JPH06303980A - 非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子ｃＤＮＡおよび抗原ポリペプチド - Google Patents

非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子ｃＤＮＡおよび抗原ポリペプチド

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JPH06303980A
JPH06303980A JP3178925A JP17892591A JPH06303980A JP H06303980 A JPH06303980 A JP H06303980A JP 3178925 A JP3178925 A JP 3178925A JP 17892591 A JP17892591 A JP 17892591A JP H06303980 A JPH06303980 A JP H06303980A
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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】 非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子ｃＤＮＡ、お
よびその少くとも一部によってコードされる非Ａ非Ｂ型
肝炎ウイルス抗原ペプチドを提供し、非Ａ非Ｂ型肝炎の
診断剤およびワクチンの製造を可能にする。 【構成】 塩基配列第１番から第９４１６番の非Ａ非Ｂ
型肝炎ウイルス遺伝子の塩基配列の全領域をカバーする
単離された該ウイルス遺伝子ｃＤＮＡ、およびそのコー
ディング領域である塩基番号第３３３番から第９３６２
番の塩基配列の少くとも一部によってコードされる非Ａ
非Ｂ型肝炎ウイルス抗原ポリペプチドが提供される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上利用の分野】本発明は、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイル
ス遺伝子ｃＤＮＡおよび非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原ポ
リペプチドに関するものである。更に詳しくは、本発明
は非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原ポリペプチドの産生に有
用な非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子ｃＤＮＡおよびその
発現産物である非Ａ非Ｂ型肝炎抗原ポリペプチドに関す
るものである。本発明の非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子
ｃＤＮＡは、また、非Ａ非Ｂ型肝炎の遺伝子診断剤とし
て有用である。更に本発明の非Ａ非Ｂ型肝炎抗原ポリペ
プチドは非Ａ非Ｂ型肝炎ワクチンや免疫グロブリン、ポ
リクローナル又はモノクローナル抗体、免疫学的診断
剤、輸血用血液のスクリーニング剤およびアフィニティ
ーカラムクロマトグラフィーによる輸血用血液中のＮＡ
ＮＢＶ除去剤等の製造に有用である。
【０００２】
【従来の技術とその問題点】
〔非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスの定義〕：周知の通り、ウイ
ルス性肝炎は肝炎ウイルスの感染に因り生じる肝疾患で
あり、該病原ウイルスとしては現在、Ａ型、Ｂ型、およ
びＤ型（デルタ）の各肝炎ウイルスが分離同定されてい
る。尚、Ｄ型肝炎ウイルス（デルタ肝炎ウイルス）は、
単独では増殖不能の欠損ウイルスであり、その増殖には
常にヘルパーウイルスとしてＢ型肝炎ウイルスを要する
ため、Ｂ型肝炎患者においてのみ存在する。ところが、
１９７４年にＡ型並びにＢ型各肝炎ウイルスの両感染に
因らないウイルス性肝炎例の多数存在することが初めて
報告された。これらの肝炎は「非Ａ非Ｂ型肝炎」と命名
され、これに関する研究が世界各地で精力的に進められ
るに至った。現在、非Ａ非Ｂ型肝炎の病原ウイルスは数
種類存在することが認められている。今日までの報告に
よれば、非Ａ非Ｂ型ウイルスはその感染経路により２つ
の型に大別される。すなわちそれらは、流行性肝炎ウイ
ルス即ち水や食物を介して伝染する経口感染型非Ａ非Ｂ
型肝炎ウイルス（ｅｎｔｅｒｉｃａｌｌｙ−ｔｒａｎｓ
ｍｉｔｔｅｄ ｎｏｎ−Ａ，ｎｏｎ−Ｂ）；および輸血
等により血液を介して伝染する血液伝播型非Ａ非Ｂ型肝
炎ウイルス〔ｂｌｏｏｄ−ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ ｎ
ｏｎ−Ａ，ｎｏｎ−Ｂ〕である。該非Ａ非Ｂ型肝炎に関
しては、アフリカ、インド、東南アジアを侵淫地とする
既にウイルス学的に確定済みの経口性非Ａ非Ｂ型肝炎ウ
イルスを除き血液伝播型非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスは未だ
確定されていない。これより血液伝播型非Ａ非Ｂ型肝炎
を「ＮＡＮＢ型肝炎」と略し、血液伝播型非Ａ非Ｂ型肝
炎ウイルスを「ＮＡＮＢＶ」と略する。
【０００３】〔ＮＡＮＢ型肝炎研究の現状と課題〕：Ｎ
ＡＮＢ型肝炎の疫学、臨床、診断、治療、予防に関する
ウイルス学上の研究は、ＮＡＮＢＶと他の肝炎ウイルス
との比較の下で、診断学、組織病理学、免疫学、分子生
物学等の知識に基づき、世界各地で進められてきた［日
本医事新報、Ｎｏ．３３２０、３−１０、１９８７年；
医学のあゆみ、１５１（１３），７３５−９２３，１９
８９；肝胆膵，２１（１），５−１１３，１９９０；実
験医学，８（３），２０１−２３３，１９９０］。ＮＡ
ＮＢ型肝炎に関しては、下記の通り報告されている。
【０００４】（イ）疫学：日本のＮＡＮＢ型肝炎患者数
は厚生省の推計によれば、慢性肝炎患者の約６０％（約
７２万人）、肝硬変患者の約４０％（約１０万人）、お
よび肝癌患者の約４０％（約７千人）であり、これによ
る死亡者数は毎年１６，０００人に達している。また、
米国では年間１５万〜３０万例の輸血後肝炎が発生し、
その９０％が該ＮＡＮＢ型肝炎であり、更に、供血者の
１〜６％がＮＡＮＢＶキャリアーだと考えられている。
その他の諸外国でも、米国および日本と同程度またはそ
れ以上の発症率並びにキャリアー率であると推定される
ため、ＮＡＮＢ型肝炎の予防、早期診断および治療法の
確立は、世界的に極めて重要である。
【０００５】（ロ）ウイルス学：現在までに既報のＮＡ
ＮＢＶは、エンベロープを有する直径約５０ｎｍの球状
ウイルス粒子であり、ウイルス分類学上トガウイルス、
フラビウイルスに近似しているか、あるいは全く新しい
タイプのウイルスと考えられている。また、ＮＡＮＢ型
肝炎患者血清を静脈内接種した複数のチンパンジー肝細
胞における細胞質内管状構造形成の有無や核内粒子出現
の病理学的所見、疫学的所見、クロロホルム感受性の有
無および、免疫学的診断等に基づき、複数のＮＡＮＢＶ
の存在が示唆されている（例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２
０５，１９７−２００，１９７９；Ｊｏｕｒｎａｌ ｏ
ｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ，１４８，
２５４−２６５，１９８３；微生物、５（５）、４６３
−４７５、１９８９）。特に、Ａ型肝炎患者の尿中に存
在するＡ型ウイルス量、あるいはＢ型肝炎患者の血中存
在するＢ型肝炎ウイルス量に比べ、ＮＡＮＢ型肝炎患者
の血中ＮＡＮＢＶ量は極端に少ない。例えば、Ｃｈｉｍ
ｐａｎｚｅｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｏｓｅｓ（Ｃ
ＩＤ）感染において、患者の血中Ｂ型肝炎ウイルス量は
１０8−１０9／ｍｌであるが，同感染において患者の血
中ＮＡＮＢＶ量は１０4−１０5／ｍｌである（Ｂｒａｄ
ｌｅｙ Ｄ.Ｗ.：Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｐｅｒｓｐｅｃｔ
ｉｖｅｓ ｉｎ ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ
ｎｏｎ−Ａ，ｎｏｎ−Ｂ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ， ｉｎ
“Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｎｄ
Ｂｌｏｏｄ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ”ｅｄｉｔｅｄ
ｂｙＤｏｄｄ Ｒ．Ｙ．＆ Ｂａｒｋｅｒ，Ｌ．Ｆ；Ａ
ｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，
８１−９７，１９８５）。更にヒト以外の感染実験系に
関し、ＮＡＮＢＶ感染により肝細胞質内に典型的な細胞
質内管状構造を形成するチンパンジーのみが感受性動物
として知られている現状では、研究には多数頭のチンパ
ンジーを要することになる。しかしチンパンジーは希少
かつ高価であるため、必然的にＮＡＮＢＶに係る感染実
験、同定、有用なマーカーの発見が制限および遅延され
ている。それゆえ、かかる問題を打開するため、ＮＡＮ
ＢＶ研究に係る様々な戦略が試みられている。例えば、
ＮＡＮＢ型肝炎発症チンパンジーの血漿からＣ型肝炎ウ
イルス（ＨＣＶ）と称するＮＡＮＢＶ遺伝子ｃＤＮＡを
クローン化し（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４，３５９−３６
２，１９８９）、更に、該遺伝子を発現させて得たＣ−
１００と称する抗原がＮＡＮＢ型肝炎患者の血中抗体と
抗原抗体反応することを確認し（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４
４，３６２−３６４，１９８９）、上例のようにチンパ
ンジーを用いることなく、ＮＡＮＢ型肝炎患者血漿から
直接ＮＡＮＢＶ遺伝子ｃＤＮＡをクローン化し、斯かる
遺伝子を発現させて得た抗原がＮＡＮＢ型肝炎患者血清
の抗体と抗原抗体反応を生じることを確認した（Ｇａｓ
ｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｉａ Ｊａｐｏｎｉｃａ，２
４，１１２０−１１２４，および１１３０−１１３３，
１９８９）。
【０００６】（ハ）臨床：一般に肝炎は、発生の集団と
頻度により流行性肝炎や散発性肝炎、また、重症度や病
期に基づき、急性肝炎、劇症肝炎、亜急性肝炎、持続性
肝炎、慢性肝炎等に分類されている。ＮＡＮＢ型肝炎の
潜伏期は２〜２６週であり、その初期症状はＢ型肝炎に
比し発熱、倦怠感などを伴う程度で軽く、７０％が無黄
疸であるため、見過ごす確率が高い。しかし、ＮＡＮＢ
型肝炎の特徴とその恐ろしさは慢性化し易く更に、肝硬
変へと移行することにある。例えば、血清中のアミノト
ランスフェラーゼ活性の上昇が観察されたＮＡＮＢ型肝
炎例のうち、４０〜５０％の率で慢性化が起こり、慢性
化した症例のうち１０〜２０％が肝硬変である。また、
受血者の年間０．５〜１％が自覚症状なしに肝硬変へと
進展する。不幸にも、更に進めば、肝細胞癌ないしは肝
癌に陥ると考えられている。従って、輸血のみならず出
血に係るバイオハザード防止のため、ＮＡＮＢ型肝炎の
根絶は公衆衛生上の観点から世界的に極めて重要であ
る。
【０００７】（ニ）診断：上述の通り、ＮＡＮＢＶ（血
液伝播型）は未だ同定されておらず、診断用のＮＡＮＢ
Ｖ抗原のようなウイルスマーカーが知られていないの
で、ＮＡＮＢ型肝炎の診断はＡ型とＢ型両肝炎、サイト
メガロ、ＥＢ、水痘、単純ヘルペス等の起炎性の各既知
ウイルスに特定な患者の血清中の抗体価の検査に基づく
除外診断、および肝生検による組織病理学的診断に頼ら
ざるを得ない（Ｓ．Ｓｈｅｎｌｏｃｋ，Ｄｉｓｅａｓｅ
ｏｆ ｔｈｅ ｌｉｖｅｒ ａｎｄ ｆｉｌｉａｒｙ
ｓｙｓｔｅｍ，８，３２６−３３３，Ｂｌａｃｋｗｅ
ｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ
ｓ．１９８９）。そして、これ等と平行して例えば血清
酵素、ＧＰＴ〔グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナ
ーゼ；別名：ＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラー
ゼ）〕、ＧＯＴ〔（グルタミン酸オキザロ酢酸トランス
アミナーゼ；別名：ＡＳＴ（アスパラギン酸アミノトラ
ンスフェラーゼ）〕、グアニンデアミナーゼ（別名：グ
アナーゼ）等の活性の測定（肝胆膵、第１４巻、５１９
−５２２、１９８７年）；上記の血清中のＧＰＴないし
はＧＯＴ活性の経時的異常高値の継続に基づくＮＡＮＢ
型肝炎の診断基準（日本輸血学会誌、３１（４）、３１
６−３２０、１９８５；日本臨壯、４６、２６３５、１
９８８）等が日本で採用されている。また、免疫学的診
断に関しては、上述の通りＮＡＮＢＶの分離と同定が困
難な現状では、遺伝子工学的技術や免疫学的知識を駆使
して分離したＮＡＮＢＶｃＤＮＡのクローンを発現させ
ることにより得られる抗原とＮＡＮＢ型肝炎患者血清と
の間の抗原抗体反応が基準として採用されている。例え
ば、抗原として、ＮＡＮＢ型肝炎患者血漿に由来のＮＡ
ＮＢＶｃＤＮＡ発現産物（欧州公開特許公報第３６３０
２５号）、ＮＡＮＢ型肝炎発症チンパンジー血漿に由来
のＨＣＶｃＤＮＡ発現産物（欧州公開特許公報第３１８
２１６号、又は特開平２−５００８８０）、ＮＡＮＢＶ
感染チンパンジー肝に由来のＮＡＮＢＶｃＤＮＡ発現産
物（欧州公開特許公報第２９３２７４号、又は特開昭６
４−２５７６および特開平１−１２４３８７）等が公知
であり、また、抗原抗体反応測定方法として、ＲＩＡ
（ラジオイムノアッセイ）、ＥＩＡ（エンザイムイムノ
アッセイ）が常用されている。しかし、かかる発現産物
の抗原性は互いに共通性に乏しく、また、例えば、前述
ＨＣＶｃＤＮＡの発現産物即ち前述Ｃ−１００抗原は、
ＨＣＶ感染による慢性肝炎診断の一応の指標と目安には
なるが、抗原性を呈する反応領域が狭いため（微生物、
５、４６３−４７５、１９８９；肝胆膵、２０、４７−
５１、１９９０；医学のあゆみ、１５１、８７１、１９
８９）、治療に要するＮＡＮＢ型肝炎ないしはＮＡＮＢ
Ｖ感染の確定診断、慢性肝炎および急性肝炎の経過の確
定には不十分であると考えられる。従って、ＮＡＮＢ型
肝炎の確実な診断および予知方法の獲得が望まれてい
る。
【０００８】（ホ）治療と予防：最近、慢性ＮＡＮＢ型
肝炎の治療におけるαおよびβインターフェロンの有用
性が報告されている（肝胆膵、２０、５９−６４、１９
９０；医学のあゆみ、１５１、８７１−８７６、１９８
９）。しかし、適切な投与量、投与期間等に関しては未
だ確定されていない。一方、ＮＡＮＢ型肝炎の予防剤、
例えば、ワクチンについては、前述の従来のＮＡＮＢＶ
ｃＤＮＡの発現産物（欧州公開特許公報第３６３０２５
号）およびＨＣＶｃＤＮＡの発現産物（欧州公開特許公
報第３１８２１６号）等が抗原として用いられている。
しかし、ＮＡＮＢＶそれ自体が本発明完成以前には未だ
に単離同定されていない事から明らかのように、多様な
抗原決定基（エピトープ）を有する上記発現産物からＮ
ＡＮＢＶワクチン用抗原を特定すること、およびかかる
特定抗原を臨床的に用いるためにその有効性と安全性を
確定することは不可能であった。従って、ＮＡＮＢＶワ
クチンは有利に実用されるには至っていない。
【０００９】
【問題を解決するための手段】本発明者等は、新規ＮＡ
ＮＢＶ遺伝子ｃＤＮＡを開発することにより前述の課題
を克服するため鋭意研究を重ねた結果、公知のＮＡＮＢ
ＶｃＤＮＡに比し優れて信頼性が高く、しかも、現在の
ＮＡＮＢＶｃＤＮＡでは最長鎖であり、該遺伝子のオー
プンリーディングフレーム全領域を有するＮＡＮＢＶ遺
伝子ｃＤＮＡをクローン化すると共に、かかるｃＤＮＡ
クローンを発現させることにより、慢性のみならず急性
のＮＡＮＢ型肝炎患者血清とも確実に特異的に抗原抗体
反応を呈するＮＡＮＢＶ抗原の獲得に成功した。かかる
成功は、真正な（ａｕｔｈｅｎｔｉｃ）ＮＡＮＢＶ遺伝
子を獲得するために、血中あるいは切除肝細胞片中のＮ
ＡＮＢＶ量が著しく低い、すなわちＡ型あるいはＢ型肝
炎のそれに比し約１万分の１であるにもかかわらず、Ｎ
ＡＮＢＶの分離を困難にすると考えられている未知の迷
入因子を有するチンパンジーを用いてＮＡＮＢＶを増幅
することなく、ＮＡＮＢ型肝炎患者の全血あるいはＮＡ
ＮＢ型肝炎に合併の肝癌患者の切除肝細片に含まれるＮ
ＡＮＢＶ粒子から直接ＮＡＮＢＶのＲＮＡを抽出すると
いう本発明者らの独特な技術によるものであり、またこ
れは、新鮮な遺伝子分離材料の保存期間中にＮＡＮＢＶ
とその遺伝子が体液や血中の酵素により開裂・分解され
ないような細心の操作を伴うことによるものである。こ
のようにしてヒト由来の新鮮材料から調整したＲＮＡを
逆転写酵素を用いて二本鎖ｃＤＮＡとし、ｃＤＮＡライ
ブラリーを得、次いで、該ｃＤＮＡライブラリーからＮ
ＡＮＢＶ遺伝子をスクリーニングするため、各ｃＤＮＡ
をそれぞれラムダｇｔ１１ファージベクターに挿入し、
ファージプラーク上に高濃度に発現させた後、かかる発
現産物と急性ＮＡＮＢ型肝炎回復期患者血清および慢性
ＮＡＮＢ型肝炎患者血清とを用いるエンザイムイムノア
ッセイ（ＥＩＡ）を繰り返し行なうことにより、ＮＡＮ
ＢＶ遺伝子ｃＤＮＡをスクリーニングすることに成功し
た。このようにして、バイオハザードを生じることなく
大量かつ安価に精製されたＮＡＮＢＶ抗原ポリペプチド
の着実な産生が、組換えＤＮＡ技術を用いた本発明ｃＤ
ＮＡの発現により初めて認められた。本発明はこれ等の
知見に基づいて完成されたものである。
【００１０】従って、本発明は、ＮＡＮＢ型肝炎ウイル
ス遺伝子ｃＤＮＡの提供を目的とする。さらに本発明
は、ＮＡＮＢ型肝炎に対する診断剤およびワクチンの有
効成分として有用なＮＡＮＢ型肝炎ウイルス抗原ポリペ
プチドの提供を目的とする。さらに本発明は、ＮＡＮＢ
Ｖ抗原ポリペプチドの産生方法の提供を目的とする。
また本発明は、ＮＡＮＢ型肝炎に対する診断剤の提供を
目的とする。またさらに本発明は、ＮＡＮＢ型肝炎に対
するワクチンの提供を目的とする。本発明の上記および
他の諸目的、諸特徴および諸利点は、添付の図面を参照
して行った以下の詳細な説明と特許請求の範囲の記載か
ら明らかになろう。
【００１１】基本的に、本発明によれば、図２−１から
図２−１６に示す塩基番号第１番から第９４１６番の非
Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスの全塩基配列の少なくとも一部を
含む第一の塩基配列および第一の塩基配列に相補的な塩
基配列からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基配
列を包含するか、または第一の塩基配列の少なくとも１
つの塩基を遺伝子コドンの縮重により置換して得られる
少なくとも１つの塩基配列を包含する単離されたデオキ
シリボ核酸が提供される。
【００１２】また本発明の他の態様によれば、図２−１
から図２−１６に示される非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスの全
塩基配列の塩基番号第３３３番から９３６２番のコーデ
ィング領域を含むデオキシリボ核酸によりコードされる
アミノ酸配列の少なくとも一部を含むアミノ酸配列を含
有する、単離された抗原ポリペプチドが提供される。
【００１３】本発明において、特にことわらない限り、
デオキシリボヌクレオチドの配列の左端と右端は、それ
ぞれ５’末端と３’末端である。また、特にことわらな
い限り、ペプチドのアミノ酸配列の左端と右端は、それ
ぞれＮ末端とＣ末端である。本発明のＮＡＮＢＶ遺伝子
ｃＤＮＡおよびその発現産物としてのＮＡＮＢＶ抗原ポ
リペプチドは、以下の工程（Ｉ）〜（VII）に従って調
製し同定することができる。
【００１４】（Ｉ）ＮＡＮＢＶ遺伝子のＲＮＡ抽出材料
の選別と採取：ＮＡＮＢＶのＲＮＡの抽出材料として
は、ＮＡＮＢＶのキャリアーあるいはこれに羅患したヒ
トまたはチンパンジーの血液、リンパ液、腹水、肝細
胞、およびＮＡＮＢ型肝炎に合併した肝細胞癌または肝
癌患者の肝細胞が使用できる。特に、チンパンジー由来
の材料中にはＮＡＮＢＶがヒトのそれに比し相対的に少
量であり、ＮＡＮＢＶの分離を困難にすると見なされて
いる未知因子が含まれるため、ヒト由来材料の使用が望
ましい。血液、リンパ液、腹水および肝細胞の中では、
血液が最も容易に、大量に得ることができ、例えば、輸
血用血液として使用に耐えない血液を血液銀行から大量
に入手することができる。このような血液は、ＮＡＮＢ
ＶのＲＮＡ抽出材料として、有利に使用することが可能
である。血液を材料として用いる場合は、まず血液を血
漿と赤血球に分別し、このようにして得られた血漿が、
Ｂ型肝炎ウイルスの表面抗原（ＷＨＯ ｅｘｐｅｒｔ
ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ ｖｉｒａｌ ｈｅｐａｔｉ
ｔｉｓ：Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｖｉｒａｌ ｈｅｐ
ａｔｉｔｉｓ，ＷＨＯ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｒｅｐｏ
ｒｔ Ｓｅｒｉｅｓ，６０２，２８−３３，１９７７）
およびＢ型肝炎ウイルスの遺伝子ＤＮＡ（Ｂｒｅｃｈｏ
ｔ， Ｃ；Ｈａｄｃｈｏｕｅｌ，Ｍ；Ｓｃｏｔｔｏ，
Ｊ；Ｄｅｇｏｓ，Ｆ；Ｃｈａｒｎａｙ，Ｐ；Ｔｒｅｐ
ｏ，Ｃ；Ｔｉｏｌｌａｉｓ，Ｐ：Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ＤＮＡ
ｉｎ ｌｉｖｅｒ ａｎｄ ｓｅｒｕｍ：ａ ｄｉｒｅ
ｃｔ ａｐｐｒａｉｓａｌ ｏｆ ｔｈｅ ｃｈｒｏｎ
ｉｃ ｃａｒｒｉｅｒ ｓｔａｔｅ．Ｌａｎｃｅｔ，
２，７６５−７６８，１９８１）に陰性であるか否かを
決定し、また該血漿を、ＮＡＮＢ型肝炎の診断の目安と
して採用されている血清酵素、例えば、ＧＰＴ（Ｗｒｏ
ｂｌｅｗｓｋｉ，Ｆ．＆ ＬａＤｕｅ，Ｊ．Ｓ．：Ｓｅ
ｒｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃ−ｐｙｒｕｖｉｃ ｔｒａｎ
ｓａｍｉｎａｓｅ ｉｎ ｃａｒｄｉａｃ ａｎｄｈｅ
ｐａｔｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘ
ｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，９１，５６９，１９５
６．）、ＧＯＴ、グアナーゼ等の活性に関して検査す
る。上記の血液を血漿と赤血球に分別しまた該血漿を検
査するという工程を、種々の血液について行い、Ｂ型肝
炎ウイルスの表面抗原および遺伝子ｃＤＮＡの両方に陰
性で、かつ上記酵素の活性が異常高値、例えば、ＧＰＴ
活性が３５ＩＵ／ｌ以上の血漿をプールする。
【００１５】血中のＮＡＮＢ型肝炎ウイルス粒子数は、
前述のＢ型肝炎ウイルス粒子数に比し非常に少ない。感
染実験の結果から（Ｂｒａｄｌｅｙ，Ｄ．Ｗ．：Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｉｎ ｐｏｓ
ｔ−ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎｎｏｎ−Ａ，ｎｏｎ−Ｂ
ｈｅｐａｔｉｔｉｓ： “Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，Ｉｍｍ
ｕｎｉｔｙ ａｎｄ Ｂｌｏｏｄ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉ
ｏｎ”ｅｄｉｔｅｄｂｙ Ｄｏｄｄ，Ｒ．Ｙ．＆ Ｂａ
ｒｋｅｒ，Ｌ．Ｆ．，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎ
ｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，８１−９７，１９８５）、Ｎ
ＡＮＢ型肝炎ウイルス粒子数は、Ｂ型肝炎ウイルス粒子
数の約１万分の１であることが予想されるので、該ＲＮ
Ａの抽出には大量の、例えば、約３〜１０ｌの血液の使
用が望ましい。そしてこの新鮮全血は、ウイルス粒子か
らＮＡＮＢＶのＲＮＡを抽出する材料として用い、ＮＡ
ＮＢＶとその遺伝子の変性および酵素による遺伝子の開
裂・分解を避けるため、１〜５℃に保存し、また、新鮮
全血採取後４８〜７２時間以内に下記工程（ＩＩ）によ
りＮＡＮＢＶのＲＮＡの調製を完了することが望まし
い。。また、肝細胞を材料として用いる場合は、ＮＡＮ
Ｂ慢性肝炎に合併した肝細胞癌または肝癌患者から得ら
れる非癌部および癌部の切除肝組織片それぞれ約１〜３
ｇを有利に使用することができる。材料として用いる肝
細胞は、例えば−７０℃に凍結保存する。
【００１６】（ＩＩ）ＮＡＮＢＶのＲＮＡの調製：上記
（Ｉ）で得られた材料から、公知の手段によりＲＮＡを
抽出および精製することができる。例えば、新鮮全血を
材料として用いる場合は、血液約２〜１０ｌを低速遠心
にかけ、上清の血漿画分を採取し、この血漿からウイル
ス画分を精製して得た後、下記のＲＮＡ抽出精製工程に
供する。
【００１７】一方、肝細片をＮＡＮＢＶのＲＮＡ抽出材
料として用いる場合は、その体積の約５〜３０倍容の下
記のＲＮＡ分解酵素阻害剤を含む希釈液を肝組織に添加
の後、公知の手段、例えば、ホモジナイザー等より、肝
組織を破砕ないし磨砕することにより、肝細胞のホモジ
ェネートを得る。尚、希釈液としては、１０〜１５０ｍ
Ｍの公知の緩衡液を使用することができる。次いで、こ
れを低速遠心にかけ、上清を採取した後該上清をＲＮＡ
抽出精製の原液として用いる。ＲＮＡの抽出精製には公
知の方法、例えば、ヘパリン、ジエチルピロカルボネー
ト、グアニジンチオシアネート等のＲＮＡ分解酵素阻害
剤と界面活性剤、キレート剤または蛋白変性を増強する
還元剤との混合液を用いる抽出法；蔗糖、セシウムクロ
ライド、セシウムトリクロロ酢酸、フィコール［Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ＡＢ社
（スウェーデン）］等を勾配の溶質として用いる密度勾
配遠心による分画法；ｍＲＮＡが特異的に有する３’末
端のポリＡ鎖を利用するアフィニティーカラムによる分
離法；ポリソーム上で合成された蛋白に対し特定の抗体
を用いる免疫沈降によりｍＲＮＡ結合ポリソームを得る
分別法；２相分配の原理に基づくフェノール抽出法；ポ
リエチレングリコール、デキストラン硫酸、アルコール
等による沈殿法を個別に、または組み合わせて使用する
ことができる。尚、上記のＮＡＮＢＶのＲＮＡの抽出と
精製工程は、ＲＮＡの不可逆的変性を避けるためｐＨ３
〜１０での実施が望ましい。
【００１８】（ＩＩＩ）ＮＡＮＢＶのＲＮＡからの二本
鎖ｃＤＮＡの調製：先に得られたＮＡＮＢＶのＲＮＡを
使用し、常法によりｃＤＮＡを調製することができる。
即ち、プライマーとしてオリゴデオキシチミジンおよび
ランダムヘキサヌクレオチドプライマーと逆転写酵素を
用い、該ＮＡＮＢＶのＲＮＡを鋳型として用いてそれに
相補的なｃＤＮＡを合成し、互いに相補的に結合した該
ｃＤＮＡと該ＮＡＮＢＶのＲＮＡからなる二本鎖を得、
次いで、これにリボヌクレアーゼＨを作用させて該ＮＡ
ＮＢＶのＲＮＡを分解し該ｃＤＮＡから除去した後、こ
の一本鎖ｃＤＮＡを鋳型としてＤＮＡ合成酵素により二
本鎖ｃＤＮＡを合成する。二本鎖ｃＤＮＡ合成は、市販
のｃＤＮＡ合成キット、例えば、ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈ
ｅｓｉｓＳｙｓｔｅｍ Ｐｌｕｓ（登録商標）〔Ａｍｅ
ｒｓｈａｍ社（英国）製〕、ｃＤＮＡ Ｓｙｓｔｅｍ
Ｋｉｔ（登録商標）〔Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ社
（スウェーデン）製〕、ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ
Ｋｉｔ（登録商標）〔Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎ
ｎｈｅｉｍ ＧｍｂＨ社（独）製〕等を用いて容易に実
施することができる。合成したｃＤＮＡが少量の場合に
は、常法のＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ
Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法（Ｅｒｌｉｃｈ，Ｈ．Ａ．：
“ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ
Ｐｒｅｓｓ，１９８９）により、ＰＣＲ用キットのＡｍ
ｐｌｉＴａｑ〔Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ
社（米国）製〕）を用いて増幅することができる。
【００１９】（ＩＶ）ｃＤＮＡライブラリーの作成：
（ＩＩＩ）で調製したｃＤＮＡを使用し、常法によりｃ
ＤＮＡライブラリーを作成する。すなわち、（ＩＩＩ）
で調製したｃＤＮＡを種々の長さを有する断片に切断
し、得られた様々の各ｃＤＮＡ断片を組換え可能なクロ
ーニングベクターに連結することによりｃＤＮＡライブ
ラリーを得る。組換え可能なクローニングベクターとし
ては、例えば、ファージ遺伝子、コスミド、プラスミド
および動物ウイルス遺伝子等の公知または市販のベクタ
ーを使用することができる。組換え可能なベクターとし
てファージ遺伝子またはコスミドを使用する場合には、
夫々のｃＤＮＡ断片を個別に挿入した該ベクターの高度
の安定化および形質転換体の出現率を達成するため、常
法により試験管内パッケージングを行い、各ｃＤＮＡが
挿入ベクターを組換えファージ粒子の形で得た後、これ
等のファージ粒子ｃＤＮＡライブラリーとしてｃＤＮＡ
のクローニングに供する。一方、組み換え可能なベクタ
ーとしてプラスミドを使用する場合には、上述の各ｃＤ
ＮＡ断片をプラスミドベクターに挿入し、これ等のｃＤ
ＮＡ挿入ベクターを常法に従って夫々大腸菌、枯草菌、
酵母等の宿主細胞に移入して得た形質転換体をｃＤＮＡ
ライブラリーとしてｃＤＮＡのクローニングに供する。
また、組換え可能なベクターとして動物ウイルス遺伝子
を使用する場合には、上述のｃＤＮＡ断片を各々ウイル
ス遺伝子ベクターに挿入し、これ等の各組換えウイルス
を標準の方法に従って感受性動物細胞にトランスフェク
トし、細胞内で増殖させる。組換えウイルスの場合は、
得られた組換えウイルスそのものをｃＤＮＡライブラリ
ーとして用いる。
【００２０】該ｃＤＮＡライブラリーの作成は、市販の
キット、例えば、ｃＤＮＡクローニングシステム ラム
ダｇｔ１０およびラムダｇｔ１１〔Ａｍｅｒｓｈａｍ社
（英国），ＢＲＬ社（米国），Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社
（米国）製販〕、インビトロパッケージングシステム
〔Ａｍｅｒｓｈａｍ社（英国），ＢＲＬ社（米国），Ｓ
ｔｒａｔａｇｅｎｅ社（米国）製販〕等を用いて容易に
実施することができる。
【００２１】（Ｖ）ｃＤＮＡライブラリーからのＮＡＮ
ＢＶ遺伝子を含むｃＤＮＡのクローニング：この工程に
おいて、ＮＡＮＢＶ遺伝子を含むｃＤＮＡクローンが得
られる。ｃＤＮＡライブラリーが形質転換体を含む場合
には、これ等の形質転換体を標準寒天培地において培養
しコロニーを形成させる。一方、ｃＤＮＡライブラリー
が組換えファージ粒子または組換えウイルスを含む場合
には、これ等の組換えファージ粒子または組換えウイル
スを公知の大腸菌、枯草菌、酵母、動物細胞培養物等の
感受性宿主細胞に感染後、培養することによりプラーク
を形成させるか、または感染細胞を増殖させる。そし
て、公知のイムノアッセイの下で、急性ＮＡＮＢ型肝炎
患者回復期血清、慢性ＮＡＮＢ型肝炎患者血清、肝細胞
質内管状構造形成型あるいは非形成型に関わりなくＮＡ
