PL175360B1 - Cząsteczka kwasu nukleinowego i kompozycja do wykrywania infekcji wirusa zapalenia wątroby typu C - Google Patents

Cząsteczka kwasu nukleinowego i kompozycja do wykrywania infekcji wirusa zapalenia wątroby typu C

Info

Publication number
PL175360B1
PL175360B1 PL94323367A PL32336794A PL175360B1 PL 175360 B1 PL175360 B1 PL 175360B1 PL 94323367 A PL94323367 A PL 94323367A PL 32336794 A PL32336794 A PL 32336794A PL 175360 B1 PL175360 B1 PL 175360B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
hepatitis
virus
hcv
epitope
amino acid
Prior art date
Application number
PL94323367A
Other languages
English (en)
Inventor
David Y. Chien
George Kuo
Original Assignee
Chiron Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=22029220&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PL175360(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Chiron Corp filed Critical Chiron Corp
Publication of PL175360B1 publication Critical patent/PL175360B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
    • G01N33/5767—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis non-A, non-B hepatitis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
    • C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/82—Hepatitis associated antigens and antibodies

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

1. Czasteczka kwasu nukleinowego obej- mujaca sekwencje nukleotydowa pochodzaca z genomu wirusa zapalenia watroby typu C ko- dujaca sekwencje aminokwasowa zawierajaca epitop typowo swoisty znajdujacy sie w obrebie regionu rdzeniowego wirusa zapalenia watroby typu C, znamienna tym, ze epitop ten zlokali- zowany jest miedzy resztami aminokwasowy- mi 67 i 84 wirusa zapalenia watroby typu C-l albo homologicznymi regionami innych typów wirusów zapalenia watroby typu C. FIG. 1 PL PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest cząsteczka kwasu nukleinowego i kompozycja Uo wykrywania infekcji wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV). Wynalazek stuży Uo klasyfikowania HCV.
Wiadomo, że wirusowe zapalenie wątroby aowoUowane jest przez pięć różnych wirusów, znanych jako wirusy zapalenia wątroby A, B, C, D, i E. HAV jest RNA-wirusem i nie powoduje długotrwałych objawów klinicznych. HBV jest DNA wirusem. HDV jest wirusem zależnym, niezdolnym Uo zakażenia komórek w nieobecności HBV. HEV jest wirusem przenoszonym z wodą. Początkowo, wirus HCV zidentyfikowano i scharakteryzowano jako przyczynę zapalenia wątroby nie-A i nie-B (NANBH). Wirus ten został ujawniony przez Houghtona i wsp. w publikacji opisu patentowego europejskiego, EP 388.232. Doprowadziło to do opracowania wielu nieswoistych i swoistych polipeptydów użytecznych jako odczynniki immunologiczne do identyfikacji HCV (Choo i wsp., Science, 1989 244, 359-362; Kuo i wsp., Science 1989, 244, 362-364; Houghton i wsp., Hepatology, 1991, 14, 381-388. Wirus HCV jest główną przyczyną zapalenia wątroby nabywanego po transfuzji krwi.
Prototypowy izolat HCV jest scharakteryzowany w publikacji opisów patentowych europejskich, nr 318.216 i 388.232. Stosowany w niniejszym opisie termin HCV obejmuje nowo wyizolowane rodzaje wirusów NANBH. Termin HCV-1 odnosi się do wirusa opisanego w wyżej cytowanych publikacjach.
Od czasu pierwszej identyfikacji wirusa HCV, zidentyfikowano i oznaczono symbolami od HCV-1 do HCV-6 co najmniej sześć różnych typów tego wirusa (Cha i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 7144-7148). W obrębie tych typów istnieje wiele podtypów. Typ wirusa, którym jest zakażony pacjent jest odpowiedzialny za prognozę klinicznego przebiegu zakażenia oraz reakcję na różne rodzaje leczenia (Yoshioka i wsp., Hepatology, 1992, 16, 293-299). W świetle faktu, że najgroźniejszym rezultatem infekcji wirusem HCV jest rak komórek wątrobę, mogłaby być użyteczna możliwość oznaczenia typu lub typów wirusa HCV, którymi jest zakażony pacjent.
Sposobem stosowanym obecnie do oznaczenia typu wirusa jest oznaczenie jego geneotypu, polegające na izolowaniu wirusowego RNA i oznaczaniu sekwencji różnych segmentów techniką łańcuchowej reakcji z użyciem polimerazy (PCR). Sposób ten jest praco- i czasochłonny i nie nadaje się do analizowania próbek przechowywanych w warunkach nie pozwalających na konserwację RNA ani próbek pobranych od pacjentów z niedostatecznym mianem wirusa. Użyteczny byłby więc sposób klasyfikacji HCY przez analizę immunologiczną albo oznaczanie stereotypu.
Stosowanym obecnie sposobem skriningu krwi i diagnozowania pacjentów jest próba immunologiczna. W próbie tej wykorzystuje się antygen z HCV-1, który zawiera wystarczającą ilość pospolitych epitopów Uo tego, aby były wykrywane przeciwciała wobec innych typów HCV. Ta próba nie daje rozróżnienia pomiędzy infekcjami różnymi typami wirusa HCV.
Przedmiotem wynalazku jest cząsteczka kwasu nukleinowego obejmującą sekwencję nukleotydową pochodzącą z genomu wirusa zapalenia wątroby typu C kodująca sekwencję aminokwasową zawierającą epitop typowo swoisty znajdujący się w obrębie regionu rdzeniowego wirusa zapalenia wątroby typu C, charakteryzująca się tym, że epitop ten zlokalizowany jest między resztami aminokwasowymi 67 i 84 wirusa zapuleniu wątroby typu C-1 albo homologicznymi regionami innych typów wirusów zapalenia wątroby typu C.
W odmianie wynalazku przedmiotem wynalazku jest także cząsteczka kwasu nukleinowego obejmującą sekwencję nukleotydową pochodzącą z genomu wirusa zapalenia wątroby typu C kodująca sekwencję aminokwasową zawierającą epitop typowo swoisty znajdujący się w obrębie regionu NS4 wirusa zapalenia wątroby typu C, charakteryzująca się tym, że epitop ten
175 360 zlokalizowany jest pomiędzy resztami aminonwusowemi 1689 i 1718 wirusa zapalenia wątroby typu C-1 albo homologicznymi regionami innych typów wirusów zapalenia wątroby typu C.
W kolejnym wariancie przedmiotem wynalazku jest cząsteczka kwasu nukleinowego obejmującą sekwencję nunleotedowk pochodzącą z genomu wirusa zapalenia wątroby typu C kodująca sekwencję aminokwasową zawierającą epitop typowo swoisty znajdujący się w obrębie regionu NS5 wirusa zapalenia wątroby typu C, charakteryzująca się tym, że epitop ten zlokalizowany jest pomiędzy resztami aminokwaakwemi 2281 i 2313 wirusa zapalenia wątroby typu C-1 albo homologicznymi regionami innych typów wirusów zapalenia wątroby typu C.
Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja do wykrywania infekcji wirusa zapalenia wątroby typu C, posiadająca rekombinantową cząsteczkę polinunleotydύ kodującą połączenie epitopów typowo swoistych wirusa zapalenia wątroby typu C, charakteryzująca się tym, że zawiera połączenie epitopów wybrane z regionu: rdzeniowego, niestrukturalnego regionu 4 (NS4), niestrukturalnego regionu 5 (NS5) wirusa zapalenia wątroby typu C.
W korzystnym wykonaniu kompozycja według wynalazku może zawierać cząsteczkę aolinukleotyUu kodującą co najmniej jeden typowo swoisty epitop wybrany z każdego z reginów rdzeniowego, NS4 i NS5 wirusa zapalenia wątroby typu C. Również korzystnie w kompozycji według wynalazku wszystkie typowo specyficzne epitopy wirusa zapalenia wątroby typu C są specyficzne dla jednego typu wirusa zapalenia wątroby typu . C. Korzystnie kompozycja według wynalazku charakteryzuje się tym, że cząsteczka polinukleotydu kodująca epitop typowo swoisty regionu rdzeniowego wirusa zapalenia wątroby typu C pochodzi z sekwencji aminokwasowej pokrywającej się z aminokwasami 67-84 wirusa zapalenia wątroby typu C-1, albo z homologicznymi regionami innych typów wirusów zapalenia wątroby typu C. W innym korzystnym wykonaniu kompozycji według wynalazku cząsteczka polinunleotedu kodująca epitop typowo swoisty regionu NS4 wirusa zapalenia wątroby typu C pochodzi z sekwencji aminokwasowej pokrywającej się z aminokwasami 1689-1718 wirusa zapalenia wątroby typu C-1, albo z homologicznymi regionami innych typów wirusów zapalenia wątroby typu C. W kolejnym korzystnym wykonaniu kompozycja według wynalazku charakteryzuje się tym, że cząsteczka polinunleotydu kodująca epitop typowo swoisty regionu NS4 wirusa zapalenia wątroby typu C pochodzi z sekwencji aminokwasowej pokrywającej się z aminokwasami 1689-1718 wirusa zapalenia wątroby typu C-1, albo z homologicznymi regionami innych typów wirusów zapalenia wątroby typu C. Korzystnie kompozycja według wynalazku charakteryzuje się tym, że cząsteczka pklinunlekteUu kodująca epitop typowo swoisty regionu NS5 wirusa zapalenia wątroby typu C pochodzi z aminonwaakwej sekwencji pokrywającej się z aminokwasami 2281-2313 wirusa zapalenia wątroby typu C-1, albo homologicznymi regionami innych typów wirusów zapalenia wątroby typu C. Również korzystnie w kompozycji według wynalazku cząsteczka polinuklektydu kodująca epitop typowo swoisty regionu NS5 wirusa zapalenia wątroby typu C pochodzi z aminokwasowej sekwencji pokrywającej się z aminokwasami 2281-2313 wirusa zapalenia wątroby typu C-1, albo homologicznymi regionami innych typów wirusów zapalenia wątroby typu C.
Cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku koduje sekwencję aminokwasowk aolipeptyUów zawierających epitopy typowo-swoiste albo epitopy swoiste wobec wiązki typów. PolipepteUy te wywodzą się z trzech różnych regionów genomu HCV. Jeden zestaw po^eptydów obejmuje epitopy typowo-swoiste albo epitopy swoiste wobec wiązki typów, otrzymane z regionu rdzeniowego wirusa HCV. Ten pierwszy zestaw znajduje się pomiędzy resztami aminokwasowemi 67 a 84 wirusa HCV-1 i homologicznymi regionami innych typów HCV. W niniej szym opisie użyte są następujące skróty reszt aminonwasowych: A = alanina, I - izoleucyna, L - leucyna, M - metionina, F - fenyloalanina, P - prolina, W- trypofan, V - walina, N - asparagina, C - cysteina, Q- glutamina, G - glicyna, S - seryna, T - treotonina, Y- tyrozyna, R - arginina, H - histedyna, K - lizyna, D- kwas asparaginowy i E = kwas glutaminowy.
Poszczególne sekwencje reszt aminokwasoech wywodzące się z regionu rdzeniowego i akdtyae, z których je otrzymano są następujące:
1. PE.GRTWAQ podtyp ła albo 1b
2. STGKSWGK, podtyp 2a albo 2b
3. SEGRSWAQ, podtyp 3a albo 4.
175 360
Inny zestaw polipeptydów obejmuje typowo-swoisty epitop otrzymany z niestrukturalnego regionu 4 wirusa HCV (NS4). Ten drugi zestaw obejmuje obszar pomiędzy resztami aminokwasowymi 1689a 1718 wirusaHCV-1 i homologicznymi regionami innych typów HCV.
Poszczególne sekwencje reszt aminokwasowych oraz typy i podtypy, z których one pochodzą są następujące:
1. CSQHLPY, podtyp 1a
2. CASHLPY, podtyp 1b
3. CASRAAL, podtyp 2a albo 2b
Jeszcze inny zestaw polipeptydów obejmuje epitop typowo-swoisty albo epitopy swoiste względem wiązki typów, otrzymane z niestrukturalnego regionu 5 (NS5) wirusa zapalenia wątroby typu C. Ten zestaw znajduje się pomiędzy resztami aminokwasowymi 2281 a 2313 wirusa HCV-1 i homologicznymi regionami innych typów wirusa zapalenia wątroby typu C.
Poszczególne sekwencje reszt aminokwasowych oraz typy i podtypy, z których one pochodzą są następujące:
