CZ294629B6 - Způsob klasifikace typů hepatitis C viru, polypeptid a kompozice pro použití ve způsobu - Google Patents
Způsob klasifikace typů hepatitis C viru, polypeptid a kompozice pro použití ve způsobu Download PDFInfo
- Publication number
- CZ294629B6 CZ294629B6 CZ19952929A CZ292995A CZ294629B6 CZ 294629 B6 CZ294629 B6 CZ 294629B6 CZ 19952929 A CZ19952929 A CZ 19952929A CZ 292995 A CZ292995 A CZ 292995A CZ 294629 B6 CZ294629 B6 CZ 294629B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- virus
- hepatitis
- type
- epitope
- specific
- Prior art date
Links
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 title claims abstract description 151
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 98
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 91
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 87
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 59
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 18
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 47
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 26
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 21
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 21
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 20
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims abstract description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 11
- 108700039791 Hepatitis C virus nucleocapsid Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 40
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 15
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 9
- 241000134307 Hepatitis C virus genotype 1 Species 0.000 claims description 7
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 6
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 claims description 4
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 claims description 3
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 claims description 3
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 claims description 2
- 241001466980 Hepatitis C virus genotype 4 Species 0.000 claims description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 claims description 2
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 claims description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 claims description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 abstract description 16
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 abstract description 15
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 39
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 38
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 22
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 20
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 14
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 14
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 13
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 12
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 11
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 11
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 10
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 10
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 10
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 8
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 7
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 7
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 7
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 7
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 101100289061 Drosophila melanogaster lili gene Proteins 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Natural products NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 4
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- -1 sarcosine (Sar) Chemical class 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 3
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 3
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 3
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 3
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 3
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 2
- 241000710831 Flavivirus Species 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical group O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- RHGKLRLOHDJJDR-BYPYZUCNSA-N L-citrulline Chemical compound NC(=O)NCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O RHGKLRLOHDJJDR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- QEFRNWWLZKMPFJ-ZXPFJRLXSA-N L-methionine (R)-S-oxide Chemical compound C[S@@](=O)CC[C@H]([NH3+])C([O-])=O QEFRNWWLZKMPFJ-ZXPFJRLXSA-N 0.000 description 2
- QEFRNWWLZKMPFJ-UHFFFAOYSA-N L-methionine sulphoxide Natural products CS(=O)CCC(N)C(O)=O QEFRNWWLZKMPFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000710924 Togaviridae Species 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N acridine Chemical compound C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 2
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 230000035622 drinking Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 2
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 2
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 2
- ZCCUUQDIBDJBTK-UHFFFAOYSA-N psoralen Chemical compound C1=C2OC(=O)C=CC2=CC2=C1OC=C2 ZCCUUQDIBDJBTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 2
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 2
- FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N sarcosine Chemical compound C[NH2+]CC([O-])=O FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- BVAUMRCGVHUWOZ-ZETCQYMHSA-N (2s)-2-(cyclohexylazaniumyl)propanoate Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC1CCCCC1 BVAUMRCGVHUWOZ-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- GVJXGCIPWAVXJP-UHFFFAOYSA-N 2,5-dioxo-1-oxoniopyrrolidine-3-sulfonate Chemical compound ON1C(=O)CC(S(O)(=O)=O)C1=O GVJXGCIPWAVXJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TXHAHOVNFDVCCC-UHFFFAOYSA-N 2-(tert-butylazaniumyl)acetate Chemical compound CC(C)(C)NCC(O)=O TXHAHOVNFDVCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ISCMYZGMRHODRP-UHFFFAOYSA-N 3-(iminomethylideneamino)-n,n-dimethylpropan-1-amine Chemical compound CN(C)CCCN=C=N ISCMYZGMRHODRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VXGRJERITKFWPL-UHFFFAOYSA-N 4',5'-Dihydropsoralen Natural products C1=C2OC(=O)C=CC2=CC2=C1OCC2 VXGRJERITKFWPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000024188 Andala Species 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N Boron Chemical compound [B] ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000714198 Caliciviridae Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 1
- 241000557626 Corvus corax Species 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-SCSAIBSYSA-N D-arginine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-SCSAIBSYSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N D-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 241000710781 Flaviviridae Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 1
- 208000005331 Hepatitis D Diseases 0.000 description 1
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical group OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 125000000998 L-alanino group Chemical group [H]N([*])[C@](C([H])([H])[H])([H])C(=O)O[H] 0.000 description 1
- ZGUNAGUHMKGQNY-ZETCQYMHSA-N L-alpha-phenylglycine zwitterion Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)C1=CC=CC=C1 ZGUNAGUHMKGQNY-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- RHGKLRLOHDJJDR-UHFFFAOYSA-N Ndelta-carbamoyl-DL-ornithine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=O RHGKLRLOHDJJDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 1
- 241000282520 Papio Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 241000710778 Pestivirus Species 0.000 description 1
- 241000709664 Picornaviridae Species 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108010077895 Sarcosine Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052796 boron Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 150000004657 carbamic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- WNKZOJNKBOBRAY-UHFFFAOYSA-N cdba Chemical compound O=CC1=CC=CC=C1.O1C(C(C2O)O)C(COC)OC2OC(C(C2O)O)C(COC)OC2OC(C(C2O)O)C(COC)OC2OC(C(C2O)O)C(COC)OC2OC(C(O)C2O)C(COC)OC2OC(C(C2O)O)C(COC)OC2OC2C(O)C(O)C1OC2COC WNKZOJNKBOBRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 235000013477 citrulline Nutrition 0.000 description 1
- 229960002173 citrulline Drugs 0.000 description 1
- 238000007621 cluster analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-N dithiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=S NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 235000013861 fat-free Nutrition 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 208000005252 hepatitis A Diseases 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 201000010284 hepatitis E Diseases 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 1
- 210000001822 immobilized cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000000677 immunologic agent Substances 0.000 description 1
- 229940124541 immunological agent Drugs 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000012606 in vitro cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N methylphosphonic acid Chemical class CP(O)(O)=O YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 150000008298 phosphoramidates Chemical class 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013081 phylogenetic analysis Methods 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 description 1
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 229940043230 sarcosine Drugs 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 210000001138 tear Anatomy 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N trans-L-hydroxy-proline Natural products ON1CCCC1C(O)=O FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
- G01N33/5767—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis non-A, non-B hepatitis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
- C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/82—Hepatitis associated antigens and antibodies
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Způsob klasifikace jednoho nebo více typů hepatitis C viru, zahrnuje stupně: - poskytnutí biologického vzorku od jedince; - kontakt vzorku s prvním reagentem, obsahujícím kombinaci typově specifických epitopů hepatitis C viru, alespoň jeden epitop v kombinaci je z nestrukturálního regionu 4 hepatitis C viru; - vyhodnocení na přítomnost komplexů epitop-protilátka ve vzorku, pro zjištění, zda se protilátka ve vzorku váže s prvním reagentem. Polypeptid pro použití ve způsobu, mající aminokyselinovou sekvenci odpovídající alespoň jednomu typově specifickému epitopu hepatitis C viru, kdy epitop je umístěn mezi aminokyselinovými zbytky 67 a 84, 1689 a 1718, nebo 2281 a 2313 hepatitis C viru-1 nebo homologními regiony jiných typů hepatitis C viru. Kompozice pro použití při způsobu obsahuje rekombinantní polynukleotidovou molekulu kódující panel typově specifických epitopů hepatitis C viru, kdy epitopy jsou zvoleny z regionu jádra hepatitis C viru, nestrukturálního regionu 4 (NS4), nebo nestrukturálního regionu 5 (NS5).ŕ
Description
Oblast techniky
Vynález se týká způsobu klasifikace typů hepatitis C viru (HCV), polypeptidu a kompozice pro použití ve způsobu. Zejména se předložený vynález týká způsobu kvalifikace HCV za použití nových peptidů příslušných pro tyto typy.
Dosavadní stav techniky
Je známo, že virová hepatitis je vyvolávána pěti různými typy viru, které jsou známy jako hepatitis A, B, C, D a E. HAV je RNA virus a nepůsobí dlouhodobé klinické symptomy. HBV je DNA virus. HDV je závislý virus, který je neschopen infikovat buňky za nepřítomnosti HBV. HEV je ve vodě se rozmnožující virus. HCV byl nejprve identifikován a charakterizován jako působící non-A, non-B hepatitis (NANBH). Houghton a kol., EP pub. 388 232. To vedlo k popisu mnoha obecných a specifických polypeptidů vhodných jako imunologická činidla pro identifikaci HCV. Viz například Choo a kol. (1989) Science, 244: 359-362; Kuo a kol. (1989) Science 244: 362-364; a Houghton a kol. (1991) Hepatology, 14: 381-388. HCV je hlavní příčinou hepatitis zprostředkované krevní transfuzí.
Prototyp izolátu HCV byl charakterizován v EP pub. 318216a388 232. Zde používaný výraz „HCV“ zahrnuje nové izolované NANBH virové druhy. Výraz „HCV-1“ označuje virus popsaný ve výše uvedených publikacích.
Po počáteční identifikaci HCV bylo identifikováno alespoň šest různých virálních typů a označeno HCV-1 až HCV-6. Cha a kol. (1992) Proč. Nati. Acad. Sci.USA, 89: 7144-7148. Tyto typy zahrnují mnoho subtypů. Typ viru, kterým je pacient infikován může ovlivňovat klinickou prognózu a také odpověď na různé způsoby léčby. Yoshioka a kol. (1992) Hepatology, 16: 293-299. Vzhledem k tomu, že nejčastějším klinickým následkem infekce HCV je hepatocelulámí karcinom, bylo by vhodné stanovit, jakým typem nebo typy HCV je pacient infikován.
Stanovení typu viru se v současnosti provádí klasifikací podle genů; tj. izolací virální RNA a stanovením sekvence různých segmentů polymerázovou řetězovou reakcí (PCR). Tato metoda je pracná a časové náročná a navíc není vhodná pro použití u vzorků, které byly skladovány za podmínek, které neumožňují ochranu RNA nebo vzorků od pacientů, které nemají dostatečný virální titr. Bylo by vhodné, aby existovala metoda pro klasifikaci HCV pomocí imunoanalýzy nebo seroklasifikace.
Současnou metodou pro screening krve a diagnostiku pacientů je imunologická zkouška. Imunologická zkouška používá antigen z HCV-1, který obsahuje dostatečné množství běžných epitopů pro detekci protilátek k jiným typům HCV. Imunologická zkouška nerozlišuje mezi infekcemi různými typy HCV.
Podstata vynálezu
Podstatou předloženého vynálezu je způsob klasifikace typů hepatitis C viru, polypeptid a kompozice pro použití ve způsobu. Způsob klasifikace jednoho nebo více typů hepatitis C viru, zahrnuje stupně:
a) poskytnutí biologického vzorku od jedince, o kterém se předpokládá, že je infikován virem hepatitis C;
- 1 CZ 294629 B6
b) kontakt vzorku s prvním reagentem, obsahujícím kombinaci typově specifických epitopů hepatitis C viru, kde alespoň jeden epitop v kombinaci je z nestrukturálního regionu 4 hepatitis C viru a kde kontakt je proveden za podmínek dovolujících vytváření komplexů první epitop-protilátka; a
c) vyhodnocení na přítomnost komplexů epitop-protilátka ve vzorku, pro zjištění zda se protilátka ve vzorku váže s prvním reagentem a tím určení, zda typ hepatitis C viru, přítomného ve vzorku, je totožný s typem uvedeného typově specifického epitopu;
d) kontaktu vzorku se druhým reagentem, obsahujícím druhý typově specifický epitop hepatitis C viru, kde druhý epitop je z regionu jádra hepatitis C viru a kde kontakt je proveden za podmínek umožňujících tvorbu druhého komplexu epitop-protilátka; a
e) vyhodnocení na přítomnost komplexu druhý epitop-protilátka ve vzorku pro určení zda se protilátky ve vzorku vážou na epitop v druhém reagentu a tím určení, zda typ hepatitis C viru, přítomného ve vzorku, je totožný s typem druhého typově specifického epitopu.
Vyhodnocení se provede kompetiční zkouškou, sendvičovou zkouškou, imunofluorescenční zkouškou, radioimunologickou zkouškou nebo zkouškou enzym-navázaný imunosorbent.
Předmětem vynálezu je polypeptid pro použití ve způsobu, který má aminokyselinovou sekvenci odpovídající alespoň jednomu typově specifickému epitopu hepatitis C viru, kdy epitop je umístěn mezi aminokyselinovými zbytky 67 a 84, 1689 a 1718 nebo 2281 a 2313 hepatitis C viru-1 nebo homologními regiony jiných typů hepatitis C viru.
Dalším předmětem vynálezu je kompozice pro použití ve výše uvedeném způsobu, která obsahuje rekombinantní polynukleotidovou molekulu kódující panel typově specifických epitopů hepatitis C viru, kdy epitopy jsou zvoleny z regionu jádra hepatitis C viru, nestrukturálního regionu 4 (NS4) nebo nestrukturálního regionu (NS5).
Polynukleotidové molekuly kompozice kódují alespoň po jednom z typově specifických epitopů z regionu jádra a NS4 a NS5 regionů hepatitis C viru. Všechny typově specifické epitopy hepatitis C viru jsou specifické pro jediný typ hepatitis C viru.
Polypeptidy jsou odvozeny od tří různých regionů HCV genomu. Jedna sada polypeptidů zahrnuje typově specifický epitop nebo typově-klastrově specifické epitopy získané z HCV jaderné oblasti. Tato první sada se nachází mezi aminokyselinovými zbytky šedesát sedm a osmdesát čtyři HCV-1 a homologními regiony jiných typů HCV. V popise jsou použity následující zkratky aminokyselinových zbytků: A - alanin, I - isoleucin, L - leucin, M - methionin, F - fenylalanin, P - prolin, W - tryptofan, V - valin, N - asparagin, C - cystein, Q -glutamin, G - glycin, S - serin, T - threonin, Y - tyrosin, R - arginin, H - histidin, K - lysin, D - kyselina aspartová a E - kyselina glutamová.
