JP2002500502A

JP2002500502A - 合成ｃ型肝炎遺伝子

Info

Publication number: JP2002500502A
Application number: JP50172298A
Authority: JP
Inventors: ドネリー，ジヨン・ジエイ; ル，トン―ミン; リウ，マーガレツト・エイ; シーバー，ジヨン・ダブリユー
Original assignee: メルクエンドカンパニーインコーポレーテッド
Priority date: 1996-06-11
Filing date: 1997-06-06
Publication date: 2002-01-08
Also published as: AU3380897A; EP1009763A1; WO1997047358A1; US20030053987A1; AU717542B2; CA2257137A1; US6653125B2; EP1009763A4

Abstract

(57)【要約】本発明は、新規な方法および核酸医薬生成物の処方物、具体的には核酸ワクチン生成物と核酸遺伝子治療生成物の処方物に関する。

Description

【発明の詳細な説明】合成Ｃ型肝炎遺伝子発明の背景本発明は新規な核酸医薬生成物、特に核酸ワクチン生成物に関する。核酸ワクチン生成物は、筋肉細胞に直接に導入されると、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）を特異的に認識する免疫応答を誘導する。Ｃ型肝炎ウイルス非Ａ型、非Ｂ型肝炎（ＮＡＮＢＨ）は、ウイルスにより引き起こされると考えられる伝染可能な病気（または病気のファミリー）であり、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、デルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）またはエプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）等による他の形態のウイルス関連肝臓病とは区別できる。疫学的証拠は、水により運ばれるタイプ、血液または注射針に関連するタイプ、および散発的に起こる（集団獲得）タイプの３種類のＮＡＮＢＨが存在することを示唆する。しかし、病因の数は知られていない。最近、新しいウイルス種であるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）が、血液関連ＮＡＮＢＨ（ＢＢ−ＮＡＮＢＨ）の（唯一でないとしても）主要な原因として同定された。Ｃ型肝炎ウイルスは、米国および日本等の多くの国々において輸血関連肝炎の主要な形であると考えられる。肝細胞癌腫の誘導にＨＣＶが関与しているとの証拠も存在する。よって、ＨＣＶ感染を予防または治療すための効果的な方法に対する要求が存在するが、現在そのような方法は存在しない。ＨＣＶはフラビビリダエに遠縁であろう。フラビウイルスファミリーは、小さなエンベロープに包まれたヒトの病原体である多数のウイルスを含有する。フラビウイルス粒子の形態学と組成は知られており、Ｍ．Ａ．Ｂｒｉｎｔｏｎの「ウイルス：トガビリダエとフラビビリダエ」（Ｆｒａｅｎｋｅｌ−ＣｏｎｒａｔおよびＷａｇｎｅｒ編集のシリーズ、ＳｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒおよびＳｃｈｌｅｎｓｉｎｇｅｒ編集刊、ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ、１９８６年）、３２７−３７４ページに記載されている。通常、形態学に関して、フラビウイルスは脂質二重層により囲まれた中心ヌクレオキャプシドを含有する。ビリオンは球状であり、約４０〜５０ｎｍの直径を有する。それらのコアは直径が約２５〜３０ｎｍである。ビリオンエンベロープの外側表面に沿って、直径が約２ｎｍの末端ノブを有する長さが約５〜１０ｎｍの突起が存在する。そのファミリーの典型的な例として黄熱病ウイルス、西ナイルウイルス、テング熱ウイルスがある。それらウイルスは、ＨＣＶよりも僅かに大きい（＋）鎖ＲＮＡケノム（約１１，０００ヌクレオチド）を有し、約３５００アミノ酸のポリタンパク質前駆体をコードする。個々のウイルスタンパク質はこの前駆体ポリペプチドから切断される。ＨＣＶのゲノムは約１０，０００ヌクレオチドを含有する一本鎖ＲＮＡであるように思われる。そのゲノムは（＋）鎖であり、約３，０００アミノ酸のポリタンパク質をコードする連続性の翻訳開放読み取り枠（ＯＲＦ）を有する。該ＯＲＦにおいて、構造タンパク質はＮ末端領域の最初のおよそ１／４にコードされ、ポリタンパク質の大部分は非構造タンパク質に帰されると思われる。すべての公知のウイルス配列と比較してみると、小さいが顕著な共線状的な相同性が、フラビウイルスファミリーの非構造タンパク質とペストウイルス（これは現在フラビウイルスファミリーの一部であるとも思われる）とに観察される。ポリヌクレオチド構築物、すなわちタンパク質をコードするＤＮＡプラスミドの筋内接種は、筋肉細胞における該タンパク質のその場での生成をもたらすことが示された。ウイルスタンパク質をコードするｃＤＮＡプラスミドを用いることにより、抗体応答とＣＴＬ応答の両方が作られて、その後の誘発に対する同種および異種保護に同種または交差株保護をそれぞれ提供する。免疫応答のこれらの各タイプは公知のワクチン接種法よりも潜在的な利点を提供する。