1. PDYEPPVVHG, podtyp 1a
2. PDYVPPVVHG, podtyp 1b
3. PDYQOATVAG, podtyp 2a
4. PGYEPPTVLG, podtyp 2b
5. FAQASPVW, podtyp 1a
6. FPPQALPIW, podtyp 1b
7. FPQALPAW, podtyp 2a
8. FPPQALPPW podtyp 2b.
Cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku jest użyteczna jako sonda, np. w próbach plamienia Southera lub w innych próbach rozpoznania DNA, takich jak próba wychwytywania, opisana w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4.868.105 i 5.124.246.
W jeszcze innym aspekcie, przedmiotem wynalazku są cząsteczki kwasu nukleinowego komplementarne do sekwencji kwasu nukleinowego flankujących regiony kodujące epitopy typowo swoiste i epitopy swoiste wobec wiązki typów. Te cząsteczki kwasu nukleinowego są użyteczne do prowadzenia łańcuchowej reakcji z udziałem polimerazy (PCR) do oznaczania geneotypów konkretnych HCV.
Wynalazek został zilustrowany na rysunku, na którym fig. 1 przedstawia schemat strategii doświadczalnego oznaczenia sereotypu. Fig. 2 przedstawia schemat strategii wyczerpującego mapowania epitopu. Fig. 3 przedstawia kompilację wykresów przedstawiających wyniki mapowania epitopu wirusa HCV 1a (Rodney). Fig. 4 przedstawia kompilację wykresów przedstawiających wyniki mapowania epitopu wirusa HCV 2b (Nomoto).
Definicje
Wirus zapalenia wątroby typu C albo HCV odnosi się do tych rodzajów wirusa, których typy patogenne powodują NANBH oraz do pochodzących od nich typów atenuowanych albo defektywnych cząstek interferujących. Wirus ten jest opisany w publikacjach cytowanych w niniejszym opisie. Genom HCV jest zbudowany z RNA. Wirusy zawierające rNa charakteryzują się stosunkowo wyższymi szybkościami mutacji spontanicznych, szacowanych na rząd 10'3 do 104 na wbudowany nukleotyd (Fields i Knipe, Fundamental Virology, 1986, Raven Press, NY). Ponieważ heterogenność i płynność geneotypu są u RNA-wirusów cechami dziedzicznymi, w obrębie rodzaju HCV istnieje wiele typów i podtypów, które mogą być wirulentne albo niezłośliwe. Namnażnie, identyfikacja, detekcja i izolacja różnych typów i izolatów HCV są udokumentowane w piśmiennictwie. Jak zaznaczono, wszystkie sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe pochodzą z wymienionych typów HCV. Ilość sekwencji genomowych HCV-1 i aminokwasowych jest taka, jaka jest opisana przez Choo i wsp., Brit. Med. Buli. 1990,46,423 - 441. Ujawnienie zawarte w opisie pozwala na oznaczenie różnych typów.
Użyty w opisie termin typ oznacza wirusy HCV różniące się pod względem genotypu o więcej niż około 30%, określenie podtyp oznacza wirusy HCV różniące się pod względem genotypu o 10 - 20%; a określenie izolat oznacza wirusy różniące się genotypowo o mniej niż
175 360 około 10%. Klasyfikowanie odnosi się do rozróżnienia jednego typu wirusa HCV od drugiego typu.
W publikacji zgłoszenia międzynarodowego, WO 93/00365 znajduje się informacja o kilku typach/podtypach HCV, zwłaszcza o typie lub podtypie CDC/HCV1 (zwanym również HCV-1). Informacja oj ednym typie albo podtypie, taka jak częściowa sekwencja genomowa lub aminokwasowa, jest wystarczająca dla specjalisty z tej dziedziny stosującego standardowe techniki do wyizolowania nowych typów HCV. Przykładowo, przeprowadzono skrining kilku różnych typów HCV w sposób opisany poniżej. Takie typy, które uzyskano z wielu surowic ludzkich (i z różnych stref geograficznych) klasyfikowano stosując sposób i odczynniki opisane w niniejszym opisie.
Wprowadzono strukturę genomu i sekwencję nukleotydową genomowego RNA wirusa HCV-1. Okazuje się, że genom jest jednoniciowym RNA zawierającym 10.000 nukleotydów. Genom posiada nić dodatnią i ciągłą, translacyjną otwartą ramkę odczytu (ORF) kodującą poliproteinę złożoną z około 3000 aminokwasów. W tej ramce ORF, białko strukturalne jest kodowane w mniej więcej pierwszej ćwiartce regionu końca aminowego a z większej części tej poliproteiny powstają białka niestrukturalne (NS). Przy porównaniu ze wszystkimi znanymi sekwencjami wirusowymi, obserwuje się niewielkie ale znaczące ko-liniwe homologię z białkami niestrukturalnymi (NS) z rodziny flawiwirusa i z pestywirusami (co do których, obecnie uważa się, że stanowią część rodziny Flaviwirusów).
Opierając się na przypuszczalnych resztach aminokwasowych kodowanych przez sekwencję nukleotydową HCV-1 i na innym dowodzie, wyprowadzono możliwe domeny białkowe kodowanej poliproteiny HCV oraz przybliżone wiązania. Są one przedstawione w tabel i 1.
Tabela 1
Przypuszczalna domena Przybliżone wiązania (numery aminokwasów)
C (białko nukleokapsydu) 1 - 191
Ei (białko otoczki wirionu) 192 - 383
E2/NS1 (otoczka) 384 - 800
NS2 (funkcja nieznana) 800 - 1050
NS3 (proteaza) 1050 - 1650
NS4 (funkcja nieznana) 1651 - 2100
NS5 (polimeraza) 2100 - 3011 (koniec)
Te domeny są przypuszczalne. Przykładowo, granica El- NS2 znajduje się prawdopodobnie w regionie 750 - 810 a granica NS3-NS4 istnieje przypuszczalnie w regionie około 1640 - 1650. Istnieje również dowód na to, że wersja C zawierająca 191 aminokwasów (aa) jest prekursorem podlegającym dalszemu przetwarzaniu do długości około 170 aminokwasów i do N52. Obydwa białka są dalej przetwarzane do dwu białek dojrzałych.
Różne typy HCV definiuje się według różnych kryteriów, takich jak np. ORF o długości od około 9.000 nukleotydów do około 12.000 nukleotydów, kodująca białko o rozmiarach podobnych do rozmiarów HCV-1, kodowana poliproteina o właściwościach hydrofobowych i/lub antygenowych podobnych do tych, jakie posiada HCV-1 oraz obecność ko-liniowych sekwencji polipeptydowych zachowanych w wirusie HCV-1.
175 360
Do identyfikacji typów HCV można zastosować następujące parametry homologii kwasu nukleinowego i homologii aminokwasowej, bądź pojedynczo bądź w kombinacji. Na ogół, jak podano powyżej, różne typy HCV wykazują około 70% homologii, podtypy wykazują 80 - 90% homologii a izolaty charakteryzują się homologią około 90 procentową.
Używane w opisie określenie: polinukleotyd pochodzący z określonej sekwencji odnosi się do sekwencji polinukleotydowej złożonej z co najmniej około 6 nukleotydów, korzystnie, co najmniej około 8 nukleotydów, korzystniej, co najmniej około 10 do 12 nukleotydów a nawet bardziej korzystnie, co najmniej około 15 do 20 nukleotydów korespondujących z regionem tej określonej sekwencji nukleotydowej. Wyrażenie korespondujący oznacza homologiczny z określoną sekwencją albo do niej komplementarny. Korzystnie, sekwencja regionu, z którego pochodzi polinukleotyd jest homologiczna z sekwencją unikalną w genomie HCV albo jest do tej sekwencji komplementarna.
Techniki hybrydyzacji do oznaczania komplementarności sekwencji kwasów nukleinowych są znane. Są one np. opisane przez Maniatisa i wsp. (1982). Ponadto, niedopasowania polinukleotydów dupleksowych powstających w wyniku hybrydyzacji można oznaczyć znanymi technikami, w tym np. techniką trawienia nukleazą, takąjak nukleaza S1, która swoiście trawi jednoniciowe obszary polinukleotydów dupleksowych. Regiony, z których mogą pochodzić typowe sekwencje DNA obejmują ale nie ograniczają się do np. regionów kodujących epitopy typowo swoiste oraz regiony nie podlegające transkrypcji ani/lub translacji.
Pochodny polinukleotyd niekoniecznie fizycznie pochodzi z przedstawionej sekwencji nukleotydowej ale może być otrzymany w dowolny sposób, w tym np. przez syntezę chemiczną, przez replikację DNA albo przez odwrotną transkrypcję lub translację. Poza tym, można modyfikować kombinacje regionów odpowiadających wyznaczonej sekwencji znanymi metodami, tak, aby były one odpowiednie do zamierzonego zastosowania.
Podobnie, określenie: polipeptyd albo sekwencja aminokwasowa pochodząca z określonej sekwencji aminokwasowej albo sekwencji kwasu nukleinowego odnosi się do polipeptydu posiadającego sekwencję aminokwasową identyczną z tą, jaką posiada polipeptyd kodowany w tej sekwencji albo jego części, która to część składa się z co najmniej 3 do 5 aminokwasów, korzystniej co najmniej 8-10 aminokwasów, a jeszcze korzystniej co najmniej 11 do 15 aminokwasów albo odnosi się do polipeptydu, który jest możliwy do identyfikacji immunologicznej za pomocą polipeptydu kodowanego w tej sekwencji. Termin ten obejmuje również polipeptyd wytwarzany przez ekspresję określonej sekwencji kwasu nukleinowego.
Rekombinantowy lub pochodny polipeptyd nie musi powstawać w wyniku translacji określonej sekwencji kwasu nukleinowego. Można go wytwarzać w dowolny sposób, obejmujący np. syntezę chemiczną albo ekspresję rekombinantowego układu ekspresyjnego albo izolację z HCV, w tym z mutowanego HCV. Polipeptydy przedstawione w niniejszym opisie są relatywnie krótkie, a zatem, najłatwiej się je syntetyzuje drogą chemiczną.
Taki rekombinantowy lub pochodny polipeptyd może zawierać w swej sekwencji jeden lub większą ilość analogów aminokwasów albo aminokwasów nie występujących w stanie naturalnym. Metody wbudowywania analogów aminokwasów do sekwencji są znane. Można również włączać jeden lub większą ilość znaczników, co jest sprawą znaną dla specjalisty z tej dziedziny. Szczegółowy opis analogów i mimotopów znajduje się w opisie patentu Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5.194.392.
Do analogów peptydowych należą analogi, w których dokonano delecji, addycji, podstawienia albo modyfikacji przy zachowaniu zdolności rozpoznawania typu wirusa HCV. Do korzystnych podstawień należą podstawienia konserwatywne, to znaczy takie, w których dana reszta jest zastąpiona przez inną resztę tego samego typu. Jak wiadomo, aminokwasy występujące w stanie naturalnym można dzielić na kwaśne, zasadowe, obojętne i polarne albo obojętne i niepolarne. Ponadto, trzy kodowane aminokwasy są aromatyczne. Korzystne jest, aby kodowane polipeptydy różniące się od naturalnego epitopu zawierały podstawione kodony dla aminokwasów należących do tej samej grupy co zastępowany aminokwas. Tak więc, aminokwasy zasadowe: Lys, Arg i His są w zasadzie wzajemnie wymienialne, aminokwasy kwaśne: kwas asparaginowy i kwas glutaminowy są wzajemnie wymienialne, obojętne, polarne aminokwasy: Ser, Thr, Cys, Gin i Asn są wzajemnie wymienialne, niepolarne alifatyczne aminokwasy: Gly,
175 360
Ala, Val, He i Leu są w stosunku do siebie nawzajem konserwatywne (ale z powodu rozmiarów, ściślej spokrewnione są Gly z Ala oraz Val z Ile i z Leu) a także aromatyczne aminokwasy: Phe, Trp i Tyr są wzajemnie wymienialne. Prolina jest aminokwasem niepolarnym i obojętnym, a pomimo tego stwarza trudności z powodu swego wpływu na konformację. Podstawienia proliną lub w miejsce proliny nie są korzystne za wyjątkiem przypadków, kiedy można uzyskać tę samą albo zbliżoną konformację. Do polarnych aminokwasów reprezentujących zmiany konserwatywne należą Ser, Thr, Gln, Asn i w mniejszym stopniu Met. Ponadto, Ala, Gly i Ser, jakkolwiek klasyfikuje się je w różnych kategoriach, wydają się być wzajemnie wymienialne a Cys dodatkowo pasuje do tej grupy albo może być klasyfikowana do polarnych obojętnych aminokwasów.