Konkrétní sekvence aminokyselinových zbytků odvozené od jádrové oblasti a subtypy, ze kterých jsou odvozeny, jsou následující:
1. PEGRTWAQ, subtyp la nebo lb.
2. STGKSWGK, subtyp 2a nebo 2b.
3. SEGRWAQ, subtyp 3a nebo 4.
Další sada polypeptidů zahrnuje typově specifický epitop získaný z HCV nestrukturálního regionu 4 (NS4). Tato druhá sada se nachází mezi aminokyselinovými zbytky 1689-1718 HCV-1 a homologních oblastí jiných typů HCV.
-2CZ 294629 B6
Konkrétní aminokyselinové sekvence a typy nebo subtypy, ze kterých jsou odvozeny, jsou následující:
1. CSQHLPY, subtyp la.
2. CASHLPY, subtyp lb.
3. CASRAAL, subtyp 2a nebo 2b.
Další sada polypeptidů zahrnuje typově specifický epitop nebo typově-klastrově specifické epitopy získané z nestrukturálního regionu 5 (NS5) hepatitis C viru. Tato sada se nachází mezi aminokyselinovými zbytky 2281-2313 HCV-1 a homologních regionů jiných typů hepatitis C viru.
Konkrétní aminokyselinové sekvence a typy nebo subtypy, ze kterých jsou odvozeny, jsou následující:
1. PDYEPPVVHG, subtyp 1 a.
2. PDYVPPWHG, subtyp lb.
3. PDYQPATVAG, subtyp 2a.
4. PGYEPPTVLG, subtyp 2b.
5. FAQASPVW, subtyp la.
6. FPQALPIW, subtyp lb.
7. FPQALPAW, subtyp 2a.
8. FPPQALPPW, subtyp 2b.
Další aspekt vynálezu zahrnuje nukleokyselinové molekuly, kódující sekvence aminokyselinových zbytků popsaného typově specifického a typově-klastrově specifického epitopu. Tyto nukleokyselinové molekuly jsou vhodné jako sondy například v Southern blot-analýze nebo jiných analýzách pro rozpoznání DNA jako je zachycovací zkouška popsaná v patentech US 4 868 105 a 5 124 246.
Další aspekt vynálezu zahrnuje nukleokyselinové molekuly, komplementární k nukleokyselinovým sekvencím přiléhajících regionů, kódujících typově specifické a typově-klastrově specifické epitopy. Takové nukleokyselinové molekuly jsou použitelné pro provedení PCR ke stanovení genotypu konkrétního HCV.
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1 je průtokový diagram seroklasifikaění experimentální strategie.
Obr. 2 je průtokový diagram komprehenzivní strategie mapování epitopu.
Obr. 3 je kompilační graf, znázorňující výsledky mapování epitopu HCV la (Rodney)
Obr. 4 je kompilační graf, znázorňující výsledky mapování epitopu HCV 2b (Nomoto).
Definice „Hepatitis C virus“ nebo „HCV“ se týká druhů virů, které jsou patogenními typy působícími NANBH a zeslabených typů nebo defektních interferujících částic z nich odvozených. Viz obecně, publikace citované v „dosavadním stavu techniky“. HCV genom obsahuje RNA. Viry, obsahující RNA mají relativně vysoké rychlosti spontánní mutace uváděné řádově 103 až 10'4 na inkorporovaný nukleotid. Fields & Knipe (1986) „Fundamental Virology“ (Raven Press, NY). Protože heterogenita a fluidita genotypu jsou v RNA virech inherentní, existuje zde mnoho typů/subtypů HCV druhů, které mohou být virulentní nebo avirulentní. Propagace, identifikace, detekce a izolace různých HCV typů nebo izolátů je dokumentována v literatuře. Jak je zde
-3 CZ 294629 B6 vyjádřeno, nukleotidové sekvence a sekvence aminokyselinových zbytků jsou od uvedených typů HCV, číslo HCV-1 genomu a aminokyselinových sekvencí je počítáno v Choo a spol. (1990) Brit.Med.Bull, 46: 423-441). Popis umožňuje diagnózu různých typů.
Jak je zde použit výraz „typ“ se týká HCV, které se liší genotypicky o více než asi 30 %; „subtyp“ označuje HCV, které se liší genotypicky o asi 10 až 20 % a „izolát“ označuje HCV, které se genotypicky liší o méně než asi 10 %. „Klasifikace“ označuje odlišení jednoho typu HCV od jiného typu.
Informace o některých odlišných HCV typech/subtypech je uvedena v Mezinárodní publikaci č. WO 93/00365 zejména pro typ nebo subtyp CDC/HCV1 (také nazývaný HCV-1). Informace o jednom typu nebo podtypu, jakož i parciální genomové nebo aminokyselinové sekvenci, je dostačující pro to, aby mohl odborník v oboru za použití standardních technik izolovat nové typy HCV. Například několik různých typů HCV bylo screenováno jak je popsáno dále. Tyto typy, které byly získány z mnoha lidských sér (a z různých geografických oblastí), jsou klasifikovány za použití metody a činidel, které jsou zde dále popsány.
Genomová struktura a nukleotidová sekvence HCV-1 genomové RNA byly dedukovány. Genom se jeví jako jednořetězcová RNA, obsahující 10 000 nukleotidů. Genom je pozitivní řetězec a vykazuje kontinuální, translační otevřený čtecí rámeček (ORF), který kóduje polyprotein o asi 3000 aminokyselinách. V ORF se jeví strukturální protein(y) jako kódované v přibližně první čtvrtině amino-koncového regionu, s převahou polyproteinu odpovědného za nestrukturální (NS) proteiny. Ve srovnání se všemi známými virálními sekvencemi jsou pozorovány malé, ale významné ko-lineární homologie s nestrukturálními (NS) proteiny rodu Flavivirů a s pestiviry (které jsou nyní také považovány za část rodu Flavivirů).
Na základě domnělých aminokyselinových zbytků kódovaných v nukleotidové sekvenci HCV-1 a jiných případech, jsou možné proteinové domény kódovaných HCV polyproteinů, jakož i přibližné hranice, uvedeny v tabulce 1.
Tabulka 1
Domnělá doména
C (nukleokapsidový protein)
Ei (virionový obalový protein)
E2/NS1 (obalový)
NS2 (neznámá funkce)
NS3(proteása)
NS4 (neznámá funkce)
NS5 (polymerása) přibližná hranice (aminokyseliny č.)
1-191
192-383
384-800
800-1050
1050-1650
1651-2100
2100-3011 (konec)
Tyto domény jsou tentativní. Například E1-NS2 pás je přibližně v regionu 750-810 a NS3-NS4 pás je asi 1640-1650. Je zde také zřejmé, že 191 aminokyselin aa) verze C jsou prekurzorem, který je dále zpracováván na asi 170 aa délky a že NS2, NS4 a NS5 proteiny jsou každý dále zpracováván do dvou zralých proteinů.
Různé typy HCV jsou definovány podle různých kriterii, jako je například ORF přibližně 9000 nukleotidů na přibližně 12 000 nukleotidů, kódující polyprotein podobného hydrofobního a/nebo antigenního charakteru jako HCV-1 a přítomností ko-lineámích polypeptidových sekvencí, které jsou konzervovány v HCV-1.
Při identifikaci HCV typů jsou aplikovatelné následující parametry nukleokyselinové homologie a aminokyselinové homologie, bud’ samotné, nebo v kombinaci. Obecně, jak je popsáno výše,
-4CZ 294629 B6 jsou různé typy HCV z asi 70 % homologní zatímco subtypy jsou z asi 80 až 90 % homologní a izoláty jsou homologní z asi 90 %.
Jak je zde použito, polynukleotid „odvozený od“ označené sekvence se týká polynukleotidové sekvence, která obsahuje sekvenci alespoň asi 6 nukleotidů, výhodně alespoň asi 8 nukleotidů, výhodněji alespoň asi 10 až 12 nukleotidů a výhodněji alespoň asi 15 až 20 nukleotidů, odpovídajících regionu označené nukleotidové sekvence. „Odpovídající“ znamená homologní k nebo komplementární k označené sekvenci. Výhodně je sekvence regionu, ze kterého je polynukleotid odvozen homologní k nebo komplementární k sekvenci, která je unikátní pro HCV genom. Hybridizační techniky pro stanovení komplementarity nukleokyselinových sekvencí jsou v oboru známé. Viz např. Maniatis a spol. (1982). Navíc mohou být chyby dvojných polynukleotidů vytvořených při hybridizaci stanoveny známými technikami, zahrnujícími například, štěpení nukleázou jako je S1, která specificky štěpí jednořetězcové plochy v duplexu polynukleotidů. Regiony, ze kterých mohou být typické DNA „odvozeny“ zahrnují, ale neomezují se na, například regiony, kódující typově specifické epitopy, jakož i netranskribované a/nebo netranslatované regiony.
Odvozený polynukleotid není nezbytně fyzicky odvozen od uvedené nukleotidové sekvence, ale může být získán mnoha způsoby, zahrnujícími například chemickou syntázu nebo DNA replikaci nebo reversní transkripci nebo transkripci. Navíc mohou být kombinace regionů, odpovídajících regionům požadované sekvence, modifikovány způsoby známými v oboru, které jsou v souladu se zamýšleným účinkem.
Podobně polypeptidová nebo aminokyselinová sekvence „odvozená od“ označené aminokyselinové nebo nukleokyselinové sekvence se týká polypeptidů, majících aminokyselinovou sekvenci identickou se sekvencí polypeptidů kódovaného v sekvenci nebo její části, kde část zahrnuje alespoň 3 až 5 aminokyselin a výhodně alespoň 8 až 10 aminokyselin a ještě výhodněji alespoň asi 11 až 15 aminokyselin, nebo která je imunologicky shodná s polypeptidem kódovaným v sekvenci. Terminologie také zahrnuje polypeptid exprimovaný z označené nukleokyselinové sekvence.
Rekombinantní nebo odvozený polyprotein není nezbytně generován z označené nukleokyselinové sekvence, může být generován jakýmkoliv způsobem, zahrnujícím například chemickou syntézu nebo expresi rekombinantního expresního systému nebo izolaci z HCV, včetně mutovaného HCV. Zde popsané polypeptidy jsou obecně relativně krátké a proto jsou snadno chemicky syntetizovatelné.
Rekombinantní nebo odvozený polypeptid může zahrnovat jeden nebo více analogů aminokyselin nebo nepřirozených aminokyselin ve své sekvenci. Způsoby inzertování analogů aminokyselin do sekvence jsou známé odborníkům v oboru. Mohou také obsahovat jedno nebo více značení, která jsou známa odborníkům v oboru. Detailní popis analogů a „mimotopů“ se nachází v patentu US 5 194 392.
Peptidové analogy zahrnují delece, adice, substituce nebo modifikace, které zachovávají schopnost klasifikace HCV. Výhodné „substituce“ jsou ty, které jsou konzervativní, tj. kde zbytek je nahrazen jiným stejného obecného typu. Je třeba chápat, že přirozeně se vyskytující aminokyseliny mohou být subklasifikovány jako kyselé, bazické, neutrální a polární, nebo neutrální a nepolární. Dále jsou tři z kódujících aminokyselin aromatické. Obecně je výhodné, že kódované polypeptidy se liší od přirozeného epitopu tím, že obsahují kodony pro aminokyseliny které jsou ze stejné skupiny, jako je nahrazená aminokyselina. Obecně, bazické aminokyseliny Lys, Arg a His jsou vzájemně zaměnitelné, kyselé aminokyseliny - kyselina aspartová a glutamová - jsou zaměnitelné; neutrální polární aminokyseliny Ser, Thr, Cys, Gin a Asn jsou vzájemně zaměnitelné; nepolární alifatické aminokyseliny Gly, Ala, Val, Ile a Leu jsou konzervativní s ohledem na ostatní (ale z důvodů velikosti jsou Gly a Ala vzájemně si bližší a Val, Ile a Leu jsou si rovněž bližší) aromatické aminokyseliny Phe, Trp a Tyr jsou vzájemně zaměnitelné. Protože prolin je
-5 CZ 294629 B6 nepolární neutrální aminokyselina, činí tato obtíže vzhledem k jejímu vlivu na konformaci a substituce prolinem nebo prolinu nejsou preferovány s výjimkou, kdy může být dosaženo stejných nebo podobných konformačních výsledků. Polární aminokyseliny, které představují konzervativní změny zahrnují Ser, Thr, Gin, Asn a v menším rozsahu Met. Dále, i když jsou klasifikovány v různých kategoriích se Ala, Gly a Ser jeví jako zaměnitelné a Cys navíc patří do této skupiny nebo může být klasifikován s polárními neutrálními aminokyselinami.
Dále by bylo třeba uvést, že jestliže jsou polypeptidy vyrobeny synteticky, mohou být také provedeny substituce aminokyselinami, které nekódují gen. Alternativní zbytky zahrnují například omega aminokyseliny vzorce H2N(CH2)nCOOH, kde n je 2 až 6. Jsou to neutrální, nepolární aminokyseliny jako je sarkosin (Sar), terc.butylalanin (t-BuA), terc.butylglycin (t-BuG), Ν’methyl Ile(N-MeIle) a norleucin (Nle). Fenylglycin, například, může nahradit Trp, Tyr nebo Phe neutrální aromatickou aminokyselinu; citrulin (Cit) a methionin sulfoxid (MSO) jsou polární ale neutrální, cyklohexylalanin (CHa) je neutrální a nepolární, cysteinová kyselina (Cya) je kyselá a ornitin (Orn) je bázický. Konformační vlastnosti prolinových zbytků mohou být zachovány jestliže je jeden nebo více z nich nahrazeno hydroxyprolinem (Hyp).