抗体を作るためのＰＮＶ（ポリヌクレオチドワクチン）の利用は、増大した抗体応答時間、ならびにウイルスの臨床的に蔓延する株の正確な配列ならびに（組換えタンパク質に対する）在来タンパク質の適当な翻訳後修飾および立体配置をともに有することのできる抗原の提供をもたらすだろう。この手段によるＣＴＬ応答の発生は、生きている潜在的に病原性のあるベクターまたは弱毒化ウイルスを使用することなく交差株保護の利点を提供する。したがって、本発明は核酸を生きている組織に導入してタンパク質の発現を誘導する方法を意図する。本発明は、ウイルスタンパク質を抗原プロセシング経路に導入して、ＣＴＬ等のしかしこれに限定されないウイルス特異的応答を発生させる方法を提供する。このように、ウイルス病原体に対する所望の予防的免疫応答を誘導することのできる特異的な治療剤に対する要求は、ＨＣＶウイルスについて本発明により満たされる。この治療アプローチにおいて特に重要なのは、抗原遺伝子が得られた株に異種であるウイルス株の感染でさえ予防できるＴ細胞免疫応答を誘導する能力である。したがって、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスコア、エンベロープ（Ｅ１）のウイルスタンパク質をコードするＤＮＡ構築物、非構造（ＮＳ５）遺伝子、またはＣＴＬ等の、しかしこれに限定されない特異的免疫応答を発生する産物をコードする他のＨＣＶ遺伝子を提供する。ＤＮＡワクチンＢｅｎｖｅｎｉｓｔｙ，Ｎ．およびＲｅｓｈｅｆ，Ｌ．［ＰＮＡＳ８３，９５５１−９５５５（１９８６）］は、マウスに腹腔内（ｉ．ｐ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）または筋肉内（ｉ．ｍ．）に導入されたＣａＣｌ₂析出ＤＮＡが発現できることを示した。ＣａＣｌ₂処理されなかったＤＮＡ発現ベクターのマウスへのｉ．ｍ．注入は、筋肉細胞によるＤＮＡの取込みおよびＤＮＡによりコードされたタンパク質の発現をもたらした。プラスミドはエピソームに保持されて複製しなかった。その後、持続する発現が、ラット、魚および霊長類の骨格筋およびラットの心筋におけるｉ．ｍ．注入後に観察された。治療剤として核酸を用いる技術は、ポリヌクレオチドを用いて脊椎動物を予防接種したＷＯ９０／１１０９２（１９９０年１０月４日）で報告された。免疫化が筋肉内でなければならないことは本方法の成功に必ずしも必要ではない。ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）をコードするＤＮＡで被覆された金マイクロ注入粒子のマウス皮膚への導入は、該マウスにおける抗ＢＧＨ抗体の産生をもたらした。ジェットインジェクターは、生きてきる動物の皮膚、筋肉、脂肪、および乳組織への移入のために用いられてきた。核酸を導入するための多様な方法が再検討されてきた。クローン化導入遺伝子の系統的発現をもたらすために、ＤＮＡ：陽イオン性リポソーム複合体のマウスへの静脈内注入がＺｈｕら［Ｓｃｉｅｎｃｅ２６１：２０９−９１１（１９９３年７月９日）によって示された。Ｕｌｍｅｒら［Ｓｃｉｅｎｃｅ２５９：１７４５−１７４９（１９９３）］は、インフルエンザウイルスタンパク質をコードするＤＮＡの筋肉内注入によるインフルエンザウイルス感染に対する異種（非相同）保護について報告した。病原体および腫瘍抗原に対する所望の免疫応答を引き出すことのできる特定の治療剤および予防剤に対する要求は本発明により満たされる。この治療アプローチにおいて特に重要なのは、抗原遺伝子が得られた株に非相同であるウイルス株により引き起こされた感染または病気でさえ予防できるＴ細胞免疫応答を誘導する能力である。このことがＨＩＶを扱うのに特に関心の対象となり、なぜならばこのウイルスは迅速に変異すると認められており、多くの毒性の単離物が同定されてきたからである［例えば、２４５の別個のＨＩＶ単離物を同定しているＬａＲｏｓａらのＳｃｉｅｎｃｅ２４９：９３２−９３５（１９９０）を参照されたい］。この認識された多様性に応じて、研究者らはペプチド免疫化に基づきＣＴＬを作ることを試みた。例えば、ＴａｋａｈａｓｈｉらはＨＩＶエンベロープ（ｇｐ１６０）決定基を認識する広く交差反応性のある細胞毒性Ｔ細胞の誘導について報告した［Ｓｃｉｅｎｃｅ２５５：３３３−３３６（１９９２）］。しかし、これらの研究者らは、真に交差反応性のあるＣＴＬ応答を得ることの困難性を認識し、非常に厳密（ストリンジェント）であるＴ細胞のプライミングまたは再刺激と、既に刺激されたＣＴＬからの、細胞毒性等を含めたエフェクター機能の誘引との対立が存在することを示唆した。Ｗａｎｇらは、クローン化ゲノム（スプライスされていない）ＨＩＶ遺伝子の筋内接種によりＨＩＶに対するマウスの免疫応答誘引について報告した。しかし、これらの研究で得られた免疫応答レベルは非常に低かった。さらに、ＷａｎｇらのＤＮＡ構築物は、連続性Ｔａｔ／ＲＥＶ−ｇｐ１６０−Ｔａｔ／ＲＥＶコード配列をコードするの基本的ゲノム片を利用した。以下に詳細に説明されるように、これはｇｐ１６０の高レベル発現を得るために次善のシステムである。Ｔａｔの発現はＫａｒｐｏｓｉの肉腫の進行に寄与するので、それは潜在的に危険である。ＷＯ９３／１７７０６はウイルスに対して動物を予防接種する方法を記載し、該方法において担体粒子が遺伝子構築物によって被覆され、被覆粒子は動物の細胞中に導入される。本発明はタンパク質の発現を誘導するためにポリヌクレオチドを生きている組織に導入するいかなる公知の方法も意図する。しかし、本発明は、特異的なＣＴＬと抗体を効果的に作るためにタンパク質を抗原プロセシング経路に導入するための新規な免疫原を提供する。コドン利用とコドンコンテキスト生物のコドン対はかなり非ランダムであり、生物ごとに異なる。