ＮＢＶに感染のチンパンジー血清を用い、ＮＡＮＢＶ抗
原を特定に産生したコロニー、プラークまたは感染細胞
を、上述の血清中の少なくとも１つと反応させることに
より、選別単離する。コロニーの厳密な選別のため、前
の工程を繰り返し、選別単離した各コロニー、プラーク
または感染細胞から、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ等によるＭ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ［Ｕ．Ｓ．Ａ］，３０９−４３
３，１９８２）に従って、ＮＡＮＢＶ遺伝子を含むｃＤ
ＮＡクローンを分離する。上記イムノアッセイは、例え
ば、酵素のパーオキシダーゼまたはアルカリ性ホスファ
ターゼで標識した抗体を用いる酵素標識抗体技術、フル
オレセインイソチオシアネートまたはユーロピウムで標
識した抗体を用いる蛍光抗体技術により実施することが
できる。上述の技術によるイムノアッセイでは、微量の
患者血清を使用しても、高感度のイムノアッセイを達成
することができる間接法による実施が望ましい。この間
接法においては、一次抗体としてはＮＡＮＢＶに特異的
な抗体の含有量が比較的多いＮＡＮＢ型肝炎患者やＮＡ
ＮＢ型肝炎チンパンジーの血清の採用が望ましく、二次
抗体としては酵素または蛍光物質等で標識した市販の抗
ヒトＩｇ（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）抗体の使用
が可能である。
【００２２】また、イムノアッセイ用の検体は、常法、
例えば、フィルター膜にコロニー、プラークまたは感染
細胞の核酸および蛋白を吸着させるブロッティング法、
マイクロプレートまたは検鏡用スライドガラスを用いる
方法等に従って調製することができる。ブロッティング
法を間接酵素抗体技術と合わせて用いると、著量のもと
のコロニー、プラークまたは感染細胞からの目的とする
コロニー、プラークまたは感染細胞の選別を、容易にし
かも迅速に実施することができる。この場合は、材質が
ニトロセルロース、セルロースアセテート、ナイロン等
の市販のフィルターをこれらのコロニー、プラークまた
は感染細胞に密着させ、ブロッティングを行う。
【００２３】この様にして得たｃＤＮＡクローンは、Ｎ
ＡＮＢＶ遺伝子の一部であるので、該ＮＡＮＢＶ遺伝子
の全領域をカバーするｃＤＮＡクローンを得るため、、
該ｃＤＮＡクローンに近傍のｃＤＮＡ断片を，該ｃＤＮ
Ａクローンの３’および５’末端部をプローブとして用
いて単離する方法により、ｃＤＮＡクローンを伸長させ
る必要がある。この場合には、ジーンウォーキング（別
称、ｇｅｎｏｍｉｃｗａｌｋｉｎｇまたはｃｈｒｏｍｏ
ｓｏｍｅ ｗａｌｋｉｎｇ）を採用することができる
（“ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｏｌｕｍｅ ＩＩ
Ｉ”、Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ編、３７−３９、ＩＲＬ
Ｐｒｅｓｓ，１９８７；Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ
ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ −
ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ”２、３．２
１−３．２３、１９８９）。クローニング操作とジーン
ウォーキングとを繰り返し行うことにより、ＮＡＮＢＶ
遺伝子全領域をｃＤＮＡクローンの形で得ることが出来
る。
【００２４】この段階では、得られた各ｃＤＮＡクロー
ンについての塩基配列の決定が望ましい。該ｃＤＮＡク
ローンのかかる塩基配列の決定は、常法、例えば、マキ
サム−ギルバート法、ジデオキシチェーンターミネータ
ー法（ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ、１５２、２３２−２３８，１９８６）等により一般
に行うことができる。
【００２５】また、決定した塩基配列に基づき、アミノ
酸配列を決定することができる。該アミノ酸のシーケン
シングは、開始コドン（ｃＤＮＡのＡＴＧまたはｍＲＮ
Ａ上のＡＵＧ）から行なう。かかるアミノ酸配列の重要
部分、例えば、エピトープを構成すると考えられる親水
性部位は、夫々の親水性部位に対応するペプチドを合成
し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で精製の
後、これ等のペプチドをエンザイムイムノアッセイ（Ｅ
ＩＡ）またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）に供する
ことにより特定することができる。
【００２６】また、該ｃＤＮＡクローンについては、各
クローンを相互に区別するため、これ等のクローンにコ
ードされるＮＡＮＢＶ抗原ポリペプチドの夫々の特性に
従い、いくつかの群に分類することが望ましい。これに
関連して、ＮＡＮＢＶ遺伝子の制限酵素地図上におけ
る、各ｃＤＮＡクローンの位置付けを分類のための指標
として使用することができる（図１−１および図１−
２）。また、ＮＡＮＢＶにはチンパンジー肝細胞質内に
管状構造形成能を有するものと、有しないものが知られ
ているため（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０５、１９７−２０
０、１９７９）、各ｃＤＮＡクローンと、チンパンジー
肝細胞質内に管状構造を形成する型のＮＡＮＢＶに感染
したチンパンジー血清と、管状構造を形成しない型のチ
ンパンジー血清との血清学的反応性を検査することによ
り、これ等のクローンを識別し分類することができる。
この血清学的反応性の検査は、上述のイムノアッセイに
より行うことができる。
【００２７】本発明において図１−１および図１−２に
示される、本発明ＮＡＮＢＶ遺伝子のｃＤＮＡクローン
には、接頭辞“ＢＫ”を付ける。図１−１は、該ＮＡＮ
ＢＶ遺伝子の全領域に対する本発明ＮＡＮＢＶ遺伝子の
ｃＤＮＡ間の関係を示す図である。また図１−２は、該
ＮＡＮＢＶ遺伝子の全領域に対するジーンウォーキング
により得られたｃＤＮＡクローン間の関係を示す図であ
る。
【００２８】ＮＡＮＢＶｃＤＮＡクローンは、例えば、
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＢＫ１０８（微工研
条寄第２９７１号)、ＢＫ１２９（微工研条寄第２９７
２号)、ＢＫ１３８（微工研条寄第２９７３号)、ＢＫ１
５３（微工研条寄第２９７４号)、ＢＫ１５７（微工研
条寄第３２４３号)、ＢＫ１６６（微工研条寄第２９７
５号）およびＢＫ１７２（微工研条寄第２９７６号）を
含むものである。これらの７つのＢＫ ＮＡＮＢＶｃＤ
ＮＡクローンは、少なくともＮＡＮＢＶ遺伝子のオープ
ンリーディングフレーム全領域、ないしは、おそらくＮ
ＡＮＢＶ遺伝子全領域をカバーしていると考えられる。
更に上記クローンに加え、ＢＫシリーズの代表例とし
て、次の５クローンが微工研に寄託されている：ＢＫ１
０２（微工研条寄第３３８４号）、ＢＫ１０６（微工研
条寄第３３８５号）、ＢＫ１１２（微工研条寄第３３８
６号）、ＢＫ１４６（微工研条寄第３３８７号）、ＢＫ
１４７（微工研条寄第３３８８号）。
【００２９】上述のＢＫ ＮＡＮＢＶｃＤＮＡクローン
によってカバーされるＮＡＮＢＶ遺伝子全領域の塩基配
列と、これらがコードするアミノ酸配列は、図２−１か
ら図２−１６に示される。図２−１から図２−１６に開
示の全ＮＡＮＢＶ塩基配列と全ＮＡＮＢＶアミノ酸配列
に基づき、該ＮＡＮＢＶ遺伝子の塩基配列およびアミノ
酸配列と他のウイルス遺伝子のそれらの配列とのホモロ
ジー、アミノ酸配列の疎水性指標（疎水性／親水性プロ
フィール）、ＮＡＮＢＶ遺伝子の構造、エピトープ（抗
原決定基）領域等に関して種々の研究および観察を行う
ことができる。
【００３０】ホモロジーについては、ＮＡＮＢＶ遺伝子
の塩基配列およびアミノ酸配列と既知の種々のウイルス
遺伝子（特開昭６２−２８６９３０；Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ、第１６１巻、４９７−５１０ページ、１９８７年）
および他のウイルスで牛ウイルス性下痢症ウイルス（Ｖ
ｉｒｏｌｏｇｙ、第１６５巻、４９７−５１０ページ、
１９８８年）、豚コレラウイルス（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、
第１７１巻、５５５−５６７ページ、１９８９年）、タ
バコ葉脈斑紋ウイルス（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ、第１６５巻、５４１７−５４３０ペー
ジ、１９８６年）等のウイルス遺伝子とを比較すること
により研究することができる。
【００３１】また、疎水性指標の解析については、例え
ば、遺伝子情報処理ソフトウェアのＳＤＣ−Ｇｅｎｅｔ
ｙｘ〔（株）ＳＤＣソフトウェア社（日本）製〕）、Ｄ
ｏｏｌｉｔｔｌｅが作成のプログラム（Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、第１５７
巻、１０５−１３２ページ、１９８２年）等を用いる技
術により研究することができる。
【００３２】図３は、本発明ＮＡＮＢＶおよび日本脳炎
ウイルス（ＪＥＶ）の疎水性プロフィールを示す図であ
り、両ウイルスの夫々の疎水性指標を相互に比較したも
のである。この図から、ＮＡＮＢＶ遺伝子の遺伝子構造
とＪＥＶ遺伝子の遺伝子構造との間に有意な類似性のあ
ることが判明している。図３に示されるように、本発明
ＮＡＮＢＶのポリペプチドは３種の構造蛋白、即ち、コ
ア蛋白（Ｃ）、プレマトリックス蛋白（ＰｒｅＭ）がさ
らに進行したマトリックス蛋白（Ｍ）、エンベロープ蛋
白（Ｅ）と７種の非構造蛋白のＮＳ１，ＮＳ２ａ，ＮＳ
２ｂ，ＮＳ３，ＮＳ４ａ，ＮＳ４ｂおよびＮＳ５を含有
する。これらの蛋白は夫々、以下の塩基配列によりコー
ドされる：
【００３３】Ｃ蛋白は塩基番号第３３３番から第６７７
番まで、Ｍ蛋白は第６７８番から第９０５番、Ｅ蛋白は
第９０６番から第１４９９番、ＮＳ１は第１５００番か
ら第２５１９番、ＮＳ２は第２５２０番から第３３５０
番、ＮＳ３は第３３５１番から第５１７７番、ＮＳ４ａ
は第５１７８番から第５９１８番、ＮＳ４ｂは第５９１
９番から第６３７１番、およびＮＳ５は第６３７２番か
ら第９３６２番まで。これ等の塩基配列は、ＮＡＮＢ型
肝炎の診断に有用であり、これ等にコードされるポリペ
プチドは夫々、ＮＡＮＢＶ型肝炎のワクチンのみならず
診断剤用の抗原として有用である。
【００３４】上述の３種の構造蛋白は、図２−１から図
２−３に示されるアミノ酸番号第１番（Ｍｅｔ）から第
３８９番により表されるものであり、第１番のメチオニ
ン残基は開始コドンによりコードされるものである。
【００３５】本発明者の引続く研究により、以下の塩基
配列が抗ＮＡＮＢＶ抗体に対し反応するエピトープを含
有することが判明した：塩基配列が、夫々塩基番号第３
３３番から４２２番、第３３３番から１４９９番、第３
３３番から第６３７１番、第４７４番から５６３番、第
９０６番から９５３番、第１０２０番から第１０４６
番、第１０２０番から第１１２１番、第１１９４番から
第１２３２番、第１２０９番から第１３２２番、第４４
８５番から第４５７４番および第５５４４番から第５６
３３番まで。
【００３６】以下に述べるように、上述の塩基配列また
はその全配列の部分としての塩基配列を含有する塩基配
列は、組換えＤＮＡ技術または化学合成によるＮＡＮＢ
Ｖ抗原ポリペプチドの産生のみならず、ハイブリダイゼ
ーションまたはポリメラーゼチェインリアクション（Ｐ
ＣＲ）によるＮＡＮＢ型肝炎の診断に対しても、効果的
に使用することができる。
【００３７】また、図２−１から図２−１６に示される
塩基番号第１番から第９４１６番の全領域の少なくとも
６個の塩基を含有する塩基配列が、ＮＡＮＢ型肝炎の診
断におけるハイブリダイゼーション用のプローブとし
て、またはポリメラーゼチェインリアクション用のプラ
イマーとして有用であり、塩基番号第３３３番から第９
３６２番の塩基配列の少なくとも１２個の塩基の塩基配
列によりコードされる少なくとも４つのアミノ酸を含有
するポリペプチドが、ＮＡＮＢ型肝炎のワクチンのみな
らず診断剤用の抗原としても効果的であることが判明し
た。さらに、当業者間では既知のことであるが、該塩基
配列に相補的な塩基配列もまた、ＮＡＮＢ型肝炎の診断
におけるハイブリダイゼーション用のプローブとして、
またはポリメラーゼチェインリアクション用のプライマ
ーとして有用であることが分かった。遺伝コドンの縮重
に従って該ＮＡＮＢＶの塩基配列の少なくとも一部のコ
ーディング領域の少なくとも１つの塩基を置換すること
により得られる塩基配列もまた、組換えＤＮＡ技術によ
り本発明抗原ポリペプチドの産生に使用することができ
る。
【００３８】従って、本発明の単離されたデオキシリボ
核酸は、図２−１から図２−１６に示される塩基番号第
１番から第９４１６番の非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスの全塩
基配列の少なくとも一部を含む第一の塩基配列および第
一の塩基配列に相補的な塩基配列からなる群から選ばれ
る少なくとも１つの塩基配列、あるいは遺伝子コドンの
縮重に従って第一の塩基配列の少なくとも１つの塩基を
置換することにより得られる塩基配列を含む。
【００３９】更に特定すれば、本発明の該デオキシリボ
核酸は、図２−１から図２−１６に示される塩基番号第
１番から第９４１６番の非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスの全塩
基配列の少なくとも６個の塩基を包含する。
【００４０】また更に特定すれば、本発明の該デオキシ
リボ核酸は、塩基番号第３３３番から第４２２番、第３
３３番から第６７７番、第３３３番から第１４９９番、
第３３３番から第６３７１番、第４７４番から第５６３
番、第６７８番から第９０５番、第９０６番から第９５
３番、第９０６番から第１４９９番、第１０２０番から
第１０４６番、第１０２０番から第１１２１番、第１１
９４番から第１２３２番、第１２０９番から第１３２２
番、第１５００番から第２５１９番、第２５２０番から
第３３５０番、第３３５１番から第５１７７番、第４４
８５番から第４５７４番、第５１７８番から第５９１８
番、第５５４４番から第５６３３番、第５９１９番から
第６３７１番、第６３７２番から第９３６２番、および
第１番から第９４１６番の塩基配列からなる群から選ば
れる少なくとも１つの塩基配列を含有する。
【００４１】また、本発明の単離された抗原ポリペプチ
ドは、図２−１から図２−１６に示される非Ａ非Ｂ型肝
炎ウイルスの塩基配列の塩基番号第３３３番から９３６
２番のコーディング領域を含むデオキシリボ核酸により
コードされるアミノ酸配列の少なくとも一部を包含す
る。なお、本発明のＮＡＮＢＶ抗原ポリペプチドは、Ｎ
ＡＮＢＶ粒子やＮＡＮＢＶ表面抗原集合体などのアセン
ブリーを構成しない状態のポリペプチドを意味する。
【００４２】更に特定すれば、本発明の該抗原ポリペプ
チドは、塩基番号第３３３番から第９３６２番の該塩基
配列の少なくとも１２個の塩基の塩基配列によりコード
される少なくとも４つのアミノ酸の少なくとも１アミノ
酸を包含する。
【００４３】また更に特定すれば、本発明の該抗原ポリ
ペプチドは、塩基番号第３３３番から第４２２番、第３
３３番から第６７７番、第３３３番から第１４９９番、
第３３３番から第６３７１番、第４７４番から第５６３
番、第６７８番から第９０５番、第９０６番から第９５
３番、第９０６番から第１４９９番、第１０２０番から
第１０４６番、第１０２０番から第１１２１番、第１１
９４番から第１２３２番、第１２０９番から第１３２２
番、第１５００番から第２５１９番、第２５２０番から
第３３５０番、第３３５１番から第５１７７番、第４４
８５番から第４５７４番、第５１７８番から第５９１８
番、第５５４４番から第５６３３番、第５９１９番から
第６３７１番、第６３７２番から第９３６２番、および
第３３３番から第９３６２番の塩基配列からなる群から
選ばれる塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含
有する。
【００４４】さらに、図２−１から図２−１６に示され
る該ＮＡＮＢＶの全コーディング領域によりコードされ
るポリペプチドは、幅広い抗原抗体反応スペクトルを有
するため、このようなポリペプチドは、単一エピトープ
を含む抗原に比べＮＡＮＢ型肝炎感染により生産された
多種多様の抗体と反応することができ、ＮＡＮＢ型肝炎
診断剤として高感度である。
【００４５】（ＶＩ）ＮＡＮＢＶ遺伝子ｃＤＮＡクロー
ンの発現、およびＮＡＮＢＶ抗原の大量生産：ＮＡＮＢ
Ｖ抗原ポリペプチドを商業的規模で産生するＮＡＮＢＶ
抗原遺伝子のクローンｃＤＮＡを発現させるために、ｃ
ＤＮＡクローン内に存在する該クローンｃＤＮＡの一部
または全体を複製可能な発現クローニングベクターから
取り出し、複製可能な発現ベクターに結合する。実例と
して、各ｃＤＮＡクローンの該ｃＤＮＡの一部または全
領域を制限酵素を用いて切り出すことによりＮＡＮＢＶ
抗原遺伝子を含むＤＮＡ断片（以後「ＮＡＮＢＶのＤＮ
Ａ断片」とする）を得、これを常法により組換え可能な
発現ベクターに挿入する。ＤＮＡ断片１種を発現ベクタ
ーに挿入する場合は、遺伝子発現によりペプチドを１
種、産生することができる。また、２種以上のＤＮＡ断
片を発現ベクターの配列に挿入する場合は、遺伝子発現
により、挿入したＤＮＡ断片にコードされているポリペ
プチドを含む融合ペプチドとして抗原ポリペプチドを産
生することができる。
【００４６】この操作において使用し得る複製可能な発
現ベクターとしては公知又は市販のもの、例えば、腸内
細菌科のプラスミドベクターｐＳＮ５０８（米国特許第
４,７０３,００５号）、酵母のプラスミドベクターｐＢ
Ｈ１０３およびその系列（特開昭６３−２２０９８）と
ｐＪＭ１０５（特開昭６２−２８６９３０）、弱毒水痘
ウイルス遺伝子（特開昭５３−４１２０２）、弱毒マレ
ック病ウイルス（日本獣医学会誌、第２７巻、２０〜２
４ページ、１９８４年；およびＴＧａｎ Ｍｏｎｏｇｒ
ａｐｈ ｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第１
０卷、９１〜１０７ページ、１９７１年）、ｐＴＴＱ系
列〔Ａｍｅｒｓｈａｍ社（英国）製販〕、ｐＳＬＶ系列
〔Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ社（スェーデン）製販〕
等を含む発現ベクターから使用することができる。
【００４７】次いで、ＮＡＮＢＶのＤＮＡを挿入した発
現ベクターを、常套手段により該ベクターに感受性の宿
主細胞に個別に移入、またはトランスフェクションし、
形質転換体を得、これらからＮＡＮＢＶ抗原ポリペプチ
ドまたはＮＡＮＢＶ粒子を産生した形質転換体を選別す
る。尚、ＮＡＮＢＶ抗原ポリペプチド（またはＮＡＮＢ
Ｖ粒子）の産生は、前述（Ｖ）に記載のイムノアッセイ
により検出することができる。その結果、発現ベクター
として動物ウイルス遺伝子を使用した場合には、その表
面にＮＡＮＢＶ抗原ポリペプチドを有する組換えウイル
スを得ることができ、該ウイルスベクターに固有の抗原
性のみならずＮＡＮＢＶの抗原性をも有する多機能ワク
チンの原料として、そのような組換えウイルスを有利に
用いることが可能である。
【００４８】前に得た該形質転換体または組換えウイル
スを常法に従い培養することにより、ＮＡＮＢＶ抗原ポ
リペプチドをその培地内に商業的規模で産生することが
できる。動物ウイルス遺伝子を発現ベクターとして用い
る方法の詳細については、欧州公開特許公報第３３４５
３０号を参考にするとよい。
【００４９】従って、本発明は更に、以下の工程を包含
する非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原ポリペプチドの産生方
法の提供を目的とする： （ａ）デオキシリボ核酸をプラスミドおよび動物ウイル
ス遺伝子から選ばれた複製可能な発現ベクターに挿入し
た後、該複製可能な発現ベクターがプラスミドの場合は
そのプラスミドおよびそれに挿入したデオキシリボ核酸
を、また該複製可能な発現ベクターが動物ウイルス遺伝
子の場合はその動物ウイルス遺伝子およびそれに挿入し
たデオキシリボ核酸を得、該デオキシリボ核酸は、図２
−１から図２−１６で示される非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス
の塩基配列の塩基番号第３３３番から第９３６２番のコ
ーディング領域の少なくとも一部を含む塩基配列および
該塩基配列の少なくとも１つの塩基を遺伝子コドンの縮
重により置換して得られる塩基配列からなる群から選ば
れる少なくとも１つの塩基配列を含有しており、（ｂ）
上記（ａ）で用いた複製可能な発現ベクターがプラスミ
ドの場合は、微生物細胞または真核細胞培養物に該組換
えＤＮＡをトランスフェクトし形質転換体を形成した
後、その微生物または真核細胞培養物の親細胞から形質
転換体を選別し、（ｃ）上記（ｂ）で得られた形質転換
体を培養することにより該デオキシリボ核酸を発現さ
せ、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原ペプチドを単一形で産
生するか、あるいは上記（ａ）で得られた組換えウイル
スを培養することにより該デオキシリボ核酸および動物
ウイルス遺伝子を発現させ、動物ウイルス遺伝子および
非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原ペプチドをその表面に含む
増殖した組換えウイルスの形で非Ａ非Ｂ型肝炎ルイルス
抗原ペプチドを産生させ、そして（ｄ）かかる非Ａ非Ｂ
型肝炎ウイルス抗原ペプチドまたは増殖した組換えウイ
ルスを単離する。
【００５０】このようにして得た抗原ペプチドはＮＡＮ
Ｂ型肝炎の診断剤またはワクチンの有効成分として有利
に用いることができ、組換えウイルスもワクチンの有効
成分として用いられる。
【００５１】また、図２−１から図２−１６の該ｃＤＮ
Ａの一部または全体を鋳型として用いて、標準的な方法
に従いｉｎ ｖｉｔｒｏで転写させて対応するＲＮＡま
たはｍＲＮＡを合成することができる。例えば、図２−
１から図２−１６の該ｃＤＮＡの全領域に対応するＲＮ
ＡまたはｍＲＮＡは、プラスミドｐＤＭ−１８（実施例
２で構築する）を制限酵素ＨｉｎｄIIIで処理して調製
したｃＤＮＡの全領域を鋳型として用い、Ｔ７ＲＮＡポ
リメラーゼおよび相似のキャップを用いてｉｎｖｉｔｒ
ｏで転写する。このようにして合成されたＲＮＡまたは
ｍＲＮＡは、ＮＡＮＢＶ遺伝子の全領域を包含してお
り、即ち、実質的に剥き出しのＮＡＮＢＶゲノムである
ため、ｍＲＮＡを動物細胞にトランスフェクトすること
により、感染性ＮＡＮＢＶ粒子を得ることができる。上
述のｍＲＮＡは、例えば市販のｍＲＮＡキャッピングキ
ット〔Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社（米国）製販〕を用い
て、従来の手段により合成することができる。かかる合
成の操作工程の詳細については、“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐ
ｔｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ”（１０．１７．１−１０．１７．５，Ｗｉｌ
ｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ発行，１９８９年）を参考にすると
よい。図２−１から図２−１６の該ｃＤＮＡの一部また
は全体を用いて得られた該ＲＮＡは、ＮＡＮＢＶゲノム
の一部または全体であるため、ＮＡＮＢＶ抗原の産生の
みならず、ＮＡＮＢＶおよびそれに起因する感染症の研
究に有用である。
【００５２】（ＶII）ＮＡＮＢＶ抗原ポリペプチドの精
製：該形質転換体または組換えウイルスの培養物中に産
生されたＮＡＮＢＶ抗原は、通常の技術、例えば、塩
析、シリカゲルや活性炭等を用いる吸脱着法、有機溶媒
による沈殿法、超遠心による分画法、イオン交換または
アフィニティーカラムクロマトグラフィーによる分離
法、高速液体クロマトグラフィー、または電気泳動によ
る分画法等を適宜、組み合わせることにより精製するこ
とができる。大腸菌または酵母の形質転換体の培養物か
ら、ＮＡＮＢＶ抗原ペプチドを精製する場合には、ＮＡ
ＮＢＶ抗原ポリペプチドの最終産生物の品質を著しく低
下させる大腸菌および酵母に由来のアレルゲンの効果的
な除去の見地から、例えば、（１）シリカゲルによる吸
脱着処理、活性炭による不純物の吸脱除法、および
（２）密度勾配遠心分離による分画を順次行う（特開昭
６３−２９７）ことによる精製が望ましい。また、組換
えウイルス培養物、例えば、ウイルス感染組換え細胞培
養液からＮＡＮＢＶ抗原ポリペプチドを精製する場合に
は、超遠心分離や密度勾配遠心分離を反復して行い該抗
原を含む原液を精製することにより、高純度のＮＡＮＢ
Ｖ抗原ポリペプチドを得ることができる。
【００５３】このようにして、本発明の精製ＮＡＮＢＶ
抗原ポリペプチドを含む溶液が得られる。必要があれ
ば、該溶液を凍結乾燥し、かかるＮＡＮＢＶ抗原ポリペ
プチドを乾燥した形で得ることが可能である。また、本
発明の混合抗原ポリペプチドは、異なる塩基配列を有す
る少なくとも２種のｃＤＮＡの遺伝子発現により得られ
る少なくとも２種のＮＡＮＢＶ抗原ポリペプチドの混合
により得ることができる。
【００５４】前述の通り、該ＮＡＮＢＶのコア蛋白（Ｃ
蛋白)、マトリックス蛋白（Ｍ蛋白)、およびエンベロー
プ蛋白（Ｅ蛋白）は、図２−１から図２−３に示される
アミノ酸番号第１番（Ｍｅｔ）から第３８９番（Ｇｌ
ｙ）の領域に含まれる。この領域に含まれる上述のエピ
トープ、特に塩基番号第９０６番から第９５３番、第１
０２０番から第１０４６番、第１１９４番から第１２３
２番の塩基配列によりそれぞれコードされるエピトープ
は抗原として非常に有用である。かかるエピトープはポ
リペプチド合成により得ることができ、市販のペプチド
合成機、例えば、ポリペプチド合成機ＣＯＵＰＬＥＲ
２１００〔ＤＵ ＰＯＮＴ社（米国）製販〕を使用して
実施することができる。かかる合成抗原ポリペプチド
は、例えばワクチン、診断剤、および抗体の製造に用い
ることができる。
【００５５】本発明は更に、プラスミドおよび動物ウイ
ルス遺伝子、そしてデオキシリボ核酸にして図２−１か
ら図２−１６に示される非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスの全塩
基配列の塩基番号第１番から第９４１６番のコーディン
グ領域の少なくとも一部を含む塩基配列および該塩基配
列を遺伝子コドンの縮重に基づき少なくとも１つの塩基
を置換して得られる塩基配列からなる群から選ばれる少
なくとも１つの塩基配列を含有するものから選ばれる、
複製可能な発現ベクターを有する複製可能な組換えＤＮ
Ａの提供を目的とするものである。かかる組換えＤＮＡ
は、本発明のＮＡＮＢＶ抗原ポリペプチドの産生のみな
らず、複製による本発明のＮＡＮＢＶ遺伝子ｃＤＮＡの
増幅に用いることができる。
【００５６】この複製による本発明のＮＡＮＢＶ遺伝子
ｃＤＮＡの増幅のための複製可能な組換えＤＮＡに関す
る本発明の好ましい具体化において、該塩基配列は塩基
番号第１番から第９４１６番の塩基配列の少なくとも６
個の塩基を含有する。該ＮＡＮＢＶ抗原ポリペプチドの
産生のための複製可能な組換えＤＮＡに関する本発明の
好ましい具体化において、該塩基配列は塩基番号第３３
３番から第９３６２番の塩基配列の少なくとも１２個の
塩基を含有する。
【００５７】更に、該ＮＡＮＢＶ抗原ポリペプチドの産
生に必要な複製可能な組換えＤＮＡは、該塩基配列は、
塩基番号第３３３番から第４２２番、第３３３番から第
６７７番、第３３３番から第１４９９番、第４７４番か
ら第５６３番、第６７８番から第９０５番、第９０６番
から第９５３番、第９０６番から第１４９９番、第１０
２０番から第１０４６番、第１０２０番から第１１２１
番、第１１９４番から第１２３２番、第１２０９番から
第１３２２番、第１５００番から第２５１９番、第２５
２０番から第３３５０番、第３３５１番から第５１７７
番、第４４８５番から第４５７４番、第５１７８番から
第５９１８番、第５５４４番から第５６３３番、第５９
１９番から第６３７１番、および第６３７２番から第９
３６２番の塩基配列からなる群から選ばれる。
【００５８】また、本発明の精製ＮＡＮＢＶ抗原ポリペ
プチドは、ＮＡＮＢ型肝炎の診断剤として有用である。
また、本発明のＮＡＮＢＶ抗原ポリペプチドは、以下の
ようにして診断剤に調剤することができる。上記（ＶI
I）で得られた精製ＮＡＮＢＶ抗原ポリペプチド溶液
を、バイアル瓶またはアンプル等の容器に分注の後、密
封する。注入した該抗原ポリペプチドは、密封する前に
上述と同様の手段で凍結乾燥することができ、容器内の
ＮＡＮＢＶ抗原ポリペプチドの量は、一般に約１μｇ〜
約１０ｍｇである。代わりに、該ＮＡＮＢＶ抗原ポリペ
プチドを、また、常用されている支持体、例えば、マイ
クロプレート、ポリエチレンビーズ、濾紙または膜の表
面に吸着させることができる。
【００５９】血清と該ＮＡＮＢＶ抗原ポリペプチドとの
反応性の決定は、上述（Ｖ）に示したのと同様の手段で
個別に実施することができる。即ち、かかる反応性の決
定は、従来のイムノアッセイの方法、例えば、ｒａｄｉ
ｏｉｍｍｕｎｏａｓｓｅｙ（ＲＩＡ），ｅｎｚｙｍｅ−
ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓｅ
ｙ（ＥＬＩＳＡ）、蛍光抗体法（ＦＡ）、受身赤血球疑
集反応（ＰＨＡ）、逆受身赤血球疑集反応（ｒＰＨＡ）
等により実施することが可能である。上記のイムノアッ
セイに用いる該ＮＡＮＢＶ抗原ポリペプチドの量は、血
清中に一般に約０．１〜約１００ｍｇ／ｍｌであり、特
にＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ＦＡ、ＰＨＡおよびｒＰＨＡに
用いる量は、それぞれ０．１〜１ｍｇ／ｍｌ、０．１〜
１ｍｇ／ｍｌ、１〜１００ｍｇ／ｍｌ、１〜５０ｍｇ／
ｍｌおよび１〜５０ｍｇ／ｍｌとなる。
【００６０】また、本発明のＮＡＮＢＶ抗原ポリペプチ
ドは、輸血用血液のスクリーニングにも使用することが
できる。かかるスクリーニング法が包括しているのは： （ａ）全血液から血清を分離し、（ｂ）未知血液の血清
と図２−１から図２−１６に示すＮＡＮＢＶの全塩基配
列の塩基番号第３３３番から第９３６２番のコーディン
グ領域を含むデオキシリボ核酸によりコードされるアミ
ノ酸配列の少なくとも一部を含む少なくとも１つのアミ
ノ酸を含有する単離されたＮＡＮＢＶ抗原ポリペプチド
とを接触させ、（ｃ）その血清と該ＮＡＮＢＶ抗原ポリ
ペプチドとの反応の有無を決定し、（ｄ）その反応性に
基づき非Ａ非Ｂ型肝炎に対し陽性か陰性かを分類し、そ
して、（ｅ）その同定に従いかかる血液の分別をするも
のである。
【００６１】未知血液の血清と本発明のＮＡＮＢＶ抗原
ポリペプチドとの接触およびその反応性の決定は、ＮＡ
ＮＢ型肝炎の診断方法に関する上述と同様の手段で実施
することが可能である。この方法により、ＮＡＮＢＶに
感染していない輸血用血液を選別することができる。ま
た、本発明のＮＡＮＢＶ抗原ポリペプチドに特定のポリ
クローナル抗体およびモノクローナル抗体を、輸血用血
液のＮＡＮＢＶ除去剤として用いることができる。即
ち、血中に存在するＮＡＮＢＶを、抗原抗体反応により
ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を用い
て、効果的に除去し得る。
【００６２】また、本発明のＮＡＮＢＶ抗原ポリペプチ
ドは、ＮＡＮＢ型肝炎ワクチンの活性要因として有利に
用いることが可能である。かかるＮＡＮＢ型肝炎ワクチ
ンは、以下のようにして調製することができる。該ＮＡ
ＮＢＶ抗原ポリペプチドをコードするｃＤＮＡの担体で
