arg Glu Asn 80 85 90 95 AAC TCC TCC CGT TGC TGG GCA GCG CTC ACT CCC ACG TTA GCG GCC AGG 335 Asn Ser Ser Arg Cys Trp Ala Ala Leu Thr Pro Thr Leu Ala Ala Arg 100 105 110 AAC ACC AGC GTC CCC ACT ACG ACA ATA CGA CGG CAT GTC GAT TTG CTC 383 Asn Thr Ser Val Pro Thr Thr Thr Ile Arg Arg His Val Asp Leu Leu 115 120 125 GTT GGG GCG GCT GCT TTC TGC TCC GCT ATG TAC GTG GGG GAT CTC TGT 431 Val Gly Ala Ala Ala Phe Cys Ser Ala Met Tyr Val Gly Asp Leu Cys 130 135 140 GGA TCT GTC TTC CTC GTT TCC CAG CTG TTC ACT TTC TCA CCT CGT CGG 479 Gly Ser Val Phe Leu Val Ser Gln Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg Arg 145 150 155 CAT GAG ACA GTA CAG GAC TGC AAC TGC TCA ATC TAT CCC GGC CAC TTG 527 His Glu Thr Val Gln Asp Cys Asn Cys Ser Ile Tyr Pro Gly His Leu 160 165 170 175 ACA GGT CAT CGC ATG GCT TGG GAT ATG ATG ATG AAC TGG TCA CCT ACA 575 hr Gly His Arg Met Ala Trp Asp Met Met Met Asn Trp Ser Pro Thr 180 185 190 ACA GCC CTA GTG GTG TCG CAT CTA CTC CGG ATC CCA CAA GCT GTC ATG 623 Thr Ala Leu Val Val Ser His Leu Leu Arg Ile Pro Gln Ala Val Met 195 200 205 GAC ATG GTG GCG GGG GCC CAC TGG GGA GTC CTA GCG GGC CTT GCC TAC 671 Asp Met Val Ala Gly Ala His Trp Gly Val Leu Ala Gly Leu Ala Tyr 210 215 220 TAT TCC ATG GTG GGG AAC TGG GCT AAG GTT TTG ATT GTG ATG CTA CTC 719 Tyr Ser Met Val Gly Asn Trp Ala Lys Val Leu Ile Val Met Leu Leu 225 230 235 TTC GCC GGC GTT GAC GGG ACC AC 742 Phe Ala Gly Val Asp Gly Thr 240 245

【図面の簡単な説明】

【図１】発現プラスミドＴｒｐ・ＴｒｐＥ Ｃ11−Ｃ21
の構築方法を示す。

【図２】発現産物と正常人血清または非Ａ非Ｂ型肝炎患
者血清との免疫反応性をウエスタンブロット法により調
べた結果を示す写真である。

【図３】表１のＥＬＩＳＡの陽性数を図に書き換えたも
のである。

フロントページの続き (72)発明者 小原 道法 埼玉県入間郡大井町西鶴ケ岡１−３−１ 東燃株式会社総合研究所内 (56)参考文献 Ｊａｐａｎ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．, 60（1990）ｐ．167−177 Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒ ｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，170（1990）ｐ. 1021−1025 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/09 ZNA C07K 14/18 G01N 33/53 G01N 33/576 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ ＭＥＤＬＩＮＥ

Claims (7)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１に記載のアミノ酸配列からな
   る事を特徴とする非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原蛋白質。
2. 【請求項２】 配列番号１に記載のアミノ酸配列からな
   る蛋白質を一構成部分とする融合型非Ａ非Ｂ型肝炎ウイ
   ルス抗原蛋白質。
3. 【請求項３】 配列番号１に記載の蛋白質とｔｒｐＥと
   からなる請求項２に記載の融合型非Ａ非Ｂ型肝炎ウイル
   ス抗原蛋白質。
4. 【請求項４】 請求項１に記載の非Ａ非Ｂ型肝炎ウイル
   ス抗原蛋白質をコードするＤＮＡ。
5. 【請求項５】 請求項２または請求項３に記載の融合型
   非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原蛋白質をコードするＤＮ
   Ａ。
6. 【請求項６】 請求項４または請求項５のいずれかに記
   載のＤＮＡをプロモーターの下流に存在するベクター内
   のクローニング部位に導入して得られる発現ベクター。
7. 【請求項７】 宿主を、請求項６に記載の発現ベクター
   で形質転換して得られる形質転換微生物。