この情報は、所望のレベルの翻訳効率を有する改変遺伝子または合成遺伝子を構築、発現し、ゲノム中のどの領域がタンパク質のコード領域であるかを決定し、翻訳中断部位を非相同遺伝子に導入し、ヌクレオチド配列の関係または先祖の起源を確かめるために用いられる。形質転換生物中での外来非相同遺伝子の発現は現在慣用である。例えば、ネズミおよびヒト遺伝子等の多くの哺乳動物遺伝子を単一細胞生物中へ挿入することに成功してきた。この点についての標準的な方法は、発現すべき外来遺伝子のプラスミドまたはファージ等のベクターへの導入、および該遺伝子を生物に挿入するための該ベクターの利用が挙げられる。そのような遺伝子の在来プロモーターは、通常、該遺伝子が挿入される宿主に対して適合性のある強力なプロモーターによって置き換えられる。タンパク質配列決定装置は在来タンパク質のごく僅かな量でさえそのアミノ酸配列の解明を可能にする。これらのアミノ酸配列から、これらのタンパク質をコードするＤＮＡ配列が類推できる。ＤＮＡ合成は急速に発展している技術でもあり、これらの類推ＤＮＡ配列に対応する合成遺伝子は容易に構築することができる。発現システムと組換えＤＮＡの急速に発展する知識にもかかわらず、生物中で外来または合成遺伝子を発現することを試みるときに顕著な障害が依然として存在する。例えば、多くの在来で活性のあるタンパク質が外来宿主で発現された場合に起こる場合とは異なってグリコシル化される。この理由から、酵母等の真核宿主が多くの哺乳動物遺伝子を発現するためには細菌宿主よりも好ましいであろう。グリコシル化の問題は継続する研究の主題である。もう一つの問題はさらに十分に理解されていない。強力なプロモーターと連結された場合でさえ、合成遺伝子の翻訳はしばしば予想されるよりもさらに不十分に進行する。同じことが、発現生物に対して外来である外来性遺伝子にもしばしば当てはまる。翻訳産物の回収可能な量が作られる十分に効率的な方法で遺伝子が転写されるときでさえ、タンパク質はしばしば活性がなく、さもなければ在来タンパク質の性質とは異なる。後者の問題は、通常は多様な生物でのタンパク質折りたたみでの違いによるものと思われる。この問題に対する解決は難しく、タンパク質折りたたみを調節する機構は十分に理解されていない。翻訳効率に関連した問題はコドンコンテキスト効果に関連すると考えられる。すべての動物においてタンパク質をコードする遺伝子領域は多様な機能的制限を受け、その一部は適切に機能するタンパク質をコードするための要件、ならびに適当な翻訳開始および終止シグナルに依存する。しかし、これらの制限に関して理解するのには容易でないタンパク質コード領域のいくつかの特徴が認識されてきた。そうした特徴の二つの重要な部類はコドン利用とコドンコンテキストを伴うものである。コドン利用は高度に偏らされ、異なる生物間で顕著に異なることが知られている。コドン利用パターンはｔＲＮＡイソアクセプターの比較的豊富さに関連性のあることが示されている。豊富さの低いタンパク質に対する豊富さの高いタンパク質をコードする遺伝子はそれらのコドン選択において違いを示す。コドン利用の偏りがペプチドの伸長速度を変更する可能性は広く議論されてきた。コドン使用の違いが翻訳速度の違いに関連している一方で、コドン選択の翻訳に対する直接の効果は示すことが困難であった。コドン利用パターンに対する他の提案された制限は翻訳の忠実さを最大化し、タンパク質合成の動力学的効率を最適化することを含む。コドンの非ランダム使用とは別に、コドン／アンチコドン認識はコドン自体の外側の配列により影響される「コドンコンテキスト」と呼ばれる現象のかなりの証拠が蓄積されている。非センスコドンならびにミスセンスコドンの抑制効率に対する近くのヌクレオチドの強い影響が存在する。明らかに、天然の細菌集団におけるサプレッサー活性の豊富さ、ならびにセレノシステインとホスホセリンをコードする「終止」コドンの利用は、終止が文脈（コンテキスト）に依存することを必要とする。類似のコンテキスト効果は、翻訳の忠実さ、ならびに翻訳開始の効率に影響を与えることが示されている。大隅菌のタンパク質のコード領域の統計学的な分析は、「コドンコンテキスト」のもう一つの出現を示している。特定コドンのある位置での存在は隣接するコドン中のあるヌクレオチドの存在頻度に強く影響を与え、これらのコンテキスト制限は、低いレベルと高いレベルで発現された遺伝子について顕著に異なる。コンテキスト効果は認識されてきたが、コドンに隣接する好ましいヌクレオチドに関する統計学的規則の予想値は比較的低い。このことは、所望のレベルの翻訳効率を達成するためにコドンを選択するためのヌクレオチド選択データの利用性を限定している。自動化ヌクレオチド配列決定装置の出現は多様な生物に関する大量の配列データを利用可能とした。これらのデータを理解することは実質的な困難性を示す。例えば、遺伝子配列データをタンパク質配列に関連させるために、ゲノムのコード領域を同定することは重要である。さらに、ある種の生物のゲノムの祖先は実質的な興味がある。一部の生物のゲノムは混合した祖先を有することが知られている。起源がウイルスである一部の配列は現在真核生物のゲノム中に安定に導入されている。ウイルス配列それ自体がもう一つの実質的に関係のない種から生じていることもある。遺伝子の祖先の理解は関連遺伝子と、他の生物中のそれらの翻訳産物との間の適当な類比を引き出すために重要となりうる。翻訳に対するコドンコンテキスト影響の良好な理解に対する要求と所望の翻訳効果のために適当なコドンを決定するための方法に対する要求が存在する。ヌクレオチド配列データからゲノムのコード領域を同定する方法に対する要求も存在する。