ある組換えファージまたはプラスミドを含む形質転換体
の培養、あるいは該ｃＤＮＡの担体である組換えウイル
スを感染させた細胞の培養を、上述と同じ方法にて実施
し、培養物内に該ＮＡＮＢＶ抗原ポリペプチドを産生さ
せる。これの毒性を除去し安全性を確実にするため、ま
たこれを固定しその免疫原性および抗原性を安定にする
ために、形質転換細胞または組換えウイルス感染細胞の
培養物あるいはこれらを除去することにより得られる培
地に、従来の不活化剤を加えることが望ましい。例え
ば、不活化剤として、フォルマリンを０．０００１〜
０．００１ｖ／ｖ％の量で加えた後、４〜３０℃にて５
〜９０日間培養することにより、かかる培養物または培
地を上述と同じ方法にて精製し、精製されたＮＡＮＢＶ
抗原ポリペプチドを含むＮＡＮＢ型肝炎ワクチン原液を
得ることが可能である。
【００６３】また、ＮＡＮＢＶワクチン原液を、マイク
ロフィルターを用い標準的な方法で濾過し、溶液を除菌
した後、濾液を生理的塩溶液にてＬｏｗｒｙ法による蛋
白濃度の測定値が約１〜約５００μｇ／ｍｌとなるよう
希釈し、アジュバントとして水酸化アルミニウムゲル
を、添加したゲルの最終濃度が約０．１〜約１ｍｇ／ｍ
ｌとなるよう添加する。アジュバントとしては、沈降ア
ジュバントのリン酸カルシウムゲル、リン酸アルミニウ
ムゲル、硫酸アルミニウム、アルミナおよびベントナイ
ト、また抗原産生を誘起するアジュバントのムラミルペ
プチド誘導体、ポリヌクレオチド、Ｋｒｅｓｔｉｎ〔登
録商標、呉羽化学工業株式会社（日本）製販〕およびピ
シバニール（共に抗腫瘍剤）も使用することができる。
更に、かかる混合物に少なくとも１種の安定剤を添加す
ることができ、安定剤としては市販のいかなる安定剤も
用いることが可能であるが、それらには、例えばゼラチ
ン、それらの加水分解物、アルブミン、糖類のグルコー
ス、フルクトース、ガラクトース、スクロースおよびラ
クトース、またアミノ酸のグリシン、アラニン、リジ
ン、アルギニンおよびグルタミンが含まれる。
【００６４】そして、ゲル吸着したＮＡＮＢＶ抗原ポリ
ペプチドを含むＮＡＮＢ型肝炎ワクチン液をアンプルま
たはバイアル瓶等の小容器に分注し密封することによ
り、吸着したＮＡＮＢＶ抗原ポリペプチドを含む精製さ
れた沈降ＮＡＮＢ型肝炎ワクチンが得られる。
【００６５】かくして得られたＮＡＮＢ型肝炎ワクチン
液を凍結乾燥し、乾燥ＮＡＮＢ型肝炎ワクチンとするこ
とにより、過酷な環境、例えば熱帯での該生成物の輸送
と保存が可能となる。かかる凍結乾燥は一般に、液体沈
降ＮＡＮＢ型肝炎ワクチンをバイアル瓶およびアンプル
等の容器に分注した後、標準的な方法に従って実施する
ことができ、凍結乾燥後に乾燥ワクチンを含む容器に窒
素ガスを注入し、密封する。尚、生成ワクチンの品質に
ついては、日本国厚生省告示第１５９号「生物学的製剤
基準」に規定の「沈降Ｂ型肝炎ワクチン」、「乾燥日本
脳炎ワクチン」および「沈降百日せきワクチン」に準拠
して試験する。
【００６６】また、該ＮＡＮＢ型肝炎ワクチンは、上述
の吸着ＮＡＮＢＶ抗原ポリペプチドおよび本ＮＡＮＢＶ
抗原ポリペプチド以外の少なくとも１つの抗原を含む混
合ワクチンの形で調製することが可能である。本ＮＡＮ
ＢＶ抗原ポリペプチド以外の抗原としては、該ＮＡＮＢ
Ｖ抗原ポリペプチドおよびこの他の抗原を組み合わせて
用いることに起因する副作用及び不都合な反応が付加的
または共同的に増加せず、またこれらの抗原性および免
疫原性がそれら相互の干渉により減少しない限り、対応
するワクチンの活性要因として従来用いられているいか
なる抗原も使用することが可能である。該ＮＡＮＢＶ抗
原ポリペプチドに混合することができる抗原の数と種類
は、上述のようにそれらの副作用および不都合な反応が
付加的または共同的に増加せず、またそれらの抗原性お
よび免疫原性が減少しない限り、制限されるものではな
い。一般に、２〜６種の抗原を該ＮＡＮＢＶ抗原ポリペ
プチドに混合することが可能であり、例として、日本脳
炎ウイルス、ＨＦＲＳ（腎症候性出血熱）ウイルス、イ
ンフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、
Ｂ型肝炎ウイルス、デング熱ウイルス、エイズウイル
ス、百日咳菌、ジフテリア菌、破傷風菌、髄膜炎菌、肺
炎双球菌等に由来の無毒化抗原、不活化抗原または変性
毒素が含まれる。
【００６７】一般に、本発明のＮＡＮＢＶ抗原ポリペプ
チドを含むワクチンは、アンプル等のバイアル瓶に注入
し密封の後、液体または懸濁液の形で投与することがで
きる。乾燥ワクチンを用いる場合は、投与前に凍結乾燥
前の元の体積となるよう滅菌蒸留水に溶解または懸濁す
る。一般に、このワクチンは皮下投与にて使用し、その
投与量は、被投与者当たり約０．５ｍｌであるが、子供
に対しては成人の半量のワクチンを投与する。また、か
かるワクチンは、通常約１週間〜１ヵ月の間隔にて２回
接種した後、約半年後にさらに１回投与する。
【００６８】更に、該ＮＡＮＢＶ抗原ポリペプチドは、
それに特異的なポリクローナル抗体およびモノクローナ
ル抗体等の抗体の調製に用いることも可能である。例え
ば、該ＮＡＮＢＶ抗原ポリペプチドに特異的なポリクロ
ーナル抗体は、以下の常法により調製することができ
る。まず本発明の精製されたＮＡＮＢＶ抗原ポリペプチ
ドを、マウス、モルモット、ウサギ等の動物の皮下、筋
肉内、腹腔内または静脈内に、通常１〜４週間の間隔に
て数回接種し、かかる動物を完全に免疫する。免疫効果
を高めるために、従来の市販のアジュバントを使用する
ことができる。次いで、免疫した動物から血清を採取し
た後、標準的な方法に従って血清から抗ＮＡＮＢＶ抗原
ポリペプチドポリクローナル抗体を単離精製する。
【００６９】一方、該ＮＡＮＢＶに特異的なモノクロー
ナル抗体は、例えば「細胞光学」第１巻の２３〜２９ペ
ージ（１９８２年）に述べられている常法により調製す
ることができる。例えば、精製されたＮＡＮＢＶ抗原に
て免疫したマウスから得られた脾細胞と市販のマウスミ
エローマ細胞を細胞融合技術により融合し、ハイブリド
ーマを得た後、これらのハイブリドーマをふるい分けて
該ＮＡＮＢＶ抗原ポリペプチドに反応する抗体を産生す
る能力を有するハイブリドーマを得る。これを標準的な
方法にて培養し、培地の上清から抗ＮＡＮＢＶ抗原ポリ
ペプチドモノクローナル抗体を単離精製する。
【００７０】また、上述のポリクローナル抗体およびモ
ノクローナル抗体は、ＮＡＮＢ型肝炎の診断剤としても
用いることが可能である。かかる抗体を用いるＮＡＮＢ
型肝炎の診断は、該ＮＡＮＢＶ抗原ポリペプチドを用い
るＮＡＮＢ型肝炎の診断に関する上述の方法と実質的に
同様にして実施することができる。ポリクローナル抗体
またはモノクローナル抗体を用いることにより、肝組織
および血中に存在する該ＮＡＮＢＶ抗原ポリペプチドの
同定および定量が可能となる。
【００７１】更に、本発明のＮＡＮＢＶ遺伝子ｃＤＮＡ
は、本発明に規定されたＮＡＮＢＶ遺伝子ｃＤＮＡを適
切な制限酵素にて消化することにより調製することがで
きる。また、本発明の遺伝子ｃＤＮＡは、本明細書の図
２−１から図２−１６に示す塩基配列に従ってＤＮＡ合
成技術により調製することができる。ＤＮＡ合成による
該ＮＡＮＢＶ遺伝子ｃＤＮＡの調製は、ＤＮＡ合成機モ
デル３８０Ｂ〔Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社
（米国）製販〕、ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒモデ
ル８７００〔Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ社（米国）製販〕等の
従来のＤＮＡ合成機を使用して実施することが可能であ
る。本発明のＮＡＮＢＶ遺伝子ｃＤＮＡは、ＮＡＮＢＶ
感染の遺伝子診断の実施に、即ち、本発明のＮＡＮＢＶ
遺伝子ｃＤＮＡをポリメラーゼチェインリアクション
（ＰＣＲ）のプライマーとして、患者の体液または細胞
内のＮＡＮＢＶ遺伝子の検出に使用することができる。
ポリメラーゼチェインリアクションによる診断には、該
ＮＡＮＢＶ遺伝子ｃＤＮＡを１０〜１００ｎｇ用いる。
【００７２】また、本発明のＮＡＮＢＶ遺伝子ｃＤＮＡ
は、ハイブリダイゼーション技術によってもＮＡＮＢ型
肝炎の診断に用いることが可能である。即ち、該ＮＡＮ
ＢＶ遺伝子ｃＤＮＡを、例えばビオチン、アルカリ性ホ
スファターゼ、放射性同位元素32Ｐ等にて標識し、標準
的な方法、例えば以下の方法により調製してハイブリダ
イゼーション技術による診断に供することができる。ま
ず、上述（Ｖ）で得られた該ＮＡＮＢＶｃＤＮＡを含む
組換えファージを適切な制限酵素にて処理し、該ＮＡＮ
ＢＶｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片を切り出した後、市販の
複製可能な組換えクローニングプラスミドに連結し、こ
のＤＮＡ断片を含む組換えプラスミドを得る。この組換
えプラスミドを宿主細胞内に導入して形質転換体を形成
させ、これを培養して組換えプラスミドを増殖させた
後、形質転換体より単離して制限酵素にて消化し、低融
点アガロースゲル電気泳動にかけ、該ＮＡＮＢＶ抗原ポ
リペプチドをコードするｃＤＮＡを単離精製する。この
ようにして得られたｃＤＮＡを、ビオチン、アルカリ性
ホスファターゼ、放射性同位元素32Ｐ等で標識する。
尚、かかる標識には市販のニックトランスレーションキ
ットまたはマルチプライムＤＮＡ標識システム〔Ａｍｅ
ｒｓｈａｍ社（英国）、ニッポンジーン（日本）社等製
販〕を用いて実施することができる。標識されたｃＤＮ
Ａは、約５〜２０ｍｌのアンプル等の容器に入れ、密封
する。このｃＤＮＡの量は、１つの容器につき一般に１
〜１００ｕｇであり、液体または凍結乾燥状態で、容器
に注入することができる。この標識されたｃＤＮＡを用
いるＮＡＮＢ型肝炎の診断は、標準的なハイブリダイゼ
ーション法により実施される。即ち、患者から得られた
血漿、血清または白血球を標識されたｃＤＮＡに接触さ
せ、この標識されたｃＤＮＡとハイブリダイズしたＲＮ
Ａを標準的な方法により検出する。このｃＤＮＡが酵素
で標識されているときはエンザイムイムノアッセイによ
り、放射性同位体で標識されているときは例えばシンチ
レーション計測により検出を行う。
【００７３】
【実施例】以下、本発明について実施例を挙げて説明す
る。但し、本発明は以下の実施例にのみ限定されるもの
ではない。 実施例１ （１）ＮＡＮＢＶゲノムＲＮＡに相補的なｃＤＮＡを作
製するための血漿由来ＲＮＡの調製：血漿よりＮＡＮＢ
Ｖを得るため、グルタミック−ピルビック トランスア
ミナーゼ（ＧＰＴ）活性（Ｗｒｏｂｌｅｗｓｉｋｉ，Ｆ
＆ Ｊ．Ｓ．ＬａＤｕｅ：Ｓｅｒｕｍ ｇｌｕｔａｍ
ｉｃ ｐｙｒｕｖｉｃ ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅｉｎ
ｃａｒｄｉａｃ ａｎｄ ｈｅｐａｔｉｃ ｄｉｓｅ
ａｓｅ．Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅ
ｄ．，９１：５６９，１９５６に従い測定）が、３５Ｉ
Ｕ／ｌまたはそれ以上を示す４．８ｌのヒト血漿を蔗糖
３０％（Ｗ／Ｗ）溶液に重層後、遠心（４８，０００×
ｇ、１３時間、４℃）し、沈殿を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・
ＨＣｌ ｐＨ ８．０−１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液に懸濁し
て、再び遠心（２５０，０００×ｇ、３時間、４℃）
後、得られた沈殿を７５ｍｌの５．５Ｍ ＧＴＣ溶液
（５．５Ｍ グアニジンチオシアネート、２０ｍＭ ク
エン酸ソーダ ｐＨ７．０、０．０５％ サルコシール
（ラウリルサルコシン酸ナトリウム）、０．１Ｍ ２−
メルカプトエタノール）に溶解し、１６ｍｌのＣｓＴＦ
Ａ−０．１Ｍ ＥＤＴＡ溶液（ρ＝１．５１）上に重層
の後、遠心（１４０，０００×ｇ、２０時間、１５℃）
してＲＮＡを沈殿させる。上清中のたん白質やＤＮＡを
吸引して除き、沈殿を２００μｌのＴＥ（１０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ・ＨＣｌｐＨ８．０，１ｍＭ ＥＤＴＡ）溶液に
溶解し、２０μｌの３Ｍ 塩化ナトリウムとエタノール
を加え、−７０℃に９０分間静置する。遠心（１２，０
００×ｇ、３０分、４℃）し、沈殿をＴＥに溶解し、上
記と同様に、塩化ナトリウムとエタノールを加え、−７
０℃で静置し、生じた沈殿を１０μｌのＴＥに溶解し精
製ＲＮＡを得た。
【００７４】（２）ＮＡＮＢＶゲノムＲＮＡに相補的な
ｃＤＮＡの作製の為の肝臓由来ＲＮＡの調製：ＮＡＮＢ
型肝炎患者の切除肝より岡山等の方法（Ｈ．Ｏｋａｙａ
ｍａ，Ｍ．Ｋａｗａｉｃｈｉ，Ｍ．Ｂｒｏｗｎｓｔｅｉ
ｎ，Ｆ．Ｌｅｅ，Ｔ．Ｙｏｋｏｔａ，ａｎｄ Ｋ．Ａｒ
ａｉ：Ｈｉｇｈ−Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ ｏｆ Ｆｕｌｌ−Ｌｅｎｇｔｈ ｃＤＮＡ；Ｃｏｎ
ｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄＳｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ
ｃＤＮＡ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｌｉｂｒａｒｉｅ
ｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ．Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５４．３−
２８，１９８７）でＮＡＮＢＶゲノムＲＮＡを調製し
た。
【００７５】即ち、切除肝１ｇを細片化し、上記（１）
の１００ｍｌの５．５Ｍ ＧＴＣ溶液に懸濁し、テフロ
ン−ガラスホモジナイザーを用いてホモジナイズした。
次いで、♯１８注射針付注射器を挿入して、ホモジネー
トを出し入れして、ＤＮＡを機械的に切断する。低速遠
心（１，５００×ｇ、１５分、４℃）して得られた上清
を、上記（１）に記載したと実質的に同様の方法でＣｓ
ＴＦＡ溶液上に重層し、遠心後、得られた沈殿のＲＮＡ
画分を、０．４ｍｌの４Ｍ ＧＴＣ溶液に懸濁し、１０
μｌの１Ｍ酢酸および３００μｌのエタノールを加え、
−２０℃で少なくとも３時間静置しＲＮＡを沈殿させ
る。遠心（１２，０００×ｇ、１０分、４℃）して、沈
殿をＴＥ溶液に溶解し、１００μｌの２Ｍ 塩化ナトリ
ウム溶液および３ｍｌのエタノールを加え、−２０℃に
３時間静置し、生じた沈殿を遠心にて回収し、１０μｌ
のＴＥに溶解して肝臓由来のＲＮＡを精製した。
【００７６】（３）ｃＤＮＡ合成キットを用いた二本鎖
ｃＤＮＡの調製：市販のｃＤＮＡ合成キット〔Ａｍｅｒ
ｓｈａｍ社（英国）製販〕を用いて二本鎖ｃＤＮＡを調
製した。即ち、上記（１）で得られた精製ＲＮＡ０．７
５μｇをキットに添付の試薬類、２μｌのランダムヘキ
サヌクレオチドプライマー、２μｌの逆転写酵素液を加
え、蒸留水で全量を２０μｌとして、反応液を以下のよ
うに４２℃にて４０分間インキュベートし、ｃＤＮＡの
ファーストストランドを合成し、次いで、氷水中にて冷
やしながら、セカンドストランドの合成を行った。先ず
反応液２０μｌにキット添付のセカンドストランド合成
反応用緩衝液３７．５μｌと大腸菌リボヌクレアーゼＨ
を１μｌ、ＤＮＡポリメラーゼＩ ６．６μｌを加え、
更に、３４．９μｌの蒸留水を加えた。１２℃で６０分
間、次いで、２２℃で６０分間反応後、更に７０℃で１
０分間インキュベートし、氷水にて再度冷やし、Ｔ４Ｄ
ＮＡポリメラーゼを１μｌ加え、３７℃で１０分間イン
キュベート後、４μｌの０．２５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ
８．０）を加え、反応を停止させ、フェノール／クロロ
ホルムをよく混和後、遠心（１２，０００×ｇ、１分
間）し、水層を分離した。水層は更に上述の抽出操作を
１回繰り返した後、クロロホルムを等量加え、よく撹拌
の後、遠心して水層を分離し、次いで等量の４Ｍ酢酸ア
ンモニウムと２倍量のエタノールを加え、−７０℃にて
冷やし、精製した二本鎖ｃＤＮＡを沈殿させた。沈殿は
５０μｌの２Ｍ酢酸アンモニウムに溶解後、１００μｌ
のエタノールを加え、−７０℃にて再び沈殿させ、遠心
（１２，０００×ｇ、１０分）により沈殿を回収し、乾
燥した後、２０μｌのＴＥに溶解した。
【００７７】（４）ポリメラーゼチェインリアクション
（ＰＣＲ）法による二本鎖ｃＤＮＡの調製：上記（１）
および（２）で調製したＲＮＡを鋳型として、逆転写酵
素を用いて調製したｃＤＮＡを、夫々ＰＣＲ法（Ｓａｉ
ｋｉ，Ｒ．Ｋ；Ｇｅｌｆａｎｄ，Ｄ．Ｈ；Ｓｔｏｆｆｅ
ｒ，Ｓ；Ｓｃｈａｒｆ，Ｓ．Ｊ；Ｈｉｇｕｃｈｉ，Ｒ；
Ｈｏｒｎ，Ｇ．Ｔ；Ｍｕｌｌｉｓ，Ｋ．Ｂ；ａｎｄ Ｅ
ｒｌｉｃｈ，Ｈ．Ａ．：Ｐｒｉｍｅｒ−ｄｉｒｅｃｔｅ
ｄ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｏｆ ＤＮＡ ｗｉｔｈ ａ ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂ
ｌｅ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ． Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２３９：４８７−４９１，１９８８）により増幅し
た。即ち、ＲＮＡ５〜１，０００ｎｇを２０μｌの逆転
写酵素液｛５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ ｐＨ ８．
３，４０ｍＭ ＫＣｌ，６ｍＭ ＭｇＣｌ2、１μＭ
３’−プライマーＧ（図２−１４の塩基番号第７９４９
番から第７９７３番の２５個の塩基を含む合成オリゴヌ
クレオチド）、１０ｍＭのｄＮＴＰおよび０．５単位の
逆転写酵素〔Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ Ｌａ
ｂ．，（米国）〕｝中で３７℃、３０分間インキュベー
トする。次いで、８０μｌのＰＣＲ反応液｛１８ｍＭ
Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ ｐＨ ８．３、４８ｍＭ ＫＣｌ、
１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．６μＭずつの５’−プラ
イマー（図２−１３の塩基番号第７６１２番から第７６
３６番の２５個の塩基を含む合成オリゴヌクレオチド）
および上記の３’−プライマー、１０ｍＭのｄＮＴＰお
よび２．５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ〔Ｐｅｒ
ｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ社（米国）製販〕を加
え、９４℃で１分間、５０℃で２分間、７２℃で３分間
のインキュベーションを４０回繰り返し、アガロースゲ
ル電気泳動にて、増幅されたｃＤＮＡを回収した。フェ
ノール処理および、エタノール沈殿させた後乾燥させ、
１０μｌのＴＥに溶解した。
【００７８】（５）ラムダｇｔ１１を用いたｃＤＮＡラ
イブラリーの作製：市販のｃＤＮＡクローニングキット
〔Ａｍｅｒｓｈａｍ社（英国）製販〕を用いて、ｃＤＮ
Ａライブラリーを作製した。即ち、上記（３）で調製し
た１３０ｎｇのｃＤＮＡにクローニングキットに添付の
Ｌ／Ｋ緩衝液２μｌ、ＥｃｏＲＩアダプター２μｌ、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼ２μｌを加え、更に蒸留水にて全量を
２０μｌとし、１５℃にて１６〜２０時間インキュベー
ト後、０．２５Ｍ ＥＤＴＡを２μｌ加え、反応を停止
させた。次いで、キットに添付されているサイズ分画カ
ラムを通し、ｃＤＮＡに連結されなかったＥｃｏＲＩア
ダプターを除去した後、ＥｃｏＲＩアダプター連結ｃＤ
ＮＡ７００μｌにＬ／Ｋ緩衝液８３μｌとＴ４ポリヌク
レオチドキナーゼ８μｌを加えて３７℃にて３０分間イ
ンキュベートする。次いで、フェノール抽出を２回し、
ブタノールにて３５０〜４００μｌに濃縮し、エタノー
ル沈殿させたものを５μｌのＴＥに溶解した。
【００７９】次に、クローニングベクターラムダｇｔ１
１のＥｃｏＲＩ部位にＥｃｏＲＩアダプター付加ｃＤＮ
Ａを挿入するために、上記のＥｃｏＲＩアダプター連結
ｃＤＮＡ１μｌ（１０ｎｇ）にＬ／Ｋ緩衝液１μｌ、ラ
ムダｇｔ１１アームＤＮＡ２μｌ（１μｇ）およびＴ４
ＤＮＡリガーゼ２μｌを加え、蒸留水にて混合液の全量
を１０μｌとして、１５℃で１６〜２０時間インキュベ
ートして組換えラムダｇｔ１１ＤＮＡ液を作製した。更
に、ｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージングを行い、組換えラ
ムダファージを得るため、市販のｉｎ ｖｉｔｒｏパッ
ケージングキット〔Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社（米国）製
販〕のＧｉｇａｐａｃｋＩＩ ＧｏｌｄのＡ液１０μｌ
とＢ液１５μｌを上記の組換えラムダｇｔ１１ＤＮＡ液
４μｌに加え、２２℃にて２時間インキュベート後、添
付のＳＭ緩衝液４７０μｌとクロロホルム１０μｌを加
え、組換えファージを４℃に保存した。
【００８０】（６）大腸菌プラスミドｐＵＣ１９を用い
たｃＤＮＡクローニング：市販のＤＮＡライゲーション
キット〔宝酒造社（日本）製販〕を用いて、ｃＤＮＡを
大腸菌プラスミドｐＵＣ１９（Ｃ．Ｙａｎｉｓｈｉ−Ｐ
ｅｒｒｏｎ，Ｊ．Ｖｉｅｉｒａ，Ｊ．Ｍｅｓｓｉｎｇ，
Ｇｅｎｅ ３３，１０３，１９８５）に挿入し、大腸菌
にてクローニングした。即ち、上記（４）でポリメラー
ゼチェインリアクション（ＰＣＲ）法にて調製したｃＤ
ＮＡ５μｌと制限酵素ＳｍａＩで切断後、脱リン酸化し
たプラスミドｐＵＣ１９ＤＮＡ ５μｌ（５０ｎｇ）に
キット添付のＡ液４０μｌとＢ液１０μｌを加え、１５
℃にて１６時間インキュベートする。この様にして得ら
れたプラスミドＤＮＡで大腸菌ＪＭ１０９株（Ｍｅｓｓ
ｉｎｇ，Ｊ；Ｃｒｅａ，Ｒ．ａｎｄ Ｓｅｅｂｕｒｇ，
Ｐ．Ｈ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９，
３０９，１９８１）を塩化カルシウム法（Ｍａｎｄｅ
ｌ，Ｍ．ａｎｄ Ａ．Ｈｉｇａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，５３，１５４，１９７０）により形質転換し、ｃ
ＤＮＡを連結したプラスミドを含む形質転換大腸菌を得
た。
【００８１】（７）ｃＤＮＡライブラリーからのＮＡＮ
ＢＶ遺伝子を有するクローンのスクリーニング：大腸菌
Ｙ１０９０株（Ｒｉｃｈａｒｄ Ａ．Ｙｏｕｎｇ ａｎ
ｄ Ｒｏｎａｌｄ Ｗ．Ｄａｖｉｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，
２２２，７７８，１９８３）を５０ｍｌのＬＢＭ培地
（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％塩化ナト
リウム、５０μｇ／ｍｌアンピシリンおよび０．４％マ
ルトース）にて３７℃で培養し、対数増殖期の大腸菌細
胞を氷冷した１５ｍｌの１０ｍＭ硫酸マグネシウムに懸
濁した。上記（５）で得られたファージ液をＳＭ緩衝液
（０．１Ｍ塩化ナトリウム、８ｍＭ硫酸マグネシウム、
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ ｐＨ７．５、０．０１％
ゲラチン）にて希釈し、この希釈ファージ液０．１ｍｌ
と上記大腸菌細胞懸濁液を等量混合して、３７℃にて１
５分間インキュベート後、４５℃に加温した４ｍｌの軟
寒天培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．
５％塩化ナトリウム、０．２５％硫酸マグネシウムおよ
び０．７％寒天 ｐＨ７．０）を加え、Ｌ−寒天培地
（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％塩化ナト
リウム、１００μｇ／ｍｌアンピシリン ｐＨ７．０）
のプレートにまき、４２℃で３時間インキュベートし
た。次いで、１０ｍＭ ＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ
β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄ
ｅ）を浸み込ませ、乾燥させたニトロセルロースフィル
ターをプレート上に密着させ、更に３７℃にて３時間イ
ンキュベートした。分離したフィルターをＴＢＳ緩衝液
で３回洗浄し、２％ウシ血清アルブミン液に浸し、室温
にて１時間インキュベートした。市販のイムノスクリー
ニングキット〔Ａｍｅｒｓｈａｍ社（英国）製販〕に添
付の大腸菌溶解液をＮＡＮＢ型肝炎患者血清に１／２０
容量加えて、室温に３０分インキュベートした後、０．
２％ウシ血清アルブミン加ＴＢＳ緩衝液にて５０倍希釈
したものにこのフィルターを浸し、室温にて１時間反応
させた。
【００８２】得られたフィルターは０．０５％Ｔｗｅｅ
ｎ２０を含むＴＢＳ緩衝液にて４回洗浄し、パーオキシ
ダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ〔Ｃａｐｐｅｌ社（独）製販〕
を１０００倍希釈した抗体液に１時間浸し、上述のＴｗ
ｅｅｎ−ＴＢＳ緩衝液にて洗浄し、５０ｍｌのＴＢＳ緩
衝液に０．４ｍｌのＤＡＢ（３，３’−ｄｉａｍｉｎｏ
ｂｅｎｚｉｄｉｎｅ ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒ
ｉｄｅ）と３０％過酸化水素液１５μｌを加えた液に浸
し、５〜３０分間、室温にてインキュベートし発色さ
せ、フィルターを蒸留水で完全に水洗し反応を停止し
た。
【００８３】上記の操作により、得られたプラークの純
化を行い、９個の陽性クローンを単離した。これらのク
ローンを夫々、ＢＫ１０２、ＢＫ１０３、ＢＫ１０５、
ＢＫ１０６、ＢＫ１０８、ＢＫ１０９、ＢＫ１１０、Ｂ
Ｋ１１１およびＢＫ１１２と命名した。これ等のクロー
ンはいずれも正常人血清とは反応せず、ＮＡＮＢ型肝炎
患者血清と特異的に反応した（第１表）。
【００８４】 第１表 ＮＡＮＢＶ型肝炎患者血清と組換えラムダｇｔ１１ファージクローンの 反応性 正常人 クローン 血 清 ＮＡＮＢ型肝炎患者血清 ＢＫ１０２ ０／１０＊ １０／１１ ＢＫ１０３ ０／１０ ９／１１ ＢＫ１０５ ０／１０ １１／１１ ＢＫ１０６ ０／１０ １１／１１ ＢＫ１０８ ０／１０ ９／１１ ＢＫ１０９ ０／１０ ９／１１ ＢＫ１１０ ０／１０ ９／１１ ＢＫ１１１ ０／１０ ９／１１ＢＫ１１２ ０／１０ １０／１１ ＊：陽性数／検体数
【００８５】（８）得られたクローンの塩基配列の決
定：クローンＢＫ１０２〜ＢＫ１１２の組換え体ファー
ジＤＮＡを回収し、制限酵素ＥｃｏＲＩで消化後、ＮＡ
ＮＢＶのｃＤＮＡ断片を単離し、個別にプラスミドｐＵ
Ｃ１９のＥｃｏＲＩサイトに組込み、プラスミドを用い
て大腸菌ＪＭ１０９株を上記（７）と実質的に同様の方
法で形質転換した。これ等の形質転換大腸菌よりプラス
ミドＤＮＡを精製し、７−ＤＥＡＺＡシークエンスキッ
ト〔宝酒造社（日本）製販、Ｍｉｚｕｓａｗａ，Ｓ．，
Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｓ．ａｎｄ Ｓｅｅｌａ，Ｆ．，
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１４，１３１
９，１９８６〕を用いて夫々のＮＡＮＢＶｃＤＮＡの塩
基配列の決定を行った。得られたｃＤＮＡクローンの塩
基配列の相互関係を図１−１に示した。
【００８６】（９）ジーンウォーキングによるｃＤＮＡ
ライブラリからのＮＡＮＢＶｃＤＮＡクローンのクロー
ニング：上記（８）で得たクローンＢＫ１０２、ＢＫ１
０６およびクローンＢＫ１１２のｃＤＮＡ断片を32Ｐ−
ｄＣＴＰでラベルしたプローブを調製し、上記（５）で
得たクローニングベクターラムダｇｔ１１のｃＤＮＡラ
イブラリーからハイブリダイゼーションによりＮＡＮＢ
ＶｃＤＮＡを含有するファージクローンを得た。即ち、
上記（８）で得たクローンＢＫ１０２、ＢＫ１０６およ
びＢＫ１１２の形質転換大腸菌よりアルカリ法（Ｍａｎ
ｉａｔｉｓ Ｔ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ
Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．：Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ
Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ ａｎｄ Ｐｌａｓｍｉ
ｄ ＤＮＡ：“ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ”Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．，ｐｐ
７５−９６．）にてプラスミドＤＮＡを調製した。
【００８７】クローンＢＫ１０２のプラスミドＤＮＡは
制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｃＩＩにより消化し、生じた
該ＤＮＡの５’末端側の０．７Ｋｂの断片をアガロース
ゲル電気泳動後、回収した。クローンＢＫ１０６および
クローンＢＫ１１２のプラスミドＤＮＡは制限酵素Ｎｃ
ｏＩで消化し、上述と同様にして、クローンＢＫ１０６
からは１．１ＫｂのＤＮＡ断片を、また、クローンＢＫ
１１２からは３’末端側の０．７Ｋｂの断片をそれぞれ
回収した。２５ｎｇ〜１μｇのＤＮＡ断片を、市販のＤ
ＮＡラベリングキット（ニッポンジーン社製）を用い
〔α−32Ｐ〕ｄＣＴＰ〔３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、Ａｍ
ｅｒｓｈａｍ社（英国）製〕で、３７℃にて３〜５時間
インキュベートすることにより、ハイブリダイゼーショ
ン用のプローブを調製した。
【００８８】次に、上記（５）で得られたｃＤＮＡライ
ブラリーのファージを、上記（７）に記載のごとくＬ−
寒天培地にて４２℃で３時間、次いで、３７℃で３時間
インキュベート後、冷却し、ニトロセルロースフィルタ
ーをのせ３０〜６０秒放置して、ファージをフィルター
に吸着させた。０．５Ｎ水酸化ナトリウム−１．５Ｍ塩
化ナトリウム液で１〜５分アルカリ変性し、０．５Ｍ
Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ ｐＨ８．０−１．５Ｍ塩化ナトリウ
ム液で１〜５分中和後、２×ＳＳＣ液（０．３Ｍ塩化ナ
トリウム−０．０３Ｍクエン酸ナトリウム）で洗浄し、
風乾後８０℃で２時間焼付けを行った。
【００８９】このフィルターをハイブリダイゼーション
液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａ
ｒｔ液、５０ｍＭリン酸クエン酸緩衝液 ｐＨ６．５、
１００μｇ／ｍｌ鮭精子ＤＮＡおよび０．１％ＳＤＳ）
にて４２℃、６時間インキュベートした後、上記の約４
×１０8ｃｐｍ／ｍｌのプローブを１ｍｌ加えた上記の
ハイブリダイゼーション液３００ｍｌに再び浸し、４２
℃にて１６〜２０時間インキュベートし、０．１％ ２
×ＳＳＣを含むＳＤＳ液で４回、０．１％ ０．１×Ｓ
ＳＣを含むＳＤＳ液で２回洗浄後、乾燥し、オートラジ
オグラフィーを行い、ハイブリダイゼーション陽性を示
すクローンを単離した。この結果、クローンＢＫ１０２
由来のプローブと反応する２７クローン、クローンＢＫ
１０６由来のプローブと反応する１４クローンおよび、
クローンＢＫ１１２由来のプローブと反応する１３クロ
ーンを得、夫々のクローンはＢＫ１１４〜ＢＫ１６９と
順次命名した。
【００９０】更に、上記（８）に記載のごとくクローン