Należy poza tym zaznaczyć, że jeśli polipeptydy wytwarza się syntetycznie, można również dokonywać podstawień przez aminokwasy, które nie są kodowane przez dany gen. Do takich alternatywnych reszt należą na przykład omega-aminokwasy o wzorze H2N(CH2)nCOOH, w którym n ma wartość 2 Uo 6. Są to obojętne, niepolarne aminokwasy takie jak sarkozyna (Sar), t-butylo-alanina (t-BuA), t-butylo-glicyna (t-BuG), N-metylo-izoleucyna (N-Melle) i norleućyna (Nie). Przykładowo, fenyloglicynę można podstawić w miejsce Trp, Tyr albo Phe, aromatycznego aminokwasu obojętnego. Cytrulina (Cit) i sulfotlenek metioniny (MSO) są polarne ale obojętne, cynlehensdloalanlna (Cha) jest obojętna i niepolarna, kwas cysternowy (Cya) jest kwaśny a omityna (Orn) jest zasadowa. Właściwości konformacyjne nadane obecnością reszt proliny można zachować podstawiając jedną lub większą ilość tych reszt hdUronsdproliną (Hyp).
Termin polinukleotyd rekombinantowy oznacza w niniejszym opisie polinrnleotyU pochodzenia genomowego, cDNA, pótsdntetyćznd, który ze względu na swe pochodzenie albo w wyniku manipulacji (1) nie jest związany ani z całością ani z częścią polinunleotyUr, z którym jest związany w stanie naturalnym, (2) jest połączony z aolinukleotdUem innym niż ten, z którym jest związany w stanie naturalnym albo (3) nie występuje w stanie naturalnym.
Termin polinukleotyd oznacza w niniejszym opisie polimeryczną formę nukleotydów o dowolnej długości, zarówno rybonukleotydów jak i dezoksyrybonukleotydów. Termin ten odnosi się tylko Uo struktury pierwszorzędowej cząsteczki. Tak więc, obejmuje on Uwu- i łeUnoniciowy DNA i RNA. Zawiera on również znane typy modyfikacji, np. znaczniki znane w stanie techniki, formy metylowane, formy o strukturze cap (osłonięte), formy zawierające podstawienie jednego lub większej ilości naturalnie występujących nukleotydów analogiem, polinukleotydy zawierające modyfikacje mlęUzdnrnleotdUowe, takie jak np. wiązania nie zawierające ładunków (np. metylofosfonianowe, fosfotrójestrowe, amiUofosforanowe, karbaminianowe i podobne) oraz takie, które zawierają ładunki (np. tiofosforany, Uitiofosforany i podobne), takie, które zawierają reszty wiszące, np. białka takie jak nukleazy, toksyny, przeciwciała, peptydy sygnalne i poli-L-lizyna, polinukleotydy zawierające internulaterd (takie jak akrydyna, psoralen i podobne), zawierające chelatory (np. metale, metale radioaktywne, bor, metale utleniające i podobne), takie, które zawierają środki alkilujące, takie, które zawierają wiązania modyfikowane (np. alfa anomeryczne kwasy nukleinowe i podobne) oraz niemodyfikowane formy tego polinukleotydu. Polinukleotydy przedstawione w opisie są relatywnie krótkie, a zatem łatwo je otrzymać na drodze syntezy chemicznej.
Określenie oczyszczony polipeptyU odnosi się Uo polipeptydu w stanie zasadniczo wolnym od innych polipeptydów, to znaczy, w kompozycji zawierającej co najmniej około 50% wagowych (stosunek żądanego polipeptydu do całkowitej ilości wszystkich polipeptydów w kompozycji), korzystnie co najmniej około 70% a nawet bardziej korzystnie, co najmniej około 90% żądanego pollaeptdUr, bez uwzględniania materiału niebiałkowego w tej kompozycji. Techniki oczyszczania wirusowych polipeptydów są znane. Oczyszczone przeciwciała są zdefiniowane podobnie w stanie techniki.
Wyrażenie epitop oznacza determinantę antygenową polipeptydu. Epitop może zawierać 3 albo większą ilość aminokwasów decydujących o miejscu wiązania z przeciwciałem. W zasadzie, epitop składa się z co najmniej 5 aminokwasów a czasem zawiera co najmniej 8 aminokwasów. Metody mapowania epitopów są znane.
175 360
Termin epitka typowo-swoisty odnosi się do epitopu występującego w jednym typie HCV. Wyrażenie epitop swoisty dla wiązki typów znajduje się w więcej niż jednym ale nie we wszystkich typach HCV. Przykładowo, konkretny epitop może być rozpoznawany przez przeciwciała pochodzące od pacjenta zakażonego wirusem HCV-1 ale nie będą rozpoznawane albo będą rozpoznawane mniej skutecznie przez przeciwciała pochodzące od pacjenta zakażonego wirusem HCV-2. Podobnie, epitop swoisty dla wiązki typów pochodzący z HCY-3 może być rozpoznany przez przeciwciała pochodzące od pacjenta zakażonego wirusem HCV-3 albo HCV-4 ale nie przez przeciwciała pochodzące od pacjenta zakażonego wirusami HCY-1 albo HCV-2. Konserwatywnymi epitopami ' 'są te, które są rozpoznawane przez przeciwciała swoiste dla wszystkich typów HCV.
Polipeptyd jest reaktywny immunologicznie z przeciwciałem, które przyłącza się do peptydu w wyniku rozpoznania przez to przeciwciało swoistego epitopu zawartego w tym polipeatydzie. Reaktywność immunologiczną można oznaczać przez wiązanie z przeciwciałem, zwłaszcza przez oznaczanie kinetyki wiązania z przeciwciałem i/lub przez oznaczanie kompetycji wiązania, stosując jako czynniki konkurencyjne znane pklipeptyUy zawierające epitop przeciwko któremu jest skierowane to przeciwciało. Techniki określania, czy polipeptyd jest reaktywny immunologicznie z danym przeciwciałem są znane.
Stosowany w niniejszym opisie termin przeciwciało odnosi się do polipeptydu albo grupy polipeptydów zawierających co najmniej jedno miejsce wiążące. Miejsce wiążące przeciwciała albo domena wiążąca powstają w wyniku sfałdowania domen zmiennych cząsteczki przeciwciała z utworzeniem trójwymiarowych przestrzeni wiążących, w których kształt powierzchni wewnętrznej i rozmieszczenie ładunków jest komplementarne do charakterystycznych cech epitopu na antygenie, co pozwala na reakcję immunologiczną z tym antygenem. Miejsce wiążące przeciwciała może się tworzyć z domeny o łańcuchu ciężkim i/lub lekkim (odpowiednio Vh i Vl) tworzącej hiperzmienne pętle biorące udział w wiązaniu antygenu. Określenie przeciwciało oznacza np. przeciwciała zwierząt kręgowych, przeciwciała hybrydowe, przeciwciała chimerowe, przeciwciała zmienione, przeciwciała jednowartościowe, białka Fab i przeciwciała jedno-domenowe.
Przeciwciała swoiste wobec polipeptydów i polipeptydy można wytwarzać dowolnym sposobem znanym w stanie techniki. Przykładowo, polipeptyUy na ogół zawiesza się w buforze akceptowalnym fizjologicznie, miesza się je z odpowiednim adiuwantem i wstrzykuje zwierzęciu. Sposoby otrzymywania przeciwciał polinlonalnyoh i monoklknalnych są znane i nie są podane w niniejszym opisie.
Określenie polipeatyU oznacza polimer aminokwasowe i nie określa długości własnej produktu. Tak więc, definicją polipeptydu są objęte polipeptedy, oligopeptydy i białka. Termin ten nie obejmuje modyfikacji postenspresyjnyoh tego polipeptydu, np. glinozylaoji, acetylami, fosforylacji i podobnych. Definicją tą objęte są np. polipeptydy zawierające jeden lub większą ilość analogów aminokwasów (w tym np. aminokwasy nie występujące w stanie naturalnym i podobne), polipeptydy z podstawionymi wiązaniami oraz inne znane modyfikacje, zarówno występujące w stanie naturalnym jak i nie występujące w naturze.
Pod określeniem leczenie rozumie się profilaktykę i/lub terapię.
Stosowane w opisie określenie osobnik odnosi się do kręgowców, zwłaszcza należących do rodzaju ssaków i obejmuje ale nie ogranicza się do zwierząt (np. psów, kotów, bydła, świni, owiec, kóz, królików, myszy, szczurów, świnek morskich i podobnych) oraz do naczelnych, w tym małp, szympansów, pawianów i ludzi.
Wyrażenie nić sensowna kwasu nukleinowego oznacza sekwencję wykazującą homologię do sekwencji mRNA. Nić antysensowna oznacza sekwencję komplementarną do nici sensownej.
Genom z nicią dodatnią danego wirusa oznacza taki wirus, w którym genom, zarówno RNA jak i DNA, jest jednonioiowy i koduje wirusowy polipeptyd albo polipeptydy. Przykładami RNA wirusów z nicią dodatnią są Togaviridae, Coronaviridae, Retroviridae, Picomaviridae i Caliciviridae. Do takich wirusów należą również Flaviviridae, poprzednio klasyfikowane jako TkgaviraUae (Fields i Knipe, 1986).
175 360
Termin zawierająca przeciwciało próbka ciała odnosi się do składnika ciała danego osobnika służącego jako źródło żądanych przeciwciał. Zawierające przeciwciała składniki organizmu są znane i obejmują ale nie ograniczają się do np. osocza, surowicy, płynu rdzeniowego, płynu limfatycznego, zewnętrznych sekcji przewodów: oddechowego, pokarmowego i moczowo-płciowego, łez, śliny, mleka, białych krwinek i szpiczaków.
Próbka biologiczna oznacza próbkę tkanki lub płynu wyizolowanego z osobnika, obejmującą ale nie ograniczającą się do np. osocza, surowicy, płynu rdzeniowego, płynu limfatycznego, zewnętrznych sekcji skóry i przewodów: oddechowego, pokarmowego i moczowo-płciowego, łez, śliny, mleka, komórek krwi, nowotworów i narządów. Termin ten obejmuje również próbki składników hodowli komórkowych in vitro (obejmujących ale nie ograniczających się do kondycjonowanego medium wytworzonego w wyniku wzrostu komórek w podłożu hodowlanym, komórek przypuszczalnie zakażonych wirusem, komórek rekombinantowych i składników komórkowych).
W praktycznym wykonaniu wynalazku, o ile nie podano inaczej, są zastosowane konwencjonalne techniki biologii molekularnej, mikrobiologii, rekombinacji DNA, syntezy polipeptydów i kwasów nukleinowych i immunologii znane w stanie wiedzy. Techniki te są w pełni wyjaśnione w piśmiennictwie, np: Maniatis, Fitsch i Sambrook: Molecular Cloning: A Laboratory Manual: (1982); DNA Cloning, tomy I i Π (wyd. D.N. Glover, 1985); Oligonucleo tide Synthesis (wyd. M.J. Gait, 1984); Nucleic Acid Hybridization (wyd. B.D. Hames i S. J. Higgins, 1984); Transcription and Translation (wyd. B.D. Hames i S.J. Higgins, 1984); Animal Cell Culture (wyd. R.I. Freshney, 1986), Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning, (1984); seria: Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (wyd. J. H. Miller i Μ. P. Calos, 1987, Cold Spring Harbor Laboratory), Meth. Enzymol., tom 154 i tom 155 (wyd. odpowiednio Wu i Grossman i Wu), wyd.: Mayer i Waler, 1987), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press, Londyn); Scopes, (1987) Protein Purification: Principles and Practice, Π wyd. (Springer Verlag, N.Y.) i Handbook of Experimental Immunology, tomy I - IV (wyd.. D.M. Weir i C. C. Blackwell, 1986).
Wszystkie patenty, zgłoszenia i publikacje patentowe cytowane powyżej i poniżej są włączone do opisu jako odnośniki.
Stosując cząsteczkę kwasu nukleinowego według wynalazku przeprowadza się skutecznie sposoby wykrywania HCV i indentyfikowania różnych typów HCV zakażających organizm.
Metody wykrywania i klasyfikowania infekcji wirusem HCV obejmują zarówno próby immunologiczne jak i identyfikację kwasu nukleinowego metodami obejmującymi ale nie ograniczającymi się do hybrydyzacji metodą Southerna i łańcuchowej reakcji z udziałem polimerazy (PCR). W celu identyfikacji zakażenia HCV, próbkę biologiczną inkubuje się z jednym z polipeptydów opisanych w niniejszym opisie w warunkach umożliwiających wiązanie antygenu z przeciwciałem i wykonuje się oznaczenie, czy przeciwciała w próbce wiążą się z epitopem obecnym na polipeptydzie.
Próby immunologiczne i zestawy diagnostyczne