タンパク質折りたたみを調節する方法、および外来遺伝子が宿主中で発現される場合に外来遺伝子が適切に折りたたまれることを確実とする方法に対する要求も存在する。所望の翻訳効率に準じて改変されるか、構築された遺伝子は顕著な価値を有するだろう。工業的および薬学的関心を有するタンパク質の微生物による発現のための組換えＤＮＡ技術実施のもう一つの特徴は「コドン選択」の現象である。遺伝子発現のための存在する機械である遺伝子形質転換された宿主が「作用して」所与の所望の産物を構築することが以前に示された一方で、微生物中で達成された発現レベルは、挿入された外来性遺伝子に存在するアミノ酸特定遺伝子コードの特定の変化形態に部分的に依存しながら多様な変化を受けうる。４種類の可能なヌクレオチド塩基の「三重」コドンは６４の多様な形で存在することができる。これらの形がわずかに２０種類の異なるアミノ酸（ならびに転写開始および終止）のためにそのメッセージを提供することは、一部のアミノ酸が２種類以上のコドンによりコードされうることを意味する。実際、あるアミノ酸は６種類もの多くの「余分」の代用コドンを有している一方で、他の一部のアミノ酸は単一の必要コドンを有している。完全に理解されたわけではないが、その理由は、代用コドンは異なる種類の細胞の内因性ＤＮＡ中に均一に存在するわけではなく、ある種の細胞中にあるコドンに対する「選択性」、すなわち可変性の自然な階層が存在するためと思われる。一つの具体例として、アミノ酸のロイシンは、ＣＴＡ、ＣＴＣ、ＣＴＧ、ＣＴＴ、ＴＴＡおよびＴＴＧ（それぞれＣＵＡ、ＧＵＣ、ＣＵＧ、ＣＵＵ、ＵＵＡおよびＵＵＧのｍＲＮＡコドンに対応する）の６種類のＤＮＡコドンのいずれかにより特定される。微生物に関するゲノムコドン頻度の網羅的な分析は、大腸菌の内因性ＤＮＡがＣＴＧのロイシンを特定するコドンを最も共通して含有する一方で、酵母および軟泥カビのＤＮＡはＴＴＡのロイシンを特定するコドンを最も共通して含有することを明らかにした。この階層に鑑みて、大腸菌宿主によりロイシンに富むポリペプチドの高いレベルを得る可能性はコドン利用の頻度にある程度依存すると一般的に考えられる。例えば、ＴＴＡコドンに富む遺伝子がおそらく大腸菌で低度に発現され、一方、ＣＴＧに富む遺伝子はおそらくポリペプチドを高く発現するだろう。同様に、酵母細胞がロイシンに富むポリペプチドの発現のための計画された形質転換宿主細胞である場合に、挿入されたＤＮＡでの使用に好適なコドンはＴＴＡであろう。コドン選択現象の組換えＤＮＡ技術に対する影響は顕著であり、その現象は、成功して形質転換された生物中での外来性遺伝子の高レベル発現を達成する多くの以前の失敗を説明するのに役立つだろう−より「好ましく」ないコドンが挿入された遺伝子に繰り返して存在しているかもしれず、発現のための宿主細胞機械は効率的に作用しないかもしれない。この現象は、計画された宿主細胞の好ましいコドンを含有するように設計された合成遺伝子は、組換えＤＮＡ技術の実施のために外来遺伝子材料の好適な形態を提供することを示唆する。タンパク質トラフィッキング真核細胞の特徴を表す機能の多様性は、それらの膜境界の構造的分化に依存する。これらの構造を作り維持するために、タンパク質は小胞体中のそれらの合成部位から細胞全体にわたる一定の目的地まで運ばれなければならない。これは、トラフィッキングタンパク質は、主要トラフィッキング経路へのアクセスポイントに位置するルート選択に責任のある分子的装置により認識される選別シグナルを示すことを必要とする。ほとんどのタンパク質は最終的目的地（それらがそれらの機能をなす細胞位置）がそれらの永久的な所在地となるので、それらの生合成経路を経るにしたがって、それらの選別決定はわすかに一回なされる必要がある。細胞内統一性の保持は、タンパク質の選択的な選別およびそれらの正しい目的地までの正確な輸送に部分的に依存する。過去数年にわたって、タンパタ質の標的化と局在化の分子的装置の詳細な分析が活発に研究されてきた。定義された配列モチーフは「アドレス標識」として働くことのできるタンパク質について同定されてきた。多くの選別シグナルは膜タンパク質の細胞質ドメインに会合していることがわかった。発明の概要本発明は核酸医薬生成物の新規な処方物、特に核酸ワクチン生成物に関する。核酸生成物は、筋肉細胞に直接に導入されると、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）を特異的に認識する免疫応答の産出を誘導する。図面の簡単な説明図１は、Ｖ１Ｒａベクターのヌクレオチド配列を示す。図２は、Ｖ１Ｒａベクターの図である。図３は、Ｖｔｐａベクターの図である。図４は、ＶＵｂベクターである。図５は、ＨＣＶコア抗原の最適化配列を示す。図６は、Ｖ１Ｒａ．ＨＣＶ１コアＰＡｂ、Ｖｔｐａ．ＨＣＶ１コアＰＡｂおよびＶＵｂ．ＨＣＶ１コアＰＡｂを示す。図７は、Ｃ型肝炎ウイルスコア抗原配列を示す。図８は、ヒトタンパク質のコード配列におけるコドン利用を示す（Ｌａｔｈｅらより）。図９は、ＨＣＶＥ１タンパク質の最適化配列を示す。図１０は、ＨＣＶＥ２タンパタ質の最適化配列を示す。図１１は、ＨＣＶＥ１＋Ｅ２タンパク質の最適化配列を示す。図１２は、ＨＣＶＮＳ５ａタンパク質の最適化配列を示す。図１３は、ＨＣＶＮＳ５ｂタンパク質の最適化配列を示す。発明の詳細な説明本発明は核酸医薬生成物の新規な処方物、特に核酸ワクチン生成物に関する。核酸ワクチン生成物は、筋肉細胞に直接に導入されると、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）を特異的に認識する免疫応答の産出を誘導する。