ＢＫ１１４〜ＢＫ１６９夫々の塩基配列の決定を行い、
各クローンのマッピングを行ったところ、ＮＡＮＢＶゲ
ノムのほぼ全長と考えられる約９．５Ｋｂの長さを有す
る塩基配列がマップされた（図１−２）。この内、５’
末端側に位置するクローンＢＫ１５７の制限酵素Ｋｐｎ
Ｉ消化により５’末端側０．５５Ｋｂの断片を回収し、
また３’の最末端側に位置するクローンＢＫ１１６の制
限酵素ＨｐａＩとＥｃｏＲＩの消化により３’末端側
０．５５Ｋｂの断片を回収し、上記のごとく32Ｐで標識
したプローブを調製し、上記（５）で得られたｃＤＮＡ
ライブラリーのファージをプラークハイブリダイゼーシ
ョンした結果、クローンＢＫ１５７由来のプローブによ
り新たに３個のクローンを分離し、夫々クローンＢＫ１
７０、ＢＫ１７１およびＢＫ１７２と命名した。
【００９１】（１０）ｃＤＮＡの塩基配列の解析：上記
（８）および（９）により得られたクローンの塩基配列
からＮＡＮＢＶ遺伝子の全塩基配列を決定し、図２−１
から図２−１６に示した。これらの図より、クローニン
グされたＮＡＮＢＶ遺伝子ｃＤＮＡは９４１６塩基より
成り、この内に９０３０塩基から成るオープンリーディ
ングフレームが存在し、３０１０個のアミノ酸残基のポ
リプロテインがコードされていると推定された。このプ
ロテインの親水性／疎水性のパターンは、既に報告され
ているフラビウイルスのパターン（Ｓｕｍｉｙｏｓｈｉ
Ｈ．，ＭｏｒｉＣ．，Ｆｕｋｅ Ｉ． ｅｔ ａ
ｌ．，Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅ
ｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｅｎ
ｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒ
ＮＡ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１６１，４９７−５１０，
１９８７）に類似していた。代表的クローンとしてＢＫ
１５７（塩基番号第１番から第１９６２番）、クローン
ＢＫ１７２（第５番から第３６６番）、クローンＢＫ１
５３（第３３８番から第１８０２番）、クローンＢＫ１
３８（第１７５５番から第５１２４番）、クローンＢＫ
１２９（第４１０４番から第６９７３番）、クローンＢ
Ｋ１０８（第６８８６番から第８３４４番）、およびク
ローンＢＫ１６６（第８０８２番から第９４１６番）挙
げることができる。これ等のクローンは、夫々、Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＫ１０８（微工研条寄
第２９７１号）、ＢＫ１２９（微工研条寄第２９７２
号）、ＢＫ１３８（微工研条寄第２９７３号）、ＢＫ１
５３（微工研条寄第２９７４号）、ＢＫ１５７（微工研
条寄第３２４３号）、ＢＫ１６６（微工研条寄第２９７
５号）およびＢＫ１７２（微工研条寄第２９７６号）と
して保存した。更に上記クローンに加え、ＢＫシリーズ
の代表例として、次の５クローンが微工研に寄託されて
いる：ＢＫ１０２（微工研条寄第３３８４号）、ＢＫ１
０６（微工研条寄第３３８５号）、ＢＫ１１２（微工研
条寄第３３８６号）、ＢＫ１４６（微工研条寄第３３８
７号）、ＢＫ１４７（微工研条寄第３３８８号）。
【００９２】（１１）ＮＡＮＢＶ感染に併う抗体応答に
関連したＮＡＮＢＶ関連抗原の大腸菌における産生：上
記（８）で得られたクローンＢＫ１０６、ＢＫ１１１、
およびＢＫ１１２と上記（９）で得られたクローンＢＫ
１４７の夫々のｃＤＮＡが個別に挿入されたプラスミド
ＤＮＡを従来のアルカリ法にて回収した。次いで、クロ
ーンＢＫ１０６の回収されたＤＮＡは制限酵素ＥｃｏＲ
ＩおよびＣｌａＩで消化し、０．３４ＫｂのＤＮＡ断片
０．５μｇを得、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ反応液（６７
ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ ｐＨ８．８，６．７ｍＭ塩化マ
グネシウム、１６．６ｍＭ硫酸アンモニウム、１０ｍＭ
２−メルカプトエタノール、６．７μＭ ＥＤＴＡ、
０．０２％ウシ血清アルブミン、０．３ｍＭ ｄＮＴＰ
および２〜５単位のＴ４ＤＮＡポリメラーゼ）中で、３
７℃にて６０分、インキュベートし、両末端を平滑にし
た。クローンＢＫ１０２のＤＮＡは制限酵素ＢａｍＨＩ
で消化し、０．７ＫｂのＤＮＡ断片０．５μｇを上記と
同様にしてＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて末端を平滑
にした。クローンＢＫ１４７のＤＮＡは制限酵素Ｓａｕ
３ＡＩで消化し、１ＫｂのＤＮＡ断片０．５μｇを上記
と同様にして末端を平滑にした。また、クローンＢＫ１
１１のＤＮＡは制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、１Ｋｂの
ＤＮＡ断片０．５μｇを実質的に上記と同様にして末端
を平滑にした。次に、発現ベクターｐＫＫ２３３−２
（Ａｍａｎｎ，Ｅ．ａｎｄ Ｂｒｏｓｉｕｓ，Ｊ．ＡＴ
Ｇ ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｈｉ
ｇｈ−ｌｅｖｅｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌ
ｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ．Ｇｅｎｅ， ４０，１８３，１９８５）の
ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化後、このＤＮＡ
２μｇをＳ１ヌクレアーゼ液（０．３Ｍ塩化ナトリウ
ム、５０ｍＭ酢酸ナトリウム ｐＨ４．５、１ｍＭ硫酸
亜鉛および１００〜２００単位のＳ１ヌクレアーゼ）中
で、３７℃にて２０分間インキュベートし、０．１２Ｍ
ＥＤＴＡおよび１Ｍ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ９．
０）液を１／１０容量加えて反応を停止し、フェノール
抽出を行った後、平滑末端となったベクターＤＮＡをエ
タノールで沈殿させ回収した。一方、ベクターｐＫＫ２
３３−２のＤＮＡは制限酵素ＰｓｔＩで消化後、フェノ
ール抽出とエタノール沈殿により精製した後、このＤＮ
Ａ２μｇを上記のＴ４ポリメラーゼ反応により末端を平
滑にした。この様にして得たクローンＢＫ１０６および
ＢＫ１１１由来のＤＮＡ断片は０．５μｇ夫々制限酵素
ＨｉｎｄＩＩＩで開裂後、また、クローンＢＫ１０２お
よびＢＫ１４７由来のＤＮＡ断片０．５μｇは夫々制限
酵素ＰｓｔＩで開裂後、平滑末端としたベクターＤＮＡ
０．５μｇと混合し、２μｌの１０×ライゲーション液
（５００ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ ｐＨ７．５、１００
ｍＭ塩化マグネシウム、１００ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭ
ＡＴＰ、３００〜４００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼお
よび蒸留水）を加えて夫々２０μｌに調整して、１４℃
にて１２〜１８時間インキュベートし、得られたプラス
ミドを夫々、ｐＣＥ−０６、ｐＥ−１１、ｐＢ−０２、
およびｐＳ−０９と命名した。次に、これらのプラスミ
ドＤＮＡを用い、実質的に上記（６）に記載のごとく大
腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、形質転換大腸菌を得、
ＬＢ培地（１％ Ｗ／Ｖトリプトン、０．５％ Ｗ／Ｖ
イーストエキストラクト、および１％ Ｗ／Ｖ塩化ナト
リウム、ｐＨ７．５）で３７℃にて培養し、対数増殖期
に１ｍＭ ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラ
クトピラノシド）を添加し、更に３時間培養した。更に
大腸菌細胞を遠心（１０，０００×ｇ、１５分間）によ
り回収し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
に溶解し、超音波処理（２０ＫＨｚ、６００Ｗ，５分
間）後、遠心（１０，０００×ｇ、１５分間）により上
清と沈殿に分画し、夫々をサンプル緩衝液（２０％ Ｖ
／Ｖグリセロール、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌｐＨ
６．８、２％ Ｗ／Ｖ ＳＤＳ、２％ Ｖ／Ｖ ２−メ
ルカプトエタノール、および０．０２％ ＢＰＢ）に溶
解し、１００℃で３０分間加熱後、０．１％ ＳＤＳ−
７．５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、蛋白を分
離し、トランス・ブロットセル〔ＢＩＯ・ＲＡＤ社（米
国）製販〕にてニトロセルロースフィルターに転写し
た。次いで、フィルターを３％ゲラチン液に浸し、６０
分放置後、１００倍希釈したＮＡＮＢ型肝炎患者血清と
室温にて２〜３時間インキュベートし、まず蒸留水で、
次にＴＴＢＳ液（０．０２Ｍ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ ｐＨ
７．５、０．５Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０５％ Ｖ
／Ｖ Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄した。次いで、２０００
倍希釈したパーオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体液に
浸し、室温にて９０分間インキュベートした。そして、
蒸留水およびＴＴＢＳで洗浄した後、上記（７）に記載
のごとく発色剤ＤＡＢおよび基質の３０％過酸化水素液
をくわえた緩衝液に５〜３０分間浸し、水洗して反応を
停止した。
【００９３】この結果、第２表に示すごとくいずれのプ
ラスミドの産生する抗原もＮＡＮＢ型肝炎患者の血清と
特異的に反応し、これらのプラスミドに挿入されたｃＤ
ＮＡの産生する蛋白が臨床的に重要であることが示され
た。 第２表 各種プラスミドの産生する蛋白とＮＡＮＢ型肝炎患者血清のウエスタン ブロット法による反応性 ｃＤＮＡ ＮＡＮＢ型肝炎 健常人 プラスミド の由来 抽出物 患者血清 血清 ｐＣＥ−０６６ ＢＫ１０６ Ｓ ± − Ｐ ＋ − ｐＥ−１１−８９ ＢＫ１１１ Ｓ ± − Ｐ ＋ − ｐＢ−０２−１０ ＢＫ１０２ Ｓ ＋ − Ｐ − − ｐＳ−０９−７ ＢＫ１０９ Ｓ ± − Ｐ ＋ − ｐＫＫ２３３−３ − Ｓ − − Ｐ − − Ｓ：遠心上清 Ｐ：遠心沈渣 ＋：陽性 ±：弱陽性 −：陰性
【００９４】（１２）大腸菌の産生したＮＡＮＢＶ関連
抗原の精製および肝疾患患者血清との反応性： 発現ベ
クターに挿入されたｃＤＮＡの産生する蛋白の有用性
は、これらの蛋白を精製し、ＥＬＩＳＡまたはラジオイ
ムノアッセイ用抗原として用いる事によって示された。
即ち、上記（１１）で得た形質転換大腸菌の菌体破砕液
を遠心（１０，０００×ｇ、１５分間）により上清と沈
殿に分画した。例えば、形質転換体ＪＭ１０９／ｐＣＥ
０６６より得られた沈殿を１００ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣ
ｌ（ｐＨ８．０）−０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１０
０溶液に懸濁し、超音波処理（２０ＫＨｚ、６００Ｗ、
１分間）後、遠心（２１，０００×ｇ、１５分間）し
て、沈殿を１００ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．
０）−６Ｍ尿素に再懸濁後、超音波処理を行った。
【００９５】得られた上清は、１０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７．５）−６Ｍ尿素に対し透析し、抗原液を２０
ｍｌ、上述の緩衝液にて平衡化したヒドロキシアパタイ
ト充填カラム（２１．５×２５０ｍｍ）に通し抗原を充
填物に吸着させ、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）により上述緩衝液中で塩化ナトリウムの０〜２Ｍ直
線濃度勾配溶出を行い、抗原を含む画分を得、５０ｍＭ
炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）−０．０５％ドデシル硫酸ナ
トリウム（ＳＤＳ）に透析した。
【００９６】また、形質転換体ＪＭ１０９／ｐＢ−０２
−１０の菌体破砕液の遠心上清（１０，０００×ｇ、１
５分間）を３５％飽和硫酸アンモニウム処理し、得られ
た沈殿を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．５）−
１００ｍＭ ２−メルカプトエタノールに溶解して、同
緩衝液に透析した。次いで、同緩衝液にて平衡化したＤ
ＥＡＥ−セルロースカラム（２２．０×２００ｍｍ）に
透析済の試料１００ｍｌを通し抗原を充填物に吸着さ
せ、高速液体クロマトグラフィーにより５０ｍＭＴｒｉ
ｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．５）−１００ｍＭ ２−メルカプ
トエタノール中で塩化ナトリウムの０〜２Ｍ直線濃度勾
配溶出を行い、抗原を含む画分をプールした。
【００９７】この画分は１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
６．８）−１００ｍＭ ２−メルカプトエタノールに透
析し、同緩衝液にて平衡化したＨＰＬＣ用ハイドロキシ
アパタイトカラムを通し抗原を充填物に吸着させた後、
高速液体クロマトグラフィーによりリン酸の１０〜４０
０ｍＭ直線濃度勾配溶出を行い、抗原を含む画分をプー
ルし、５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）−０．０５％
ＳＤＳ液に透析した。更に、形質転換体ＪＭ１０９／ｐ
Ｅ−１１−８９の菌体破砕液の遠心沈殿は、１０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ５．５）に懸濁し、超音波処理を１分
間行い、遠心（２１，０００×ｇ、１５分間）した。得
られた沈殿は１００ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ１０．５）−
５００ｍＭ塩化ナトリウム−１０ｍＭ ＥＤＴＡ溶液に
懸濁し、再び超音波処理を１分間行い、遠心上清を３０
ｍＭリン酸緩衝液−６Ｍ尿素に対し透析した。次いで、
透析に用いたと同様の緩衝液で平衡化した高速液体クロ
マトグラフィー（ＨＰＬＣ）用ＣＭ−セルロースカラム
（２２×２００ｍｍ）に２０ｍｌの透析液を通し抗原を
充填物に吸着させ、同緩衝液中で塩化ナトリウムの０〜
１．５Ｍ直線濃度勾配溶出を行い、抗原を含む画分を
得、５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）−０．０５％Ｓ
ＤＳに透析し、抗原液を得た。
【００９８】上記のごとく調製した抗原は、ＥＬＩＳＡ
用抗原として、ＮＡＮＢ型肝炎ウイルス感染の臨床的診
断に用いることができた。夫々の上記の精製抗原を蛋白
濃度１μｇ／ｍｌに調製し、ＥＬＩＳＡ用マイクロプレ
ート・イムロン６００〔ＩＭＭＵＬＯＮ（登録商標）、
Ｇｒｅｉｎｅｒ社（独）製販〕の各ウェルに分注し、４
℃にて一夜静置する。各ウェルはＰＢＳ−Ｔ緩衝液（１
０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．２、０．８％塩化ナトリウ
ムおよび０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）で３回よく洗浄
し、ＰＢＳ−Ｔ緩衝液で希釈した被検血清を１００μｌ
／ウェル加え、３７℃にて１時間反応させた。ＰＢＳ−
Ｔ緩衝液で３回洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩ
ｇＧ抗体〔Ｃａｐｐｅｌ社（独）製販〕を１０％牛胎児
血清を含むＰＢＳ−Ｔ緩衝液にて８，０００倍希釈した
ものを各ウェルに１００μｌづつ加え、３７℃にて１時
間反応後、再び、ＰＢＳ−Ｔ緩衝液で４回洗浄し、基質
発色剤溶液（９ｍｌの０．０５Ｍクエン酸−リン酸緩衝
液に０．５μｇのｏ−フェニレンジアミンと過酸化水素
水２０μｌを含む）を各ウェルに１００μｌづつ加え、
プレートを遮光して室温で６０分静置した。４Ｎ硫酸を
各ウェルに７５μｌづつ加え、４９０ｎｍの吸光度を測
定した。第３表に示した結果から明らかなように、いず
れの形質転換体由来抗原もＮＡＮＢ型肝炎患者血清と特
異的に反応することから、これらの形質転換体の産生す
る抗原の臨床診断における有用性が実証された。
【００９９】 第３表 各種形質転換大腸菌より精製した抗原とＮＡＮＢ型肝炎患者血清とのＥ ＬＩＳＡによる反応性 抗原の由来 輸血後肝炎患者血清 健常人 （形質転換大腸菌） 急性 慢性 肝硬変 肝癌 血清 ＪＭ１０９／ｐＣＥ−０６６ ２／３＊ ７／８ ３／４ ３／３ ０／１０ ＪＭ１０９／ｐＢ−０２−１０ ２／３ ８／８ ４／４ ３／３ ０／１０ ＪＭ１０９／ｐＥ−１１−８９ ２／３ ８／８ ２／４ ３／３ ０／１０ ＊：陽性数／検体数
【０１００】第３表に示した結果は、上記の抗原を用い
たラジオイムノアッセイによっても得ることが出来た。
即ち、１μｇ／ｍｌの濃度の上記精製抗原液０．２ｍｌ
づつに、直径１／４インチのポリスチレンボール〔ペー
ゼル社（独）製販〕を加え、４℃にて一夜静置する。次
いで、上記ＥＬＩＳＡに用いたＰＢＳ−Ｔ緩衝液にてポ
リスチレンボールを５回洗浄し、被検血清をＰＢＳ−Ｔ
緩衝液で２０〜２５００倍希釈したものを２００μｌづ
つ加え、３７℃にて６０分間反応させる。ＰＢＳ−Ｔ緩
衝液で５回洗浄し、125Ｉ−標識抗ヒトＩｇＧ抗体を２
００μｌづつ加えて３７℃にて１時間反応させた後、Ｐ
ＢＳ−Ｔ緩衝液で５回洗浄し、スチレンボールに結合し
ている125Ｉのｃｐｍを測定する事により、第３表に示
したと同様の結果が得られ、先に得られた精製抗原のＮ
ＡＮＢ型肝炎ウイルス感染の臨床診断における有用性が
示された。
【０１０１】応用例１ 合成ポリペプチドの反応性に関する試験：抗体分子は抗
原分子上に存在する“エピトープ”として知られる特定
の領域の構造と反応するが、これらの特定な領域は抗原
分子上の親水性領域に見られる。この様な特定領域を有
する抗原ポリペプチドは、高い反応特異性を持つ有用な
臨床診断剤を容易に調製し得るものと考えられる。ＮＡ
ＮＢＶのエピトープは、図２−１から図２−１６に示さ
れたＮＡＮＢＶ遺伝子ｃＤＮＡがコードするアミノ酸配
列の親水性／疎水性パターンより推定される。即ち、図
２−１に示される塩基番号第３３３番から第４２２番、
図２−１および図２−２に示される塩基番号第４７４番
から第５６３番、図２−８に示される塩基番号第４４８
５番から第４５７４番、および図２−１０に示される塩
基番号第５５４４番から第５６３３番にコードされるア
ミノ酸残基を夫々含有するポリペプチドＢＫＰ−１０６
−１、ＢＫＰ−１０６−２、ＢＫＰ−１０２−１、およ
びＢＫＰ−１４７−１を合成した。夫々のポリペプチド
は１μｇ／ｍｌの濃度に調製し、実施例１の（１２）に
記載と同様の方法により、ＥＬＩＳＡ用マイクロプレー
トに固相化し、ＥＬＩＳＡ法にて、ＮＡＮＢ型肝炎患者
血清との反応性を試験した。第４表に示した結果から明
らかなように、いずれの合成ペプチドもＮＡＮＢ型肝炎
患者の血清と特異的に反応することから、上記の塩基配
列の特定領域の臨床診断における重要性が示された。
【０１０２】 第４表 合成ポリペプチドとＮＡＮＢ型肝炎患者血清との反応性 ＮＡＮＢ型肝炎患者血清 合成ポリペプチド 急性 慢性 健常人 ＢＫＰ−１０６−１ ２／５ ５／５ ０／５ ＢＫＰ−１０６−２ ２／５ ５／５ ０／５ ＢＫＰ−１０２−１ ３／５ ５／５ ０／５ ＢＫＰ−１４７−１ ２／５ ５／５ ０／５ 更に、ＮＡＮＢＶのエンベロープ蛋白上のエピトープを
推定し、３種の蛋白を合成した。即ち、図２−２に示さ
れる塩基番号第９０６番から第９５３番および第１０２
０番から第１０４６番と、図２−２および図２−３に示
される塩基番号第１１９４番から第１２３２番にコ−ド
される蛋白を合成した。これ等のポリペプチドはいずれ
も、ＮＡＮＢＶの株により抗原変異が生じると考えられ
るエンベロープ領域に対応するものであり、かつ、ＥＬ
ＩＳＡ法により、ＮＡＮＢ型肝炎患者血清との間での反
応が確認されたため、上述の蛋白は疫学調査、臨床診断
および予防接種において重要かつ有用である。
【０１０３】応用例２ ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃ
ｔｉｏｎ）法によるＮＡＮＢＶ核酸の検出：輸血後ＮＡ
ＮＢ型肝炎発症予防には、輸血に供される血液中のＮＡ
ＮＢＶの感染の有無を検定することが重要であり、ま
た、肝疾患の診断のため、肝組織のＮＡＮＢＶ感染の有
無について検討することは、臨床的に極めて重要である
が、本発明のＮＡＮＢＶｃＤＮＡよりポリメラーゼチェ
インリアクション（ＰＣＲ）用プライマーを有利に調製
し、ＮＡＮＢ型肝炎診断に用いることができる。即ち、
実施例１の（１）に記載のごとく、１ｍｌの血清につい
てＲＮＡの精製およびｃＤＮＡの調製を行った。同様に
実施例１の（２）に記載のごとく、肝臓細胞よりｃＤＮ
Ａを調製した。次いで、実施例１の（４）に記載のごと
く、ＰＣＲおよび電気泳動を行い、常法に従い、サザー
ンハイブリダイゼーションによる増幅されたｃＤＮＡが
ＮＡＮＢＶ由来のものであるかの同定を、ＮＡＮＢＶｃ
ＤＮＡクローンＢＫ１０８由来のｃＤＮＡより作成した
32Ｐ−標識プローブを用いて行った。 第５表に示した
結果から明らかなように、本発明により得られたＮＡＮ
ＢＶｃＤＮＡの塩基配列より調製したプライマーおよび
クローニングされたＮＡＮＢＶｃＤＮＡの断片をプロー
ブとして用いる事により、血清中のＮＡＮＢＶ核酸の検
出を行い、血清のＮＡＮＢＶ感染を診断することができ
る。
【０１０４】 第５表 ＰＣＲによるＮＡＮＢＶ核酸の検出 検 体 ＮＡＮＢＶに対する抗体 ＰＣＲ 慢性肝炎患者血清 ＮＡＮＢ型 １ ＋ ＋ ２ ＋ ＋ ＨＢＶキャリアー１ − − ２ − − 健常人 １ − − ２ − − ＮＡＮＢ型肝癌の 切除肝−１ ＋ 癌部 ＋ 非癌部 ＋ ＮＡＮＢ型肝癌の 切除肝−２ ＋ 癌部 ＋ 非癌部 ＋
【０１０５】
【発明の作用と効果】
（１）本発明のＮＡＮＢＶ遺伝子ｃＤＮＡは信頼性が非
常に高く、ＮＡＮＢＶ遺伝子のオープンリーディングフ
レームの全領域を包含するものである。 （２）本発明のＮＡＮＢＶ抗原ポリペプチドは、ＮＡＮ
ＢＶと特異的に反応するため、該ＮＡＮＢＶ抗原ポリペ
プチドを診断剤として用いた場合と、ＮＡＮＢ型肝炎の
診断を高い信頼性をもって容易に実施することができ
る。 （３）本発明のＮＡＮＢＶ抗原ポリペプチドを輸血用血
液のスクリーニングに用いた場合と、ＮＡＮＢＶ感染の
血液を高い信頼性をもって容易に選別し、非感染の血液
から除去することができるため、血液伝播型のＮＡＮＢ
型肝炎の予防が可能となる。 （４）本発明のＮＡＮＢＶ抗原ポリペプチドは、ＮＡＮ
Ｂ型肝炎を予防するワクチンの活性要因として有利に用
いることが可能である。 （５）本発明のＮＡＮＢＶ抗原ポリペプチドにより、Ｎ
ＡＮＢＶに特異的な抗体、特にモノクローナル抗体を、
容易に調製することができ、このＮＡＮＢＶに特異的な
抗体は、ＮＡＮＢ型肝炎検出の診断剤のみならず輸血用
血液からのＮＡＮＢＶの除去剤としても有利に使用する
ことができる。 （６）更にまた、本発明のＮＡＮＢＶ抗原ポリペプチド
が動物のウイルス感染ではなく宿主細胞内に存在する抗
原ポリペプチドをコードするＤＮＡの遺伝子発現により
産生されることに注目すべきであるため、この抗原ポリ
ペプチドの産生段階中の感染の可能性は、実質的に排除
され、且つ産生コストも減少させることができ、産生工
程において用いられる全ての物質、例えば培養系に用い
る培地はその組成に関してはよく知られているため、精
製がたやすく、高純度の抗原ポリペプチド生成物を得る
ことが可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１−１および図１−２は、ＮＡＮＢＶの全領
域に対する本発明のＮＡＮＢＶ遺伝子のｃＤＮＡクロー
ン間の関係を示す。
【図２】図２−１から図２−１６は、本発明のＮＡＮＢ
Ｖ遺伝子ｃＤＮＡ全領域の塩基配列および該塩基配列に
コードされるアミノ酸配列をそれぞれ示す。
【図３】図３は、本発明のＮＡＮＢＶ遺伝子ｃＤＮＡお
よび日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）遺伝子がコードする両
蛋白の間の疎水性指標（疎水性／親水性パターン）の比
較を示す。横軸はアミノ酸Ｎｏ．、縦軸は疎水性指標、
白三角は糖鎖結合可能部位、アステリスクはＲＮＡポリ
メラーゼ共通のアミノ酸配列（Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｓ
ｐ）部位、Ｃ、Ｍ、ＥおよびＮＳはそれぞれ、コア蛋
白、マトリックス蛋白、エンベロープ蛋白、および非構
造蛋白を意味する。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成３年９月２５日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正内容】
【書類名】 明細書
【発明の名称】 非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子ｃＤＮ
Ａおよび抗原ポリペプチド
【特許請求の範囲】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上利用の分野】本発明は、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイル
ス遺伝子ｃＤＮＡおよび非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原ポ
リペプチドに関するものである。更に詳しくは、非Ａ非
Ｂ型肝炎ウイルス抗原ポリペプチドの産生に有用な非Ａ
非Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子ｃＤＮＡおよびその発現産物
である非Ａ非Ｂ型肝炎抗原ポリペプチドに関するもので
ある。本発明の非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子ｃＤＮＡ
は、非Ａ非Ｂ型肝炎のウイルス抗原をコードする遺伝子
及び遺伝子診断剤として有用である。特に、本発明の非
Ａ非Ｂ型肝炎抗原ポリペプチドは非Ａ非Ｂ型肝炎ワクチ
ンや免疫グロブリン、ポリクローナル又はモノクローナ
ル抗体、免疫学的診断剤、輸血用血液のスクリーニング
剤およびアフィニティーカラムクロマトグラフィーによ
る輸血用血液中のＮＡＮＢＶ除去剤等の製造に有用であ
る。
【０００２】
【従来の技術とその問題点】 〔非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスの定義〕：周知の通り、ウイ
ルス性肝炎は肝炎ウイルスの感染に因り生じる肝疾患で
あり、該病原ウイルスとしては現在、Ａ型、Ｂ型、およ
びＤ型（デルタ）の各肝炎ウイルスが分離同定されてい
る。尚、Ｄ型肝炎ウイルス（デルタ肝炎ウイルス）は、
単独では増殖不能の欠損ウイルスであり、その増殖には
常にヘルパーウイルスとしてＢ型肝炎ウイルスを要する
ため、Ｂ型肝炎患者においてのみ存在する。ところが、
１９７４年にＡ型並びにＢ型各肝炎ウイルスの両感染に
因らないウイルス性肝炎例の多数存在することが初めて
報告された。爾来、これに関する研究が世界各地で精力
的に進められ、斯かる肝炎例の総称として、非Ａ非Ｂ
（ｎｏｎ−Ａ，ｎｏｎ−Ｂ）型肝炎なる用語が使用され
るに至った。現在、非Ａ非Ｂ肝炎の病原ウイルスは数種
類、存在すると考えられている。非Ａ非Ｂ型肝炎ウイル
スは、その感染経路により、次の２つに大別される：水
や食物を介して水系伝染する流行性肝炎型ないしは経口
感染型（ｅｎｔｅｒｉｃａｌｌｙ−ｔｒａｓｍｉｔｔｅ
ｄ ｎｏｎ−Ａ，ｎｏｎ−Ｂ）；および主として血液を
介して伝播し輸血後などに多発する血液伝播型（ｂｌｏ
ｏｄ−ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ ｎｏｎ−Ａ，ｎｏｎ−
Ｂ）。そして、斯かるウイルスの分離・同定に関して
は、アフリカ、インド、東南アジアを侵淫地とする既に
ウイルス学的に確定済みの経口感染性非Ａ非Ｂ型肝炎ウ
イルスを除き、ウイルス学上の一般承認を得たウイルス
は未だ知られていない。以下、特に断りのない限り、用
語「ＮＡＮＢ型肝炎」は血液伝播型非Ａ非Ｂ型肝炎を、
また、用語「ＮＡＮＢＶ」は血液伝播型非Ａ非Ｂ型肝炎
ウイルスをそれぞれ意味する。
【０００３】〔ＮＡＮＢ型肝炎研究の現状と課題〕：Ｎ
ＡＮＢ型肝炎の疫学、臨床、診断、治療、予防に関する
研究は、ＮＡＮＢＶ型肝炎と他の肝炎との比較の下で、
ウイルス学、診断学、組織病理学、免疫学、分子生物学
等の知識と技術を駆使し、世界各地で進められている
［日本医事新報、Ｎｏ．３３２０、３−１０、１９８７
年；医学のあゆみ、１５１（１３），７３５−９２３，
１９８９；肝胆膵，２１（１），５−１１３，１９９
０；実験医学，８（３），２０１−２３３，１９９
０］。例えば、ＮＡＮＢ型肝炎に関しては、下記の通り
報告されている。
【０００４】（イ）疫学：日本のＮＡＮＢ型肝炎患者数
は厚生省の推計によれば、慢性肝炎患者の約６０％（約
７２万人）、肝硬変患者の約４０％（約１０万人）、お
よび肝癌患者の約４０％（約７千人）であり、これによ
る死亡者数は毎年１６，０００人に達している。また、
米国では年間１５万〜３０万例の輸血後肝炎が発生し、
その９０％が該ＮＡＮＢ型肝炎であり、更に、供血者の
１〜６％がＮＡＮＢＶキャリアーだと考えられている。
その他の諸外国でも、米国および日本と同程度またはそ
れ以上の発症率並びにキャリアー率であると推定される
ため、ＮＡＮＢ型肝炎の予防、早期診断および治療法の
確立は、世界的に極めて重要である。
【０００５】（ロ）ウイルス学：現在までに既報のＮＡ
ＮＢＶは、エンベロープを有する直径約５０ｎｍの球状
であり、ウイルス分類学上トガウイルスやフラビウイル
スに近似しているか、あるいは全く新しいタイプのウイ
ルスと考えられている。また、ＮＡＮＢ型肝炎患者血清
を静脈内接種したチンパンジー肝細胞における細胞質内
管状構造形成の有無や核内粒子出現の病理学的所見、疫
学的所見、クロロホルム感受性の有無および、免疫学的
診断等に基づき、２種以上のＮＡＮＢＶの存在が推定さ
れている（例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０５，１９７−
２００，１９７９；Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃ
ｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ，１４８，２５４−２６
５，１９８３；微生物、５（５）、４６３−４７５、１
９８９）。特に、Ａ型及びＢ型両肝炎に比べ、患者の血
中ＮＡＮＢＶ量は極端に少なく、例えば、Ｃｈｉｍｐａ
ｎｚｅｅ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｏｓｅ（ＣＩＤ）
は、Ｂ型では１０８−１０９ＣＩＤ／ｍｌであるのに対
し，ＮＡＮＢ型では１０４−１０５ＣＩＤ／ｍｌである
（Ｂｒａｄｌｅｙ Ｄ．Ｗ．：Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｅ
ｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｉｎ Ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｆ
ｕｓｉｏｎ ｎｏｎ−Ａ，ｎｏｎ−Ｂ ｈｅｐａｔｉｔ
ｉｓ， ｉｎ “Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，Ｉｍｍｕｎｉｔ
ｙａｎｄ Ｂｌｏｏｄ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ”ｅｄ
ｉｔｅｄ ｂｙＤｏｄｄ Ｒ．Ｙ．＆ Ｂａｒｋｅｒ，
Ｌ．Ｆ；Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ， ８１−９７，１９８５）。更にヒト以外の感
染実験系に関し、ＮＡＮＢＶ感染により肝細胞質内に典
型的な細胞質内管状構造を形成するチンパンジーのみが
感受性動物として知られている現状では、この基礎研究
に希少かつ高価なチンパンジーを多数頭要することにな
り、その入手に係る供給制限と経済的制約が、ＮＡＮＢ
Ｖに関する決定的な感染実験、同定、マーカーの発見等
を困難にし、遅延させている。それゆえ、かかる問題を
打開するため、ＮＡＮＢＶ研究に係る様々な戦略が試み
られている。例えば、ＮＡＮＢ型肝炎発症チンパンジー
の血漿からＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）と称するＮＡＮ
ＢＶ遺伝子ｃＤＮＡをクローン化し（Ｓｃｉｅｎｃｅ，
２４４，３５９−３６２，１９８９）、更に、該遺伝子
を発現させて得たＣ−１００と称する抗原がＮＡＮＢ型
肝炎患者の血中抗体と抗原抗体反応することを確認（Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ，２４４，３６２−３６４，１９８９）；
上例のようにチンパンジーを用いることなく、ＮＡＮＢ
型肝炎患者血漿から直接ＮＡＮＢＶ遺伝子ｃＤＮＡをク
ローン化し、斯かる遺伝子を発現させて得た抗原がＮＡ
ＮＢ型肝炎患者血清の抗体と抗原抗体反応を生じること
を確認（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｉａ Ｊａｐ
ｏｎｉｃａ，２４，５４０−５４４，および５４５−５
４８，１９８９等が公知である。
【０００６】（ハ）臨床：一般に肝炎は、発生の集団と
頻度により流行性肝炎や散発性肝炎、また、重症度や病
期に基づき、急性肝炎、劇症肝炎、亜急性肝炎、持続性
肝炎、慢性肝炎等に分類されている。ＮＡＮＢ型肝炎の
潜伏期は２〜２６週であり、その初期症状はＢ型肝炎に
比し発熱、倦怠感などを伴う程度で軽く、７０％が無黄
疸であるため、見過ごす確率が高い。しかし、ＮＡＮＢ
型肝炎の特徴とその恐ろしさは慢性化し易く更に、肝硬
変へと移行することにある。例えば、血清中のアミノト
ランスフェラーゼ活性の上昇が観察されたＮＡＮＢ型肝
炎例のうち、４０〜５０％の率で慢性化が起こり、慢性
化した症例のうち１０〜２０％が肝硬変に陥っている。
また、受血者の年間０．５〜１％が自覚症状なしに肝硬
変へと進展する。不幸にも、更に進めば、肝細胞癌ない
しは肝癌に陥ると考えられている。従って、輸血のみな
らず出血に係るバイオハザード防止のため、ＮＡＮＢ型
肝炎の根絶は公衆衛生上の観点から世界的に極めて重要
である。
【０００７】（ニ）診断：上述の通り、ＮＡＮＢＶ（血
液伝播型）は未だ同定されておらず、診断用の確実なマ
ーカーが知られていないので、ＮＡＮＢ型肝炎の診断は
Ａ型とＢ型両肝炎、サイトメガロ、ＥＢ、水痘、単純ヘ
ルペス等の起炎性の各既知ウイルスに特定な患者の血清
中の抗体価の検査に基づく除外診断、および肝生検によ
る組織病理学的診断に頼らざるを得ない（Ｓ．Ｓｈｅｎ
ｌｏｃｋ，Ｄｉｓｅａｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｌｉｖｅｒ
ａｎｄ ｆｉｌｉａｒｙ ｓｙｓｔｅｍ，８，３２６
−３３３，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ
Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ １９８９）。そして、こ
れ等と平行して例えば血清酵素、ＧＰＴ〔グルタミン酸
ピルビン酸トランスアミナーゼ；別名：ＡＬＴ（アラニ
ンアミノトランスフェラーゼ）〕、ＧＯＴ〔（グルタミ
ン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ；別名：ＡＳＴ
（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）〕、グア
ニンデアミナーゼ（別名：グアナーゼ）等の活性の測定
（肝胆膵、第１４巻、５１９−５２２、１９８７年）；
上記の血清中のＧＰＴないしはＧＯＴ活性の経時的異常
高値の継続に基づく診断基準（日本輸血学会誌、３１
（４）、３１６−３２０、１９８５；日本臨牀、４６、
２６３５−２６３８、１９８８）等が採用されている。
また、免疫学的診断に関しては、上述の通りＮＡＮＢＶ
の分離と同定が困難な現状では、遺伝子工学的技術や免
疫学的知識を駆使して分離したＮＡＮＢＶｃＤＮＡのク
ローンを発現させることにより得られる抗原とＮＡＮＢ
型肝炎患者血清との間の抗原抗体反応が採用されてい
る。例えば、抗原として、ＮＡＮＢ型肝炎患者血漿に由
来のＮＡＮＢＶｃＤＮＡ発現産物（欧州公開特許公報第
３６３０２５号）、ＮＡＮＢ型肝炎発症チンパンジー血
漿に由来のＨＣＶｃＤＮＡ発現産物（欧州公開特許公報
第３１８２１６号、又は特開平２−５００８８０）、Ｎ
ＡＮＢＶ感染チンパンジー肝に由来のＮＡＮＢＶｃＤＮ
Ａ発現産物（欧州公開特許公報第２９３２７４号、又は
特開昭６４−２５７６および特開平１−１２４３８７）
等が公知であり、また、抗原抗体反応による測定方法と
して、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）、ＥＩＡ（エン
ザイムイムノアッセイ）が常用されている。しかし、か
かる発現産物の抗原性は互いに共通性に乏しく、また、
例えば、前述ＨＣＶｃＤＮＡの発現産物即ち前述のＣ−
１００抗原は、ＨＣＶ感染による漫性肝炎診断の一応の
指標と目安にはなるが、抗原性を呈する反応領域が狭い
ため（微生物、５、４６３−４７５、１９８９；肝胆
膵、２０、４７−５１、１９９０；医学のあゆみ、１５
１、８７１、１９８９）、治療に要するＮＡＮＢ型肝炎
ないしはＮＡＮＢＶ感染の確定診断、慢性肝炎および急
性肝炎の経過の判定には不十分であると考えられる。従
って、ＮＡＮＢ型肝炎の診断、及び経過と治療の判定を
確実にするため、更に詳細なウイルス学的及び免疫学的
究明の展開が期待されている。
【０００８】（ホ）治療と予防：最近、慢性ＮＡＮＢ型
肝炎の治療におけるαおよびβインターフェロンの有用
性が報告されている（肝胆膵、２０、５９−６４、１９
９０；医学のあゆみ、１５１、８７１−８７６、１９８
９）。しかし、適切な投与量、投与期間等に関しては未
だ確定されていない。−方、ＮＡＮＢ型肝炎の予防剤、
例えば、ワクチンについては、前述のＮＡＮＢＶｃＤＮ
Ａの発現産物（欧州公開特許公報第３６３０２５号）お
よびＨＣＶｃＤＮＡの発現産物（欧州公開特許公報第３
１８２１６号）等をワクチン用抗原として用いる技術が
公知である。しかし、ＮＡＮＢＶそれ自体が未確定の現
状では、多様な抗原決定基（エピトープ）を有する上記
発現産物からＮＡＮＢＶワクチン用抗原を特定し、斯か
る特定抗原の安全性と有効性を臨床的に確定するには、
更に詳細な試験研究と長時間を要するため、ＮＡＮＢＶ
ワクチンは未だ市販の域には達していない。
【０００９】
【問題を解決するための手段】本発明者等は、前述の課
題を克服するため鋭意研究を重ねた結果、公知のＮＡＮ
ＢＶｃＤＮＡに比し優れて信頼性が高く、しかも、公知
のＮＡＮＢＶｃＤＮＡに比べ最長鎖であり、遺伝子のオ
ープンリーディングフレーム全領域とノンコーディング
領域とを有するＮＡＮＢＶ遺伝子ｃＤＮＡをクローン化
すると共に、かかるｃＤＮＡクローンを発現させること
により、慢性のみならず急性のＮＡＮＢ型肝炎患者血清
とも優れて特異的に抗原抗体反応を呈するＮＡＮＢＶ抗
原の生産と取得に成功した。かかる成功は、真正な（ａ
ｕｔｈｅｎｔｉｃ）ＮＡＮＢＶ遺伝子を得るために、血
中あるいは切除肝細胞片中のＮＡＮＢＶ量が著しく低く
Ａ型あるいはＢ型肝炎のそれに比し約１万分の１である
にもかかわらず、ＮＡＮＢＶの分離を困難にすると考え
られている未知の迷入因子を有するチンパンジーを用い
てＮＡＮＢＶを増幅することなく、真正なＮＡＮＢＶ含
有の信頼性が最も高いヒト由来の新鮮材料、すなわち、
ＮＡＮＢ型肝炎患者の全血あるいはＮＡＮＢ型肝炎に合
併の肝癌患者の切除肝細片に含まれるＮＡＮＢＶ粒子か
ら直接、無傷または可能な限り長鎖のＲＮＡを抽出する
という本発明者らの独特な技術によるものであり、また
これは、新鮮な遺伝子分離材料の取扱いと保存下でＮＡ
ＮＢＶとその遺伝子が体液や血中の酵素により開裂・分
解されないよう細心の操作を行ったことによるものであ
る。このようにしてヒト由来の新鮮材料から調製したＲ
ＮＡを逆転写酵素やＤＮＡポリメラーゼＩ等を用いて二
本鎖ｃＤＮＡとし、ｃＤＮＡライブラリーを得、次い
で、該ｃＤＮＡライブラリーからＮＡＮＢＶ遺伝子をス
クリーニングするため、各ｃＤＮＡをそれぞれラムダｇ
ｔ１１ファージベクターに挿入し、ファージプラーク上
に高濃度に発現させた後、かかる発現産物と急性ＮＡＮ
Ｂ型肝炎回復期患者血清および慢性ＮＡＮＢ型肝炎患者
血清を用いるエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）を繰
り返し行なうことにより、ＮＡＮＢＶ遺伝子ｃＤＮＡを
スクリーニングすることに成功した。このようにして、
バイオハザードを生じることなく大量かつ安価に精製さ
れたＮＡＮＢＶ抗原ポリペプチドの着実な産生が、組換
えＤＮＡ技術を用いた本発明ｃＤＮＡの発現により初め
て認められた。本発明はこれ等の知見に基づいて完成さ
れたものである。
【００１０】従って、本発明は、ＮＡＮＢ型肝炎ウイル
ス遺伝子ｃＤＮＡの提供を目的とする。さらに本発明
は、ＮＡＮＢ型肝炎に対する診断剤およびワクチンの有
効成分として有用なＮＡＮＢ型肝炎ウイルス抗原ポリペ
プチドの提供を目的とする。さらに本発明は、ＮＡＮＢ
Ｖ抗原ポリペプチドの産生方法の提供を目的とする。ま
た本発明は、ＮＡＮＢ型肝炎に対する診断剤の提供を目
的とする。またさらに本発明は、ＮＡＮＢ型肝炎に対す
るワクチンの提供を目的とする。本発明の上記および他
の諸目的、諸特徴および諸利点は、添付の図面を参照し
て行った以下の詳細な説明と特許請求の範囲の記載から
明らかになろう。
【００１１】基本的に、本発明によれば、図２−１から
図２−１６に示す塩基番号第１番から第９４１６番の非
Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスの全塩基配列の少なくとも一部を
含む第一の塩基配列および第一の塩基配列に相補的な塩
基配列からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基配
列を包含するか、または第一の塩基配列の少なくとも１
つの塩基を遺伝子コドンの縮重により置換して得られる
少なくとも１つの塩基配列を包含する単離されたデオキ
シリボ核酸が提供される。
【００１２】また本発明の他の態様によれば、図２−１
から図２−１６に示される非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスの全
塩基配列の塩基番号第３３３番から９３６２番のコーデ
ィング領域を含むデオキシリボ核酸によりコードされる
アミノ酸配列の少なくとも一部を含むアミノ酸配列を含
有する、単離された抗原ポリペプチドが提供される。
【００１３】本発明において、特にことわらない限り、
デオキシリボヌクレオチドの配列の左端と右端は、それ
ぞれ５’末端と３’末端である。また、特にことわらな
い限り、ペプチドのアミノ酸配列の左端と右端は、それ
ぞれＮ末端とＣ末端である。本発明のＮＡＮＢＶ遺伝子
ｃＤＮＡおよびその発現産物としてのＮＡＮＢＶ抗原ポ
リペプチドは、以下の工程（Ｉ）〜（ＶＩＩ）に従って
調製し同定することができる。
【００１４】（Ｉ）ＮＡＮＢＶ遺伝子のＲＮＡ抽出材料
の選別と採取：ＮＡＮＢＶのＲＮＡの抽出材料として
は、ＮＡＮＢＶのキャリアーあるいはこれに罹患したヒ
トまたはチンパンジーの血液、リンパ液、腹水、肝細
胞、およびＮＡＮＢ型肝炎に合併した肝細胞癌または肝
癌患者の肝細胞が使用できる。特に、チンパンジー由来
の材料中にはＮＡＮＢＶ量がヒトのそれに比し少なく、
ＮＡＮＢＶの分離を困難にする迷入因子の混入の可能性
が高いため、ヒト由来材料の使用が望ましい。血液、リ
ンパ液、腹水および肝細胞のうち、血液が最も容易に、
大量に得ることができ、例えば、輸血用血液として使用
に耐えない血液を血液銀行から大量に入手することがで
きる。このような血液は、ＮＡＮＢＶ遺伝子ＲＮＡの抽
出材料として、有利に使用することが可能である。血液
を材料として用いる場合は、まず血液を血漿と赤血球に
分別し、このようにして得られた血漿が、Ｂ型肝炎ウイ
ルスの表面抗原（ＷＨＯ ｅｘｐｅｒｔ ｃｏｍｍｉｔ
ｔｅｅ ｏｎ ｖｉｒａｌ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ：Ａｄ
ｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｖｉｒａｌ ｈｅｐａｔｉｔｉ
ｓ，ＷＨＯ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｒｅｐｏｒｔ Ｓｅ
ｒｉｅｓ，６０２，２８−３３，１９７７）およびＢ型
肝炎ウイルスの遺伝子ＤＮＡ（Ｂｒｅｃｈｏｔ，Ｃ；Ｈ
ａｄｃｈｏｕｅｌ，Ｍ；Ｓｃｏｔｔｏ，Ｊ；Ｄｅｇｏ
ｓ，Ｆ；Ｃｈａｒｎａｙ，Ｐ；Ｔｒｅｐｏ，Ｃ；Ｔｉｏ
ｌｌａｉｓ，Ｐ：Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆｈｅｐａｔ
ｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ＤＮＡ ｉｎ ｌｉｖｅｒ
ａｎｄｓｅｒｕｍ：ａ ｄｉｒｅｃｔ ａｐｐｒａｉ
ｓａｌ ｏｆ ｔｈｅ ｃｈｒｏｎｉｃ ｃａｒｒｉｅ
ｒ ｓｔａｔｅ．Ｌａｎｃｅｔ，２，７６５−７６８，
１９８１）に陰性であるか否かを決定し、また該血漿
を、ＮＡＮＢ型肝炎の診断の目安として採用されている
血清酵素、例えば、ＧＰＴ（Ｗｒｏｂｌｅｗｓｋｉ，
Ｆ．＆ＬａＤｕｅ，Ｊ．Ｓ．：Ｓｅｒｕｍ ｇｌｕｔａ
ｍｉｃ−ｐｙｒｕｖｉｃｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ ｉ
ｎ ｃａｒｄｉａｃ ａｎｄ ｈｅｐａｔｉｃｄｉｓｅ
ａｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅ
ｄ．，９１，５６９，１９５６．）、ＧＯＴ、グアナー
ゼ等の活性に関して検査する。上記の血液を血漿と赤血
球に分別しまた該血漿を検査するという工程を、種々の
血液について行い、Ｂ型肝炎ウイルスの表面抗原および
遺伝子ｃＤＮＡの両方に陰性で、かつ上記酵素の活性が
異常高値、例えば、ＧＰＴ活性が３５ＩＵ／ｌ以上の血
漿をプールする。
【００１５】血中のＮＡＮＢ型肝炎ウイルス粒子数は、
前述のＢ型肝炎ウイルス粒子数に比し非常に少ない。感
染実験の結果から（Ｂｒａｄｌｅｙ，Ｄ．Ｗ．：Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｉｎ ｐｏｓ
ｔ−ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎｎｏｎ−Ａ，ｎｏｎ−Ｂ
ｈｅｒａｔｉｔｉｓ： “Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，Ｉｍｍ
ｕｎｉｔｙ ａｎｄ Ｂｌｏｏｄ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉ
ｏｎ”ｅｄｉｔｅｄｂｙ Ｄｏｄｄ，Ｒ．Ｙ．＆ Ｂａ
ｒｋｅｒ，Ｌ．Ｆ．，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎ
ｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，８１−９７，１９８５）、Ｎ
ＡＮＢ型肝炎ウイルス粒子数は、Ｂ型肝炎ウイルス粒子
数の約１万分の１であることが予想されるので、該ＲＮ
Ａの抽出には大量の、例えば、約３〜１０１の血液の使
用が望ましい。そしてこの新鮮全血は、ウイルス粒子か
らＮＡＮＢＶのＲＮＡを抽出する材料として用い、ＮＡ
ＮＢＶとその遺伝子の変性および酵素による遺伝子の開
裂・分解を避けるため、１〜５℃に保存し、また、新鮮
全血採取後４８〜７２時間以内に下記工程（ＩＩ）によ
りＮＡＮＢＶのＲＮＡの調製を完了することが望まし
い。また、肝細胞を材料として用いる場合は、ＮＡＮＢ
慢性肝炎に合併した肝細胞癌または肝癌患者から得られ
る非癌部および癌部の切除肝組織片それぞれ約１〜３ｇ
を使用することができる。材料として用いる肝細胞は、
例えば−７０℃に凍結保存する。
【００１６】（ＩＩ）ＮＡＮＢＶのＲＮＡの調製：上記
（１）で得られた材料から、公知の手段によりＲＮＡを
抽出および精製することができる。例えば、新鮮全血を
材料として用いる場合は、血液約２〜１０１を低速遠心
にかけ、上清の血漿画分を採取し、この血漿からウイル
ス画分を精製して得た後、下記のＲＮＡ抽出精製工程に
供する。
【００１７】一方、肝細片をＮＡＮＢＶのＲＮＡ抽出材
料として用いる場合は、その体積の約５〜３０倍容の下
記のＲＮＡ分解酵素阻害剤を含む希釈液を肝組織に添加
の後、公知の手段、例えば、ホモジナイザー等より、肝
組織を破砕ないし磨砕することにより、肝細胞のホモジ
ェネートを得る。尚、希釈液としては、１０〜１５０ｍ
Ｍの公知の緩衡液を使用することができる。次いで、こ
れを低速遠心にかけ、上清を採取した後、該上清をＲＮ
Ａ抽出精製の原液として用いる。ＲＮＡの抽出精製には
公知の方法、例えば、ヘパリン、ジエチルピロカルボネ
ート、グアニジンチオシアネート等のＲＮＡ分解酵素阻
害剤と界面活性剤、キレート剤または蛋白変性を増強す
る還元剤との混合液を用いる抽出法；蔗糖、セシウムク
ロライド、セシウムトリクロロ酢酸、フイコール［Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ＡＢ
社（スウェーデン）］等を溶質として用いる密度勾配遠
心による分画法；ｍＲＮＡが特異的に有する３’末端の
ポリＡ鎖を利用するアフィニティーカラムによる分離
法；ポリソーム上で合成された蛋白に対する特異的抗体
を用いる免疫沈降によりｍＲＮＡ結合ポリソームを得る
分別法；２相分配の原理に基づくフェノール抽出法；ポ
リエチレングリコール、デキストラン硫酸、アルコール
等による沈殿法を個別に、または組み合わせて使用する
ことができる。尚、上記のＮＡＮＢＶのＲＮＡの抽出と
精製工程は、ＲＮＡの不可逆的変性を避けるためｐＨ３
〜１０での実施が望ましい。
【００１８】（ＩＩＩ）ＮＡＮＢＶのＲＮＡからの二本
鎖ｃＤＮＡの調製：先に得られたＮＡＮＢＶのＲＮＡを
使用し、常法によりｃＤＮＡを調製することができる。
即ち、プライマーとしてオリゴデオキシチミジンおよび
ランダムヘキサヌクレオチドプライマーと逆転写酵素を
用い、該ＮＡＮＢＶのＲＮＡを鋳型として用いてそれに
相補的なｃＤＮＡを合成し、互いに相補的に結合した該
ｃＤＮＡと該ＮＡＮＢＶのＲＮＡからなる二本鎖を得、
次いで、これにリボヌクレアーゼＨを作用させて該ＮＡ
ＮＢＶのＲＮＡを分解し該ｃＤＮＡから除去した後、こ
の一本鎖ｃＤＮＡを鋳型としてＤＮＡ合成酵素により二
本鎖ｃＤＮＡを合成する。二本鎖ｃＤＮＡ合成は、市販
のｃＤＮＡ合成キット、例えば、ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈ
ｅｓｉｓＳｙｓｔｅｍ Ｐｌｕｓ（登録商標）〔Ａｍｅ
ｒｓｈａｍ社（英国）製〕、ｃＤＮＡ Ｓｙｓｔｅｍ
Ｋｉｔ（登録商標）〔Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ社
（スウェーデン）製〕、ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ
Ｋｉｔ（登録商標）〔Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎ
ｎｈｅｉｍ ＧｍｂＨ社（独）製〕等を用いて容易に実
施することができる。合成したｃＤＮＡが少量の場合に
は、常法のＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ
Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法（Ｅｒｌｉｃｈ，Ｈ．Ａ ：
“ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ
Ｐｒｅｓｓ，１９８９）により、ＰＣＲ用キットのＡｍ
ｐｌｉＴａｑ〔Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ
社（米国）製〕）を用いて増幅することができる。
【００１９】（ＩＶ）ｃＤＮＡライブラリーの作成：
（ＩＩＩ）で調製したｃＤＮＡを使用し、常法によりｃ
ＤＮＡライブラリーを作成する。すなわち、（ＩＩＩ）
で調製した種々の長さのｃＤＮＡをクローニングベクタ
ーに連結することによりｃＤＮＡライブラリーを得る。
クローニングベクターとしては、例えば、ファージ遺伝
子、コスミド、プラスミドおよび動物ウイルス遺伝子等
の公知または市販のベクターを使用することができる。
組換え可能なベクターとしてファージ遺伝子またはコス
ミドを使用する場合には、夫々のｃＤＮＡ断片を個別に
挿入した該ベクターの高度の安定化および形質転換体の
出現率を達成するため、常法により試験管内パッケージ
ングを行い、各ｃＤＮＡが挿入されたベクターを組換え
ファージ粒子の形で得た後、これ等のファージ粒子の集
団をｃＤＮＡライブラリーとしてｃＤＮＡのクローニン
グに供する。一方、組み換え可能なベクターとしてプラ
スミドを使用する場合には、上述の各ｃＤＮＡ断片をプ
ラスミドベクターに挿入し、これ等のｃＤＮＡ挿入ベク
ターを常法に従って夫々大腸菌、枯草菌、酵母等の宿主
細胞に移入して得た形質転換体をｃＤＮＡライブラリー
としてｃＤＮＡのクローニングに供する。また、組換え
可能なベクターとして動物ウイルス遺伝子を使用する場
合には、上述のｃＤＮＡ断片を各々ウイルス遺伝子ベク
ターに挿入し、これ等の各組換えウイルスを常法に従っ
て感受性動物細胞にトランスフェクトし、細胞内で増殖
させる。このようにして、得られた組換えウイルスその
ものをｃＤＮＡライブラリーとして用いる。
【００２０】該ｃＤＮＡライブラリー作成の簡便法とし
て、市販のキット、例えば、ｃＤＮＡクローニングシス
テム ラムダｇｔ１０およびラムダｇｔ１１〔Ａｍｅｒ
ｓｈａｍ社（英国），ＢＲＬ社（米国），Ｓｔｒａｔａ
ｇｅｎｅ社（米国）製販〕、インビトロ パッケージン
グシステム〔Ａｍｅｒｓｈａｍ社（英国），ＢＲＬ社
（米国），Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社（米国）製販〕等を
用いて実施することができる。
【００２１】（Ｖ）ｃＤＮＡライブラリーからのＮＡＮ
ＢＶ遺伝子ｃＤＮＡのクローニング：この工程におい
て、ＮＡＮＢＶ遺伝子を含むｃＤＮＡクローンが得られ
る。ｃＤＮＡライブラリーが形質転換体の場合には、こ
れ等の形質転換体を寒天培地において培養しコロニーを
形成させる。一方、ｃＤＮＡライブラリーが組換えファ
ージ粒子または組換えウイルスの場合には、これ等の組
換えファージ粒子または組換えウイルスを公知の大腸
菌、枯草菌、酵母、動物細胞培養物等の感受性宿主細胞
に感染後、培養することによりプラークを形成させる
か、または感染細胞を増殖させる。そして、公知のイム
ノアッセイの下で、急性ＮＡＮＢ型肝炎患者回復期血
清、慢性ＮＡＮＢ型肝炎患者血清、肝細胞質内管状構造
形成型あるいは非形成型に関わりなくＮＡＮＢＶに感染
のチンパンジー血清を用い、ＮＡＮＢＶ抗原を特異的に
産生するコロニー、プラークまたは感染細胞を、上述の
血清中の少なくとも１つと反応させることにより、選別
単離する。コロニーの厳密な選別のため、前の工程を繰
り返し、選別単離した各コロニー、プラークまたは感染
細胞から、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ等によるＭｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ［Ｕ．Ｓ．Ａ］，３０９−４３３，１９８２）
に従って、ＮＡＮＢＶ遺伝子ｃＤＮＡクローンを分離す
る。上記イムノアッセイは、例えば、酵素のパーオキシ
ダーゼまたはアルカリ性ホスファターゼで標識した抗体
を用いる酵素標識抗体技術、フルオレセインイソチオシ
アネートまたはユーロピウムで標識した抗体を用いる蛍
光抗体技術により実施することができる。上述の技術に
よるイムノアッセイでは、微量の患者血清を使用して
も、高感度のイムノアッセイを達成することができる間
接法による実施が望ましい。この間接法においては、一
次抗体としてはＮＡＮＢＶに特異的な抗体の含有量が比
較的多いＮＡＮＢ型肝炎患者やＮＡＮＢ型肝炎チンパン
ジーの血清の採用が望ましく、二次抗体としては酵素ま
たは蛍光物質等で標識した市販の抗ヒトＩｇ（Ｉｍｍｕ
ｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）抗体の使用が可能である。
【００２２】また、イムノアッセイ用の検体は、常法、
例えば、フィルター膜にコロニー、プラークまたは感染
細胞の核酸および蛋白を吸着させるブロッティング法、
マイクロプレートまたは検鏡用スライドガラスを用いる
方法等に従って調製することができる。ブロッティング
法を間接酵素抗体技術と合わせて用いると、多数のコロ
ニー、プラークまたは感染細胞からの所望のコロニー、
プラークまたは感染細胞の選別を、容易にしかも迅速に
実施することができる。この方法では、材質がニトロセ
ルロース、セルロースアセテート、ナイロン等である市
販のフィルターをこれらのコロニー、プラークまたは感
染細胞に密着させ、ブロッティングを行う。
【００２３】この様にして得たｃＤＮＡクローンは、Ｎ
ＡＮＢＶ遺伝子ｃＤＮＡの一部であるので、該ＮＡＮＢ
Ｖ遺伝子の全領域をカバーするｃＤＮＡクローンを得る
ため、、、該ｃＤＮＡクローンに近傍のｃＤＮＡ断片
を、該ｃＤＮＡクローンの５’または３’末端部をプロ
ーブとして用いて単離する方法により、ｃＤＮＡを伸長
させる必要がある。この場合には、ジーンウォーキング
（別称、ｇｅｎｏｍｉｃｗａｌｋｉｎｇまたはｃｈｒｏ
ｍｏｓｏｍｅ ｗａｌｋｉｎｇ）を採用することができ
る（“ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｏｌｕｍｅ ＩＩ
Ｉ”、Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ編、３７−３９、ＩＲＬ
Ｐｒｅｓｓ，１９８７；Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ
ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ −
ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ”２、３．２
１−３．２３、１９８９）。クローニング操作とジーン
ウォーキングとを繰り返し行うことにより、ＮＡＮＢＶ
遺伝子全領域をｃＤＮＡクローンの形で得ることが出来
る。
【００２４】この段階では、得られた各ｃＤＮＡクロー
ンについての塩基配列の決定が望ましい。該ｃＤＮＡク
ローンのかかる塩基配列の決定は、常法、例えば、マキ
サム−ギルバート法、ジデオキシチェーンターミネータ
ー法（ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ、１５２、２３２−２３８，１９８６）等により行う
ことができる。
【００２５】また、決定した塩基配列に基づき、アミノ
酸配列を決定することができる。該アミノ酸のシーケン
シングは、開始コドン（ｃＤＮＡのＡＴＧまたはｍＲＮ
Ａ上のＡＵＧ）の位置を確認することにより順次行な
う。かかるアミノ酸配列の重要部分、例えば、エピトー
プを構成すると考えられる親水性部位は、夫々の親水性
部位に対応するペプチドを合成し、高速液体クロマトグ
ラフィー（ＨＰＬＣ）で精製の後、これ等のペプチドを
エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）またはラジオイム
ノアッセイ（ＲＩＡ）に供することにより確認すること
ができる。
【００２６】また、該ｃＤＮＡクローンについては、各
クローンを相互に区別するため、いくつかの群に分類す
ることが望ましい。例えば、ＮＡＮＢＶ遺伝子の制限酵
素地図上における、各ｃＤＮＡクローンの位置付けを分
類のための指標として使用することができる（図１−１
および図１−２）。また、ＮＡＮＢＶにはチンパンジー
肝細胞質内に管状構造形成能を有するものと、有しない
ものが知られているため（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０５、１
９７−２００、１９７９）、各ｃＤＮＡクローンの発現
産物と、チンパンジー肝細胞質内に管状構造を形成する
型のＮＡＮＢＶに感染したチンパンジー血清と、管状構
造を形成しない型のチンパンジー血清との血清学的反応
性を検査することにより、これ等のクローンを識別し分
類することができる。斯かる血清学的反応性の検査は、
上述のイムノアッセイにより行うことができる。
【００２７】本発明において図１−１および図１−２に
示される本発明ＮＡＮＢＶ遺伝子のｃＤＮＡクローンに
は、接頭辞“ＢＫ”を付ける。図１−１は、該ＮＡＮＢ
Ｖ遺伝子の全領域における本発明ＮＡＮＢＶ遺伝子の各
ｃＤＮＡクローンが占める位置範囲を示す図である。ま
た図１−２は、該ＮＡＮＢＶ遺伝子の全領域におけるジ
ーンウォーキングにより得られた各ｃＤＮＡクローンが
占める位置範囲を示す図である。
【００２８】ＮＡＮＢＶｃＤＮＡクローンは、例えば、
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＢＫ１０８（微工研
条寄第２９７１号）、ＢＫ１２９（微工研条寄第２９７
２号）、ＢＫ１３８（微工研条寄第２９７３号）ＢＫ１
５３（微工研条寄第２９７４号）、ＢＫ１５７（微工研
条寄第３２４３号），ＢＫ１６６（微工研条寄第２９７
５号）およびＢＫ１７２（微工研条寄第２９７６号）を
含むものである。これらの７つのＢＫ ＮＡＮＢＶｃＤ
ＮＡクローンは、少なくともＮＡＮＢＶ遺伝子のオープ
ンリーディングフレーム全領域、ないしは、おそらくＮ
ＡＮＢＶ遺伝子全領域をカバーしていると考えられる。
更に上記クローンに加え、ＢＫシリーズの代表例とし
て、次の５クローンが微工研に寄託されている：ＢＫ１
０２（微工研条寄第３３８４号）、ＢＫ１０６（微工研
条寄第３３８５号）、ＢＫ１１２（微工研条寄第３３８
６号）、ＢＫ１４６（微工研条寄第３３８７号）、ＢＫ
１４７（微工研条寄第３３８８号）。
【００２９】上述のＢＫ ＮＡＮＢＶｃＤＮＡクローン
によってカバーされるＮＡＮＢＶ遺伝子全領域の塩基配
列と、これらがコードするアミノ酸配列は、図２−１か
ら図２−１６に示される。図２−１から図２−１６に開
示の全ＮＡＮＢＶ塩基配列と全ＮＡＮＢＶアミノ酸配列
に基づき、該ＮＡＮＢＶ遺伝子の塩基配列およびアミノ
酸配列と他のウイルス遺伝子のそれらの配列とのホモロ
ジー、アミノ酸配列の疎水性指標（疎水性／親水性プロ
フィール）、ＮＡＮＢＶ遺伝子の構造、エピトープ（抗
原決定基）領域等に関して種々の研究および観察を行う
ことができる。
【００３０】ホモロジーについては、ＮＡＮＢＶ遺伝子
の塩基配列およびアミノ酸配列と既知の種々のウイルス