Výraz „rekombinantní polynukleotid“ jak je zde použit, zahrnuje polynukleotidy genomického, cDNA, semisyntetického nebo syntetického původu, který díky svému původu nebo zpracování: (1) není spojen se všemi nebo částí polynukleotidu, se kterým je spojen v přírodě, (2) je napojen k polynukleotidu jinému než ke kterému je napojen v přírodě, nebo (3) nevyskytuje se v přírodě.
Výraz „polynukleotid“ jak je zde použit, označuje polymemí formu nukleotidů jakékoliv délky, buď ribonukleotidů, nebo desoxyribonukleotidů. Tento výraz zahrnuje dvoj- a jednořetězcovou DNA a RNA. Zahrnuje také známé typy modifikací, například značení, která jsou známá v oboru, methylaci, „caps“, náhradu jednoho nebo více přirozeně se vyskytujících nukleotidů analogem, internukleotidové modifikace jako jsou například ty se spoji nenesoucími náboj (např. methylfosfonáty, fosforoteiesteiy, fosforoamidáty, karbamáty atd.) a se spoji nesoucími náboj (např. fosforothioáty, fosforodithioáty atd.), ty, které obsahují pendant skupiny jako jsou například proteiny, zahrnující, ale neomezující se na nukleázy, toxiny, protilátky, signální peptidy a polyL-lysin; obsahující interkalátory (např. akridin, psoralen atd.), obsahující chelátory (např. kovy, radioaktivní kovy, bor, oxidující kovy atd.), obsahující alkylátory, obsahující modifikované spojení (např. alfa anomerní kyseliny atd.) jakož i nemodifikované polynukleotidů. Zde popsané polynukleotidy jsou relativně krátké a jsou proto syntetizovatelné.
„Čištěný“ polypeptid označuje polypeptid, který je ve stavu, kdy je v podstatě prostýjiných polypeptidů, tj. ve složení, které obsahuje minimálně asi 50 % hmotn. (požadovaný polypeptid/celkový polypeptid ve složení), výhodně minimálně asi 70 % a výhodněji i minimálně asi 90 % požadovaného polypeptidu, bez ohledu na neproteinové materiály ve složení. Techniky pro čištění virálních polypeptidů jsou známé v oboru. Čištěné protilátky jsou podobně definovány v oboru.
Jak je zde použit, označuje výraz „epitop“ antigenní determinantu polypeptidu. Epitop by měl obsahovat 3 nebo více aminokyselin, které definují vazebné místo protilátky. Obecně epitop obsahuje alespoň 5 aminokyselin a někdy obsahuje alespoň 8 aminokyselin. Způsoby mapování epitopu jsou v oboru známé.
Používaný výraz „typově specifický epitop“ označuje epitop, který se nachází v jednom HCV typu. „Typově-klastrový specifický epitop“ se nachází na více než jednom, ale méně než všech HCV typech. Například jednotlivý epitop může být rozpoznáván protilátkami od pacienta infikovaného HCV-1, ale rozpoznáván méně účinně protilátkami od pacienta infikovaného HCV-2. Podobně typ klastrově specifického epitopu odvozeného od HCV-3 může být rozpoznáván protilátkami od pacienta infikovaného HCV-1 nebo HCV-2. „Konzervované epitopy“ jsou ty, které jsou rozpoznávány protilátkami specifickými pro všechny HCV typy.
-6CZ 294629 B6
Polypeptid je „imunologicky reaktivní“ s protilátkou, která se váže k peptidu díky tomu, že protilátka rozpoznává specifický epitop obsažený v polypeptidu. Imunologická reaktivita může být determinována vazbou protilátky, konkrétněji kinetikou vazby protilátky a/nebo soutěžením ve vazbě za použití známých polypeptidů jako soutěžících látek, obsahujících epitop proti kterému je protilátka řízena. Techniky pro stanovení, který polypeptid je imunologicky reaktivní s protilátkou jsou známé v oboru.
Zde používaný výraz „protilátka“ označuje polypeptid nebo skupinu polypeptidů, které obsahují alespoň jedno kombinované místo pro protilátku. „Kombinovaná místa pro protilátku“ nebo „vazebná doména“ jsou vytvořeny ze složení různých domén molekuly (molekul) protilátek za vzniku trojrozměrného vazebného spojeni se vnitřním povrchovým tvarem a distribucí náboje komplementárním k rysům epitopu antigenu, které umožňuje imunologickou reakci s antigenem. Kombinované protilátkové místo může být vytvořeno z těžké a/nebo lehké řetězcové domény (VH a VL), které tvoří hypervariabilní smyčku, která přispívá k vazbě antigenu. Výraz „protilátka“ zahrnuje, například, protilátky obratlovců, hybridní protilátky, chimémí protilátky, změněné protilátky jednovazné protilátky, Fab proteiny a jednotlivé domény protilátek.
Protilátky specifické k polypeptidům a polypeptidy mohou být vyrobeny jakoukoliv metodou známou v oboru: Například jsou polypeptidy obecně suspendovány ve fyziologicky přijatelném pufru, smíseny se vhodnou přísadou a injektovány zvířeti. Způsoby výroby polyklonálních a monoklonálních protilátek jsou známé v oboru a nebudou zde podrobně popisovány.
Výraz „polypeptid“ označuje polymer aminokyselin a neoznačuje specifickou délku produktu; v rozsahu definice polypeptidu jsou proto zahrnuty polypeptidy, oligopeptidy a proteiny. Tento výraz také neznamená nebo vylučuje postexpresní modifikace polypeptidu, například glykosylaci, acetylaci, fosforylaci a podobně. V definici jsou například zahrnuty polypeptidy, obsahující jeden nebo více analogů aminokyseliny (zahrnující například nepřirozené aminokyseliny atd.), polypeptidy se substituovanými vazbami jakož i jiné modifikace známé v oboru, jak přirozeně se vyskytující tak nepřirozené se vyskytující.
„Léčení“ jak je zde používáno, znamená jak profylaxi tak terapii.
„Jednotlivec“ jak je zde tento výraz používán, označuje obratlovce, zejména příslušníky rodu savců a zahrnuje, ale není takto omezen, živočichy (např. psy, kočky, hovězí dobytek, vepře, ovce, kozy, králíky, myši, krysy, morčata atd.) a primáty, včetně opic, šimpanzů, paviánů a lidí.
Používaný výraz „negativní řetězec“ (sense strans) nukleové kyseliny obsahuje sekvenci, která má sekvenci homologní k sekvenci mRNA, „Pozitivní řetězec“ obsahuje sekvenci., která je komplementární se sekvencí „negativního řetězce“.
Jak je zde použit je „pozitivní řetězcovaný genom“ viru ten, ve kterém genom, až RNA nebo DNA, je jednořetězcový a který kóduje virální polypeptid(y). Příklady pozitivně řetězcových RNA virů zahrnují Togaviridae, Coronaviridae; Tetroviridae, Picornaviridae a Caliciviridae. Zahrnuty jsou rovněž Flaviviridae, které byly dříve označovány jako Togaviridae. Viz Fields & Knipe (1986).
Zde použitý výraz „vzorek z těla, obsahující protilátky“ označuje komponentu jednotlivcova těla, která je zdrojem zájmových protilátek. Komponenty, obsahující tělové protilátky jsou známy v oboru a zahrnují, ale nejsou tak omezeny, například plasmu, sérum, míšní kapalinu, lymfatickou kapalinu, vnější sekce dýchacího, intestinálního a genitourinámího traktu, sliny, mléko, bílé krvinky a myelomy.
„Biologický vzorek“ se týká vzorku tkáně nebo kapaliny izolované z jednotlivce, zahrnující, ale neomezující se například na plasmu, sérum, míšní mok, lymfatickou kapalinu, vnější části kůže, respirační, intestinální a genitourinální trakci, slzy, sliny, mléko, krevní buňky, nádory, orgány.
-7CZ 294629 B6
Zahrnuty jsou také vzorky složek buněčných in vitro kultur (zahrnující, ale neomezující se na, kondicionované medium vzniklé při růstu buněk, domněle virálně infikovaných buněk, rekombinantních buněk a složek buněk).
Způsoby provedení vynálezu
Při provedení předloženého vynálezu se využívá, pokud není jinak uvedeno, běžných technik molekulární biologie, mikrobiologie, syntézy rekombinantní DNA, polypeptidů a nukleových kyselin a imunologie, které jsou odborníkům známé. Takové techniky jsou plně v literatuře popsány. Viz např. Maniatis, Fitsch & Sambroook, „Moleculary Cloning: A Laboratory Manual“ (1982); „DNA Cloning, sv. I a II“ (D.N. Glover ed. 1985); „Oligonukleotide Synthesis“ (M. J. Gait ed., 2984); „Nucleic Acid Hybridization; (H. D. Hames & S. J. Higgins vyd. 1984); Transcription and Translation“ (B. D. Hames & S. J. Higgins vyd. 1984); „Animal Cell Culture“ (R.I. Freshney ed. 1986); „Immobilized Cells And Enzymes“ (IRL Press, 1986); B. Rerbal, „A Practical Guide To Molecular Cloning“ (1984); serie, „Methods in Enzymology“ (Academie Press, lne.); „Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells“ (J. H. Miller a Μ. P. Calos vyd., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory), Meth. Enzymol., sv. 154 a sv. 155 (Wu a Grossman a Wu, vyd.), Mayer a Walker, vyd. (1987), „Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology“ (Academie Press, Londýn); Scopes (1987) „Protein Purifícation: Principles and Practice“, druhé vydání (Springer Verlag, N.Y.) a „Handbook of Experimental Immunology“, sv. I-IV (D. M. Weir a C. C. Hlackwell vyd. 1986).
Všechny patenty, patentové přihlášky a publikace uvedené v tomto popise, jak výše tak dále, jsou zde zahrnuty jako odkazy.
Vynález zahrnuje metody pro detekci HCV a identifikaci infekce různých typů HCV. Vynález také zahrnuje polypeptidy a molekuly nukleové kyseliny pro použití v těchto metodách.
Metody detekce a klasifikace infekce HCV zahrnují jak imunozkoušky, tak identifikace nukleové kyseliny metodami, zahrnujícími, ale neomezujícími se na ně, „Southem blot“ analýzu a polymerázovou řetězcovou reakci. Za účelem identifikace infekce HCV se biologický vzorek inkubuje s jedním ze zde popsaných polypeptidů za podmínek, které umožňují vazbu antigen-protilátka a stanovení, zda se protilátky ve vzorku vážou k epitopu, který se nachází v polypeptidů.
Imunozkouška a diagnostické kity
Peptidy, obsahující specifické epitopy a typ-klastrově specifické epitopy jsou vhodné v imunozkouškách pro detegování přítomnosti HIV protilátek, nebo přítomnosti viru a/nebo virálních antigenů, v biologických vzorcích. Provedení imunozkoušek se může různě měnit a v oboru je známo mnoho provedení. Imunozkouška bude využívat alespoň jeden typově specifický epitop nebo typ-klastrově specifický epitop. V jednom provedení používá imunozkouška kombinace typově specifických epitopů typ-klastrově specifických epitoptů.
Polypeptidy jsou použitelné pro klasifikaci HCV za použití epitopů pro stanovení přítomnosti typově specifických nebo typově-klastrově specifických protilátek. Polypeptidy jsou také vhodné pro použití při generování typově nebo typově-klastrově specifických protilátek, které mohou být použity v imunozkoušce pro rozlišení mezi různými typy HCV.
Polypeptidy jsou odvozeny od tří různých regionů HCV genomu. Jedna sada polypeptidů zahrnuje typově nebo typově-klastrově specifický epitop získaný z regionu HCV jádra. Další sada polypeptidů zahrnuje typově nebo typově-klastrově specifický epitop získaný z HCV nestrukturálního regionu 4 (NS4). Další set polypeptidů zahrnuje typově nebo typově-klastrově specifický epitop získaný z nestrukturálního regionu 5 (NS5) viru hepatitidy C. Tento set se nachází mezi
-8CZ 294629 B6 aminokyselinovými zbytky 2281-2313 HCV-1 a homologními oblastmi jiných typů viru hepatitis C.
Polypeptidy jsou použitelné v imunozkouškách pro jeden nebo více typů HCV. Při zkoušce jednoho typu se vzorek uvede do kontaktu s jedním nebo více polypeptidy, obsahujícími typověklastrově specifický epitop za podmínek, které umožňují vazbu antigen-protilátka a stanovení, kdy se protilátky vážou ve vzorku k epitopu.
V imunozkoušce k rozlišení jednotlivého typu HCV se získá biologický vzorek od jednotlivce, uvede se do kontaktu s prvním typově specifickým epitopem nebo typově-klastrově specifickým epitopem za podmínek, které umožňují vazbu antigen-protilátka; kontaktuje se s druhým typově specifickým epitopem nebo typově-klastrově specifickým epitopem za podmínek, které umožňují vazbu antigen-protilátka a stanoví se, které protilátky ve vzorku se vážou buď k prvnímu, nebo druhému epitopu. Tyto stupně mohou být opakovány s mnoha polypeptidy, obsahujícími typově a/nebo typově-klastrově specifické epitopy.
Typicky, imunozkouška na anti-HCV protilátku(y) zahrnuje výběr a přípravu zkušebního vzorku, o kterém se předpokládá, že obsahuje protilátky, jako je biologický vzorek, potom inkubaci tohoto vzorku s typově specifickým epitopem nebo typově-klastrově specifickým epitopem za podmínek, které umožňují vznik komplexů antigen-protilátka a pak detekci tvorby takových komplexů. Vhodné inkubační podmínky jsou v oboru známé. Imunozkouška může být, bez omezení, v heterogenním nebo homogenním provedení a standardního nebo kompetitivního typu.