Peptydy kodowane przez cząsteczkę kwasu nukleinowego według wynalazku zawierają epitopy typowo swoiste i epitopy swoiste dla wiązki typów są użyteczne w próbach immunologicznych do wykrywania obecności przeciwciał HCV albo obecności wirusa i/lub antygenów wirusowych w próbkach biologicznych. Projektowanie prób immunologicznych jest przedmiotem ogromnej zmienności i znanych jest wiele formatów. W próbie immunologicznej będzie się stosować co najmniej jeden epitop typowo swoisty albo epitop swoisty dla wiązki typów. W jednym rozwiązaniu, w próbie immunologicznej stosuje się kombinację epitopów typowo swoistych i/lub epitopów swoistych dla wiązki typów.
Polipeptydy takie są przydatne do oznaczania typu HCV przez zastosowanie epitopów do oznaczenia obecności przeciwciał swoistych względem danego typu albo przeciwciał swoistych dla wiązki typów. Polipeptydy te są również przydatne do generowania przeciwciał swoistych względem danego typu albo przeciwciał swoistych dla wiązki typów, które to przeciwciała mogą być następnie stosowane w próbie immunologicznej do odróżniania różnych typów HCV.
175 360
Polipeptydy te pochodzą z trzech różnych regionów genomu HCV. Jeden zestaw polipeptydów zawiera epitop typowo swoisty albo epitop swoisty dla wiązki typów otrzymany z rdzeniowego regionu HCV. Następny zestaw polipeptydów zawiera epitop typowo swoisty albo epitop swoisty dla wiązki typów, otrzymany z niestrukturalnego regionu 4 (NS4) wirusa HCV. Trzeci zestaw polipeptydów zawiera epitop typowo swoisty albo epitop swoisty dla wiązki typów, otrzymany z niestrukturalnego regionu 5 (NS5) wirusa zapalenia wątroby C. Ten zestaw znajduje się pomiędzy resztami aminokwasowymi 2281 a 2313 wirusa HCV-1 i w homologicznych regionach innych typów wirusa zapalenia wątroby typu C.
Polipeptydy te nadają się do stosowania w próbach immunologicznych na określenie jednego albo większej ilości typów HCV. W celu oznaczenia jednego typu, próbkę kontaktuje się z jednym lub z większą ilością polipeptydów zawierających epitop swoisty dla wiązki typów w warunkach umożliwiających wiązanie antygenu z przeciwciałem i oznacza się, czy przeciwciała w próbce wiążą się z epitopem.
W próbie immunologicznej zaprojektowanej na oznaczanie konkretnego typu wirusa HCV, pobiera się od osobnika próbkę biologiczną, kontaktuje się ją z pierwszym typowo swoistym epitopem albo z epitopem swoistym dla wiązki typów w warunkach umożliwiających wiązanie przeciwciała z antygenem, kontaktuje się ją z drugim typowo swoistym epitopem albo z epitopem swoistym dla wiązki typów w warunkach umożliwiających wiązanie przeciwciała z antygenem i oznacza się, czy przeciwciała w próbce wiążą się z pierwszym lub z drugim epitopem. Procedury te można powtarzać z dowolną ilością polipeptydów zawieraj ących epitopy typowo swoiste i/lub epitopy swoiste dla wiązki typów.
Na ogół, próba immunologiczna na obecność przeciwciał anty-HCV polega na selekcji i przygotowaniu badanej próbki podejrzanej o obecność przeciwciał, takiej jak próbka biologiczna, inkubacji tej próbki z epitopem typowo swoistym lub z epitopem swoistym dla wiązki typów w warunkach pozwalających na powstawanie kompleksów antygen-przeciwciało i wykryciu powstania takich kompleksów. Odpowiednie warunki inkubacji są znane z piśmiennictwa. Próbę immunologiczną można bez ograniczeń prowadzić w formacie heterogennym albo homogennym, może to być typ standardowy lub kompetytywny.
W formacie heterogennym wiąże się epitop typowo swoisty albo epitop swoisty dla wiązki typów ze stałym podłożem w celu ułatwienia oddzielenia próbki od polipeptydu po inkubacji. Przykłady stałych podłoży, które można użyć obejmują ale nie ograniczają się do nitrocelulozy (np. w formie błony albo ścianki wgłębienia w płytce do mikromianowania), polichlorku winylu (np. w formie arkuszy albo ścianki wgłębienia w płytce do mikromianowania), lateksu polistyrenowego (np. w formie perełek albo płytek do mikromianowania, fluorku poliwinylidyny znanego pod nazwą ImmulonR), bibuły dwuazowanej, błon nylonowych, perełek aktywowanych i perełek Proteiny A. W formacie heterogennym można np. stosować płytki do mikromianowania Dynatech ImmulonR 1 albo Immulon 2 albo perełki polistyrenowe o średnicy 0,25 cala (Precision Plastic Bali). Stałe podłoże zawierające typowo swoisty epitop albo epitop swoisty dla wiązki typów zazwyczaj przemywa się po oddzieleniu go od badanej próbki a przed detekcją związanych przeciwciał. Formaty standardowe i kompetytywne są znane w piśmiennictwie.
W formacie homogennym, badaną próbkę inkubuje się z typowo swoistym epitopem albo z epitopem swoistym dla wiązki typów w roztworze. Przykładowo, próbę prowadzi się w warunkach, w których zachodzi precypitacja utworzonych kompleksów antygen-przeciwciało. Zarówno formaty standardowe jak i kompetytywne tych prób są znane w stanie techniki.
W formacie standardowym wykonuje się bezpośredni pomiar ilości przeciwciał HCV tworzących kompleks z epitopem typowo swoistym albo z epitopem swoistym dla wiązki typów. Można tego dokonać przez oznaczenie zdolności wiązania znakowanych anty-ksenogenicznych (np. anty-ludzkich) przeciwciał rozpoznających epitop na przeciwciałach anty-HCV w wyniku powstawania kompleksu. W formacie kompetytywnym, ilość przeciwciał obecnych w próbce oznacza się pośrednio, przez monitorowanie wpływu współzawodnictwa na wiązanie znanej ilości znakowanego przeciwciała (lub innego kompetytywnego ligandu) w tym kompleksie.
175 360
W teście inhibicyjnym oznacza się zdolność przeciwciał do wiązania się z polipeptydami zawierającymi różne epitopy typowo swoiste lub epitopy swoiste dla wiązki typów. Przeciwciała te najpierw kontaktuje się z polipeptydami zawierającymi epitop (epitopy) dla jednego typu lub wiązki typów HCV i następnie z polipeptydami zawierającymi epitop (epitopy) dla innego typu lub wiązki typów HCV. Procedurę tę można powtórzyć dla dodatkowych typów lub wiązki typów HCV.
Utworzone kompleksy zawierające przeciwciało ant-HCV (albo w przypadku próby kompetytywnej, pewną ilość przeciwciała współzawodniczącego) wykrywa się jedną z wielu znanych technik, zależnie od formatu. Przykładowo, nieznakowane przeciwciała HCV w kompleksie można wykryć stosując koniugat antyksenogenicznej Ig skompleksowanej ze znacznikiem (np. znacznikiem enzymatycznym).
W typowych próbach immunologicznych, badaną próbkę, na ogół próbkę biologiczną, inkubuje się z polipeptydami zawierającymi jeden lub większą ilość epitopów typowo swoistych albo epitopów swoistych dla wiązki typów w warunkach pozwalających na powstawanie kompleksów antygen-przeciwciało. Można stosować różne formaty. Przykładowo, można zastosować technikę kanapkową, w której przeciwciało związane ze stałym podłożem inkubuje się z badaną próbką, następnie podłoże przemywa się, inkubuje się z drugim znakowanym przeciwciałem przeciw badanemu typowi i powtórnie przemywa się nośnik. Badany typ wirusa wykrywa się oznaczając, czy to drugie przeciwciało wiąże się z podłożem. W formacie kompetytywnym, który może być heterogenny lub homogenny, badaną próbkę zazwyczaj inkubuje się z przeciwciałem oraz bądź kolejno bądź jednocześnie, ze znaczonym antygenem konkurencyjnym. Te i inne formaty są znane w technice.
Przeciwciała skierowane przeciw epitopom typowo swoistym albo epitopom swoistym dla wiązki typów można użyć w próbach immunologicznych do wykrywania antygenów wirusowych u pacjentów zakażonych wirusem zapalenia wątroby NANBH i u zakażonych dawców krwi. Ponadto, przeciwciała te mogą być szczególnie użyteczne do wykrywania dawców i pacjentów z ostrą fazą choroby.
W próbie immunologicznej można stosować np. przeciwciało monoklonalne skierowane przeciw epitopowi typowo swoistemu albo epitopowi swoistemu wobec wiązki typów, kombinację przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciw epitopom jednego antygenu wirusowego, monoklonalne przeciwciała skierowane przeciw epitopom różnych antygenów wirusowych, przeciwciała poliklonalne skierowane przeciw temu samemu antygenowi wirusowemu albo przeciwciała poliklonalne skierowane przeciw różnym antygenom wirusowym. Procedury postępowania mogą być oparte np. na zasadzie kompetycji albo na reakcji bezpośredniej lub na technikach kanapkowych. W próbach tych można stosować podłoża stałe albo wykorzystywać immunoprecypitację. W większości prób stosuje się znaczone przeciwciało albo znaczony polipeptyd. Jako znaczniki stosuje się znaczniki enzymatyczne, fluorescencyjne, chemiluminescencyjne, radioaktywne albo cząsteczki barwnika. Znane są również techniki, w których amplifikuje się sygnały wysyłane przez sondę. Przykładami takich technik są te, w których stosuje się biotynę i awidynę, próby immunologiczne z użyciem znaczonego enzymu i pośrednie, takie jak ELISA.
Cząsteczkę kwasu nukleinowego według wynalazku koduje sekwencje reszt aminokwasowych opisanych powyżej epitopów typowo swoistych i epitopów swoistych dla wiązki typów. Te cząsteczki kwasu nukleinowego są użyteczne także jako sondy, np. w próbach hybrydyzacji Southerna albo w innych technikach identyfikacji DNA, takich jak próba wychwytywania ujawniona w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4.868.105 i 5.124.246.
Badania nad mapowaniem antygenowym metodą ekspresji cDNA HCV wykazały, że wiele klonów zawierających te cDNA wytwarzało polipeptydy reagujące immunologicznie z surowicą pochodzącą od osobników wykazujących obecność NSNBH. Żaden pojedynczy polipeptyd nie był reaktywny immunologicznie ze wszystkimi surowicami. Pięć z tych polipeptydów wykazywało wysoką reaktywność immunologiczną z przeciwciałami przeciw epitopom HCV w tych polipeptydach, które to przeciwciała wykrywano w wielu różnych surowicach od
175 360 pacjentów, chociaż nie zachodziło całkowite nakładanie się podczas detekcji. Tak więc, wyniki badania immunogeniczności polipeptydów kodowanych w różnych klonach świadczą o tym, że w skutecznych systemach wykrywania zakażenia HCV można stosować panele epitopów. Epitopy w takim panelu można konstruować w formie jednego albo wielu polipeptydów. Testy na obecność różnych epitopów mogą być sekwencyjne albo jednoczesne.
Cząsteczki kwasu nukleinowego komplementarne do sekwencji kwasu nukleinowego flankują regiony kodujące epitopy typowo swoiste i epitopy swoiste dla wiązki typów. Takie cząsteczki kwasu nukleinowego są potrzebne do prowadzenia enzymatycznej reakcji amplifikacji, PCR, w której oznacza się genotyp konkretnego HCV.
Należy zwrócić uwagę na obecność regionów zmiennych i hiperzmiennych w genomie HCV. Zakłada się, że homologia w tych regionach będzie znacznie mniejsza od homologii w całym genomie.
Techniki oznaczania homologii sekwencji kwasu nukleinowego i aminokwasowych są znane w stanie techniki. Przykładowo, można bezpośrednio oznaczyć sekwencję aminokwasową i porównać ją z sekwencjami według wynalazku. Alternatywnie, można oznaczyć (zwykle poprzez pośredni cDNA) sekwencję nukleotydową materiału genomowego przypuszczalnego typu wirusa HCV, następnie oznaczyć kodowaną przez nią sekwencję aminokwasową i porównać odpowiednie regiony.