遺伝子（特開昭６２−２８６９３０；Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ、第１６１巻、４９７−５１０ページ、１９８７
年）、例えば、牛ウイルス性下痢症ウイルス（Ｖｉｒｏ
ｌｏｇｙ、第１６５巻、４９７−５１０ページ、１９８
８年）、豚コレラウイルス（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第１７
１巻、５５５−５６７ページ、１９８９年）、タバコ葉
脈斑紋ウイルス（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ、第１６５巻、５４１７−５４３０ページ、１
９８６年）等の遺伝子との間で比較研究することができ
る。
【００３１】また、疎水性指標の解析については、例え
ば、遺伝子情報処理ソフトウェアのＳＤＣ−Ｇｅｎｅｔ
ｙｘ〔（株）ＳＤＣソフトウェア社（日本）製〕、Ｄｏ
ｏｌｉｔｔｌｅが作成のプログラム（Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、第１５７
巻、１０５−１３２ページ、１９８２年）等を用いる技
術により研究することができる。
【００３２】図３は、本発明ＮＡＮＢＶおよび日本脳炎
ウイルス（ＪＥＶ）の疎水性プロフィールを示す図であ
り、両ウイルスの夫々の疎水性指標を相互に比較したも
のである。この図から、ＮＡＮＢＶ遺伝子の遺伝子構造
とＪＥＶ遺伝子の遺伝子構造との間に有意な類似性のあ
ることが判明している。図３に示されるように、本発明
ＮＡＮＢＶのポリペプチドは３種の構造蛋白、即ち、コ
ア蛋白（Ｃ）、プレマトリックス蛋白（ＰｒｅＭ）のプ
ロセッシングにより生じるマトリックス蛋白（Ｍ）、エ
ンベロープ蛋白（Ｅ）と７種の非構造蛋白のＮＳ１，Ｎ
Ｓ２ａ，ＮＳ２ｂ，ＮＳ３，ＮＳ４ａ，ＮＳ４ｂおよび
ＮＳ５を含有する。これらの蛋白は夫々、以下の塩基配
列によりコードされる：
【００３３】Ｃ蛋白は塩基番号第３３３番から第６７７
番まで、Ｍ蛋白は第６７８番から第９０５番、Ｅ蛋白は
第９０６番から第１４９９番、ＮＳ１は第１５００番か
ら第２５１９番、ＮＳ２は第２５２０番から第３３５０
番、ＮＳ３は第３３５１番から第５１７７番、ＮＳ４ａ
は第５１７８番から第５９１８番、ＮＳ４ｂは第５９１
９番から第６３７１番、およびＮＳ５は第６３７２番か
ら第９３６２番まで。これ等の塩基配列は、ＮＡＮＢ型
肝炎の診断に有用であり、これ等にコードされるポリペ
プチドは夫々、ＮＡＮＢＶ型肝炎のワクチンのみならず
診断剤用の抗原として有用である。
【００３４】上述の３種の構造蛋白は、図２−１から図
２−３に示されるアミノ酸番号第１番（Ｍｅｔ）から第
３８９番により表されるものであり、第１番のメチオニ
ン残基は開始コドンによりコードされるものである。
【００３５】本発明者らの絶え間ない研究により、以下
の塩基配列が抗ＮＡＮＢＶ抗体に対し反応するエピトー
プをコードしていることが判明した：塩基配列が、夫々
塩基番号第３３３番から４２２番、第３３３番から１４
９９番、第３３３番から第６３７１番、第４７４番から
５６３番、第９０６番から９５３番、第１０２０番から
第１０４６番、第１０２０番から第１１２１番、第１１
９４番から第１２３２番、第１２０９番から第１３２２
番、第４４８５番から第４５７４番および第５５４４番
から第５６３３番まで。
【００３６】以下に述べるように、上述の塩基配列また
はその全配列の部分としての塩基配列を含有する塩基配
列は、組換えＤＮＡ技術または化学合成によるＮＡＮＢ
Ｖ抗原ポリペプチドの産生のみならず、ハイブリダイゼ
ーションまたはポリメラーゼチェインリアクション（Ｐ
ＣＲ）によるＮＡＮＢ型肝炎の診断に対しても、効果的
に使用することができる。
【００３７】また、図２−１から図２−１６に示される
塩基番号第１番から第９４１６番の全領域の少なくとも
６個の塩基を含有する第一の塩基配列が、ＮＡＮＢ型肝
炎の診断におけるハイブリダイゼーション用のプローブ
として、またはポリメラーゼチェインリアクション用の
プライマーとして有用であり、塩基番号第３３３番から
第９３６２番の塩基配列の少なくとも１２個の塩基の塩
基配列によりコードされる少なくとも４つのアミノ酸を
含有するポリペプチドが、ＮＡＮＢ型肝炎のワクチンの
みならず診断剤用の抗原としても効果的であることが判
明した。さらに、当業者間では既知のことであるが、第
一の塩基配列に相補的な第二の塩基配列もまた、ＮＡＮ
Ｂ型肝炎の診断におけるハイブリダイゼーション用のプ
ローブとして、またはポリメラーゼチェインリアクショ
ン用のプライマーとして有用であることが判明した。遺
伝コドンの縮重に従って該ＮＡＮＢＶの第一の塩基配列
の少なくとも一部のコーディング領域の少なくとも１つ
の塩基を置換することにより得られる塩基配列もまた、
組換えＤＮＡ技術により本発明抗原ポリペプチドの産生
に使用することができる。
【００３８】従って、本発明の単離されたデオキシリボ
核酸は、図２−１から図２−１６に示される塩基番号第
１番から第９４１６番の非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスの全塩
基配列の少なくとも一部を含む第一の塩基配列および第
一の塩基配列に相補的な第二の塩基配列からなる群から
選ばれる少なくとも１つの塩基配列、あるいは遺伝子コ
ドンの縮重に従って第一の塩基配列の少なくとも１つの
塩基を置換することにより得られる塩基配列を含む。
【００３９】更に特定すれば、本発明の該デオキシリボ
核酸において、第一の塩基配列は図２−１から図２−１
６に示される塩基番号第１番から第９４１６番の非Ａ非
Ｂ型肝炎ウイルスの全塩基配列の少なくとも６個の塩基
を包含する。
【００４０】また更に特定すれば、本発明の該デオキシ
リボ核酸において、第一の塩基配列は塩基番号第３３３
番から第４２２番、第３３３番から第６７７番、第３３
３番から第１４９９番、第３３３番から第６３７１番、
第４７４番から第５６３番、第６７８番から第９０５
番、第９０６番から第９５３番、第９０６番から第１４
９９番、第１０２０番から第１０４６番、第１０２０番
から第１１２１番、第１１９４番から第１２３２番、第
１２０９番から第１３２２番、第１５００番から第２５
１９番、第２５２０番から第３３５０番、第３３５１番
から第５１７７番、第４４８５番から第４５７４番、第
５１７８番から第５９１８番、第５５４４番から第５６
３３番、第５９１９番から第６３７１番、第６３７２番
から第９３６２番、および第１番から第９４１６番の塩
基配列からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基配
列を含有する。
【００４１】また、本発明の単離された抗原ポリペプチ
ドは、図２−１から図２−１６に示される非Ａ非Ｂ型肝
炎ウイルスの塩基配列の塩基番号第３３３番から９３６
２番のコーディング領域を含むデオキシリボ核酸により
コードされるアミノ酸配列の少なくとも一部を包含す
る。なお、本発明のＮＡＮＢＶ抗原ポリペプチドは、Ｎ
ＡＮＢＶ粒子やＮＡＮＢＶ表面抗原集合体などのアセン
ブリーを構成しない状態のポリペプチドを意味する。
【００４２】更に特定すれば、本発明の該抗原ポリペプ
チドは、塩基番号第３３３番から第９３６２番の該塩基
配列の少なくとも１２個の塩基の塩基配列によりコード
される少なくとも４つのアミノ酸の少なくとも１アミノ
酸を包含する。
【００４３】また更に特定すれば、本発明の該抗原ポリ
ペプチドは、塩基番号第３３３番から第４２２番、第３
３３番から第６７７番、第３３３番から第１４９９番、
第３３３番から第６３７１番、第４７４番から第５６３
番、第６７８番から第９０５番、第９０６番から第９５
３番、第９０６番から第１４９９番、第１０２０番から
第１０４６番、第１０２０番から第１１２１番、第１１
９４番から第１２３２番、第１２０９番から第１３２２
番、第１５００番から第２５１９番、第２５２０番から
第３３５０番、第３３５１番から第５１７７番、第４４
８５番から第４５７４番、第５１７８番から第５９１８
番、第５５４４番から第５６３３番、第５９１９番から
第６３７１番、第６３７２番から第９３６２番、および
第３３３番から第９３６２番の塩基配列からなる群から
選ばれる塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含
有する。
【００４４】さらに、図２−１から図２−１６に示され
る該ＮＡＮＢＶの全コーディング領域によりコードされ
るポリペプチドは、幅広い抗原抗体反応スペクトルを有
するため、このようなポリペプチドは、単一エピトープ
を含む抗原に比べＮＡＮＢ型肝炎感染により生産された
多種多様の抗体と反応することができ、ＮＡＮＢ型肝炎
診断剤として高感度である。
【００４５】（ＶＩ）ＮＡＮＢＶ遺伝子ｃＤＮＡクロー
ンの発現、およびＮＡＮＢＶ抗原の大量生産：ＮＡＮＢ
Ｖ抗原ポリペプチドを商業的規模で産生するＮＡＮＢＶ
抗原遺伝子のクローンｃＤＮＡを発現させるために、ｃ
ＤＮＡクローン内に存在する該クローンｃＤＮＡの一部
または全体をクローニングベクターから取り出し、発現
ベクターに結合する。例えば、各ｃＤＮＡクローンの該
ｃＤＮＡの一部または全領域を制限酵素を用いて切り出
すことによりＮＡＮＢＶ抗原遺伝子を含むＤＮＡ断片
（以後「ＮＡＮＢＶのＤＮＡ断片」とする）を得、これ
を常法により発現ベクターに挿入する。１種の遺伝子Ｄ
ＮＡ断片を発現ベクターに挿入する場合は、該ＤＮＡ断
片にコードされているペプチドを１種、産生することが
できる。また、２種以上の遺伝子ＤＮＡ断片を発現ベク
ターの配列に挿入する場合は、遺伝子発現により、挿入
したＤＮＡ断片にコードされているポリペプチドを融合
ペプチドとして産生することができる。
【００４６】この操作において使用し得る複製可能な発
現ベクターとしては公知又は市販のもの、例えば、腸内
細菌科のプラスミドベクターｐＳＮ５０８（米国特許第
４，７０３，００５号）、酵母のプラスミドベクターｐ
ＢＨ１０３およびその系列（特開昭６３−２２０９８）
とｐＪＭ１０５（特開昭６２−２８６９３０）、弱毒水
痘ウイルス遺伝子（特開昭５３−４１２０２）、弱毒マ
レック病ウイルス（日本獣医学会誌、第２７巻、２０〜
２４ページ、１９７４年；およびＧａｎ Ｍｏｎｏｇｒ
ａｐｈ ｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第１
０巻、９１〜１０７ページ、１９７１年）、ｐＴＴＱ系
列〔Ａｍｅｒｓｈａｍ社（英国）製販〕、ｐＳＬＶ系列
〔Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ社（スェーデン）製販〕
等を使用することができる。
【００４７】次いで、ＮＡＮＢＶのＤＮＡを挿入した発
現ベクターを、常套手段により該ベクターに感受性の宿
主細胞に個別に移入、またはトランスフェクションし、
形質転換体を得、これらからＮＡＮＢＶ抗原ポリペプチ
ドまたはＮＡＮＢＶ粒子を産生する形質転換体を選別す
る。尚、ＮＡＮＢＶ抗原ポリペプチドの産生は、前述
（Ｖ）に記載のイムノアッセイにより検出することがで
きる。その結果、発現ベクターとして動物ウイルス遺伝
子を使用した場合には、ＮＡＮＢＶ抗原ポリペプチドを
産生する組換えウイルスを得ることができ、斯かる組み
替えウイルスは該ウイルスベクターに固有の抗原性のみ
ならずＮＡＮＢＶの抗原性をも有する多機能ワクチンの
原料として用いることが可能である。
【００４８】前に得た該形質転換体または組換えウイル
スを常法に従い培養することにより、ＮＡＮＢＶ抗原ポ
リペプチドをその焙地内に商業的規模で産生することが
できる。動物ウイルス遺伝子を発現ベクターとして用い
る方法の詳細については、欧州公開特許公報第３３４５
３０号を参考にするとよい。
【００４９】更に本発明は、以下の工程を包含する非Ａ
非Ｂ型肝炎ウイルス抗原ポリペプチドの産生方法の提供
を目的とする： （ａ）デオキシリボ核酸をプラスミドおよび動物ウイル
ス遺伝子から選ばれた複製可能な発現ベクターに導入し
た後、該複製可能な発現ベクターがプラスミドの場合は
該プラスミドおよびそれに挿入されたデオキシリボ核酸
を含有する複製可能な組換えＤＮＡを得、また該複製可
能な発現ベクターが動物ウイルス遺伝子の場合は該動物
ウイルス遺伝子およびそれに挿入されたデオキシリボ核
酸を得、該デオキシリボ核酸は、図２−１から図２−１
６で示される非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスの塩基配列の塩基
番号第１番から第１４９９番の塩基配列の少なくとも一
部領域または第１５００番から第９４１６番の塩基配列
の少なくとも一部領域を含む第一の塩基配列および第一
の塩基配列の少なくとも１つの塩基を遺伝子コドンの縮
重により置換して得られる少なくとも１つの塩基配列か
らなる群から選ばれる塩基配列を含有しており、（ｂ）
上記（ａ）で用いた複製可能な発現ベクターがプラスミ
ドの場合は、微生物細胞または真核細胞培養物に該組換
えＤＮＡをトランスフェクトし形質転換体を形成した
後、その微生物または真核細胞培養物の親細胞から該形
質転換体を選別し、（ｃ）上記（ｂ）で得られた形質転
換体を培養することにより該デオキシリボ核酸を発現さ
せ、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原ペプチドを産生する
か、あるいは上記（ａ）で得られた組換えウイルスを培
養することにより該デオキシリボ核酸および動物ウイル
ス遺伝子を発現させ、動物ウイルス遺伝子および非Ａ非
Ｂ型肝炎ウイルス抗原ペプチドを産生する組換えウイル
スの形で非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原ペプチドを産生さ
せ、そして（ｄ）かかる非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原ペ
プチドを単独または増殖組換えウイルスの形で単離す
る。
【００５０】このようにして得た抗原ペプチドはＮＡＮ
Ｂ型肝炎の診断剤またはワクチンの有効成分としてに用
いることができ、組換えウイルスもワクチンの有効成分
として用いられる。
【００５１】また、図２−１から図２−１６の該ｃＤＮ
Ａの一部または全体を鋳型として用いて、常法に従いｉ
ｎ ｖｉｔｒｏで転写させて対応するＲＮＡまたはｍＲ
ＮＡを合成することができる。例えば、図２−１から図
２−１６のｃＤＮＡの全領域に対応するＲＮＡまたはｍ
ＲＮＡは、該ｃＤＮＡの全領域を鋳型として用い、Ｔ７
ＲＮＡポリメラーゼを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで転写す
る。このようにして合成されたＲＮＡまたはｍＲＮＡ
は、ＮＡＮＢＶ遺伝子の全領域を包含しており、即ち、
実質的に裸のＮＡＮＢＶゲノムであるため、ｍＲＮＡを
動物細胞にトランスフェクトすることにより、ＮＡＮＢ
Ｖ抗原または感染性ＮＡＮＢＶ粒子を得ることができ
る。尚、斯かるｍＲＮＡの合成には、例えば市販のｍＲ
ＮＡキャッピングキット〔Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社（米
国）製販〕を用いることができる。その操作の詳細につ
いては、“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｔｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”（１０．１
７．１−１０．１７．５，Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ発
行，１９８９年）を参考にするとよい。図２−１から図
２−１６の該ｃＤＮＡの一部または全体を用いて得られ
た該ＲＮＡは、ＮＡＮＢＶゲノムの一部または全体であ
るため、ＮＡＮＢＶ抗原の産生のみならず、ＮＡＮＢＶ
およびそれに起因する感染症の研究に有用である。
【００５２】（ＶＩＩ） ＮＡＮＢＶ抗原ポリペプチド
の精製：該形質転換体または組換えウイルスの培養物中
に産生されたＮＡＮＢＶ抗原は、通常の技術、例えば、
塩析、シリカゲルや活性炭等を用いる吸脱着法、有機溶
媒による沈殿法、超遠心による分画法、イオン交換また
はアフィニティーカラムクロマトグラフィーによる分離
法、高速液体クロマトグラフィー、または電気泳動によ
る分画法等を適宜、組み合わせることにより精製するこ
とができる。大腸菌または酵母の形質転換体の培養物か
ら、ＮＡＮＢＶ抗原ペプチドを精製する場合には、ＮＡ
ＮＢＶ抗原ポリペプチドの最終製品の品質を著しく低下
させる大腸菌および酵母に由来のアレルゲンの効果的な
除去の見地から、例えば、（１）シリカゲルによる吸脱
着処理、活性炭による不純物の吸脱除法、および（２）
密度勾配遠心分離による分画を順次行う（特開昭６３−
２９７）ことによる精製が望ましい。また、組換えウイ
ルス培養物、例えば、ウイルス感染組換え細胞培養液か
らＮＡＮＢＶ抗原ポリペプチドを精製する場合には、超
遠心分離や密度勾配遠心分離を反復して行い該抗原を精
製することにより、高純度のＮＡＮＢＶ抗原ポリペプチ
ドを得ることができる。
【００５３】このようにして、本発明の精製ＮＡＮＢＶ
抗原ポリペプチドを含む原液が得られる。必要があれ
ば、該溶液を凍結乾燥し、かかるＮＡＮＢＶ抗原ポリペ
プチドを乾燥した形で得ることが可能である。また、本
発明の混合抗原ポリペプチドは、異なる塩基配列を有す
る少なくとも２種のｃＤＮＡの遺伝子発現により得られ
る少なくとも２種のＮＡＮＢＶ抗原ポリペプチドの混合
により得ることができる。
【００５４】（ＶＩＩＩ）ＮＡＮＢ抗原の合成：前述の
通り、該ＮＡＮＢＶのコア蛋白（Ｃ蛋白）、マトリック
ス蛋白 （Ｍ蛋白）、およびエンベロープ蛋白（Ｅ蛋
白）は、図２−１から図２−３に示されるアミノ酸番号
第１番（Ｍｅｔ）から第３８９番（Ｇｌｙ）の領域に含
まれる。この領域に含まれる上述のエピトープ、特に塩
基番号第９０６番から第９５３番、第１０２０番から第
１０４６番、第１１９４番から第１２３２番の塩基配列
によりそれぞれコードされるエピトープは抗原として非
常に有用である。かかるエピトープはポリペプチド合成
により得ることができ、市販のペプチド合成機、例え
ば、ポリペプチド合成機ＣＯＵＰＬＥＲ ２１００〔Ｄ
Ｕ ＰＯＮＴ社（米国）製販〕、ペプチド合成機４３０
Ａ〔ＡＰＰｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社（米国）
製〕等を使用して実施することができる。かかる合成抗
原ポリペプチドは、例えばワクチン、診断剤、および抗
体の製造に用いることができる。
【００５５】（ＩＸ）ＮＡＮＢＶｃＤＮＡの重要領域：
本発明は更に、プラスミドおよび動物ウイルス遺伝子か
ら選ばれる複製可能な発現ベクターとデオキシリボ核酸
とからなり、該デオキシリボ核酸は図２−１から図２−
１６に示される非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスの全塩基配列の
塩基番号第１番から第１４９９番の少なくとも一部領域
または第１５００番から第９４１６番の少なくとも一部
領域を含む第一の塩基配列および第一の塩基配列を遺伝
子コドンの縮重に基づき少なくとも１つの塩基を置換し
て得られる少なくとも１つの塩基配列からなる群から選
ばれる塩基配列を含有することを特徴とする複製可能な
組換え体の提供を目的とするものである。かかる組換え
体は、本発明のＮＡＮＢＶ抗原ポリペプチドの産生のみ
ならず、複製による本発明のＮＡＮＢＶ遺伝子ｃＤＮＡ
の増幅に用いることができる。
【００５６】尚、本発明のＮＡＮＢＶ遺伝子ｃＤＮＡの
増幅のための上記組換え体に挿入連係される好ましい第
一の塩基配列は、塩基番号第１番から第１４９９番の塩
基配列の少なくとも６個の塩基または第１５００番から
第９４１６番の塩基配列の少なくとも６個の塩基を含有
する。また、本発明のＮＡＮＢＶ抗原ポリペプチドの生
産のための前述の組換え体に挿入連係される好ましい第
一の塩基配列は、塩基番号第３３３番から１４９９番の
塩基配列の少なくとも１２個の塩基または第１５００番
から第９３６２番の塩基配列の少なくとも１２個の塩基
を含有する。
【００５７】更に、本発明のＮＡＮＢＶ抗原ポリペプチ
ドの生産のための前述の組換え体に挿入連係される第一
の塩基配列は、塩基番号第３３３番から第４２２番、第
３３３番から第６７７番、第３３３番から第１４９９
番、第４７４番から第５６３番、第６７８番から第９０
５番、第９０６番から第９５３番、第９０６番から第１
４９９番、第１０２０番から第１０４６番、第１０２０
番から第１１２１番、第１１９４番から第１２３２番、
第１２０９番から第１３２２番、第１５００番から第２
５１９番、第２５２０番から第３３５０番、第３３５１
番から第５１７７番、第４４８５番から第４５７４番、
第５１７８番から第５９１８番、第５５４４番から第５
６３３番、第５９１９番から第６３７１番、および第６
３７２番から第９３６２番の塩基配列からなる群から選
ばれる。
【００５８】（Ｘ）診断用抗原の製造：また、本発明の
精製ＮＡＮＢＶ抗原ポリペプチドは、ＮＡＮＢ型肝炎の
診断剤として有用である。本発明のＮＡＮＢＶ抗原ポリ
ペプチドは、以下のようにして診断剤に調剤することが
できる。上記（ＶＩＩ）で得られた精製ＮＡＮＢＶ抗原
ポリペプチド溶液を、バイアル瓶またはアンプル等の容
器に分注の後、密封する。注入した該抗原ポリペプチド
は、密封する前に上述と同様の手段で凍結乾燥すること
ができ、容器内のＮＡＮＢＶ抗原ポリペプチドの量は、
一般に約１μｇ〜約１０ｍｇである。代わりに、該ＮＡ
ＮＢＶ抗原ポリペプチドを、また、常用されている支持
体、例えば、マイクロプレート、ポリスチレンビーズ、
濾紙または膜の表面に吸着させることができる。
【００５９】血清と該ＮＡＮＢＶ抗原ポリペプチドとの
反応性の決定は、上述（Ｖ）に示したのと同様の手段で
個別に実施することができる。即ち、かかる反応性の決
定は、従来のイムノアッセイの方法、例えば、ｒａｄｉ
ｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（ＲＩＡ），ｅｎｚｙｍｅ−
ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａ
ｙ（ＥＬＩＳＡ）、蛍光抗体法（ＦＡ）、受身赤血球疑
集反応（ＰＨＡ）、逆受身赤血球疑集反応（ｒＰＨＡ）
等により実施することが可能である。上記のイムノアッ
セイに用いる該ＮＡＮＢＶ抗原ポリペプチドの量は、血
清中に一般に約０．１〜約１００ｍｇ／ｍｌであり、特
にＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ＦＡ、ＰＨＡおよびｒＰＨＡに
用いる量は、それぞれ０．１〜１ｍｇ／ｍｌ、０．１〜
１ｍｇ／ｍｌ、１〜１００ｍｇ／ｍｌ、１〜５０ｍｇ／
ｍｌおよび１〜５０ｍｇ／ｍｌとなる。
【００６０】また、本発明のＮＡＮＢＶ抗原ポリペプチ
ドは、輸血用血液のスクリーニングにも使用することが
できる。かかるスクリーニング法は、（ａ）全血液から
血清を分離し、（ｂ）未知血液の血清と図２−１から図
２−１６に示すＮＡＮＢＶの全塩基配列の塩基番号第３
３３番から第９３６２番のコーディング領域を含むデオ
キシリボ核酸によりコードされるアミノ酸配列の少なく
とも一部を含む少なくとも１つのアミノ酸を含有する単
離されたＮＡＮＢＶ抗原ポリぺプチドとを接触させ、
（ｃ）その血清と該ＮＡＮＢＶ抗原ポリペプチドとの反
応の有無を決定し、（ｄ）その反応性に基づき非Ａ非Ｂ
型肝炎に対し陽性か陰性かを分類し、（ｅ）その結果に
基づき、輸血用血液を選別するものである。
【００６１】未知血液の血清と本発明のＮＡＮＢＶ抗原
ポリペプチドとの接触およびその反応性の決定は、ＮＡ
ＮＢ型肝炎の診断方法に関する上記と同様の手段で実施
することが可能である。この方法により、ＮＡＮＢＶに
感染していない輸血用血液を選別することができる。
【００６２】（ＸＩ）ワクチンの製造：また、本発明の
ＮＡＮＢＶ抗原ポリペプチドは、ＮＡＮＢ型肝炎ワクチ
ンの有効成分として用いることが可能である。かかるＮ
ＡＮＢ型肝炎ワクチンは、以下のようにして調製するこ
とができる。該ＮＡＮＢＶ抗原ポリペプチドをコードす
るｃＤＮＡの担体である組換えファージまたはプラスミ
ドを含む形質転換体の培養、また、該ｃＤＮＡの担体で
ある組換えウイルスを感染させた細胞を培養し、培養物
中に該ＮＡＮＢＶ抗原ポリペプチドを産生させる。尚、
斯かる培養物中のＮＡＮＢＶ抗原を無毒化し安全性を確
保すると共に、該抗原の免疫原性ないしは抗原性を固定
化しその安定化を図るため、前述（ＶＩＩ）の精製を行
う前の培養物、または培養物中の細胞破片や培養菌体を
除去するための濾過や遠心後の培養濾液や遠心上清の段
階での不活化が望ましい。例えば、常用の不活化剤、ホ
ルマリンを最終濃度が０．０００１〜０．００１％（Ｖ
／Ｖ）になるよう上記培養調製物に添加混合の後、４〜
３７℃にて５〜９０日間保存することにより、ＮＡＮＢ
Ｖ抗原を不活化できる。また、ワクチン原液は、前述
（ＶＩＩ）と同様にして調製できる。
【００６３】更に、ＮＡＮＢＶワクチン原液を、マイク
ロフィルターを用い常法で濾過し、溶液を除菌した後、
濾液を生理的塩溶液にてＬｏｗｒｙ法による蛋白濃度の
測定値が約１〜約５００μｇ／ｍｌとなるよう希釈し、
アジュバントとして水酸化アルミニウムゲルを、最終濃
度が約０．１〜約１ｍｇ／ｍｌとなるよう添加する。更
に、かかる混合物に少なくとも１種の安定剤を添加する
ことができ、安定剤としては市販の公知の安定剤も用い
ることが可能であり、例えばゼラチン、それらの加水分
解物、アルブミン、糖類のグルコース、フルクトース、
ガラクトース、スクロースおよびラクトース、またアミ
ノ酸のグリシン、アラニン、リジン、アルギニン、グル
タミン等を使用することができる。アジュバントとして
は、沈降アジュバントのリン酸カルシウムゲル、リン酸
アルミニウムゲル、硫酸アルミニウム、アルミナおよび
ベントナイト、また抗原産生を誘起するアジュバントの
ムラミルペプチド誘導体、ポリヌクレオチド、Ｋｒｅｓ
ｔｉｎ〔登録商標、呉羽化学工業株式会社（日本）製
販〕およびピシバニール（共に抗腫瘍剤）等を使用する
ことができる。更に、かかる混合物に少なくとも１種の
安定化剤を添加することができ、安定化剤としては市販
かつ公知のも、例えば、ゼラチン、それらの加水分解
物、アルブミン、糖類のグルコース、フルクトース、ガ
ラクトース、スクロースおよびラクトース、またアミノ
酸のグリシン、アラニン、リジン、アルギニンおよびグ
ルタミン等を使用できる。
【００６４】そして、ゲル吸着したＮＡＮＢＶ抗原ポリ
ペプチドを含むＮＡＮＢ型肝炎ワクチン液をアンプルま
たはバイアル瓶等の小容器に分注し密封することによ
り、沈降ＮＡＮＢ型肝炎ワクチンが得られる。
【００６５】得られたＮＡＮＢ型肝炎ワクチン液を凍結
乾燥し、乾燥ＮＡＮＢ型肝炎ワクチンとすることによ
り、過酷な環境、例えば熱帯での該製剤の輸送と保存が
可能となる。かかる凍結乾燥は一般に、液体沈降ＮＡＮ
Ｂ型肝炎ワクチンをバイアル瓶およびアンプル等の容器
に分注した後、常法に従って行い、凍結乾燥後に乾燥ワ
クチンを含む容器に窒素ガスを注入し、密封する。尚、
ワクチン製剤の品質については、日本国厚生省告示第１
５９号「生物学的製剤基準」に規定の「沈降Ｂ型肝炎ワ
クチン」、「乾燥日本脳炎ワクチン」および「沈降百日
せきワクチン」に準拠して試験する。
【００６６】また、該ＮＡＮＢ型肝炎ワクチンは、上述
の吸着ＮＡＮＢＶ抗原ポリペプチドおよび本ＮＡＮＢＶ
抗原ポリペプチド以外の少なくとも１つの抗原を含む混
合ワクチンの形で調製することが可能である。本ＮＡＮ
ＢＶ抗原ポリペプチド以外の抗原としては、該ＮＡＮＢ
Ｖ抗原ポリペプチドおよびこの他の抗原を組み合わせて
用いることに起因する副作用及び不都合な反応が相加的
または相乗的に増加せず、またこれらの抗原性および免
疫原性がそれら相互の干渉により減少しない限り、対応
するワクチンの活性要因として従来用いられているいか
なる抗原も使用することが可能である。該ＮＡＮＢＶ抗
原ポリペプチドに混合することができる抗原の数と種類
は、上述のようにそれらの副作用および不都合な反応が
相加的または相乗的に増加せず、またそれらの抗原性お
よび免疫原性が減少しない限り、制限されるものではな
い。一般に、２〜６種の抗原を該ＮＡＮＢＶ抗原ポリペ
プチドに混合することが可能であり、例えば、目本脳炎
ウイルス、ＨＦＲＳ（腎症候性出血熱）ウイルス、イン
フルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、Ｂ
型肝炎ウイルス、デング熱ウイルス、エイズウイルス、
百日咳菌、ジフテリア菌、破傷風菌、髄膜炎菌、肺炎双
球菌等に由来の不活化抗原または無毒化毒素またはトキ
ソイドが含まれる。
【００６７】一般に、本発明のＮＡＮＢＶ抗原ポリペプ
チドを含むワクチンは、アンプル等のバイアル瓶に注入
し密封の後、液体または懸濁液の形で提供することがで
きる。乾燥ワクチンを用いる場合は、使用前に凍結乾燥
前の元の体積となるよう滅菌蒸留水に溶解または懸濁す
る。一般に、このワクチンは皮下接種にて使用し、成人
へのその接種量は、約０．５ｍｌであるが、子供に対し
ては成人の半量のワクチンを接種する。また、かかるワ
クチンは、通常約１週間〜１ヵ月の間隔にて２回接種し
た後、約半年後にさらに１追加接種する。
【００６８】（ＸＩＩ）診断用抗体の作製：該ＮＡＮＢ
Ｖ抗原ポリペプチドは、それに特異的なポリクローナル
抗体およびモノクローナル抗体等の抗体の作製に用いる
ことも可能である。例えば、該ＮＡＮＢＶ抗原ポリペプ
チドに特異的なポリクローナル抗体は、以下の常法によ
り作製することができる。まず本発明の精製されたＮＡ
ＮＢＶ抗原ポリペプチドを、マウス、モルモット、ウサ
ギ等の動物の皮下、筋肉内、腹腔内または静脈内に、通
常１〜４週間の間隔にて数回接種し、かかる動物を完全
に免疫する。免疫効果を高めるために、従来の市販のア
ジュバントを使用することができる。次いで、免疫した
動物から血清を採取した後、常法に従って血清から抗Ｎ
ＡＮＢＶ抗原ポリペプチドポリクローナル抗体を単離精
製する。
【００６９】一方、該ＮＡＮＢＶに特異的なモノクロー
ナル抗体は、例えば「細胞工学」第１巻の２３〜２９ペ
ージ（１９８２年）に述べられている常法により調製す
ることができる。例えば、精製されたＮＡＮＢＶ抗原に
て免疫したマウスから得られた脾細胞と市販のマウスミ
エローマ細胞を細胞融合技術により融合し、ハイブリド
ーマを作製の後、これらのハイブリドーマから該ＮＡＮ
ＢＶ抗原ポリペプチドに反応する抗体を産生する能力を
有するハイブリドーマを選別し、更にクローニングす
る。斯かるクローンを常法にて培養し、培養上清から抗
ＮＡＮＢＶ抗原ポリペプチドモノクローナル抗体を単離
精製する。
【００７０】また、上述のポリクローナル抗体およびモ
ノクローナル抗体は、ＮＡＮＢ型肝炎の診断剤としても
用いることが可能である。かかる抗体を用いるＮＡＮＢ
型肝炎の診断は、該ＮＡＮＢＶ抗原ポリペプチドを用い
るＮＡＮＢ型肝炎の診断に関する上記の方法と実質的に
同様にして実施することができる。ポリクローナル抗体
またはモノクローナル抗体を用いることにより、肝組織
および血中に存在する該ＮＡＮＢＶ抗原ポリペプチドの
同定および定量が可能となる。また、上述のポリクロー
ナル抗体及びモノクローナル抗体は、輸出用血液中のＮ
ＡＮＢＶの除去剤つぃて使用できる。例えば、斯かる抗
体を用いるアフィニティークロマトグラフィーの技術に
より、血中のＮＡＮＢＶを効果的に除去できる。
【００７１】（ＸＩＩＩ）遺伝子診断剤の製造：本発明
のＮＡＮＢＶ遺伝子ｃＤＮＡは、本発明のＮＡＮＢＶ遺
伝子ｃＤＮＡを適切な制限酵素にて消化することにより
調製することができる。また、本発明の遺伝子ｃＤＮＡ
は、本明細書の図２−１から図２−１６に示す塩基配列
に従ってＤＮＡ合成技術により調製することができる。
ＤＮＡ合成による該ＮＡＮＢＶ遺伝子ｃＤＮＡの調製
は、ＤＮＡ合成機モデル３８０Ｂ〔Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂ
ｉｏｓｙｓｔｅｍ社（米国）製販〕、ＤＮＡ Ｓｙｎｔ