V heterogenním provedení se typově specifický epitop nebo typově klastrový specifický epitop typicky vážou k pevnému nosiči pro usnadnění oddělení vzorku od polypeptidu po inkubaci. Příklady pevných nosičů, které mohou být použity zahrnují, ale nejsou tak omezeny, nitrocelulózu (např. ve formě membrán nebo mikrotitračních destiček), polyvinylchlorid (např. v deskách nebo mikrotitračních jamkách), polystyrénový latex (např. v kuličkách nebo mikrotitračních plotnách), polyvinylidenfluorid (známý jako ImmunolonR), diazotizovaný papír, nylonové membrány, aktivované kuličky a kuličky Proteinu A. Například Dynatech ImmunonR 1 nebo Immunolon2 mikrotitrační destičky nebo 0,25 palcové polystyrénové kuličky (Precision Plastic Balí) mohou být použity v heterogenním provedení. Pevný nosič, obsahující typově specifický epitop nebo typově klastrově specifický epitop je typicky promyt po jeho oddělení ze zkoušeného vzorku a před detekcí navázaných protilátek. Jak standardní tak kompetitivní provedení jsou v oboru známé.
V homogenním provedení se zkoušený vzorek inkubuje s typově specifickým epitopem nebo typově klastrově specifickým epitopem v roztoku. Například to může být za podmínek, kdy se budou srážet jakékoliv komplexy antigen-protilátka, které se vytvoří. Jak standardní, tak kompetitivní provedení pro tyto zkoušky jsou známé v oboru.
Ve standardním provedení se množství HCV protilátek tvořící komplex protilátka-typově- nebo typově-klastrově specifický epitop sleduje přímo. Toto může být provedeno stanovením, jak se značené anti-xenogenní (např. antihumánní) protilátky, které rozpoznávají epitop na anti-HCV protilátkách, budou vázat díky tvorbě komplexu. V kompetitivním provedení se množství HCV protilátek odvodí od kompetitivního účinku na vazbu známého množství značené protilátky (nebo jiného kompetitivního ligandu) v komplexu.
V inhibiční zkoušce se stanoví schopnost protilátek vázat se k polypeptidům, obsahujícím různé odlišné typově specifické epitopy k typově-klastrově specifickým epitopům. Protilátky se nejprve vystaví polypeptidům, obsahujícím epitop(y) z jiného typu nebo typ-klastru HCV. Proces může být opakován pro další typy nebo typové klastry HCV.
Vytvořené komplexy obsahující anti HCV protilátky (nebo v případě kompetitivní zkoušky, množství soutěžící protilátky) se detegují mnoha známými technikami, v závislosti na provedení.
-9CZ 294629 B6
Například neznačené HCV protilátky v komplexu mohou být detegovány za použití konjugátu antoxenogenního Ig komplexovaného se značením (např. enzymovým značením).
V typických imunozkouškách se testovaný vzorek, typicky biologický vzorek, inkubuje s polypeptidy, obsahujícími jeden nebo více typově specifických epitopů nebo typově-klastrově specifických epitopů za podmínek, které umožňují tvorbu komplexů antigen-protilátka. Různá provedení mohou být použita. Například „sendvičová“ mohou být použita tam, kde se protilátka váže k pevnému nosiči a je inkubována zkoušeným vzorkem; promyta; inkubována se druhou, značenou protilátkou k analytu a nosič je opět promyt. Analyt se deteguje stanovením, je-li navázána druhá protilátka k nosiči. V kompeptitivním provedení, které může být buď heterogenní nebo homogenní, se zkoušený vzorek obvykle inkubuje s protilátkou a značí. Kompetitující antigen se také inkubuje, buď postupně, nebo současně. Tato a jiná provedení jsou známa v oboru.
Protilátky řízené proti typově specifickým epitopům nebo typově-klastrově specifickým epitopům mohou být použity v imunozkoušce pro detekci virových antigenů u pacientů s HCV vyvolanou NANBH a v infekční krvi dárců. Navíc jsou tyto protilátky extrémně vhodné pro použití v detekci akutní fáze dárců a pacientů.
Imunozkouškamůže použít například monoklonální protilátku řízenou proti typově specifickému epitopů nebo typově-klastrově specifickému epitopů, kombinaci monoklonálních protilátek řízenou proti epitopům jednoho virálního antigenů, monoklonálních protilátek řízených proti epitopům různých virálních protilátek, polyklonálních protilátek řízených proti stejnému virálnímu antigenů nebo polyklonální protilátky řízení proti různým virálním antigenům. Protokoly mohou také například používat pevné nosiče nebo může být provedena imunoprecipitace. Nejvíce zkoušek zahrnuje použití značené protilátky nebo polypeptidu; značení může být, ale nemusí být omezeno na molekuly enzymatické, fluorescentní, chemiluminiscentní; radioaktivní nebo barviv. Jsou také známy zkoušky, které amplifikují signály ze sond; příklady takových zkoušek, které využívají biotin a avidin a enzymem značené a zprostředkované imunozkoušky, jako je ELISA zkouška.
Vynález dále zahrnuje nukleokyselinové molekuly, kódující sekvence aminokyselinových zbytků popsaných typově specifických epitopů a typově-klastrově specifických epitopů. Tyto nukleokyselinové molekuly jsou použitelné jako sondy například pro Southem bloty nebo jiné DNA rozpoznávající zkoušky jako je zachycovací zkouška popsaná v patentech US 4 868 105 a 5 124 246.
Studie antigenního mapování expresí HCV cDBA ukazují, že mnoho z klonů, obsahujících tyto cDNA exprimuje polypeptidy, které jsou imunologicky reaktivní se sérem z jednotlivců, vykazujících NANBH. Žádný jediný polypeptid nebyl imunologicky reaktivní se všemi séry. Pět z těchto polypeptidů bylo velmi imunogenických v tom, že protilátky k HCD epitopům v těchto polypeptidech byly detegovány v séru různých pacientů i když přesah v detekci nebyl úplný. Proto výsledky imunogenicity polypeptidů kódovaných v různých klonech potvrzují, že účinné detekční systémy pro HCV infekci mohou být provedeny za použití panelů epitopů. Epitopy v panelu mohou být konstruovány v jednom nebo více polypeptidech. Zkoušky pro různé epitopy mohou být postupné nebo současné.
Kity vhodné pro imunodiagnózu a obsahující vhodně značená činidla jsou konstruovány balením vhodných materiálů, zahrnujících polypeptidy podle vynálezu, obsahující typově specifické epitopy a typově-klastrově specifické epitopy nebo protilátky řízené proti typově specifickým epitopům a typově-klastrově specifickým epitopům ve vhodných kontejnerech, spolu s ostatními činidly a materiály, potřebnými pro provedení zkoušky jakož i příslušným návodem pro použití.
Vynález dále zahrnuje nukleokyselinové molekuly komplementární k nukleokyselinovým sekvencím, lemujícím regiony, kódující typově specifické epitopy a typově-klastrově specifické epi
- 10CZ 294629 B6 topy. Takové nukleokyselinové molekuly jsou vhodné pro provedení PCR pro stanovení genotypu jednotlivého HCV.
Bylo by třeba poznamenat, že se vyskytují různé a hypervariabilní regiony v HCV genomu; proto je homologie v těchto regionech považována za významně nižší než v celém genomu.
Techniky pro stanovení nukleokyselinové a aminokyselinové homologie jsou v oboru známé. Například aminokyselinová sekvence může být stanovena přímo a porovnána se sekvencemi zde uvedenými. Alternativně může být nukleotidová sekvence genomického materiálu domnělého HCV stanovena (obvykle přes cDNA meziprodukt), může být stanovena kódující aminokyselinová sekvence a odpovídající regiony porovnány.
Předchozí diskuse a příklady pouze ilustrují vynález pro odborníky v oboru bude zřejmé, že vynález může být proveden jinými cestami a vynález je definován rozsahem předložených nároků.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Porovnání hlavních epitopů různých odlišných typů HCV
Homologie aminokyselinových zbytků mezi různými typy a subtypy HCV byla porovnávána pro různé regiony. Subtyp HCV je popsán Simmondsemovou fylogenetickou analýzou. Číslování aminokyselinové sekvence odpovídá číslování popsanému pro prototypovou HVV-1 sekvenci. Choo a spol. tabulka 2 ukazuje procento homologie aminokyselinových zbytků pro NS4 region typově specifických epitopů a typově-klastrově specifických epitopů a konzervovaného hlavního epitopu. Tabulka 3 ukazuje homologii aminokyselinových zbytků mezi dvěma typově specifickými epitopy a typově-klastrově specifickými epitopy NS5 regionu. Tabulka 4 ukazuje procento homologie aminokyselinových zbytků pro jaderný region konzervovaných hlavních epitopů a typově specifických epitopů.
Tabulka 2
Aminokyselinová homologie (%) mezi různými HCV subtypy
| HCV subtyp | příklad zkratky typu | NS4 region typ specifických hlavních epitopů (1689-1718aa)* | NS4 region konzervovaného hlavního epitopu (1910-1936aa)* |
| la | HCV-1 (la) vs(la) | 100 % | 100% |
| lb | HCV-J (la) vs (lb) | 83 % | 100 % |
| 2a | HCV-J6 (la) vs (2a) | 47% | 93 % |
| 2b | HCV-J8 (la) vs (2b) | 43 % | 93% |
- 11 CZ 294629 B6
Tabulka 3
Aminokyselinová homologie (%) mezi různými HCV subtypy
| HCV subtyp | příklad zkratky typu | NS4 region typ specifických hlavních epitopů (2281-2313aa)* | NS4 region konzervovaného hlavního epitopů (2673-2707aa)* |
| la | HCV-1 (la) vs(la) | 100% | 100 % |
| lb | HCV-J(la) vs(lb) | 76% | 89% |
| 2a | HCV-J6 (la) vs (2a) | 70% | 83 % |
| 2b | HCV-J8 (la) vs (2b) | 73 % | 83 % |
| 3a | HCV-E-bl (la) vs (lb) | 77% | |
| 3b | HCV-Tb (la) vs (3b) | 83% |
Tabulka 4
Aminokyselinová homologie (%) mezi různými HCV subtypy
| HCV subtyp | příklad zkratky typu | NS4 region typ specifických hlavních epitopů (10-45 aa)* | NS4 region konzervovaného hlavního epitopů (67-84 aa)* |
| la | HCV-1 (la)vs(la) | 100 % | 100 % |
| lb | HCV-J (la) vs (lb) | 98% | 100% |
| 2a | HCV-J6 (la) vs (2a) | 98% | 61 % |
| 2b | HCV-J8 (la) vs (2b) | 98% | 61 % |
| 3a | HCV-E-bl (la)vs (3ab) | 93% | 89% |
| 4 | HCV-EG-21 (la) vs (4) | 98% | 83 % |
Příklad 2
Syntéza peptidů
Byly syntetizovány dvě sady polypeptidů. První sada byla sestavena pro provedení epitopového mapování HCV-1 a druhá sada byla sestavena pro zjištění, který epitop identifikovaný ve studiích 20 mapování epitopů obsahuje typově specifické epitopy. V první sadě bylo syntetizováno šedesát čtyři sad (dvojmo) přesahujících oktapeptidů pomocí Momotopes přes celý HCV-1 polyprotein (3011 aminokyselinových zbytků).
Druhá sada polypeptidů byla provedena podle metody popsané Geysenem (1990) J. Trop. Med. 25 Pub. Health, 21: 523-533 a Merrifield (1063) J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2154.
Ve druhé sadě polypeptidů byly vybrány čtyři antigenní regiony, které představují hlavní epitopy nebo konzervativních sekvencí v HCV-1 z jádra, NS4, NS5 a jejich odpovídajících sekvencí z HCV subtypů lb, 2a, 3a a typu 4 pro typově specifickou epitopovou syntézu. Sekvence z jádra 30 byla vybrána z méně konzervovaného regionu aminokyselinových zbytků 67-88. Sekvence z NS4 regionu byla vybrána z aminokyselinových zbytků 1689-1718. Sekvence vybrané zNS5 regionu byly regiony aminokyselinových zbytků 2281-2313 a 2673-2707.
-12 CZ 294629 B6
Příklad 3
Biologické vzorky
Za účelem stanovení účinnosti polypeptidů v rozlišování mezi protilátkami specifickými k různým typům HCV byla získána antiséra od dvacetičtyř chronických NANHH pacientů z různých oblastí Spojených států - východní a západní pobřeží, Japonska, zemí západní Evropy, jižní Evropy a jižní Afriky. Virální RNA izolace, cDNA syntéza, PCR amplifikace, DNA sekvenování ahybridizace oligonukleotidovou sondou byly provedeny jak popsal Cha a spol. (1992) Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 89: 7144-7148.
Příklad 4
Postupy mapování epitopu
Za účelem stanovení, které regiony HCV obsahují epitopy, jak skupiny konzervované tak specifické, byl celý HCV-1 polyprotein podroben epitopovému mapování. Metoda je v podstatě znázorněna na obr. 2.
Sedesátčtyři (dvojmo) přesahujících oktapeptidů bylo syntetizováno pomocí MimotopesR přes celý HCV-1 polyprotein (3011 aminokyselin). Panel 40 vzorků, který obsahuje 25 US HCV protilátka reaktivních vzorků, 9 japonských HCV reaktivních vzorků a 6 HCV nereaktivních negativních kontrolních vzorků, které byly vybrány pro epitopové mapování a klasterovou analýzu. Imunozkoušky byly provedeny za použití standardních ELISA postupů.
Kriteria pro identifikování hlavních epitopů byla založena na četnosti protilátkové reakce a intenzitě (titru) protilátkové reakce k těmto epitopům. Výsledky jsou uvedeny na obr. 3 a 4.
Příklad 5
Studie peptidový odvozený enzym-napojený imunosorbent
Za účelem stanovení optimální imunozkoušky využívající polypeptidy popsané v příkladu 2, byly provedeny dva rozdílné typy zkoušky polypeptid odvozený enzym-napojený imunosorbent (ELISA) a výsledky byly porovnány. První typ ELISA byl Nunc MaxiSorb™ na který byly peptidy jednoduše adsorbovány a druhý typ použil Nunc Convalink NH™, na který jsou polypeptidy navázány kovalentně. Tvorba amidových vazeb mezi karboxylovými kyselinami a aminy je iniciována přídavkem karbodiimidu. Pro snížení hydrolýzy může být aktivní ester vyroben přídavkem N-hydroxy-sukcinimidu (NHS) k výše uvedeným konjugačním postupům.