Przykład I
Porównanie głównych epitopów wielu różnych typów HCV
Porównano homologię reszt aminokwasowych występującą między różnymi typami i podtypami HCV dla różnych regionów. Podtyp HCV jest taki, jak opisany metodą analizy filogenetycznej Simmonds’a. Numery sekwencji aminokwasowej odpowiadają numerom opisanym dla prototypowej sekwencji HCV-1 (Choo i wsp.). Tabela 2 przedstawia homologię reszt aminokwasowych wyrażoną w procentach dla epitopów typowo swoistych i epitopów swoistych dla wiązki typów regionu NS4 i dla konserwatywnego głównego epitopu. Tabela 3 przedstawia homologię reszt aminokwasowych pomiędzy dwoma epitopami typowo swoistymi albo epitopami swoistymi dla wiązki typów regionu NS5. Tabela 4 przedstawia homologię reszt aminokwasowych wyrażoną w procentach dla konserwatywnych głównych epitopów i epitopów typowo swoistych z regionu rdzeniowego.
Tabela 2
Homologie aminokwasowe (w%) między różnymi podtypami HCV
Podtyp Przykłady Główne epitopy Główny epitop
HCV skrótów typów typowo swoiste regionu NS4 (1689-1718 aa)* konserwatywny regionu NS4 (1910-1936 aa) *
la HCV-1 (1a)/(1a) 100 % 100 %
1b HCV-J (1a)/(1b) 83 % 100 %
2a HCV-J6 (1a)/(2a) 47 % 93 %
2b HCV-J8 (1a)/(2b) 43 % 93 %
175 360
Tabela 3
Homologie aminokwasowe (w%) między różnymi podtypami HCV
Podtyp HCV Przykłady skrótów typów Główne epitopy typowo swoiste regionu NS5 (22Β1-2313 aa)* Główny epitop konserwatywny regionu NS4 (2673-2707 aa)*
la HCV-1 (1a)/(1a) 100 % 100 %
1b HCV-J (1a)/(1b) 76 % 89 %
2a HCV-J6 (1a)/(2a) . 70 % 83 %
2b HCV-J8 (1a)/(2b) 73 % 83 %
3a HCV-E-bl (1a)/(3a) 77
3b HCV-Tb (1a) / (3b) 83 %
Tabela 4
Homologie reszt aminokwasowych (w%) między różnymi podtypami HCV
Podtyp HCV Przykłady skrótów typów Konserwatywne główne epitopy regionu rdzeniowego (10-45 aa)* Główne epitopy typowo-swoiste regionu rdzeniowego (67-84 aa)*
la HCV-1 (1a)/(1a) 100 % 100 %
1b HCV-J (1a)/(1b) 98 % 100 %
2a HCV-J6 (1a)/(2a) 98 % 61 %
2b HCV-J8 (1a)/(2b) 98 % 61 %
3a HCV-E-b1 (1a)/(3a) 93 % 89 %
4 HCV-EG-21 (1a)/(4) 98 % 83 %
Przykład II
Synteza peptydów
Zsyntetyzowano dwa zestawy polipeptydów. Pierwszy zestaw zaprojektowano w celu przeprowadzenia mapowania epitopów HCV-1 a drugi zestaw zaprojektowano tak, aby mógł służyć do oznaczeń, które epitopy zidentyfikowane w badaniach nad mapowaniem epitopów są epitopami typowo swoistymi. W pierwszym zestawie polipeptydów zsyntetyzowano techniką Mimotopes 64 zestawy (oraz duplikaty) częściowo nakładających się oktapeptydów obejmujące całą poliproteinę HCV-1 (3011 reszt aminokwasowych).
175 360
Drugi zestaw polipeptydów przygotowano sposobem opisanym przez Geysen'a (J. Trop. Med. Pub. Health, 21,523 - 533,1990) i Merrifield’a (J. Am. Chem. Soc. 85,2149 - 2154,1963).
W tym drugim zestawie polipeptydów, do syntezy epitopu typowo swoistego wyselekcjonowano cztery regiony antygenowe reprezentujące główne epitopy niekonserwatywnych sekwencji w HCV-1 z rdzenia, z regionów NS4, NS5 i odpowiednich sekwencji z podtypów HCV-1b, 2a, 3a i 4. Sekwencję z rdzenia wyselekcjonowano z mniej konserwatywnego regionu reszt aminokwasowych 67 - 88. Sekwencję z regionu NS4 wyselekcjonowano z reszt aminokwasowych 1689-1718. Sekwencje z regionu NS5 wyselekcjonowano z reszt aminokwasowych 2281-2313 i 2673-2707.
Przykład III
Próbki biologiczne
W celu oznaczenia efektywności polipeptydów pod względem rozróżniania poszczególnych przeciwciał swoistych wobec różnych typów HCV, zebrano surowice od 24 zakażonych chronicznie wirusem NANBH z różnych obszarów świata, w tym ze wschodniego i zachodniego wybrzeża Stanów Zjednoczonych, z Japonii, krajów Europy Zachodniej, krajów Europy Południowej i Południowej Afryki. Izolację wirusowego RNA, syntezę cDNA, reakcje amplifikacji PCR, sekwencjonowanie DNA i hybrydyzację z sondami oligonukleotydowymi prowadzono w sposób opisany przez Cha i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 7144 - 7148, 1992.
Przykład IV
Procedury mapowania epitopu
W celu określenia, które regiony HCV zawierają epitopy bądź grupowo dwoiste bądź konserwatywne, poddano mapowaniu całą poliproteinę HCV-1. Zastosowany sposób w zasadzie odpowiada schematowi przedstawionemu na fig. 2.
Zsyntetyzowano techniką Mimotopes 64 zestawy (oraz duplikaty) częściowo pokrywających się oktapeptydów w oparciu o całą poliproteinę HCV-1 (3011 aminokwasów). Do mapowania epitopów i analizy epitopów swoistych dla wiązki typów wyselekcjonowano panel 40 próbek, z których 25 było próbkami reaktywnego przeciwciała HCV ze Stanów Zjednoczonych, 9 próbek zawierających reaktywny HCV pochodziło z Japonii a 6 próbek, były to próbki nie zawierające HCV, stanowiące kontrolę negatywną. Próby immunologiczne wykonywano standardową techniką ELISA.
Kryteria identyfikacji głównych epitopów oparto na częstości reakcji przeciwciała i intensywności reakcji przeciwciała (miano) przeciw tym epitopom. Wyniki są przedstawione na fig. 3 i 4.
Przykład V
Enzymatyczna próba immunologiczna peptydo-pochodna (peptydo-pochodna technika ELISA).
W celu ustalenia optymalnej próby immunologicznej, w której byłyby użyte polipeptydy opisane w przykładzie II, przeprowadzono dwa oddzielne typy peptydo-pochodnej próby ELISA i porównano wyniki. Pierwszym typem próby ELISA był Nunc MaxiSorb™ polegający na prostej adsorpcji peptydów. W drugim typie użyto zestaw Nunc Covalinc NH™. W tym teście polipeptydy były wiązane kowalencyjnie. Tworzenie wiązań amidowych między kwasami karboksylowymi a aminami inicjowano przez dodanie karbodiimidu. W celu zmniejszenia hydrolizy, można wytworzyć aktywny ester, dodając do powyższej mieszaniny koniugacyjnej N-hydroksy-sulcynimidu (NhS).
W pierwszym typie próby ELISA przygotowywano płytki do mikromianowania następująco: Polipeptydy umieszczano w dołkach płytek do mikromianowania Nunc MaxiSorbT w stężeniu 1 μg/dołek w 100 gl soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS). Polipeptydy pozostawiono do absorpcji przez dobę w temperaturze pokojowej. Następnie płytki przemywano cztery razy roztworem pBs bez detergenta, po czym dołki pokrywano ilością 220 gl odczynnika SuperblockR (Pierce) przez godzinę, następnie zasysano bez dalszego przemywania i suszono pod zmniejszonym ciśnieniem.
175 360
Oznaczenie prowadzono w sposób następujący: próbkę surowicy o objętości 5 gl nanoszono do dołków z dodatkiem 100 gl 5% odtłuszczonego mleka i inkubowano przez godzinę w temperaturze 37°C. Następnie dołki przemywano 5 razy w roztworze PBS z dodatkiem 0,05% Tween'u. W celu oznaczenia stopnia wiązania ludzkich przeciwciał do polipeptydów zastosowano koniugat charakteryzujący się powinowactwem oczyszczonej IgG koziej anty-ludzkiej znakowanej peroksydazą chrzanu (Jackson Laboratories). Koniugat ten uprzednio rozcieńczano do stężenia IgG wynoszącego 5% w 150 mM NaCl, PBS, 5% surowicy końskiej (denaturowanej ciepłem). Ilości po 100 gl tego koniugatu umieszczano w dołkach i inkubowano przez godzinę w temperaturze 37°C. Następnie dołki przemywano 5 razy roztworem PBS/Tween z dodatkiem OPD [dwuohlorowoUorku orto-fenyleno-diaminy w ilości jedną tabletkę na bufor wywołujący (0,02% roztwór H2O2 buforowany buforem oytryniankwo-fosforanowym, Sigma] przez 30 minut w temperaturze pokojowej, po czym oznaczano przeciwciała przy 492 nm i 620 nm. Odcięcie oznaczano na podstawie 200 losowych (normalnych) próbek, gdzie 7 odchyleń standardowych od średniej wynosiło około 0,45.
Płytki do minromianowania dla drugiego typu oznaczeń techniką ELISA przygotowano następująco. Polipeptydy umieszczano w dołkach płytek do mikromianowania MaxiSorb w stężeniu 10 mg/dołek w 50 gl wody. Do tych polipeptydów dodano 25 gl 0,1 M odczynnika NHS (sulfo-N-hedroksy-sukcynlmid, Pierce) i 25 gl 0,1 M EDC [1-etylo-3-(3-dimetyloaminoaropylokαrbodilmid, Sigma] i mieszano w temperaturze pokojowej w czasie 30 minut na tacy wahliwej. Następnie, całą zawartość dodano do 52 ml schłodzonego lodem 0,1 M roztworu węglanu sodowego o wartości pH = 8,6. Ilość 100 gl tej mieszaniny stosowano do pokrywania dołków w płytkach do mlnromianowania i następnie inkubowano w temperaturze 4°C w czasie 30 minut. Płytki przemywano 4 razy roztworem o składzie: PBS/0,1%, Triton Χ-100. Płytki te traktowano odczynnikiem o nazwie Suaerblook i dalej prowadzono próbę w sposób podany powyżej.
Uzyskane wyniki są przedstawione w tabelach 5 -14.
Przykład VI
Test inhibicyjny
Testy inhibicyjne przeprowadzono w celu stwierdzenia, czy badane peptydy mogą między sobą współzawodniczyć o wiązanie z przeciwciałami. Zsyntetyzowano trzy zestawy krótkich akliρeatyUów z regionów rdzeniowych NS4 i NS5 różnych typów sekwencji HCV. Polipeptydy te pokrywają regiony sekwencji aminokwasowych od 1689 do 1696, od 1696 do 1702 i od 1711 do 1917. Testy inhibicji' prowadzono dodając do próbki 10 gg powyższych polipeptydów i inkubując próbki w temperaturze 37°C w czasie godziny, po czym prowadzono oznaczenie techniką ELISA, jak opisano powyżej. W przypadkach, kiedy hamowanie wiązania przeciwciała wynosiło powyżej 50%, uznawano, że polipeptyd ma działanie hamujące.
Wyniki są przedstawione w tabeli 15.
Przykład VII
Klasyfikowanie HCV w próbce klinicznej
Epitopy typowo swoiste lub swoiste dla wiązki typów przedstawione w tabeli 16, powyżej, użyto w próbie ELISA opisanej w przykładzie V do badania 13 próbek klinicznych pochodzących od pacjentów z zapaleniem wątroby nie-A, nie-B (10 płatnych dawców, 3 pacjentów z nabytym przez transfuzję zapaleniem wątroby nie-A, nie-B). W tabeli 17 przedstawione są wyniki tych prób. W każdej próbce klinicznej oznaczano reaktywność z dwunastoma różnymi peptydami odpowiadającymi podanym regionom (aa 67 - 84, 1689 - 1718 lub 2281 - 2313) reprezentującym różne epitopy typowo swoiste lub swoiste względem wiązki typów. Każda próbka daje z danym charakterystycznym dla typu peptydem następującą odpowiedź: brak reakcji (NR), słaba reakcja (WR) albo reakcja (R). Wyniki tej próby określają genotyp HCV dla każdej próbki, korelujący z genotypem HCV oznaczonym w łańcuchowej reakcji z udziałem polimerazy, PCR, podanym w kolumnie po prawej stronie.
175 360 a
s χ
τ>
ο
Φ β
•Ν φ
ι—I (β
Μ
S
X
Ω
X σ
X υ
Μ χ
Μ
Ω
X
W
X
S
Ω >
>
U χ
X ο
(0 α
s
4-1
X ο
S β
•ο
Ui
Ό
Λ
Ο
X
-Η a
Φ co
Ο a
s
4J
Ο
Ui
Φ
Ul (0 Ν •Η ι—1 ίθ G
Ν
0)
-η □
C φ
X
Φ
U1 >
ο
ΌΧ x cu as
X rH
Ρ» rH ι
σι χ
ko
ΗΌ
-S
X ’Φ a<
X UJH 2ΧΧ ιη λ
•Η
-π
U β
CD
X ΦΩ co I-I β (0 ΟΧ -ΗΧ tno Φ Ui XX
Μ
X
Ο a
Μ
Μ <
X
X ο
χ
Μ S X Ω X ο υΐ υ χ w 2 Μ Ω X Η X S Ω > X X Ω X I—I Μ < X X ο χ
Μ χ
χ
X
X <
υ
X
X
X
Ω
X σ
S χ
>
X
X
Ω
X
Η >
X
X ο
X
X υ
χ
X
X
Ω
X
X
S
Ω >
X
X
Ω
X
CC s
Ω >1-1
X xx
Ω
X
Λ
CM — (0 (TT CM rH
PDREVLY K I to χ ιϋ rH rl (Μ
Ο rH (Μ rH rH rH
I I I
CM CM CM
Ο Ο Ο
Μ* Μ* a a a υ υ ο
Λ cm rH i
CM
O
M· a
o ιίΛΊβ-Λ rHrHCMCM
OrHCMm rH rH rH rH I I I I IM CM (MCM OOOO aaaa oooo < · X X l-H CM Ω · X -H
O cO O CM rH u Ό. X O rH ca c0
-rH
I.
X co
-rH o
s ra
I
O
O a
s
X cOX c0X rH HCMCM
OHCHH rH rH rH rH i i l i CM CM CM CM OOOO aaaa uuou <
X l-H
Ω
X o
o rH
Ό
O co cO rH
Ό a
s jj (0 i—I
X
X o
s β
X co
X a