ｈｅｓｉｚｅｒモデル８７００〔Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ社
（米国）製販〕等の公知のＤＮＡ合成機を使用して実施
することが可能である。本発明のＮＡＮＢＶ遺伝子ｃＤ
ＮＡは、ＮＡＮＢＶ感染の遺伝子診断では、例えば、ポ
リメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）のプライマ
ーとして、患者の体液または細胞内のＮＡＮＢＶ遺伝子
の検出に使用することができる。ポリメラーゼチェイン
リアクションによる診断には、該ＮＡＮＢＶ遺伝子ｃＤ
ＮＡを１０〜１００ｎｇ用いる。
【００７２】また、本発明のＮＡＮＢＶ遺伝子ｃＤＮＡ
は、ハイブリダイゼーション技術によるＮＡＮＢ型肝炎
の診断に用いることも可能である。即ち、該ＮＡＮＢＶ
遺伝子ｃＤＮＡを、例えばビオチン、アルカリ性ホスフ
ァターゼ、放射性同位元素３２Ｐ等にて標識し、プロー
ブとしてハイブリダイゼーション技術による診断に供す
ることができる。この場合まず、上述（Ｖ）で得られた
該ＮＡＮＢＶｃＤＮＡを含む組換えファージを適切な制
限酵素にて処理し、該ＮＡＮＢＶｃＤＮＡを含むＤＮＡ
断片を切り出した後、市販の複製可能なクローニングベ
クターに連結し、このＤＮＡ断片を含む組換えプラスミ
ドを得る。この組換えプラスミドを宿主細胞内に導入し
て形質転換体を形成させ、これを培養して組換えプラス
ミドを増殖させた後、該形質転換体よりプラスミドＤＮ
Ａを単抽出して制限酵素にて消化し、これを低融点アガ
ロースゲル電気泳動にかけ、該ＮＡＮＢＶ抗原ポリペプ
チドをコードするｃＤＮＡを単離精製する。このように
して得られたｃＤＮＡを、ビオチン、アルカリ性ホスフ
ァターゼ、放射性同位元素３２Ｐ等で標識する。尚、か
かる標識には市販のニックトランスレーションキットま
たはマルチプライムＤＮＡ標識システム〔Ａｍｅｒｓｈ
ａｍ社（英国）、ニッポンジーン（日本）社等製販〕を
用いることができる。標識されたｃＤＮＡは、約５〜２
０ｍｌのアンプル等の容器に入れ、密封する。このｃＤ
ＮＡ量は１容器当り１〜１００ｕｇであり、液状または
凍結乾燥状態で、提供することができる。この標識され
たｃＤＮＡを用いるＮＡＮＢ型肝炎の診断は、公知の標
準的なハイブリダイゼーション法により実施できる。即
ち、患者から得られた血漿、血清または白血球を標識さ
れたｃＤＮＡに接触させ、該ｃＤＮＡとハイブリダイズ
した核酸を常法により検出する。かかるｃＤＮＡが酵素
で標識されているときはエンザイムイムノアッセイによ
り、放射性同位体で標識されているときは例えばシンチ
レーション計測により検出を行う。
【００７３】
【実施例】以下、本発明について実施例を挙げて説明す
る。但し、本発明は以下の実施例にのみ限定されるもの
ではない。 実施例１ （１）ＮＡＮＢＶゲノムＲＮＡに相補的なｃＤＮＡを作
製するための血漿由来ＲＮＡの調製：血漿よりＮＡＮＢ
Ｖを得るため、血中グルタミックーピルビック トラン
スアミナーゼ（ＧＰＴ）値（Ｗｒｏｂｌｅｗｓｉｋｉ，
Ｆ ＆ Ｊ．Ｓ．ＬａＤｕｅ：Ｓｅｒｕｍ ｇｌｕｔａ
ｍｉｃ ｐｙｒｕｖｉｃ ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅｉ
ｎ ｃａｒｄｉａｃ ａｎｄ ｈｅｐａｔｉｃ ｄｉｓ
ｅａｓｅ．Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅ
ｄ．，９１：５６９，１９５６）が、３５ＩＵ／ｌ以上
を示す４．８１のヒト血漿を蔗糖３０％（Ｗ／Ｗ）溶液
に重層後、遠心（４８，０００×ｇ、１３時間、４℃）
し、沈殿を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ ｐＨ ８．０
−１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液に浮遊して、再び遠心（２５
０，０００×ｇ、３時間、４℃）後、得られた沈殿を７
５ｍｌの５．５Ｍ ＧＴＣ溶液（５．５Ｍ グアニジン
チオシアネート、２０ｍＭ クエン酸ソーダ ｐＨ７．
０、０．０５％ サルコシール（ラウリルサルコシン酸
ナトリウム）、０．１Ｍ２−メルカプトエタノール）に
溶解し、１６ｍｌのＣｓＴＦＡ−０．１Ｍ ＥＤＴＡ溶
液（ｐ＝１．５１）上に重層の後、遠心（１４０，００
０×ｇ、２０時間、１５℃）してＲＮＡを沈殿させる。
上清中のたん白質やＤＮＡを吸引して除き、沈殿を２０
０μｌのＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ ｐＨ８．
０，１ｍＭＥＤＴＡ）溶液に溶解し、２０μｌの３Ｍ
塩化ナトリウムとエタノールを加え、−７０℃に９０分
間静置する。遠心（１２，０００×ｇ、３０分、４℃）
し、沈殿をＴＥに溶解し、上記と同様に再度、塩化ナト
リウムとエタノールを加え、−７０℃で静置し、生じた
沈殿を回収し、１０μｌのＴＥに溶解し精製ＲＮＡとし
た。
【００７４】（２）ＮＡＮＢＶゲノムＲＮＡに相補的な
ｃＤＮＡの作製の為の肝臓由来ＲＮＡの調製：ＮＡＮＢ
型肝炎患者の切除肝より岡山等の方法（Ｈ．Ｏｋａｙａ
ｍａ，Ｍ．Ｋａｗａｉｃｈｉ，Ｍ．Ｂｒｏｗｎｓｔｅｉ
ｎ，Ｆ．Ｌｅｅ，Ｔ．Ｙｏｋｏｔａ，ａｎｄ Ｋ．Ａｒ
ａｉ：Ｈｉｇｈ−Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ ｏｆ Ｆｕｌｌ−Ｌｅｎｇｔｈ ｃＤＮＡ；Ｃｏｎ
ｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄＳｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ
ｃＤＮＡ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｌｉｂｒａｒｉｅ
ｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ．Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５４．３−
２８，１９８７）でＮＡＮＢＶゲノムＲＮＡを調製し
た。
【００７５】即ち、切除肝１ｇを細片化し、上記（１）
の１００ｍｌの５．５Ｍ ＧＴＣ溶液に浮遊し、テフロ
ン−ガラスホモジナイザーを用いてホモジナイズした。
次いで、＃１８注射針付注射器を用いて、ホモジネート
を出し入れして、ＤＮＡを機械的に切断した。低速遠心
（１，５００×ｇ、１５分、４℃）して得られた上清
を、上記（１）に記載したと実質的に同様の方法でＣｓ
ＴＦＡ溶液上に重層し、遠心後、得られた沈殿のＲＮＡ
画分を、０．４ｍｌの４Ｍ ＧＴＣ溶液に浮遊し、１０
μｌの１Ｍ酢酸および３００μｌのエタノールを加え、
−２０℃で少なくとも３時間静置しＲＮＡを沈殿させ
る。遠心（１２，０００×ｇ、１０分、４℃）して、沈
殿をＴＥ溶液１ｍｌに溶解し、１００μｌの２Ｍ 塩化
ナトリウム溶液および３ｍｌのエタノールを加え、−２
０℃に３時間静置し、生じた沈殿を遠心にて回収し、１
０μｌのＴＥに溶解して肝臓由来のＲＮＡを精製した。
【００７６】（３）ｃＤＮＡ合成キットを用いた二本鎖
ｃＤＮＡの調製：市販のｃＤＮＡ合成キット〔Ａｍｅｒ
ｓｈａｍ社（英国）製販〕を用いて二本鎖ｃＤＮＡを調
製した。即ち、上記（１）で得られた精製ＲＮＡ０．７
５μｇをキットに添付の試薬類、２μｌのランダムヘキ
サヌクレオチドプライマー、２μｌの逆転写酵素液を加
え、蒸留水で全量を２０μｌとして、反応液を４２℃に
て４０分間インキューベートし、ｃＤＮＡのファースト
ストランドを合成し、次いで、氷水中にて冷やしなが
ら、セカンドストランドの合成を行った。先ず反応液２
０μｌにキット添付のセカンドストランド合成反応用緩
衝液３７．５μｌと大腸菌リボヌクレアーゼＨを１μ
ｌ、ＤＮＡポリメラーゼＩ６．６μｌを加え、更に、３
４．９μｌの蒸留水を混和した。１２℃で６０分間、次
いで、２２℃で６０分間反応後、更に７０℃で１０分間
インキュベートし、氷水にて再度冷やし、Ｔ４ＤＮＡポ
リメラーゼを１μｌ加え、３７℃で１０分間インキュベ
ート後、４μｌの０．２５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）
を加え、反応を停止させ、フェノール／クロロホルムを
よく混和後、遠心（１２，０００×ｇ、１分間）し、水
層を分離した。水層は更に上述の抽出操作を１回繰り返
した後、クロロホルムを等量加え、よく攪拌の後、遠心
して水層を分離し、次いで等量の４Ｍ酢酸アンモニウム
と２倍量のエタノールを加え、−７０℃にて精製した二
本鎖ｃＤＮＡを沈殿させた。沈殿は５０μｌの２Ｍ酢酸
アンモニウムに溶解後、１００μｌのエタノールを加
え、−７０℃にて再び沈殿させ、遠心（１２，０００×
ｇ、１０分）により沈殿を回収し、乾燥した後、２０μ
ｌのＴＥに溶解した。
【００７７】（４）ポリメラーゼチェインリアクション
（ＰＣＲ）法による二本鎖ｃＤＮＡの調製：上記（１）
および（２）で調製したＲＮＡを鋳型として、逆転写酵
素を用いて調製したｃＤＮＡを、夫々ＰＣＲ法（Ｓａｉ
ｋｉ，Ｒ．Ｋ；Ｇｅｌｆａｎｄ，Ｄ．Ｈ；Ｓｔｏｆｆｅ
ｒ，Ｓ；Ｓｃｈａｒｆ，Ｓ．Ｊ；Ｈｉｇｕｃｈｉ，Ｒ；
Ｈｏｒｎ，Ｇ．Ｔ；Ｍｕｌｌｉｓ．Ｋ・Ｂ；ａｎｄ Ｅ
ｒｌｉｃｈ，Ｈ．Ａ．：Ｐｒｉｍｅｒ−ｄｉｒｅｃｔｅ
ｄ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｏｆ ＤＮＡ ｗｉｔｈ ａ ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂ
ｌｅ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ． Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２３９：４８７−４９１，１９８８）により増幅し
た。即ち、ＲＮＡ５〜１，０００ｎｇを２０μｌの逆転
写酵素液｛５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ ｐＨ ８．
３，４０ｍＭ ＫＣｌ，６ｍＭ ＭｇＣｌ２１μＭ
３’−プライマーＧ（図２−１４の塩基番号第７９４９
番から第７９７３番の２５個の塩基からなるオリゴヌク
レオチド）、１０ｍＭのｄＮＴＰおよび０．５単位の逆
転写酵素〔Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ Ｌａ
ｂ．，（米国）〕｝中で３７℃、３０分間インキュベー
トする。次いで、８０μｌのＰＣＲ反応液｛１８ｍＭ
Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ ｐＨ ８．３、４８ｍＭ ＫＣｌ、
１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．６μＭずつの５’−プラ
イマー（図２−１３の塩基番号第７６１２番から第７６
３６番の２５個の塩基を含む合成オリゴヌクレオチド）
および上記の３’−プライマー、１０ｍＭのｄＮＴＰお
よび２．５単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ〔Ｐｅｒｋ
ｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ社（米国）製販〕を加
え、９４℃で１分間、５０℃で２分間、７２℃で３分間
のインキュベーションを４０回繰り返し、アガロースゲ
ル電気泳動にて、増幅されたｃＤＮＡを回収した。フェ
ノール処理および、エタノール沈殿させた後乾燥させ、
１０μｌのＴＥに溶解した。
【００７８】（５）ラムダｇｔ１１を用いたｃＤＮＡラ
イブラリーの作製：市販のｃＤＮＡクローニングキット
〔Ａｍｅｒｓｈａｍ社（英国）製販〕を用いて、ｃＤＮ
Ａライブラリーを作製した。即ち、上記（３）で調製し
た１３０ｎｇのｃＤＮＡにクローニングキットに添付の
Ｌ／Ｋ緩衝液２μｌ、ＥｃｏＲＩアダプター２μｌ、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼ２μｌを加え、更に蒸留水にて全量を
２０μｌとし、１５℃にて１６〜２０時間インキュベー
ト後、０．２５Ｍ ＥＤＴＡを２μｌ加え、反応を停止
させた。次いで、キットに添付されているサイズ分画カ
ラムを通し、ｃＤＮＡに連結されなかったＥｃｏＲＩア
ダプターを除去した後、ＥｃｏＲＩアダプター連結ｃＤ
ＮＡ７００μｌにＬ／Ｋ緩衝液８３μｌとＴ４ポリヌク
レオチドキナーゼ８μｌを加えて３７℃にて３０分間イ
ンキュベートする。次いで、フェノール抽出を２回し、
ブタノールにて３５０〜４００μｌに濃縮し、エタノー
ル沈殿させたものを５μｌのＴＥに溶解した。
【００７９】次に、クローニングベクターラムダｇｔ１
１のＥｃｏＲＩ部位にＥｃｏＲＩアダプター付加ｃＤＮ
Ａを挿入するために、上記のＥｃｏＲＩアダプター連結
ｃＤＮＡ１μｌ（１０ｎｇ）にＬ／Ｋ緩衝液１μｌ、ラ
ムダｇｔ１１アームＤＮＡ２μｌ（１μｇ）およびＴ４
ＤＮＡリガーゼ２μｌを加え、蒸留水にて混合液の全量
を１０μｌとして、１５℃で１６〜２０時間インキュベ
ートして組換えラムダｇｔ１１ＤＮＡ液を作製した。更
に、ｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージングを行い、組換えラ
ムダファージを得るため、市販のｉｎ ｖｉｔｒｏパッ
ケージングキット〔Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社（米国）製
販〕のＧｉｇａｐａｃｋＩＩ ＧｏｌｄのＡ液１０μｌ
とＢ液１５μｌを上記の組換えラムダｇｔ１１ＤＮＡ液
４μｌに加え、２２℃にて２時間インキュベート後、添
付のＳＭ緩衝液４７０μｌとクロロホルム１０μｌを加
え、組換えファージを４℃に保存した。
【００８０】（６）大腸菌プラスミドｐＵＣ１９を用い
たｃＤＮＡクローニング：市販のＤＮＡライゲーション
キット〔宝酒造社（日本）製販〕を用いて、ｃＤＮＡを
大腸菌プラスミドｐＵＣ１９（Ｃ．Ｙａｎｉｓｈｉ−Ｐ
ｅｒｒｏｎ，Ｊ．Ｖｉｅｉｒａ，Ｊ．Ｍｅｓｓｉｎｇ，
Ｇｅｎｅ ３３，１０３，１９８５）に挿入し、大腸菌
にてクローニングした。即ち、上記（４）でポリメラー
ゼチェインリアクション（ＰＣＲ）法にて調製したｃＤ
ＮＡ５μｌと制限酵素ＳｍａＩで切断後、脱リン酸化し
たプラスミドｐＵＣ１９ＤＮＡ ５μｌ（５０ｎｇ）に
キット添付のＡ液４０μｌとＢ液１０μｌを加え、１５
℃にて１６時間インキュベートする。この様にして得ら
れたプラスミドＤＮＡで大腸菌ＪＭ１０９株（Ｍｅｓｓ
ｉｎｇ，Ｊ；Ｃｒｅａ，Ｒ．ａｎｄ Ｓｅｅｂｕｒｇ，
Ｐ．Ｈ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ９，
３０９，１９８１）を塩化カルシウム法（Ｍａｎｄｅ
ｌ，Ｍ．ａｎｄ Ａ．Ｈｉｇａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，５３，１５４，１９７０）により形質転換し、ｃ
ＤＮＡを組み込んだプラスミドを含む形質転換大腸菌を
得た。
【００８１】（７）ｃＤＮＡライブラリーからのＮＡＮ
ＢＶ遺伝子を有するクローンのスクリーニング：大腸菌
Ｙ１０９０株（Ｒｉｃｈａｒｄ Ａ．Ｙｏｕｎｇ ａｎ
ｄ Ｒｏｎａｌｄ Ｗ．Ｄａｖｉｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，
２２２，７７８，１９８３）を５０ｍｌのＬＢＭ培地
（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％塩化ナト
リウム、５０μｇ／ｍｌアンピシリンおよび０．４％マ
ルトース）にて３７℃で培養し、対数増殖期の大腸菌細
胞を氷冷した１５ｍｌの１０ｍＭ硫酸マグネシウムに浮
遊した。上記（５）で得られたファージ液をＳＭ緩衝液
（０．１Ｍ塩化ナトリウム、８ｍＭ硫酸マグネシウム、
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ ｐＨ７．５、０．０１％
ゲラチン）にて希釈し、この希釈ファージ液０．１ｍｌ
と上記菌液を等量混合して、３７℃にて１５分間インキ
ュベート後、４５℃に加温した４ｍｌの軟寒天培地（１
％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナト
リウム、０．２５％硫酸マグネシウムおよび０．７％寒
天 ＰＨ７．０）を加え、Ｌ−寒天培地（１％トリプト
ン、０．５％酵母エキス、１％塩化ナトリウム、１００
μｇ／ｍｌアンピシリン ＰＨ７．０，１．５％寒天）
のプレートにまき、４２℃で３時間インキュベートし
た。次いで、１０ｍＭ ＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ
β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄ
ｅ）をニトロセルロースフィルターに浸み込ませ、それ
を乾燥させたものをプレート上に密着させ、更に３７℃
にて３時間インキュベートした。分離したフィルターを
ＴＢＳ緩衝液で３回洗浄し、２％ウシ血清アルブミン液
に浸し、室温にて１時間インキュベートした。市販のイ
ムノスクリーニングキット〔Ａｍｅｒｓｈａｍ社（英
国）製販〕に添付の大腸菌溶解液を１／２０容量加え
て、室温に３０分インキュベートした後、０．２％ウシ
血清アルブミン加ＴＢＳ緩衝液にて５０倍希釈したＮＡ
ＮＢ型肝炎患者血清にこのフィルターを浸し、室温にて
１時間反応させた。
【００８２】得られたフィルターは０．０５％Ｔｗｅｅ
ｎ２０加ＴＢＳ緩衝液にて４回洗浄し、パーオキシダー
ゼ標識抗ヒトＩｇＧ〔Ｃａｐｐｅｌ社（独）製販〕を１
０００倍希釈した抗体液に１時間浸し、上述のＴｗｅｅ
ｎ−ＴＢＳ液にて洗浄し、５０ｍｌのＴＢＳ緩衝液に
０．４ｍｌのＤＡＢ（３，３’−ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎ
ｚｉｄｉｎｅ ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄ
ｅ）と３０％過酸化水素液１５μｌを加えた液に浸し、
５〜３０分間、室温にてインキュベートし発色させ、フ
ィルターを蒸留水で完全に水洗し反応を停止した。
【００８３】上記の操作により得られたプラークの純化
を行い、９個の陽性クローンを単離した。これらのクロ
ーンを夫々、ＢＫ１０２、ＢＫ１０３、ＢＫ１０５、Ｂ
Ｋ１０６、ＢＫ１０８、ＢＫ１０９、ＢＫ１１０、ＢＫ
１１１およびＢＫ１１２と命名した。これ等のクローン
はいずれも正常人血清とは反応せず、ＮＡＮＢ型肝炎患
者血清と特異的に反応した（第１表）。
【００８４】
【００８５】（８）得られたクローンの塩基配列の決
定：クローンＢＫ１０２〜ＢＫ１１２の組換え体ファー
ジＤＮＡを回収し、制限酵素ＥｃｏＲＩで消化後、ＮＡ
ＮＢＶのｃＤＮＡ断片を単離し、個別にプラスミドｐＵ
Ｃ１９のＥｃｏＲＩサイトに組込み、得られたプラスミ
ドを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を上記（６）と実質的に
同様の方法で形質転換した。これ等の形質転換大腸菌よ
りプラスミドＤＮＡを精製し、７−ＤＥＡＺＡシークエ
ンスキット〔宝酒造社（日本）製販、Ｍｉｚｕｓａｗ
ａ，Ｓ．，Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｓ．ａｎｄ Ｓｅｅｌ
ａ，Ｆ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１
４，１３１９，１９８６〕を用いて夫々のＮＡＮＢＶｃ
ＤＮＡの塩基配列の決定を行った。得られたｃＤＮＡク
ローンの塩基配列の相互関係を図１−１に示した。
【００８６】（９）ジーンウォーキングによるｃＤＮＡ
ライブラリからのＮＡＮＢＶｃＤＮＡクローンのクロー
ニング：上記（８）で得たクローンＢＫ１０２、ＢＫ１
０６およびクローンＢＫ１１２のｃＤＮＡ断片を３２Ｐ
−ｄＣＴＰでラベルしたプローブを調製し、上記（５）
で得たクローニングベクターラムダｇｔ１１のｃＤＮＡ
ライブラリーからハイブリダイゼーションによりＮＡＮ
ＢＶｃＤＮＡを含有するファージクローンを得た。即
ち、上記（８）で得たクローンＢＫ１０２、ＢＫ１０６
およびＢＫ１１２の形質転換大腸菌よりアルカリ法（Ｍ
ａｎｉａｔｉｓ Ｔ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ Ｅ．Ｆ．，ａ
ｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．：Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ
ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ ａｎｄ Ｐｌａｓ
ｍｉｄ ＤＮＡ：“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ”Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａ
ｂ．，ｐｐ７５−９６．）にてプラスミドＤＮＡを調製
した。
【００８７】クローンＢＫ１０２のプラスミドＤＮＡは
制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｃＩＩにより消化し、生じた
該ＤＮＡの５’末端側の０．７Ｋｂの断片をアガロース
ゲル電気泳動後、回収した。クローンＢＫ１０６および
クローンＢＫ１１２のプラスミドＤＮＡは制限酵素Ｎｃ
ｏＩで消化し、上述と同様にして、クローンＢＫ１０６
からは１．１ＫｂのＤＮＡ断片を、また、クローンＢＫ
１１２からは３’末端側の０．７Ｋｂの断片をそれぞれ
回収した。２５ｎｇ〜１μｇのＤＮＡ断片を、市販のＤ
ＮＡラベリングキット（ニッポンジーン社製）を用い
〔α−３２Ｐ〕ｄＣＴＰ〔３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、Ａ
ｍｅｒｓｈａｍ社（英国）製〕で、３７℃にて３〜５時
間インキュベートすることにより、ハイブリダイゼーシ
ョン用のプローブを調製した。
【００８８】次に、上記（５）で得られたｃＤＮＡライ
ブラリーのファージを、上記（７）に記載のごとくＬ−
寒天培地にて４２℃で３時間、次いで、３７℃で３時間
インキュベート後、冷却し、ニトロセルロースフィルタ
ーをのせ３０〜６０秒放置して、ファージをフィルター
に吸着させた。０．５Ｎ水酸化ナトリウム−１．５Ｍ塩
化ナトリウム液で１〜５分アルカリ変性し、０．５Ｍ
Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ ｐＨ８．０−１．５Ｍ塩化ナトリウ
ム液で１〜５分中和後、２×ＳＳＣ液（０．３Ｍ塩化ナ
トリウム−０．０３Ｍクエン酸ナトリウム）で洗浄し、
風乾後８０℃で２時間焼付けを行った。
【００８９】このフィルターをハイブリダイゼーション
液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａ
ｒｔ液、５０ｍＭリン酸クエン酸緩衝液 ｐＨ６．５、
１００μｇ／ｍｌ鮭精子ＤＮＡおよび０．１％ＳＤＳ）
にて４２℃、６時間インキュベートした後、上記の約４
×１０８ｃｐｍ／ｍｌのプローブを１ｍｌ加えた上記の
ハイブリダイゼーション液３００ｍｌに再び浸し、４２
℃にて１６〜２０時間インキュベートし、０．１％ ２
×ＳＳＣを含むＳＤＳ液で４回、０．１％ ０．１×Ｓ
ＳＣを含むＳＤＳ液で２回洗浄後、乾燥し、オートラジ
オグラフィーを行い、ハイブリダイゼーション陽性を示
すクローンを単離した。この結果、クローンＢＫ１０２
由来のプローブと反応する２７クローン、クローンＢＫ
１０６由来のプローブと反応する１４クローンおよび、
クローンＢＫ１１２由来のプローブと反応する１３クロ
ーンを得、夫々のクローンはＢＫ１１４〜ＢＫ１６９と
順次命名した。
【００９０】更に、上記（８）に記載のごとくクローン
ＢＫ１１４〜ＢＫ１６９夫々の塩基配列の決定を行い、
各クローンのマッピングを行ったところ、ＮＡＮＢＶゲ
ノムのほぼ全長と考えられる約９．５Ｋｂの長さを有す
る塩基配列がマップされた（図１−２）。この内、５’
末端側に位置するクローンＢＫ１５７から制限酵素Ｋｐ
ｎＩ消化により５’末端側０．５５Ｋｂの断片を回収
し、また３’の最末端側に位置するクローンＢＫ１１６
から制限酵素ＨｐａＩとＥｃｏＲＩの消化により３’末
端側０．５５Ｋｂの断片を回収し、上記のごとく３２Ｐ
で標識したプローブを調製し、上記（５）で得られたｃ
ＤＮＡライブラリーのファージをプラークハイブリダイ
ゼーションした結果、クローンＢＫ１５７由来のプロー
ブにより新たに３個のクローンを分離し、夫々クローン
ＢＫ１７０、ＢＫ１７１およびＢＫ１７２と命名した。
【００９１】（１０）ｃＤＮＡの塩基配列の解析：上記
（８）および（９）により得られたクローンの塩基配列
からＮＡＮＢＶ遺伝子の全塩基配列を決定し、図２−１
から図２−１６に示した。この結果、クローニングされ
たＮＡＮＢＶ遺伝子ｃＤＮＡは９４１６塩基より成り、
この内に９０３０塩基から成るオープンリーディングフ
レームが存在し、３０１０個のアミノ酸残基のプロテイ
ンがコードされていると推定された。このプロテインの
親水性／疎水性のパターンは、既に報告されているフラ
ビウイルスのパターン（Ｓｕｍｉｙｏｓｈｉ Ｈ．，Ｍ
ｏｒｉ Ｃ．，Ｆｕｋｅ Ｉ． ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍ
ｐｌｅｔｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ｏｆ ｔｈｅ Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｅｎｃｅｐｈａｌ
ｉｔｉｓＶｉｒｕｓ Ｇｅｎｏｍｅ ＲＮＡ． Ｖｉｒ
ｏｌｏｇｙ，１６１，４９７−５１０，１９８７）に類
似していた。代表的クローンとしてＢＫ１５７（塩基番
号第１番から第１９６２番）、クローンＢＫ１７２（第
５番から第３６６番）、クローンＢＫ１５３（第３３８
番から第１８０２番）、クローンＢＫ１３８（第１７５
５番から第５１２４番）、クローンＢＫ１２９（第４１
０４番から第６９７３番）、クローンＢＫ１０８（第６
８８６番から第８３４４番）、およびクローンＢＫ１６
６（第８０８２番から第９４１６番）挙げることができ
る。これ等のクローンは、夫々、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｉ ＢＫ１０８（微工研条寄第２９７１
号）、ＢＫ１２９（微工研条寄第２９７２号）、ＢＫ１
３８（微工研条寄第２９７３号）、ＢＫ１５３（微工研
条寄第２９７４号）、ＢＫ１５７（微工研条寄第３２４
３号）、ＢＫ１６６（微工研条寄第２９７５号）および
ＢＫ１７２（微工研条寄第２９７６号）として保存し
た。更に上記クローンに加え、ＢＫシリーズの代表例と
して、次の５クローンが微工研に寄託されている：ＢＫ
１０２（微工研条寄第３３８４号）、ＢＫ１０６（微工
研条寄第３３８５号）、ＢＫ１１２（微工研条寄第３３
８６号）、ＢＫ１４６（微工研条寄第３３８７号）、Ｂ
Ｋ１４７（微工研条寄第３３８８号）。
【００９２】（１１）ＮＡＮＢＶ感染に併う抗体応答に
関連したＮＡＮＢＶ関連抗原の大腸菌における産生：上
記（８）で得られたクローンＢＫ１０６、ＢＫ１１１、
およびＢＫ１１２と上記（９）で得られたクローンＢＫ
１４７の夫々のｃＤＮＡが個別に挿入されたプラスミド
ＤＮＡを従来のアルカリ法にて回収した。次いで、クロ
ーンＢＫ１０６の回収されたＤＮＡは制限酵素ＥｃｏＲ
ＩおよびＣｌａＩで消化し、０．３４ＫｂのＤＮＡ断片
０．５μｇを得、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ反応液（６７
ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ ｐＨ８．８，６．７ｍＭ塩化マ
グネシウム、１６．６ｍＭ硫酸アンモニウム、１０ｍＭ
２−メルカプトエタノール、６．７μＭ ＥＤＴＡ、
０．０２％ウシ血清アルブミン、０．３ｍＭ ｄＮＴＰ
および２〜５単位のＴ４ＤＮＡポリメラーゼ）中で、３
７℃にて６０分、インキュベートし、両末端を平滑にし
た。クローンＢＫ１０２のＤＮＡは制限酵素ＢａｍＨＩ
で消化し、回収した０．７ＫｂのＤＮＡ断片０．５μｇ
を上記と同様にしてＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて末
端を平滑にした。クローンＢＫ１４７のＤＮＡは制限酵
素Ｓａｕ３ＡＩで消化し、回収した１ＫｂのＤＮＡ断片
０．５μｇを上記と同様にして末端を平滑にした。ま
た、クローンＢＫ１１１のＤＮＡは制限酵素ＥｃｏＲＩ
で消化し、回収した１ＫｂのＤＮＡ断片０．５μｇを実
質的に上記と同様にして末端を平滑にした。次に、発現
ベクターｐＫＫ２３３−２（Ａｍａｎｎ，Ｅ．ａｎｄＢ
ｒｏｓｉｕｓ，Ｊ．ＡＴＧ ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ ｒ
ｅｇｕｌａｔｅｄ ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ ｅｘｐｒｅ
ｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓｉｎ Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｇｅｎｅ， ４０，
１８３，１９８５）のＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ
で消化後、このＤＮＡ２μｇをＳ１ヌクレアーゼ液
（０．３Ｍ塩化ナトリウム、５０ｍＭ酢酸ナトリウム
ｐＨ４．５、１ｍＭ硫酸亜鉛および１００〜２００単位
のＳ１ヌクレアーゼ）中で、３７℃にて２０分間インキ
ュベートし、０．１２Ｍ ＥＤＴＡおよび１Ｍ Ｔｒｉ
ｓ・ＨＣｌ（ｐＨ９．０）液を１／１０容量加えて反応
を停止し、フェノール抽出を行った後、平滑末端となっ
たベクターＤＮＡをエタノールで沈殿させ回収した。一
方、ベクターｐＫＫ２３３−２のＤＮＡは制限酵素Ｐｓ
ｔＩで消化後、フェノール抽出とエタノール沈殿により
精製した後、このＤＮＡ２μｇを上記のＴ４ＤＮＡポリ
メラーゼ反応により末端を平滑にした。この様にして得
たクローンＢＫ１０６およびＢＫ１１１由来のＤＮＡ断
片０．５μｇは夫々制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで開裂後、
また、クローンＢＫ１０２およびＢＫ１４７由来のＤＮ
Ａ断片０．５μｇは夫々制限酵素ＰｓｔＩで開裂後、平
滑末端としたベクターＤＮＡ０．５μｇと混合し、２μ
ｌの１０×ライゲーション液（５００ｍＭ Ｔｒｉｓ・
ＨＣｌ ｐＨ７．５、１００ｍＭ塩化マグネシウム、１
００ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭ ＡＴＰ）、３００〜４０
０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼおよび蒸留水を加えて全量
を２０μｌとして、１４℃にて１２〜１８時間インキュ
ベートし、得られたプラスミドを夫々、ｐＣＥ−０６、
ｐＥ−１１、ｐＢ−０２、およびｐＳ−０９と命名し
た。次に、これらのプラスミドＤＮＡを用い、実質的に
上記（６）に記載のごとく大腸菌ＪＭ１０９株を形質転
換し、形質転換大腸菌を得、ＬＢ培地（１％ Ｗ／Ｖト
リプトン、０．５％ Ｗ／Ｖイーストエキストラクト、
および１％ Ｗ／Ｖ塩化ナトリウム、ｐＨ７．５）で３
７℃にて培養し、対数増殖期に１ｍＭ ＩＰＴＧ（イソ
プロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を添加
し、更に３時間培養した。更に大腸菌細胞を遠心（１
０，０００×ｇ、１５分間）により回収し、５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に溶解し、超音波処理
（２０ＫＨｚ、６００Ｗ，５分間）後、遠心（１０，０