Mikrotitrační plotny pro první typ ELISA byly provedeny následovně. Polypeptidy byly umístěny do jamek Nunc MaxiSorb™ mikrotitračních ploten v koncentraci 1 pg/jamka ve 100 μΐ fosfátem pufrovaného salinického roztoku (PBS). Polypeptidy byly ponechány absorbovat přes noc při teplotě místnosti. Mikrotitrační plotny byly pak promyty čtyřikrát PBS bez detergentu. Jamky pak byly následně potaženy 220 μΐ Superblock™ (Pierce) po jednu hodinu a pak aspirovány bez dalšího promývání a vakuově sušeny.
Zkouška byla provedena následovně. Vzorky séra o objemu 5 μΐ byly přidány do jamek se 100 μΐ 5% netučného mléka a inkubovány po jednu hodinu při 37 °C. Jamky pak byly promyty pětkrát v PBS s 0,05 % Tweenu. Konjugát afínitně čištěného kozího anti-humánního IgG značeného s křenovou peroxidázou (Jackson Laboratories) byl pak použit pro stanovení stupně navázání lidských protilátek k polypeptidům. Konjugát byl předem zředěn na 5 % IgG ve 150 mM NaCl,
-13 CZ 294629 B6
PBS, 5% koňské sérum (tepelně denaturované). 100 μΐ konjugátu bylo umístěno do jamek a inkubováno jednu hodinu při 37 °C. Jamky pak byly promyty pětkrát PBS/Tween a OPD [o-fenyldiamin-2HCl, jedna tableta na vývojku pufru (citrát a fosforečnan pufrovaný 0,02% H2O2); Sigma] po třicet minut při teplotě místnosti a byla stanovena absorpce při 492 a 620 nm. Vzorek 5 byl stanoven ze 200 náhodných (normálních) vzorků při sedmi standardních odchylkách od průměru nebo asi 0,45.
Mikrotitrační plotny pro druhý typ ELISA byly provedeny následovně. Polypeptidy byly umístěny v jamkách Nunc MaxiSorbR mikrotitračních ploten v koncentraci 10 mg/jamka v 50 μΐ vody, 10 25 μΐ 0,1Μ NHS (sulfo-N-hydroxysukcinimid, Pierce) a 25 μΐ 0,1Μ EDC [1—ethyl—3—(3—dimethylaminopropylkarbodiimid) Sigma] bylo přidáno k polypeptidům a mícháno při teplotě místnosti 30 minut na kývající se plošině. Celé obsahy byly přidány k 52 ml ledově studeného 0,lM uhličitanu sodného, pH 8,6. 100 μΐ směsi bylo použito pro potažení jamek mikrotitračních ploten a pak inkubováno při 4 po 30 minut. Plotny byly promyty čtyřikrát PBS/0,1% Triton 15 X-100. Plotny byly pak zpracovány se Superblock a zkouška byla provedena jak popsáno výše.
Výsledky jsou uvedeny v následujících tabulkách 5 až 14.
- 14CZ 294629 B6
Ta bu1ka s seroklasifikace epitonové analýzy z různých HCV typů__________________
NS4 (1689-1710} ~
Sekv.region vzorekio Peptid Peptid sekvence závislá na typu
EIA (HCV Typ }
| M | M | ||||
| >4 | H | J | iJ | ||
| X | X | X | <qf | ||
| U | U | CU | 2 | 2 | |
| X | X | u | X | ||
| o | o | X | V) | to | |
| W | to | to | < | « | |
| O | o | < | o | u | |
| ω | ω | u | ω | ω | |
| tó | ω | M | M | ω | |
| X | X | ω | X | X | |
| w | ω | X | ω | ω | |
| Q | η | ω | o | ο | |
| Cm | Cm | o | Cu | u | |
| ω | ω | Cm | < | *c | |
| X | X | O | ω | ω | |
| x | X | X | X | X | |
| u | u | □ | *4 | u | « |
| > | > | > | > | Μ | |
| w | ω | W | ω | Μ | |
| X | X | X | X | X | |
| O | ο | CJ | Q | ο | |
| cu | χ | cu | CU | X | |
| >-l | Μ | KC | |||
| M4 | H | > | |||
| < | c | > | ζ | ||
| X | CU | X | « | ||
| X | X | X | X | X | |
| u | o | o | o | Q | ♦ |
| <0 | to | to | z | ζ |
| rf— | rf— | rf— | rf—, rfK. | co | |
| <β | £> | «ο | Λ | £1 <0 XI | M |
| Ή | rH | <Ν | οι | Η Η OJ Μ | ♦4 |
| ·*·* | — | —rf· —r· —* —rf | to | ||
| Ο | r~< | Οί | ΓΠ | O HO4 H | |
| ·—1 | *-4 | •M W «Η r-4 | O | ||
| i | 1 | I | 1 | lili | O |
| 04 | OJ | 04 | 04 | oj O4 oj oj | X |
| Ο | ο | ο | ο | o o o o | O |
| τΤ | V | rr | Kř ·<? Tf | Ό | |
| CU | α | CL | CL | “CL X X X | O |
| υ | υ | υ | υ | υ υ u u | m |
| 0 | O | 4> |
| ctí | ||
| r4 | c | •H |
| a | □ | s |
| □ | '>1 | |
| Ό | «3 | c |
| O | r4 | >N |
| ti | >a> | |
| > | £> | |
| Λί ·Ρ | d | |
| U □ | o | <n |
| 0 U | ||
| n '<a | !>· o | Φ |
| > Ό | Jí o | •n |
| M *5· | □ | |
| 0 f' | tn | |
| — | N “? | <0 |
| — *4 | 0) μ |
| X | X | |
| >4 | ||
| > ►-* | > χ | |
| ω | ω | |
| X X | X X | |
| α | Q | |
| X | X |
Tabulka 6 Seroklasifikace epitopové analýzy z různých HCV typů sekvenční region NS4 (1689-1718) popis vzorku peptid EIA peptid z typově závislé sekvence signál/řez různých HCV
| »-4 | M | H | ||||
| X | X | 1 M | 1-3 | 0 | ||
| CL | CL | X | ||||
| U | u | 2 | 2 | |||
| X | X | ►4 | s | 2 | ||
| o* | o | X | co | <0 | ||
| <0 | co | CO | < | < « | ||
| o | o | < | u | υ | ||
| ω | M | U | M | M | ||
| ω | Id | M | Cd | Ed | ||
| X | X | W | X | X | ||
| Cd | W | X | Cd | Cd | ||
| o | 0 | ω | O | 0 | ||
| k | Cm | Q | Cm | k | ||
| ω | td | Cm | < | < | ||
| x | X | Ο» | Cd | Cd | ||
| X | X | X | X | X | X | X |
| u | *4 | »4 | «4 | *4 * | >4 | |
| > | > | > | > | > »-»1 | > | |
| Cd | W | Cd | Cd | Cd | co | Cd |
| x | X | X | X | X | X Xi | X |
| Q | Q | a | O | O | o | a |
| X | CL | CL | CL | CL | CL | X |
| w | H4 | M | < | < | ||
| w | HC | > | > | |||
| < | < | > | J> | |||
| X | £L | CL | > < | |||
| Lí | X | X | 2 | t£ | ||
| 0 | 0 | 0 | o | Q « | ||
| <0 | 10 | co | Z | Z |
| co | ||||||
| x> | řO | x> | « X> « X> | w | ||
| •H | CM | CM | Η Η N CN | 0 | ||
| 'w* | *—» | *w» | ω | |||
| O | t-H | CM | m | O Ή CM «η | ||
| r-4 | r-4 | r—< | ·< »-4 | o | ||
| 1 | 1 | 1 | 1 | lili | o | |
| CN | CM | CM | CM | CM CM CN CM | w | |
| & | O | O | O | O | O O O O | o |
| TT | *y | <T «Γ V <7 | η | |||
| -μ | CL | CL | CL | CL | CL CL CL CL | 0 |
| υ | O | υ | O | υ □ υ υ | m |
| co | r· | «—4 | r* | co | tn | CM | |||||
| •Λ | r* | CM | O | 03 | <P | « | • | « | « | • | |
| • | ♦ | » | ♦ | m | r· | co | Γ* | ||||
| ΙΛ | cn | CD | vD | kD | í>^ | (0 | »—< | ||||
| £b | |||||||||||
| 0 | ω | ||||||||||
| 4J | •ΓΊ |
- 16CZ 294629 B6
| ►J u | ||
| < < | ||
| 2 < * | < < | |
| £ | Λ 2 | |
| CO v> | W CO | |
| < Λ | < < | |
| O O | u o |
| H | M | M | n | M |
| ÍM | X | ♦4 | u | |
| Dy | ÍL | & | ||
| u | *4 | ►4 | 2 | 2 |
| X | X | X | 2 | |
| Ο» | O | w | w | to |
| w | co | «c | < | < |
| o | O | o | o | u |
| ω | m | ta | ta | ω |
| » | tu | ta | ta | ω |
| X | X | X | X | X |
| tu | ω | ta | ta | tu |
| O | Q | o | o | Q |
| U« | Ur | ta | tx | ω |
| ω | tu | ta | < | < |
| X | al | cx | ta | ω |
| >* | X | X | X | |
| «u | u | ►a | u | |
| > | > | > | > | Μ |
| ω | ω | ta | ca | w |
| tí. | X | « | X | |
| o | o | o | o | Q |
| ÍX | CL | u | Cb | CL |
| »-4 | M | < | < | |
| *-í | k-4 | > | > | *> |
| < | < | < | > | ·> |
| CL | CL | a. | <ť | ~> |
| u; | Pí | |||
| O | o | o | o | Q |
| co | w | w | z | z; |
| Λ | <0 | Λ | |
| *-4 | CM | CM | |
| iw· | |||
| O | <N | r·) | |
| »-< t | •H | | «-Η | r-4 |
| 1 CM | 1 (NJ | 1 CM | 1 CM |
| O | O | O | O |
| vr | ΤΓ | ||
| CL | CL | CL | CL |
| O | U | U | U |
| Ή G | Ή C | |
| > 4-> | > | |
| ní | ύ£ | |
| G) P | «5 | |
| < | ||
| »e | <O | «*« *·'» r-* |
| Íú Λ m Λ | 1-4 | c0 Λ <0 XJ |
| Hrl (N (N | »4 | -4 «-1 CM CM |
| *x** | tó | *»* |
| o ή cm n | O «-< cm c*> | |
| ♦K rd ^4 r-< | O | eM Η Η H |
| 1111 | O | lili |
| CM CM CM CM | ♦—< | CM CM CM CM |
| O O O O | O | O O O O |
| «y *r | *0 | «? <r v |
| CL CL CL CL | o | Q. Cu (X CU |
| o υ o o | o | O u u u |
| CO | C* ·Η | CO | r-> | r· | T? n ť\ |
| d> | VJO CO | co | CM | CM | in > |
| ♦ | « * | • | • | » | • · · |
| O | O Γ' | o | O | O | O in tt |
o
| Xt CM | D CM | ||
| CM | <3 | Cr» | |
| r> | r» | «» | |
| 1 | <ϋ | 1 | <υ |
| H | CM | (-1 | ΓΝ |
.41 sodCIOO ELISA(la)
- 17CZ 294629 B6
| H | H | £- | H | ||
| H | H | H | H | & | |
| 4 | 4 | «4 | 4 | 4 | |
| > | > | > | > | > | > |
| O | O | 0 | O | u | O |
| CO | co < | V) *C | <0 | to | co Λ |
| 2 o | 2 u | 2 υ | 2 υ | 2 o | 2 o |
| λ | CX | (X | CX | cx | íX |
| CX | cx | X | cx | cx | (X |
| X | X | X | X | X | X |
| P | 0 | o | 0 | 0 | o |
| o | O | Q | u | o | o |
| τζ | & | H | CO | 0 | o |
| W | CM | 0» | o | cm | < |
| 9 | o | 0 | 0 | o | 0 |
| X | X | X | X | X | |
| v> | co | to | co | co | to |
| Z | <Z | z | Z | z | z |
| H | Cm | Cm | H | Cm | |
| 4 | 4 | X | X | X | X |
| ÍX | CX | CX | cx | & | Cl |
| o | u | o | o | 0 | 0 |
| o | 0 | 0 | o | o | 0 |
| > | w | > | > | > | U |
| X | X | X | X | X | X |
| 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 |
| tí. | CX | cx | cx | X | CX |
| ω | ω | ω | ω | 4 | ω |
| H | H | f-· | H | ||
| 4 | 4 | •4 | «4 | 4 | 4 |
| V) | to | <O | co | CO | co |
| X | (X | X | CO | X | w |
| ř-4 | w | ♦H | w | H( | M |
| < | u - | |||||||||||
| <6 | XI | <6 | X | Λ | rfl | 0 | £ * | £> | flj | XI | Λ | nj |
| T-l | •H | CM | n | <N | ΓΊ | Ht | 0 Ή | ·—1 | CM | <O | CM | m |
| «w* | w» | >·*«· | >»_» | •v | 4 | 4J — | w* | |||||
| m | vo | t | co | W | in | KD | <n | Γ- | co | |||
| 1 | 1 | | | l | > 1 | i | 1 | 1 | |||||
| CM | CM | CM | CM | CM | CM | in | CM | CM | CM | CM | CM | CM |
| O | O | O | O | O | o | co | x: o | O | O | O | O | O |
| *<r cu | *r a | cx | <r CX | tt a | <T A | z | B o- | CX | ^r cx | •cř CX | KT CX | <r CX |
| u | o | u | u | 0 | u | kl | o' υ +> Ή Cb a> > $ i | u | o | υ | U | O |
| cn | in | CM | co | o | O | O « | in | CD | <*> | r*· | m | |
| ro | r- | KD | in | in | bl -J | kD | CM | o | M· | |||
| m | m | r*·) | o | CM | •H | CM | «Η | O |
| 5 | ΰ | Γ0 co |
| Ή | •H | sř |
| g | C § | CD tH O 1 |
| V) .-J | 5 | *T m |
ot
Kritická sekvenční změna provedená v epitopů odpověá ve vzorku
- 18CZ 294629 B6
Tabulka 9 Seroklasifikační epítopová analýza různých HCV typů
| H | E-i | H | |||
| H | e-4 | H | CL | ||
| t-3 | Cm | U | |||
| > | > | > | > | ||
| 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| V} < | w | 0 < | 0 | < | to |
| 2 u | 2 u | 2 u | 2 u | 2 u | 2 o |
| í£ | a | ix | K | íx | cí |
| CZ | Λ | a | a | IX | |
| >4 | >4 | >4 | X | X | X |
| 0 | ϋ | 0 | 0 | 0 | 0 |
| u | o | 0 | u | U | 0 |
| 2S | z | H | w | co | o |
| ώ | o | O | o | O* | < |
| o | 0 | O | 0 | 0 | 0 |
| cc | S4 | US | írf | ||
| W | « | w | co | w | 0 |
| Z | Z | z | z | z | z |
| H | u. | Cm | Cm | ||
| UJ | Ul | z | X | X | X |
| řL | CL | CL | CL | CL | CL |
| 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| O | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| > | t-4 | > | > | > | Q |
| X | X | >4 | X | X | X |
| _3 | UJ | u | UJ | .4 | Ul |
| Ct | cť | ci | Cť | ct | |
| ω | W | ω | M | w | ω |
| H | H | H | (- | ||
| u | U | *4 | *4 | ►4 | u |
| 1/3 | 10 | W | 1/3 | V} | <0 |
| tX | X | to | X | to | |
| M | M | ♦H | x | L4 |
| fl | Λ | 4 | s | jo | « | < 0 | i | re | x> | d | ♦O | Λ | flj |
| •H | rH | CM | ťO | CM | **> | H | r4 | «—c | CM | <*> | 04 | o> | |
| ·—.» | »w* | %<* | »4 | <k->· | ··* | •w> | *v« | ||||||
| 4cr | in | cn | o- | cd | ω | > | <r | tr> | XD | O | o- | CD | |
| CN | 04 | 04 | 04 | 04 | Λ | m | 04 | 04 | CM | 04 | A | CM | |
| O | O | o | O | O | o | w | xí | O | O | O | O | o | O |
| *7 | 4y | «<?· | *»y | ’Τ | z | KT | •y | «σ | TT | Ό- | «Τ | ||
| CL | a | a | cu | a | Q | 1 | δ | cl | a | CL | a | cl | Cu |
| u | □ | O | u | o | O | u | i > 1 1 | U | u | υ | u | o | u |
| o· | r-4 | 04 | M3 | CD | CD | □> | O | (A | CM | cn | o | ||
| O | O | in | r*4 | in | ’Ο’ | \D | EL | CD | r-4 | Uf) | *7· | r· | XD |
| *~í | T-< | r-i | o | O | t-4 | ctí | m | n | 04 | <n | o | O |
| O '<0 | |||
| •H | 4č | sD | |
| g1 | 5 | o •á | xD CO CO |
| o | •—4 | ||
| Ή | 0 | M | O |
| c | N | jd | |
| >0 a | > | υ | co |
| δ | W | ||
| > | •H | — | |
| /h | R* | n | «4 |
| ω | 8: | — |
a. · u.