非Ａ型、非Ｂ型肝炎（ＮＡＮＢＨ）は、ウイルスにより引き起こされると考えられる伝染可能な病気（または病気のファミリー）であり、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、デルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）またはエプスタイン・バールウイルス(ＥＢＶ)等の他の形態のウイルス関連肝臓病とは区別できる。疫学的証拠は、水により運ばれるタイプ、血液または注射針に関連するタイプ、および散発的に起こる（集団獲得）タイプの３種類のＮＡＮＢＨが存在することを示唆する。しかし、病因の数は知られていない。最近、新しいウイルス種であるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）が、血液関連ＮＡＮＢＨ（ＢＢ−ＮＡＮＢＨ）の（唯一でないとしても）主要な原因として同定された。Ｃ型肝炎ウイルスは、米国および日本等の多くの国において輸血関連肝炎の主要な形であると考えられる。肝細胞癌腫の誘導にＨＣＶが関与しているとの証拠も存在する。よって、ＨＣＶ感染を予防または治療すための効果的な方法に対する要求が存在するが、現在そのような方法は存在しない。ＨＣＶはフラビビリダエに遠縁であろう。フラビウイルスファミリーは、小さなエンベロープに包まれたヒトの病原体である多数のウイルスを含有する。フラビウイルス粒子の形態学と組成は知られており、Ｍ.Ａ.Ｂｒｉｎｔｏｎの「ウイルス：トガビリダエとフラビビリダエ」（Ｆｒａｅｎｋｅｌ−ＣｏｎｒａｔおよびＷａｇｎｅｒ編集のシリーズ、ＳｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒおよびＳｃｈｌｅｎｓｉｎｇｅｒ編集刊、ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ、１９８６年）、３２７−３７４ページに記載されている。通常、形態学に関して、フラビウイルスは脂質二重層により囲まれた中心ヌクレオキャプシドを含有する。ビリオンは球状であり、約４０〜５０ｎｍの直径を有する。それらのコアは直径が約２５〜３０ｎｍである。ビリオンエンベロープの外側表面に沿って、直径が約２ｎｍの末端ノブを有する長さが約５〜１０ｎｍの突起が存在する。そのファミリーの典型的な例として黄熱病ウイルス、西ナイルウイルス、テング熱ウイルスがある。それらウイルスは、ＨＣＶよりも僅かに大きい（＋）鎖ＲＮＡゲノム（約１１，０００ヌクレオチド）を有し、約３５００アミノ酸のポリタンパク質前駆体をコードする。個々のウイルスタンパク質はこの前駆体ポリペプチドから切断される。ＨＣＶのゲノムは約１０，０００ヌクレオチドを含有する一本鎖ＲＮＡであるように思われる。そのゲノムは（＋）鎖であり、約３，０００アミノ酸のポリタンパク質をコードする連続性の翻訳開放読み取り枠（ＯＲＦ）を有する。該ＯＲＦにおいて、構造タンパク質はＮ末端領域の最初のおよそ１／４にコードされ、ポリタンパク質の大部分は非構造タンパク質に帰されると思われる。すべての公知のウイルス配列と比較してみると、小さいが顕著な共線的な相同性が、フラビウイルスファミリーの非構造タンパク質とペストウイルス（これは現在フラビウイルスファミリーの一部であるとも思われる）とに観察される。ポリヌクレオチド構築物、すなわちタンパタ質をコードするＤＮＡプラスミドの筋内接種は、筋肉細胞における該タンパク質のその場での生成をもたらすことが示された。ウイルスタンパク質をコードするｃＤＮＡプラスミドを用いることにより、抗体応答とＣＴＬ応答の両方が作られて、その後の誘発に対する相同的および非相同的保護に相同的または交差株保護をそれぞれ提供する。免疫応答のこれらの各タイプは存在するワクチン接種法よりも潜在的な利点を提供する。抗体を作るためのＰＮＶ（ポリヌクレオチドワクチン）の利用は、抗体応答時間の増加、ならびにウイルスの臨床的に蔓延する株の正確な配列ならびに（組換えタンパク質に対する）在来タンパク質の適当な翻訳後修飾および立体配置をともに有することのできる抗原の提供をもたらすだろう。この手段によるＣＴＬ応答の発生は、生きている潜在的に病原性のあるベクターまたは弱毒化ウイルスを使用することなく交差株保護の利点を提供する。ＤＮＡ構築物を調製し、精製するための分子生物学の標準的な技術は本発明のＤＮＡ治療剤の調製を可能とする。したがって、分子生物学の標準的な技術は本発明生成物の生産に十分である一方で、ここに開示された特定の構築物は、標準的な不活化全ウイルスまたはサブユニットタンパク質ワクチンでこれまでに達成されうる結果である交差株保護を意外にも生み出す新規な治療法を提供する。ワクチン受容者に導入される発現可能なＤＮＡの量はＤＮＡ構築物に用いられる転写および翻訳プロモーターの強さおよび発現された遺伝子産物の免疫原性に依存するであろう。一般的に、約１μｇ〜１ｍｇ、好ましくは約１０μｇ〜３００μｇの免疫的または予防的な効果のある投与量が筋肉組織に直接投与される。皮下注入、経皮導入、皮膚を経る押印、および他の態様の投与、例えば腹腔内、静脈内または呼吸輸送も意図される。追加免疫ワクチン接種の提供も意図される。ＤＮＡは、裸、つまり、受容者の免系系に影響を与えるタンパク質、補助剤および他の試薬に会合していなくてもよい。この場合、ＤＮＡは、滅菌塩水または滅菌緩衝性塩溶液等の、しかしこれらに限定されない生理学的に許容される溶液中に存在することが望ましい。もしくは、ＤＮＡは界面活性剤、リポソーム、例えばレシチンリポソームまたは当分野で公知の他のリポソームに、ＤＮＡ−リポソーム混合物として会合させてもよく（例えば、ＷＯ９３／２４６４０を参照）、またはＤＮＡは、免疫応答を上昇させるために当分野で公知の補助剤、例えばタンパク質または他の担体と会合させてもよい。