•H 3 ΧΌ X U •O S Ul (0 ΧΌ
H|C0H<rl
SCMHOJH1 o · · ·
OM* kOkOn
CO
Ό
X o
s β
.u (0
X a
ko
HO
Xm<
•om
ΧΩ
XJ •rd ε
CO a
o x
C- -rl χ a • φ kO
Ή
f.
X •rH r—I
O a
co
O a
N (0 -I—I O X CO Φ X
Ή ε (0 a 0 x
•H ΟΧΟΗ1
a C-CO CM O
OJ N Ή X X Ό Ui a (0 -i—1 m r- <oco
O σ\
X <0 ω co rH O
co
Φ
X
1
M Hd τί* CO
•rl ε
(0 a
o
X
X -H 'j* a • φ kO •H ε
s
X
O a
en
O a
N
CO -i—i U X (0 Φ X
175 360
Tabelaó. Analiza serotypowa epitopów w różnych typach HCV
175 360
Tabela7 . Analiza serotypowa epitopów w różnych typach
175 360
H
H a
>
Tabela 8, Analiza serotypowa epitopów w różnych typach HCV
Ó4 >·.
U)
Ό
O (U c
•N ω
I—I t0 N ω
•η
O fi
CU (U cn a> uu Ό fi
UOO a fi α ω >,
Ol N4J •O
U
CC
Ό
Jfi
O >1 fi
Jj c0 fil a
Ό
O
K
CQ o
rCN i
n r·
CD
CN tn cn s
o c
0)
2·Η
4444
Φ43 ra-o fi c a o
-fi CQ tTifi ω a C4 o >,
X3
O fi .U
W
CU •H fi (U r—ł
CC a
CC
N
CU fi
N
U
-fi fi
O i-c
4Ż o
o cn w
Ό
U a
cu a
O O cn cn s s u o C4 C4 C4 Di >4 >1
O O U U s s w o o o
Di t4 cn cn
2;
H fil a a O O O o > M >C fil
Di Di ω w
H fil
E* fil cn cn S4 Di cc
Ν'
I
CN
O
Ν' a
o σι n
H |J >
0 cn cn g
U 0 Di Di Di Di >4 >4
0 U 0 H cn o o 0 0 t4 a cn cn 25 21 a a 0 0 0 0 > >
><
fil fil
Di Di w a
H fil
H fil l-Η I-I cn cn K cn a
fil >
a| in
I
CN
O
N* a
o in t
m n
Ν'
CD i—I.—om
I CN
N—
CD
0 cn cn
S 2
0 Di Di Di Di >4 >4
0 O 0 σ o 0 0 « a w cn
H a
a a 0 0 0 0 > o fil fil
Di Di a a
H fil w cn K cn M I-I c0 a a cn n CN co σ
I I
CN CN O O Ν' a
U
CN
CD
Γι
CN O
Ν' Ν' a a o o
CD m
n co m
CD i
CN
O
N· a
O in cn
H a
a cn cn
2:
I fi
O
Ν'
CU u
a o
fi a
•n *— cu ra a
XJ fi 4—I ra a a
CN n CN
CU
-H a
o •U
-fi a
(U
I—I (U fi N O >4
r) >4 fi
O fi cu (U ra co fi (0 •fi ε
N
Ν' i
CN
O
Ν' in
I
CN
O
Ν'
CD i
CN
O
Ν' a
u σ
I
CN
O
Ν' a
o
Γι
CN
O
Ν' a
o co n
co i
CN o
Ν' a
u co
CN
CD
CD co
CN rN* n
N*
CN
CN
LD σ
in-— cn ra a== a
CN ra-H i-l N —Ό (U rfj-fi cn 2 m o a a wo o m 2 cn
2: ra i fi Li O •fi fi (U •fi ε
N •o (U fi
N
U >4
r) tfi >,<U ra i-i O •44a Ν' Ό •fi i-l •na
U
C-n (U (U 2 j-i 44 (U 2 ra fi ra a fi o ra η •H-H ε a
N (U
175 360
175 360
Φ β
X u
<0
Ui φ
ra fi
O
Λί
X3
CN
Φ
CN
Λ r-l
Φ r-l
OlN*CU -3* OcoS — 4J i Cu Cu|
Ολου w—cu
Φ β
X
4-1
Φ
Ο
Φ ra βοώ ΛίΗ Γ* ΧΗ Οι' Οσι 4-1 C0 HUO ΟιΗ Η —
Λ r-i
Φ r-l
X (4 >
ω
Oi
Q
CU η
CN
Φ
CN
Tabela 10 . Zestawienie głównych typowo swoistych epitopów w częśch rdzeniowee i w regionach NSh i NS5
Φ n
I >
U
SC
XI
CN
I >
u
SC
Φ u
ra O«|O -H <ule SSS Hcalcal oi «Ιοί UUU HHW cucakai
I I I
O.
X i-icnX3 η 3 Ή Ή i-4
Ο ra
Ο ο
QiN< φ Φ Φ OoOr-iCNn 4—1111! -Η > > > Ολουυυ W— ΚΖΚ
Φ β 3 X 4J Φ 5 Ο Φ ra β - Ο Χϋ 3
Ο X -η α β ο
Φ 4-3 Ν·Η
τ) α ο φ χ
> υ υ— >Η ί—I I Ο> UU USC υ—
CU
PuU «►ο >0i
-QCU β Φΐηαυ Ο β^ΛΡί Η 5 ι oi Oi tnomtó α ΦγΜ r-l Z >J C4O—Ε-> J
Φ
4-1 ω
-Η
Ο ra
Ο
Ο
Οι—
Χοο
4-1 r-i ΓΧΗ α < Οσι 4JOO •Γ-ινο ΟιΗ Μ' φ
β
X
4J (0 ί-ι
Φ ra β
Ο
Λί
X
Οι
Ο
4J — •'ł-i-iin ca on Ζ Φσ> r4 β Φ I Ο βιη rlSfM εηοσι
ΦγΜΗ tóU'—
X X cu cu ο cal ca <[ u u e
i—i I >
Λ rH ł
>
u u ffi SC
-r-i
Φ
CN
I >
u
SC >
u
SC >
X
SC
E-1
CU £'
SC z
u oi uu
OJI s >>S MKCUI U E->E->I>|CU <|cu cu j CU CU Je mecie o XXO1CU|
Φ
4-1 w
•ri o . . _
Ol Q0W sci ra WOICU1CU Cu
X Q CU
CU o 3 o
Οι—X3 Χ-Ί Η 4-3 r-i η-Η XCN Οι I Φ
CUI
Cu λ
CN
E-1
CM* I
J >
U, ca φ CN
ΦΧ) ΦΛ u
oi oi x
u u
Ο i—i r-i CN CN r-i r-i
4-1 CO I -ri CN >
I I I I >>>>
onu uuuu H—SC KKSK
Φ β
X
4-1
Φ
Ui
Φ ra β— mOM* ca a cn Z CN
XmZ β Οι i X O OcoQ -ri 4-1 CO Ol (7>HCN Oi φ one «W—S
Φ β
X
4J
Φ
O
E-i
H
Cu|+
I u
oi oi x
u u
cal ei u
«I o
«I φ
CN
ΦΧ3 X3 r-i r-ι n I I I >> > UU U SCSC SC
E-i EJ >
U φ ca m e β—κ oxu XO0i
XCNX Ol I U OnU
4J r- z E-«( cal -ri CD W O) Ol onu ω— Οί«| S4|
175 360
Tabela 11. Analiza serotypowa epitopów z różnych typów sekwencji HCV (I) z próbek clironicznego zapalenia wątroby NANBH od płatnych dawców. Region sekwencji: rdzeń (67-84) υ
jo σ:
N
O
Ź o
rr <D o* i
o co >
I £
s-z
Ό a?
o.
OJ
CL
O o
ω
X3 cl u
CL s
co
-D SO u·
CL o
to
Om Om 0« 0« S S 2 2 CU CU O« CU > > > Cu o o o o
CU O« O· CU
0^00 < o <c < X S X H w co to a x α a o o o o ω η ta ω cu co co co
CU s
CU Cł, >
O
CU
o.
o
M-J
W
Λ (Z
Λ a
a x
e: κ c: a >v c
O σ cu o
< o < < *
2 2 2 2
H CO co co
a X <X Λ
o u u o
ta H u u
cu CO co co «
ee
O αα«
A <5 < < «
2 2 2 2
H co co co
<X X a tz
O o o o
w H ω ta
Om co co co «
J3 J2 Si Si Λ Si 1 Λ O
«4 CM CM I CM CM m4 CM
UJ Uf —— UJ UJ —* CM UJ UJ UJ UJ
«} <C «0 —« « <0 i0 — <0 <0 «0 —* <X3 <Q ra —
»4 CM co tt •4-CM ci tt <£ t4 CM m tt < t4 CM co TT
*·***·* *-*» «·—< —* *-*co *—* •mm* «•Μ· Ί—· CO MT ·«-*’ >—
Ή CM t* tn ł-U CM tt tn w ^4 CM tt tn w »4 CM tt tn
O o O O O O o o u O O O O J O O O O
1 I 1 i 1 1 i i ta 1 1 1 1 ta 1 1 1 (
*4 ł-H ^4 «4 »4 ^4 *4 *4 ^4 *4 .4 ^4 »4
o o O o O o O O CM O O O o CM O O O o
47 TT ττ ’Τ tt tt TT TT CM 47 TT TT TT CM TT TT 4“
CU Cu CU CU cl cl cl c. u .Cm a Om CU O CU CU CU CU
□ υ □ U υ o υ o ui XJ υ ϋ υ Uf □ υ U 0
Cl \D σ' Ό ·“· θ' Ul r- © cm co σ' tn o σ'
CM LD O rtt ΓO O r- r- r* tO \D O c*
to Cl
o Cl
Γ* TT
Γ- e
«4 .4 kO
o O σ' Μ-»
I (C 1 Si Ό O
TT <4 TT CM \D CM
CC CD T- σ' —r
.23 rC22 ELISA (2-120 aa) tO
175 360
Tabela 12, Analiza serotypowa epitopów z różnych typów sekwencji HCV (I) z próbek chronicznego zapalenia wątroby NANBH od płatnych dawców. Region sekwencji: NS5 (2281-2313)
O o X X ££ CL CL
CL
Cd
Q
CL
SC
SC s
CL >
O CL Q SC s w Cd Cd > J J J J CL CL CL
U O < J > > E« < CL CL CL O Cd > > Q U CL CL CC CC SC SC S 3: tO E-t Cd Cd >
U <
>
<
CL θ' >
a
CL >
•a o
—
N
I-I < CL
CL CL CL G, CL CL ł-»
Ό
O
S->
•a
JO
N
-_ (0 r*4 - ~ - _l_L. ___ to
10 X3 « X3 <0 32 <0 -Ω *—*
T—1 r-( CN CN < η π η n <
>—* * ·*—* w w
o *-ł CN n I-I O Η μ n M
o O O O J OOOO J
1 1 1 1 Cd 1 t 1 1 Cd
(N CN CN CN in n n n <m in
o O O O w OOOO ω
’Τ •<y 2 V TJ· TT TT 2
a a- a CL 1 CL CL CL CL l
u u υ υ Li U U U U Li
cn p* o P* r-1 P* cn CN CN
in in r-ł VD TT σ» t?
• • • • • • • • • •
ł“{ O in cn o m O O
q u
co <
Ξ <0
CN cn
CO p* p*» ι-H
O i
rr
CO
CN
Ό
U.
dj
175 360
Tabela 13. Analiza serotypowa epitopów z różnych typów sekwencji HCV (I) z próbek chronicznego zapalenia wątroby NANBH odpłatnych dawców. Region sekwencji: NS5 (2281-2313)
c.
2?
-R ja ee
N υ
<Z)
O o
□o
-o
2?
cu o
CU
ω w ω κ > _) J w J J XJ J CU 0« Ol > CU CU Ol Ol
CX Ol Ol Ol < Ol Ol CU &L Ol fci U.
<0 JO ίο xł
ł-X «—< cn cn
X—· x—*
O o o o
< J
źź > > Ε- E-
& CU < CU
Ol Ol CU CU
Cd > o Cd
X X X X
Q O o o
Ol CU 0. 0-
<0 X2 <α\Ω Π3 X! (O X2
Η Η (\ (M < «Η »—1 (N (M
L_. CO —
O «-( (N (-> I-I O —H (N n
o o o o J O o O O
1 1 1 1 ω 1 1 1 1
Μ (N t\ TJ tn OJ <N <N fM
O O O O CO O o O O
'Τ TT TT TT 2 Ό- TT <3· Ό-
CU CU CU CU 1 CU CU α CU
U U U U Ci υ u u u
CO cn o P* ND TT CO (N o
CN tn TT ΓΊ n m o
• • • • • • • • «
Γ·* k0 o o kO kO ”T tn in
τ Ή
XJ CN
r-ł τ-ł
x-* O
tn tn
U CN
< U.
2: U
X
Q
Ol <
Epitopy typowo nieswoiste (konserwatywne
175 360
Tabela 14. Analiza serotypowa epitopów z różnych typów sekwencji HCV (I) z próbek chronicznego zapalenia wątroby NANBH odpłatnych dawców. Region sekwencji: NS5 (2281-2313) >
>
i
I ί
I i
i ►
O-* Z—w —* * o—«. .._u
(3 ΰ fl J3 (0 Ω
Η Η Γ4 (N W rM
0 0 0 0 0000 0 0 0
2 2 < Ω 2 2 < Ω * •ł- «ł* <
££££ ££££* ξξ > E
X Cl. < CU CU CM < X CU X <
CU CU CU CU CU CU CU Cu X X CU
ω > σ w x > o x * w > o
x x x x x x x x X X X
Ω Ω Ω 0 Ω Ω Ω 0 * Ω Ω Ω
CU CU CU CU CU CU CU &4 X X X
tz Ω X X
tz tz tz tz
2 2 2 2
El W ω Ε
CZ ω ω ω
> Ω > w
Ω Ω Ω Ω
X X X >
X X X X
2 2 2 2
X X X X
Ω Ω Ω Ω
X X X X
X X X X
< < < <
2 2 2 2
W < X
X X X X
Ω Ω Ω Ω
< < <
O! X X X
< X X X
X X X X
o.
o
X -e
o.
o ^4 •
O.
(U .a o
O £
o £
H
10
ζ—ζ- o z*“x z—z—Z—*. Z—
(0 Ω β'ΰ £ 10 Ω (0 Ω tO Ω Ό Ω <
<-Ι ·—1 (Μ (Μ s < rU Ol CM < Η H OJ (N cn
*—* χ-- χ—' g; w — cn * ^Z >^Z M
Ο Η Ν η O Ή (Ν η h O ή cn n Ω
Ο Ο Ο Ο Ω O O o o Ω OOOO X
I I 1 1 Cd 1 t 1 1 X 1111
CN CSJ CN CN ID C4 CN CN CN ID CN CN ΓΝ CN LD
ο ο ο ο w o o o o cn OOOO w
-τ* 2 V ^7 « •'J· 2 ’Γ tt 2
CU CU CU Cu 1 CU CU CU 1 CU CU Ou CU 1
u o U 0 J-l 0 u U U U U 0 U 0 Ui
ο σι o x kO O n LO O ΰ CO tn > Ό cn
Ν 1Π H n σ ’Τ in tn co \o η o n ω
• · · · • •
x co o o kO > in O O LO r- r~ tn o kO
ŁD > z o ~ <ϋ ca <o o
m
E
175 360 <β
CN «Ω CN f0 <0 hj (O <0 <0 & <0 ^CNCN^«HCN«-»fMCN^ p*fxr*CNł*J<*lCOCD τΗι-Η·ΗΓ*^·Κ®® r-r*r*on<*>cN<N ł I I ł t ł t ® ®
CNCNCNcOTT^rHwMf^r* H^HOOOOCOt I r*r*p*®omcN<N«-<*-c
TJ“ z
a o
•ES) υ
¢2
CZ5
Z a
o 'Eb υ
(4 »e *a υ υ N N T3 Ό
CŹ ¢4
ΗΝη^ιηΌΓ-βσ'Ο
OOOOOOOOO^ •H
I t I I I I I t t I zzzzzzzzzz MUMMWWMWWW HI I-I HI HI HI HI X HI HI t-1 H H· w· Γ Η TT Γ· Τ Τ'
UGOOUUUOOU
O O
Z < 2 > > 2 α, χ σ
X > {-> > Ł O <
>JJJ£S.<ŁJ22 ^<ί<ωιίσ>£σ*:ο:
zas2axxoaoo
OWWOQQ<CO.HU
W<C<CC.ŁO.Ł.(lWW ω
X)
.........O
H
175 360 δ
fM
Tabela 16. Główne typowo swoisee epioopy HCV w rdzemu i w regioncch NS4 i NS5
Główne eailoey EpRopy typowo Epkojiy konserwatywne nonseIgvatywne sagolito
CD
I r* <0
CM
CU
X
CU >· o
CU
I o
to >4
J w > ω cc *c o
cu
o
5b >
O
O **>
I o> o u O X o — CU
Cu o uc u > oc
Q O. 0*0 O. QC CC CC CC CU Z u H J
O p*
CM
I n
p* kO
CM
RGENCGYRRCRASGVLTT HCV-1a KGAęCGYRRCRASWL P T—HCV-3a _________ *
K QT HCV-1b,2a
K QS HCV-3b 0GQSCGYRRCRASG-FTT·HIC—-2b
175 360
Tabela 17. Serotyp .XLS
GENOTYP 1 1 1 1b 1 CN 1 2 1 2 Cl 1b 20 CN a rc
-O 2b NR g g NR R Z R g g R ź θ' Z NR g NR
2 CN r Z g R Z NR % NR g NR g R N Z g N Z
13 N Z g N £ R Z R £ g g g g NR NR g g
NS5(2281- 2313) 2 R R R g R g g g R R 5 N Z NR NR
CN g g R Z R R g R g g R Z R R Z
2 CN g NR g R R g R g R Z R Z R NR
D NR g g ί R ξ R R NR NR ξ g
PRÓBKA KLINICZNA HCV OCENIAAA WEDŁUG GENOTYPÓW NS4(1689-1718 1 R R Z R R R R N Z R Z R=OD SYGNAŁ > 1,5 OD WR = 1.0 OD <SYGNAŁ < 1,5 OD
TJ- g g g g g g g g g g g ξ g
2 m g g R g g g NR g g g NR g g
2a i 2b g g R g g R g g g g N Z R g
rdzeń (6784aa) 1a i 1b NR R g g g g g g R Z g g θ' Z
PRÓBKA OPIS PRÓBKI NANBHOD PŁATNYCH DAWCÓW FF 25951 96727 <o Γ* Gk I •O* OO 96996 FF 25910 sn -38 oo Τ- Ο 1 ro 2>o cn o tO 00 00 25931 FF 25912 84 017778 CHRONICZNE NANBH PO TRANSFUZJI NAC5 l2 ODCIĘCIE OD=1.0
175 360
175 360
ρ— 4 Μ
S2 φ
•Η •Η
C-H Φ q φ f—1 Ό Φ
·% Ul Φ
'δ Λί X)
κ 0 tn
0 Ή
4J 0
•Ή
η. E
φ •Η
•η U C 0 3 0
ο Φ (X
•Η 3
S? Λί Ul
Ul Φ W
fi >1
0 cu
►: υ 0
ι—( C >1 4J
1 >5 XI •H
ή rM __ CU
2 &» ε 0) Φ
fi .Μ fff
□ <3
& 4J Φ •Η Ν TJ 3 Ul Φ
η •Η 3 X
<u XI PJ Ν £ <0
& Ul § 3 , 0 •Η *> ·»* N Φ Ul
ϋ CT > U 0 Ul 3 0 X) X
φ fi co
·.
S 3 5
3 Ό π. 0
2 cu c
5 >- Χ> 0
(5 +> fi _ •H
2 fi σ> φ
Φ π*> 1 Ul
>1 3+J
C N
•Ν Ό α 3
Ul 0
0
•Η 0 SN
•ΓΊ -oC U)
ϋ CU
C +jC Φ
we cu§ 0) > 1 1 CU
ek 00 N
3 Cn5 Φ
Φ 4J
.qc 1 c
•Η qC >1
C 3 + Λ
równa •MT co s 1
0
cu
1 M
Φ
>1
X)
(3
5
>
N
c
Φ
0
c
3
•H 1
C 0
Ul
Χ33 Φ
‘0 c tn
Ul U
cuz te
u •X
'ΓΊ- c
ΦΧ (8
Cf“ N
TJ <1 0
Φ 3 3
•mit fi
c ! N
Ή 0
c
<c N
w '
rU 3 fi
0
Cd C . >1
_fi
f04- 3
·γΊ·Γ“ X
c c . tn
ia α
5 j N
>tC 3
+J U
>.> 1 S
S4J o
fi *3
O- H Cl
>ir i fi >
5 C >tX
c 3 0
Λ.Χ fi
O-r 3 Φ
UtM- nO
cu> I □
Ul <0·Η
3 Φ Ή
55 Φ 3
Ό Ul Q
3 0 >
φ,- XX»
•H C
c c
(8
33
0
X—
ΦΧ
r-Ct
0-
Ul
Cur- 1
8 Φ
ESI C
Ο
Li_
175 360
3,000 oktapeptydy ł
nośników po 96 szpilek testowanie,w 30 . piytkech z3Drobkami surowicy *
2,993
3,000
FIG. 2
175 360
81428-1
8400
175 360
rs O O o cm
J Τ ι i L i i >
r*~ i co co ło «ό oo oo r? <·Ρ Γ2 M cm c^i to »*5 to to to to
Μ
Miano przeciwciała częstotliwość względna testowane próbki
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.
Cena 6,00 zł