SI
Ol
-19CZ 294629 B6
B
Ol Φ o
&
tn £
+>
A <M <tí CM
ΟΧ|Ο < *
H x o ω X
I A €3
A
I
CL_ Φ 03
ŽE
A CM <ϋ (N ·—<J *1 >· A x <
X
A A <? X x x O vil ω uj <1 <
O O <U1 s > > ? »-«) <£l txi <lo. cx u cx cx u <
o x
a.
IX ,, „ „ W|>|CXM < O >< ‘ ---Q o.
>4 Q X
| o o u | •W . -H | |||
| A | Qj n | |||
| CM | ||||
| <3 |
X I
A CM c25 «0 CM
OJ
| T7 | <TJ | *d | < | ω | « Λ | « | « | <c x> | ns | |||
| CO | CM | <O | Ch | rd >~l | CM | i-4 | «-< | <n | rd | |||
| i | 1 | • Λ | ω | 1 1 | 1 | • | X | < | l l | 1 | ||
| r* | > | > | > | & | sO | ? > | > | δ | CM | > | > > | > |
| A£> | o | O | O | p | •H | o o | ω | CM | u | u o | v | |
| X | X | X | *·* | X X | X | *-* | X | X X | X |
A <0
A
CM
I > O X
| Ř» | >4 | |||
| cl | > | |||
| 0 | O | >< | ||
| +» | O | cl | ||
| H | > | 0 | r-< | |
| hO. | w | r-t | P | | |
| ΟΦ | Ο» | 1 | •H | > |
| O - | 0 | > | CL | Q |
| •HN | O | O | Φ | X |
| 0 a | X | • .. N — | > | |
| MM | 1*4 | 0 | C Cm | >< |
| A | O O h·) | X | ||
| > | X | —Ι,Μ Τ' | H | |
| >P | X | ετ t | X | |
| p> w | in Οϋ | ΟΡΗ » | vil | |
| •V X | X | x α λ | > | |
| 1 X | X | > IN | X | |
| 'HIC , | in pj | X | v m | X |
| *-i Z | A | ιλ >-j ·-< | o | |
| — H J | z xí ·— | X |
>h*H cm
X
O
X
X <
CM
-20CZ 294629 B6
O
O
CQ < w ω
Ό •*4 <P Q
Φ Cu
o* d. cu cu XSřJ β. a, o. a, > x X u. c o o o o* cu a* cu
t£ cZ tí. Λ ás
CH cc CH CH žž
>4 u Ck
rtí <0
| O | S4 | ΟΟ« |
| < | O | < < * |
| 3 | s | X X |
| H | « | w w |
| tz | a: tc | |
| o | O | u o |
| M | H | ω ω |
| tk | W | W (Λ « |
O
| CM | «*·« — | |||||||
| Λ «Ο | Λ | Λ | •H | Q | Λ | |||
| r-< <N | fí | CM | t | CM | ||||
| 4 4 ~ | LB | <2 — | CM | LB | i3 | |||
| 1tí < ctí | C | Ctí Ctí — | •w* | «6 | <tí | <0 | ||
| h oj n | ττ | rH | cm n ·*? | < | CM | m | «e | |
| ·—* «*-* “ | *—<· | *.** *^· | 40 | |||||
| 1H CM xr | tr> | rM | cm *σ tn | M | CM | <σ | ΙΛ | |
| o o o | O | O | o o o | u | O | O | O | O |
| 1 1 1 | 1 | i | 1 1 1 | w | l | I | 1 | I |
| Η Η H | *—4 | rH | ·—< *-1 | •H | «-4 | ·—1 | ||
| O O O | O | O | O O O | CM | O | O | o | O |
| Tf xT <? | xr *v | CM | •σ | |||||
| O- Q- O- Q- | o< a a au | -CL | ο- | ο- | cx | |||
| υ o υ | υ | υ | υ o o | U | XJ | υ | υ | υ |
<e ctí
| o | »4 | oo« |
| rt | n | *£ «£ * |
| 3: | 3 | £ 3 |
| H | to | w w |
| (Z | X | a a |
| U | o | 0 o |
| ÍU | H | ω ω |
| Ck | V) | w w * |
O CM
| r-4 | «—w | ||
| 1 | X3 | o | |
| CM | r-4 | CM | |
| tíS | <4 | ||
| <0 | ctí | <0 —· | |
| < | •H | CM | r*> -q· |
| CO | «Μ0 | ||
| »-< | CM | 40· U*» | |
| xí | O | O | O O |
| ω | 1 ř-4 | t | 1 1 •“4 r-< |
| CM | O | O | O o |
| CM | *?· | *T | 40 «0 |
| O | ο- | ο- | a ο- |
| w | υ | υ | υ υ |
Í0 ctí
O CM *-<
I ťU to ♦-4 ♦J ω
CM CM O u
| c*í v> o i£> «*4 | -“4 | CM | tn σ\ | CO | CM | in | r- |
| σ» ďt r· CO Φ | m | tn | O c* | ^4 | O | r* | CO r*> |
| r- r* r- o <o | O | r* | r-< O | ω | <r | rM -~4 |
<F·*>
\DXí
10CM
QX
CM sO
-21 CZ 294629 B6
Tabulka 12 Seroklasifikace epitopové analýzy různých typů HCV sekvencí /1/ Chronické NRNBII od plac.dárců Sekv.region: NS5 /2281-2313/
| O O O Q |
| I |
| > > > > |
| > !> Η H |
| 0 0 < 0 |
| 0 0 0 0 |
| ω > θ' μ |
| X X X X |
| Q Q Q 0 |
| 0 0 0 04 |
| « 0 Pí 0 |
| w w w w |
| l£ Sc ÍS 3: |
| Η ω CZ) H |
| ω M M M |
| > μΐ > Hi |
| l~3 1-4 >h |
| 0 04 04 > |
| 04 04 04 04 |
| κ z z z |
| X X X X |
| Q Q Q Q |
| 04 04 04 04 |
| Pí ítí Pí « |
| Skáš |
| > H< 04 |
| 04 04 0 04 |
| O O J J |
| < < < < |
| θ' 0 0 0 |
| <000 |
| 0 0 0 0 |
| <0 1 | <0 f—í | ||||
| rtí | 0 uJP | X—X | ® Λ «Λ | ||
| r4 | r4 CJ | tM | < | Η H fí N | < |
| V—, | w | Xrf- | ω | ||
| O | *-4 (M | rt | H4 | 0 r-4 C4 O | t-4 |
| O | O O | O | J | O O O O | |
| 1 | 1 1 | 1 | 0 | lili | ω |
| CJ | N C-J | <N | in | N N N <\ | in |
| O | O O | O | CZ) | O O O O | ω |
| xT xT | XT | Z | xr ·α· xr xr | z | |
| a | 0 a | a | 1 | 0 0 0 0 | 1 |
| u | υ o | υ | u | o u o υ | Li |
| O | r· | r- | ’ζΓ | r-4 | c* | cn | ca | ca | |
| in | tn | i-H | ·—1 | <£> | xT | xr | Čh | XT | XT |
| • | • | » | • | • | • | • | a | • | • |
| x* | «Η | o | in | ΓΜ | O | tn | o | o |
-22CZ 294629 B6
0 0 X X < > Η CL CL <
u >
H CL
CL CL CL £L ω > o m X X X > Q O Q 0 CL CL CL CL
Q 0 CL CL
| <o x> | íu-ja | |||
| rH | t | CM | CM | < |
| · | s-»» | 10 | ||
| O | w | CM | ΓΊ | hH |
| o | o | O | O | |
| 1 | t | 1 | 1 | w |
| <N | CM | fM | CM | m |
| O | O | O | O | to |
| V | Μ* | M· | M* | z |
| CL CL £L CL | 1 | |||
| O | u | o | u | í-i |
Z > Q CL X < Z
| CD | CH | O | > | M* | CO | CM | o | |
| CM | ID | r-4 | m | iň | ΓΊ | |||
| « | * | • | • | • | • | • | • | • |
| X | O | O | O | in | m |
nwet netypově specifické /konzervované/ epitopy
-23 CZ 294629 B6
| ϋ σ u u | U CD |
| !E ÍE C 25 | Z E |
| > > > > >>HR | ŽŠ |
| d d < d | d d |
| dl d d d | d d |
| Μ > O M | ω > |
| JX ÍH ΪΜ >4 | >· >1 |
| Q Q O CD | O o |
| d d £L< d< | d d |
| « O dl Pí | |
| Z 3: S: 3 | |
| Η ω W h | |
| w μ ω ω | |
| > f-4 > Μ | |
| 4-3 »—1 »~4 1-4 | |
| d d d > | |
| d d d d | x> |
| z z z z | r4 |
| ><>><>< | |
| O Q Q O | c3 |
| 0* PU P* Q-í | |
| Pí Pí Pí Pí | Cd |
| «C < < < | w |
| SSS 3: | |
| > FH < d. | |
| 0* 0* CU 0« | |
| u dJ .J dJ | |
| c c <C | |
| O d d d | |
| 04 04 04 | |
| Ui d Um d | & |
| £’ | |||||
| □ | cd | ||||
| <· «*—* W | •H | r4 | <^*-x «'«-X | ||
| cd X) nj'Xi | «Μ | cd Λ <d Xi —· | cd Λ | cd Xi | < |
| «-4 d oj OJ | fj | Η Η (Μ N < | «—< «Η | OJ OJ | co |
| *—-· s^· X—* | φ CO | x— — —' --CO | v-· s—- | Xw_>- | Í-H |
| O η η n | CLW | O d OJ Π M | 0 d | CM ΓΊ | XI |
| O O O O | tnltq | OOO Oj | 0 0 | 0 0 | ω |
| lili <M n n t\ | >0 5 in | 1 l 1 I W OJ OJ OJ OJ tn | r 1 CM CM | 1 1 CM C\J | in |
| O O O O | 0 « | o o o o co | 0 0 | 0 0 | co |
| XT XT XT XT | QiZ | xr if xf Z | TT | -e τΤ | z |
| CL CL CL CL | 4J j., | £U CL CL £Χι 1 | CL CL | CL CL | 1 |
| U U U O | υ υ υ 0 μ | υ υ | U U | Li | |
| « σι o r- | kD | o n »c o ιχ> | CO Ch | r* KO | σ> |
| OJ lď ι-C xT | r> | co χτ in in co | kD fň | 0 cn | 00 |
| « · · · | • | ||||
| r- v> o o | kO | r- tn 0 0 *ů | Γ t | ir> 0 | kD |
-24CZ 294629 B6
| r- | θ' | r· | n | ro | co | CĎ | |||
| w | w | •H | 0* | r4 | r~t | co | ® | ||
| r* | r- | O* | CA | m | <*> | CN | OJ | ||
| rH | ♦H | r4 | r-i | ťN | CM | CM | <M | ||
| 1 | | | 1 | I | 1 | 1 | 1 | t | 03 | co |
| OJ | CM | cm | kD | v | r4 | r* | O* | ||
| v< | r*4 | rH | CA | O | O | 00 | CO | 1 | |
| r* | r* | r* | «*> | «*) | CM | OJ | rH | t-H | |
| Ή | ^4 | w | *4 | CM | CM | CM | oj | o* | o* |
c o •rl σ>
w •<r w z.