ＤＮＡの細胞取込みを援助するカルシウムイオン、界面活性剤、ウイルスタンパク質および他のトランスフェクション促進化剤等の、しかしこれらに限定されない薬剤も有利に用いられよう。これらの薬剤はトランスフェクション促進化剤および薬学的に許容される担体として一般に称される。ここに用いられる遺伝子との用語は個別のポリペプチドをコードする核酸セグメントを意味する。医薬およびワクチンとの用語は免疫応答を誘導するために有用な組成物を示すために交換可能に用いられる。構築物およびプラスミドとの用語は交換可能に用いられる。ベクターとの用語は、本発明の方法による使用のために遺伝子をクローン化できるＤＮＡを意味する。以下の実施例は本発明を実施例の具体例に限定することなく本発明をさらに説明するために提供されるものである。実施例１Ｖ１Ｊ発現ベクター：Ｖ１Ｊは、ベクターＶ１と市販プラスミドであるベクターｐＵＣ１８に由来する。Ｖ１はＳｓｐＩとＥｃｏＲＩ制限酵素で消化されて、２断片のＤＮＡを作る。これらの断片の小さい方は非相同遺伝子の発現を調節するＣＭＶｉｎｔＡプロモーターとウシ生長ホルモン（ＢＧＨ）転写終止要素を有し、アガロース電気泳動ゲルから精製した。次に、このＤＮＡ断片の末端を、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ酵素を用いて「平滑」にして、もう一つの「平滑末端化」ＤＮＡ断片への連結を容易した。発現ベクターの「骨格」を提供するためにｐＵＣ１８を選択した。配列と機能により良く特性付けられ、最小サイズを有する高収率のプラスミドを作ることは知られている。我々の目的のために不必要で、プラスミド収率および非相同遺伝子発現に対して有害でもある全ｌａｃオペロンをＨａｅＩＩ制限酵素による部分消化によりこのベタターから除去した。残りのプラスミドをアガロースゲル電気泳動から精製し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化し、ウシ腸アルカリホスファターゼで処理し、上記のＣＭＶｉｎｔＡ／ＢＧＨ要素に連結した。ｐＵＣ骨格内のプロモーター要素の有り得る２方向のいずれかの方向を示すプラスミドが得られた。これらのプラスミドの一つは大腸菌内でさらに高収率のＤＮＡを与え、Ｖ１Ｊと命名された。このベクターの構造は連結領域の配列分析により証明され、次に、Ｖ１と比べて匹敵するか、またはそれよりも高い非相同遺伝子の発現を与えることが示された。アンピシリン耐性マーカーをネオマイシン耐性マーカーに置換してベクターＶ１Ｊｎｅｏを作った。ＳｆｉＩ部位をＶ１Ｊｎｅｏに付加して組込み研究を容易にした。市販の１３塩基対ＳｆｉＩリンカー（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ）をベクターのＢＧＨ配列内のＫｐｎＩ部位に付加した。Ｖ１ＪｎｅｏをＫｐｎＩで直鎖として、ゲルで精製し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑とし、平滑化ＳｆｉＩリンカーに連結した。クローン単離物を制限地図作成により選択し、リンカーを用いる配列決定により証明した。この新しいベクターはＶ１Ｊｎｓと命名された。（ＳｆｉＩを有する）Ｖ１Ｊｎｓ中の非相同遺伝子の発現は（ＫｐｎＩを有する）Ｖ１Ｊｎｅｏ中の同じ遺伝子の発現に匹敵した。ベクターＶ１Ｒａ（配列を図１に示す；地図を図２に示す）はＶ１Ｊｎｓベクターの誘導体であるベクターＶ１Ｒ由来であった。多クローニング部位（ＢｇｌＩＩＩ、ＫｐｎＩ、ＥｃｏＲＶ、ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ、およびＮｏｔＩ）をＶ１Ｒに導入してＶ１Ｒａベクターを作ってサブクローニングの便利さを向上させた。ｔｐａリーダー配列およびユビキチン配列を含有するＶ１Ｒａベクター誘導体を作った（それぞれＶｔｐａ（図３）およびＶｕｂ（図４））。Ｖｔｐａベクターからのウイルス抗原の発現はエキソサイトーシス経路中への抗原タンパク質を標的として、分泌可能な形の抗原タンパク質を作る。これらの分泌されたタンパク質は専門の抗原提示細胞、例えばマクロファージおよび樹木状細胞により捕捉されて、クラスＩＩ分子により処理、提示されてＣＤ４＋Ｔｈ細胞を活性化するだろう。さらに、それらは抗体応答を効率的に促進するであろう。ＶＵｂベクターによるウイルス抗原の発現はユビキチンと抗原との融合タンパク質を作るだろう。非切断性のユビキチンセグメント（切断部位でのグリシン〜アラニン変更、Ｂｕｔｔら、ＪＢＣ２６３：１６３６４，１９８８）が、迅速な分解のためにユビキチン関連プロテアソームに対するウイルス抗原を標的にするだろう。得られたペプチドフラグメントはクラスＩ分子による抗原提示のためにＥＲ中に輸送されよう。この修飾は、ウイルス抗原に対するクラスＩ分子制限ＣＴＬ応答を向上させるために試みられている（Ｔｏｗｎｓｅｎｄら、ＪＥＭ１６８：１２１１，１９８８）。実施例２合成遺伝子の設計と構築Ａ．ＨＣＶ遺伝子発現のための合成遺伝子セグメントの設計：遺伝子セグメントは、（示された場所を除いて）同一の翻訳配列を有する配列であるが、「アミノ酸配列データから予想される合成オリゴヌクレオチドプローブ：理論的および実用的考察」と題されるＪ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．Ｖｏｌ．１８１，ｐｐ．１−１２（１９８５）の研究論文でＲ．Ｌａｔｈｅにより定義された代用のコドン利用を有する配列に変換された。以下に記載の方法は、哺乳動物細胞中で効率的に遺伝子を発現できないのは全体の転写物組成の結果であるという我々の仮説に基づいた。