Claims (11)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Cząsteczka kwasu nukleinowego obejmującą sekwencję nukleotydową pochodzącą z genomu wirusa zapalenia wątroby typu C kodująca sekwencję aminokwasową zawierającą epitop typowo swoisty znajdujący się w obrębie regionu rdzeniowego wirusa zapalenia wątroby typu C, znamienna tym, że epitop ten zlokalizowany jest między resztami aminokwasowymi 67 i 84 wirusa zapalenia, wątroby typu C-1 albo homologicznymi regionami innych typów wirusów zapalenia wątroby typu C.
  2. 2. Cząsteczka kwasu nukleinowego obejmującą sekwencję nukleotydową pochodzącą z genomu wirusa zapalenia wątroby typu C kodująca sekwencję aminokwasową zawierającą epitop typowo swoisty znajdujący się w obrębie regionu NS4 wirusa zapalenia wątroby typu C, znamienna tym, że epitop ten zlokalizowany jest pomiędzy resztami aminokwasowymi 1689 i 1718 wirusa zapalenia wątroby typu C-1 albo homologicznymi regionami innych typów wirusów zapalenia wątroby typu C.
  3. 3. Cząsteczka kwasu nukleinowego obejmującą sekwencję nukleotydową pochodzącą z genomu wirusa zapalenia wątroby typu C kodująca sekwencję aminokwasową zawierającą epitop typowo swoisty znajdujący się w obrębie regionu NS5 wirusa zapalenia wątroby typu C, znamienna tym, że epitop ten zlokalizowany jest pomiędzy resztami aminokwasowymi 2281 i 2313 wirusa zapalenia wątroby typu C-1 albo homologicznymi regionami innych typów wirusów zapalenia wątroby typu C.
  4. 4. Kompozycja do wykrywania infekcji wirusa zapalenia wątroby typu C, posiadająca rekombinantową cząsteczkę polinukleotydu kodującą połączenie epitopów typowo swoistych wirusa zapalenia wątroby typu C, znamienna tym, że zawiera połączenie epitopów wybrane z regionu rdzeniowego, niestrukturalnego regionu 4 (NS4), niestrukturalnego regionu 5 (NS5) wirusa zapalenia wątroby typu C.
  5. 5. Kompozycja według zastrz. 4, znamienna tym, że zawiera cząsteczkę polinukleotydu kodującą co najmniej jeden typowo swoisty epitop wybrany z każdego z reginów rdzeniowego, NS4 i NS5 wirusa zapalenia wątroby typu C.
  6. 6. Kompozycja według zastrz. 5, znamienna tym, że wszystkie typowo specyficzne epitopy wirusa zapalenia wątroby typu C są specyficzne dla jednego typu wirusa zapalenia wątroby typu C.
  7. 7. Kompozycja według zastrz. 4, znamienna tym, że cząsteczka polinukleotydu kodująca epitop typowo swoisty regionu rdzeniowego wirusa zapalenia wątroby typu C pochodzi z sekwencji aminokwasowej pokrywającej się z aminokwasami 67-84 wirusa zapalenia wątroby typu C-1, albo homologicznymi regionami innych typów wirusów zapalenia wątroby typu C.
  8. 8. Kompozycja według zastrz. 4, znamienna tym, że cząsteczka polinukleotydu kodująca epitop typowo swoisty regionu NS4 wirusa zapalenia wątroby typu C pochodzi z sekwencji aminokwasowej pokrywającej się z aminokwasami 1689-1718 wirusa zapalenia wątroby typu C-1, albo homologicznymi regionami innych typów wirusów zapalenia wątroby typu C.
  9. 9. Kompozycja według zastrz. 7, znamienna tym, że cząsteczka polinukleotydu kodująca epitop typowo swoisty regionu NS4 wirusa zapalenia wątroby typu C pochodzi z sekwencji aminokwasowej pokrywającej się z aminokwasami 1689-1718 wirusa zapalenia wątroby typu C-1, albo homologicznymi regionami innych typów wirusów zapalenia wątroby typu C.
  10. 10. Kompozycja wedłu g zastrz.. 4, znam iznnatym, że cząsteczkapolinupleotydu kodująca epitop typowo swoisty regionu NS5 wirusa zapalenia wątroby typu C pochodzi z aminokwasowej sekwencji pokrywającej się z aminokwasami 2281-2313 wirusa zapalenia wątroby typu C-1, albo homologicznymi regionami innych typów wirusów zapalenia wątroby typu C.
    175 360
  11. 11. Kompozycja według ztdtrz. 9, znamienna tym, żecząsteczkapolinu kleotydu kodująca epitop typowe swoisty region- NS5 wirusa zapalenia wątroby typ- C pochodzi 9 aminonwasewej sekwencji pokrywającej się 9 aminokwasami 2281-2313 wirusa zapalenia wątroby typu C-1, albo homologicznymi regionami innych typów wirusów zapalenia wątroby typu C.
PL94323367A 1993-05-10 1994-05-09 Cząsteczka kwasu nukleinowego i kompozycja do wykrywania infekcji wirusa zapalenia wątroby typu C PL175360B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US6040093A 1993-05-10 1993-05-10
PCT/US1994/005151 WO1994027153A1 (en) 1993-05-10 1994-05-09 Methods of typing hepatitis c virus and reagents for use therein