c o σ' o; κ in z
ty ty o o u o
| w | CM | CO | u*> | Ό | n- | co | cr\ | o | |
| o | O | O | o | o | O | O | O | O | «“4 |
| «-4 | i—4 | ^4 | •—4 | •H k | r4 1 | «-4 • | |||
| 1 z | I Z | 1 Z | í Z | Z | Z | 1 Z | 1 z | 4 z | 1 z |
| ω | &3 | ω | M | M | w | W | W | ω | 1*1 |
| M | 4-t | M | W | t-t | M | M | M | n | »-< |
| X X | Z | X | X | X | Z | Μ X | X | ||
| υ o | υ | O | u | υ | u | o o | u |
| O Q X < > > é | z r o. x o |
| x S H 5 | > cu o < |
X J JUO. <tL Jž x di«£C>CLCUU<4:0lO <-irt kíkik: o<< cx x θ«(ΛθΩα<η.Ηω υ><<α<α.Ρ<ΡΜ(Μ<0(0
.........o
-25 CZ 294629 B6
Příklad 6
Byly provedeny imunozkoušky pro stanovení, které peptidy by mohly vzájemně soutěžit v navázání k protilátkám. Byly syntetizovány tři sady krátkých polypeptidů z jaderných NS4 aNS5 5 regionů různých typů HCV sekvencí. Tyto polypeptidy pokrývají sekvenční regiony od aminokyselin 1689-1695, 1696-1702 a 1711-1917. Inhibiční zkoušky byly provedeny přídavkem 10 pg výše uvedených polypeptidů ke vzorku a inkubovány při 37 °C po jednu hodinu a pak byly provedeny ELISA zkoušky jak popsáno výše. Jestliže byla nalezena inhibice více než 50 % protilátkové vazby polypeptid byl považován na inhibiční. Získané výsledky jsou uvedeny v nás1 o leduj ící tabulce 15.
-26CZ 294629 B6
| -D r4 | a> | XI Λ «Ή 01 | ||
| >*· | •u | r· | <Q Μ | |
| «ΰ | vH | <r4 CM | ||
| co | r-í | | | >W> *»·» | |
| t | ·«-* | O* | ||
| r* | CO | |||
| to | 0« | to | u ** | |
| & | *>*<. | w | > | |
| 0« | w» | ω | ||
| X | **·* | 2 M | ||
| 0 | Q | |||
| fe | fe | U. |
| 0X3 «u< | X X U | |
| as s | fe fe < | |
| H W W | ||
| fe K fe | ZE X fe | |
| o o o | C*w to | |
| W H fe | U3 < < | |
| fe u> W | u o o |
| J—,_ | Δ JO M· r~< Γ4 | r-i o | XI 04 | 04 | JQ v4 |
| *ř | 14 | •~4 | { | ||
| co | a uj o | 1 | 4» | *—< | 05 |
| | | Ch | co | |||
| r· | flj | co | <D Λ <0 | 01 | |
| to | «-< Ol **> | to | Η H CN | 01 | r-t |
| sz | 1 1 1 | f-i | 1 1 1 | •w» | t |
| y> > > | *-Z | > > > | > | ||
| u u O | O O Q | O | |||
| X X X | XXX | X |
| « m | ||||
| > | Xi | |||
| u | 04 | |||
| O 0 | X | I | ||
| < p | Ϊ | —--1 | | > | |
| > 5 | s | M | < ft. I | 0 |
| H t-> | > | fe | .............J f- | X |
| < a, | fe | I | ||
| fe fe | u | c | fe * | ř- |
| o « | < | o< | H | |
| X X | Ο» | fe | fe * | |
| a o | *c | fe | > | > |
| fe fe | fe | fe | o | 0 |
| Λ | < | < | ||
| 04 | 3 | fe | ||
| 4» | υ | u | ||
| « | fe | |||
| 04 | fe | fe | ||
| <o | X | X | ||
| « JD | 1$ | JO | 0 | 0 |
| 04 04 | f-t | ♦-4 | o | o |
| t 1 | I | o | v> | |
| > ř: | > | > | < | CX |
| o u | o | o | C3 | o |
| X X | X | X | * |
«ο
Γ4
-27CZ 294629 B6
U)
5<
o i
My*
| ίΰ £ g LU O | © | © | © | £ | © | x> CM | J2 | o | o | D CM | -O | JA CM | J? | |||||||||||||||||||||||
| CM | X X | X X | X X | X X | § | ad | z z | X X | g | X X | X X | X X | X X | |||||||||||||||||||||||
| X X | X X | X X | X X | X 9c | X X | z z | X X | z z | X | X X | X X | X X | ||||||||||||||||||||||||
| **·*>< K-J rO CM «£ z CM CM ίη g | x> | z z | z z | z z | X X | X *£ | z z | z z | X X | z z | z z | z | X X | z z | ||||||||||||||||||||||
| o | X | z | X | X X | X | X X | X X | X X | X | ec 3c | X X | X X | X X | |||||||||||||||||||||||
| JS CM | X X | X X | Z XI | X X | X | X | X X | X | X X | X X | X X | oc | X X | |||||||||||||||||||||||
| a <M | X X | X X | X X | X X | X | X | X X | X | X X | X X | X X | X | X X | |||||||||||||||||||||||
| X> v*» | § | X X | X X | i | X | i | z | X | i | X X | X X | X fX | X X | |||||||||||||||||||||||
| -H | co r*. Cn co u> w z | Ό | Z | X X | X X | Od Z | X | X | X | X | z z | X X | X X | X x | A o 10 A δ CA O o z | O Φ 0 V O CA V § Ti X 3B | ||||||||||||||||||||
| Z z | Z | Od Z | z Z | Od z | X X | X X | X XI | z z | X X | X X | X X | z z | ||||||||||||||||||||||||
| •Γ7) Λ s Q |d '£ o a 44 LJ | 3? | z z | X X | z | X X | g | X X | X X | z | z z | z z | X X | X X | |||||||||||||||||||||||
| JS rM © ΓΜ | z z | X X | z | X X | X X | X | X X | X X | X X | X X | g | X | X X | |||||||||||||||||||||||
| *2: g £ rl S > | X> *-* **> | X X | X X | Z | X | ad Z | X X | X X | X X | g | X X | X X | X X | X X | ||||||||||||||||||||||
| ί- | •H cl L_ | •H «ΰ a X ω i | •8 '1 1 | m Ch £ | r*s CM r* <£> cn | to co r* c-* δ i *+ CO | CO ©> co co er> | O *·* w ifí CM U. Uo | 1*) *o CO δ 1 co | cn <n to co 3 ! <+ co | r> X CM | CM cn in E | co r*. Γ·*c* δ 1 wr co | NX 39? i ΰ á 0 N£ L.q | Λ 1 | 3 | o | 8 O *n o o 44 P |
-28CZ 294629 B6
PATENTOVÉ NÁROKY
Claims (21)
1. Způsob klasifikace jednoho nebo více typů hepatitis C viru, vyznačující se tím, že zahrnuje stupně:
a) poskytnutí biologického vzorku od jedince, o kterém se předpokládá, že je infikován virem hepatitis C;
b) kontakt vzorku s prvním reagentem, obsahujícím kombinaci typově specifických epitopů hepatitis C viru, kde alespoň jeden epitop v kombinaci je z nestrukturálního regionu 4 hepatitis C viru a kde kontakt je proveden za podmínek dovolujících vytváření komplexů první epitopprotilátka; a
c) vyhodnocení na přítomnost komplexů epitop-protilátka ve vzorku, pro zjištění zda se protilátka ve vzorku váže s prvním reagentem a tím určení, zda typ hepatitis C viru, přítomného ve vzorkuje totožný s typem uvedeného typově specifického epitopu.
2. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že dále zahrnuje stupně:
d) kontakt vzorku s druhým reagentem, obsahujícím druhý typově specifický epitop hepatitis C viru, kde druhý epitop je z regionu jádra hepatitis C viru a kde kontakt je proveden za podmínek umožňujících tvorbu druhého komplexu epitop-protilátka; a
e) vyhodnocení na přítomnost komplexu druhý epitop-protilátka ve vzorku pro určení, zda se protilátky ve vzorku vážou na epitop ve druhém reagentu a tím určení, zda typ hepatitis C viru, přítomného ve vzorku, je totožný s typem druhého typově specifického epitopu.
3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že vyhodnocení se provede kompetitiční zkouškou, sendvičovou zkouškou, imunofluorescenční zkouškou, radioimunozkouškou nebo zkouškou enzym-navázaný imunosorbent.
4. Způsob podle kteréhokoli z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že první reagent zahrnuje další typově specifický epitop získaný z regionu jádra hepatitis C viru nebo z nestrukturálního regionu 5 hepatitis C viru.
5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že uvedený další typově specifický epitop je umístěn mezi aminokyselinovými zbytky 67 a 84, nebo 2281 a 2313 hepatitis C viru-1 nebo homologními regiony jiných typů hepatitis C viru.
6. Způsob podle kteréhokoliv nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že nestrukturální 4 region typově specifického epitopu je umístěn mezi aminokyselinovými zbytky 1689 a 1718 hepatitis C viru- nebo homologními regiony jiných typů hepatitis C viru.
7. Způsob podle kteréhokoli z nároků 1 až 5,vyznačující se tím, že první reagent je vázán na pevný nitrocelulózový nosič.
8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že první reagent zahrnuje alespoň jeden typově specifický epitop z každého nestrukturálního regionu 4, nestrukturálního regionu 5 a regionu jádra hepatitis C viru.
9. Způsob podle kteréhokoli z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že první reagent zahrnuje více typově specifických epitopů z nestrukturálního regionu 4 hepatitis C viru.
-29CZ 294629 B6
10. Polypeptid pro použití ve způsobu podle kteréhokoli z nároků 1 až 9, mající aminokyselinovou sekvenci odpovídající alespoň jednomu typově specifickému epitopů hepatitis C viru, vyznačující se tím, že epitop je umístěn mezi aminokyselinovými zbytky 67 a 84, 1689 a 1718 nebo 2281 a 2313 hepatitis C viru-1 nebo homologními regiony jiných typů hepatitis C viru.
11. Kompozice pro použití ve způsobu podle kteréhokoli nároku 1 až 9, obsahující rekombinantní polynukleotidovou molekulu kódující panel typově specifických epitopů hepatitis C viru, vyznačující se tím, že epitopy jsou zvoleny z regionu jádra hepatitis C viru, nestrukturálního regionu 4 (NS4) nebo nestrukturálního regionu 5 (NS5).
12. Kompozice podle nároku 11,vyznačující se tím, že polynukleotidové molekuly kódují alespoň po jednom z typově specifických epitopů z regionu jádra a NS4 a NS5 regionů hepatitis C viru.
13. Kompozice podle nároku 11 nebo 12, vyznačující se tím, že všechny typově specifické epitopy hepatitis C viru jsou specifické pro jediný typ hepatitis C viru.
14. Kompozice podle kteréhokoli z nároků 11 až 13, vyznačující se tím, že polynukleotidová molekula kóduje typově specifický epitop hepatitis C viru z regionu jádra odvozený z aminokyselinové sekvence pokrývající aminokyseliny 67 až 84 hepatitis C viru-1, nebo jemu homologní region jiného typu.
15. Kompozice podle kteréhokoli z nároků 11 až 14, vyznačující se tím, že polynukleotidová molekula kóduje typově specifický epitop regionu NS4 hepatitis C viru odvozený z aminokyselinové sekvence pokrývající aminokyseliny 1689 až 1718 hepatitis C viru-1 nebo jemu homologní region jiného typu hepatitis C viru.
16. Kompozice podle kteréhokoli z nároků 11 až 15, vyznačující se tím, že polynukleotidová molekula kóduje typově specifický epitop regionu NS5 hepatitis C viru odvozený z aminokyselinové sekvence pokrývající aminokyseliny 2281 až 2313 hepatitis C viru-1 nebo jemu homologní region jiného typu hepatitis C viru.
17. Způsob klasifikace jednoho nebo více typů hepatitis C viru, vyznačující se tím, že sestává z následujících kroků:
a) poskytnutí biologického vzorku od jedince, o kterém se předpokládá, že je infikován virem hepatitis C;
b) kontakt vzorku s prvním reagentem, obsahujícím kombinaci protilátek specifických pro alespoň dva různé typově specifické epitopy hepatitis C viru, kdy alespoň jedna protilátka v kombinaci je specifická pro typově specifický epitop z nestrukturálního regionu 4 hepatitis C viru a kde je kontakt proveden za podmínek, které dovolují tvorbu komplexů první epitop-protilátka; a
c) vyhodnocení na přítomnost komplexů epitop-protilátka ve vzorku pro zjištění zda přítomný hepatitis C virus ve vzorku je typu typově specifického epitopů.
18. Způsob podle nároku 17, vyznačující se tím, že sestává z následujících kroků:
d) kontakt vzorku s druhým reagentem, obsahujícím protilátku specifickou pro další typ epitopu hepatitis C viru, kdy další epitop je z regionu jádra hepatitis C viru a kde kontakt je proveden za podmínek, které dovolují tvorbu dalšího komplexu epitop-protilátka; a
e) vyhodnocení na přítomnost dalšího komplexu epitop-protilátka ve vzorku.