００×ｇ、１５分間）により上清と沈殿に分画し、夫々
をサンプル緩衝液（２０％ Ｖ／Ｖグリセロール、０．
１Ｍ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ ｐＨ６．８、２％ Ｗ／Ｖ
ＳＤＳ、２％ Ｖ／Ｖ ２−メルカプトエタノール、お
よび０．０２％ ＢＰＢ）に溶解し、１００℃で３分間
加熱後、０．１％ ＳＤＳ−７．５％ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動後、蛋白を分離し、トランス・ブロット
セル〔ＢＩＯ・ＲＡＤ社（米国）製販〕にてニトロセル
ロースフィルターに転写した。次いで、フィルターを３
％ゲラチン液に浸し、６０分放置後、１００倍希釈した
ＮＡＮＢ型肝炎患者血清と室温にて２〜３時間インキュ
ベートし、まず蒸留水で、次にＴＴＢＳ液（０．０２Ｍ
Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ ｐＨ７．５、０．５Ｍ塩化ナトリウ
ムおよび０．０５％ Ｖ／Ｖ Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄
した。次いで、２０００倍希釈したパーオキシダーゼ標
識抗ヒトＩｇＧ抗体液に浸し、室温にて９０分間インキ
ュベートした。そして、蒸留水およびＴＴＢＳで洗浄し
た後、上記（７）に記載のごとく発色剤ＤＡＢおよび基
質の３０％過酸化水素液をくわえた緩衝液に５〜３０分
間浸し、水洗して反応を停止した
【００９３】この結果、第２表に示すごとくいずれのプ
ラスミドの産生する抗原もＮＡＮＢ型肝炎患者の血清と
特異的に反応し、これらのプラスミドに挿入されたｃＤ
ＮＡの産生する蛋白が臨床的に重要であることが示され
た。
【００９４】（１２）大腸菌の産生したＮＡＮＢＶ関連
抗原の精製および肝疾患患者血清との反応性： 発現ベ
クターに挿入されたｃＤＮＡの産生する蛋白の有用性
は、これらの蛋白を精製し、ＥＬＩＳＡまたはラジオイ
ムノアッセイ用抗原として用いる事によって示された。
即ち、上記（１１）で得た形質転換大腸菌の菌体破砕液
を遠心（１０，０００×ｇ、１５分間）により上清と沈
殿に分画する。例えば、形質転換体ＪＭ１０９／ｐＣＥ
０６６より得られた沈殿を１００ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣ
ｌ（ｐＨ８．０）−０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１０
０溶液に浮遊し、超音波処理（２０ＫＨｚ、６００Ｗ、
１分間）後、遠心（２１，０００×ｇ、１５分間）し
て、沈殿を１００ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．
０）−６Ｍ尿素に再浮遊後、超音波処理を行った。
【００９５】得られた上清は、１０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７．５）−６Ｍ尿素に対し透析し、抗原液を２０
ｍｌ、高速液体クロマトグラフイー（ＨＰＬＣ）により
上述の緩衝液にて平衡化したヒドロキシアパタイト充填
カラム（２１．５×２５０ｍｍ）に吸着させ、上述緩衝
液中で塩化ナトリウムの０〜２Ｍ直線濃度勾配溶出を行
い、抗原を含む画分をプールし、５０ｍＭ炭酸緩衝液
（ｐＨ９．６）−０．０５％ドデシル硫酸ナトリウム
（ＳＤＳ）に透析した。
【００９６】また、形質転換体ＪＭ１０９／ｐＢ−０２
−１０の菌体破砕液の遠心上清（１０，０００×ｇ、１
５分間）を３５％飽和硫酸アンモニウム処理し、得られ
た沈殿を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．５）−
１００ｍＭ ２−メルカプトエタノールに溶解して、同
緩衝液に透析した。次いで、高速液体クロマトグラフィ
ーにより同緩衝液にて平衡化したＤＥＡＥ−セルロース
カラム（２２．０×２００ｍｍ）に透析済の試料１００
ｍｌを吸着させ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ
８．５）−１００ｍＭ ２−メルカプトエタノール中で
塩化ナトリウムの０〜２Ｍ直線濃度勾配溶出を行い、抗
原を含む画分をプールした。
【００９７】この画分は１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
６．８）−１００ｍＭ ２−メルカプトエタノールに透
析し、同緩衝液にて平衡化したＨＰＬＣ用ハイドロキシ
アパタイトカラムに吸着させた後、リン酸の１０〜４０
０ｍＭ直線濃度勾配溶出を行い、抗原を含む画分をプー
ルし、５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）−０．０５％
ＳＤＳ液に透析した。更に、形質転換体ＪＭ１０９／ｐ
Ｅ−１１−８９の菌体破砕液の遠心沈殿は、１０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ５．５）に浮遊し、超音波処理を１分
間行い、遠心（２１，０００×ｇ、１５分間）した。得
られた沈殿は１００ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ１０．５）−
５００ｍＭ塩化ナトリウム−１０ｍＭ ＥＤＴＡ溶液に
浮遊し、再び超音波処理を１分間行い、遠心上清を３０
ｍＭリン酸緩衝液−６Ｍ尿素に対し透析した。次いで、
透析に用いたと同様の緩衝液で平衡化した（ＨＰＬＣ）
用ＣＭ−セルロースカラム（２２×２００ｍｍ）に２０
ｍｌの透析液を吸着させ、同緩衝液中で塩化ナトリウム
の０〜１．５Ｍ直線濃度勾配溶出を行い、抗原を含む画
分をプールし、５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）−
０．０５％ＳＤＳに透析し、抗原液を得た。
【００９８】上記のごとく調製した抗原は、ＥＬＩＳＡ
用抗原として、ＮＡＮＢ型肝炎ウイルス感染の臨床的診
断に用いることができた。即ち、上記の精製抗原を蛋白
濃度１μｇ／ｍｌに調製し、ＥＬＩＳＡ用マイクロプレ
ート・イムロン６００〔ＩＭＭＵＬＯＮ（登録商標）、
Ｇｒｅｉｎｅｒ社（独）製販〕の各ウェルに１００μｌ
ずつ分注し、４℃にて一夜静置する。各ウェルはＰＢＳ
−Ｔ緩衝液（１０ｍＭリン酸緩衝液 ｐＨ７．２、０．
８％塩化ナトリウムおよび０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２
０）で３回よく洗浄し、ＰＢＳ−Ｔ緩衝液で希釈した被
検血清を１００μｌ／ウェル加え、３７℃にて１時間反
応させた。ＰＢＳ−Ｔ緩衝液で３回洗浄後、ペルオキシ
ダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体〔Ｃａｐｐｅｌ社（独）製
販〕を１０％牛胎児血清を含むＰＢＳ−Ｔ緩衝液にて
８，０００倍希釈したものを各ウェルに１００μｌづつ
加え、３７℃にて１時間反応後、再び、ＰＢＳ−Ｔ緩衝
液で４回洗浄し、基質発色剤溶液（９ｍｌの０．０５Ｍ
クエン酸−リン酸緩衝液に０．５μｇのｏ−フェニレン
ジアミンと過酸化水素水２０μｌを含む）を各ウェルに
１００μｌづつ加え、プレートを遮光して室温で６０分
静置した。４Ｎ硫酸を各ウェルに７５μｌづつ加え、４
９０ｎｍの吸光度を測定した。第３表に示した結果から
明らかなように、いずれの形質転換体由来抗原もＮＡＮ
Ｂ型肝炎患者血清と特異的に反応することから、これら
の形質転換体の産生する抗原の臨床診断における有用性
が実証された。
【００９９】
【０１００】第３表に示した結果は、上記の抗原を用い
たラジオイムノアッセイによっても得ることが出来た。
即ち、１μｇ／ｍｌの濃度の上記精製抗原液０．２ｍｌ
づつに、直径１／４インチのポリスチレンボール〔ペー
ゼル社（独）製販〕を加え、４℃にて一夜静置する。次
いで、上記ＥＬＩＳＡに用いたＰＢＳ−Ｔ緩衝液にてポ
リスチレンボールを５回洗浄し、被検血清をＰＢＳ−Ｔ
緩衝液で２０〜２５００倍希釈したものを２００μｌづ
つ加え、３７℃にて６０分間反応させる。ＰＢＳ−Ｔ緩
衛液で５回洗浄し、１２５Ｉ−標識抗ヒトＩｇＧ抗体を
２００μｌづつ加えて３７℃にて１時間反応させた後、
ＰＢＳ−Ｔ緩衝液で５回洗浄し、スチレンボールに結合
している。１２５Ｉのｃｐｍを測定する事により、第３
表に示したと同様の結果が得られ、先に得られた精製抗
原のＮＡＮＢ型肝炎ウイルス感染の臨床診断における有
用性が示された。
【０１０１】応用例１ 合成ポリペプチドの反応性に関する試験：抗体分子は抗
原分子上に存在する“エピトープ”として知られる特定
の領域の構造と結合するが、これらの特定な領域は抗原
分子上の親水性領域に見られる。この様な特定領域を有
する抗原ポリペプチドは、高い反応特異性を持つ有用な
臨床診断剤を容易に調製し得るものと考えられる。ＮＡ
ＮＢＶのエピトープは、図２−１から図２−１６に示さ
れたＮＡＮＢＶ遺伝子ｃＤＮＡがコードするアミノ酸配
列の親水性／疎水性パターンより推定される。即ち、図
２−１に示される塩基番号第３３３番から第４２２番、
図２−１および図２−２に示される塩基番号第４７４番
から第５６３番、図２−８に示される塩基番号第４４８
５番から第４５７４番、および図２−１０に示される塩
基番号第５５４４番から第５６３３番にコードされるア
ミノ酸残基を夫々含有するポリペプチドＢＫＰ−１０６
−１、ＢＫＰ−１０６−２、ＢＫＰ−１０２−１、およ
びＢＫＰ−１４７−１を合成した。夫々のポリペプチド
は１μｇ／ｍｌの濃度に調製し、実施例１の（１２）に
記載と同様の方法により、ＥＬＩＳＡ用マイクロプレー
トに固相化し、ＥＬＩＳＡ法にて、ＮＡＮＢ型肝炎患者
血清との反応性を試験した。第４表に示した結果から明
らかなように、いずれの合成ペプチドもＮＡＮＢ型肝炎
患者の血清と特異的に反応することから、上記の塩基配
列の特定領域の臨床診断における重要性が示された。
【０１０２】 更に、ＮＡＮＢＶのエンベロープ蛋白上のエピトープを
推定し、３種のポリペプチドを合成した。即ち、図２−
２に示される塩基番号第９０６番から第９５３番および
第１０２０番から第１０４６番と、図２−２および図２
−３に示される塩基番号第１１９４番から第１２３２番
にコードされるポリペプチドを合成した。これ等のポリ
ペプチドはいずれも、ＮＡＮＢＶの株により抗原変異が
生じると考えられるエンベロープ領域に対応するもので
あり、かつ、ＥＬｌＳＡ法により、ＮＡＮＢ型肝炎患者
血清との間での反応が確認されたため、上述の蛋白は疫
学調査、臨床診断において、ワクチン等の抗原として重
要かつ有用である。
【０１０３】応用例２ ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃ
ｔｉｏｎ）法によるＮＡＮＢＶ核酸の検出：輸血後ＮＡ
ＮＢ型肝炎発症予防には、輸血に供される血液中のＮＡ
ＮＢＶの感染の有無を検定することが重要であり、ま
た、肝疾患の診断のため、肝組織のＮＡＮＢＶ感染の有
無について検討することは、臨床的に極めて重要である
が、本発明のＮＡＮＢＶｃＤＮＡよりポリメラーゼチェ
インリアクション（ＰＣＲ）用プライマーを調製し、Ｎ
ＡＮＢ型肝炎診断に用いることができる。即ち、実施例
１の（１）に記載のごとく、１ｍｌの患者や健常人に由
来の種々の血清についてＲＮＡの精製を行った。同様に
実施例１の（２）に記載のごとく、肝臓細胞よりＲＮＡ
を調製した。次いで、実施例１の（４）に記載のごと
く、ＰＣＲおよび電気泳動を行い、常法に従い、サザー
ンハイブリダイゼーションによる増幅されたｃＤＮＡが
ＮＡＮＢＶ由来のものであるかの同定を、ＮＡＮＢＶｃ
ＤＮＡクローンＢＫ１０８由来のｃＤＮＡより作成した
３２Ｐ−標識プローブを用いて行った。第５表に示した
結果から明らかなように、本発明により得られたＮＡＮ
ＢＶｃＤＮＡの塩基配列より調製したプライマーおよび
クローニングされたＮＡＮＢＶｃＤＮＡの断片をプロー
ブとして用いる事により、血清中のＮＡＮＢＶ核酸の検
出を行い、血清のＮＡＮＢＶ感染を診断することができ
る。
【０１０４】
【０１０５】
【発明の作用と効果】 （１）本発明のＮＡＮＢＶ遺伝子ｃＤＮＡは信頼性が非
常に高く、ＮＡＮＢＶ遺伝子のオープンリーデイングフ
レームの全領域を包含するものである。 （２）本発明のＮＡＮＢＶ抗原ポリベプチドは、ＮＡＮ
ＢＶと特異的に反応するため、該ＮＡＮＢＶ抗原ポリペ
プチドを診断剤として用いた場合と、ＮＡＮＢ型肝炎の
診断を高い信頼性をもって容易に実施することができ
る。 （３）本発明のＮＡＮＢＶ抗原ポリペプチドを輸血用血
液のスクリーニングに用いた場合と、ＮＡＮＢＶ感染の
血液を高い信頼性をもって容易に選別し、非感染の血液
から除去することができるため、血液伝播型のＮＡＮＢ
型肝炎の予防が可能となる。 （４）本発明のＮＡＮＢＶ抗原ポリペプチドは、ＮＡＮ
Ｂ型肝炎を予防するワクチンの活性要因として有利に用
いることが可能である。 （５）本発明のＮＡＮＢＶ抗原ポリペプチドにより、Ｎ
ＡＮＢＶに特異的な抗体、特にモノクローナル抗体を、
容易に調製することができ、このＮＡＮＢＶに特異的な
抗体は、ＮＡＮＢ型肝炎検出の診断剤のみならず輸血用
血液からのＮＡＮＢＶの除去剤としても有利に使用する
ことができる。 （６）更にまた、本発明のＮＡＮＢＶ抗原ポリペプチド
が動物のウイルス感染ではなく宿主細胞内に存在する抗
原ポリペプチドをコードするＤＮＡの遺伝子発現により
産生されることに注目すべきであるため、この抗原ポリ
ペプチドの産生段階中の感染の可能性は、実質的に排除
され、且つ産生コストも減少させることができ、産生工
程において用いられる全ての物質、例えば培養系に用い
る培地はその組成に関してはよく知られているため、精
製がたやすく、高純度の抗原ポリペプチド生成物を得る
ことが可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１−１および図１−２は、ＮＡＮＢＶの全領
域に対する本発明のＮＡＮＢＶ遺伝子のｃＤＮＡクロー
ン間の関係を示す。
【図２】図２−１から図２−１６は、本発明のＮＡＮＢ
Ｖ遺伝子ｃＤＮＡ全領域の塩基配列および該塩基配列に
コードされるアミノ酸配列をそれぞれ示す。
【図３】図３は、本発明のＮＡＮＢＶ遺伝子ｃＤＮＡお
よび日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）遺伝子がコードする両
蛋白の間の疎水性指標（疎水性／親水性パターン）の比
較を示す。横軸はアミノ酸Ｎｏ．、縦軸は疎水性指標、
白三角は糖鎖結合可能部位、アステリスクはＲＮＡポリ
メラーゼ共通のアミノ酸配列（Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｓ
ｐ）部位、Ｃ、Ｍ、ＥおよびＮＳはそれぞれ、コア蛋
白、マトリックス蛋白、エンベロープ蛋白、および非構
造蛋白を意味する。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｌ 8310−2Ｊ 33/576 Ｚ 8310−2Ｊ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 森 千里 香川県観音寺市八幡町２丁目９番41号 財 団法人阪大微生物病研究会 観音寺研究所 内 (72)発明者 高見沢 昭久 香川県観音寺市八幡町２丁目９番41号 財 団法人阪大微生物病研究会 観音寺研究所 内 (72)発明者 吉田 巌 香川県観音寺市八幡町２丁目９番41号 財 団法人阪大微生物病研究会 観音寺研究所 内

Claims (29)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 図２−１から図２−１６に示す塩基番号
    第１番から第９４１６番の非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスの全
    塩基配列の少なくとも一部を含む第一の塩基配列および
    第一の塩基配列に相補的な塩基配列からなる群から選ば
    れる少なくとも１つの塩基配列を包含するか、または第
    一の塩基配列の少なくとも１つの塩基を遺伝子コドンの
    縮重により置換して得られる少なくとも１つの塩基配列
    を包含する単離されたデオキシリボ核酸。
  2. 【請求項２】 該塩基配列が図２−１から図２−１６に
    示す塩基番号第１番から第９４１６番の非Ａ非Ｂ型肝炎
    ウイルスの全塩基配列の少なくとも６個の塩基を包含す
    ることを特徴とする請求項１に記載のデオキシリボ核
    酸。
  3. 【請求項３】 第一の塩基配列が塩基番号第３３３番か
    ら第４２２番、第３３３番から第６７７番、第３３３番
    から第１４９９番、第３３３番から第６３７１番、第４
    ７４番から第５６３番、第６７８番から第９０５番、第
    ９０６番から第９５３番、第９０６番から第１４９９
    番、第１０２０番から第１０４６番、第１０２０番から
    第１１２１番、第１１９４番から第１２３２番、第１２
    ０９番から第１３２２番、第１５００番から第２５１９
    番、第２５２０番から第３３５０番、第３３５１番から
    第５１７７番、第４４８５番から第４５７４番、第５１
    ７８番から第５９１８番、第５５４４番から第５６３３
    番、第５９１９番から第６３７１番、第６３７２番から
    第９３６２番、および第１番から第９４１６番の塩基配
    列からなる群から選ばれることを特徴とする請求項１に
    記載のデオキシリボ核酸。
  4. 【請求項４】 図２−１から図２−１６に示す非Ａ非Ｂ
    型肝炎ウイルスの全塩基配列の塩基番号第３３３番から
    第９３６２番のコーディング領域からなるデオキシリボ
    核酸によりコードされるアミノ酸配列の少なくとも一部
    からなるアミノ酸配列を含有する単離された抗原ポリペ
    プチド。
  5. 【請求項５】 上記のアミノ酸配列が塩基番号第３３３
    番から第９３６２番の塩基配列の少なくとも１２個の塩
    基の塩基配列によりコードされる少なくとも４個のアミ
    ノ酸のアミノ酸配列を含有することを特徴とする請求項
    ４に記載の抗原ポリペプチド。
  6. 【請求項６】 上記のアミノ酸配列が塩基番号第３３３
    番から第４２２番、第３３３番から第６７７番、第３３
    ３番から第１４９９番、第３３３番から第６３７１番、
    第４７４番から第５６３番、第６７８番から第９０５
    番、第９０６番から第９５３番、第９０６番から第１４
    ９９番、第１０２０番から第１０４６番、第１０２０番
    から第１１２１番、第１１９４番から第１２３２番、第
    １２０９番から第１３２２番、第１５００番から第２５
    １９番、第２５２０番から第３３５０番、第３３５１番
    から第５１７７番、第４４８５番から第４５７４番、第
    ５１７８番から第５９１８番、第５５４４番から第５６
    ３３番、第５９１９番から第６３７１番、第６３７２番
    から第９３６２番、および第３３３番から第９３６２番
    の塩基配列からなる群から選ばれる塩基配列によりコー
    ドされるアミノ酸配列を含有することを特徴とする請求
    項４に記載の抗原ポリペプチド。
  7. 【請求項７】 非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原ポリペプチ
    ドの産生方法にして、（ａ）デオキシリボ核酸をプラス
    ミドおよび動物ウイルス遺伝子から選ばれる複製可能な
    発現ベクターに導入して、該複製可能な発現ベクターが
    プラスミドの場合は該プラスミドとそれに挿入された該
    デオキシリボ核酸を含有する複製可能な組換えＤＮＡを
    得、または該発現ベクターが動物ウイルス遺伝子の場合
    は該動物ウイルス遺伝子とそれに挿入された該デオキシ
    リボ核酸を含有する組換えウイルスを得、 該デオキシリボ核酸は図２−１から図２−１６に示す非
    Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスの全塩基配列の塩基番号第１番か
    ら第１４９９番の領域の少なくとも一部または第１５０
    ０番から第９４１６番の領域の少なくとも一部を含む第
    一の塩基配列および第一の塩基配列の少なくとも１つの
    塩基を遺伝子コドンの縮重により置換して得られる少な
    くとも１つの塩基配列からなる群から選ばれる塩基配列
    を含有しており、（ｂ）ステップ（ａ）で用いた複製可
    能な発現ベクターがプラスミドの場合は、該組換えＤＮ
    Ａを微生物または真核細胞培養物にトランスフェクトし
    て形質転換体を形成し、続いて該形質転換体を微生物あ
    るいは真核細胞培養物の親細胞から選別し、（ｃ）ステ
    ップ（ｂ）で得た該形質転換体を培養して、該デオキシ
    リボ核酸を発現させることにより、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイ
    ルス抗原ペプチドを産生し、またはステップ（ａ）で得
    た該組換ウイルスを培養して該デオキシリボ核酸と該動
    物ウイルス遺伝子を発現させることにより非Ａ非Ｂ型肝
    炎ウイルス抗原ペプチドを動物ウイルスおよびそれと共
    に発現された非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原ペプチドを含
    む増殖組換えウイルスの形で産生し、そして（ｄ）該非
    Ａ非Ｂウイルス抗原ペプチドを単独または該増殖組換え
    ウイルスの形で単離することを包含することを特徴とす
    る産生方法。
  8. 【請求項８】 第一の塩基配列が塩基番号第３３３番か
    ら第９３６２番の塩基配列の少なくとも１２個の塩基を
    含有することを特徴とする請求項７に記載の方法。
  9. 【請求項９】 第一の塩基配列が塩基番号第３３３番か
    ら第４２２番、第３３３番から第６７７番、第３３３番
    から第１４９９番、第４７４番から第５６３番、第６７
    ８番から第９０５番、第９０６番から第９５３番、第９
    ０６番から第１４９９番、第１０２０番から第１０４６
    番、第１０２０番から第１１２１番、第１１９４番から
    第１２３２番、第１２０９番から第１３２２番、第１５
    ００番から第２５１９番、第２５２０番から第３３５０
    番、第３３５１番から第５１７７番、第４４８５番から
    第４５７４番、第５１７８番から第５９１８番、第５５
    ４４番から第５６３３番、第５９１９番から第６３７１
    番、および第６３７２番から第９３６２番の塩基配列か
    らなる群から選ばれることを特徴とする請求項７に記載
    の方法。
  10. 【請求項１０】 プラスミドおよび動物ウイルス遺伝子
    から選ばれる複製可能な発現ベクターとデオキシリボ核
    酸とからなり、該デオキシリボ核酸は図２−１から図２
    −１６に示す非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスの全塩基配列の塩
    基番号第１番から第１４９９番の領域の少なくとも一部
    または第１５００番から第９４１６番の領域の少なくと
    も一部を含む第一の塩基配列および第一の塩基配列の少
    なくとも１つの塩基を遺伝子コドンの縮重により置換し
    て得られる少なくとも１つの塩基配列からなる群から選
    ばれる塩基配列を含有することを特徴とする複製可能な
    組換え体。
  11. 【請求項１１】 該塩基配列が塩基番号第1番から第９
    ４１６番の塩基配列の少なくとも６個の塩基を含有する
    ことを特徴とする請求項１０に記載の複製可能な組換え
    体。
  12. 【請求項１２】 該塩基配列が塩基番号第３３３番から
    第１４９９番の塩基配列の少なくとも１２個の塩基また
    は第１５００番から第９３６２番の塩基配列の少なくと
    も１２個の塩基を含有することを特徴とする請求項１０
    に記載の複製可能な組換え体。
  13. 【請求項１３】 該塩基配列が塩基番号第３３３番から
    第４２２番、第３３３番から第６７７番、第３３３番か
    ら第１４９９番、第４７４番から第５６３番、第６７８
    番から第９０５番、第９０６番から第９５３番、第９０
    ６番から第１４９９番、第１０２０番から第１０４６
    番、第１０２０番から第１１２１番、第１１９４番から
    第１２３２番、第１２０９番から第１３２２番、第１５
    ００番から第２５１９番、第２５２０番から第３３５０
    番、第３３５１番から第５１７７番、第４４８５番から
    第４５７４番、第５１７８番から第５９１８番、第５５
    ４４番から第５６３３番、第５９１９番から第６３７１
    番、および第６３７２番から第９３６２番の塩基配列か
    らなる群から選ばれることを特徴とする請求項１２に記
    載の複製可能な組換え体。
  14. 【請求項１４】 ハイブリダイゼーションまたはポリメ
    ラーゼチェインリアクションによって非Ａ非Ｂ型肝炎を
    検知するための診断剤にして、図２−１から図２−１６
    に示す塩基番号第１番から第９４１６番の非Ａ非Ｂ型肝
    炎ウイルスの全塩基配列の少なくとも一部を含む塩基配
    列および該塩基配列に相補的な塩基配列からなる群から
    選ばれる少なくとも１つの塩基配列を含有する単離され
    たデオキシリボ核酸を、ハイブリダイゼーションまたは
    ポリメラーゼチェインリアクションに十分の量含有する
    ことを特徴とする診断剤。
  15. 【請求項１５】 該塩基配列が図２−１から図２−１６
    に示される塩基番号第１番から第９４１６番の非Ａ非Ｂ
    型肝炎ウイルスの全塩基配列の少なくとも６個の塩基を
    含有することを特徴とする請求項１４に記載の診断剤。
  16. 【請求項１６】 抗原抗体反応によって非Ａ非Ｂ型肝炎
    を検知するための診断剤にして、図２−１から図２−１
    ６に示す非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスの全塩基配列の塩基番
    号第３３３番から第９３６２番のコーディング領域を含
    むデオキシリボ核酸によりコードされるアミノ酸配列の
    少なくとも一部を含有するアミノ酸配列を有する単離さ
    れた抗原ポリペプチドを、抗原抗体反応を呈するに十分
    の量含有することを特徴とする診断剤。
  17. 【請求項１７】 該抗原ポリペプチドが塩基番号第３３
    ３番から第９３６２番の塩基配列の少なくとも１２個の
    塩基の塩基配列によりコードされる少なくとも４個のア
    ミノ酸のアミノ酸配列を含有することを特徴とする請求
    項１６に記載の診断剤。
  18. 【請求項１８】 該抗原ポリペプチドが塩基番号第３３
    ３番から第４２２番、第３３３番から第６７７番、第３
    ３３番から第１４９９番、第３３３番から第６３７１
    番、第４７４番から第５６３番、第６７８番から第９０
    ５番、第９０６番から第９５３番、第９０５番から第１
    ４９９番、第１０２０番から第１０４６番、第１０２０
    番から第１１２１番、第１１９４番から第１２３２番、
    第１２０９番から第１３２２番、第１５００番から第２
    ５１９番、第２５２０番から第３３５９番、第３３５１
    番から第５１７７番、第４４８５番から第４５７４番、
    第５１７８番から第５９１８番、第５５４４番から第５
    ６３３番、第５９１９番から第６３７１番、第６３７２
    番から第９３６２番、および第３３３番から第９３６２
    番の塩基配列からなる群から選ばれる塩基配列によりコ
    ードされるアミノ酸配列を含有することを特徴とする請
    求項１６に記載の診断剤。
  19. 【請求項１９】 図２−１から図２−１６で示される非
    Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスの全塩基配列の塩基番号第３３３
    番から第９３６２番のコーディング領域を含むデオキシ
    リボ核酸によりコードされるアミノ酸配列の少なくとも
    一部を含むアミノ酸配列を含有する単離された抗原ポリ
    ペプチドを免疫原性を奏するのに十分の量含有し、かつ
    少なくとも１つの医薬的に許容される担体、希釈剤また
    は賦形剤を含有することを特徴とする非Ａ非Ｂ型肝炎ワ
    クチン。
  20. 【請求項２０】 該抗原ポリペプチドが塩基番号第３３
    ３番から第９３６２番の塩基配列の少なくとも１２個の
    塩基の塩基配列によりコードされる少なくとも４個のア
    ミノ酸のアミノ酸配列を含有することを特徴とする請求
    項１９に記載のワクチン。
  21. 【請求項２１】 該抗原ポリペプチドが塩基番号第３３
    ３番から第４２２番、第３３３番から第６７７番、第３
    ３３番から第１４９９番、第３３３番から第６３７１
    番、第４７４番から第５６３番、第６７８番から第９０
    ５番、第９０６番から第９５３番、第９０６番から第１
    ４９９番、第１０２０番から第１０４６番、第１０２０
    番から第１１２１番、第１１９４番から第１２３２番、
    第１２０９番から第１３２２番、第１５００番から第２
    ５１９番、第２５２０番から第３３５０番、第３３５１
    番から第５１７７番、第４４８５番から第４５７４番、
    第５１７８番から第５９１８番、第５５４４番から第５
    ６３３番、第５９１９番から第６３７１番、第６３７２
    番から第９３６２番および第３３３番から第９３６２番
    の塩基配列からなる群から選ばれる塩基配列によりコー
    ドされるアミノ酸配列を含有することを特徴とする請求
    項１９に記載のワクチン。
  22. 【請求項２２】 図２−１から図２−１６に示される塩
    基番号第１番から第９４１６番の非Ａ非Ｂ型肝炎ウイル
    ス全塩基配列の少なくとも一部または全領域を鋳型とし
    て用いることにより合成されるＲＮＡ。
  23. 【請求項２３】 非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子ｃＤＮ
    Ａを保有する大腸菌ＢＫ１０８（微工研条寄第２９７１
    号）。
  24. 【請求項２４】 非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子ｃＤＮ
    Ａを保有する大腸菌ＢＫ１２９（微工研条寄第２９７２
    号）。
  25. 【請求項２５】 非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子ｃＤＮ
    Ａを保有する大腸菌ＢＫ１３８（微工研条寄第２９７３
    号）。
  26. 【請求項２６】 非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子ｃＤＮ
    Ａを保有する大腸菌ＢＫ１５３（微工研条寄第２９７４
    号）。
  27. 【請求項２７】 非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子ｃＤＮ
    Ａを保有する大腸菌ＢＫ１５７（微工研条寄第３２４３
    号）。
  28. 【請求項２８】 非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子ｃＤＮ
    Ａを保有する大腸菌ＢＫ１６６（微工研条寄第２９７５
    号）。
  29. 【請求項２９】 非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子ｃＤＮ
    Ａを保有する大腸菌ＢＫ１７２（微工研条寄第２９７６
    号）。
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