例えば、同じタンパク質の配列をコードする代用コドンを用いることはＨＣＶ遺伝子発現に対する制限を取り除くであろう。ＨＣＶゲノム内のコドン利用の調査は、高度に発現されたヒト遺伝子によりまれに用いられているもののなかに高い比率のコドンが存在することを明らかにした。使用される具体的なコドン置換方法はＬａｔｈｅらのデータを用いて以下のように記載されよう：１．適当な開放読み取り枠のためにコドン置換を同定する。２．ヒト遺伝子による使用の観察された頻度に関して野生型コドンと比較する（Ｌａｔｈらの表３を参照されたい）。３．コドンが最も普通に用いられない場合、それを表５のデータに基づく高い発現のための最適コドンに置き換える。４．新しいコドンの第３ヌクレオチド、および第１の３’−のすぐに隣接するコドンの第１ヌクレオチドを調べる。５’−ＣＧ−３’対が新しいコドン選択により作られた場合、それを表５に示された選択と置き換える。５．全遺伝子セグメントが置換されるまでこの操作を繰り返す。６．これらのコドン置換により作られる所望でない配列（例えば、「ＡＴＴＴＡ」配列、イントロンスプライス認識部位の不注意な作製、必要とされない制限酵素部位等）に関して新しい配列を調べ、これらの配列を除去するコドンで置換する。７．合成遺伝子セグメントを組み立てて向上した発現を調べる。Ｂ．ＨＣＶコア抗原配列ＨＣＶのコンセンサスコア配列をＢｕｋｈら(ＰＮＡＳ，９１：８２３９，１９９４)により報告された一般化コア配列から採用した。この核配列はヒトおよびマウスの両方におけるすべての同定されたＣＴＬエピトームを含有する。この遺伝子は５７３ヌクレオチドからなり、１９１アミノ酸をコードする。予想される分子量は約２３ｋＤａである。ＤＮＡワクチンの翻訳効率を最大化するために、コドン置換を行って、トランスフェクトされた哺乳動物細胞中でＨＣＶコアタンパク質の発現を妨げる可能性のあるコドンを除去する。２３．２％のヌクレオチド配列（５７３ヌクレオチド中１３３ヌクレオチド）が変更されて、コア抗原配列中で６１．３％のコドン（１９１コドン中１１７コドン）変化が得られた。ＨＣＶ核の最適化ヌクレオチド配列を図５に示す。Ｃ．合成コア遺伝子の構築最適化ＨＣＶコア遺伝子（図５）が、多合成オリゴヌクレオチドからアニールされた合成遺伝子として構築された。細胞培養物中での合成遺伝子の発現およびマウスでのその免疫原性の同定と評価を容易にするために、インフルエンザウイルス核タンパク質残基３６６〜３７４に由来するＣＴＬエピトープおよびＳＶ４０Ｔ抗原残基６８４〜６９８に由来する抗体エピトープ配列がコア配列のカルボキシル末端に付加された（図６）。臨床的な使用のために、核タンパク質３６６〜３７４およびＳＶ４０Ｔ６８４〜６９８配列を持たないコア配列を発現させるのが望ましいだろう。この理由から、２種類のエピトープ配列を、この配列断片を後に切断するために用いられる２個所のＥｃｏＲＩ部位に隣接させる。例えば、臨床的な利用のための本発明の実施態様は、ＥｃｏＲＩで切断され、アニールされ、連結されてプラスミドＶ１Ｒａ．ＨＣＶ１コア、Ｖｔｐａ．ＨＣＶ１コアおよびＶＵｂ．ＨＣＶ１コアを生じるＶ１Ｒａ．ＨＣＶ１コアＰＡｂ、Ｖｔｐａ．ＨＣＶ１コアＰＡｂ、またはＶＵｂ．ＨＣＶ１コアＰＡｂプラスミドからなってもよい。合成遺伝子は３ベクター中の３つの別々のセグメント、すなわちＶ１Ｒａ中のヌクレオチド１〜８０、ｐＵＣ１８中のヌクレオチド８０〜３４７（ＢＳｔＸＩ部位）、およびヌクレオチド３４７〜５７３、およびそれに加えてｐＵＣ１８中の二つのエピトープ配列として構築された。すべてのセグメントはＤＮＡ配列決定により証明され、Ｖ１Ｒａベクター中で結合された。Ｄ．ＨＣＶ遺伝子発現構築物：各々の場合において、クローン化遺伝子中への５’プロモーター領域（ＣＭＶｉｎｔＡ）からの結合配列を示す。結合が起こる位置は、配列中の不連続性を示さない“／”により示される。これらの構築物の命名は「ベクター名称−ＨＣＶ株−遺伝子」の約束に従う。Ｖ１Ｒａ．ＨＣＶ１．コアＰＡｂ −−−ＩｎｔＡ−−−ＡＧＡＴＣＴＡＣＣ／ＡＴＧＡＧＣ−−−ＨＣＶ．コア．−−ＧＣＣ／ＧＡＡＴＴＣＧＣＴＴＣＣ−−ＰＡｂ配列−−ＴＡＡ／ＡＣＣＣＧＧＧＡＡＴＴＣＴＡＡＡ／ＧＴＣＧＡＣ−−ＢＧＨ− − Ｖｔｐａ．ＨＣＶ１．コアＰＡｂ −−−ＩｎｔＡ−−ＡＴＣＡＣＣ／ＡＴＧＧＡＴ−−ｔｐａリーダー−−ＧＡＧＡＴＣ−ＴＴＣ／ＡＴＧＡＧＣ−−ＨＣＶ．コア．−− ＧＣＣ／ＧＡＡＴＴＣＧＣＴＴＣＣ−ＰＡｂ配列−−ＴＡＡ／ＡＣＣＣＧＧＧＡＡＴＴＣＴＡＡＡ／ＧＴＣＧＡＣ−−ＢＧＨ−− ＶＵｂ．ＨＣＶ１．コアＰＡｂ −−−ＩｎｔＡ−−ＡＧＡＴＣＣＡＣＣ／ＡＴＧＣＡＧ −−ユビキチン −−ＧＧＴＧＣＡＧＡＴＣＴＧ／ＡＴＧＡＧＣ−−ＨＣＶ．コア．−− ＧＣＣ／ＧＡＡＴＴＣＧＣＴＴＣＣ−−ＰＡｂ配列−−ＴＡＡ／ＡＣＣＣＧＧＧＡＡＴＴＣＴＡＡＡ／ＧＴＣＧＡＣ−−ＢＧＨ−− Ｖ１Ｒａ．ＨＣＶ１．コア −−−ＩｎｔＡ−−ＡＧＡＴＣＴＡＣＣ／ＡＴＧＡＧＣ−−ＨＣＶ．コア．−−ＧＣＣ／ＴＡＡＡ／ＧＴＣＧＡＣ−−ＢＧＨ−− Ｖｔｐａ．ＨＣＶ１．コア −−−ＩｎｔＡ−−ＡＴＣＡＣＣ／ＡＴＧＧＡＴ−−ｔｐａリーダー−−ＧＡＧＡＴＣ−ＴＴＣ／ＡＴＧＡＧＣ−−ＨＣＶ．コア．−−ＧＣＣ／ＴＡＡＡ／ＧＴＣＧＡＣ−−ＢＧＨ−− ＶＵｂ．ＨＣＶ１．コア −−−ＩｎｔＡ−−ＡＧＡＴＣＣＡＣＣ／ＡＴＧＣＡＧ−−ユビキチン− −ＧＧＴＧＣＡＧＡＴＣＴＧ／ＡＴＧＡＧＣ−−ＨＣＶ．コア．−−ＧＣＣ／ＴＡＡＡ／ＧＴＣＧＡＣ−−ＢＧＨ−−Ｅ．