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PL175360B1 true PL175360B1 (pl) 1998-12-31

Family

ID=22029220

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL94311653A PL175342B1 (pl) 1993-05-10 1994-05-09 Sposób klasyfikowania jednego lub większej liczby typów wirusa zapalenia wątroby typu C
PL94323367A PL175360B1 (pl) 1993-05-10 1994-05-09 Cząsteczka kwasu nukleinowego i kompozycja do wykrywania infekcji wirusa zapalenia wątroby typu C
PL94323368A PL175338B1 (pl) 1993-05-10 1994-05-09 Polipeptyd i reagent do klasyfikowania jednego lub większej liczby typów wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV)

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL94311653A PL175342B1 (pl) 1993-05-10 1994-05-09 Sposób klasyfikowania jednego lub większej liczby typów wirusa zapalenia wątroby typu C

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL94323368A PL175338B1 (pl) 1993-05-10 1994-05-09 Polipeptyd i reagent do klasyfikowania jednego lub większej liczby typów wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV)

Country Status (19)

Country Link
US (3) US6054264A (pl)
EP (1) EP0698216B2 (pl)
JP (1) JP3645904B2 (pl)
KR (1) KR100330278B1 (pl)
CN (1) CN1129795C (pl)
AT (1) ATE281647T1 (pl)
CZ (1) CZ294629B6 (pl)
DE (1) DE69434117T3 (pl)
DK (1) DK0698216T4 (pl)
ES (1) ES2232815T5 (pl)
GE (1) GEP20012421B (pl)
HU (1) HU224513B1 (pl)
PL (3) PL175342B1 (pl)
PT (1) PT698216E (pl)
RO (1) RO115471B1 (pl)
RU (1) RU2158928C2 (pl)
SK (1) SK282543B6 (pl)
UA (1) UA46707C2 (pl)
WO (1) WO1994027153A1 (pl)

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0610436B9 (en) 1991-11-21 2003-03-26 Common Services Agency Hepatitis-c virus testing
US7255997B1 (en) 1993-04-27 2007-08-14 N.V. Innogenetics S.A. Sequences of hepatitis C virus genotypes and their use as therapeutic and diagnostic agents
ATE373093T1 (de) 1993-04-27 2007-09-15 Innogenetics Nv Sequenzen der genotype des hepatitis-c-virus sowie ihre verwendung als arzneimitteln und diagnostika
RU2158928C2 (ru) * 1993-05-10 2000-11-10 Чирон Корпорейшн Способы типирования вируса гепатита с и используемые для этого реагенты
US7070790B1 (en) 1993-06-29 2006-07-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Nucleotide and deduced amino acid sequences of the envelope 1 and core genes of isolates of hepatitis C virus and the use of reagents derived from these sequences in diagnostic methods and vaccines
US5882852A (en) * 1993-06-29 1999-03-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Hepatitic C virus (HCV) core gene nucleotide sequences and related methods of detecting major and minor genotypes of HCV isolates
DE19504302A1 (de) * 1995-02-09 1996-08-14 Boehringer Mannheim Gmbh Methode zur serologischen Typisierung mittels typspezifischer Antigene
WO1996034013A1 (fr) * 1995-04-28 1996-10-31 Srl, Inc. Compose peptidique antigenique et methode de dosage immunologique
US6514731B1 (en) 1996-05-24 2003-02-04 Chiron Corporation Methods for the preparation of hepatitis C virus multiple copy epitope fusion antigens
US7052830B1 (en) * 1998-06-09 2006-05-30 Branch Andrea D Hepatitis C virus peptides and uses thereof
EP1131345A1 (en) * 1998-11-20 2001-09-12 Bio Merieux Synthetic polypeptides corresponding to the hepatitis c virus (hcv) and applications
US6995299B2 (en) * 1999-11-02 2006-02-07 University Of Connecticut Propagation of human hepatocytes in non-human animals
US8124348B2 (en) * 2000-08-23 2012-02-28 Jonathan Zmuda Oral fluid rapid assay for hepatitis C virus (HCV) antibodies using non-antibody labeling of IgA molecules recognizing HCV peptide epitopes
AU2002311897A1 (en) * 2001-05-09 2002-11-18 Third Wave Technologies, Inc. Nucleic acid detection in pooled samples
US7196183B2 (en) * 2001-08-31 2007-03-27 Innogenetics N.V. Hepatitis C virus genotype, and its use as prophylactic, therapeutic and diagnostic agent
EP1497469A4 (en) * 2002-04-04 2005-06-08 Achillion Pharmaceuticals Inc TEST FOR ASSESSING THE ACTIVITY OF COMPOUNDS AGAINST HCV USING A NOVEL DETECTION SYSTEM IN THE HCV REPLICIC
US20050202036A1 (en) * 2003-07-22 2005-09-15 Branch Andrea D. Alternate reading frame polypeptides drived from hepatitis C and methods of their use
WO2005009418A2 (en) 2003-07-25 2005-02-03 Idenix (Cayman) Limited Purine nucleoside analogues for treating diseases caused by flaviviridae including hepatitis c
US8124747B2 (en) * 2003-08-29 2012-02-28 Innogenetics HCV clade and prototype sequences thereof
CN1977050B (zh) 2004-01-07 2012-09-05 第三次浪潮技术公司 丙型肝炎病毒基因型的确定
JP4533656B2 (ja) * 2004-04-28 2010-09-01 アボットジャパン株式会社 特異性の改良されたｃ型肝炎ウイルス（ｈｃｖ）抗体測定法
US7858752B2 (en) 2006-12-05 2010-12-28 Abbott Laboratories Recombinant antibodies against hepatitis C virus and methods of obtaining and using same
FR2984328B1 (fr) 2011-12-20 2016-12-30 Bio-Rad Innovations Procede de detection d'une infection par le virus de l'hepatite c
CN110261616B (zh) * 2019-04-30 2021-07-20 广东菲鹏生物有限公司 一种丙型肝炎病毒检测试剂盒

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4868105A (en) * 1985-12-11 1989-09-19 Chiron Corporation Solution phase nucleic acid sandwich assay
US5124246A (en) * 1987-10-15 1992-06-23 Chiron Corporation Nucleic acid multimers and amplified nucleic acid hybridization assays using same
US5350671A (en) * 1987-11-18 1994-09-27 Chiron Corporation HCV immunoassays employing C domain antigens
HU220204B (hu) * 1987-11-18 2001-11-28 Chiron Corp. HCV polipeptidek és HCV polinukleotidok, ilyen polinukleotidokat tartalmazó vektorok és ezekkel transzformált gazdasejtek, valamint HCV fertőzés kimutatására szolgáló diagnosztikumok és immunvizsgálati készlet
HU225068B1 (en) * 1989-03-17 2006-05-29 Chiron Corp Process for producing diagnostics and vaccine of nanbh
US5106726A (en) * 1990-02-16 1992-04-21 United Biomedical, Inc. Synthetic peptides specific for the detection of antibodies to HCV
RO109916B1 (ro) * 1990-04-04 1995-07-28 Chiron Corp Compozitie de antigeni ai hepatitei virale c
US6190864B1 (en) * 1991-05-08 2001-02-20 Chiron Corporation HCV genomic sequences for diagnostics and therapeutics
RO117329B1 (ro) * 1991-06-24 2002-01-30 Chiron Corp Emeryville Polipeptide care contin o secventa a virusului hepatitei c
ATE241704T1 (de) * 1991-08-27 2003-06-15 Hoffmann La Roche Primers und sondern zum nachweis von hepatitis c
US5427909A (en) * 1991-09-09 1995-06-27 Immuno Japan Inc. Oligonucleotides and determination system of HCV genotypes
ATE191792T1 (de) * 1991-09-16 2000-04-15 Abbott Lab Verfahren zur detektion von hepatitis c
EP0610436B9 (en) * 1991-11-21 2003-03-26 Common Services Agency Hepatitis-c virus testing
CN1053196C (zh) 1992-07-16 2000-06-07 株式会社先端生命科学研究所 用于丙型肝炎病毒分类的抗原肽, 含有所述肽的药盒及用所述肽进行分类的方法
AU680450B2 (en) * 1992-11-06 1997-07-31 Mimotopes Pty Ltd Support for the synthesis of modular polymers
US6881821B2 (en) 1993-05-05 2005-04-19 Common Services Agency Hepatitis-C virus type 4, 5, and 6
RU2158928C2 (ru) * 1993-05-10 2000-11-10 Чирон Корпорейшн Способы типирования вируса гепатита с и используемые для этого реагенты
EP0729973A4 (en) * 1993-10-29 1998-12-30 Srl Inc AN ANTIQUE PEPTIDE COMPOUND AND IMMUNOASSAY PROCEDURE

Also Published As

Publication number Publication date
SK282543B6 (sk) 2002-10-08
ATE281647T1 (de) 2004-11-15
US6416946B1 (en) 2002-07-09
GEP20012421B (en) 2001-04-25
ES2232815T3 (es) 2005-06-01
HUT73384A (en) 1996-07-29
DE69434117T2 (de) 2006-02-02
HU9503219D0 (en) 1996-01-29
CN1129795C (zh) 2003-12-03
HU224513B1 (hu) 2005-10-28
KR100330278B1 (ko) 2002-08-19
PL311653A1 (en) 1996-03-04
EP0698216A1 (en) 1996-02-28
CZ292995A3 (en) 1996-05-15
JP3645904B2 (ja) 2005-05-11
UA46707C2 (uk) 2002-06-17
DK0698216T3 (da) 2005-02-14
ES2232815T5 (es) 2009-06-15
CN1125982A (zh) 1996-07-03
RO115471B1 (ro) 2000-02-28
DK0698216T4 (da) 2009-06-15
DE69434117D1 (de) 2005-01-20
SK135995A3 (en) 1996-09-04
EP0698216B1 (en) 2004-11-03
RU2158928C2 (ru) 2000-11-10
EP0698216B2 (en) 2009-02-25
JPH08510329A (ja) 1996-10-29
US6054264A (en) 2000-04-25
PL175338B1 (pl) 1998-12-31
PT698216E (pt) 2005-03-31
PL175342B1 (pl) 1998-12-31
US6416944B1 (en) 2002-07-09
WO1994027153A1 (en) 1994-11-24
DE69434117T3 (de) 2009-10-08
CZ294629B6 (cs) 2005-02-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL175360B1 (pl) Cząsteczka kwasu nukleinowego i kompozycja do wykrywania infekcji wirusa zapalenia wątroby typu C
EP0591431B1 (en) Hepatitis c virus (hcv) polypeptides
Dammacco et al. Hepatitis C virus infection, mixed cryoglobulinemia, and non-Hodgkin's lymphoma: an emerging picture
FI113967B (fi) Hepatitis-C-virustesti
EP0627000B1 (en) Mammalian expression systems for hcv proteins
ES2272065T3 (es) Epitopos en proteinas de cubierta viricas y anticuerpos especificos dirigidos contra estos epitopos: uso para la deteccion de antigeno virico de hcv en tejido de hospedantes.
ES2231773T3 (es) Virus de la hepatitis c de tipo 4, 5 y 6.
Mondelli et al. Significance of the immune response to a major, conformational B-cell epitope on the hepatitis C virus NS3 region defined by a human monoclonal antibody
Ferroni et al. Identification of four epitopes in hepatitis C virus core protein
US5674676A (en) HCV peptide antigens and method of determining HCV
JPH0940694A (ja) 肝炎ｇｂウイルスの合成ペプチド及びその使用
Chang et al. Artificial NS4 mosaic antigen of hepatitis C virus
WO2006113522A2 (en) Methods of detecting hepatitis c virus
US5670310A (en) Methods and compositions for differential diagnosis of acute and chronic hepatitis c virus infection
CA2162250C (en) Methods of typing hepatitis c virus and reagents for use therein
AU5809694A (en) Peptides from the c33 region of hcv, antibodies thereto and methods for the detection of hcv
JPH08505131A (ja) 肝炎ｃ型ウイルス（ｈｃｖ）非構造−３−ペプチド、該ペプチドに対する抗体及びｈｃｖの検出方法