-30CZ 294629 B6
19. Způsob podle nároku 17 nebo 18, v y z n a č u j í c í se t í m, že vyhodnocení se provede kompetitiční zkouškou, sendvičovou zkouškou, imunofluorescenční zkouškou, radioimunozkouškou nebo zkouškou enzym-navázaný imunosorbent.
5
20. Způsob podle kteréhokoli z nároků 17 až 19, vyznačující se tím, že první reagent zahrnuje specifickou protilátku k dalšímu typově specifickému epitopů získanému z regionu jádra hepatitis C viru, nebo nestrukturálního regionu 5 hepatitis C viru.
21. Způsob podle nároku 20, vyznačující se tím, že další typově specifický epitop je ío umístěn mezi aminokyselinovými zbytky 67 a 84 nebo 2281 a 2313 hepatitis C viru-1 nebo homologními regiony jiných typů hepatitis C viru.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US6040093A | 1993-05-10 | 1993-05-10 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ292995A3 CZ292995A3 (en) | 1996-05-15 |
| CZ294629B6 true CZ294629B6 (cs) | 2005-02-16 |
Family
ID=22029220
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ19952929A CZ294629B6 (cs) | 1993-05-10 | 1994-05-09 | Způsob klasifikace typů hepatitis C viru, polypeptid a kompozice pro použití ve způsobu |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US6054264A (cs) |
| EP (1) | EP0698216B2 (cs) |
| JP (1) | JP3645904B2 (cs) |
| KR (1) | KR100330278B1 (cs) |
| CN (1) | CN1129795C (cs) |
| AT (1) | ATE281647T1 (cs) |
| CZ (1) | CZ294629B6 (cs) |
| DE (1) | DE69434117T3 (cs) |
| DK (1) | DK0698216T4 (cs) |
| ES (1) | ES2232815T5 (cs) |
| GE (1) | GEP20012421B (cs) |
| HU (1) | HU224513B1 (cs) |
| PL (3) | PL175338B1 (cs) |
| PT (1) | PT698216E (cs) |
| RO (1) | RO115471B1 (cs) |
| RU (1) | RU2158928C2 (cs) |
| SK (1) | SK282543B6 (cs) |
| UA (1) | UA46707C2 (cs) |
| WO (1) | WO1994027153A1 (cs) |
Families Citing this family (26)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2065863T3 (es) | 1991-11-21 | 2003-09-01 | Common Services Agency | Analisis para la deteccion de virus de la hepatitis c. |
| ATE551423T1 (de) | 1993-04-27 | 2012-04-15 | Innogenetics Nv | Sequenzen von hepatitis c virus-genotypen sowie ihre verwendungen als therapeutika und diagnostika |
| US7255997B1 (en) * | 1993-04-27 | 2007-08-14 | N.V. Innogenetics S.A. | Sequences of hepatitis C virus genotypes and their use as therapeutic and diagnostic agents |
| ATE281647T1 (de) * | 1993-05-10 | 2004-11-15 | Chiron Corp | Verfahren zur typisierung von hepatitis c viren und dafür zu verwendende reagenzien |
| US5882852A (en) * | 1993-06-29 | 1999-03-16 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Hepatitic C virus (HCV) core gene nucleotide sequences and related methods of detecting major and minor genotypes of HCV isolates |
| US7070790B1 (en) | 1993-06-29 | 2006-07-04 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Nucleotide and deduced amino acid sequences of the envelope 1 and core genes of isolates of hepatitis C virus and the use of reagents derived from these sequences in diagnostic methods and vaccines |
| DE19504302A1 (de) * | 1995-02-09 | 1996-08-14 | Boehringer Mannheim Gmbh | Methode zur serologischen Typisierung mittels typspezifischer Antigene |
| KR19990008122A (ko) * | 1995-04-28 | 1999-01-25 | 곤도도시유키 | 항원 펩타이드 화합물 및 면역학적 측정방법 |
| US6514731B1 (en) | 1996-05-24 | 2003-02-04 | Chiron Corporation | Methods for the preparation of hepatitis C virus multiple copy epitope fusion antigens |
| RU2146825C1 (ru) * | 1998-05-07 | 2000-03-20 | Харламова Флора Семеновна | Способ диагностики внепеченочной персистенции вирусных антигенов в тканях у детей, больных хроническим гепатитом в, или дельта, или с |
| US7052830B1 (en) * | 1998-06-09 | 2006-05-30 | Branch Andrea D | Hepatitis C virus peptides and uses thereof |
| EP1131345A1 (en) * | 1998-11-20 | 2001-09-12 | Bio Merieux | Synthetic polypeptides corresponding to the hepatitis c virus (hcv) and applications |
| US6995299B2 (en) * | 1999-11-02 | 2006-02-07 | University Of Connecticut | Propagation of human hepatocytes in non-human animals |
| US8124348B2 (en) * | 2000-08-23 | 2012-02-28 | Jonathan Zmuda | Oral fluid rapid assay for hepatitis C virus (HCV) antibodies using non-antibody labeling of IgA molecules recognizing HCV peptide epitopes |
| AU2002311897A1 (en) * | 2001-05-09 | 2002-11-18 | Third Wave Technologies, Inc. | Nucleic acid detection in pooled samples |
| US7196183B2 (en) * | 2001-08-31 | 2007-03-27 | Innogenetics N.V. | Hepatitis C virus genotype, and its use as prophylactic, therapeutic and diagnostic agent |
| WO2003085375A2 (en) * | 2002-04-04 | 2003-10-16 | Achillion Pharmaceuticals, Inc. | Hcv antiviral and cytotoxicity drug screening assay |
| US20050202036A1 (en) * | 2003-07-22 | 2005-09-15 | Branch Andrea D. | Alternate reading frame polypeptides drived from hepatitis C and methods of their use |
| PT1658302E (pt) * | 2003-07-25 | 2010-10-25 | Centre Nat Rech Scient | Análogos do nucleósido purina para o tratamento de doenças provocadas por flaviviridae incluindo hepatite c |
| ES2596753T3 (es) * | 2003-08-29 | 2017-01-11 | Fujirebio Europe N.V. | Nuevo clado del virus de la hepatitis C y secuencias prototipo del mismo |
| RU2269134C2 (ru) * | 2003-11-27 | 2006-01-27 | Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера | Способ прогнозирования исходов острого вирусного гепатита с |
| CA2552949C (en) * | 2004-01-07 | 2012-10-02 | Third Wave Technologies, Inc. | Determination of hepatitis c virus genotype |
| JP4533656B2 (ja) * | 2004-04-28 | 2010-09-01 | アボットジャパン株式会社 | 特異性の改良されたｃ型肝炎ウイルス（ｈｃｖ）抗体測定法 |
| US7858752B2 (en) | 2006-12-05 | 2010-12-28 | Abbott Laboratories | Recombinant antibodies against hepatitis C virus and methods of obtaining and using same |
| FR2984328B1 (fr) | 2011-12-20 | 2016-12-30 | Bio-Rad Innovations | Procede de detection d'une infection par le virus de l'hepatite c |
| CN110261616B (zh) * | 2019-04-30 | 2021-07-20 | 广东菲鹏生物有限公司 | 一种丙型肝炎病毒检测试剂盒 |
Family Cites Families (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4868105A (en) * | 1985-12-11 | 1989-09-19 | Chiron Corporation | Solution phase nucleic acid sandwich assay |
| US5124246A (en) * | 1987-10-15 | 1992-06-23 | Chiron Corporation | Nucleic acid multimers and amplified nucleic acid hybridization assays using same |
| US5350671A (en) * | 1987-11-18 | 1994-09-27 | Chiron Corporation | HCV immunoassays employing C domain antigens |
| DE318216T1 (de) * | 1987-11-18 | 1990-06-13 | Chiron Corp., Emeryville, Calif. | Nanbv-diagnostika und vakzine. |
| WO1990011089A1 (en) * | 1989-03-17 | 1990-10-04 | Chiron Corporation | Nanbv diagnostics and vaccines |
| US5106726A (en) * | 1990-02-16 | 1992-04-21 | United Biomedical, Inc. | Synthetic peptides specific for the detection of antibodies to HCV |
| BR9106309A (pt) * | 1990-04-04 | 1993-04-20 | Chiron Corp | Combinacao de antigenos sinteticos de hepatite c viral (hcv),processo de detectar anticorpos para o virus da hepatite c e estojo para realizar teste |
| US6190864B1 (en) * | 1991-05-08 | 2001-02-20 | Chiron Corporation | HCV genomic sequences for diagnostics and therapeutics |
| ES2188583T3 (es) * | 1991-06-24 | 2003-07-01 | Chiron Corp | Polipeptidos para el virus de la hepatitis c (hcv). |
| EP0787807B1 (en) * | 1991-08-27 | 2003-05-28 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Primers and probes for hepatitis C detection |
| EP0532258A2 (en) * | 1991-09-09 | 1993-03-17 | Immuno Japan Inc. | Oligonucleotides and determination system of HCV genotypes |
| WO1993006247A1 (en) * | 1991-09-16 | 1993-04-01 | Abbott Laboratories | Hepatitis c assay |
| ES2065863T3 (es) * | 1991-11-21 | 2003-09-01 | Common Services Agency | Analisis para la deteccion de virus de la hepatitis c. |
| KR100317509B1 (ko) | 1992-07-16 | 2002-02-20 | 야스모토 토루 | C형간염바이러스를분류하기위한항원성펩티드,이펩티드를포함하는키트및이펩티드를사용하는c형간염바이러스를분류하는방법 |
| JPH08505604A (ja) * | 1992-11-06 | 1996-06-18 | カイロン ミモトープス プロプライエトリー リミテッド | モジュラーポリマーを合成するための支持体 |
| AU695259B2 (en) | 1993-05-05 | 1998-08-13 | Common Services Agency | Hepatitis-C virus type 4, 5 and 6 |
| ATE281647T1 (de) * | 1993-05-10 | 2004-11-15 | Chiron Corp | Verfahren zur typisierung von hepatitis c viren und dafür zu verwendende reagenzien |
| EP0729973A4 (en) * | 1993-10-29 | 1998-12-30 | Srl Inc | ANTIGENIC PEPTIDE COMPOUND AND IMMUNOLOGICAL ASSAY METHOD |
-
1994
- 1994-05-09 AT AT94916061T patent/ATE281647T1/de active
- 1994-05-09 JP JP52562794A patent/JP3645904B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1994-05-09 PT PT94916061T patent/PT698216E/pt unknown
- 1994-05-09 PL PL94323368A patent/PL175338B1/pl unknown
- 1994-05-09 GE GEAP19942944A patent/GEP20012421B/en unknown
- 1994-05-09 WO PCT/US1994/005151 patent/WO1994027153A1/en active IP Right Grant
- 1994-05-09 RU RU95122701/13A patent/RU2158928C2/ru active
- 1994-05-09 KR KR1019950704993A patent/KR100330278B1/ko not_active Expired - Lifetime
- 1994-05-09 EP EP94916061A patent/EP0698216B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-05-09 CZ CZ19952929A patent/CZ294629B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1994-05-09 RO RO95-01952A patent/RO115471B1/ro unknown
- 1994-05-09 HU HU9503219A patent/HU224513B1/hu active IP Right Grant
- 1994-05-09 SK SK1359-95A patent/SK282543B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1994-05-09 DE DE69434117T patent/DE69434117T3/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-05-09 DK DK94916061T patent/DK0698216T4/da active
- 1994-05-09 PL PL94311653A patent/PL175342B1/pl unknown
- 1994-05-09 PL PL94323367A patent/PL175360B1/pl unknown
- 1994-05-09 ES ES94916061T patent/ES2232815T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-05-09 UA UA95114832A patent/UA46707C2/uk unknown
- 1994-05-09 CN CN94192560A patent/CN1129795C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1994-11-09 US US08/336,553 patent/US6054264A/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-05-11 US US08/439,157 patent/US6416944B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1999
- 1999-11-09 US US09/437,895 patent/US6416946B1/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ294629B6 (cs) | Způsob klasifikace typů hepatitis C viru, polypeptid a kompozice pro použití ve způsobu | |
| JP3516681B2 (ja) | Ｃ型肝炎ウイルス（ｈｃｖ）ポリペプチド | |
| Tsukiyama-Kohara et al. | Antigenicities of group I and II hepatitis C virus polypeptides—molecular basis of diagnosis | |
| JP2656995B2 (ja) | Ｎａｎｂｖの診断用薬 | |
| EP0610436B9 (en) | Hepatitis-c virus testing | |
| FI118688B (fi) | Hepatiitti-C-virustyypit 4,5 ja 6 | |
| Mondelli et al. | Significance of the immune response to a major, conformational B-cell epitope on the hepatitis C virus NS3 region defined by a human monoclonal antibody | |
| SK123293A3 (en) | Hcv genomic sequences for diagnostics and therapeutics | |
| Moradpour et al. | Characterization of three novel monoclonal antibodies against hepatitis C virus core protein | |
| Ferroni et al. | Identification of four epitopes in hepatitis C virus core protein | |
| US20020037868A1 (en) | Method for detecting hepatitis C | |
| Chang et al. | Artificial NS4 mosaic antigen of hepatitis C virus | |
| JP2005510211A (ja) | 合成ｈｃｖ外被蛋白質及びワクチンのためのその使用 | |
| Kalamvoki et al. | Expression of immunoreactive forms of the hepatitis C NS5A protein in E. coli and their use for diagnostic assays | |
| CA2162250C (en) | Methods of typing hepatitis c virus and reagents for use therein | |
| JPH08505131A (ja) | 肝炎ｃ型ウイルス（ｈｃｖ）非構造−３−ペプチド、該ペプチドに対する抗体及びｈｃｖの検出方法 | |
| JPH0568563A (ja) | Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子およびその利用方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20140509 |