他の合成ＨＣＶ遺伝子類似のコドン最適化技術を用いて、ＨＣＶＥ１（図９）、ＨＣＶＥ２（図１０）、ＨＣＶＥ１＋Ｅ２（図１１）、ＨＣＶＮＳ５ａ（図１２）およびＨＣＶＮＳ５ｂ（図１３）タンパク質をコードする合成遺伝子が作られた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 31/20 Ｃ１２Ｒ 1:92） 37/04 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＡ６１Ｋ 37/66 ＧＣ１２Ｒ 1:92） (31)優先権主張番号６０／０３３，５３４ (32)優先日平成８年12月20日(1996．12．20) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者ル，トン―ミンアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者リウ，マーガレツト・エイアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者シーバー，ジヨン・ダブリユーアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126

Claims

【特許請求の範囲】１．ＨＣＶコアタンパク質、ＨＣＶＥ１タンパク質、ＨＣＶＥ１＋Ｅ２タンパク質、ＨＣＶＮＳ５ａタンパク質、ＨＣＶＮＳ５ｂタンパク質およびそれらのフラグメントからなる群から選択されるＨＣＶタンパク質をコードするＤＮＡ配列からなる合成ポリヌクレオチドであって、該ＤＮＡ配列が脊椎動物宿主での発現のために最適化されたコドンを含む合成ポリヌクレオチド。２．脊椎動物宿主の免疫化のために適した、請求項１のポリヌクレオチドを含むプラスミドベクター。３．ＨＣＶ遺伝子型Ｉ／Ｉａコアである請求項１記載のポリヌクレオチド。４．次の配列：を有する請求項１記載のポリヌクレオチド。５．次の配列：を有する請求項２記載のプラスミドベクター。６．ＰＡｂ配列が除去されている請求項４記載のポリヌクレオチド。７．ＰＡｂ配列が除去されている請求項５記載のプラスミドベクター。８．請求項１に記載の１ｎｇ〜１００ｍｇのポリヌクレオチドを脊椎動物の組織に導入することを含む、脊椎動物中にＨＣＶエピトープに対する免疫応答を誘導する方法。９．請求項１に記載のポリヌクレオチドを脊椎動物の組織に導入することを含む、ＨＣＶにより引き起こされる感染または病気に対する免疫応答を誘導する方法。１０．請求項１に記載のポリヌクレオチドおよび薬学的に許容される担体を含む、ＨＣＶ感染に対する免疫応答を誘導するためのワクチン。１１．請求項１に記載のポリヌタレオチドを霊長類の組織に導入すると同時にインターロイキン１２を非経口で投与することを含む、霊長類に抗ＨＣＶ免疫応答を誘導する方法。１２．請求項１に記載のポリヌクレオチドに脊椎動物の細胞をインビボでさらすことを含む、ＨＣＶ抗原に特異的なリンホカイン分泌等のエフェクター機能、細胞毒性およびヘルパーＴ細胞増殖を促進するための抗原提示細胞の誘導方法。１３．請求項１に記載のポリヌクレオチドを、インターフェロンアルファ、リバビリン、ジドブジン、または他の薬学的に許容される抗ウイルス薬剤と組み合せて患者に投与することを含む、治療を必要とする患者を治療する方法。１４．請求項１に記載のポリヌクレオチドを含む医薬組成物。１５．請求項１に記載のポリヌクレオチドを患者に投与することを含む免疫応答を誘導する方法において、該ポリヌクレオチドの投与が、サブユニット、組換え、組換えの生きているベクター、不活性化、組換え不活性化ベクター、または生きている弱毒化ＨＣＶワクチンの患者への投与前、または投与と同時または投与後である方法。１６．請求項２に記載の１ｎｇ〜１００ｍｇのポリヌクレオチドを脊椎動物の組織に導入することを含む、脊椎動物ＨＣＶエピトープに対するに免疫応答を誘導する方法。１７．請求項２に記載のポリヌクレオチドを脊椎動物の組織に導入することを含む、ＨＣＶにより引き起こされる感染または病気に対する免疫応答を誘導する方法。１８．請求項２に記載のポリヌタレオチドおよび薬学的に許容される担体を含む、ＨＣＶ感染に対する免疫応答を誘導するためのワクチン。１９．請求項２に記載のポリヌクレオチドを霊長類の組織に導入すると同時にインターロイキン１２を非経口で投与することを含む、霊長類に抗ＨＣＶ免疫応答を誘導する方法。２０．請求項２に記載のポリヌクレオチドに脊椎動物の細胞をインビボでさらすことからなる、ＨＣＶ抗原に特異的なリンホカイン分泌等のエフェクター機能、細胞質毒性およびヘルパーＴ細胞増殖を促進するための抗原提示細胞の誘導方法。２１．請求項２に記載のポリヌクレオチドを、インターフェロンアルファ、リバビリン、ジドブジン、または他の薬学的に許容される抗ウイルス薬剤と組み合せて患者に投与することを含む、治療を必要とする患者を治療する方法。２２．請求項２に記載のポリヌタレオチドを含む医薬組成物。２３．請求項２に記載のポリヌクレオチドを患者に投与することを含む免疫応答を誘導する方法において、該ポリヌクレオチドの投与が、サブユニット、組換え、組換えの生きているベクター、不活性化、組換え不活性化ベクター、または生きている弱毒化ＨＣＶワクチンの患者への投与前、または投与と同時または投与後である方法。２４．Ｖ１Ｒａ．ＨＣＶ１コアＰＡｂ、Ｖｔｐａ．ＨＣＶ１コアＰＡｂおよびＶＵｂ．ＨＣＶ１コアＰＡｂ、Ｖ１Ｒａ．ＨＣＶ１コア、Ｖｔｐａ．ＨＣＶ１コアおよびＶＵｂ．ＨＣＶ１コアから選択される、請求項２に記載のベクター。２５．請求項２１に記載のベクターを含む医薬組成物。２６．図５、図９、図１０、図１１、図１２および図１３に示されたヌクレオチド配列からなる群から選択された、請求項１に記載のＤＮＡ配列。